KR20210049701A

KR20210049701A - Rspo3 억제제를 포함하는 심장 판막 질환의 예방 또는 치료용 조성물

Info

Publication number: KR20210049701A
Application number: KR1020200139187A
Authority: KR
Inventors: 장기육; 박은혜; 김은민; 강권윤; 김찬우
Original assignee: 가톨릭대학교 산학협력단
Priority date: 2019-10-24
Filing date: 2020-10-26
Publication date: 2021-05-06
Also published as: WO2021080396A1; KR102531265B1

Abstract

본 발명은 RSPO3의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 심장 판막 질환(valvular heart disease)의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로서, 상기 RSPO3의 발현 또는 활성 억제제는 혈관 또는 판막의 석회화를 억제할 수 있어, 관련 질환의 예방 또는 치료에 유용하게 사용할 수 있다.

Description

RSPO3 억제제를 포함하는 심장 판막 질환의 예방 또는 치료용 조성물{Composition for preventing or treating valvular heart diseases comprising RSPO3 inhbitors}

본 발명은 RSPO3의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 심장 판막 질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

심장 판막 질환(valvular heart diseases)은 판막의 열고 닫히는 개폐 작용이 원할하지 않은 질환으로서, 기능적으로 판막이 잘 열지지 않는 경우를 협착증(stenosis)이라 하고, 열리기는 잘하지만 꽉 닫히지 않아 피가 역류하는 경우를 폐쇄부전증(insufficiency/regurgitation)이라고 한다. 인체의 심장에서 방이 4개이므로 판막도 4 가지가 있으며, 임상적으로 문제가 되는 부위는 대부분 대동맥 판막과 승모판막 2 곳이다.

석회성 대동맥 판막 질환(calcific aortic valve disease)은 대동맥 판막의 석회화(calcification)에 의해 유발되는 질환으로서, 가장 흔한 심장 판막 질환 중 하나이며, 노인 인구의 증가에 따라 질환의 발생율이 점점 증가되는 추세이다. 석회성 대동맥 판막 질환은 대동맥 판막 경화증(aortic valve sclerosis)으로 진행되다가 대동맥 판막 협착증(aortic valve stenosis)으로 진행될 수 있다.

심장 판막 질환의 근본적인 치료는 병든 판막을 제거하고 인공 판막으로 대체하는 판막치환술이 있고, 최근에는 판막을 수선하여 계속 사용하게 하는 성형수술이 도입되고 있다. 그러나, 수술 자체가 지니는 위험성 및 수술 이후에 발생할 수 있는 문제점을 고려해야 한다는 점에서, 대동맥 판막의 석회화를 억제할 수 있는 물질의 개발이 필요한 실정이다.

KR

10-1598612

B

본 발명의 목적은 RSPO3 (R-spondin 3)의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 혈관 또는 판막 석회화의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 1) 혈관 또는 판막 석회화가 유도된 개체에 후보물질을 투여하는 단계;

2) 상기 후보물질이 투여된 개체에서, 생물학적 시료를 분리하는 단계;

3) 상기 분리된 생물학적 시료로부터, RSPO3 유전자 또는 단백질의 발현을 대조군과 비교하는 단계; 및

4) 상기 단계 3)에서, 대조군과 비교하여 RSPO3 유전자 또는 단백질의 발현의 감소를 확인하는 단계;를 포함하는 혈관 또는 판막 석회화의 예방 또는 치료용 후보물질의 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.

본 발명은 RSPO3 (R-spondin 3)의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 혈관 또는 판막 석회화의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명은 1) 혈관 또는 판막 석회화가 유도된 개체에 후보물질을 투여하는 단계;

4) 상기 단계 3)에서, 대조군과 비교하여 RSPO3 유전자 또는 단백질의 발현의 감소를 확인하는 단계;를 포함하는 혈관 또는 판막 석회화의 예방 또는 치료용 후보물질의 스크리닝 방법을 제공한다.

도 1은 정상 판막 유래 VIC 세포 그룹(대조군, control); 석회화 병변 형성이 있는 판막(CAVD) 유래 VIC 세포에 Pro-calcific medium의 무처리(patient(-) 그룹)); 또는 처리 그룹(patient(+) 그룹)에서의 RNA 시퀀싱 분석 방법 및 이의 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 정상 판막 유래 VIC 세포 그룹; 및 석회화 병변 형성이 있는 판막 유래 VIC 세포에 Pro-calcific medium을 처리한 그룹에서의 GO(gene ontology) 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 정상 판막 유래 VIC 세포 및 석회화 병변 형성이 있는 판막 유래 VIC 세포에 각각 Pro-calcific medium을 처리한 후, real-time PCR을 통해 BMP2, RUNX2 및 RSPO3의 발현량을 측정한 결과를 나타낸 것이다 (AR(-): aortic regurgitation(control) without pro-calcific medium; AR(+): aortic regurgitation(control) with pro-calcific medium; AS(-): aortic stenosis(patient) without pro-calcific medium; 및 AS(+): aortic stenosis(patient) with pro-calcific medium).
도 4는 정상 판막 조직(Non-CAVD) 및 석회성 대동맥 판막 질환 환자의 판막 조직(CAVD)에 대하여 Alizarin Red S 염색 및 RSPO3에 대한 면역조직화학염색(immunohistochemistry)을 수행한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 정상 판막 조직(Non-CAVD) 및 석회성 대동맥 판막 질환 환자의 판막 조직(CAVD)에서 RSPO3에 대한 면역조직화학염색(immunohistochemistry) 결과를 나타낸 것이다.
도 6A는 석회화 병변 형성이 있는 판막 유래 VIC 세포에 control siRNA를 처리한 그룹(siControl Cal-); 석회화 병변 형성이 있는 판막 유래 VIC 세포에 Pro-calcific medium의 처리 및 control siRNA를 처리한 그룹(siControl Cal+); 및 석회화 병변 형성이 있는 판막 유래 VIC 세포에 Pro-calcific medium의 처리 및 RSPO3 siRNA를 처리한 그룹(siRSPO3 Cal+)에 대하여 real-time PCR을 통해 BMP2 및 RSPO3의 발현량을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 6B는 석회화 병변 형성이 있는 판막 유래 VIC 세포에 Pro-calcific medium의 처리 및 control siRNA를 처리한 그룹(siControl); 및 석회화 병변 형성이 있는 판막 유래 VIC 세포에 Pro-calcific medium의 처리 및 RSPO3 siRNA를 처리한 그룹(siRSPO3)에 대하여 Alizarin Red S 염색을 수행한 결과를 나타낸 것이다.

본 발명에서 "혈관 또는 판막 석회화"란 혈관 또는 판막 내에 세포외성 기질(matrix) 수산화인회석(hydroxyapatite)(인산칼슘)결정 침착물(crystal deposits)의 형성, 성장 또는 침착을 의미한다.

상기 혈관 석회화는 관상 동맥, 대동맥 및 기타 혈관의 석회화를 포함하며, 예를 들어, 중막성 석회화(medialcalcification) 또는 죽상경화성 석회화(atherosclerotic calcification)일 수 있다.

상기 중막성 석회화는 중막 벽 석회화(medial wall calcification) 또는 묀케베르그 경화증(Moenckeberg's sclerosis)과 동일한 의미로 사용될 수 있으며, 중막 벽 내에 침착된 칼슘에 의한 석회화를 의미한다. 이러한 중막성 석회화는 당뇨, 칼슘 대사기전 이상 또는 신장 질환 등으로 인하여 골 형성 촉진 인자들이 혈관에 발현되어 발생하는 것으로 알려져 있다.

상기 죽상경화성 석회화는 내막층을 따라 죽종성 플라크(artheromatous plaques)내에 발생하는 석회화를 의미한다. 이러한 죽상경화성 석회화는 죽상경화 병소 부위에 직접 칼슘이 침착되어 발생되는 것으로 알려져 있다.

상기 혈관 또는 판막 석회화는 인간의 심장, 폐, 신장 및 대동맥에 유발될수 있고, 석회화가 발생될수 있는 모든 조직 및 기관에는 제한되지 않는다.

상기 석회화가 심장에 발생할 경우, 심장 판막 질환이 야기되고 이는, 판막의 열고 닫히는 개폐 작용이 원할하지 않은 질환으로서, 기능적으로 판막이 잘 열지지 않는 경우를 협착증(stenosis)이라 하고, 열리기는 잘하지만 꽉 닫히지 않아 피가 역류하는 경우를 폐쇄부전증(insufficiency/regurgitation)이라고 한다.

상기 심장 판막 질환은 석회성 대동맥 판막 질환(calcific aortic valve disease; CAVD), 대동맥 판막 협착증(aortic stenosis), 승모판막 협착증(mitral stenosis), 대동맥 판막 폐쇄부전증(aortic regurgitation) 및 승모판막 폐쇄부전증(mitral regurgitation)으로 이루어진 군에 선택되는 어느 하나인 것일 수 있고, 바람직하게는 석회성 대동맥 판막 질환 또는 대동맥 판막 협착증일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 석회성 대동맥 판막 질환 또는 대동맥 판막 협착증은 대동맥 판막의 석회화(calcification)에 의해 유발될 수 있다.

상기 RSPO3는 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있고, 상기 RSPO3를 코딩하는 유전자는 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 것일 수 있다.

상기 RSPO3 발현 또는 활성 억제제는 RSPO3 유전자의 발현 억제제 또는 RSPO3 단백질의 발현 또는 활성 억제제인 것일 수 있다. 상기 RSPO3 유전자의 발현 억제제는 RSPO3 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 안티센스 올리고뉴클레오티드(antisense oligonucleotide), siRNA(small interfering RNA), shRNA(short hairpin RNA) 및 앱타머(aptamer)로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 RSPO3 단백질의 발현 또는 활성 억제제는 RSPO3 단백질에 특이적으로 결합하는 화합물, 펩티드, 펩티드 모방체(peptide mimetics), 기질 유사체(substrate analog), 앱타머(aptamer) 및 항체로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 "안티센스 올리고뉴클레오티드"는 목적 유전자의 mRNA 염기서열에 상보적인 핵산 서열을 함유하고 있는 DNA, RNA 또는 이들의 유도체로서, mRNA 내의 상보적인 서열에 결합하여 mRNA의 단백질로의 번역을 저해하는 작용을 한다.

상기 "siRNA" 목적 유전자의 mRNA 염기서열에 상보적으로 결합하여 mRNA 절단에 의한 RNAi(RNA interference)를 통해 목적 유전자의 발현을 억제할 수 있는 15 내지 30 bp 길이의 센스 서열 및 안티센스 서열로 이루어진 double-stranded RNA로서, 유전자의 넉다운(knockdown) 또는 유전자치료(gene therapy)에 사용될 수 있다.

본 발명에서, 상기 siRNA는 RSPO3 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합할 수 있는 서열번호 3의 염기서열로 이루어진 센스 서열(UGUGAUACCUGUUUCAACAtt) 및 서열번호 4의 염기서열로 이루어진 안티센스 서열(UGUUGAAACAGGUAUCACAgt)의 RNA 분자인 것일 수 있다.

상기 "shRNA"는 목적 유전자의 mRNA 염기서열에 상보적으로 결합하여 RNAi(RNA interference)를 통해 목적 유전자의 발현을 침묵(siliencing)시킬 수 있는 헤어핀 구조를 가진 RNA로서, shRNA는 세포 내 기작에 의하여 절단되어 siRNA가 된 후, RISC(RNA-induced silencing complex)에 결합하고, RISC는 mRNA에 결합하여 절단함으로써 유전자의 발현을 억제하는데 사용될 수 있다.

상기 "펩티드 모방체"는 목적 단백질의 결합 도메인을 억제하여 목적 단백질의 활성을 억제하는 펩티드 또는 비펩티드인 것을 말한다.

상기 "앱타머"는 목적 분자에 특이적으로 결합하는 올리고뉴클레오티드 또는 펩티드 분자로서, 핵산 앱타머의 경우 SELEX(systematic evolution of ligands by exponential enrichment)라 불리는 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide) 라이브러리를 이용한 진화적인 방법에 의해 특정 화학 분자나 생물학적 분자에 높은 친화력과 선별력을 갖고 결합하는 올리고머를 분리하여 수득할 수 있다. 앱타머는 표적에 특이적으로 결합하고 표적의 활성을 조정할 수 있는데, 예컨대, 결합을 통하여 표적이 기능을 차단할 수 있다.

상기 "항체"는 생체의 면역계에서 혈액이나 림프를 순환하면서 외부 물질인 항원이 침입한 경우 이에 반응하는 물질을 말하며, 림프조직에서 형성되는 글로불린계 단백질로 면역글로불린이라고도 불린다. 항체는 B세포에 의해 생산되며, 항원과 특이적으로 결합한다. 하나의 항체 분자에는 두 개의 중사슬(heavy chain)과 두 개의 경사슬(light chain)이 있으며, 각각의 중사슬과 경사슬은 각각 N-말단에 가변영역을 포함하고 있다. 각각의 가변영역은 3 개의 상보성 결정부위 (Complementarity determining region: CDR)와 4 개의 구조 형성부위 (framework regions: FRs)로 구성되는데, 상보성 결정 부위들은 항체의 항원 결합 특이성을 결정하고, 가변영역의 구조형성 부위들로 유지되는 비교적 짧은 펩티드 서열로 존재한다.

상기 항체는 다클론 항체, 단클론 항체, 재조합 항체 및 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라 및 항체 분자의 기능적인 단편, 예를 들어, Fab, F(ab'), F(ab')2및 Fv를 모두 포함한다.

본 발명의 약학 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체를 추가로 포함할 수 있다. 본 발명에서 용어, "약학적으로 허용가능한"이란 상기 조성물에 노출되는 세포나 인간에게 독성이 없는 특성을 나타내는 것을 의미한다. 상기 담체는 완충제, 보존제, 무통화제, 가용화제, 등장제, 안정화제, 기제, 부형제, 윤활제 등 당업계에 공지된 것이라면 제한없이 사용할 수 있다.

또한, 본 발명의 약학 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 나아가, 연고제, 로션제, 스프레이제, 패취제, 크림제, 산제, 현탁제, 겔제 또는 젤의 형태의 피부 외용제의 형태로 사용될 수 있다. 본 발명의 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다.

경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 유효성분에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트 (calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데, 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜 (propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈 (tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명의 용어 "투여"란 적절한 방법으로 개체에게 소정의 물질을 도입하는 것을 의미하며 상기 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 복강내 투여, 정맥내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 경구 투여, 국소 투여, 비내 투여, 폐내 투여, 직장내 투여될 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.

상기 용어, "개체"란 인간을 포함한 쥐, 생쥐, 가축 등의 모든 동물을 의미한다. 바람직하게는, 인간을 포함한 포유동물일 수 있다.

상기 용어, "약학적으로 유효한 양"이란 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분하며 부작용을 일으키지 않을 정도의 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 환자의 성별, 연령, 체중, 건강 상태, 질병의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 방법, 투여 시간, 투여 경로, 및 배출 비율, 치료 기간, 배합 또는 동시에 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 투여는 상기 권장 투여량을 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다.

상기 방법은 RSPO3 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현량을 기준치보다 감소시킨 후보 물질을 선별하는 단계를 추가적으로 더 포함하는 것일 수 있다.

상기 측정은 RT-PCR (reverse transcription polymerase chain reaction), competitive RT-PCR, real-time quantitative RT-PCR, RNase 보호 분석법(RNase protection method), 노던블럿(northern blot), DNA 칩 분석법(DNA chip technology assay), ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay), 웨스턴블럿(western blot), 면역블럿(immunoblot) 또는 면역세포화학법(immunocytochemistry)에 의하여 수행되는 것일 수 있다.

본 발명은 RSPO3 (R-spondin 3) 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현량을 측정할 수 있는 제제를 포함하는 심장 판막 질환(valvular heart disease)의 진단용 조성물을 제공한다.

상기 단백질의 발현량을 측정하는 제제는 상기 단백질 또는 펩티드 단편에 특이적으로 결합하는 항체, 상호작용 단백질, 리간드, 나노입자(nanoparticles) 또는 앱타머(aptamer)인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 단백질을 코딩하는 유전자의 발현량을 측정하는 제제는 상기 유전자의 mRNA에 결합하는 프라이머 또는 프로브인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에서의 용어, "프라이머"는 짧은 자유 3-말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 염기서열로서, 상보적인 템플레이트(template)와 염기쌍을 형성할 수 있고, 템플레이트 가닥 복사을 위한 시작 지점으로서 작용하는 짧은 염기서열을 말한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응을 위한 시약(즉, DNA 폴리머레이트 또는 역전사효소) 및 상이한 4 가지의 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재 하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다. PCR 조건, 센스 및 안티센스 프라이머의 길이는 당업계에 공지된 기술에 따라 적절히 선택될 수 있다.

본 발명에서의 용어, "프로브"는 유전자에 특이적으로 결합을 이룰 수 있는 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 의미하며, 표지되어 있어 특정 유전자의 존재 유무 및 발현양을 확인할 수 있다. 프로브는 올리고뉴클레오타이드(oligonucleotide) 프로브, 단쇄 DNA(single strand DNA) 프로브, 이중쇄 DNA(double strand DNA)프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있다. 적절한 프로브의 선택 및 혼성화 조건은 당해 기술 분야에 공지된 기술에 따라 적절히 선택할 수 있다.

본 발명의 프라이머 또는 프로브는 포스포아미다이트(phosphoramidite) 고체 지지체 합성법이나 기타 널리 공지된 방법을 이용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 염기서열은 또한 당해 기술 분야에 공지된 다양한 방법을 통해 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 예로는 메틸화, 캡화, 천연 뉴클레오티드 하나 이상의 동족체로의 치환 및 뉴클레오티드 간의 변형, 예를 들면 하전되지 않은 연결체(예: 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형이 있다.

이하, 본 발명을 실시예를 통하여 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. RNA 시퀀싱 분석(RNA sequencing analysis)

본 발명자들은 대동맥 판막 치환술을 받은 환자로부터 석회화 병변 형성이 없는 정상 판막 및 석회화 병변 형성이 있는 판막을 얻었고, 상기 판막으로부터 VIC(valvular interstitial cell) 세포를 분리하여 배양한 후, RNA 시퀀싱 분석법을 통해 각각의 유전자 발현 프로파일을 분석하였다. 실험은 정상 판막 유래 VIC 세포 그룹(대조군, control), 석회화 병변 형성이 있는 판막 유래 VIC 세포에 Pro-calcific medium의 무처리(patient(-) 그룹)) 또는 처리 그룹(patient(+) 그룹)에서 실시하였다 (도 1 위쪽 패널). 각 세포는 7 일 동안 배양한 후 분석에 사용되었다.

그 결과, 석회화 병변 형성이 있는 판막 유래 VIC 세포에 Pro-calcific medium의 무처리 또는 처리 그룹에서는 대조군인 정상 판막 유래 VIC 세포 그룹과 비교하여 유전자 발현 프로파일이 상이하게 나타났다. 또한, 석회화 병변 형성이 있는 판막 유래 VIC 세포에 Pro-calcific medium의 무처리 또는 처리 그룹 간에도 유전자 발현 프로파일이 상이한 것으로 확인되었다 (도 1 아래쪽 패널).

상기 결과로부터, 본 발명자들은 석회화 판막 질환 여부 및 석회화 유도 여부에 따라 다양한 유전자의 발현 조절이 이루어지고 있음을 확인하였다.

또한, GO(gene ontology) 분석 결과에서는 상향조절(up-regulation)되는 그룹으로서 regulation of actin filament-based movement (GO:1903115), negative regulation of microtubule polymerization (GO:0031115), negative regulation of bone mineralization (GO:0030502) 순으로 나타났고, 하향조절(down-regulation)되는 그룹으로서 type I interferon signaling pathway(GO:0060337), protein localization to chromosome, centromeric region (GO:0071459) 순으로 나타났다 (도 2).

본 발명자들은 상기 상향조절되는 유전자 그룹 중 대조군인 정상 판막 유래 VIC 세포에 비해 석회화 병변 형성이 있는 판막 유래 VIC 세포에서 발현이 증가되고, 석회화 유도 시 발현이 더욱 증가되는 유전자를 석회화와 관련성이 높은 유전자인 것으로 판단하여, 유전자의 발현 증가율을 분석하였다. 그 결과, RSPO3(R-spondin 3)이 정상 판막 유래 VIC 세포에 비해 석회화 병변 형성이 있는 판막 유래 VIC 세포에서 3.16 배로 상향조절되었고, 석회화 유도 시 2.74 배로 상향조절되어, 가장 현저하게 발현이 증가된 유전자인 것으로 확인되었다.

실시예 2. 판막 유래 VIC 세포에서 RSPO3 유전자의 발현 분석

본 발명자들은 RSPO3(R-spondin 3)가 석회화 관련 유전자로 알려진 BMP2(bone morphogenetic protein 2) 및 RUNX2(Runt-related transcription factor 2)와 비교하여 석회화 병변 형성이 있는 판막 유래 VIC 세포에서 유전자의 발현량이 높아지는지 여부를 검증하기 위한 실험을 수행하였다. 간단히, 정상 판막 유래 VIC 세포 및 석회화 병변 형성이 있는 판막 유래 VIC 세포에 각각 Pro-calcific medium을 처리한 후 4 일 및 7 일 동안 배양한 후, real-time PCR을 통해 유전자의 발현량을 확인하였다.

그 결과, RSPO3 유전자의 발현량은 석회화 관련 유전자인 BMP2 및 RUNX2와 동일하게 석회화 병변 형성이 있는 판막 유래 VIC 세포에 Pro-calcific medium을 처리하여 석회화를 유도할 경우 현저하게 상향조절되는 것으로 확인되었다 (도 3).

상기 결과로부터, 본 발명자들은 RSPO3 유전자는 석회화가 진행된 판막 유래 VIC 세포에서 상향조절되는 것을 검증하였다.

실시예 3. 대동맥 판막의 석회화에 따른 RSPO3의 발현 분석

본 발명자들은 사람 대동맥 판막 조직에서 석회화 정도에 따른 RSPO3의 발현을 비교하는 실험을 수행하였다. 간단히, 환자로부터 분리된 사람 대동맥 판막 샘플은 4% 포르말린 용액에 고정시킨 후, 파라핀으로 포매하여 4 μm 두께의 절편으로 준비하였다. 판막 조직의 석회화 정도를 확인하기 위하여 Alizarin Red S 염색을 수행하였다. 그 결과, 대동맥 판막 협착증(석회성 대동맥 판막 질환) 환자의 판막에서는 정상 판막에 비해 석회화가 현저하게 나타났음을 확인하였다 (도 4).

또한, 본 발명자들은 판막 조직에서 RSPO3의 발현 여부를 확인하기 위하여 면역조직화학염색(immunohistochemistry)을 수행하였다. 그 결과, 대동맥 판막 협착증(석회성 대동맥 판막 질환) 환자의 판막에서는 정상 판막에 비해 RSPO3의 발현이 현저하게 높았음을 확인하였다 (도 4 및 도 5).

상기 결과로부터, 본 발명자들은 대동맥 판막 협착증(석회성 대동맥 판막 질환) 환자의 판막에서는 정상 판막에 비해 석회화가 현저하게 나타나고, 이와 함께 RSPO3의 발현이 현저하게 높았음을 확인하였다.

실시예 4. 석회화에 대한 RSPO3 넉다운(knockdown)의 효과

본 발명자들은 RSPO3가 석회화를 유도하는지 확인하기 위하여 판막 유래 VIC 세포에 RSPO3를 넉다운시켜 석회화에 대한 효과를 확인하는 실험을 수행하였다. 간단히, 석회화 병변 형성이 있는 판막 유래 VIC 세포에 control siRNA를 처리한 그룹(siControl Cal-); 석회화 병변 형성이 있는 판막 유래 VIC 세포에 Pro-calcific medium의 처리 및 control siRNA를 처리한 그룹(siControl Cal+); 및 석회화 병변 형성이 있는 판막 유래 VIC 세포에 Pro-calcific medium의 처리 및 RSPO3 siRNA를 처리한 그룹(siRSPO3 Cal+)에 대하여 real-time PCR을 통해 BMP2 및 RSPO3의 발현량을 측정하였다.

그 결과, RSPO3 siRNA를 처리한 경우 RSPO3의 발현이 현저하게 낮아져 siRNA의 처리로 RSPO3의 발현을 억제할 수 있음을 확인하였고, RSPO3 siRNA에 의해 석회화 관련 유전자인 BMP2의 발현 역시 억제할 수 있음을 확인하였다 (도 6A).

또한, 본 발명자들은 RSPO3 siRNA를 처리에 따른 석회화 정도를 비교하기 위하여 Alizarin Red S 염색을 수행하였다. 그 결과, RSPO3 siRNA(siRSPO3)를 처리한 경우 control siRNA를 처리한 경우에 비해 석회화를 현저하게 감소시키는 효과가 있음을 확인하였다 (도 6B).

상기 결과로부터, 본 발명자들은 RSPO3의 발현 억제를 통해 대동맥 판막의 석회화를 억제할 수 있음을 확인하였다. 이로써, 본 발명자들은 RSPO3의 발현 또는 활성 억제제가 대동맥 판막의 석회화를 억제함으로써 석회성 대동맥 판막 질환(calcific aortic valve disease) 또는 대동맥 판막 협착증(aortic stenosis) 등의 심장 판막 질환의 예방 또는 치료에 사용할 수 있음을 확인하였다.

<110> THE CATHOLIC UNIVERSITY OF KOREA INDUSTRY-ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION <120> Composition for preventing or treating valvular heart diseases comprising RSPO3 inhbitors <130> PN2010-485 <150> KR 10-2019-0132769 <151> 2019-10-24 <160> 4 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 272 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> RSPO3 protein <400> 1 Met His Leu Arg Leu Ile Ser Trp Leu Phe Ile Ile Leu Asn Phe Met 1 5 10 15 Glu Tyr Ile Gly Ser Gln Asn Ala Ser Arg Gly Arg Arg Gln Arg Arg 20 25 30 Met His Pro Asn Val Ser Gln Gly Cys Gln Gly Gly Cys Ala Thr Cys 35 40 45 Ser Asp Tyr Asn Gly Cys Leu Ser Cys Lys Pro Arg Leu Phe Phe Ala 50 55 60 Leu Glu Arg Ile Gly Met Lys Gln Ile Gly Val Cys Leu Ser Ser Cys 65 70 75 80 Pro Ser Gly Tyr Tyr Gly Thr Arg Tyr Pro Asp Ile Asn Lys Cys Thr 85 90 95 Lys Cys Lys Ala Asp Cys Asp Thr Cys Phe Asn Lys Asn Phe Cys Thr 100 105 110 Lys Cys Lys Ser Gly Phe Tyr Leu His Leu Gly Lys Cys Leu Asp Asn 115 120 125 Cys Pro Glu Gly Leu Glu Ala Asn Asn His Thr Met Glu Cys Val Ser 130 135 140 Ile Val His Cys Glu Val Ser Glu Trp Asn Pro Trp Ser Pro Cys Thr 145 150 155 160 Lys Lys Gly Lys Thr Cys Gly Phe Lys Arg Gly Thr Glu Thr Arg Val 165 170 175 Arg Glu Ile Ile Gln His Pro Ser Ala Lys Gly Asn Leu Cys Pro Pro 180 185 190 Thr Asn Glu Thr Arg Lys Cys Thr Val Gln Arg Lys Lys Cys Gln Lys 195 200 205 Gly Glu Arg Gly Lys Lys Gly Arg Glu Arg Lys Arg Lys Lys Pro Asn 210 215 220 Lys Gly Glu Ser Lys Glu Ala Ile Pro Asp Ser Lys Ser Leu Glu Ser 225 230 235 240 Ser Lys Glu Ile Pro Glu Gln Arg Glu Asn Lys Gln Gln Gln Lys Lys 245 250 255 Arg Lys Val Gln Asp Lys Gln Lys Ser Val Ser Val Ser Thr Val His 260 265 270 <210> 2 <211> 819 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RSPO3 gene <400> 2 atgcacttgc gactgatttc ttggcttttt atcattttga actttatgga atacatcggc 60 agccaaaacg cctcccgggg aaggcgccag cgaagaatgc atcctaacgt tagtcaaggc 120 tgccaaggag gctgtgcaac atgctcagat tacaatggat gtttgtcatg taagcccaga 180 ctattttttg ctctggaaag aattggcatg aagcagattg gagtatgtct ctcttcatgt 240 ccaagtggat attatggaac tcgatatcca gatataaata agtgtacaaa atgcaaagct 300 gactgtgata cctgtttcaa caaaaatttc tgcacaaaat gtaaaagtgg attttactta 360 caccttggaa agtgccttga caattgccca gaagggttgg aagccaacaa ccatactatg 420 gagtgtgtca gtattgtgca ctgtgaggtc agtgaatgga atccttggag tccatgcacg 480 aagaagggaa aaacatgtgg cttcaaaaga gggactgaaa cacgggtccg agaaataata 540 cagcatcctt cagcaaaggg taacctgtgt cccccaacaa atgagacaag aaagtgtaca 600 gtgcaaagga agaagtgtca gaagggagaa cgaggaaaaa aaggaaggga gaggaaaaga 660 aaaaaaccta ataaaggaga aagtaaagaa gcaatacctg acagcaaaag tctggaatcc 720 agcaaagaaa tcccagagca acgagaaaac aaacagcagc agaagaagcg aaaagtccaa 780 gataaacaga aatcggtatc agtcagcact gtacactag 819 <210> 3 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RSPO3 siRNA sense <400> 3 ugugauaccu guuucaaca 19 <210> 4 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RSPO3 siRNA antisense <400> 4 uguugaaaca gguaucaca 19

Claims

RSPO3 (R-spondin 3)의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 혈관 또는 판막 석회화의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제 1항에 있어서,
상기 혈관 또는 판막 석회화는 인간의 심장, 폐, 신장 및 대동맥에 유발되는 것을 특징으로하는 혈관 또는 판막 석회화의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제 1항에 있어서,
상기 혈관 또는 판막 석회화는, 판막증, 고지혈증, 노화, 에스트로겐 부족, 협심증, 심부전, 신장질환, 요독증, 당뇨병, 염증 질환 및 심혈관계질환으로 이루어진 군으로부터 선택된 것 적응증으로 유발되는 것을 특징으로 하는 혈관 또는 판막 석회화의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제 3항에 있어서,
상기 판막증은 대동맥 판막 협착증으로 유발되는 것을 특징으로 하는 혈관 또는 판막 석회화의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제 1항에 있어서,
상기 혈관 또는 판막 석회화는 액틴 필라멘트-기반 이동의 조절(regulation of actin filament-based movement), 미세소관 중합반응의 음성 조절(negative regulation of microtubule polymerization) 및 골 광화의 음성 조절(negative regulation of bone mineralization)과 관련된 유전자 발현이 상향 조절되는 것을 특징으로 하는 혈관 또는 판막 석회화의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제 1항에 있어서,
상기 혈관 또는 판막 석회화는 타입 I 인터페론 시그널 경로(type I interferon signaling pathway) 및 크로모좀 및 중심절 영역에 위치한 단백질(protein localization to chromosome, centromeric region)과 관련된 유전자 발현이 하향 조절되는 것을 특징으로 하는 혈관 또는 판막 석회화의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제 1항에 있어서,
상기 RSPO3는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 혈관 또는 판막 석회화의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제 1항에 있어서,
상기 RSPO3는 서열번호 2의 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 혈관 또는 판막 석회화의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제 1항에 있어서,
상기 RSPO3의 발현 또는 활성 억제제는, RSPO3 유전자의 발현 억제제 또는 RSPO3 단백질의 발현 또는 활성 억제제인 것을 특징으로 하는 혈관 또는 판막 석회화의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제 9항에 있어서,
상기 RSPO3 유전자의 발현 억제제는 RSPO3 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 안티센스 뉴클레오티드(antisense nucleotid), siRNA 및 shRNA로 이루어진 군에서 선택된 것을 특징으로 하는 혈관 또는 판막 석회화의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제 10항에 있어서,
상기 siRNA는 서열번호 3 및 서열번호 4를 포함하는 siRNA인 것을 특징으로 하는 혈관 또는 판막 석회화의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제 9항에 있어서,
상기 RSPO3 단백질의 발현 또는 활성 억제제는 RSPO3 단백질에 상보적으로 결합하는 펩티드, 펩티드미메틱스, 기질유사체, 앱타머 및 항체로 이루어진 군에서 선택된 것을 특징으로 하는 혈관 또는 판막 석회화의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
1) 혈관 또는 판막 석회화가 유도된 개체에 후보물질을 투여하는 단계;
2) 상기 후보물질이 투여된 개체에서, 생물학적 시료를 분리하는 단계;
3) 상기 분리된 생물학적 시료로부터, RSPO3 유전자 또는 단백질의 발현을 대조군과 비교하는 단계; 및
4) 상기 단계 3)에서, 대조군과 비교하여 RSPO3 유전자 또는 단백질의 발현의 감소를 확인하는 단계;를 포함하는 혈관 또는 판막 석회화의 예방 또는 치료용 후보물질의 스크리닝 방법.
제 13에 있어서,
상기 RSPO3 유전자의 발현은, 역전사 중합효소연쇄반응, 경쟁적 중합효소 연쇄반응, 실시간 중합효소 연쇄반응, Nuclease 보호 분석(RNase, S1 nuclease assay), in situ 교잡법 및 DNA 마이크로어레이 이용법으로 이루어진 군에서 선택되는 방법으로 수행되는 것을 특징으로 하는 혈관 또는 판막 석회화의 예방 또는 치료용 후보물질의 스크리닝 방법.
제 13항에 있어서,
상기 RSPO3 단백질의 발현은 노던 블롯, 웨스턴 블롯, ELISA(Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay), 방사선 면역분석법, 면역 확산법, 면역 전기영동, 조직 면역염색, 면역침전 분석법, 보체 고정 분석법, FACS, 질량분석법(Mass spectrometry) 및 단백질 마이크로어레이 이용법으로 이루어진 군에서 선택된 방법으로 수행되는 것을 특징으로 하는 혈관 또는 판막 석회화의 예방 또는 치료용 후보물질의 스크리닝 방법.