KR101179843B1 - 뉴로필린 ２의 위암 진단 및 치료용 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 정상 위 점막에 비해 위암 유래 혈관 내피세포에서 과발현되는 것으로 규명된 유전자(표 2)의 발현량을 mRNA 또는 단백질 수준에서 측정하는 제제를 포함하는 위암 진단용 조성물 및 이를 이용하여 위암을 진단하는 방법에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 뉴로필린2(Neuropilin2)의 억제제를 포함하는 위암 치료용 약제학적 조성물에 관한 것이다.

Neuropilin2, 종양 내피세포, 위암, VEGF

Description

뉴로필린 ２의 위암 진단 및 치료용 용도{Usage of Neuropilin2 for Diagnosis and Treatment of Gastric Cancer}

본 발명은 위암 유래 혈관 내피세포에서 과발현되는 것으로 규명된 유전자의 발현량을 mRNA 또는 단백질 수준에서 측정하는 제제를 포함하는 위암 진단용 조성물 및 이를 이용하여 위암을 진단하는 방법 및 뉴로필린2의 억제제를 포함하는 위암 치료용 약제학적 조성물에 관한 것이다.

비정상적인 구조 및 성질을 갖는 혈관에 의해 특징지어진 병리학적 신생혈관형성은 암과 다양한 허혈 및 염증 질환과 관련이 있다(P. Carmeliet, et al. Nature 407 (2000) 249-257). 종양 혈관은 정상 혈관과 상이한 것으로 알려져 있고, 구조적으로 리키하고(leaky), 비틀리고(tortuous), 무질서한 것을 특징으로 하고 있다. 또한, 유전학적 견지에서, 상기 혈관은 특이적 유전자와 TEM(tumor endothelial cell marker)이라고 하는 표면 단백질을 가지고 있다(B. St Croix, et al. Science 289 (2000) 1197-1202; A. Nanda, et al. Curr. Opin. Oncol. 16 (2004) 44-49). 상기 종양 혈관의 성향은 정상 혈관과 비교하였을 때 여러 신생혈 관형성 인자에 대해 다양하다(E. Boye, et al. J. Clin. Invest. 107 (2001) 745-752). 종양 혈관은 일정한 정도로 이들을 둘러싼 종양과 동일한 유전학적 백그라운드를 공유하며, 염색체 불안정과 전이를 특징으로 하고 있다(K. Hida, et al. Cancer Res. 64 (2004) 8249-8255; B. Streubel, et al. N. Engl. J. Med. 351 (2004) 250-259).

최근, 종양 내피세포를 특이적으로 타겟팅하는 아이디어가 당 분야에서 관심을 받고 있다. 예를 들어, EGFR(epidermal growth factor receptor)을 발현하지만, ErbB3을 발현하지 않는 흑색종 유래 종양 내피세포는 특이적 EGFR 키나제 억제제로 치료함으로써 제거될 수 있다(D.N. Amin, et al. Cancer Res. 66 (2006) 2173-2180). 신생혈관현성의 마커인 피브로넥틴의 엑스트라도메인(extradomain) B에 대한 항체와 융합된 TNF(Tumor necrosis factor) 및 인터루킨-12는 종양 혈관으로 전달되어 종양 EC(endothelial cell)의 아폽토시스를 유발할 수 있다(L. Borsi, et al. Blood 102 (2003) 4384-4392; C. Halin, et al. Nat. Biotechnol. 20 (2002) 264-269). 또한, 종양 혈관은 비정상적인 유전자 발현을 조정함으로써 구조적 기능적으로 혈관을 안정화시켜 정상화될 수 있으며, 더 나아가 항암제 및 방사선요법의 활성을 증가시킬 수 있다(R.K. Jain, Science 307 (2005) 58-62). 따라서, 정상 혈관에 심각한 부작용을 유발하지 않는 종양 특이적 항-신생혈관형성 치료 및 예방책을 설계하기 위해 종양 특이적인 종양 내피세포 특이적 유전자를 동정하는 것이 필수적이다.

한편, 위암은 세계에서 두 번째로 많은 악성종양으로, 이의 공격성은 다양한 발암유전자(oncogene) 및 종양 억제제를 코딩하고 있는 유전자내 돌연변이와 같은 많은 인자와 관련이 있다. 상기 유전자들의 비정상적인 발현과 이들의 다운스트림 타겟이 증가된 신생혈관형성 및 전이의 표현형을 부여한다(E. Tahara, IARC Sci. Publ. 157 (2004) 327-349; J. Sanz-Ortega, S.M. Steinberg, E. Moro, et al. Histol. Histopathol. 15 (2000) 455-462). 신생혈관형성 표현형은 상이한 위 종양 간에서 다양하며, 고밀도 혈관이 분포된 위암은 저밀도로 혈관이 분포된 암에 비해 나쁜 예후를 보인다는 것은 놀랍지 않다(N. Tanigawa, et al. Br. J. Cancer 75 (1997) 566-571; C.N. Chen, et al. Ann. Surg. 235 (2002) 512-518; W. Gong, et al. Clin. Cancer Res. 11 (2005) 1386-1393). src 및 ras와 같은 발암 단백질을 포함한 많은 신생혈관형성 인자의 과발현 및 혈관 침습이 위암에서 나쁜 예후 및 전이와 연관이 있다는 증거가 늘고 있다. 그러나, 지금까지 위암과 정상 점막간 내피세포 특이적인 표현형을 분자 수준에서 비교한 경우는 없었다.

본 발명자는 정상 위 점막에 비해 위암 유래 혈관 내피세포에서 과발현되는 유전자를 비교 분석한 결과, 표 2에 나타낸 유전자가 정상 위 점막에 비해 위암 유래 내피세포에서 유의적으로 과발현되어 위암 진단에 이용 가능하고, 또한, 상기 유전자 중 뉴로필린 2의 억제제가 신생혈관형성을 억제하여 위암 치료에 유용함을 확인하고, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

본 발명의 한 목적은 표 2에 기재된 유전자의 발현량을 mRNA 또는 단백질 수준에서 측정하는 제제를 포함하는 위암 진단용 조성물은 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 생물학적 시료내 표 2에 기재된 유전자의 발현 수준을 측정하여 위암을 진단하는 방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 뉴로필린 2의 억제제를 함유하는 위암 치료용 약제학적 조성물을 제공하는데 있다.

본 발명에서는, 위암 유래 혈관 내피세포에서 정상 위 점막에 비해 특이적으로 과발현되는 유전자들을 스크리닝하여, 표 2에 기재된 유전자를 위암 진단 마커로 확보하였다.

하나의 양태로서, 본 발명은 표 2에 기재된 유전자 중 적어도 한 유전자의 mRNA 수준을 측정하는 제제를 포함하는 위암 진단용 조성물에 관한 것이다.

상기 유전자의 mRNA 수준을 측정하는 제제는 바람직하게는 프라이머 쌍 또는 프로브이다.

구체적으로, 프라이머는 짧은 자유 3말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로 상보적인 템플레이트와 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 템플레이트 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다.

본 발명의 프라이머는 필요한 경우, 분광학적, 광화학적, 생화학적, 면역화학적 또는 화학적 수단에 의해 직접적으로 또는 간접적으로 검출 가능한 표지를 포함할 수 있다. 표지는, 호스래디쉬 퍼옥시다제, 알칼린 포스파타아제 등과 같은 효소, 33P 등과 같은 방사성 동위원소, 바이오틴 등과 같은 화학그룹 및 형광성 분자를 예로 들 수 있다.

프로브는 mRNA와 특이적 결합을 이룰 수 있으며 라벨링되어 있어서 특정 mRNA의 존재 유무를 확인할 수 있는 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 의미한다. 프로브는 올리고뉴클로타이드(oligonucleotide) 프로브, 단쇄 DNA(single stranded DNA) 프로브, 이중쇄 DNA(double stranded DNA) 프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있다.

당업자는, 공지된 유전자의 핵산 서열로부터, 표적 유전자내 서열간의 혼성화 정도 등의 변수를 고려하여 상기 유전자의 특정 영역을 특이적으로 증폭하는 프라이머 쌍 또는 상기 유전자의 특정 영역을 특이적으로 인지하는 프로브를 디자인할 수 있다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 표 2에 기재된 유전자 중 적어도 한 유전자의 단백질 수준을 측정하는 제제를 포함하는 위암 진단용 조성물에 관한 것이다.

유전자의 단백질 수준을 측정하는 제제는 바람직하게는 항체로, 표 2에 기재된 유전자 중 적어도 한 유전자의 단백질에 대해 특이적으로 결합하는 다클론 항체, 단클론 항체 및 재조합 항체를 모두 포함한다. 또한, 본 발명의 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태 및 항체 분자의 기능적인 단편, 예를 들어, Fab, F(ab'), F(ab') 2 및 Fv을 포함한다.

본 발명의 위암 진단용 조성물은 당분야에서 널리 사용되는 다른 구성 성분 또는 장치를 추가로 포함하여 위암 진단용 키트로 응용, 제작될 수 있다.

구체적인 예로서, 상기 유전자에 대한 특이적인 프라이머 쌍 및, 추가적으로 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액, 데옥시뉴클레오타이드(dNTPs), Taq-폴리머라아제 및 역전사효소와 같은 효소, DNAse 억제제, RNAse 억제제, DEPC-수(DEPC-water), 멸균수 등을 포함하여 RT-PCR용 키트로 제작될 수 있다. 또 다른 예로서, DNA 칩을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 DNA 칩용 키트로 제작될 수 있다.

또 다른 예로서, 상기 유전자의 단백질에 대한 특이적인 항체 및, 추가적으로, 결합된 항체를 검출할 수 있는 시약, 예를 들면, 표지된 2차 항체, 발색단(chromophores), 효소 및 그의 기질을 포함하는 ELISA용의 키트로 제작될 수 있다. 또 다른 예로서, 단백질 칩을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 단백질 칩용 키트로 제작될 수 있다.

상기 예시한 키트 외에도, 상기 유전자를 검출할 수 있는 래피드 진단 키트로 제작되는 여러 형태의 진단 키트를 포함한다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 생물학적 시료에서 표 2에 기재된 유전자 중 적어도 한 유전자의 발현 수준을 측정하여 위암을 진단하는 방법에 관한 것이다. 구체적으로는, 유전자의 발현 수준을 mRNA 수준 또는 단백질 수준에서 검출할 수 있다.

구체적인 양태로서, 본 발명은 표 2에 기재된 유전자 중 적어도 한 유전자에 특이적인 프라이머 쌍 또는 프로브를 사용하여 위암 의심 환자의 생물학적 시료로부터 상기 유전자의 mRNA 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 위암 진단방법에 관한 것이다.

상기 방법으로 mRNA 수준을 측정하기 위한 구체적 분석 방법으로는 RT-PCR, 경쟁적 RT-PCR, 실시간 RT-PCR, RNase 보호 분석법, 노던블랏팅, DNA 칩 등이 있으나, 이로 제한되는 것은 아니다.

또 다른 구체적인 양태로서, 본 발명은 표 2에 기재된 유전자 중 적어도 한 유전자의 단백질에 특이적인 항체를 사용하여 위암 의심환자의 생물학적 시료와 접촉시켜 항원-항체 복합체 형성하는 방법으로 단백질 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 위암 진단방법에 관한 것이다.

상기 방법으로 단백질 수준을 측정하기 위한 구체적 분석 방법으로는, 웨스턴 블랏, ELISA, 방사선면역분석, 방사 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법, 보체 고정 분석법, FACS, 단백질 칩 등이 있으나, 이로 제한되는 것은 아니다. ELISA는 고체 지지체에 부착된 항체와 항원의 복합체에서 항원을 인지하는 표지된 또 다른 항체를 이용하는 직접적 샌드위치 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항체와 항원의 복합체에서 항원을 인지하는 또 다른 항체와 반응시킨 후 이 항체를 인지하는 표지된 2차 항체를 이용하 는 간접적 샌드위치 ELISA 등의 다양한 ELISA 방법을 포함한다.

진단에 사용되는 생물학적 시료는 특별히 제한되지 않으며, 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 객담, 뇌척수액, 뇨와 같은 시료 등을 포함할 수 있다. 본 발명에서는 혈관 내피세포(endothelial cell)를 포함하는 것이 바람직하다.

또한, 위암에 걸리지 않은 시료를 대조군으로 사용하여 시료내의 위암 의심 환자의 생물학적 시료에서의 유전자 발현량과 비교하는 단계를 포함할 수 있다. 이는 대조군과 생물학적 시료 간의 발현량의 차이는 절대적 또는 상대적 차이로 비교될 수 있다.

상기 예시한 검출 방법들을 통하여, 위암 마커 유전자의 mRNA 또는 단백질 수준을 정량적으로 분석 가능하고, 이를 통하여 위암 의심 환자의 위암 여부를 진단할 수 있다.

본 발명에서는, 정상 위 점막에 비해 위암 유래 혈관 내피세포에서 특히 Neuropilin2(Nrp2)가 과발현됨을 확인하였다. Nrp2는 신생혈관형성에 관여하는 유전자로서, 이의 억제제는 신생혈관형성을 억제함으로써 위암을 치료하는데 이용될 수 있다.

따라서, 본 발명은 Nrp2의 억제제를 함유한 위암 치료용 약제학적 조성물에 관한 것이다.

본 발명에서, 'Nrp2의 억제제'는 Nrp2의 활성 억제제 또는 Nrp2의 발현 억제제일 수 있다.

본 발명에서 Nrp2의 활성 억제제로는 예를 들면, 이에 한정되지는 않으나 펩타이드, 폴리펩타이드, 단백질, 펩타이드 모조물, 화합물 및 생물제제일 수 있다. 바람직하게는 Nrp2의 활성을 중화시킬 수 있는 항-Nrp2 항체일 수 있다.

본 발명에서 항-Nrp2 항체는 다클론 항체 또는 단클론 항체일 수 있다. 본 발명의 항체는 Nrp2 단백질을 항원으로 하여 면역학 분야에서 널리 알려져 있는 통상의 방법으로 제조할 수 있다.

본 발명에서 "유전자의 발현 억제"에는 유전자 전사의 억제 및 단백질로의 번역 억제가 포함된다. 또한, 유전자 발현이 완전히 정지된 것 뿐 만 아니라 발현이 감소된 것도 포함된다.

유전자의 발현을 억제하는 방법으로는 안티센스 분자를 이용하는 것이 가장 보편적이다. 안티센스 분자가 표적 유전자의 발현을 억제하는 작용으로는 삼중쇄 형성에 의한 전사개시 저해, RNA 폴리머라제에 의해 국부적인 개상 루프 구조가 만들어진 부위에서 하이브리드 형성에 의한 전사 억제, 합성이 진행되고 있는 RNA에서 하이브리드 형성에 의한 전사 저해, 인트론과 엑손과의 접합점에서 하이브리드 형성에 의한 스플라이싱 억제, 스플라이소좀 형성 부위에서 하이브리드 형성에 의한 스플라이싱 억제, mRNA와의 하이브리드 형성에 의한 핵으로부터 세포질로의 이행 억제, 번역 개시인자 결합 부위에서 하이브리드 형성에 의한 번역개시 억제 등이 있다. 이들은 전사, 스플라이싱 또는 번역 과정을 저해하여 표적 유전자의 발 현을 억제한다.

본 발명에 사용되는 안티센스 분자는 상기의 어느 작용으로든지 표적 유전자의 발현을 억제해도 좋다. 대표적인 안티센스 분자로는 3중제, 리보자임(ribozyme), RNAi, 또는 안티센스 핵산 등이 포함된다.

3중제는 이중 나선 DNA 주변을 감아 3 본쇄 나선을 형성하도록 함으로써 전사 개시가 억제되도록 한다(Maher et al., Antisense Res. and Dev., 1(3):227, 1991; Helene, C., Anticancer Drug Design, 6(6):569, 1991).

리보자임은 1 본쇄 RNA를 특이적으로 절단하는 능력을 보유한 RNA 효소이다. 리보자임은 표적 RNA 분자 내 특정 뉴클레오티드 서열을 인식하여 부위 특이적으로 절단시킴으로써 표적 유전자의 단백질 발현을 억제한다(Cech, J. Amer. Med. Assn., 260:3030, 1998; Sarver et al., Science 247:1222-1225, 1990).

RNAi(RNA interference)는 염기서열 특이적으로 작용하는 헤어핀 형태의 소분자의 RNA를 사용하여 전사 수준 혹은 전사 후 수준에서 유전자 발현을 억제시키는 방법이다(Mette et al., EMBO J., 19: 5194-5201, 2000). 상기 RNAi 방법에 사용되는 소분자 RNA는 표적 유전자와 상동성을 가지는 이중가닥 RNA 분자이다.

상기에서 RNA 분자를 제조하는 방법으로는 공지된 화학적 합성 방법 및 효소적 방법을 사용할 수 있다. 예를 들면, RNA 분자의 화학적 합성은 문헌에 개시되어 있는 방법을 사용할 수 있으며(Verma and Eckstein, Annu. Rev. Biochem. 67, 99-134, 1999), RNA 분자의 효소적 합성은 T7, T3 및 SP6 RNA 폴리머라제와 같은 파아지 RNA 폴리머라제를 이용하는 방법이 문헌에 개시되어 있다(Milligan and Uhlenbeck, Methods Enzymol. 180:51-62, 1989).

안티센스 핵산은 표적 mRNA 분자와 적어도 일부분이 상보적인 DNA 또는 RNA 분자를 말한다(Weintraub, Scientific American, 262:40, 1990). 세포 내에서, 안티센스 핵산은 이에 상응하는 mRNA와 혼성화되어 2본쇄 분자를 형성함으로써 표적 유전자의 mRNA 해독을 저해하여 단백질 발현을 억제한다(Marcus-Sakura, Anal. Biochem., 172:289, 1988). 상기 안티센스 핵산은 바람직하게는 올리고뉴클레오타이드 형태로서 당업계에 공지된 임의의 적합한 방법에 의해 제조할 수 있다. 상기 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 화학 합성법, 예를 들어 문헌(Tetrahedron Lett., 1991, 32, 30005-30008)에 기재된 바와 같이 아세토니트릴 중에서 테트라에틸티우람 디술파이드로 황화시키는 포스포아미다이트 화학과 같은 방법에 의해 매우 용이하게 제조할 수 있다.

본 발명에서는 Nrp2 억제제를 어떠한 경로를 통해서든지 투여 가능하다. 따라서, 본 발명의 조성물은 국소 (협측(buccal), 설하, 피부 및 안내의 투여를 포함), 비경구(피하, 피내 근육내, 혈관내 및 관절내의 투여를 포함) 또는 경피성 투여를 포함한 여러 경로를 통해 투여할 수 있다.

한 양태로서, Nrp2 억제제는 적합한 희석제에 현탁시켜 개체에 투여할 수 있는데, 이 희석제는 세포를 보호 및 유지하고, 목적하는 조직에 주입시 사용에 용이하도록 하는 용도로서 사용된다. 상기 희석제는 생리식염수, PBS, HBSS 등의 완충용액, 혈장, 뇌척수액(cerebrospinal fluid, CSF) 또는 혈액성분 등이 있을 수 있 다.

다른 양태로서, Nrp2 억제제는 통상적인 방법에 따라 약제학적으로 허용되는 담체와 혼합하여 사용할 수 있다. 적합한 담체의 예로는, 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸 셀루로오스, 미정질 셀루로오스, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 필요에 따라 상기 조성물에 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제, 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 조성물은 개체에 투여된 후 유효 성분의 신속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 잘 알려진 방법을 사용하여 제형화될 수 있다. 제형은 정제, 분말, 환제, 에멀전, 용액, 시럽, 에어로졸, 연질 또는 경질 젤라틴 캅셀, 멸균 주사용액, 멸균 분말 등의 형태일 수 있다. 상기 제형은 1회용 투약 형태가 편리할 것이다.

본 발명의 조성물은 약제학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에서 "약제학적으로 유효한 양"은 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 질환의 중증도; 환자의 연령, 체중, 건강, 성별; 환자의 약물에 대한 민감도; 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율; 치료 기간; 사용된 본 발명의 조성물과 배합 또는 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 약학적 조성물은 질환의 정도에 따라 유효량을 달리할 수 있으나, 바람직하게는 1~10000㎍/체중kg/day, 더욱 바람직하게는 10~1000㎎/체중kg/day의 유효량으로 하루에 수회 반복 투여될 수 있다.

본 발명에 의하면, 위암 유래 혈관 내피세포에서 특이적으로 과발현되는 표 2에 기재된 유전자의 발현을 mRNA 또는 단백질 수준에서 측정함으로써 위암을 간편하고 효과적으로 진단할 수 있다.

또한, Nrp2 억제제는 신생혈관형성을 억제하여 위암을 치료하는데에도 유용하다.

이하, 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: 재료 및 방법

1-1. 재료

콜라게나제 A 및 엘라스타제는 Roche Applied Science로부터 입수하였다. tosyl-activated Dynabead, CytoCellect Epithelial enriched (BerEP4 항체가 코팅된) 비드, 항-CD14 비드 및 CD45가 코팅된 비드는 모두 Dynal (Lake Success, NY)로부터 구입하였다. 항-사람-CD64 항체는 BD Pharmingen (San Jose, CA)로부터 구입하였고, P1H12 항체는 Chemicon (Temecula, CA)로부터 구입하였다. 항-사람 vWF, CD31, 및 FITC-콘주게이티드 pan CK(cytokeratin) 항체는 Dako (Santa Cruz, CA) 및 Abcam (Cambridge, UK)로부터 각각 구입하였다. 또한, 항-사람 neuropilin 2 (Santa Cruz, CA) 항체가 면역조직화학법에 이용되었다. 다른 시약은 모두 Sigma로부터 입수하였다.

1-2. 사람 조직 표본 및 환자 정보

서울대병원에서 치료받은 9명의 환자로부터 사람 위암 조직과 인접한 정상의 점막의 표본을 수득하였다. 그 대학 병리학 연구실은 상기 환자의 일차 위 암종은 분화도가 낮은 Stage III (TEC1) 또는 Stage IIb (TEC2)라고 판명하였다. 또한, 서울 유방 클리닉(Seoul Breast Clinic)에서 환자로부터 수득한, 침습적 관 암종으로, 핵 등급(nuclear grade) 3으로 진단된 유방암 조직으로부터 EC를 분리하였다. 본 실시예는 서울대학교병원의 임상시험심사위원회(Institutional Review Board)의 허가를 받았다.

1-3. 조직 내피세포의 분리

정상 및 위 암종 종양 EC를 각각의 조직으로부터 Dynabead magnetic bead system (Dynal, Lake Success, NY)을 이용하여 분리하였다. 신선한 위암 조직을 외과적 절제술 후 30분 내에 입수하였다. 정상 조직 시료의 경우에는, 위 점막을 종양의 경계로부터 10cm 떨어진 영역에서 수득하였다. 분리 프로토콜은 공지된 방법(B. St Croix, et al. Science 289 (2000) 1197-1202)을 약간 수정하여 수행하였다. EC 분리를 위해, 잔류 세포는 항-P1H12가 코팅된 magnetic Dynabead를 이용하여 정제하였다. 이 세포가 EC인 것으로 간주하여 젤라틴이 코팅된 접시 상에서 EGM-2 SingleQuots (hVEGF, human epidermal growth factor (hEGF), human fibroblast growth factor (hbFGF), insulin-like growth factor-1 (IGF-1), ascorbic acid, gentamycin, and heparin)와 페니실린, 스트렙토마이신 및 fungizone (PSF; GIBCO)를 포함한 20% 우태아혈청 (Hyclone, Logan, UT)으로 보충된 microvessel EGM-2MV을 위한 EC growth media-2(Clonetics, Walkersville, MD)로 후속 배양되었다. 세포를 37℃ 및 5% CO₂에서 습한 배양기에서 보관하였다.

1-4. 총 RNA 분리 및 DNA 마이크로어레이 분석

총 RNA는 Trizol 시약 (Invitrogen, Gaithersburg, MD)을 가지고 단일 단계 과정을 사용함으로써 배양 세포로부터 분리하였다. 세포를 성장인자를 포함하지 않은 2% FBS를 함유한 EMB(endothelial basal media)에서 16시간 동안 기아시킨 후 용해하여 총 RNA를 추출하였다. 총 RNA의 질은 260/280 nm 비율을 측정한 결과 우수하였고(2.0 이상), 이어서 cDNA 합성 및 제조업자의 설명문(HU133 plus 2, Affymetrix, Inc., Santa Clara, CA)에 따라 칩 혼성화 과정에 이용되었다. 모든 마이크로어레이 데이터는 Affymetrix 웹 사이트인, http://www.affymetrix.com/analysis/index.affx내 NetAffx Analysis Center에서 분석되었다.

1-5. RT-PCR

cDNA는 200 unit의 MMLV-RT (Promega, Madison, WI) 및 500 ng의 16 mer oligo-(dT)를 이용하여 5㎍의 총 RNA로부터 합성되었다. PCR 반응에 이용된 모든 프라이머 서열은 표 1에 나열하였다. 모든 PCR은 thermal cycler (Bio-Rad MJ research PCR, Waltham MA)를 이용하여, 주기 조건은 변성 단계(94℃/ 30초), 어닐링 단계(55℃/30초), 연장 단계(72℃/40초) 및 최종 연장 단계(72℃/10분)이었고, β-액틴의 경우 60℃/30초의 어닐링 단계를 포함하도록 하였다. PCR 산물은 1.5% 아가로스 겔에서 0.5 x TBE 완충액으로 분리하였고 에티듐 브로마이드로 염색하고 UV로 시각화하였다.

1-6. 실시간 RT-PCR

정량적 실시간 RT-PCR은 SYBR-green premix Ex Tag을 이용하여 ABI PRISM 7300 HT (Applied Biosystems)에서 수행하였다. 실시간 RT-PCR 증폭은 공지된 바에 따라 수행하였다(T. Kawakami, et al. Cancer 15 (2002) 2196-2201). FBN2(fibrillin 2)에 대한 프라이머는 포워드: 5'-TGCATGGATGTTGATGAGTG-3'(서열번호 : 1) 및 리버스: 5'-AAACCCTGGGTAGCACAGAC-3'(서열번호: 2), Nrp2(neuropilin2)에 대한 프라이머는 포워드: 5'-ACCGATCCAGAATACCGAAG-3'(서열번호: 3) 및 리버스: 5'-CGGTCCTAGGAGGGTAATCA-3'(서열번호: 4), NOG(noggin)에 대한 프라이머는 포워드: 5'-GCGAGATCAAAGGGCTAGAG-3'(서열번호: 5) 및 리버스: 5'-TAACTTCCTCCGCAGCTTCT-3'(서열번호: 6), COL4A6(collagen, type IV, alpha 6)에 대한 프라이머는 포워드: 5'-CAGTGGGAGCTGTCAGTGTT-3'(서열번호: 7) 및 리버스: 5'-AATCCTTGAGGACCTGTTGG-3'(서열번호: 8), β-액틴에 대한 프라이머는 포워드: 5'-TTGCCGACAGGATGCAGAA-3'(서열번호: 9) 및 리버스: 5'- GCCGATCCACACGGAGTACT-3'(서열번호: 10).

1-7. 유세포 분석

부유 세포를 4% 파라포름알데히드로 고정하고 1% BSA를 함유한 총 100ml의 PBS 용액으로 희석된 일차 항체 1㎍으로 1시간 동안 정치배양하였다. 세포를 1% BSA를 함유한 PBS로 2회 세척하고 적절한 형광으로 접합된 이차 항체의 1:50의 희석액으로 1시간 동안 정치배양하였다. 시료는 FACS Caliber flow cytometer (Beckman)를 사용하여 분석하였다.

1-8. 면역조직화학

사람 종양 조직 어레이 블록에 있는 위암 표본을 면역염색하였다. 동일 블록내에 포함된 정상 점막 및 다른 암 조직이 대조군으로서 이용되었다(Superbiochips, Seoul, Korea). 조직 절편을 탈파라핀화한 후 자일렌 및 에탄올로 재수화하였다. 항-Nrp2 (Santa Cruz, CA) 항체가 이용되었고 1:250으로 희석하여 Vector ABC kit (Vector Laboratories, Burlingame, VA)와 조합하여 면역염색에 이용하였다. 면역염색된 조직은 200x 또는 100x 배율에서 광학 현미경을 이용하여 관찰되었다.

1-9. HUVEC 및 위암세포의 공동 배양

HUVEC 세포 (1x10⁶)를 20% FBS 및 PSF로 보충된 M199 배지를 포함한 60mm 디쉬에 플레이팅하였다. 다음날 아침, 세포를 PBS로 3회 세척하고 1x10⁶ MKN45 세포를 HUVEC을 포함한 플레이트에 스프레딩하였다. 일주일 후에 공동 배양된 세포를 트립신으로 처리하고 마우스 항-사람 P1H12 (CD146) 단클론 항체(Chemicon, Temecula, CA)를 사용하여 Dynabead 선별 방법과 커플링하여 암세포로부터 EC를 분리하였다. P1H12 양성인 세포를 분류하여 1% 젤라틴 코팅된 배양 플레이트 상에 플레이팅하고 20% FBS 및 PSF로 보충된 M199 배지에서 배양하였다.

1-10. 증식 측정법

HUVEC은 젤라틴이 코팅된 96-구판에 2x10³ 세포/구의 농도로 접종하였다. 증식 측정법은 공지된 방법에 따라 수행하였다(M.H. Jung, et al. Carcinogenesis. 2009 in press).

1-11. 세포 이동 측정법

세포 이동 측정도 공지된 방법에 따라 수행하였다(M.H. Jung, et al. Carcinogenesis. 2009 in press). 필터의 상단 표면에 있는 세포를 제거하고 하단부로 이동한 세포를 200x 배율로 광학현미경을 이용하여 계수하였다. 각 시료는 3반복으로 측정되었고 2회 반복되었다.

실시예 2: 결과

2-1. 위 종양 조직 및 정상 점막으로부터 EC의 분리

종양 EC와 정상 세포 간의 분자 수준에서의 차이를 규명하기 위해, 정상 및 악성 위 조직의 혈관으로부터 유래된 EC의 유전자 발현 패턴을 비교하였다. 먼저, 공지된 방법(B. St Croix, et al. Science 289 (2000) 1197-1202)을 약간 수정하여 조직으로부터 EC를 분리하였다. magnetic beads에 코팅된 선별 마커로 다양한 상피세포와 혈액세포를 제거한 (음성적 선별) 후 P1H12 항체로 EC를 라벨링하고 Dynalㄾ magnetic bead purification techniques를 이용하여 분리하였다.

분리된 세포의 성질을 확인하기 위해, FACS 분석 및 RT-PCR을 수행하였다. 도 1A에 나타낸 바와 같이 유세포 분석에 의하면, 분리된 EC에서 vWF 및 P1H12는 발현되는데 반해 상피세포의 마커인 CK(pan-cytokeratine)는 발현되지 않았다. 이는 EC의 순도를 확인한다는 측면에서 중요하고 EC가 위의 상피세포로 오염되지 않았다는 것을 의미한다. 본 발명에서는 이 세포를 종양의 TEC로 및 정상 점막의 NEC로 이용하였다. RT-PCR의 분석은 P1H12, CD105, Jagged-1 및 CD31 (PECAM-1)이 종양 및 정상 조직 유래 EC에서 발현되지만, CD31의 발현은 HUVEC에 비해 TEC 및 NEC에서 보다 낮다는 것을 보여주었다.

위종양 조직 유래 EC에서 TEM이 발현됨을 재확인하였다. TEM 1, 5, 7 및 8의 발현은 NEC에 비해 TEC에서 상향조절되었다. 이는 결장직장암종 유래 EC 결과와 상응하였다. 그러나, TEM1 및 TEM8은 또한 NEC에서 발현되었고, TEM5는 HUVEC에서 검출되었다(도 1C). 상기 결과는 암 조직으로부터 분리된 세포는 EC로 구성되어 있고, 유사한 결장직장암 연구로부터 이미 동정된 TEM을 발현한다는 것을 재확인하였다(B. St Croix, et al. Science 289 (2000) 1197-1202).

2-2. DNA 마이크로어레이 분석으로부터 상향 및 하향 조절된 유전자

Affymetrix 전체 사람 게놈 올리고머 칩을 이용하여, 705개의 프로브 세트가 종양 EC에서 3배 이상 상향 조절되는 한편, 398개의 프로브 세트는 정상 EC에 부재함을 확인하였다. 또한, 4배 이상의 증가가 1088개의 프로브 세트에서 확인된 반면, 447개의 프로브 세트는 종양 EC에 부재함을 확인하였다. 두 경우에 유의 수준이 p<0.001을 갖는 유전자를 선택하였다. 선택된 유전자를 생물학적 기능에 따라 NetAffx 인터넷 홈페이지에 제공된 유전자 온톨로지(Ontology) 분석 프로그램을 사용함으로써 분류하였다. 표 2에 나타낸 바와 같이, TEC에서 상향 조절되는 유전자는 'angiogenesis' (vascular development), 'muscular development' 및 'cellular morphogenesis' 유전자로 분류할 수 있었다. 특이적인 신생혈관형성 조절 유전자는 다른 유전자들 중에서도 Nrp2 (56배, 가장 높음), endothelial cell growth factor (24배) 및 jagged-1 (5배)인 것으로 확인되었다(표 2).

세포간 접착에 관여하는 유전자를 유전자 온톨로지 브라우저를 이용하여 분류하지 않았지만, 이들의 발현도 현저하게 증가되었다. 이 결과 MCAM (P1H12)가 종양 내피세포에서 상향조절된다는 것을 의미한다. MCAM/P1H12/MUC18은 HUVEC에서 발현되고 신생혈관질환 뿐만 아니라 몇몇 공격적인 종양 유형과 연관 있는 신생혈관형성 표현형과 높은 상관관계가 있다. ICAM-1은 26배까지 매우 상향조절되었고, 최근 종양 침습(R. Aalinkeel, et al. Cancer Res. 64 (2004) 5311-5321) 및 신생형관형성(Y.S. Gho, et al. Cancer Res. 61 (2001) 4253-4257)과 관련이 있는 것으로 확인되었다. 또한, 세포외 기질 성분, 특히 collagen type IV alpha 서브유니트가 현저하게 상향조절되었다(α1 9배까지, α2 5배까지, α5 26배까지 및 α6 30배까지). 또한, 세포의 형태형성에 관여하는 많은 유전자가 상향조절되었다. 일부 유전자는 TGF-β2 및 WISP1과 같은 각각 신생형관형성 또는 세포 증식, 또는 p53 및 IGFBP5와 같은 세포 주기 조절 기능과 중첩되는 것으로 확인되었다. 이 모든 유전자가 종양내 혈관의 새로운 구조물을 형성하는데 필수적인 것으로 보여진다. 이러한 데이터는 TEC가 NEC에 비해 더 증식적이고, 이동적이며, 아폽토시스에 저항적인 미성숙 상태임을 의미한다.

2-3. TEC에서 상향조절된 유전자는 위암세포와 공동발현된 EC에서 상향조절되는 것으로 규명되었다.

DNA 마이크로어레이 데이터를 확인하기 위해, TEC에서 현저하게 상향조절된 유전자를 선별하여 RT-PCR을 수행하였다. 9명의 위암 환자로부터 TEC를 분리하였고 6명의 환자로부터 TEC를 배양하는데 성공하였다. 그러나, 시료 중 4개의 RNA 함량은 도 1 및 2A에서 선택된 모든 유전자를 분석하는데 충분하지 않았다. 도 2A에 나타낸 바와 같이, 선택된 유전자의 발현은 NEC에 비해 분리된 TEC에서 증가됨을 알 수 있었다. ephrin B2, Eph A2, Nrp2, plakophillin2, collagen type IV α6, noggin, IGFBP5, ICAM-1, α-actin (심장 근육) 및 transgelin 유전자의 발현은 NEC에 비해 TEC에서 현저하게 높아졌다. 그러나, 두 개의 분리된 TEC는 동일한 발현은 아니지만, 상기 유전자의 유사한 패턴을 보여주었다. 흥미롭게도 Nrp2, Col IV α6, noggin 및 TGFβ2는 HUVEC에서 발현되지 않았지만, ephrin B2, EphA2, ICAM-1, protocadherin 10, plakophillin2, IGFBP5 및 α-actin (심장 근육)은 HUVEC에서 발현됨으로써, HUVEC의 활성 특징이 TEC와 유사함을 알 수 있었다. 따라서, HUVEC 및 위암세포의 공동 배양 실험 분석에서 상기 중첩된 유전자를 배제하였다.

종양 미세환경이 정상 EC에서 관찰된 유전자 발현 패턴을 변화시킬 수 있는지 여부를 동정하기 위해, 생체외 종양 미세환경을 모방한 실험 조건을 설정하였다. 이를 위해, HUVEC를 MKN45 위암세포와 직접 공동배양하고, 대조군 HUVEC에서 관찰된 유전자 발현 패턴과 비교하였다. 흥미롭게도, TEC에서 상향조절된 유전자는 공동 배양된 EC에서도 상향조절되었다. 특히, Nrp 2, transgelin 및 type IV collagen의 발현이 공동 배양된 EC에서 현저하게 증가되었다(도 2B). 특히 공동배양된 EC에서 Nrp2의 발현이 가장 높게 상향조절되었다. 정량적 실시간 RT-PCR 데이터는 RT-PCR에서 수득한 데이터와 유사하였다(도 2C). TEC 및 공동 배양된 EC RT-PCR 데이터를 분석한 후 팔로우업(follow-up) 유전자로서 Nrp2를 선택하였다.

2-4. Nrp2는 위암 미세혈관 내피세포 라이닝(lining)에서 특이적으로 발현된다.

TEC 및 위암 세포와 공동발현된 EC에서 상향 조절되는 Nrp2의 발현 패턴을 조사하였다. 조직 어레이 슬라이드를 이용하여 위암 조직과 다양한 다른 암 조직에 대해 면역조직화학을 수행하였다. Nrp2는 정상 위 점막의 NEC에서는 발현하지 않은 반면(도 3A), 위암 환자 조직의 EC 라이닝에서는 강하게 염색, 즉 발현되었다(도 3B 및 C). 유방암, 간암 및 콩팥 세포 암종 조직의 종양 미세혈관에서, Nrp2가 발현되었다(도 3D, E 및 F). 그러나, 정상 유방 조직의 관 상피세포 뿐 아니라 EC에서 Nrp2가 발현된 반면(도 3G), 정상 간 조직의 EC에서는 Nrp2 발현이 검출되지 않았다(도 3H). 정상 콩팥의 수질 조직에서, Nrp2 발현은 원위곡세관에서 높았으나, EC에서는 그렇지 않았다(도 3I). 이러한 결과로부터, Nrp2는 위암에서 종양 혈관 EC 마커이고, 모든 유형의 암의 EC에서 발현되지는 않는다는 것을 알 수 있다.

2-5. Nrp2는 VEGF에 의해 촉진된 증식과 이동을 증가시킨다.

종양 특이적 EC에서 Nrp2를 기능적으로 분석하기 위해, MNK45 위암세포와 공동배양된 HUVEC을 이용하였다. VEGF 및 bFGF로 자극한 후 공동배양된 EC에 대한 증식 측정법을 수행하였을 때, VEGF에 의해 유도된 증식은 3.5배까지 현저하게 증가되었지만, bFGF에 의해 유도되는 증가는 관찰되지 않았다(도 4A). 또한, 공동 배양된 EC의 VEGF에 의해 촉진된 이동은 조작되지 않은 HUVEC로 관찰된 경우보다 현저하게 증가되었다(도 4B).

발현 분석 결과를 재확인하기 위해, HUVEC을 전장 Nrp2 발현 벡터로 형질감염하였다. VEGF 자극에 반응하여 Nrp2로 형질감염된 HUVEC은 모방 벡터로 형질감염된 HUVEC에 비해 더 높은 증식율을 보였다(도 5A). 또한, Nrp2 과발현은 VEGF에 의해 유도된 HUVEC의 이동을 현저하게 증가시켰다(도 5B). 그러나, Nrp2 과발현 또는 종양세포와 EC의 공동발현이 VEGF 수용체 발현율에서 증가를 초래한다면, 도 4, 5A 및 5B에 나타낸 데이터는 VEGF 반응에서의 자연적 증가에 의해 유도될 수 있다. 이러한 가능성을 배제하기 위해, 종양 세포와 공동 발현된 HUVEC 및 Nrp2 과발현 세포에서 VEGFRs 및 Nrps의 발현양을 확인하였다. VEGFR1, -R2 및 -R3 및 Nrp1 mRNA의 발현은 공동 발현 또는 Nrp2 과발현에 의해서 달라지지 않았다(도 5C). 실제로, VEGF-R3은 정상 HUVEC에서 발현되지 않았다(도 5C).

TEC에서 Nrp2 발현은 VEGF-C 반응성을 조절하는지 여부를 조사하였다. 대조군 HUVEC, MKN45 위암세포와 공동발현된 EC 또는 Nrp2 과발현 HUVEC이 VEGF-C로 처리되었을 때, 세포의 증식율과 이동능은 대조군 HUVEC에 비해 공동 발현된 EC 및 Nrp2 과발현 시료에서 증가하였다(도 5D). 그러나, 반응성은 VEGF-A(3배 이상, 도 4) 보다 더 적었다(약 1.6배). 이 결과는 Nrp2의 TEC 과발현은 VEGF에 반응하여 EC 증식과 이동을 증가시켜, 공격적인 종양 신생혈관형성 표현형으로 이어진다는 것을 의미한다.

도 1은 위 종양 조직 및 정상 점막 유래 내피세포에서 내피세포 특이적 마커 및 TEM(tumor endothelial marker)의 발현을 나타낸 것이다.

도 2는 TEC 및 위암세포와 공동배양된 내피세포에서 마이크로어레이로부터 상향 조절된 유전자의 발현을 나타낸 것이다.

도 3은 다양한 종양 조직에서 Nrp2의 면역조직화학적 위치를 나타낸 것이다.

도 4는 위암세포와 공동발현된 EC의 증식 및 이동을 나타낸 것이다.

도 5는 Nrp2 과발현 내피세포의 증식 및 이동을 나타낸 것이다.

<110> Kyungbuk National University Industry-Academic Cooperation Foundation <120> Usage of Neuropilin2 for Diagnosis and Treatment of Gastric Cancer <160> 10 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 tgcatggatg ttgatgagtg 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 aaaccctggg tagcacagac 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 accgatccag aataccgaag 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 cggtcctagg agggtaatca 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 gcgagatcaa agggctagag 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 taacttcctc cgcagcttct 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 cagtgggagc tgtcagtgtt 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 aatccttgag gacctgttgg 20 <210> 9 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 9 ttgccgacag gatgcagaa 19 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 10 gccgatccac acggagtact 20

Claims (11)

1. 뉴로필린 2(Neuropilin 2) 유전자의 mRNA 또는 단백질 수준을 측정하는 제제를 포함하는 위암 진단용 조성물.
2. 제 1항에 있어서,

   상기 mRNA 수준을 측정하는 제제는 뉴로필린 2 유전자에 특이적인 프라이머 쌍 또는 프로브인 것을 특징으로 하는, 조성물.
3. 제 1항에 있어서,

   상기 단백질 수준을 측정하는 제제는 뉴로필린 2 유전자의 단백질에 특이적인 항체인 것을 특징으로 하는, 조성물.
4. 삭제
5. 삭제
6. 삭제
7. 삭제
8. 삭제
9. 뉴로필린 2(Neuropilin2)의 억제제로 뉴로필린 2에 대한 항체를 함유하는 것을 특징으로 하는 위암 치료용 약제학적 조성물.
10. 뉴로필린 2(Neuropilin2)의 억제제로 뉴로필린 2의 유전자에 대한 안티센스 분자를 함유하는 것을 특징으로 하는 위암 치료용 약제학적 조성물.
11. 제 10항에 있어서,

    상기 뉴로필린 2의 유전자에 대한 안티센스 분자는 3중제, 리보자임, RNAi 또는 안티센스 핵산인 것을 특징으로 하는 위암 치료용 약제학적 조성물.

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