KR20200110852A

KR20200110852A - 유사분열억제제 저항성 암의 진단에 유용한 정보를 제공하는 방법

Info

Publication number: KR20200110852A
Application number: KR1020190030298A
Authority: KR
Inventors: 김재훈; 채두병; 양우겸; 신하연
Original assignee: 연세대학교 산학협력단
Priority date: 2019-03-18
Filing date: 2019-03-18
Publication date: 2020-09-28

Abstract

본 발명은 유사분열억제제 저항성 암의 진단에 유용한 정보를 제공하는 방법에 관한 것이다.
암은 전세계적으로 가장 보편적인 사망원인 중의 하나로, 효과적인 항암제를 개발하고자 하는 노력이 지속되어 왔고, 보다 효과적으로 암세포를 사멸시키는 항암제가 다수 개발되었다. 그러나 암의 특성에 따라 효과를 보이는 항암제가 상이하므로, 암 치료를 위한 항암제 선택에 어려움이 있는 실정이다.
본 발명은 유사분열억제제 저항성 암의 진단에 유용한 정보를 제공하는 방법에 관한 것으로, 본 발명의 방법은 항암제 중에서도 유사분열억제제 계열의 약제에 저항성을 나타내는 암을 진단하는 것이 가능하므로, 암 치료 분야에서 크게 활용될 것으로 기대된다.

Description

유사분열억제제 저항성 암의 진단에 유용한 정보를 제공하는 방법{Method for provide useful information to diagnose resistive cancer to mitotic inhibitor}

본 발명은 유사분열억제제 저항성 암의 진단에 유용한 정보를 제공하는 방법에 관한 것이다.

암은 전세계적으로 가장 보편적인 사망원인 중의 하나이다. 약 천만 건의 새로운 케이스가 매년 발생하며, 전체 사망원인의 약 12%를 차지하여 세 번째로 많은 사망의 원인이 되고 있다. 따라서 효과적인 항암제를 개발하고자 하는 노력이 지속되어 왔고, 보다 효과적으로 암세포를 사멸시키는 항암제가 다수 개발되었으나, 암의 특성에 따라 효과를 보이는 항암제가 상이하여 문제가 되고 있다. 예를 들면 난소암의 경우, 상피종양, 생식세포 종양, 및 성기삭간질성 종양으로 구분되고, 상피종양은 다시 장액성 종양, 점액성 종양, 자궁내막양 종양, 투명세포암, 및 기타암으로 구분되는데, 같은 투명세포암이라도 어느 경우에는 유사분열억제제에 감수성을 나타내고, 어느 경우에는 저항성을 나타내므로, 암 치료를 위한 항암제 선택에 어려움이 있는 실정이다(PLoS One. 2014 Nov 6;9(11):e112438. PubMed PMID: 25375122). 암세포는 분열이 빠르고 암이 진행될수록 다른 장기로의 전이 위험이 증가하기 때문에, 암 치료는 초기 대응이 중요하다. 그러나 특정 항암제에 대한 암의 반응성을 사전에 예측할 수 있는 방법이 부재하므로 환자에게 반응성이 미비한 항암제를 투여하게 되면, 그 기간 동안의 암 치료는 실패하고 나아가 암이 더 진행되므로, 환자 맞춤형 항암제를 선택할 수 있도록 사전에 특정 항암제에 대한 암의 반응성을 예측할 수 있는 기술의 개발이 시급하다고 할 것이다.

따라서 본 발명은 상기와 같은 종래의 기술상의 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로, 유사분열억제제 저항성 암의 진단에 유용한 정보를 제공하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 방법은 항암제 중에서도 유사분열억제제 계열의 약제에 저항성을 나타내는 암을 진단하는 것이 가능하므로, 암 치료 분야에서 크게 활용될 것으로 기대된다.

본 발명은 상기와 같은 종래의 기술상의 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로, 유사분열억제제 저항성 암의 진단에 유용한 정보를 제공하는 방법에 관한 것이다.

그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당 업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

이하, 본원에 기재된 다양한 구체예가 도면을 참조로 기재된다. 하기 설명에서, 본 발명의 완전한 이해를 위해서, 다양한 특이적 상세사항, 예컨대, 특이적 형태, 조성물 및 공정 등이 기재되어 있다. 그러나, 특정의 구체예는 이들 특이적 상세 사항 중 하나 이상 없이, 또는 다른 공지된 방법 및 형태와 함께 실행될 수 있다. 다른 예에서, 공지된 공정 및 제조 기술은 본 발명을 불필요하게 모호하게 하지 않게 하기 위해서, 특정의 상세사항으로 기재되지 않는다. "한 가지 구체예" 또는 "구체예"에 대한 본 명세서 전체를 통한 참조는 구체예와 결부되어 기재된 특별한 특징, 형태, 조성 또는 특성이 본 발명의 하나 이상의 구체예에 포함됨을 의미한다. 따라서, 본 명세서 전체에 걸친 다양한 위치에서 표현된 "한 가지 구체예에서" 또는 "구체예"의 상황은 반드시 본 발명의 동일한 구체예를 나타내지는 않는다. 추가로, 특별한 특징, 형태, 조성, 또는 특성은 하나 이상의 구체예에서 어떠한 적합한 방법으로 조합될 수 있다.

명세서에서 특별한 정의가 없으면 본 명세서에 사용된 모든 과학적 및 기술적인 용어는 본 발명이 속하는 기술분야에서 당업자에 의하여 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다.

본 발명의 일 구체예에서 “암”이란, 제어되지 않은 세포성장으로 특징지어지며, 이러한 비정상적인 세포성장에 의해 종양이라고 불리는 세포 덩어리가 형성되어 주위의 조직으로 침투하고 심한 경우에는 신체의 다른 기관으로 전이되기도 하는 것을 말한다. 학문적으로는 신생물이라고 명명되기도 한다. 암은 수술, 방사선 및 화학요법으로 치료를 하더라도 많은 경우에 근본적인 치유가 되지 못하고 환자에게 고통을 주며 궁극적으로는 죽음에 이르게 하는 난치성 만성질환으로, 암의 발생요인으로는 여러 가지가 있으나, 내적 요인과 외적 요인으로 구분한다. 정상세포가 어떠한 기전을 거처 암세포로 형질전환이 되는지에 대해서는 정확하게 규명되지 않았으나, 상당수의 암이 환경요인 등 외적인자에 의해 영향을 받아 발생하는 것으로 알려져 있다. 내적 요인으로는 유전 인자, 면역학적 요인 등이 있으며, 외적 요인으로는 화학물질, 방사선, 바이러스 등이 있다. 암의 발생에 관련되는 유전자에는 종양형성유전자(oncogenes)와 종양억제유전자(tumor suppressor genes)가 있는데, 이들 사이의 균형이 위에서 설명한 내적 혹은 외적 용인들에 의해 무너질 때 암이 발생하게 된다. 암은 그 발생 부위에 따라 구강암, 간암, 위암, 결장암, 유방암, 폐암, 골암, 췌장암, 피부암, 두부암, 경부암, 피부암, 자궁경부암, 난소암, 대장암, 소장암, 직장암, 나팔관암종, 항문부근암, 자궁내막암종, 질암종, 음문암종, 호지킨병(Hodgkin's disease), 식도암, 임파선암, 방광암, 담낭암, 내분비선암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 전립선암, 만성 백혈병, 급성 백혈병, 림프구 림프종, 신장암, 수뇨관암, 신장세포암종, 신장골반암종, 중추신경계 종양, 1차 중추신경계 림프종, 척수 종양, 뇌간 신경교종 및 뇌하수체 선종으로 구분할 수 있으나, 이에 한정하는 것은 아니다.

특히 상기의 난소암은 크게 상피종양(common epithelial tumors), 생식세포 종양, 및 성기삭간질성 종양(sex cord stromal tumors)으로 구분 가능하고, 상기의 상피종양은 장액성 종양(serous tumors), 점액성 종양(mucinous tumors), 자궁내막양 종양(endometrioid tumors), 및 투명세포암(clear cell tumors)으로 구분 가능하며, 상기의 생식세포 종양은 미분화세포종(dysgerminoma), 기형종(teratoma), 내배엽동 종양(endodermal sinus tumor), 및 기타로 구분 가능하며, 상기의 성기삭간질성 종양은 과립막기질세포 종양, 남성화배세포 종양, 남녀성세포함유종, 및 기타로 구분 가능하다. 상피종양성 난소암 분류에서 투명세포암은 세포질 안에 투명한 물질이 채워져 있어 투명세포암으로 불리우는데, 특징적인 종양표지자가 없고 암세포 자체가 투명해 혈액을 이용한 검사, CT, MRI, 및 PET-CT에서 정상 소견으로 오진되는 경우가 많으므로 주의가 필요하다.

특히 암 치료가 어렵고, 예후가 좋지 못한 것으로 알려져 있으므로, 효과적인 치료 방법의 개발이 요구된다.

본 발명의 일 구체예에서 “암 줄기세포(cancer stem cell)”란, 줄기세포 특유의 능력인 자가재생이나 분화능력을 가지고 있는 포괄적인 의미의 암세포를 의미하며, 예를 들어 구(sphere) 형태의 암세포 집단이나, 형태가 불분명하고 예후가 좋지 않은 암 조직을 포함할 수 있다. 상기 암 줄기세포의 정상적인 종양 생장 조건(상기 "정상적인 종양의 생장 조건"이란 세포 성장에 필요한 영양분(포도당)이 충분하고 종양미세환경의 생장 여건이 풍족하여 세포 스트레스가 없는 상태를 칭한다.)에서 일반적인 암세포와 상이하게 느린 속도로 증식하거나 휴지기(dormant state) 상태를 유지하여 항암제에 대한 저항성을 가지고 있을 수 있으며, 예를 들어, PGC-1a 등의 전사조절인자의 발현이 정상적인 종양세포와 달리 통제되어 주요 대사조절물질의 기능이 일반 암세포와 비교하여 상이할 수 있다. 이러한 상이한 대사조절 능력과 이에 기전(mechanism)적으로 연계된 세포신호전달계의 조절을 통해 영양 결핍 상태에서 세포 사멸(apoptosis)에 대한 저항성을 획득하고 침윤 및/또는 전이능이 있는 세포를 포괄적으로 지칭한다. 그러나 일반적인 암세포로 분화할 수 있는 세포라면 이에 제한되지 않는다.

최근까지 개발된 항암제들은 대부분 일반적인 암세포를 표적으로 하는 것으로, 암환자의 치료내성 및 재발에 중요한 역할을 하는 암 줄기세포의 사멸에는 효과적이지 못하다. 암 치료 후에도 체내에 암 줄기세포가 남게 되면 암의 재발 및 /또는 전이가 활발히 일어나므로, 암 줄기세포 치료제 개발은 시급한 과제라고 할 것이다.

본 발명의 일 구체예에서 "암 줄기세포 치료”란, 암 줄기세포의 사멸, 암 줄기세포 유지(maintenance) 억제, 암 줄기세포 악성화(malignance) 억제, 및 암 줄기세포 침윤활성(invasive) 억제를 포함하는 의미이다.

본 발명의 일 구체예에서 “항암제”란, 악성종양의 치료를 위하여 사용되는 화학요법제의 총칭이다. 주로 DNA에 직접 작용하여 DNA의 복제, 전사, 번역과정을 차단하거나 대사경로에 핵산 전구체의 합성을 방해하고 세포분열을 저해함으로써 항암활성, 즉 암세포에 대한 세포 독성을 나타내는 약제를 총칭한다. 현재 암치료에 사용되고 있는 항암제는 생화학적인 작용 기전에 따라 크게 하기 5개의 범주로 분류하고 있다.

(1) Direct DNA-interacting agents: DNA에 직접 작용하는 약제로 ①알킬화제, ②항암성항생물질, ③토포이소머라제 억제제로 구분 가능하다.

① 알킬화제(alkylating agent)-어떤 화합물에 알킬기 R-CH2를 도입할 능력을 갖춘, 반응성이 대단히 높은 물질로 세포에 작용시키면 대부분은 DNA의 구아닌의 N7과 반응하여 DNA구조를 변형시키고, 사슬절단을 일으켜 항암효과 및 세포독성 효과를 나타낸다. 여기에 속하는 약물로는 Cyclophosphamide, Mechlorethamine, Chlorambucil, Melphalan, Carmustine(BCNU), Lomustine(CCNU), Ifosfamide, Procarbazine, Dacarbazine(DTIC), Temozolomide, Altretamine(formerly hexamethylmelamine), Cisplatin, Carboplatin, Oxaliplatin 등이 있다.

② 항암성항생물질(antitumor antibiotics)-세균에서 생산되는 항생물질 가운데 항암작용을 나타내는 것으로 주로 염기쌍 사이에 끼어들어 DNA 나선을 푸는 작용을 한다. 여기에 속하는 약물로는 Bleomycin, Actinomycin D, Mitomycin C, Etoposide(VP16-213), Doxorubicin and daunorubicin, Idarubicin, Epirubicin, Mitoxantrone 등이 있다.

③ 토포이소머라제 억제제(topoisomerase inhibitors) 등-DNA는 이중나선 구조로 이루어져 염색체 내에 밀집되어 있는데 DNA가 복제되고 세포분열을 하기 위해서는 이러한 이중나선 구조가 완화되어야 한다. 토포이소머라제는 이 때 필요한 효소로서, 이중나선 구조 완화에 작용한다. 여기에 속하는 약물로는 Topotecan, Irinotecan(CPT II) 등이 있다.

(2) 대사길항제(antimetabolites): 이 군(群)에 속하는 약물은 암세포의 증식에 필요한 대사과정을 저해하는 작용을 나타낸다. 여기에 속하는 약물로는 Deoxycoformycin, 6-Mercaptopurine, 6-Thioguanine, Azathioprine, 2-Chlorodeoxyadenosine, Hydroxyurea, Methotrexate, 5-Fluorouracil, Capecitabine, Cytosine arabinoside, Azacytidine, Gemcitabine, Fludarabine phosphate, Asparaginase, Pemetrexed 등이 있다.

(3) 유사분열억제제: 이들 약물은 분열시기 특이성 약물이고, 튜불린에 작용하는 약물군이다. 유사분열 시기 중 중기(metaphase)에서 튜불린(tubulin)에 작용하여 mitotic spindle inhibitor의 역할을 하는 제제로서 세포분열을 중지시킨다. 빈가 알칼로아드(vinca alkaloid)와 탁센(taxane)이 해당된다. 여기에 속하는 약물로는 Vincristine, Vinblastine, Vinorelbine, Paclitaxel, Docetaxel, Estramustine phosphate, NAB-Paclitaxel (protein bound) 등이 있다.

(4) 호르몬제: 어떤 종류의 암은 호르몬을 투여함으로써 치료효과를 볼 수 있는데, 대부분의 항종양 호르몬제는 스테로이드계의 기능적 작용제이거나 길항제이다. 남성호르몬을 사용하는 경우는 유방암, 여성호르몬은 전립선암, 프로게스테론은 자궁내막암에 효과가 있으며, 부신피질호르몬은 급성림프성 백혈병이나 림프종의 치료에 사용한다. 여기에 속하는 약물로는 tamoxifen, Aromatase 저해제, Leuprolide, Bicalutamide, flutamide, nilutamide, Octreotide 등이 있다.

(5) 기타: 그 밖에 분류하기 어려운 여러 다른 기전의 약물이 존재하는데, 그 예로 Arsenic trioxide 등이 있다.

효과적인 항암제 개발에 대한 지속적인 노력에도 불구하고, 현재 선두적인 치료는 수술, 방사선 및 화학요법 등이 주종을 이룬다. 화학요법적인 접근은 전이성이거나 특별히 공격적인 암을 치료하는데 주로 사용된다.

현재 임상적으로 사용되는 대부분의 암화학요법 약제는 세포독소(cytotoxins)이다. 세포독성제는 빠른 성장을 보이는 세포들에 해를 입히거나, 살해함으로써 작용하게 된다. 이상적인 세포독성제는 암 및 종양 세포들에 특이성을 가지고 있는 반면, 정상 세포에는 영향을 미치지 않아야 한다. 그러나 이러한 이상적인 세포독성제는 현재까지 발견되지 않았으며, 대신 특별히 빠르게 분화하는 세포들(종양 세포 및 정상 세포 모두)을 타겟으로 하는 약제가 사용되고 있을 뿐이다. 따라서, 정상 세포들에게는 단지 가벼운 효과를 미치면서, 암세포에게는 세포독성이 있는 물질들이 매우 바람직하다. 따라서, 종양세포들(tumor cells)의 증식을 특히 억제할 수 있는 대안적인 항암물질의 개발이 필요하며, 암이 발생하는 원발 장기의 특성이 상이하므로, 각 조직의 특징과 분화된 암 자체의 특성을 반영하는 맞춤형 항암제의 개발이 요구된다.

본 발명의 일 구체예에서 “전이”란, 암세포가 원발장기를 떠나 다른 장기로 가는 것이며, 상기의 “암”이란 “암 줄기세포”를 포함하는 의미이다. 암이 신체의 다른 부분으로 퍼지는 것은 크게 원발암에서 암조직이 성장하여 직접적으로 주위장기를 침윤하는 것과 멀리 있는 다른 장기로 혈관이나 림프관을 따라 원격전이를 하는 것으로 나눈다. 전이는 암 발생과 관련된 유전자의 발현 억제 또는 상기 유전자의 단백질 활성 억제를 통해 조절될 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서 “약학조성물”이란, 특정한 목적을 위해 투여되는 조성물을 의미한다. 본 발명의 목적상, 본 발명의 약학조성물은 유사분열억제제 저항성 암의 치료를 위해 투여되는 것이고, 이에 관여하는 화합물 및 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 포함할 수 있다. 본 발명에 따른 약학 조성물은 조성물 총 중량에 대하여 본 발명의 유효성분을 0.1 내지 50 중량%로 포함한다. 본 발명의 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 일 구체예에서 “치료”란, 목적하는 질병의 완화 또는/및 개선을 위해 수행되는 일련의 활동을 의미한다. 본 발명의 목적상 치료는 유사분열억제제 저항성 암세포의 수적 또는 양적 증식을 억제시키거나, 암세포를 사멸시키거나, 암 조직의 성장을 억제시키거나, 암 조직의 크기를 감소시키거나, 암 조직 내의 신생혈관의 발달을 억제시키는 활동을 포함한다.

본 발명의 일 구체예에서 “진단”이란, 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미하며, 본 발명의 목적상 진단은 유사분열억제제 저항성 암의 발병 유무, 증식 여부 및 전이 여부를 확인하는 것이며, 상기의 “암”이란 “암 줄기세포”를 포함하는 의미이다. 암 발병 또는 전이 의심 환자로부터의 조직의 육안적 또는 세포학적 확인으로 암을 진단할 수 있으며, 암 발병 또는 전이 의심 조직의 검체(임상적으로는 세포, 혈액, 수액, 흉수, 복수, 관절액, 농(膿), 분비액, 담, 인두점액, 요(尿), 담즙, 대변등) 내에 포함되어 있는 암 대응 항체를 이용하는 방법, 상기 검체 내 암 관련 단백질을 직접 검출하는 방법 또는 암 관련 단백질을 코딩하는 핵산을 직접 검출하는 방법으로 암을 진단할 수 있다. 항원-항체 결합 또는 암 관련 단백질을 직접 검출하는 방법을 이용한 진단적 수단으로는 웨스턴 블랏, ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석(RIA: Radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion), 오우크테로니(Ouchterlony) 면역 확산법, 로케트(rocket) 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법(Immunoprecipitation Assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay), 유세포분석(Fluorescence Activated Cell Sorter, FACS), 단백질 칩(protein chip) 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 암 관련 단백질을 코딩하는 핵산을 직접 검출하는 방법으로는 역전사 중합효소반응(RT-PCR), 경쟁적 역전사 중합효소반응(Competitive RT-PCR), 실시간 역전사 중합효소반응(Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA; RNase protection assay), 노던 블랏팅(Northern blotting) 또는 DNA 칩 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 일 구체예에서 “투여”란, 어떠한 적절한 방법으로 환자에게 본 발명의 조성물을 도입하는 것을 의미하며, 본 발명의 조성물의 투여경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 경구 투여, 복강 내 투여, 정맥 내 투여, 근육 내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 비내 투여, 폐내 투여, 직장내 투여, 강내 투여, 복강 내 투여, 경막 내 투여가 이루어질 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 본 발명에서 유효량은 질환의 종류, 질환의 중증도, 조성물에 함유된 유효 성분 및 다른 성분의 종류 및 함량, 제형의 종류 및 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자에 따라 조절될 수 있다. 성인의 경우, 상기 치료용 약학조성물을 1회 50ml~500ml의 양으로 체내에 투여 가능하며, 화합물일 경우 0.1ng/kg-10㎎/kg, 모노클로날 항체일 경우 0.1ng/kg-10㎎/kg의 용량으로 투여될 수 있다. 투여간격은 1일 1회 내지 12회일 수 있으며, 1일 12회 투여할 경우에는 2시간마다 1회씩 투여할 수 있다. 또한 본 발명의 약학조성물은 목적하고자 하는 암 줄기세포의 치료를 위해 단독 또는 당업계에 공지된 다른 치료법, 예를 들어 화학요법제, 방사선 및 수술과 같이 투여될 수 있다. 또한 본 발명의 약학조성물은 면역 반응을 증진하기 위하여 고안된 다른 치료, 예를 들어 당업계에 주지된 것과 같은 어쥬번트 또는 사이토카인(또는 사이토카인을 코딩하는 핵산)과 혼합하여 투여될 수 있다. 바이오리스틱(biolistic) 전달 또는 생체 외(ex vivo) 처리와 같은 다른 표준 전달 방법들이 사용될 수도 있다. 생체 외 처리에서 예를 들어 항원제시 세포들(APCs), 수지상세포들, 말초혈액 단핵구 세포들, 또는 골수세포들을 환자 또는 적당한 공여자로부터 얻어서 본 약학조성물로 생체 외에서 활성화된 후 그 환자에게 투여될 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서, 난소암 시료에서 RGL3, EPS8L1, S100A1, TSPAN1, MAPK15, 및 MSLN으로 이루어진 군으로부터 선택된 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계;를 포함하는 난소암 진단에 관한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.

상기 RGL3의 발현 수준이 자궁내막, 또는 자궁내막증 시료에서의 RGL3 발현 수준보다 유의하게 높을 경우에, 상기 난소암을 투명세포 난소암으로 결정할 수 있다.

상기 EPS8L1의 발현 수준이 자궁내막, 또는 자궁내막증 시료에서의 EPS8L1 발현 수준보다 유의하게 높을 경우에, 상기 난소암을 투명세포 난소암으로 결정할 수 있고, 나아가 상기 투명세포 난소암은 유사분열억제제 저항성 투명세포 난소암인 것으로 결정할 수 있다.

상기 S100A1의 발현 수준이 자궁내막, 또는 자궁내막증 시료에서의 S100A1 발현 수준보다 유의하게 높을 경우에, 상기 난소암을 투명세포 난소암으로 결정할 수 있고, 나아가 상기 투명세포 난소암은 유사분열억제제 저항성 투명세포 난소암인 것으로 결정할 수 있다.

상기 TSPAN1의 발현 수준이 자궁내막, 또는 자궁내막증 시료에서의 TSPAN1 발현 수준보다 유의하게 높을 경우에, 상기 난소암을 투명세포 난소암으로 결정할 수 있고, 나아가 상기 투명세포 난소암은 유사분열억제제 저항성 투명세포 난소암인 것으로 결정할 수 있다.

상기 MAPK15의 발현 수준이 자궁내막, 또는 자궁내막증 시료에서의 MAPK15 발현 수준보다 유의하게 높을 경우에, 상기 난소암을 투명세포 난소암으로 결정할 수 있고, 나아가 상기 투명세포 난소암은 유사분열억제제 저항성 투명세포 난소암인 것으로 결정할 수 있다.

상기 MSLN의 발현 수준이 자궁내막, 또는 자궁내막증 시료에서의 MSLN 발현 수준보다 유의하게 높을 경우에, 상기 난소암을 투명세포 난소암으로 결정할 수 있고, 나아가 상기 투명세포 난소암은 유사분열억제제 저항성 투명세포 난소암인 것으로 결정할 수 있다.

이하 상기 본 발명을 단계별로 상세히 설명한다.

효과적인 항암제를 개발하고자 하는 노력이 지속되어 왔고, 보다 효과적으로 암세포를 사멸시키는 항암제가 다수 개발되었으나, 암의 특성에 따라 효과를 보이는 항암제가 상이하므로, 암 치료를 위한 항암제 선택에 어려움이 있는 실정이다.

본 발명은 유사분열억제제 저항성 암의 진단에 유용한 정보를 제공하는 방법에 관한 것으로, 본 발명의 방법은 항암제 중에서도 유사분열억제제 계열의 약제에 저항성을 나타내는 암을 진단하는 것이 가능하므로, 암 치료 분야에서 크게 활용될 것으로 기대된다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른, 자궁내막증, 비전형적 자궁내막증, 난소암 주위의 자궁내막증, 또는 난소암 시료의 조직학적 형태를 나타낸 도이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른, 자궁내막증, 비전형적 자궁내막증, 난소암 주위의 자궁내막증, 및 난소암 시료의 DEG 분석을 벤 다이어그램으로 나타낸 도이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른, 자궁내막증, 비전형적 자궁내막증, 난소암 주위의 자궁내막증, 및 난소암 그룹간에 의미 있게 변화되는 유전자 25개의 발현양 차이를 나타낸 도이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른, 8가지로 구분된 상기 25개 유전자의 온톨로지(Gene ontology)를 나타낸 도이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른, 총 9종류의 자궁내막, 자궁내막증, 또는 난소암 세포주로부터 S100A1, PKP3, TSPAN1, MAPK15, MSLN, CDK2AP2, RGL3, EPS8L1, B3GNT3, 및 KRT7의 발현량 차이를 Real-time PCR로 확인한 결과를 나타낸 도이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1. 난소암 시료로부터 RNA 추출, 및 시퀀싱 수행

한국 강남세브란스병원에서 자궁내막증(Benign endometriosis), 비정형적 자궁내막증(Atypical endometriosis) 및 난소암(Ovarian cancer) 진단을 받은 환자의 파라핀 블록을 확보하였고, 레이저 미세절편기 장비를 이용하여 각각의 해당 병변만을 오려내어, 이로부터 RNA를 추출하였다. 난소암의 경우 투명세포(Clear), 및 자궁내막모양(Endometrioid) 타입만을 사용하였고 암조직 주위의 자궁내막증 병변도 같이 RNA를 확보하였다. 총 66개의 RNA 시료로부터 RNA 시퀀싱을 진행하였고, 총 4개의 그룹으로 분류하였다. 상기 66개의 RNA 시료의 특징과 그룹화 결과를 표 1과 표 2에 기재하였고, 대표 시료의 H&E 염색 결과를 도 1에 나타내었다.

Characteristic	Benign endometriosis n = 9 13.60%	Atypical endometriosis n = 18 27.30%	Adjacent endometriosis n = 10 15.20%	Ovarian Cancer n = 29 43.90%
Age at presentation(years), mean(SD)	27.78 (5.74)	40 (6.6)	44.8 (9.6)	45.62 (10.5)
Histology of cancer, n(%)
Clear cell	N/A	N/A	N/A	17 (58.6%)
Endometrioid	N/A	N/A	N/A	12 (41.4%)
FIGO stage of cancer, n(%)
Ⅰ/Ⅱ	N/A	N/A	N/A	16 (55.8%)
Ⅲ/Ⅳ	N/A	N/A	N/A	3 (10.3%)
Recurrent	N/A	N/A	N/A	5 (17.2%)
Tumor grade, n(%)
1	N/A	N/A	N/A	5 (17.2%)
2	N/A	N/A	N/A	2 (6.9%)
3	N/A	N/A	N/A	12 (41.4%)
x	N/A	N/A	N/A	4 (13.8%)
N/A; not applicable

Group
A	Benign endometriosis	n = 9
B	Atypical endometriosis	n = 18
C	Adjacent endometriosis to ovarian cancer(Clear, Endometrioid)	n = 10
D	Ovarian cancer (Clear, Endometrioid)	n = 29
Total		n = 66

RNA 시퀀싱을 보다 구체적으로 설명하면, 먼저 제조사의 프로토콜에 따라 총 RNeasy® FFPE kit(Qiagen, Hilden, Germany)으로 추출하고, Qubit® RNA HS Assay Kit(Life Technologies, Carlsbad, CA)로 정량화하고, Agilent 2100 Bioanalyzer(Agilent Technologies, Santa Clara, CA)의 스미어 분석을 사용하여 200nt보다 큰 RNA 단편의 백분율을 계산하였다. Qubit® dsDNA HS Assay Kit (Life Technologies)를 사용하여 DNA 샘플을 정량화하였고, Ion AmpliSeqTM 전사체 라이브러리는 제조사의 프로토콜에 따라 Ion Transcriptome Human Gene Expression Kit(Life Technologies)로 제작하였다. 전체 RNA의 10 ng을 역전사시켜 무작위 프라이밍으로 cDNA를 제조하였다. cDNA 산물은 Ion AmpliSeqTM Library Kit Plus가 함께 있는 Ion AmpliSeqTM Human Gene Expression Core Panel을 사용하여 증폭된 표적 유전자이다. 프라이머 분해 후, 어댑터 및 분자 바코드를 증폭산물에 연결하고 이어서 마그네틱 비드로 정제를 수행하였다. 이 라이브러리는 총 5사이클 동안 증폭되고 정제하였다. 증폭산물 크기와 DNA 농도는 Agilent High Sensitivity DNA Kit(Agilent Technologies)을 사용하여 제조업체의 권장 사항에 따라 측정하였다.

샘플 에멀젼 PCR, 에멀젼 브레이크 및 농축은 제조사의 지침에 따라 Ion PITM Template OT2 200 Kit v3(Life Technologies, Part #4488318 Rev. B.0)을 사용하여 수행하였고, 하나의 Ion PITM v2 칩에 대해 여러 바코드된 라이브러리를 같은 몰비로 결합하였다. 2개의 풀링된 Ion AmpliSeqTM Exome 라이브러리를 단일 Ion PITM v2 칩에 로딩하였고, 5개의 풀링된 AmpliSeqTM 전사체 라이브러리를 단일 Ion PITM v2 칩에 로딩하였다. 후속 에멀젼 PCR 및 풀링된 라이브러리의 시퀀싱 비드의 농축은 제조사의 프로토콜에 따라 Ion OneTouchTM 시스템(Life Technologies)을 사용하여 약 7시간 이내에 수행하였다. 마지막으로 Ion ProtonTM 시퀀서(Life Technologies) 상에서 Ion PITM Sequencing 200 Kit v3(Life Technologies, Part #4488315 Rev. B.0)을 사용하여 Ion PITM v2 칩에서 520 Flows 시퀀싱을 수행하였다.

실시예 2. RNA 시퀀싱 판독 및 유전자 발현 분석

RNA 시퀀싱 판독 맵핑은 STAR와 Bowtie2 소프트웨어 및 인간 게놈19(hg19) 레퍼런스를 이용하여 수행하였다. 상기 실시예 1에서 분류한 그룹간 차별 발현 유전자(Differential Expression Gene; DEG)를 얻기 위해 2fold & p-value <0.05 & FDR < 0.05 조건으로 분석하였고, 정확도를 높이기 위해 edgeR과 DESeq2의 2가지 방법을 사용하였다. DEG 분석결과는 표3에 기재하였으며, 내용을 보면, 그룹 B(비전형적 자궁내막증)와 그룹 C(난소암 주변에 있는 자궁내막증)에서 DEG 수가 다른 조합에 비해 가장 적으며, 두 그룹은 자궁내막증에서 난소암으로 진행되는 비슷한 중간단계로 볼 수 있으므로, 이후 분석시 두 그룹간의 분석은 제외하였다. 총 5개의 분석 조합(A vs B, A vs C, A vs D, B vs D, C vs D)에서 모두 변화하는 유전자를 선별하였고, 그 결과를 도 2에 벤 다이어그램으로 나타내었다. 2가지 분석방법에서 공통으로 나온 유전자를 최종 선별한 결과, 의미 있게 변화되는 유전자 25개를 발굴하였다. 상기 25개 유전자 리스트를 하기 표 4와 표 5에 기재하였다.

edgeR	Differential Expression Gene(2fold & p-value <0.05 & FDR < 0.05)
	Group _vs_ Group	A vs B	A vs C	A vs D	B vs C	B vs D	C vs D
	Up	403	369	2,530	206	3,165	2,085
	Down	895	1,129	2,755	29	2,429	1,599
	Total	1,298	1,498	5,285	235	5,594	3,684

DESeq2_vst	Differential Expression Gene(2fold & p-value <0.05 & padj < 0.05)
	Group _vs_ Group	A vs B	A vs C	A vs D	B vs C	B vs D	C vs D
	Up	298	365	2,412	105	2,931	2,122
	Down	752	1,087	2,598	30	1,975	1,510
	Total	1,050	1,452	5,010	135	4,906	3,632

Fold change_edgeR
Group _vs_ Group	A vs B	A vs C	A vs D	B vs D	C vs D
PKP3	3.64	5.05	57.90	15.87	11.03
TSPAN1	3.42	5.79	75.99	21.78	12.49
C2orf65	7.15	8.94	116.77	16.11	12.42
MSLN	5.86	4.32	37.87	6.40	8.34
MAPK15	4.74	3.29	14.29	2.98	4.12
PDXK1	4.96	5.66	47.10	9.11	7.78
CDK2AP2	2.15	2.11	4.65	2.09	2.09
S100A1	6.12	3.72	32.18	5.22	8.20
GRIN3B	7.15	5.67	75.84	10.42	12.49
HSPB6	4.05	3.28	-3.44	-14.26	-11.93
B3GNT3	4.78	5.44	50.29	10.34	8.72
B4GALNT3	3.13	4.00	40.28	12.61	9.56
SYTL1	3.59	3.01	16.30	4.40	5.13
OVOL2	3.61	4.49	39.62	10.96	8.47
EPS8L1	3.46	2.79	21.82	6.23	7.43
SULT2B1	6.53	14.77	85.81	13.25	5.46
KRT7	3.21	5.20	36.02	10.96	6.54
RXFP1	2.76	2.70	24.35	8.55	8.59
CCNA2	-2.14	-2.09	2.23	4.66	4.45
TMEM184A	9.54	9.78	101.66	10.46	9.87
ERBB3	3.73	5.06	59.53	15.76	11.14
CXADR	2.46	3.10	18.19	7.31	5.63
RGL3	2.27	2.94	7.95	3.44	2.57
PRSS8	3.08	3.44	74.18	23.69	20.52
BSPRY	3.97	3.97	40.21	10.09	9.71

Fold change_ DESeq2
Group _vs_ Group	A vs B	A vs C	A vs D	B vs D	C vs D
PKP3	2.56	3.71	49.65	14.80	9.85
TSPAN1	2.54	4.41	58.73	19.13	10.33
C2orf65	3.44	4.47	79.34	14.80	10.15
MSLN	2.69	3.26	25.00	5.48	6.37
MAPK15	3.43	2.91	12.49	2.86	3.80
PDXK1	3.33	3.96	32.30	8.09	6.28
CDK2AP2	2.03	2.04	4.27	2.07	2.02
S100A1	2.53	3.05	24.70	4.72	6.78
GRIN3B	2.48	3.91	45.64	8.68	8.97
HSPB6	3.37	2.86	-3.46	-12.99	-9.94
B3GNT3	2.71	3.36	37.73	9.38	7.41
B4GALNT3	2.54	3.50	34.55	11.83	8.73
SYTL1	2.89	2.70	14.18	4.23	4.77
OVOL2	2.35	3.44	32.83	10.04	7.52
EPS8L1	2.54	2.54	18.75	5.82	6.62
SULT2B1	2.60	4.47	48.25	11.25	4.43
KRT7	2.37	3.94	29.05	9.99	5.78
RXFP1	2.17	2.47	15.93	6.93	5.94
CCNA2	-2.09	-2.04	2.09	4.54	4.21
TMEM184A	4.53	6.14	78.91	9.67	8.76
ERBB3	2.59	3.74	49.03	14.61	9.96
CXADR	2.07	2.68	15.02	6.72	4.80
RGL3	2.05	2.65	7.11	3.30	2.44
PRSS8	2.39	3.05	63.23	21.79	18.20
BSPRY	2.91	3.33	34.67	9.50	8.83

각각의 그룹에서 상기 25개 유전자의 발현양 차이를 도 3에 나타내었다. 도 3을 보면, 25개의 유전자는 자궁내막증에서 난소암으로 진행될수록 발현양이 전반적으로 증가하는 것을 알 수 있으며, 25개 유전자 중 2개의 유전자만 감소하는 경향을 보였다. 자궁내막증에서 난소암(투명세포 및 자궁내막모양)은 특정 유전자들의 발현을 증가시켜 암화과정을 유도하는 것으로 볼 수 있는 결과이다. 상기 25개 유전자의 온톨로지(Gene ontology)는 8가지로 구분되며, 그 결과를 도 4에 나타내었다. 유전자 온톨로지 분석 결과 세포 과정(Cellular process)에 가장 많은 유전자가 포함된 것으로 나타나, 여기에 포함되는 13개 유전자 S100A1, PKP3, GRIN3B, TSPAN1, RXFP1, MAPK15, ERBB3, MSLN, CDK2AP2, RGL3, SYTL1, EPS8L1, 및 B3GNT3 중에서 9개의 유전자 S100A1, PKP3, TSPAN1, MAPK15, MSLN, CDK2AP2, RGL3, EPS8L1, 및 B3GNT3와 추가로 1개의 유전자 KRT7의 발현 정도를 다양한 난소암 세포주에서 확인하였다.

실시예 3. 난소암 세포주에서의 유전자 발현 분석

총 9종류의 자궁내막, 자궁내막증, 또는 난소암 세포주로부터 S100A1, PKP3, TSPAN1, MAPK15, MSLN, CDK2AP2, RGL3, EPS8L1, B3GNT3, 및 KRT7의 발현량 차이를 Real-time PCR로 확인하였다. 사용된 세포주들의 정보는 하기 표 6에 기재하였다.

상피종양 내 분류	세포주명	특징
자궁내막 (Endometrium)	6595_hTERT
자궁내막 (Endometrium)	6866_SV40
자궁내막증 (Endometriosis)	6045_SV40
자궁내막증 (Endometriosis)	9585_SV40
난소암-투명세포 (Ovarian cancer-Clear)	RMG-1	유사분열억제제 감수성^*
	ES-2	유사분열억제제 감수성^*
	TOV-21G	유사분열억제제 저항성^*
난소암-자궁내막모양 (Ovarian cancer-Endometrioid)	TOV112D
난소암-자궁내막모양 (Ovarian cancer-Endometrioid)	SNU-251
^*PLoS One. 2014 Nov 6;9(11):e112438. PubMed PMID: 25375122 참조.

상기 세포들 중 자궁내막, 및 자궁내막증 세포주는 각각의 조직으로부터 분리된 세포에 렌티바이러스 시스템을 사용하여 hTERT 또는 SV40 T 항원을 형질변형하여 세포주를 제작하였다. 10% 우태아혈청(Fetal bovine serum)과 1% 페니실린(penciling)/스트렙토마이신(streptomycin)이 포함된 DMEM/F12, 및 DMEM 배지에서 성장하였고, 5% CO₂에서 37'C로 배양하였다. 난소암 세포주 5종류는 한국세포주은행(Korean Cell Line Bank), 또는 미국세포주은행(American Type Culture Collection; ATCC)로부터 분양받거나, 상업적으로 판매되는 것을 구매하여 제조사에서 제공하는 가이드라인에 따라 배양하였다.

모든 세포는 PBS로 세척하고, 제조사의 프로토콜에 따라 TRizol(Ambion, Carlsbad, CA)시약으로 전체 RNA 추출하였다. 제조사의 프로토콜에 따라, Maxima First Strand cDNA Synthesis Kit(Thermo Scientific, Waltham, MA)를 사용하여 각 시료의 총 RNA (2ug)를 cDNA로 역전사 하였다. SYBR Green PCR을 이용하여 mRNA 발현양을 정량화 하기 위해 실시간 중합효소 연쇄반응 (Real-time PCR)을 수행하였다. Master Mix (Enzynomics, Daejeon, Republic of Korea) 및 ABI PRISM 7300 Real- time PCR 시스템 (Applied Biosystems, Foster City, CA)을 제조사의 지시에 따라 사용 하였다

상기 RT-PCR 결과를 도 5에 나타내었다. 실험 결과, RGL3와 EPS8L1의 경우 난소암 중에서도 투명세포에서만 유의적으로 과발현되고, 자궁내막모양 난소암에서는 자궁내막, 및 자궁내막증 세포주와 마찬가지로 거의 발현되지 않았다. 이는 RGL3와 EPS8L1이 난소암 중에서도 투명세포 난소암에 특이적인 마커로 사용될 수 있음을 의미한다. 또한, S100A1, TSPAN1, MAPK15, MSLN, 및 EPS8L1은 투명세포 난소암 중에서도 유사분열억제제 저항성이 있는 투명세포 난소암에서 특이적으로 과발현되었다. 이로서 S100A1, TSPAN1, MAPK15, MSLN, 또는 EPS8L1를 이용하여 투명세포 난소암 중에서도 유사분열억제제 저항성이 있는 투명세포 난소암을 선택적으로 구분할 수 있음을 알 수 있었다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims

난소암 시료에서 RGL3, EPS8L1, S100A1, TSPAN1, MAPK15, 및 MSLN으로 이루어진 군으로부터 선택된 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계;를 포함하는, 난소암 진단에 관한 정보를 제공하는 방법.
제 1항에 있어서,
상기 RGL3의 발현 수준이 자궁내막, 또는 자궁내막증 시료에서의 RGL3 발현 수준보다 유의하게 높을 경우에, 상기 난소암을 투명세포 난소암으로 결정하는 단계;를 추가로 포함하는, 난소암 진단에 관한 정보를 제공하는 방법.
제 1항에 있어서,
상기 EPS8L1의 발현 수준이 자궁내막, 또는 자궁내막증 시료에서의 EPS8L1 발현 수준보다 유의하게 높을 경우에, 상기 난소암을 투명세포 난소암으로 결정하는 단계;를 추가로 포함하는, 난소암 진단에 관한 정보를 제공하는 방법.
제 3항에 있어서,
상기 투명세포 난소암은 유사분열억제제 저항성 투명세포 난소암인 것인, 난소암 진단에 관한 정보를 제공하는 방법.
제 1항에 있어서,
상기 S100A1의 발현 수준이 자궁내막, 또는 자궁내막증 시료에서의 S100A1 발현 수준보다 유의하게 높을 경우에, 상기 난소암을 투명세포 난소암으로 결정하는 단계;를 추가로 포함하는, 난소암 진단에 관한 정보를 제공하는 방법.
제 5항에 있어서,
상기 투명세포 난소암은 유사분열억제제 저항성 투명세포 난소암인 것인, 난소암 진단에 관한 정보를 제공하는 방법.
제 1항에 있어서,
상기 TSPAN1의 발현 수준이 자궁내막, 또는 자궁내막증 시료에서의 TSPAN1 발현 수준보다 유의하게 높을 경우에, 상기 난소암을 투명세포 난소암으로 결정하는 단계;를 추가로 포함하는, 난소암 진단에 관한 정보를 제공하는 방법.
제 7항에 있어서,
상기 투명세포 난소암은 유사분열억제제 저항성 투명세포 난소암인 것인, 난소암 진단에 관한 정보를 제공하는 방법.
제 1항에 있어서,
상기 MAPK15의 발현 수준이 자궁내막, 또는 자궁내막증 시료에서의 MAPK15 발현 수준보다 유의하게 높을 경우에, 상기 난소암을 투명세포 난소암으로 결정하는 단계;를 추가로 포함하는, 난소암 진단에 관한 정보를 제공하는 방법.
제 9항에 있어서,
상기 투명세포 난소암은 유사분열억제제 저항성 투명세포 난소암인 것인, 난소암 진단에 관한 정보를 제공하는 방법.
제 1항에 있어서,
상기 MSLN의 발현 수준이 자궁내막, 또는 자궁내막증 시료에서의 MSLN 발현 수준보다 유의하게 높을 경우에, 상기 난소암을 투명세포 난소암으로 결정하는 단계;를 추가로 포함하는, 난소암 진단에 관한 정보를 제공하는 방법.
제 11항에 있어서,
상기 투명세포 난소암은 유사분열억제제 저항성 투명세포 난소암인 것인, 난소암 진단에 관한 정보를 제공하는 방법.