JP5312024B2 - ヒトがん細胞の不死化に関わる遺伝子およびその利用 - Google Patents
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Description
Harley CB, Mutation Res, 256: 271-82, 1991 Kim NWら、Science 266: 2011-5, 1994 Hiyama Kら、J Natl Cancer Inst 87: 895-902, 1995 Morales CPら、Nat Genet 21: 115-8, 1999 Shay JW, Bacchetti S, Eur J Cancer 33: 787-91, 1997 Hiyama Kら、J Immunol 155: 3711-5, 1995 Hiyama Eら、Int J Oncol 9: 453-8, 1996 Forsyth NRら、Aging Cell 2: 235-43, 2003 Bodnar AGら、Exp Cell Res 228: 58-64, 1996 Hiyama Kら、Int J Oncol 27: 87-95, 2005
項1.配列番号1〜13のいずれかに示される塩基配列内の少なくとも15塩基長の連続した塩基配列と特異的にハイブリダイズする、15塩基長以上の塩基配列を有するポリヌクレオチドからなる、がん細胞の不死化を判定するための遺伝子マーカー。
(1)被験者から採取されたがん細胞を含み得る生体試料から調製されたRNA又は当該RNAの派生物と項1又は2のいずれか1項記載の遺伝子マーカーとを結合させる工程、
(2)上記遺伝子マーカーに結合したRNA又は当該RNAの派生物の量を、該遺伝子マーカーを指標として測定する工程、
(3)上記工程(2)で得られたRNA又は当該RNAの派生物の量(以下、これらを総称して「RNA量」という)と不死化していない正常もしくはがん細胞における対応するRNA又は当該RNAの派生物の量(以下、これらを総称して「対照RNA量」という)とを比較する工程。
(4)工程(2)のRNA量が対照RNA量より高い場合に、被験者のがん細胞が不死化していると判定し、高くない場合に被験者のがん細胞が不死化していないと判定する工程。
(1’)被験者から採取されたがん細胞を含み得る生体試料から調製されたポリペプチドを含むタンパク質含有画分と項5記載の抗体とを結合させる工程
(2’)上記抗体に結合したポリペプチドの量を、該抗体を指標として測定する工程
(3’)上記工程(2’)のポリペプチド量と不死化していない正常もしくはがん細胞における対応するポリペプチドの量(以下、「対照ポリペプチド量」という)とを比較する工程。
(4’)工程(2’)のポリペプチド量が対照ポリペプチド量より高い場合に被験者のがん細胞が不死化していると判定し、高くない場合に被験者のがん細胞が不死化していないと判定する工程。
(A)被験物質と、配列番号1〜13のいずれかに示される塩基配列からなる遺伝子を発現可能な細胞とを接触させる工程
(B)被験物質を接触させた細胞について、配列番号1〜13のいずれかに示される塩基配列からなる遺伝子の発現量を測定する工程
(C)上記工程(B)で得られた遺伝子の発現量と被験物質を接触させない対照の細胞における対応する遺伝子の発現量を比較する工程、および
(D)上記工程(B)で得られた遺伝子の発現量が対照の発現量よりも低い場合に、当該被験物質を不死化がん細胞の増殖を抑制する物質として選択する工程。
(A’)被験物質と、配列番号14〜26のいずれかに示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドとを接触させる工程、
(B’)被験物質を接触させた配列番号14〜26のいずれかに示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの活性を測定する工程、
(C’)上記工程(B’)で得られたポリペプチドの活性と被験物質を接触させない対照の活性を比較する工程、および
(D’)上記工程(B’)で得られたポリペプチドの活性が対照の活性よりも低い場合に、当該被験物質を不死化がん細胞の増殖を抑制する物質として選択する工程。
本発明において「不死化していないがん細胞」とは、がん細胞のうち、(1)テロメラーゼ活性が陰性であり、(2)テロメア長が短縮しており、且つ(3)テロメラーゼタンパク質の発現が確認できない有限寿命細胞を意味する。一方、本発明において「不死化がん細胞」とは、がん細胞のうち、上記(1)〜(3)のうち少なくとも1つの特徴を備えていない細胞、すなわちテロメラーゼ活性が陽性であるか、テロメア長が延長しているか、またはテロメラーゼタンパク質の発現が確認できる細胞で、無限に細胞増殖することが可能になった細胞を意味する。
前述するように配列番号1〜13に示す塩基配列からなる各不死化規定遺伝子((1)〜(13))は、いずれも複数のがん種に由来する不死化がん細胞に特異的に高発現していることから、これを指標(マーカー遺伝子)とすることにより、がん細胞の不死化の有無を判定することが可能となる。
がん細胞の不死化の判定は、不死化がん細胞に特異的に高発現している上記不死化規定遺伝子〔(1)UBE2S遺伝子、(2)RFC4遺伝子、(3)PTGES2遺伝子、(4)MAF1遺伝子、(5)ACVR2B遺伝子、(6)FAM119A遺伝子、(7)LTB4DH遺伝子、(8)DPM2遺伝子、(9)SEPX1遺伝子、(10)PSMA3遺伝子、(11)CHCHD3遺伝子、(12)LSM3遺伝子、または(13)GTSE1遺伝子〕のいずれか少なくとも一つを検出することによって行われる。
(2)RFC4遺伝子の塩基配列(配列番号2)において15塩基長以上の連続した塩基配列からなるポリヌクレオチド、
(3)PTGES2遺伝子の塩基配列(配列番号3)において15塩基長以上の連続した塩基配列からなるポリヌクレオチド、
(4)MAF1遺伝子の塩基配列(配列番号4)において15塩基長以上の連続した塩基配列からなるポリヌクレオチド、
(5)ACVR2B遺伝子の塩基配列(配列番号5)において15塩基長以上の連続した塩基配列からなるポリヌクレオチド、
(6)FAM119A遺伝子の塩基配列(配列番号6)において15塩基長以上の連続した塩基配列からなるポリヌクレオチド、
(7)LTB4DH遺伝子の塩基配列(配列番号7)において15塩基長以上の連続した塩基配列からなるポリヌクレオチド、
(8)DPM2遺伝子の塩基配列(配列番号8)において15塩基長以上の連続した塩基配列からなるポリヌクレオチド、
(9)SEPX1遺伝子の塩基配列(配列番号9)において15塩基長以上の連続した塩基配列からなるポリヌクレオチド、
(10)PSMA3遺伝子の塩基配列(配列番号10)において15塩基長以上の連続した塩基配列からなるポリヌクレオチド、
(11)CHCHD3遺伝子の塩基配列(配列番号11)において15塩基長以上の連続した塩基配列からなるポリヌクレオチド、
(12)LSM3遺伝子の塩基配列(配列番号12)において15塩基長以上の連続した塩基配列からなるポリヌクレオチド、
(13)GTSE1遺伝子の塩基配列(配列番号13)において15塩基長以上の連続した塩基配列からなるポリヌクレオチド。
本発明は、遺伝子マーカーとして各不死化規定遺伝子の塩基配列領域を特異的に増幅するためのプライマーとして用いられるポリヌクレオチドを提供する。
(2)RFC4遺伝子の塩基配列(配列番号2)において15塩基長以上の連続した塩基配列からなるポリヌクレオチド、
(3)PTGES2遺伝子の塩基配列(配列番号3)において15塩基長以上の連続した塩基配列からなるポリヌクレオチド、
(4)MAF1遺伝子の塩基配列(配列番号4)において15塩基長以上の連続した塩基配列からなるポリヌクレオチド、
(5)ACVR2B遺伝子の塩基配列(配列番号5)において15塩基長以上の連続した塩基配列からなるポリヌクレオチド、
(6)FAM119A遺伝子の塩基配列(配列番号6)において15塩基長以上の連続した塩基配列からなるポリヌクレオチド、
(7)LTB4DH遺伝子の塩基配列(配列番号7)において15塩基長以上の連続した塩基配列からなるポリヌクレオチド、
(8)DPM2遺伝子の塩基配列(配列番号8)において15塩基長以上の連続した塩基配列からなるポリヌクレオチド、
(9)SEPX1遺伝子の塩基配列(配列番号9)において15塩基長以上の連続した塩基配列からなるポリヌクレオチド、
(10)PSMA3遺伝子の塩基配列(配列番号10)において15塩基長以上の連続した塩基配列からなるポリヌクレオチド、
(11)CHCHD3遺伝子の塩基配列(配列番号11)において15塩基長以上の連続した塩基配列からなるポリヌクレオチド、
(12)LSM3遺伝子の塩基配列(配列番号12)において15塩基長以上の連続した塩基配列からなるポリヌクレオチド、
(13)GTSE1遺伝子の塩基配列(配列番号13)において15塩基長以上の連続した塩基配列からなるポリヌクレオチド。
上記本発明の遺伝子マーカー(プローブまたはプライマー)には、前述するポリヌクレオチドに、不死化規定遺伝子検出のための適当な標識物、例えば蛍光色素、酵素、タンパク質、放射性同位体、化学発光物質、ビオチン等が付加されたものが含まれる。
本発明はまた、上記不死化がん細胞検出用試薬〔遺伝子マーカー(非標識または標識されたプローブまたはプライマー)〕をキットとして提供するものである。当該キットは、上記プローブまたはプライマーとして用いられる、非標識または標識されたポリヌクレオチド(なお、これらは固相に固定化されていてもよい)を少なくとも1つ含むものである。本発明の試薬キットは上記遺伝子マーカー(プローブまたはプライマー)の他、必要に応じてハイブリダイゼーション用の試薬、プローブの標識、ラベル体の検出剤、緩衝液など、後述する本発明の方法の実施に必要な他の試薬、器具などを適宜含んでいてもよい。
(III-1) 上記本発明の遺伝子マーカー(プローブ又はプライマー)を使用することにより、被験者から採取したがん細胞について不死化規定遺伝子(マーカー遺伝子)の発現量を測定することができ、さらに、その発現量に基づき当該がん細胞が「不死化がん細胞」であるか、それとも「不死化していないがん細胞」であるかを判定することができる。従来の病理診断では不死化がん細胞の判定ができなかったが、本発明に係る不死化がん細胞の判定方法によれば、進行する前の早期の不死化がん細胞でも判定でき、それにより患者にあったがん治療を早期に促すことができる。
(1)被験者から採取されたがん細胞を含み得る生体試料から調製されたRNA又は当該RNAの派生物と本発明に係るプローブまたはプライマーとを結合させる工程、
(2)プローブまたはプライマーに結合したRNA又は当該RNAの派生物の量を、当該プローブまたはプライマーを指標として測定する工程。
(4)工程(2)のRNA量が対照RNA量より高い場合に、被験者のがん細胞が不死化していると判定し、RNA量が対照RNA量より高くない場合に、被験者のがん細胞が不死化していないと判定する工程。
(15)RFC4ポリペプチド:配列番号2に示される塩基配列からなるRFC4遺伝子(2)によりコードされるポリペプチド、具体的には配列番号15に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
(16)PTGES2ポリペプチド:配列番号3に示される塩基配列からなるPTGES2遺伝子(3)によりコードされるポリペプチド、具体的には配列番号16に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
(17)MAF1ポリペプチド:配列番号4に示される塩基配列からなるMAF1遺伝子(4)によりコードされるポリペプチド、具体的には配列番号17に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
(18)ACVR2Bポリペプチド:配列番号5に示される塩基配列からなるACVR2B 遺伝子(5)によりコードされるポリペプチド、具体的には配列番号18に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
(19)FAM119Aポリペプチド:配列番号6に示される塩基配列からなるFAM119A遺伝子(6)によりコードされるポリペプチド、具体的には配列番号19に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
(20)LTB4DHポリペプチド:配列番号7に示される塩基配列からなるLTB4DH 遺伝子(7)によりコードされるポリペプチド、具体的には配列番号20に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
(21)DPM2ポリペプチド:配列番号8に示される塩基配列からなるDPM2遺伝子(8)によりコードされるポリペプチド、具体的には配列番号21に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
(22)SEPX1ポリペプチド:配列番号9に示される塩基配列からなるSEPX1遺伝子(9)によりコードされるポリペプチド、具体的には配列番号22に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
(23)PSMA3ポリペプチド:配列番号10に示される塩基配列からなるPSMA3遺伝子(10)によりコードされるポリペプチド、具体的には配列番号23に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
(24)CHCHD3ポリペプチド:配列番号11に示される塩基配列からなるCHCHD3遺伝子(11)によりコードされるポリペプチド、具体的には配列番号24に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
(25)LSM3ポリペプチド:配列番号12に示される塩基配列からなるLSM3遺伝子(12)によりコードされるポリペプチド、具体的には配列番号25に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
(26)GTSE1ポリペプチド:配列番号13に示される塩基配列からなるGTSE1遺伝子(13)によりコードされるポリペプチド、具体的には配列番号26に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
(1’)被験者から採取されたがん細胞を含み得る生体試料から調製されたポリペプチドを含むタンパク質含有画分と、本発明の不死化規定ポリペプチドを認識する抗体とを混合する工程
(2’)上記抗体に結合したポリペプチドの量を、該抗体を指標として測定する工程
なお、上記工程(2’)で得られるポリペプチドの量は、不死化規定ポリペプチドの産生量を反映するものである。
(3’)上記工程(2’)で得られたポリペプチドの量と不死化していない正常もしくはがん細胞における対応するポリペプチドの量(対照ポリペプチド量)とを比較する工程、
(4’)上記工程(2’)のポリペプチド量が対照ポリペプチド量に比して高い場合に被験者のがん細胞が不死化していると判定し、高くない場合に被験者のがん細胞が不死化していないと判定する工程。
(IV-1)実施例に示すように、本発明にかかる不死化規定遺伝子((1)〜(13))は、不死化がん細胞に特異的に高発現しており、また、当該各不死化規定遺伝子のsiRNAを用いてその発現を抑制することにより、不死化がん細胞の増殖を抑制することができる。このことは、不死化規定遺伝子((1)〜(13))の発現を抑制する作用を有する物質が、不死化がん細胞増殖抑制剤(抗がん剤)となり得ることを示している。すなわち、前述する不死化規定遺伝子((1)〜(13))の発現抑制を指標とすることにより、不死化がん細胞の増殖を抑制する作用を有する物質をスクリーニングすることができる。
(A)被験物質と、(1)〜(13)のいずれかの不死化規定遺伝子を発現可能な細胞とを接触させる工程、
(B)被験物質を接触させた細胞における、当該不死化規定遺伝子の発現量を測定する工程、
(C)上記工程(B)で得られた不死化規定遺伝子の発現量と、被験物質を接触させない細胞における当該不死化規定遺伝子の発現量(対照発現量)とを比較する工程、および
(D)上記工程(B)で得られた遺伝子の発現量が対照発現量より低い場合に該被験物質を不死化がん細胞の増殖を抑制する物質として選択する工程。
(A’)被験物質と、(14)〜(26)のいずれかの不死化規定ポリペプチドとを接触させる工程、
(B’)被験物質を接触させた不死化規定ポリペプチドの活性を測定する工程、
(C’)上記工程(B’)で得られた不死化規定ポリペプチドの活性と被験物質を接触させない水溶液、細胞または細胞画分における不死化規定ポリペプチドの活性(対照活性)とを比較する工程、
(D’)上記工程(B’)で得られた不死化規定ポリペプチドの活性が対照活性よりも低い場合に、当該被験物質を不死化がん細胞の増殖を抑制する物質として選択する工程。
1.ヒト組織サンプルおよびヒトがん細胞株、ヒト非腫瘍性培養細胞からのtotal RNAの調製
9種の肺癌細胞株、21種の食道癌細胞株、9種の消化器癌、他さまざまながん(胃癌、大腸癌、頭頚部癌、白血病)細胞株および2種の非腫瘍性食道上皮細胞、2種の正常気道上皮からRNeasyTM Mini kit(Qiagen社製)を用いて添付プロトコールに従いtotal RNAを抽出し、-80℃で保存した。
上記で調製したtotal RNAを用いてマイクロアレイによる網羅的遺伝子発現解析を行った。マイクロアレイはCodeLink UniSet Human 20K I Bioarray (19881プローブ)を用い、(1) total RNAからcDNAの合成、(2) cDNAからラベル化cRNAの合成、(3)ラベル化cRNAの断片化、(4)断片化cRNAとマイクロアレイとのハイブリダイズ、(5)マイクロアレイの染色、(6)マイクロアレイのスキャン、(7)遺伝子発現解析の手順で行った。
CodeLink Expression Assay Reagent Kit(GEヘルスケアバイオサイエンス社製)を用いて、そのプロトコールに従いfirst-strand cDNA合成を行った。すなわち、1で得られた各total RNA 1μgを10μl にNuclease-free Waterで調製し、該キットに含まれる1μl Bacterial Control mRNA 希釈溶液、1μl T7 Oligo(dT)Primerを混合し、計12μl を70℃で10 分間加温した後、氷上で3 分間急冷した。氷上で該キットに含まれる2μl の10 × First-strand Buffer、4μl の5 mM dNTP Mix、1μl のRNase Inhibitor、1μl のReverse Transcriptase(200 U/μl)を加え、計20μl を42℃で2 時間加温した。
引き続きCodeLink Expression Assay Reagent Kit(GEヘルスケアバイオサイエンス社製)のプロトコールに従いビオチン標識ヌクレオチド存在下でin vitro transcription (IVT) 反応を行い、cRNA を合成した。すなわち、該キットに含まれる4.0μl の10 × T7 Reaction Buffer、4.0μl のT7 ATP Solution、4.0μl のT7 GTP Solution、4.0μl のT7 CTP Solution、3.0μl のT7 UTP Solutionを混合し、7.5μl の10 mM Biotin-11-UTP (Perkin Elmer社製)も加え、計26.5μl を(1)で調製した9.5μl cDNA 溶液に添加した。さらに該キットに含まれる4.0μl の10 × T7 Enzyme Mixを加え、計40.0μlをよく混合し、気相で37℃14 時間加温した。反応終了後、RNeasy Mini Kit(QIAGEN 社製)を用いて添付プロトコールに従い、合成したcRNAを精製した。すなわち、IVT 反応液(40μl)に60μl のNuclease-free Waterを添加し、合計100μl の溶液に該キットに含まれる350μl のBuffer RLT を添加してよく混合し、さらに250μl の100% エタノールを添加してよく混合し、全量(700 μl)を該キットに含まれるRNeasy ミニスピンカラムに添加して、12,000 rpmで15 秒間遠心した。RNeasy ミニスピンカラムを新しい2 ml チューブにセットし、該キットに含まれる500μl のBuffer RPE をカラムに添加して12,000 rpmで15 秒間遠心し、この操作を再度繰り返した。溶出液を除去した後、再度RNeasy ミニスピンカラムを元の2 ml チューブにセットし、12,000 rpmで2 分間遠心してカラム内のメンブレンを乾燥させた後、RNeasy ミニスピンカラムを新しい1.5 ml チューブに移し、50μl のNuclease-free Waterをメンブレン上に直接添加した。室温で10 分間静置した後、12,000 rpmで1分間遠心し、この操作を再度繰り返した(計100μlで溶出)。
引き続きCodeLink Expression Assay Reagent Kit(GEヘルスケアバイオサイエンス社製)のプロトコールに従い、cRNA を約100〜200塩基に断片化した。すなわち、10μg のcRNA が20μl になるよう、Nuclease-free Waterでメスアップし、該キットに含まれる 5μlの 5 × Fragmentation Buffer を添加し、94℃で20分間加熱後、氷上で急冷した。断片化された10μg のcRNA を含む25μl の溶液に、該キットに含まれる78μl Hybridization Buffer A、130μl Hybridization Buffer B、27μl Nuclease-free Waterを加え、計260μlのハイブリダイゼーション溶液を調製した。最高速度で5 秒間ボルテックスしてスピンダウン後、90℃で5分間加熱してcRNA の熱変性を行い、氷上で冷却した。
CodeLink Shaker Kit(GEヘルスケアバイオサイエンス社製)、CodeLink INNOVA シェイカーを用いてプロトコールに従いハイブリダイズを行った。すなわち、CodeLink UniSet Human 20K I Bioarrayを該キットに含まれる12 Slide Shaker Tray にセットした。(3)で調製したハイブリダイゼーション溶液を最高速度で5秒間ボルテックス後スピンダウンし、ハイブリダイゼーション溶液250μlをアレイのシール型チャンバーの右下の穴から注入し、アレイ付属のSealing strip(シール)で穴を密封した。アレイを載せたShaker Tray をCodeLink INNOVA シェイカーの中に設置し、37℃、300 rpmで旋回させながら18時間加温した。
CodeLink Parallel Processing Kit(GEヘルスケアバイオサイエンス社製)を用いてプロトコールに従い、アレイの染色および洗浄を行った。すなわち、上記で得られたハイブリダイズ済みアレイのシールチャンバーを剥がし、室温で13 ml の0.75 × TNT Buffer (0.1 M Tris-HCl(pH 7.6)、0.15 M NaCl、0.05% Tween 20)を満たし、該キットに含まれるBioarray Rack をセットしたMedium Reagent リザーバーの各スロットに挿入した。数回Rackを上下に動かして余分のハイブリダイゼーション溶液をアレイから落とし、46℃に加温した240 ml 0.75 × TNT Bufferを満たしたLarge Reagent リザーバーにアレイを保持しているBioarray Rack を移し、46℃で1 時間加温した。
染色した各アレイをAgilent G2565 (Agilent社製)スキャナに供し、染色パターンを読み取りTIFF imageとして保存した。TIFF imageをCodeLink Expression Analysis ソフトウエアで処理し、アレイ上の各遺伝子スポットのシグナル強度を数値化した。
上記で得られたシグナル強度データをGeneSpring GX (Agilent社製)マイクロアレイ遺伝子発現解析ソフトを用いてNormalizationを行い解析した。すなわち、スポットシグナルから背景シグナルを差し引き、その値が0.01未満は0.01とし、アレイの全スポットシグナルの中央値で割った値をそれぞれの遺伝子の標準化した相対的発現量とした。この相対的発現量が正常細胞(図1、左上)に比べ共通して不死化がん細胞株(図1、右下)で増加している遺伝子を以下のようにして選択した。臓器を越えて普遍的に発現増強している遺伝子は、正常体細胞(図1、左上)のがん化(図1中、下向き青矢印)に関わる遺伝子よりも、がん細胞の不死化(図1中、右向き赤矢印)に関わる遺伝子であることが予想される。
(1)不死化細胞(図3〜15黒塗り:MCF-12A、SV11e、SV11-106以外はすべてヒトがん由来細胞株)で、有限寿命の非腫瘍性細胞(図3〜15白抜き)に比し発現が亢進している、
(2)ヒトがん由来不死化がん細胞(図3〜15 MCF-12A、SV11e、SV11-106以外の黒塗り)で有限寿命がん細胞(図3〜15 SV12e、SV12-72以外の斜線)よりも発現が亢進している、
(3)正常肺線維芽細胞にテロメラーゼコード遺伝子TERTを導入して得られた非腫瘍性テロメラーゼ発現延命細胞(図3〜15 菱形ドットTERT6e, TERT6-85)では、親細胞(TIG-1)に比し発現の亢進が認められない、
遺伝子であり、がん細胞特異的にテロメラーゼ陽性不死化細胞で高発現している遺伝子である。このことから、これらの遺伝子は、がん細胞の不死化を規定する遺伝子(不死化規定遺伝子)であると考えられる。
実施例1で特定した13種の不死化規定遺伝子のがん細胞増殖との関連性を解析するために各遺伝子配列特異的siRNAを設計・作製後、3種のがん細胞株(HeLa: 子宮頸癌、KYSE150: 食道癌、HCC50:大腸癌)に遺伝子導入し、不死化規定遺伝子のmRNA発現の抑制、および導入後96時間後の細胞増殖能への影響を検討した。
13種の各不死化規定遺伝子について、2種あるいは4種の特異的なsiRNA配列を設定し、sense鎖とantisense鎖により二本鎖が形成されたsiRNAをQiagen社及び日本バイオサービス社より購入した。作製した各siRNAの配列のうち、sense鎖のみを表2および3に示す。各遺伝子のsiRNA-1は2種類の等モル混合とした。
3種のがん細胞株(HeLa: 子宮頸癌、KYSE150: 食道癌、HCC50:大腸癌)はそれぞれ以下の条件で培養した。HeLaは10% Fetal Bovine Serum(Sigma社製)及びゲンタマイシン(Sigma社製)を含むDMEM培地(Nacalai Tesque社製)を用いて、KYSE150とHCC50は10% Fetal Bovine Serum及びゲンタマイシンを含むRPMI 1640培地(Nacalai Tesque社製)を用いて培養した。
トランスフェクションの前日に、予め培養した各がん細胞をトリプシン処理で回収し、(2)に記載した培地に懸濁した後、24ウェルプレートの1ウェルあたり、HeLaを1.2×104個、KYSE150を2×104個、HCC50を1.5×104個の細胞数で播種した。トランスフェクション当日に無血清培地 Opti-MEM(Invitrogen社製)に交換し、Oligofectamine(Invitrogen社製)あるいはLipofectamine 2000(Invitrogen社製)を用いて表2及び3に示したsiRNAをトランスフェクションした。また、トランスフェクション時のsiRNAの濃度は1ウェルあたり、40 nMとした。ネガティブコントロールとして、Control(non-silencing)siRNA(Qiagen社製)を使用した。
(3)で行ったトランスフェクション1日後の各がん細胞株から、RNeasy Mini(Qiagen社製)を用いて製品の説明書に従い、total RNAを抽出した。QuantiTect Probe RT-PCR(Qiagen社製)及び不死化規定遺伝子配列特異的TaqMan Probe(ABI社製)を用いて、以下の条件にて定量RT-PCR(ABI社製、ABI PRISM 7000 sequence detection systemを使用)を行った。
i)50℃、30分間、
ii)95℃、15分間、
iii)94℃、15秒間 → 60℃、1分間を35〜45サイクル。
がん細胞株の増殖は生細胞数測定試薬SF(Nacalai Tesque社製)を用いて行った。(3)で行ったトランスフェクション96時間後に、1ウェルあたり、WST試薬を10μl添加し、37℃で3時間インキュベートした後に450nm及び595nm(参照波長)の吸光度をプレートリーダー(Perkin Elmer社製、Wallac ARVO MX1420 Multilabel Counter)を用いて測定した。450nmの吸光度−595nmの吸光度−BG(培地のみ)の吸光度で数値化を行い、3ウェルあたりの平均値を求め、NS配列siRNA導入細胞の値を100%として表示した。なお、がん細胞株の増殖測定は、同一標的遺伝子、同一がん細胞株において同条件で2回ずつ行った。
配列番号28はUBE2S遺伝子に関するsiRNA-1(146-166)のセンス鎖の塩基配列を示す。
配列番号29はUBE2S遺伝子に関するsiRNA-2のセンス鎖の塩基配列を示す。
配列番号30はUBE2S遺伝子に関するsiRNA-3のセンス鎖の塩基配列を示す。
配列番号31はRFC4遺伝子に関するsiRNA-1(897-917)のセンス鎖の塩基配列を示す。
配列番号32はRFC4遺伝子に関するsiRNA-1(189-209)のセンス鎖の塩基配列を示す。
配列番号33はRFC4遺伝子に関するsiRNA-2のセンス鎖の塩基配列を示す。
配列番号34はRFC4遺伝子に関するsiRNA-3のセンス鎖の塩基配列を示す。
配列番号35はPTGES2遺伝子に関するsiRNA-1(2003-2023)のセンス鎖の塩基配列を示す。
配列番号36はPTGES2遺伝子に関するsiRNA-1(1105-1125)のセンス鎖の塩基配列を示す。
配列番号37はPTGES2遺伝子に関するsiRNA-2のセンス鎖の塩基配列を示す。
配列番号38はPTGES2遺伝子に関するsiRNA-3のセンス鎖の塩基配列を示す。
配列番号39はMAF1遺伝子に関するsiRNA-1(1538-1558)のセンス鎖の塩基配列を示す。
配列番号40はMAF1遺伝子に関するsiRNA-1(1031-1051)のセンス鎖の塩基配列を示す。
配列番号41はMAF1遺伝子に関するsiRNA-2のセンス鎖の塩基配列を示す。
配列番号42はMAF1遺伝子に関するsiRNA-3のセンス鎖の塩基配列を示す。
配列番号43はACVR2B遺伝子に関するsiRNA-1(626-646)のセンス鎖の塩基配列を示す。
配列番号44はACVR2B遺伝子に関するsiRNA-1(208-228)のセンス鎖の塩基配列を示す。
配列番号45はACVR2B遺伝子に関するsiRNA-2のセンス鎖の塩基配列を示す。
配列番号46はACVR2B遺伝子に関するsiRNA-3のセンス鎖の塩基配列を示す。
配列番号47はFAM119A遺伝子に関するsiRNA-1(754-774)のセンス鎖の塩基配列を示す。
配列番号48はFAM119A遺伝子に関するsiRNA-1(1068-1088)のセンス鎖の塩基配列を示す。
配列番号49はFAM119A遺伝子に関するsiRNA-2のセンス鎖の塩基配列を示す。
配列番号50はFAM119A遺伝子に関するsiRNA-3のセンス鎖の塩基配列を示す。
配列番号51はLTB4DH 遺伝子に関するsiRNA-1(775-795)のセンス鎖の塩基配列を示す。
配列番号52はLTB4DH 遺伝子に関するsiRNA-1(658-678)のセンス鎖の塩基配列を示す。
配列番号53はLTB4DH 遺伝子に関するsiRNA-2のセンス鎖の塩基配列を示す。
配列番号54はLTB4DH 遺伝子に関するsiRNA-3のセンス鎖の塩基配列を示す。
配列番号55はDPM2遺伝子に関するsiRNA-1(145-165)のセンス鎖の塩基配列を示す。
配列番号56はDPM2遺伝子に関するsiRNA-1(84-104)のセンス鎖の塩基配列を示す。
配列番号57はDPM2遺伝子に関するsiRNA-2のセンス鎖の塩基配列を示す。
配列番号58はDPM2遺伝子に関するsiRNA-3のセンス鎖の塩基配列を示す。
配列番号59はSEPX1遺伝子に関するsiRNA-1(870-890)のセンス鎖の塩基配列を示す。
配列番号60はSEPX1遺伝子に関するsiRNA-1(794-814)のセンス鎖の塩基配列を示す。
配列番号61はSEPX1遺伝子に関するsiRNA-2のセンス鎖の塩基配列を示す。
配列番号62はSEPX1遺伝子に関するsiRNA-3のセンス鎖の塩基配列を示す。
配列番号63はPSMA3遺伝子に関するsiRNA-1(853-873)のセンス鎖の塩基配列を示す。
配列番号64はPSMA3遺伝子に関するsiRNA-1(686-706)のセンス鎖の塩基配列を示す。
配列番号65はPSMA3遺伝子に関するsiRNA-2のセンス鎖の塩基配列を示す。
配列番号66はPSMA3遺伝子に関するsiRNA-3のセンス鎖の塩基配列を示す。
配列番号67はCHCHD3遺伝子に関するsiRNA-1(546-566)のセンス鎖の塩基配列を示す。
配列番号68はCHCHD3遺伝子に関するsiRNA-1(1450-1470)のセンス鎖の塩基配列を示す。
配列番号69はCHCHD3遺伝子に関するsiRNA-2のセンス鎖の塩基配列を示す。
配列番号70はCHCHD3遺伝子に関するsiRNA-3のセンス鎖の塩基配列を示す。
配列番号71はLSM3遺伝子に関するsiRNA-1(540-560)のセンス鎖の塩基配列を示す。
配列番号72はLSM3遺伝子に関するsiRNA-1(37-57)のセンス鎖の塩基配列を示す。
配列番号73はLSM3遺伝子に関するsiRNA-2のセンス鎖の塩基配列を示す。
配列番号74はLSM3遺伝子に関するsiRNA-3のセンス鎖の塩基配列を示す。
配列番号75はGTSE1遺伝子に関するsiRNA-2のセンス鎖の塩基配列を示す。
配列番号76はGTSE1遺伝子に関するsiRNA-3のセンス鎖の塩基配列を示す。
Claims (11)
- 配列番号1又は13に示される塩基配列内の少なくとも15塩基長の連続した塩基配列と特異的にハイブリダイズする、15塩基長以上の塩基配列を有するポリヌクレオチドからなる、がん細胞の不死化を判定するための遺伝子マーカー。
- プローブ又はプライマーである、請求項1記載のがん細胞の不死化を判定するための遺伝子マーカー。
- 下記工程(1)〜(3)を含む、不死化がん細胞の判定方法:
(1)被験者から採取されたがん細胞を含み得る生体試料から調製されたRNA又は当該RNAの派生物と請求項1又は2のいずれか1項記載の遺伝子マーカーとを結合させる工程、
(2)上記遺伝子マーカーに結合したRNA又は当該RNAの派生物の量を、該遺伝子マーカーを指標として測定する工程、
(3)上記工程(2)で得られたRNA又はその派生物の量(以下、総称して「RNA量」という)と不死化していない正常もしくはがん細胞における対応するRNA又はその派生物の量(以下、総称して「対照RNA量」という)とを比較する工程。 - さらに下記工程(4)を含む、請求項3に記載する不死化がん細胞の判定方法:
(4)工程(2)で得られたRNA量が対照RNA量より高い場合に、被験者のがん細胞が不死化していると判定し、高くない場合に被験者のがん細胞が不死化していないと判定する工程。 - 下記工程(1’)〜(3’)を含む、不死化がん細胞の判定方法。
(1’)被験者から採取されたがん細胞を含み得る生体試料から調製されたポリペプチドを含むタンパク質含有画分と、配列番号14又は26に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを認識する抗体とを結合させる工程
(2’)上記抗体に結合したポリペプチドの量を、該抗体を指標として測定する工程
(3’)上記工程(2’)で得られたポリペプチド量と不死化していない正常もしくはがん細胞における対応するポリペプチドの量(以下、「対照ポリペプチド量」という)とを比較する工程。 - 下記工程(4’)を含む、請求項5に記載する不死化がん細胞の判定方法。
(4’)工程(2’)で得られたポリペプチド量が対照ポリペプチド量より高い場合に被験者のがん細胞が不死化していると判定し、高くない場合に被験者のがん細胞が不死化していないと判定する工程。 - 請求項1に記載する遺伝子マーカー、および
配列番号14又は26に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを認識する抗体
からなる群から選択される少なくとも1つを含む、不死化がん細胞判定用試薬キット。 - 下記工程(A)〜(D)を含む、不死化がん細胞の増殖を抑制する物質のスクリーニング方法。
(A)被験物質と、配列番号1又は13に示される塩基配列からなる遺伝子を発現可能な細胞とを接触させる工程
(B)被験物質を接触させた細胞について、配列番号1又は13に示される塩基配列からなる遺伝子の発現量を測定する工程
(C)上記工程(B)で得られた遺伝子の発現量と被験物質を接触させない対照の細胞における対応する遺伝子の発現量(以下、「対照発現量」という)を比較する工程、および
(D)上記工程(B)で得られた遺伝子の発現量が対照発現量よりも低い場合に、当該被験物質を不死化がん細胞の増殖を抑制する物質として選択する工程。 - 下記工程(A’)〜(D’)を含む、不死化がん細胞の増殖を抑制する物質のスクリーニング方法。
(A’)被験物質と、配列番号14又は26に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドとを接触させる工程、
(B’)被験物質を接触させた配列番号14又は26に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの活性を測定する工程、
(C’)上記工程(B’)で得られたポリペプチドの活性と被験物質を接触させない対照の活性(以下、「対照活性」という)を比較して、上記工程(B’)で得られたポリペプチドの活性の程度を識別する工程、および
(D’)上記工程(B’)で得られたポリペプチドの活性が対照活性よりも低い場合に、
当該被験物質を不死化がん細胞の増殖を抑制する物質として選択する工程。 - 配列番号1又は13に示される塩基配列の少なくとも15塩基長以上の連続した塩基配列に特異的にハイブリダイズする、15塩基以上の塩基配列からなるポリヌクレオチドを有効成分とする、不死化がん細胞増殖抑制剤。
- 上記ポリヌクレオチドが、配列番号27〜30及び75〜76のいずれかに示される塩基配列からなるポリヌクレオチドである、請求項10記載の不死化がん細胞増殖抑制剤。
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