KR101496745B1 - 인간 암세포의 불사화에 관련되는 유전자 및 그 용도 - Google Patents

인간 암세포의 불사화에 관련되는 유전자 및 그 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 암세포의 불사화에 관련되는 유전자(불사화 규정 유전자) 및 해당 유전자를 갖는 불사화 암세포를 표적으로 한 선택적인 암치료에 유용한 방법을 제공한다.
서열 번호 1~13 중 선택되는 염기 서열 내 적어도 15 염기 길이의 연속한 염기 서열과 특이적으로 하이브리다이즈하는 15 염기 길이 이상의 염기 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드를 이용하여, 불사화 암세포를 판정한다. 해당 폴리뉴클레오티드는, 해당 판정 방법에 있어서, 불사화 암세포에 특이적으로 높게 발현하고 있는 불사화 규정 유전자를 검출하기 위한 프라이머나 프로브로 사용된다.

Description

인간 암세포의 불사화에 관련되는 유전자 및 그 용도{Gene involved in immortalization of human cancer cell and use thereof}
본 발명은, 암세포의 불사화에 관련되는 유전자(불사화 규정 유전자) 및 해당 유전자를 가지는 불사화 암세포를 표적으로 한 선택적인 암치료에 유용한 방법을 제공한다. 보다 구체적으로는, 본 발명은 불사화 규정 유전자를 지표로 하는 불사화 암세포의 판정 방법 및 그 판정에 사용하는 시약을 제공한다. 또한 본 발명은 불사화 암세포를 표적으로 하는 선택적인 항암제(불사화 암세포 증식 억제제)의 유효 성분을 스크리닝 하는 방법 및 해당 항암제(불사화 암세포 증식 억제제)를 제공한다.
인간 고형암은 근치(根治) 수술이 이루어지지 않는 한 예후 불량이며, 그 주된 요인은 현재의 화학요법의 효과가 불충분하다는데에 기인한다. 종래의 화학요법 약은, 핵산 합성 과정, DNA, 미소관에 작용하여, 핵산으로부터 단백질 생성 과정을 저해하는 것을 기본으로 하여, 암 세포 뿐 아니라 세포 증식이 일어나는 재생성 조직 정상세포에의 장해를 피할 수 없었다. 최근, 암 세포에 특이적으로 발현하고 있는 분자가 차례차례로 분류되고 있어, 이들을 표적으로 하는 저해약의 경우 정상세포에의 유해 반응을 최소로 할 수 있으며 그 결과, 투여량도 증대할 수 있다. 이러한 분자 표적 치료약도 개발되어 왔지만, 그 최대의 결점은, 반드시 많은 증례에 유효한 것은 아니고, 개개의 증례에 의해 효과가 달라, 그것을 투여 전에 예측하는 것이 불완전하다는 것이다. 분자 표적 치료약의 효과가 개개의 증례로 크게 다른 이유로 치료의 표적으로 여겨 온 분자가 발암 과정이나 전이에 관련되는 유전자인 것을 들 수 있다. 발암 과정은 암종에 따라서 뿐 아니라, 같은 암종 내에서도 다양하기 때문에, 표적으로 하는 분자가 암의 증식에 관여하는 정도는 개개의 증례에 따라 다르다고 생각된다. 그러므로, 암종을 넘어 보편적으로 중심적 역할을 하는 분자가 확인되면, 많은 암 증례에 보편적으로 효과를 기대할 수 있는 분자 표적 치료약의 개발이 가능해진다.
인간을 포함한 모든 척추동물의 염색체의 양말단은“TTAGGG”라고 하는 단순 반복 서열이 계속되지만(인간에서는 약 10 kb, 마우스는 그 수배), 세포 분열에 수반하는 DNA 복제마다 말단을 완전하게는 복제하지 못하고 조금씩(인간에서는 약 200 염기) 단축해 간다. 이 말단 구조가 「텔로미어(telomere)」이며, 텔로미어가 세포 분열에 따라 일정(인간비암세포에서는 약 5 kb) 수준 이하로 단축되면, 이미 세포는 분열할 수 없게 된다. 암화하면 더욱 분열할 수 있지만, 그래도 텔로미어가 궁극적으로 단축하면(약 2 kb) 세포는 사멸하게 된다. 이 단축한 텔로미어를 신장하여 텔로미어의 길이를 안정되게 유지함으로써 세포 분열 수명을 늘리는 것이, 역전사 효소인 「텔로메라제」이다(비특허 문헌 1 참조). 이 텔로메라제는, 통상의 정상 체세포에서는 발현하고 있지 않고, 그러므로 분열 가능 회수는 몇 십회에 한정되어 있지만, 무한히 증식 하는 것이 가능한 생식 세포와 불사화 암세포에서는 높게 발현하고 있다. 이전에는 암세포는 모든 것이 불사화하고 있는 것이라고 생각하는 경향이 있었지만, 임상적으로 분명한 암이어도 반드시 텔로메라제 활성이 검출되지 않는 예가 있고(비특허 문헌 2 및 3 등 참조), 텔로메라제 효소 성분인 TERT를 비(非)암세포에 강제 발현시켜도 암세포의 형질을 나타내지 않는 것(비특허 문헌 4 참조)등을 보아, 현재 암화와 불사화는 다른 현상으로 이해되고 있다.
비특허 문헌 1 : Harley CB, Mutation Res, 256: 271-82, 1991
비특허 문헌 2 : Kim NW 등, Science 266: 2011-5, 1994
비특허 문헌 3 : Hiyama K 등, J Natl Cancer Inst 87: 895-902, 1995
비특허 문헌 4 : Morales CP 등, Nat Genet 21: 115-8, 1999
비특허 문헌 5 : Shay JW, Bacchetti S, Eur J Cancer 33: 787-91, 1997
비특허 문헌 6 : Hiyama K 등, J Immunol 155: 3711-5, 1995
비특허 문헌 7 : Hiyama E 등, Int J Oncol 9: 453-8, 1996
비특허 문헌 8 : Forsyth NR 등, Aging Cell 2: 235-43, 2003
비특허 문헌 9 : Bodnar AG 등, Exp Cell Res 228: 58-64, 1996
비특허 문헌 10 : Hiyama K 등, Int J Oncol 27: 87-95, 2005
본 발명은, 불사화 암세포의 판정 방법 및 그 판정에 사용하는 시약에 관한 것이다. 또한 본 발명은, 불사화 암세포의 증식을 특이적으로 억제하는 작용을 하여 선택적인 항암제로서 유용한, 불사화 암세포 증식 억제제의 유효 성분을 스크리닝 하는 방법 및 해당 불사화 암세포 증식 억제제에 관한 것이다.
본 발명자들은 암치료, 특히 많은 암 증례에 보편적으로 효과가 기대되는 분자 표적 치료약의 개발을 목표로 하여, 암세포의 암화(악성화) 형질과는 다른 또 하나의 형질 「불사화」에 주목하였다. 즉, 체내에 암세포가 출현하더라도 무한 증식을 억제시키면, 숙주를 죽음에 이르게 할 때까지 증대·전이하지는 않을 뿐 아니라, 통상의 화학요법이나 비(非)근치적 수술에 의해 어느 정도 잔존 암세포수를 줄이는 것으로도, 그것이 재차 증대하기까지는 분열 수명이 다해 자연스럽게 사멸하는 것이 기대된다. 지금까지 조사할 수 있던 수 천가지 검체물 임상 암 검체의 80% 이상이 텔로메라제를 발현하고 있는 점(비특허 문헌 5 참조), 지금까지 조사할 수 있던 모든 암종에 있어서 텔로메라제 발현이 확인된 점, 인간 암 유래의 세포주는 거의 모두 텔로메라제를 발현하고 있는 점(비특허 문헌 2 참조), 일단 텔로메라제를 발현한 세포는 자연적으로 음성화되지 않는 점 등에서, 다양한 발암 과정과 달리, 이 불사화 과정은, 많은 암세포에 꽤 보편적으로 공통적으로 존재한다고 생각된다. 즉, 불사화를 규정하는 분자를 표적으로 함으로써, 암종을 넘어 보편적으로 많은 증례에 유효한 암의 무한 증식 억제가 가능하여질 것으로 기대할 수 있다. 이러한 의미에서, 텔로메라제 자체를 표적으로 하는 항암전략도 시도되고 있다.
그렇지만, 본 발명자등은 정상 체세포이어도 재생성 조직의 선구 세포나 임파구에는 텔로메라제 활성이 검출된다는 것을 이미 발견하였고(비특허 문헌 6 및 7 참조), 한층 더 텔로메라제 효소 성분인 TERT를 비암세포에서 강제 발현시켜도 반드시 불사화하지는 않는 점(비특허 문헌 8 참조), 텔로메라제를 발현하는 정상 선구 세포나 임파구는 결코 불사화하고 있는 것은 아니고 연명할 뿐이라는 점(비특허 문헌 6 및 9 참조) 등에서도, 텔로메라제의 발현만으로 세포가 불사화하는 것은 아닌 것이 분명하다. 즉, 인간 세포의 불사화에는, 염색체 말단 텔로미어를 연장하는 효소 텔로메라제의 활성화가 거의 필수이지만 충분하지 않고, 텔로메라제 활성화에 가세해 불사화에 불가결한 분자가 존재하고 있어, 그 분자는 암세포에 특이적으로 작용하고 있을 것으로 예상된다. 사실, 본 발명자등은, 정상 체세포에 TERT를 도입해 텔로메라제를 강제 발현시키고 불사화 시킨 클론(clone)에서 특이적으로 발현 변동하고 있는 유전자는, 보고된 암세포의 발현 변동과는 전혀 다르다는 것을 확인하였다(비특허 문헌 10 참조). 이러한 것으로도 정상세포의 불사화와 암세포의 불사화에 관련되는 유전자는 다르다고 말할 수 있다. 텔로메라제 자체를 표적으로 하면, 임파구, 혈액 전구 세포 및 소화관 점막 클립트 세포 등의 분열 능력이 억제되어 암치료의 유해 현상으로 치명적인 면역능력, 조혈능력 및 소화관 기능 장해가 될 위험성이 높지만, 암세포에서만 작용하는 불사화 규정 인자를 표적으로 하면, 텔로메라제 활성 양성의 정상간(正常幹)/전구 세포 등의 기능을 해치는 일 없이 암세포 특이적인 무한 증식의 저지가 가능해질 것으로 생각된다.
앞으로 살펴보겠지만, 본 발명자 등은 인간 암세포의 불사화에 보편적으로 관련되는 유전자를 찾아낼 수 있도록, 예의 탐구하였다. 그 결과, 해당 유전자는 정상세포에 있어서의 텔로메라제의 활성화에 의한 연명에는 관련되지 않고, 암세포의 증식 유지에 특이적으로 작용하고 있다고 생각하여, 그 불사화 규정 유전자로 13개 유전자(표 1 참조)를 특정하였다. 그 개략은 다음과 같다. 우선, 암종을 넘어 보편적으로 발현 증강하고 있는 유전자를 마이크로 어레이 해석에 의해 추출하여, 얻을 수 있던 유전자 중에서, 불사화한 암세포로 구성되어 있는 임상적 암조직에 있어, 불사화하지 않고 있는 암세포로 구성되어 있는 암조직의 발현 수준보다 발현이 증강하고 있고, 게다가 정상세포에 텔로메라제를 도입해 발현시킨 세포에서는 발현 또는 증강하고 있지 않은 유전자를 13종 선택하였다. 그 다음에, 얻을 수 있던 13종의 유전자의 발현을 불사화 암세포내에서 siRNA에 의해 억제하면, 모두 불사화 암세포의 증식이 억제되는 것을 확인하였다.
본 발명자 등은, 이러한 발견에 근거해 한층 더 검토를 거듭한 결과, 본 발명을 완성하기에 이르렀다. 즉, 본 발명은 하기의 태양을 갖는다.
항 1. 서열 번호 1~13 중 어느 하나로 표시되는 염기서열 내의 15 염기 길이 이상의 연속적인 염기서열과 특이적으로 하이브리다이즈하며, 15 염기 길이 이상의 염기 서열을 갖는 폴리뉴클레오타이드로 구성되는, 암세포의 불사화를 판정하기 위한 마커 유전자.
항 2. 제 1항에 있어서, 암세포의 불사화를 판정하기 위한 마커 유전자는 프로브 또는 프라이머인 것을 특징으로 하는 마커 유전자.
항 3.
(1) 피험자로부터 채취되었고, 암세포가 포함된 것이 예상되는 생체 시료로부터 수득된 RNA 또는 이의 파생물과 1항 또는 2항의 마커 유전자를 결합시키는 단계;
(2) 상기 마커 유전자를 지표로 사용하여, 상기 마커 유전자에 결합한 RNA 또는 이의 파생물의 양을 측정하는 단계; 및,
(3) 상기 단계(2)에서 얻은 RNA 또는 이의 파생물의 양(이하, 「RNA량」)과 불사화되지 않은 정상세포 또는 암세포의 상응하는 RNA 또는 이의 파생물의 양(이하, 「대조 RNA량」)을 비교하는 단계를 포함하는 불사화 암세포의 판정 방법.
*항 4. 제 3항에 있어서,
(4) 단계 (2)에서 숙득한 RNA량이 대조 RNA량보다 높은 경우에, 피험자의 암세포가 불사화되었다고 판정하고, 높지 않은 경우 피험자의 암세포가 불사화되지 않았다고 판정하는 단계를 추가로 포함하는 불사화 암세포의 판정 방법.
항 5. 서열번호 14 내지 26으로 기재되는 군으로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 인식하는 항체.
상기 항체는 불사화된 암세포의 판정 용도로 적합하다.
항 6. (1＇) 피험자로부터 채취되었고, 암세포가 포함된 것이 예상되는 생체 시료로부터 수득된 폴리펩티드를 포함하는 단백질 함유 분획(protein-containing fraction)과, 제 5항의 항체를 결합시키는 단계;
(2＇) 상기 항체를 지표로 하여, 상기 항체에 결합한 폴리펩티드의 양을 측정하는 단계; 및,
(3＇) 상기 단계(2＇)에서 수득한 폴리펩티드량과 불사화되지 않은 정상세포 또는 암세포의 상응하는 폴리펩티드의 양(이하, 「대조 폴리펩티드량」)을 비교하는 단계를 포함하는 불사화 암세포의 판정 방법.
항 7. 제 6항에 있어서,
(4＇) 단계(2＇)에서 수득한 폴리펩티드량이 대조 폴리펩티드량보다 높은 경우에 피험자의 암세포가 불사화되었다고 판정하고, 높지 않은 경우에 피험자의 암세포가 불사화되지 않았다고 판정하는 단계를 추가로 포함하는 불사화 암세포의 판정 방법.
항 8. 제 1항의 마커 유전자 및 제 5항의 항체로 구성되는 군으로부터 선택되는 1개 이상을 포함하는, 불사화 암세포 판정용 시약 키트.
항 9.
(A) 서열번호 1 내지 13으로 기재되는 군으로부터 선택된 어느 하나의 불사화 규정 유전자를 발현할 수 있는 세포를 피험물질과 접촉시키는 단계;
(B) 상기 피험물질을 접촉시킨 세포에서 불사화 규정 유전자의 발현량을 측정하는 단계;
(C) 상기 단계(B)에서 수득한 불사화 규정 유전자의 발현량과, 피험물질을 접촉시키지 않는 대조세포에 있어서의 상응하는 유전자의 발현량(이하, 「대조 발현량」)을 비교하는 단계; 및,
(D) 상기 단계(B)에서 수득한 불사화 규정 유전자의 발현량이 대조 발현량보다 적은 경우, 해당 피험물질을 불사화 암세포의 증식을 억제하는 후보물질로 선택하는 단계를 포함하는 불사화 암세포의 증식을 억제하는 물질의 스크리닝 방법.
항 10.
(A＇) 서열번호 14 내지 26으로 기재되는 군으로부터 선택된 어느 하나의 아미노산 서열로 구성된 폴리펩티드를 피험물질과 접촉시키는 단계;
(B＇) 상기 피험물질로 접촉된, 서열번호 14 내지 26으로 기재되는 군으로부터 선택된 어느 하나의 아미노산 서열로 구성된 폴리펩티드의 활성을 측정하는 단계;
(C＇) 상기 단계(B＇)에서 수득한 폴리펩티드의 활성과, 피험물질을 접촉시키지 않는 대조군의 활성(이하, 「대조 활성」)을 비교하여, 상기 단계(B＇)에서 얻은 폴리펩티드의 활성 정도를 식별하는 단계; 및,
(D＇) 상기 단계(B＇)에서 얻은 폴리펩티드의 활성이 대조 활성보다 낮은 경우, 상기 피험물질을 불사화 암세포의 증식을 억제하는 후보물질로 선택하는 단계를 포함하는 불사화 암세포의 증식을 억제하는 물질의 스크리닝 방법.
항 11. 서열 번호 1~13 중 어느 하나로 표시되는 염기 서열의 15 염기 길이 이상의 연속적인 염기서열과 특이적으로 하이브리다이즈하며, 15 염기 이상의 염기 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드를 유효 성분으로 하는 불사화 암세포 증식 억제제.
항 12. 제 11항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드가, 서열번호 27~76 중 어느 하나로 표시되는 염기 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드인 것을 특징으로 하는 불사화 암세포 증식 억제제.
항 13. 제 11항 또는 제 12항의 불사화 암세포 증식 억제제를 환자의 암세포에 투여하는 단계를 포함하는 항암요법.
항 14. 서열 번호 1~13 중 어느 하나로 표시되는 염기 서열의 15 염기 길이 이상의 연속적인 염기 서열에 특이적으로 하이브리다이즈하는, 15 염기 이상의 염기 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드의, 불사화 암세포 증식 억제제의 제조를 위한 용도.
항 15. 제 14항에 있어서 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 27~76 중 어느 하나로 표시되는 염기 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드인 불사화 암세포 증식 억제제의 제조를 위한 용도.
본 발명에 의해, 복수의 암종에 대하여, 불사화 암세포에 특이적으로 발현이 증대하여, 암종을 넘어 보편적으로 암세포의 불사화를 규정하는 유전자가 밝혀졌다. 본 발명의 불사화 암세포의 판정 방법 및 그 판정 방법으로 사용하는 시약을 이용하면, 관계된 불사화 규정 유전자의 발현 정도를 식별할 수 있고, 그 정도로부터, 통상의 병리 진단에서는 판정할 수 없었던 불사화 암세포와 유한 수명 세포를 감별 할 수 있다. 그리고 해당 감별에 의해, 암의 조기진단·치료 선택·예후 예측에의 임상 응용이 가능해진다.
또 본 발명의 불사화 규정 유전자를 표적으로 한 스크리닝 방법을 이용하여, 불사화 암세포의 증식을 특이적으로 억제할 수 있는 항암제의 유효 성분을 얻을 수 있다.
[도 1] 인간 세포의 암화(canceration) 및 불사화의 메카니즘을 나타내는 개략도이다.
[도 2] 본 발명의 표적 유전자 추출 방법을 나타내는 개략도이다.
[도 3a] 내지 [도 3d] 올리고 어레이(oligo array)를 이용한, 각종 불사화 암세포에 있어 UBE2S 유전자의 발현 수준을 나타내고,
불사화된 암세포(검은색으로 표시, MCF-12A, SV11e, SV11-106 이외에는 모두 인간 유래 암 세포주)는 유한 수명의 비종양성 세포(흰색으로 표시)에 비해 UBE2S 유전자가 고발현되고(도 3a 내지 도 3d), 텔로머라제 양성 폐암 전이조직(불사화된 암세포, 「D4M2」)에서 동일 증상의 텔로머라제 음성 원발조직(비불사화된 암세포, 「D2Pr」) 보다 상기 유전자가 고발현되고(도 3c), 불사화되지 않은 암세포가 혼재되어 있는 췌장암 조직(사선으로 표시)보다 불사화된 세포만으로 구성되는 췌장암 세포주(검은색으로 표시)에서 상기 유전자가 고발현된다(도 3a).
[도 4] 올리고 어레이에 의한, 각종 불사화 암세포에 있어 RFC4 유전자의 발현 수준을 나타낸다.
[도 5] 올리고 어레이에 의한, 각종 불사화 암세포에 있어 PTGES2 유전자의 발현 수준을 나타낸다.
[도 6] 올리고 어레이에 의한, 각종 불사화 암세포에 있어 MAF1 유전자의 발현 수준을 나타낸다.
[도 7] 올리고 어레이에 의한, 각종 불사화 암세포에 있어 ACVR2B 유전자의 발현 수준을 나타낸다.
[도 8] 올리고 어레이에 의한, 각종 불사화 암세포에 있어 FAM119A 유전자의 발현 수준을 나타낸다.
[도 9] 올리고 어레이에 의한, 각종 불사화 암세포에 있어 LTB4DH 유전자의 발현 수준을 나타낸다.
[도 10] 올리고 어레이에 의한, 각종 불사화 암세포에 있어 DPM2 유전자의 발현 수준을 나타낸다.
[도 11] 올리고 어레이에 의한, 각종 불사화 암세포에 있어 SEPX1 유전자의 발현 수준을 나타낸다.
[도 12] 올리고 어레이에 의한, 각종 불사화 암세포에 있어 PSMA3 유전자의 발현 수준을 나타낸다.
[도 13] 올리고 어레이에 의한, 각종 불사화 암세포에 있어 CHCHD3 유전자의 발현 수준을 나타낸다.
[도 14] 올리고 어레이에 의한, 각종 불사화 암세포에 있어 LSM3 유전자의 발현 수준을 나타낸다.
[도 15] 올리고 어레이에 의한, 각종 불사화 암세포에 있어 GTSE1 유전자의 발현 수준을 나타낸다.
[도 16] 암세포주에 있어서의 siRNA에 의한 UBE2S 유전자의 발현 억제와 그 증식 억제 효과를 나타낸다(실시예 2).
[도 17] 암세포주에 있어서의 siRNA에 의한 RFC4 유전자의 발현 억제와 그 증식 억제 효과를 나타낸다(실시예 2).
[도 18] 암세포주에 있어서의 siRNA에 의한 PTGES2 유전자의 발현 억제와 그 증식 억제 효과를 나타낸다(실시예 2).
[도 19] 암세포주에 있어서의 siRNA에 의한 MAF1 유전자의 발현 억제와 그 증식 억제 효과를 나타낸다(실시예 2).
[도 20] 암세포주에 있어서의 siRNA에 의한 ACVR2B 유전자의 발현 억제와 그 증식 억제 효과를 나타낸다(실시예 2).
[도 21] 암세포주에 있어서의 siRNA에 의한 FAM119A 유전자의 발현 억제와 그 증식 억제 효과를 나타낸다(실시예 2).
[도 22] 암세포주에 있어서의 siRNA에 의한 LTB4DH 유전자의 발현 억제와 그 증식 억제 효과를 나타낸다(실시예 2).
[도 23] 암세포주에 있어서의 siRNA에 의한 DPM2 유전자의 발현 억제와 그 증식 억제 효과를 나타낸다(실시예 2).
[도 24] 암세포주에 있어서의 siRNA에 의한 SEPX1 유전자의 발현 억제와 그 증식 억제 효과를 나타낸다(실시예 2).
[도 25] 암세포주에 있어서의 siRNA에 의한 PSMA3 유전자의 발현 억제와 그 증식 억제 효과를 나타낸다(실시예 2).
[도 26] 암세포주에 있어서의 siRNA에 의한 CHCHD3 유전자의 발현 억제와 그 증식 억제 효과를 나타낸다(실시예 2).
[도 27] 암세포주에 있어서의 siRNA에 의한 LSM3 유전자의 발현 억제와 그 증식 억제 효과를 나타낸다(실시예 2).
[도 28] 암세포주에 있어서의 siRNA에 의한 GTSE1 유전자의 발현 억제와 그 증식 억제 효과를 나타낸다(실시예 2).
(I) 불사화 규정 유전자
본 발명에 있어 「불사화하지 않은 암세포」란, 암세포 가운데,(1) 텔로메라제 활성이 적고, (2) 텔로미어 길이가 단축하는 한편 (3) 텔로메라제 단백질의 발현을 확인할 수 없는 유한 수명 세포를 의미한다. 한편, 본 발명에 있어「불사화 암세포」란, 암세포 가운데, 상기 (1) ~ (3) 중 적어도 1개의 특징을 갖추지 않은 세포, 즉 텔로메라제 활성이 양성이거나, 텔로미어 길이가 연장하고 있거나, 및/또는 텔로메라제 단백질의 발현을 확인할 수 있는 세포로, 무한하게 세포 증식 하는 것이 가능하게 된 세포를 의미한다.
본 발명에 있어 「불사화 규정 유전자」란, 암세포의 불사화를 규정하는 유전자를 의미한다.
본 발명이 대상으로 하는 암세포는 특별히 한정되지 않고, 예를 들면, 폐암, 유방암, 식도암, 머리 경부암, 위암, 결장암, 직장암, 간암, 담낭·담관암, 췌장암, 방광암, 전립선암, 자궁경암 등에서 유래된 것들을 들 수 있다.
　불사화 규정 유전자로는 구체적으로, (1) UBE2S 유전자, (2) RFC4 유전자, (3) PTGES2 유전자, (4) MAF1 유전자, (5) ACVR2B 유전자, (6) FAM119A 유전자, (7) LTB4DH 유전자, (8) DPM2 유전자, (9) SEPX1 유전자, (10) PSMA3 유전자, (11) CHCHD3 유전자, (12) LSM3 유전자, 및 (13) GTSE1 유전자를 들 수 있다. 이러한 유전자의 GenBank 접근번호, 정식 유전자명, 유전자 기호 및 이러한 유전자의 염기 서열을 나타낸 서열 번호를 하기의 표 1에 기재하였다. 한편, 표 1에서 유전자명, 유전자 기호 등은, NCBI로 인터넷 공개(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)된 데이터에 근거하여 기재하였다.
SEQ ID No. GenBank
Accession No.		 Gene Name Gene Symbol
1 NM_014501 ubiquitin-conjugating enzyme E2S UBE2S
2 NM_002916 replication factor C (activator 1) 4, 37kDa RFC4
3 NM_025072 prostaglandin E synthase 2 PTGES2
4 NM_032272 MAF1 homolog (S. cerevisiae) MAF1
5 NM_001106 activin A receptor, type IIB ACVR2B
6 NM_145280 family with sequence similarity 119, member A FAM119A
7 NM_012212
(D49387,
BQ214856)		 leukotriene B4 12-hydroxydehydrogenase LTB4DH
8 NM_003863 dolichyl-phosphate mannosyltransferase polypeptide 2, regulatory subunit DPM2
9 NM_016332 selenoprotein X, 1 SEPX1
10 NM_002788 proteasome (prosome, macropain) subunit, alpha type, 3 PSMA3
11 NM_017812 coiled-coil-helix-coiled-coil-helix domain containing 3 CHCHD3
12 NM_014463 LSM3 homolog, U6 small nuclear RNA associated (S. cerevisiae) LSM3
13 NM_016426 G-2 and S-phase expressed 1 GTSE1
실시예 1에서 볼 수 있듯이, 상기 각종의 불사화 규정 유전자는, 모두 폐암, 식도암 및 유방암 등의 복수의 암종에서 유래하는 불사화 암세포에 특이적으로 높게 발현하고 있다. 또, 실시예 2에서 볼 수 있듯이,불사화 암세포내에서 siRNA를 이용하여 이들 13종 유전자의 발현을 억제하면, 모두 불사화 암세포의 증식이 억제되었다. 이러한 것에 근거하여, 상기 13종의 불사화 규정 유전자는 모두 암세포의 불사화를 규정하는 유전자(불사화 규정 유전자)라고 생각된다.
(II) 암세포의 불사화를 판정하기 위한 시약(유전자 마커)
전술한 바와 같이, 서열 번호 1~13로 표시되는 염기 서열로 이루어진 각각의 불사화 규정 유전자((1) ~ (13))가 모두 복수의 암종에서 유래하는 불사화 암세포에 특이적으로 높게 발현하고 있다는 점을 이용하여, 이것을 지표(마커 유전자)로 하여 암세포의 불사화의 유무를 판정하는 것이 가능하다.
본 발명은, 관계있는 암세포의 불사화를 판정하기 위해서 매우 적합하게 사용되는 수단(시약)으로 불사화 규정 유전자 마커(이하,「유전자 마커」)을 제공한다. 해당 유전자 마커는, 전술한 서열 번호 1~13 중 어느 하나로 표시되는 불사화 규정 유전자의 염기 서열내의 적어도 15 염기 길이의 연속한 염기 서열과 특이적으로 하이브리다이즈 하는, 적어도 15 염기 길이를 갖는 폴리뉴클레오티드로 설계된다. 아울러 본 발명의 유전자 마커의 형태는, 그 목적에 따라 적당히 설정할 수 있는데, 단일가닥 DNA, 단일가닥RNA, 이중가닥DNA, 이중가닥 RNA 및 DNA:RNA 하이브리드(hybrid) 중 어느 것이어도 좋다.
해당 유전자 마커에는, 불사화 암세포를 판정할 때에, 암세포중에서의 불사화 규정 유전자의 발현의 유무나 그 정도(발현량)를 검출하는데 유용한 프로브나 프라이머가 포함된다. 또한, 이러한 프로브나 프라이머는, 불사화 암세포의 증식을 억제하는 물질의 스크리닝에 있어서, 불사화 규정 유전자의 발현 변동을 검출하는 수단(검출 시약)으로도 유용하다.
(II-1) 프로브
불사화 암세포에서 특이적으로 높게 발현하고 있는 상기 불사화 규정 유전자〔(1) UBE2S 유전자, (2) RFC4 유전자, (3) PTGES2 유전자, (4) MAF1 유전자, (5) ACVR2B 유전자, (6) FAM119A 유전자, (7) LTB4DH 유전자, (8) DPM2 유전자, (9) SEPX1 유전자, (10) PSMA3 유전자, (11) CHCHD3 유전자, (12) LSM3 유전자 및 (13) GTSE1 유전자〕중 적어도 하나 이상을 검출함으로써 암세포의 불사화를 판정한다.
이러한 불사화 규정 유전자의 검출에는, 이러한 각 유전자의 염기 서열에 특이적으로 하이브리다이즈하여, 해당 불사화 규정 유전자를 특이적으로 검출할 수 있는 폴리뉴클레오티드가 프로브로 이용된다. 아울러 본 발명에서, 용어「폴리뉴클레오티드」는 복수 개의 염기 서열로 구성되는 올리고뉴클레오티드도 포함된다.
상기 폴리뉴클레오티드는, 각 불사화 규정 유전자의 염기 서열내의, 적어도 15 염기 길이 ~ 각 불사화 규정 유전자의 전체 염기 길이, 바람직하게는 20 염기 길이 ~ 각 불사화 규정 유전자의 전체 염기 길이, 보다 바람직하게는 30 염기 길이~ 각 불사화 규정 유전자의 전체 염기 길이의 연속한 염기 서열과 특이적으로 하이브리다이즈하도록, 상기에 대응하는 염기 길이를 가지는 폴리뉴클레오티드로 설계된다.
본 명세서 전체에서, 또한 특허 청구의 범위에 있어서 「특이적으로 하이브리다이즈 한다」는 것은, 엄격한 하이브리다이제이션 조건하에서, 특이적인 하이브리드(hybrid)가 형성되고 비특이적인 하이브리드(hybrid)는 형성되지 않는 것을 말한다. 엄격한 하이브리다이제이션 조건은, 통상적인 방법에 따라 하이브리드(hybrid)를 형성하는 핵산의 융해 온도(Tm) 등에 기초하여 결정할 수 있다. 구체적인 하이브리다이즈 상태를 유지할 수 있는 세정 조건으로는 통상 「1×SSC, 0.1%SDS, 37℃」정도의 조건, 보다 엄격하게는 「0.5×SSC, 0.1%SDS, 42℃」정도의 조건, 한층 더 엄격하게는 「0.1×SSC, 0.1%SDS, 65℃」정도의 조건을 들 수 있다.
또한 폴리뉴클레오티드(프로브)는, 상기 불사화 규정 유전자의 적어도 15 염기 길이의 연속하는 염기 서열에 대해서 상보적인 염기 서열을 가지는 것이 바람직하지만, 상기 특이적인 하이브리다이제이션이 가능하면, 완전하게 상보적인 필요는 없다. 상기 폴리뉴클레오티드로는 바람직하게는 불사화 규정 유전자의 염기 서열에 대해 연속하는 적어도 15 염기 이상의 염기 서열로 된 폴리뉴클레오티드 또는 그 상보적인 폴리뉴클레오티드와 비교해, 염기 서열에 대해 70%이상, 바람직하게는 80%이상, 보다 바람직하게는 90%이상, 한층 더 바람직하게는 95%이상, 특히 바람직하게는 98%이상의 동일성을 가지는 폴리뉴클레오티드이다. 이 때, 염기 서열의 동일성은, 동일성 검색, 서열 alignment 프로그램, BLAST, FASTA, ClustalW 등을 이용하여 계산할 수 있다.
본 발명에 적합한 프로브는 구체적으로는, 하기와 같이 (1) ~ (13)으로 구성되는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드(단, 해당 폴리뉴클레오티드가 RNA의 경우는, 서열중의 염기 「t」는 「u」로 전환되어 있는 것으로 한다)에 하이브리다이즈 하는 15 염기 길이~ 각 불사화 규정 유전자의 전체 염기 길이, 바람직하게는 20 염기 길이~ 각 불사화 규정 유전자의 전체 염기 길이, 보다 바람직하게는 30 염기 길이~ 각 불사화 규정 유전자의 전체 염기 길이의 연속한 염기 서열로 된 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드를 들 수 있다.
(1) UBE2S 유전자의 염기 서열(서열 번호 1) 중 15 염기 길이 이상의 연속한 염기 서열로 된 폴리뉴클레오티드,
(2) RFC4 유전자의 염기 서열(서열 번호 2) 중 15 염기 길이 이상의 연속한 염기 서열로 된 폴리뉴클레오티드,
(3) PTGES2 유전자의 염기 서열(서열 번호 3) 중 15 염기 길이 이상의 연속한 염기 서열로 된 폴리뉴클레오티드,
(4) MAF1 유전자의 염기 서열(서열 번호 4) 중 15 염기 길이 이상의 연속한 염기 서열로 된 폴리뉴클레오티드,
(5) ACVR2B 유전자의 염기 서열(서열 번호 5) 중 15 염기 길이 이상의 연속한 염기 서열로 된 폴리뉴클레오티드,
(6) FAM119A 유전자의 염기 서열(서열 번호 6) 중 15 염기 길이 이상의 연속한 염기 서열로 된 폴리뉴클레오티드,
(7) LTB4DH 유전자의 염기 서열(서열 번호 7) 중 15 염기 길이 이상의 연속한 염기 서열로부터 되는 폴리뉴클레오티드,
(8) DPM2 유전자의 염기 서열(서열 번호 8) 중 15 염기 길이 이상의 연속한 염기 서열로 된 폴리뉴클레오티드,
(9) SEPX1 유전자의 염기 서열(서열 번호 9) 중 15 염기 길이 이상의 연속한 염기 서열로 된 폴리뉴클레오티드,
(10) PSMA3 유전자의 염기 서열(서열 번호 10) 중 15 염기 길이 이상의 연속한 염기 서열로 된 폴리뉴클레오티드,
(11) CHCHD3 유전자의 염기 서열(서열 번호 11) 중 15 염기 길이 이상의 연속한 염기 서열로 된 폴리뉴클레오티드,
(12) LSM3 유전자의 염기 서열(서열 번호 12) 중 15 염기 길이 이상의 연속한 염기 서열로 된 폴리뉴클레오티드,
(13) GTSE1 유전자의 염기 서열(서열 번호 13) 중 15 염기 길이 이상의 연속한 염기 서열로 된 폴리뉴클레오티드.
아울러, 이러한 폴리뉴클레오티드(프로브)는 각 불사화 규정 유전자의 표적 염기 서열을 이용하여, 예를 들면 시판 중인 뉴클레오티드 합성기에 의해 통상의 방법으로 제작할 수 있다. 또한, 상기 폴리뉴클레오티드(프로브)는 불사화 규정 유전자의 표적 염기 서열을 주형으로 하여 PCR 방법에 의해 제조할 수도 있다.
한층 더 바람직하게는, 해당 프로브는 각 불사화 규정 유전자를 용이하게 검출할 수 있도록 방사성 물질, 형광 물질, 화학 발광 물질, 또는 효소로 표지 될 수 있다(자세한 것은 후술한다).
또 이러한 프로브는 임의의 고체 면에 고정화해 이용할 수도 있다. 따라서 본 발명에 적합한 프로브는 앞서 언급한 폴리뉴클레오티드를 임의의 고체 면에 고정화된 프로브(예를 들면, 유전자 칩, cDNA 마이크로 어레이, 올리고 DNA 어레이 또는 멤브레인 필터(membrane filter)를 포함하는 고정화된 프로브)도 포함된다. 상기 프로브는 불사화 규정 유전자 검출용 DNA 칩, 또는 더욱 특이적으로는 불사화 암세포 검출용 DNA 칩에 적합하다.
상기 프로브(폴리뉴클레오티드)의 고정화에 사용되는 고체 면은 폴리뉴클레오티드를 고정화할 수 있는 것이면 특별히 제한되지 않으며, 예를 들면 유리판, 나일론 멤브레인(nylon memvrane), 마이크로 비즈(micro beads), 실리콘 칩, 모세관(capillary) 또는 그 외의 기판 등을 들 수 있다. 폴리뉴클레오티드를 고체 면에 고정하는 것은, 미리 합성한 폴리뉴클레오티드를 고체 면에 심는 방법도 좋고, 표적 폴리뉴클레오티드를 고체 면에서 합성하는 방법일 수 있다. 상기 고정화는 당업계에서 잘 알려진 기술로, 고정화된 프로브의 유형에 따라 임의의 적당한 방법이 사용될 수 있다. 예를 들면 DNA 마이크로 어레이의 경우, 시판되는 스팟터(spotter)(코스모·바이오 사 제품 등)를 이용할 수 있다〔예를 들면, 광식각(photolithographic) 기술(Affymetrix사) 또는 잉크젯 기술(Rosetta Inpharmatics사)에 의한 폴리뉴클레오티드의 in situ 합성 등〕.
　
(II-2) 프라이머
본 발명은 유전자 마커로서 각 불사화 규정 유전자의 염기 서열 영역을 특이적으로 증폭하기 위한 프라이머로서 이용되는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
상기 폴리뉴클레오티드로는, 하기의 (1) ~ (13)으로 구성되는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드(단, 해당 폴리뉴클레오티드가 RNA인 경우, 서열 중의 염기 기호 「t」는 「u」로 전환된다)의 일부에 특이적으로 하이브리다이즈하여, 해당 폴리뉴클레오티드 또는 일부 영역을 특이적으로 증폭하기 위하여 이용될 수 있는, 적어도 15 염기 길이, 바람직하게는 15~100 염기 길이, 보다 바람직하게는 15~50 염기 길이, 한층 더 바람직하게는 15~35 염기 길이의 연속한 염기 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드가 있다.
(1) UBE2S 유전자의 염기 서열(서열 번호 1) 중 15 염기 길이 이상이 연속한 염기 서열로 된 폴리뉴클레오티드,
(2) RFC4 유전자의 염기 서열(서열 번호 2) 중 15 염기 길이 이상이 연속한 염기 서열로 된 폴리뉴클레오티드,
(3) PTGES2 유전자의 염기 서열(서열 번호 3) 중 15 염기 길이 이상이 연속한 염기 서열로 된 폴리뉴클레오티드,
(4) MAF1 유전자의 염기 서열(서열 번호 4) 중 15 염기 길이 이상이 연속한 염기 서열로 된 폴리뉴클레오티드,
(5) ACVR2B 유전자의 염기 서열(서열 번호 5) 중 15 염기 길이 이상이 연속한 염기 서열로 된 폴리뉴클레오티드,
(6) FAM119A 유전자의 염기 서열(서열 번호 6) 중 15 염기 길이 이상이 연속한 염기 서열로 된 폴리뉴클레오티드,
(7) LTB4DH 유전자의 염기 서열(서열 번호 7) 중 15 염기 길이 이상이 연속한 염기 서열로 된 폴리뉴클레오티드,
(8) DPM2 유전자의 염기 서열(서열 번호 8) 중 15 염기 길이 이상이 연속한 염기 서열로 된 폴리뉴클레오티드,
(9) SEPX1 유전자의 염기 서열(서열 번호 9) 중 15 염기 길이 이상이 연속한 염기 서열로 된 폴리뉴클레오티드,
(10) PSMA3 유전자의 염기 서열(서열 번호 10) 중 15 염기 길이 이상이 연속한 염기 서열로 된 폴리뉴클레오티드,
(11) CHCHD3 유전자의 염기 서열(서열 번호 11) 중 15 염기 길이 이상이 연속한 염기 서열로 된 폴리뉴클레오티드,
(12) LSM3 유전자의 염기 서열(서열 번호 12) 중 15 염기 길이 이상이 연속한 염기 서열로 된 폴리뉴클레오티드,
(13) GTSE1 유전자의 염기 서열(서열 번호 13) 중 15 염기 길이 이상이 연속한 염기 서열로 된 폴리뉴클레오티드.
이러한 폴리뉴클레오티드(프라이머)는, 프로브와 같이, 상기 각 불사화 규정 유전자의 적어도 15 염기 길이의 연속하는 염기 서열에 대해서 상보적인 염기 서열을 갖는 것이 바람직하지만, 특이적인 하이브리다이제이션이 가능하면, 완전하게 상보적인 필요는 없다. 상기 폴리뉴클레오티드은 바람직하게는 불사화 규정 유전자의 염기 서열 내 연속하는 적어도 15 염기 이상의 염기 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 또는 그 상보적인 폴리뉴클레오티드와 비교해, 염기 서열에 대해 70%이상, 바람직하게는 80%이상, 보다 바람직하게는 90%이상, 한층 더 바람직하게는 95%이상, 특히 바람직하게는 98%이상의 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드이다.
아울러 이러한 폴리뉴클레오티드는, 프로브와 같이, 상기 각 불사화 규정 유전자의 표적 염기 서열을 기반으로, 통상적인 방법으로 예를 들면 시판 중인 뉴클레오티드 합성기에 의하여 제작할 수 있다.
(II-3) 표지물
상기 본 발명의 유전자 마커(프로브 또는 프라이머)는, 전술한 폴리뉴클레오티드에, 불사화 규정 유전자 검출을 위한 적당한 표지물, 예를 들면 형광 색소, 효소, 단백질, 방사성 동위체, 화학 발광 물질, 비오틴 등이 부가된 것이 포함된다.
예를 들면, 본 발명에서 이용되는 형광 색소, 방사성 동위체 또는 화학 발광 물질등의 표지물들은 뉴클레오티드를 표지하고 핵산의 검출이나 정량에 일반적으로 매우 적합하게 사용될 수 있다. 예를 들면, 형광 색소로는, HEX(4,7,2', 4', 5', 7'-헥사클로로-6-카르복실플루오레세인(7'-hexachloro-6-carboxylfluorescein), 녹색 형광 색소), 플루오레세인(fluorescein), NED(상품명, 어플라이드바이오시스템즈(Applied Biosystems사 제품, 황색 형광 색소), 또는, 6-FAM(상품명, 어플라이드바이오시스템즈사 제품, 황녹색 형광 색소), 로다민(rhodamin) 또는 그 유도체〔예를 들면, 테트라메치르로다민(TMR)〕를 들 수 있지만, 이것들로 한정되는 것은 아니다. 형광 색소로 뉴클레오티드를 표지 하는 방법은, 공지의 표지법 중 적당한 것을 사용할 수 있다〔Nature Biotechnology, 14, 303-308 (1996) 참조〕. 또한, 시판되고 있는 형광 표지 키트를 사용할 수도 있다(예를 들면, 애머셤(Amersham)·파마시아(Pharmacia)사 제품, 올리고뉴클레오티드 ECL　3'－올리고 표지 시스템 등).
이상의, 유전자 마커(비표지 또는 표지 된 프로브 또는 프라이머)는, 불사화 규정 유전자 검출용 시약, 즉, 불사화 암세포 검출용 시약으로 이용할 수 있다.
(II-4) 불사화 암세포 검출용 시약 키트
본 발명은 또한, 상기 불사화 암세포 검출용 시약〔유전자 마커(비표지 또는 표지 된 프로브 또는 프라이머)〕을 키트로 제공한다. 해당 키트는 상기 프로브 또는 프라이머로서 이용되는, 비표지 또는 표지 된 폴리뉴클레오티드(아울러 이것들은 고체 상에 고정화될 수 있다)를 적어도 1개 이상 포함하는 것이다. 본 발명의 시약 키트는 상기 유전자 마커(프로브 또는 프라이머) 외, 필요에 따라서 하이브리다이제이션 용 시약, 프로브 표지 물질, 표지체의 검출제, 완충액 등, 본 발명의 방법의 실시에 필요한 앞으로 후술하는 다른 시약, 기구 등을 적절히 포함할 수 있다.
(III) 불사화 암세포의 판정 방법
(III-1) 상기 본 발명의 유전자 마커(프로브 또는 프라이머)를 이용하여, 피험자로부터 채취한 암세포에서 불사화 규정 유전자(마커 유전자)의 발현량을 측정할 수 있고, 아울러 그 발현량에 근거하여 해당 암세포가 「불사화된 암세포」인지, 아니면 「불사화되지않은 암세포」인지 판정할 수 있다. 종래의 병리 진단에서는 불사화 암세포의 판정을 할 수 없었지만, 본 발명의 불사화 암세포의 판정 방법에 의하면, 진행하기 전의 조기의 불사화 암세포라도 판정할 수 있어, 이를 이용하여 환자의 암치료를 조기에 촉진할 수 있다.
이 경우, 상기 본 발명의 프라이머는, 상기 불사화 규정 유전자가 발현한 RNA 또는 그로부터 제조되는 폴리뉴클레오티드(예를 들면, cDNA)를 특이적으로 인식하여 증폭시키기 위한 프라이머이며, 또한 본 발명의 프로브는, 해당 RNA 또는 그로부터 파생하는 폴리뉴클레오티드(예를 들면 cDNA, 또는 RNA나 cDNA로부터 증폭된 DNA)를 특이적으로 검출하기 위한 프로브로 이용된다.
즉, 본 발명의 유전자 마커(프라이머 또는 프로브)는, 노던블롯(northern blotting), RT-PCR, 인 시츄 하이브리다제이션법(in situ hybridization) 등 특정 유전자를 특이적으로 검출하는 종래 방법에 따라, 불사화 규정 유전자를 특이적으로 검출하기 위한 프라이머 및/또는 프로브로 이용될 수 있다. 또한, 암세포에 있어서의 불사화 규정 유전자의 발현량을, DNA 칩을 이용하여 검출 또는 정량할 수 있다. 이때, 본 발명의 프로브는, 해당 DNA 칩의 프로브로 사용할 수 있다.
예를 들면, 본 발명의 프로브, 바람직하게는 방사성 동위 원소, 형광 물질 또는 화학 발광 물질 등의 표지물로 표지 된 프로브를 사용하여, 노던블롯으로 불사화 규정 유전자의 발현량을 측정할 수 있다. 구체적으로는, 피험자의 암세포로부터 분리된 RNA를 나일론 멤브레인 등에 심고(transfer), 표지 된 프로브를 여기에 하이브리다이즈시킨다. 계속해서, 형성된 프로브와 RNA의 이중가닥의 양을, 당해 프로브의 표지물에 유래하는 신호로 측정한다. 신호의 검출은, 프로브의 표지물에 따라 통상적인 방법에 의하여, 예컨대 방사선 검출기나 형광 검출기 등으로 측정하여 실시할 수 있다. 아울러 시판 중인 노던블롯팅 시약 키트(northern blotting reagent kit)를 이용하여, 해당 시약 키트의 프로토콜에 따라 실시하는 것도 가능하다.
또한 RT-PCR에 의한 불사화 규정 유전자 발현량의 측정은, 본 발명의 프라이머, 바람직하게는 방사성 동위 원소, 형광 물질 또는 화학 발광 물질등의 표지물로 표지 된 프라이머를 사용하여 실시할 수 있다. 구체적으로는, 피험자의 암세포로부터 분리된 RNA로부터 제조한 cDNA를 주형으로 하여, 이것에 표지 된 프라이머 쌍을 하이브리다이즈시켜, 통상적인 방법에 따라 PCR을 실시한다. 계속해서, 이로써 얻은 증폭된 이중가닥 DNA의 양을, 해당 프라이머의 표지에 의한 신호를 이용하여 측정한다. 신호의 검출은, 통상적인 방법에 의하여, 예를 들면, 방사선 검출기나 형광 검출기 등으로 측정해 실시할 수 있다. 아울러 시판 중인 RT-PCR용 시약 키트를 이용하여, 해당 시약 키트의 프로토콜에 따라 실시하는 것도 가능하다.
DNA 칩 검사에 의한 불사화 규정 유전자 발현량의 측정은, 본 발명의 프로브, 바람직하게는 방사성 동위 원소나 형광 물질등의 표지물로 표지 된 프로브를 사용하여 실시할 수 있다. 구체적으로는, 우선, 방사성 동위 원소, 형광 물질 또는 화학 발광 물질등으로 표지 한 프로브를 적당한 담체에 고정시킨 DNA 칩을 준비한다. 다음에, 해당 DNA 칩과 피험자의 암세포로부터 분리된 RNA를 기초로 제조된 표지 DNA 또는 RNA를 하이브리다이즈시킨다. 계속해서, 형성된, 프로브와 표지 DNA 또는 RNA의 이중가닥의 양을, 해당 프로브의 표지물에 의한 신호를 이용하여 측정한다. 신호의 검출은, 통상적인 방법에 의해, 예를 들면, 방사선 검출기나 형광 검출기 등으로 측정해 실시할 수 있다. 아울러 본 발명의 프로브와 일치하는 DNA가 고정된 것이라면, 시판 중인 DNA 칩을 이용하여도 좋다.
이러한 불사화 규정 유전자 발현량의 측정은, 기본적으로는 하기의 단계(1) 및 (2)를 포함한다.
(1) 피험자로부터 채취되었고, 암세포가 포함된 것이 예상되는 생체 시료로부터 분리된 RNA 또는 이의 파생물을 본 발명의 프로브 또는 프라이머와 결합시키는 단계,
(2) 프로브 또는 프라이머와 결합한, RNA 또는 해당 이의 파생물의 양을, 해당 프로브 또는 프라이머를 지표로 하여 측정하는 단계.
아울러 상기 단계(1)에 있어, 생체 시료는 피험자 자신의 것으로, 암세포를 포함할 가능성이 있는 시료이면 특별히 한정되지 않고, 예컨대 체액(혈액, 소변 등), 조직, 그 추출물 및 채취된 조직의 배양물 등이다. 또한, 생체 시료의 채취 방법은, 생체 시료의 종류나 암종에 따라 적당한 방법을 선택할 수 있다. 또한 통상적인 방법에 따라 생체 시료로부터 RNA를 준비할 수 있다.
아울러 본 명세서 전체에 있어, 또한 특허 청구의 범위에 있어 「RNA의 파생물」이란, 생체 시료로부터 분리된 RNA를 원료로 하여 제조되는 것을 의미하며, RNA로부터 전사되어 제조된 상보적 폴리뉴클레오티드(cDNA) 및 당해 RNA 또는 cDNA로부터 PCR에 의해 증폭된 DNA가 포함된다. cDNA는 통상적인 방법에 의해 조제할 수 있으며, 상기 DNA는 상기 각 불사화 규정 유전자에 대한 본 발명의 프라이머를 이용하여 PCR을 통하여 조제할 수 있다. 또한 단계(1)에서 사용된 본 발명의 프로브 또는 프라이머는, 방사성 동위 원소, 형광 물질 또는 화학 발광 물질 등의 표지물로 표지 되는 것이 바람직하다.
상기 단계(2)에서 얻은 RNA 또는 해당 RNA 파생물의 양은 피험자에게서의 불사화 규정 유전자의 발현량을 반영한다. 그러므로, 상기 단계(2)에서 얻은 RNA 또는 해당 RNA 파생물의 양(이하, 「RNA량」)을, 불사화되지 않은 정상 또는 암세포의 상응하는 RNA 또는 해당 RNA의 파생물의 양(이하, 「대조 RNA량」)과 비교함으로써, 피험자의 암세포가 불사화되었는지 여부를 판정할 수 있다. 즉, 상기 단계(2)에서 얻은 피험자의 RNA량(불사화 규정 유전자의 발현량)이 대조 RNA량(대조군의 불사화 규정 유전자의 발현량)보다 많은 경우, 피험자의 암세포는 불사화되었다고 판정하고, 높지 않은 경우는 피험자의 암세포는 불사화되지 않았다고 판정할 수 있다.
그러므로 본 발명의 불사화 암세포의 판정 방법은, 상기 단계 (1) 및 (2)에 부가하여, 하기의 단계(3), 한층 더 바람직하게는 단계(4)를 포함한다.
(3) 상기 단계(2)에서 얻은 RNA 또는 해당 RNA의 파생물의 양(RNA량)을, 불사화하지 않은 정상 또는 암세포의 상응하는 RNA 또는 해당 RNA 파생물의 양(대조 RNA량)과 비교하는 단계,
(4) 단계(2)의 RNA량이 대조 RNA량보다 많은 경우, 피험자의 암세포가 불사화하였다고 판정하고, RNA량이 대조 RNA량보다 많지 않은 경우, 피험자의 암세포가 불사화하지 않았다고 판정하는 단계.
아울러 불사화하지 않은 정상 또는 암세포에 있어 불사화 규정 유전자의 RNA량(대조 RNA량)은, 복수의 불사화되지 않은 정상세포 또는 암세포의 불사화 규정 유전자의 RNA량을 균일한 조건으로 미리 측정하여, 그 RNA량의 평균치 또는 중간치로 정할 수 있다.
(III-2) 또한, 암세포의 불사화의 판정은, 본 발명의 불사화 규정 유전자의 발현 산물, 즉 해당 유전자에 의해 코드되는 폴리펩티드(이하, 「불사화 규정 폴리펩티드」)의 생산량에 근거해 할 수 있다. 해당 불사화 규정 폴리펩티드의 생산량은, 해당 폴리펩티드를 인식하는 항체를 이용하여 측정할 수 있다.
이 때, 본 발명이 대상으로 하는 불사화 규정 폴리펩티드로는, 전술한 각종 불사화 규정 유전자〔(1) ~ (13)〕에 상응하여 하기의 것들을 들 수 있다.
(14) UBE2S 폴리펩티드：서열 번호 1로 표시되는 염기 서열로 된 UBE2S 유전자(1)가 코드하는 폴리펩티드, 구체적으로는 서열 번호 14로 표시되는 아미노산 서열로 된 폴리펩티드,
(15) RFC4 폴리펩티드：서열 번호 2로 표시되는 염기 서열로부터 된 RFC4 유전자(2)가 코드하는 폴리펩티드, 구체적으로는 서열 번호 15로 표시되는 아미노산 서열로 된 폴리펩티드,
(16) PTGES2 폴리펩티드：서열 번호 3으로 표시되는 염기 서열로 된 PTGES2 유전자(3)가 코드하는 폴리펩티드, 구체적으로는 서열 번호 16으로 표시되는 아미노산 서열로 된 폴리펩티드,
(17) MAF1 폴리펩티드：서열 번호 4로 표시되는 염기 서열로 된 MAF1 유전자(4)가 코드하는 폴리펩티드, 구체적으로는 서열 번호 17로 표시되는 아미노산 서열로 된 폴리펩티드,
(18) ACVR2B 폴리펩티드：서열 번호 5로 표시되는 염기 서열로 된 ACVR2B 유전자(5)가 코드하는 폴리펩티드, 구체적으로는 서열 번호 18로 표시되는 아미노산 서열로 된 폴리펩티드,
(19) FAM119A 폴리펩티드：서열 번호 6로 표시되는 염기 서열로 된 FAM119A 유전자(6)가 코드하는 폴리펩티드, 구체적으로는 서열 번호 19로 표시되는 아미노산 서열로 된 폴리펩티드,
(20) LTB4DH 폴리펩티드：서열 번호 7로 표시되는 염기 서열로 된 LTB4DH 유전자(7)이 코드하는 폴리펩티드, 구체적으로는 서열 번호 20로 표시되는 아미노산 서열로 된 폴리펩티드,
(21) DPM2 폴리펩티드：서열 번호 8로 표시되는 염기 서열로 된 DPM2 유전자(8)이 코드하는 폴리펩티드, 구체적으로는 서열 번호 21로 표시되는 아미노산 서열로 된 폴리펩티드,
(22) SEPX1 폴리펩티드：서열 번호 9로 표시되는 염기 서열로 된 SEPX1 유전자(9)가 코드하는 폴리펩티드, 구체적으로는 서열 번호 22로 표시되는 아미노산 서열로 된 폴리펩티드,
(23) PSMA3 폴리펩티드：서열 번호 10로 표시되는 염기 서열로 된 PSMA3 유전자(10)이 코드하는 폴리펩티드, 구체적으로는 서열 번호 23로 표시되는 아미노산 서열로 된 폴리펩티드,
(24) CHCHD3 폴리펩티드：서열 번호 11로 표시되는 염기 서열로부터 되는 CHCHD3 유전자(11)이 코드하는 폴리펩티드, 구체적으로는 서열 번호 24로 표시되는 아미노산 서열로 된 폴리펩티드,
(25) LSM3 폴리펩티드：서열 번호 12로 표시되는 염기 서열로 된 LSM3 유전자(12)가 코드하는 폴리펩티드, 구체적으로는 서열 번호 25로 표시되는 아미노산 서열로 된 폴리펩티드,
(26) GTSE1 폴리펩티드：서열 번호 13로 표시되는 염기 서열로 된 GTSE1 유전자(13)이 코드하는 폴리펩티드, 구체적으로는 서열 번호 26로 표시되는 아미노산 서열로 된 폴리펩티드.
이때, (14) UBE2S 폴리펩티드는, 공지의 폴리펩티드이며, 그 취득 방법 역시 J. Biol. Chem. 267 (22), 15829-15835 (1992)에 기재된 바와 같이 공지이다. (15) RFC4 폴리펩티드 역시, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89 (12), 5211-5215 (1992)에 기재된 바와 같이 공지이며, 이하, (16) PTGES2 폴리펩티드는 Biochem. Biophys. Res. Commun. 291 (4), 884-889 (2002)；(18) ACVR2B 폴리펩티드는 Mol. Cell Biol. 16 (3), 1066-1073 (1996)；(20) LTB4DH 폴리펩티드는 J. Biol. Chem. 271 (5), 2844-2850 (1996)；(21) DPM2 폴리펩티드는 EMBO J. 19 (11), 2475-2482 (2000)；(22) SEPX1 폴리펩티드는 J. Biol. Chem. 274 (48), 33888-33897 (1999)；(23) PSMA3 폴리펩티드는 Biochem. Biophys. Res. Commun. 207 (1), 318-323 (1995)；(25) LSM3 폴리펩티드는 EMBO J. 18 (12), 3451-3462 (1999)；(26) GTSE1 폴리펩티드는 Gene 254 (1-2), 229-236 (2000)에 각각 기재되어 있는바 이들은 모두 공지의 폴리펩티드이다.
또한, 상기 불사화 규정 폴리펩티드〔(14) ~ (26)〕는, 상응하는 불사화 규정 유전자〔(1) ~ (13)〕를 클로닝(cloning)하여, 벡터 플라스미드에 라이게이션(ligation)한 후, 대장균 등 숙주세포에 형질 전환하여, 이로써 얻은 형질 전환 세포를 배양하여, 배양물 내에서 회수함으로써 제조할 수도 있다.
본 발명에서 이용되는 항체는, 상기 각 불사화 규정 폴리펩티드를 인식하는 것이라면 특별히 제한되지 않고, 단일클론항체 또는 다클론항체 어느 것이든 좋다. 또한 항체는, 상기 불사화 규정 폴리펩티드를 면역 항원으로 하여 조제되는 항체, 또는 해당 불사화 규정 폴리펩티드를 구성하는 아미노산 서열 중 적어도 연속하는, 8 아미노산, 바람직하게는 15 아미노산, 보다 바람직하게는 20 아미노산으로 구성되는 폴리펩티드에 항원 결합성을 갖는 항체여도 좋다. 상기 폴리펩티드는, 본 발명의 불사화 규정 폴리펩티드의 아미노산 서열 또는 그것을 코드하는 염기 서열로부터, 통상, 공지의 방법으로 합성할 수 있다. 예를 들면, 아미노산 합성기에 의한 화학적 합성 방법 또는, 유전자 공학적 방법을 들 수 있다.
본 발명의 항체는, 통상적인 방법에 따라 제조할 수 있다(예를 들면, Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987), Publish. John Wiley and Sons. Section 11.12-11. 13). 예를 들면, 다클론 항체의 경우는, 통상적인 방법으로 대장균에서 발현시키고 정제 한 상기 폴리펩티드를 이용하거나, 또는 통상적인 방법에 따라 이러한 부분 아미노산 서열을 갖도록 합성한 폴리펩티드를 이용하여, 실험동물에게 면역을 시키고, 당해 면역 동물의 혈청로부터 통상적인 방법에 따라 얻을 수 있다. 한편, 예컨대 단일클론항체의 경우, 통상적인 방법에 따라 대장균 등에서 발현하여 정제한 상기 폴리뉴클레오티드 또는, 통상적인 방법에 따라 이러한 부분적인 아미노산 서열을 갖도록 합성한 폴리펩티드를 이용하여 실험동물에게 면역을 시키고, 당해 실험동물의 비장 세포와 골수종 세포를 융합시켜 잡종세포(hybridoma)를 합성하여, 당해 잡종세포로부터 얻을 수 있다.
아울러 상기 항체 또한, 전술한 암세포의 불사화를 판정하기 위한 시약 및 시약 키트의 유효성분에 포함된다.
불사화 암세포의 판정은, 구체적으로는, 하기의 단계(1＇) ~ (2＇)에 의해 실시할 수 있다.
(1＇) 피험자로부터 채취되었고, 암세포가 포함된 것이 예상되는 생체 시료로부터 수득된 폴리펩티드를 포함하는 단백질 함유 분획(protein-containing fraction)과, 본 발명의 불사화 규정 폴리펩티드를 인식하는 항체를 혼합하는 단계
(2＇) 상기 항체를 지표로 하여, 상기 항체에 결합한 폴리펩티드의 양을 측정하는 단계,
아울러 상기 단계(2＇)으로 얻을 수 있는 폴리펩티드의 양은, 불사화 규정 폴리펩티드의 생산량을 반영하는 것이다.
단계(2＇)에서, 생체 시료는 피험자 자신의 것이고, 암세포를 포함할 가능성이 있는 시료이면 되고, 특별히 한정되는 것은 아니며, 예컨대 체액(혈액, 소변 등), 조직, 그 추출물 및 채취한 조직의 배양물 등이다. 또한, 생체 시료의 채취 방법은, 생체 시료의 종류 또는 암종에 따라 적당한 방법을 선택할 수 있다. 공지의 분획, 정제 방법을 적당히 조합하여, 생체 시료로부터 단백질 함유 분획(protein-containing fraction)(폴리펩티드를 포함한다)을 제조할 수 있다. 해당 단백질 함유 분획은, 예를 들면 웨스턴 블롯팅법, 효소 면역법(EIA), 방사성 동위 원소 면역법(RIA), 형광 면역법 등의 면역학적 검출법을 이용하여, 상기 항체를 프로브로서 사용하여 불사화 규정 폴리펩티드를 검출할 수 있다.
예컨대　단계(1＇) 및(2＇)을, 웨스턴블롯을 이용하여 폴리펩티드량(불사화 규정 폴리펩티드의 생산량)을 측정하는 경우를 상세히 설명하자면, 우선, 해당 불사화 규정 폴리펩티드에 대한 항체를 일차 항체로 하여 피험자의 생체 시료로부터 제조된 단백질 함유 분획과 혼합하여, 해당 단백질 함유분획에 포함된 불사화 규정 폴리펩티드과 결합시킨다. 다음에, 방사성 동위 원소, 형광 물질 또는 화학 발광 물질 등의 표지물로 표지 한 2차 항체를 일차 항체에 결합시킨다. 계속해서, 불사화 규정 폴리펩티드의 양을, 2차 항체의 표지의 신호로측정한다. 신호의 검출은, 통상적인 방법에 의해, 예를 들면, 방사선 검출기나 형광 검출기 등으로 측정해 할 수 있다.
상기 단계(2＇)에서 얻은 피험자의 폴리펩티드량(불사화 규정 폴리펩티드의 생산량)을, 불사화하지 않은 정상 또는 암세포의 상응하는 폴리펩티드량(대조 폴리펩티드량)(즉, 대조군의 불사화 규정 폴리펩티드 생산량(대조생산량))과 비교하고 그 정도를 식별함으로써, 피험자의 암세포가 불사화했는지 아닌지를 판정할 수 있다. 즉, 상기 단계(2＇)에서 얻은 피험자의 폴리펩티드량(불사화 규정 폴리펩티드의 생산량)이 대조 폴리펩티드량(대조 세균의 생산량)보다 많은 경우, 피험자의 암세포가 불사화되었다고 판정하고, 높지 않은 경우, 피험자의 암세포가 불사화하지 않았다고 판정할 수 있다.
그러므로 본 발명의 불사화 암세포의 판정 방법은, 상기의 단계(1＇) 및 (2＇)에 부가하여, 하기의 단계(3), 한층 더 바람직하게는 단계(4)를 가진다.
(3＇) 상기 단계(2＇)에서 수득한 폴리펩티드의 양으로 불사화되지 않은 정상 또는 암세포에 있어서의 상응하는 폴리펩티드의 양(대조 폴리펩티드량)을 비교하는 단계,
(4＇) 상기 단계(2＇)의 폴리펩티드량이 대조 폴리펩티드량에 비교해 높은 경우에 피험자의 암세포가 불사화되었다고 판정하고, 높지 않은 경우 피험자의 암세포가 불사화되지 않았다고 판정하는 단계.
이때, 불사화되지 않은 정상 또는 암세포의 불사화 규정 폴리펩티드의 생산량은 복수의 불사화되지 않은 정상세포 또는 암세포의 불사화 규정 폴리펩티드의 생산량을 균일한 조건으로 미리 측정하여, 그 생산량의 평균치 또는 중간치로 정할 수 있다.
(IV) 불사화 암세포 증식 억제제의 스크리닝 방법
(IV-1) 실시예에 나타났듯이, 본 발명의 불사화 규정 유전자((1) ~ (13))은, 불사화 암세포에서 특이적으로 높게 발현하므로, 각각의 해당 불사화 규정 유전자의 siRNA를 이용하여 그 발현을 억제함으로써, 불사화 암세포의 증식을 억제할 수 있다. 이것은, 불사화 규정 유전자((1) ~ (13))의 발현을 억제하는 물질이, 불사화 암세포 증식 억제제(항암제)가 될 수 있다는 것을 의미한다. 즉, 전술한 불사화 규정 유전자((1) ~ (13))의 발현 억제를 지표로 함으로써, 불사화 암세포의 증식억제작용을 갖는 물질을 스크리닝 할 수 있다.
따라서, 본 발명은 전술한 불사화 규정 유전자((1) ~ (13))의 발현 억제를 지표로 한 불사화 암세포 증식 억제제의 스크리닝 방법을 제공한다.
해당 방법은, 하기의 단계 (A) ~ (D)를 포함할 수 있다.
(A) 피험물질과 (1) ~ (13) 중 선택되는 하나의 불사화 규정 유전자를 발현할 수 있는 세포를 접촉시키는 단계,
(B) 피험물질을 접촉시킨 세포에서, 해당 불사화 규정 유전자의 발현량을 측정하는 단계,
(C) 상기 단계(B)에서 얻은 불사화 규정 유전자의 발현량과, 피험물질을 접촉시키지 않는 세포의 해당 불사화 규정 유전자 발현량(대조 발현량)을 비교하는 단계, 및
(D) 상기 단계(B)에서 얻은 유전자의 발현량이 대조 발현량보다 낮은 경우 해당 피험물질을 불사화 암세포의 증식 억제 물질로 선택하는 단계.
본 발명에서 사용하는 세포는 어느 조직에서 유래된 세포든간에, 전술한 (1) ~ (13) 중 적어도 하나의 불사화 규정 유전자를 발현할 수 있는 세포면 된다. 본 발명에서 사용하는 세포는 예컨대, 폐, 위, 결장, 직장, 간장, 담낭·담관, 췌장, 신장, 방광, 전립선, 자궁, 골수, 림프절, 혈액 등으로부터 유래한 세포일 수 있다. 본 발명에서 사용하는 세포는, 포유류 또는 조류에서 유래한 것일 수 있고, 보다 바람직하게는 포유류에서 유래한 세포이며, 한층 더 바람직하게는 인간에게서 유래한 세포이다. 또한, 불사화 규정 유전자의 발현은, 내재성이든 외래성이든 좋다.
피험물질은 특별히 제한되는 것은 아니지만, 핵산(폴리뉴클레오티드를 포함한다), 펩티드(폴리펩티드를 포함한다), 유기 화합물, 무기 화합물 등 어느 것이어도 좋다. 구체적으로 해당 피험물질 또는 해당 피험물질을 포함한 시료(피험시료)를, 상기 불사화 규정 유전자를 발현시킬 수 있는 세포와 접촉시킴으로써 스크리닝을 할 수 있다. 상기 피험시료에는, 세포 추출액, 유전자 라이브러리(gene library)의 발현 산물, 식물이나 동물 유래 천연물의 추출물 등이 포함된다.
한편, 스크리닝 시, 피험물질과 세포를 접촉시키는 조건은 세포가 죽지 않고, 해당 세포에 대해 불사화 규정 유전자를 발현할 수 있는 조건이면 특별히 제한되지 않는다.
상기 단계(B) 및 (C)에서 불사화 규정 유전자의 발현량은, 전술한 본 발명의 프로브 또는 프라이머를 이용하여 노던블롯 또는 RT-PCR 등의 방법으로, 불사화 규정 유전자의 mRNA 또는 그 파생물인 cDNA나 이중가닥 DNA의 양을 측정함으로써 확인할 수 있다. 또한, 상기 단계 (B) 및 (C)에 있어 불사화 규정 유전자의 발현량을, 불사화 규정 유전자의 발현 산물인 불사화 규정 폴리펩티드의 양으로 정하여도 좋다. 불사화 규정 폴리펩티드의 양은, 전술한 불사화 규정 폴리펩티드에 대한 항체를 이용하여, 웨스턴 블롯팅법, 효소 면역법(EIA), 방사성 동위 원소 면역법(RIA), 형광 면역법등의 면역학적 검출법을 실시함으로써, 측정할 수도 있다.
단계(C)에서는, 상기 단계(B)에서 얻은 불사화 규정 유전자의 발현량을, 피험물질을 세포에 접촉시키지 않는 경우의 불사화 규정 유전자의 발현량(대조 발현량)과 비교함으로써, 불사화 암세포의 증식억제물질을 선택할 수 있다. 즉, 상기 단계 (B)에서 얻은 불사화 규정 유전자의 발현량이 대조 발현량과 비교하여 낮은 경우, 해당 피험물질을 불사화 암세포의 증식 억제 물질로 선택할 수 있다.
(IV-2) 불사화 암세포의 증식 억제제의 스크리닝은, 본 발명의 불사화 규정 유전자((1) ~ (13))의 발현 산물인 불사화 규정 폴리펩티드((14) ~ (26))의 활성 저해를 지표로 함으로써 실시할 수도 있다. 예를 들면, (14) UBE2S 폴리펩티드는, 유비퀴틴 활성화제 (E2)((ubiquitin activator) (E2))를 포함하는 것으로 알려져 있다(J. Biol. Chem. 267 (22), 15829-15835 (1992)). (16) PTGES2 폴리펩티드는, 프로스타글란딘 H2(prostaglandin H2)를 프로스타글란딘 E2(prostaglandin E2)로 변환시키는 활성을 갖는 것으로 알려져 있으며(Biochem. Biophys. Res. Commun. 291 (4), 884-889 (2002))；(18) ACVR2B 폴리펩티드는 막관통 수용체로, 그 세포내 도메인에 Ser/Thr kinase 활성을 가지는 것(Mol. Cell Biol. 16 (3), 1066-1073 (1996))；(20) LTB4DH 폴리펩티드는 류코트리엔 B4 (leukotriene B4)를 12-옥소-류코트리엔 B4 (12-oxo-leukotriene B4)로 변환하는 활성을 갖는 것(J. Biol. Chem. 271 (5), 2844-2850 (1996))；(22) SEPX1 폴리펩티드는 메티오닌 설폭사이드(methionine sulfoxide) 환원 활성을 갖는 것(Mol. Biol. Cell 15 (3), 1055-1064 (2004)) 들이, 각각 알려져 있다. 따라서, 특히 상기 불사화 규정 폴리펩티드의 활성 저해를 지표로 하여 불사화 암세포의 증식 억제제의 스크리닝을 할 수 있다.
구체적으로는, 하기의 단계(A＇) ~ (D＇)에 의해, 불사화 암세포의 증식억제물질을 스크리닝 할 수 있다.
(A＇) 피험물질과 (14) ~ (26)에서 선택되는 불사화 규정 폴리펩티드를 접촉시키는 단계,
(B＇) 피험물질을 접촉시킨 불사화 규정 폴리펩티드의 활성을 측정하는 단계,
(C＇) 상기 단계(B＇)에서 얻은 불사화 규정 폴리펩티드의 활성과 피험물질을 접촉시키지 않는 수용액, 세포 또는 세포분획의 불사화 규정 폴리펩티드의 활성(대조 활성)을 비교하는 단계,
(D＇) 상기 단계(B＇)에서 얻은 불사화 규정 폴리펩티드의 활성이 대조 활성보다 낮은 경우, 해당 피험물질을 불사화 암세포의 증식 억제 물질로 선택하는 단계.
상기 스크리닝은 불사화 규정 폴리펩티드의 활성을 지표로 하며, (14) ~ (26)〔바람직하게는(14), (16), (18), (20) 또는(22)〕에서 선택되는 불사화 규정 폴리펩티드를 포함하거나 포함할 수 있는 것을 대상으로하여 실시할 수 있다. 구체적으로 그 대상은 불사화 규정 폴리펩티드의 기능(활성)에 따라 선택되며, 예컨대 (14) ~ (26) 〔바람직하게는 (14), (16), (18), (20) 또는 (22)〕중 어느 하나의 불사화 규정 폴리펩티드를 포함하는 수용액, (1) ~ (13) 〔바람직하게는(1), (3), (5), (7) 또는 (9)〕중 어느 하나의 불사화 규정 유전자를 발현시킬 수 있는 세포 또는 해당 세포로부터 제조한 세포분획이다. 이 때, 수용액이란, 불사화 규정 폴리펩티드를 포함하는 한, 특별히 제한되지 않으며, 예컨대, 통상의 수용액 외에도 세포 용해액(cell solution), 핵추출액(nuclear extraction), 또는 배양상청액(liquid culture supernatant) 등이 포함된다. 또한 세포는 내재성 및 외래성 등 그 유래는 상관없으며, 불사화 규정 유전자를 발현시킬 수 있는 상태에 있는 세포이면 된다. 세포분획은, 상기 세포에서 유래하는 각종 분획으로, 예를 들면 세포막 분획(cell membrane fraction), 세포질 분획, 세포핵 분획 등을 들 수 있다.
아울러 스크리닝에 사용하는 세포 및 대상으로 하는 피험물질로는 전술한 스크리닝 방법과 같은 것을 사용할 수 있다.
단계(B＇)에서 UBE2S 폴리펩티드(14)의 유비퀴틴 활성화의 측정은 공지의 방법에 의해 실시할 수 있는데, 예를 들면, J. Biol. Chem. 267 (22), 15829-15835 (1992)에 기재된 것과 같이, 유비퀴틴, 유비퀴틴 활성화 효소(E1) 및 UBE2S 폴리펩티드를 포함하는 계(system)에서 UBE2S 폴리펩티드의 유비퀴틴화 반응을 행하고, UBE2S 폴리펩티드에 결합한 유비퀴틴의 양을 측정함으로써 실시할 수 있다. 이 때, 유비퀴틴의 양은 공지의 방법을 이용하여 확인할 수 있는데, 예를 들면 방사성 물질, 효소 등으로 표지 한 유비퀴틴을 이용하여 상기 반응을 실시하고, 그 표지물의 양을 측정함으로써 확인할 수 있다(J. Biol. Chem. 267 (22), 15829-15835 (1992), J. Biol. Chem. 279 (51), 52970-52977 (2004)). 또한 항유비퀴틴 항체로 검출함으로써 측정할 수도 있다(J. Biol. Chem. 279 (51), 52970-52977 (2004)). 유비퀴틴 및 유비퀴틴 활성화 효소(E1)는, 공지의 단백질 합성법에 의해 제조하여도 좋고, 시판되는 제품을 이용하여도 좋다.
단계(B＇)에서 PTGES2 폴리펩티드(16)의 프로스타글란딘 E2 합성 활성은 공지의 방법을 이용하여 측정할 수 있는데, 예를 들면, Biochem. Biophys. Res. Commun. 291 (4), 884-889 (2002)에 기재된 대로, PTGES2 폴리펩티드 및 프로스타글란딘 H2를 포함한 계에서, PTGES2 폴리펩티드를 이용하여 프로스타글란딘 E2변환 반응을 일으키고, 생산된 프로스타글란딘 E2의 양을 측정함으로써 실시할 수 있다. 이 때, 프로스타글란딘 E2의 양은 공지의 방법을 이용하여 측정할 수 있는데, 예를 들면, 방사성 물질, 효소등으로 표지 한 프로스타글란딘 H2를 이용하여 상기 반응을 실시하고, 생산된 프로스타글란딘 E2의 표지물의 양을 측정함으로써 실시할 수 있다(Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96 (13), 7220-7225 (1999)). 또한 항프로스타글란딘 E2항체로 검출함으로써 측정할 수도 있다(J. Dairy. Sci. 87 (7), 2197-2210 (2004)). 프로스타글란딘 H2는, 공지의 합성법으로 제조하여도 좋고 시판되는 제품을 이용하여도 좋다.
단계(B＇)에서 ACVR2B 폴리펩티드(18)의 Ser/Thr kinase 활성의 측정은 공지의 방법에 의해 실시할 수 있는데, 예를 들면, Mol. Cell Biol. 16 (3), 1066-1073 (1996)에 기재되어 있는 대로, ACVR2B 폴리펩티드를 포함한 계에서, 기질과 ATP 존재하, kinase 반응을 실시해, 기질의 인산화량을 측정함으로써 실시할 수 있다. 이 때, 기질의 인산화량의 측정은 공지의 방법에 의해 실시할 수 있는데 예를 들면,γ32 P-ATP 또는γ33 P-ATP를 트레이서로서 이용하여 방사 활성을 측정함으로써 인산화량을 측정할 수 있다(Mol. Cell Biol. 16 (3), 1066-1073 (1996)). 또, 형광 물질이나 비오틴등으로 표지 한 기질을 이용하여 인산화 반응을 실시해, 인산화 표지물의 양을 측정함으로써 실시할 수 있다. 이때 기질은, ACVR2B 폴리펩티드, 특이적 기질 또는 펩티드를 등을 들 수 있다.
단계(B＇)에 있어서의 LTB4DH 폴리펩티드(20)의 로이코트리엔 B4변환 활성의 측정은 공지의 방법에 의해 실시할 수 있어 예를 들면, J. Biol. Chem. 271 (5), 2844-2850 (1996)에 기재되어 있는 대로, LTB4DH 폴리펩티드 및 로이코트리엔 B4를 포함한 계에 대해, LTB4DH 폴리펩티드에 의한 로이코트리엔 B4변환 반응을 실시해, 세균이 고분자물질을 생합성하는 되는 12-oxo-leukotriene B4의 양을 측정함으로써 실시할 수 있다. 이 때, 12-oxo-leukotriene B4의 양은, HPLC 등 공지의 방법에 의해 측정할 수 있다. 로이코트리엔 B4는, 공지의 화학 합성법에 의해 취득해도 자주(잘), 또, 시판품을 이용하여도 좋다.
단계(B＇)에 있어서의 SEPX1 폴리펩티드(22)의 메치오닌스르호키시드 환원 활성의 측정은 공지의 방법에 의해 실시할 수 있어 예를 들면, Mol. Biol. Cell 15 (3), 1055-1064 (2004)에 기재되어 있는 대로, SEPX1 폴리펩티드 및 메치오닌스르호키시드를 포함한 계에 대해, SEPX1 폴리펩티드에 의한 메치오닌스르호키시드 환원 반응을 실시해, 세균이 고분자물질을 생합성하는 되는 메티오닌의 양을 측정함으로써 실시할 수 있다. 이 때, 메티오닌의 양은, HPLC 등 공지의 방법에 의해 측정할 수 있다. 메치오닌스르호키시드는, 공지의 화학 합성법에 의해 취득해도 자주(잘), 또, 시판품을 이용하여도 좋다.
단계(C＇) 및 (D＇)에 있어, 상기 단계(B＇)에서 얻은 불사화 규정 폴리펩티드의 활성을 대조 활성과 비교함으로써, 불사화 암세포의 증식을 억제하는 물질을 선택할 수 있다. 즉, 상기 단계(B＇)에서 얻은 불사화 규정 폴리펩티드의 활성이 대조 활성보다 낮은 경우, 당해 피험물질을 불사화 암세포의 증식을 억제하는 물질로서 선택할 수 있다.
실시예에 기재한 바와 같이, 표 2 및 표 3에 나타낸 안티센스 폴리뉴클레오티드(siRNA)(서열번호 27~76)는, 암세포 내에서 본 발명의 불사화 규정 유전자와 하이브리다이즈함으로써, 당해 불사화 규정 유전자의 발현을 억제하고, 그 결과 불사화 암세포의 증식을 억제한다. 따라서, 이러한 안티센스 폴리뉴클레오티드(siRNA)는, 불사화 암세포 증식 억제제로서 이용할 수 있다. 따라서 본 발명은, 상기 안티센스 폴리뉴클레오티드를 유효 성분으로 하는 불사화 암세포의 증식 억제제를 제공한다.
상기 안티센스 폴리뉴클레오티드는, (1) ~ (13)의 불사화 규정 유전자 중 선택되는 염기 서열의 적어도 15 염기 이상이 연속한 염기 서열로 된 폴리뉴클레오티드에 특이적으로 하이브리다이즈하는 15 염기 길이 이상의 폴리뉴클레오티드로부터 구성된다. 해당 폴리뉴클레오티드는, 상기(1) ~ (13)의 불사화 규정 유전자의 적어도 15 염기 이상의 연속한 염기 서열에 대해서 상보적인 염기 서열을 가지는 것이 바람직하지만, 상기의 특이적인 하이브리다이제이션이 가능하고, 해당 불사화 규정 유전자와 하이브리다이즈함으로써, 해당 불사화 규정 유전자의 발현을 억제할 수 있다면, 완전하게 상보적인 필요는 없다. 예를 들면, 당해 불사화 규정 유전자의 상보 서열과 비교해, 염기 서열에 대해 70%이상, 바람직하게는 80%이상, 보다 바람직하게는 90%이상, 한층 더 바람직하게는 95%이상, 특히 바람직하게는 98%이상의 동일성을 갖고, 한편 당해 불사화 규정 유전자의 RNA와 하이브리다이즈 함으로써, 당해 불사화 규정 유전자의 발현을 억제할 수 있는 폴리뉴클레오티드이면 괜찮다. 아울러 본 발명의 안티센스 폴리뉴클레오티드의 염기 길이은, 15~1000 염기 길이인 것이 바람직하고, 15~500 염기 길이인 것이 한층 더 바람직하고, 16~30 염기 길이인 것이 특히 바람직하다.
본 발명의 안티센스 폴리뉴클레오티드는, 서열번호 27~76 중 선택되는 어느 하나의 염기 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드가 바람직하고, 상기 염기서열을 갖는 이중가닥 RNA가 보다 더 바람직하다.
또, 본 발명의 안티센스 폴리뉴클레오티드는, 안정성 및 세포 투과성을 높이기 위하여, 공지의 변형(modify)이 이루어져도 괜찮다. 예를 들면, 각 뉴클레오티드의 인산 잔기는, 뉴클레아제(nuclease) 등 가수분해 효소에 의한 분해를 막기 위하여, 포스포로치오에이트(phosphorothioate), 메틸 포스포네이트(methyl phosphonate), 포스포로디치오에이트(phosphorodithioate) 등의 화학적으로 수식된 인산 잔기(chemically modified phosphoric residue)로 치환되도 괜찮다.
본 발명의 안티센스 폴리뉴클레오티드의 형태는, 단일사슬 DNA, 단일사슬 RNA, 이중가닥 DNA, 이중가닥 RNA 및 DNA:RNA 하이브리드(hybrid) 중 어느 것이어도 괜찮다.
본 발명의 안티센스 폴리뉴클레오티드는, 통상, 공지의 방법에 의해 합성할 수 있는데, 예를 들면, 합성기를 이용하여 화학적으로 합성할 수 있다.
본 발명의 안티센스 폴리뉴클레오티드는, 레트로바이러스 벡터(retrovirus vector), 아데바이러스 벡터(adenovirus vector), 아데노수반 바이러스 벡터(adeno-associated virus vector) 등 바이러스 벡터 또는 리포좀(liposome) 등의 비-바이러스 벡터(non-virus vector) 등을 이용하여, ex vivo 또는 in vivo 방법 등에 의하여 환자의 암세포에 도입할 수 있어 적절한 과정을 통하여 항암요법으로 매우 적합하게 이용할 수 있다. 따라서, 본 발명에는, 해당 안티센스 폴리뉴클레오티드를 유효 성분으로 하는 불사화 암세포 증식 억제제를 암환자에게 투여하는 단계를 포함하는 항암요법이 포함된다.
본 발명의 불사화 암세포 증식 억제제는, 상기 안티센스 폴리뉴클레오티드를 유효 성분으로 하는 것으로, 그 세포 증식 억제 작용을 해치지 않는 범위에서 안정화제, 현탁제, 동결제, 완충액, 용매 등을 함유할 수 있다. 또, 본 발명의 불사화 암세포 증식 억제제의 암환자에 대한 투여량 및 투여 스케줄은, 대상 질환, 환자의 연령·체중 등에 따라 당업자가 적당히 설정할 수 있다. 그러한 투여 스케줄로는, 예를 들면, 1 사이클을 3주간으로 하여, 그 중 2~3주간을 연속으로 2~10 mg/kg/일의 상기 안티센스 폴리뉴클레오티드를 정맥 내 투여하는 투여 스케줄, 1 사이클을 1주간으로서 하여 그 중 5일간 연속으로 80~120 mg/m2/일의 상기 안티센스 폴리뉴클레오티드를 정맥내 투여하는 투여 스케줄, 및 1 사이클을 4주간으로 하여 그 중 3주간 연속으로 80~120 mg/m2/일의 상기 안티센스 폴리뉴클레오티드를 정맥내 투여하는 투여 스케줄을 들 수 있다.
[서열목록의 설명]
서열 번호 27은 UBE2S 유전자에 대한 siRNA-1(44-64)의 센스 가닥(sense strand)의 염기 서열을 나타낸다.
서열 번호 28은 UBE2S 유전자에 대한 siRNA-1(146-166)의 센스 가닥의 염기 서열을 나타낸다.
서열 번호 29는 UBE2S 유전자에 대한 siRNA-2의 센스 가닥의 염기 서열을 나타낸다.
서열 번호 30은 UBE2S 유전자에 대한 siRNA-3의 센스 가닥의 염기 서열을 나타낸다.
서열 번호 31은 RFC4 유전자에 대한 siRNA-1(897-917)의 센스 가닥의 염기 서열을 나타낸다.
서열 번호 32는 RFC4 유전자에 대한 siRNA-1(189-209)의 센스 가닥의 염기 서열을 나타낸다.
서열 번호 33은 RFC4 유전자에 대한 siRNA-2의 센스 가닥의 염기 서열을 나타낸다.
서열 번호 34는 RFC4 유전자에 대한 siRNA-3의 센스 가닥의 염기 서열을 나타낸다.
서열 번호 35는 PTGES2 유전자에 대한 siRNA-1(2003-2023)의 센스 가닥의 염기 서열을 나타낸다.
서열 번호 36은 PTGES2 유전자에 대한 siRNA-1(1105-1125)의 센스 가닥의 염기 서열을 나타낸다.
서열 번호 37은 PTGES2 유전자에 대한 siRNA-2의 센스 가닥의 염기 서열을 나타낸다.
서열 번호 38은 PTGES2 유전자에 대한 siRNA-3의 센스 가닥의 염기 서열을 나타낸다.
서열 번호 39는 MAF1 유전자에 대한 siRNA-1(1538-1558)의 센스 가닥의 염기 서열을 나타낸다.
서열 번호 40은 MAF1 유전자에 대한 siRNA-1(1031-1051)의 센스 가닥의 염기 서열을 나타낸다.
서열 번호 41은 MAF1 유전자에 대한 siRNA-2의 센스 가닥의 염기 서열을 나타낸다.
서열 번호 42는 MAF1 유전자에 대한 siRNA-3의 센스 가닥의 염기 서열을 나타낸다.
서열 번호 43은 ACVR2B 유전자에 대한 siRNA-1(626-646)의 센스 가닥의 염기 서열을 나타낸다.
서열 번호 44는 ACVR2B 유전자에 대한 siRNA-1(208-228)의 센스 가닥의 염기 서열을 나타낸다.
서열 번호 45는 ACVR2B 유전자에 대한 siRNA-2의 센스 가닥의 염기 서열을 나타낸다.
서열 번호 46은 ACVR2B 유전자에 대한 siRNA-3의 센스 가닥의 염기 서열을 나타낸다.
서열 번호 47은 FAM119A 유전자에 대한 siRNA-1(754-774)의 센스 가닥의 염기 서열을 나타낸다.
서열 번호 48은 FAM119A 유전자에 대한 siRNA-1(1068-1088)의 센스 가닥의 염기 서열을 나타낸다.
서열 번호 49는 FAM119A 유전자에 대한 siRNA-2의 센스 가닥의 염기 서열을 나타낸다.
서열 번호 50은 FAM119A 유전자에 대한 siRNA-3의 센스 가닥의 염기 서열을 나타낸다.
서열 번호 51은 LTB4DH 유전자에 대한 siRNA-1(775-795)의 센스 가닥의 염기 서열을 나타낸다.
*서열 번호 52는 LTB4DH 유전자에 대한 siRNA-1(658-678)의 센스 가닥의 염기 서열을 나타낸다.
서열 번호 53은 LTB4DH 유전자에 대한 siRNA-2의 센스 가닥의 염기 서열을 나타낸다.
서열 번호 54는 LTB4DH 유전자에 대한 siRNA-3의 센스 가닥의 염기 서열을 나타낸다.
서열 번호 55는 DPM2 유전자에 대한 siRNA-1(145-165)의 센스 가닥의 염기 서열을 나타낸다.
서열 번호 56은 DPM2 유전자에 대한 siRNA-1(84-104)의 센스 가닥의 염기 서열을 나타낸다.
서열 번호 57은 DPM2 유전자에 대한 siRNA-2의 센스 가닥의 염기 서열을 나타낸다.
서열 번호 58은 DPM2 유전자에 대한 siRNA-3의 센스 가닥의 염기 서열을 나타낸다.
서열 번호 59는 SEPX1 유전자에 대한 siRNA-1(870-890)의 센스 가닥의 염기 서열을 나타낸다.
서열 번호 60은 SEPX1 유전자에 대한 siRNA-1(794-814)의 센스 가닥의 염기 서열을 나타낸다.
서열 번호 61은 SEPX1 유전자에 대한 siRNA-2의 센스 가닥의 염기 서열을 나타낸다.
서열 번호 62는 SEPX1 유전자에 대한 siRNA-3의 센스 가닥의 염기 서열을 나타낸다.
서열 번호 63은 PSMA3 유전자에 대한 siRNA-1(853-873)의 센스 가닥의 염기 서열을 나타낸다.
서열 번호 64는 PSMA3 유전자에 대한 siRNA-1(686-706)의 센스 가닥의 염기 서열을 나타낸다.
서열 번호 65는 PSMA3 유전자에 대한 siRNA-2의 센스 가닥의 염기 서열을 나타낸다.
서열 번호 66은 PSMA3 유전자에 대한 siRNA-3의 센스 가닥의 염기 서열을 나타낸다.
서열 번호 67은 CHCHD3 유전자에 대한 siRNA-1(546-566)의 센스 가닥의 염기 서열을 나타낸다.
서열 번호 68은 CHCHD3 유전자에 대한 siRNA-1(1450-1470)의 센스 가닥의 염기 서열을 나타낸다.
서열 번호 69는 CHCHD3 유전자에 대한 siRNA-2의 센스 가닥의 염기 서열을 나타낸다.
서열 번호 70은 CHCHD3 유전자에 대한 siRNA-3의 센스 가닥의 염기 서열을 나타낸다.
서열 번호 71은 LSM3 유전자에 대한 siRNA-1(540-560)의 센스 가닥의 염기 서열을 나타낸다.
서열 번호 72는 LSM3 유전자에 대한 siRNA-1(37-57)의 센스 가닥의 염기 서열을 나타낸다.
서열 번호 73은 LSM3 유전자에 대한 siRNA-2의 센스 가닥의 염기 서열을 나타낸다.
서열 번호 74는 LSM3 유전자에 대한 siRNA-3의 센스 가닥의 염기 서열을 나타낸다.
서열 번호 75는 GTSE1 유전자에 대한 siRNA-2의 센스 가닥의 염기 서열을 나타낸다.
서열 번호 76은 GTSE1 유전자에 대한 siRNA-3의 센스 가닥의 염기 서열을 나타낸다.
[ 실시예 ]
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 한층 더 상세하게 설명하지만, 본 발명의 범위는 이러한 실시예로 한정되는 것은 아니다.
불사화 규정 유전자의 분류
1. 인간 조직 샘플 및 인간 암세포주, 인간비종양성 배양 세포로부터의 total RNA의 제조(preparation)
9종의 폐암 세포주, 21종의 식도암 세포주, 9종의 소화기암, 그 외 다양한 암(위암, 대장암, 머리 경부암, 백혈병) 세포주 및 2종의 비종양성 식도 표피 세포, 2종의 정상 기도 표피로부터, RNeasyTM Mini kit(Qiagen사 제품)을 이용하여 첨부 프로토콜에 따라 total RNA를 추출하여, -80℃에서 보관하였다.
또한 11종의 유방암 세포주, 10종의 난소암 세포주, 10종의 췌장암 세포주, 1종의 비종양성 불사화 유선 표피, 1종의 비종양성 유선 표피, 동일한 췌장암환자 유래의 췌장암조직과 비암부(non-cancer) 췌장 조직 10 세트, 동일한 비소세포성 폐암(non-small cell lung cancer) 환자 유래의 원발소(primary focus)와 전이 폐암 조직(metastasis portions) 3 세트에서도 total RNA를 추출하여 보존하였다. total RNA는 2100 Bioanalyzer(Agilent Technologies사 제품) 및 RNA LabChip(Agilent Technologies사 제품)를 이용하여, 18 S 및 28S rRNA의 피크가 선명한 고품질인 것을 확인하고 나서 마이크로 어레이 분석에 제공하였다.
2. 마이크로 어레이 분석
상기 제조한 total RNA를 이용하여 마이크로 어레이에 의한 총체적(exhaustive) 유전자 발현 분석을 실시하였다. 마이크로 어레이는 CodeLink UniSet Human 20K I Bioarray　(19881 프로브)를 이용하여 (1) total RNA로부터 cDNA의 합성, (2)　cDNA로부터 표지된 cRNA의 합성, (3) 표지된 cRNA의 단편화, (4) 단편화 cRNA와 마이크로 어레이와의 하이브리다이즈, (5) 마이크로 어레이의 염색, (6) 마이크로 어레이의 스캔, (7) 유전자 발현 분석의 순서로 하였다.
(1) total RNA로부터 cDNA의 합성
CodeLink Expression Assay Reagent Kit(GEhelthcare bioscience사 제)를 이용하여, 그 프로토콜에 따라 first-strand cDNA 합성을 실시하였다. 즉, 1.에서 얻은 각 total RNA 1μg를 Nuclease-free Water를 이용하여 10μl로 조정(adjust)하고, 당해 키트에 포함되는 1μl Bacterial Control mRNA 희석 용액, 1μl T7 Oligo(dT) Primer를 혼합하여, 합계 12μl를 70℃으로 10 분간 가온한 후, 빙상(on ice)에서 3 분간 급냉하였다. 빙상에서 당해 키트에 포함되는 2μl 의 10 × First-strand 완충용액, 4μl의 5 mM dNTP Mix, 1μl의 RNase Inhibitor, 1μl의 Reverse Transcriptase(200 U/μl)를 더해 합계 20μl를 42℃로 2 시간 가온하였다.
계속하여 프로토콜에 따라 RNA-DNA 하이브리드(hybrid)중의 RNA를 분해하고, DNA 사슬로 그 RNA 사슬을 치환하여 Second-strand cDNA (이중가닥 cDNA)를 합성하였다. 즉, 상기 20μl First-strand cDNA 반응액에, 63μl Nuclease-free Water, 당해 키트에 포함되는 10×Second-strand 완충용액(10μl), 5 mM dNTP Mix(4μl), DNA Polymerase Mix(2μl：10 U/μl), 1μl RNase H를 더해 합계 100μl를 잘 혼합하여, 16℃으로 2 시간 가온하였다.
반응 종료 후, QIAquick PCR purification Kit(QIAGEN사 제품)를 이용하여, 첨부된 프로토콜에 따라, 합성한 이중가닥 cDNA를 정제하였다. 즉, cDNA 용액 100μl에 해당 키트에 포함되는 500μl의 완충용액 PB를 첨가하여 혼합하여, 2 ml의 원심분리튜브에 넣은 QIAquick 스핀 컬럼에 첨가하고, 13,000 rpm으로 50 초간 원심하였다. 용출액을 제거해 다시 QIAquick 스핀 컬럼을 넣어, 해당 키트에 포함되는 700μl의 완충용액 PE를 첨가하고, 13,000 rpm으로 1 분간 원심분리하였다. 용출액을 제거해 다시 QIAquick 스핀 컬럼을 넣어, 재차 13,000 rpm으로 1 분간 원심분리하여 완전하게 완충용액 PE를 제거하였다. QIAquick 스핀 컬럼을 새로운 1.5 ml 튜브에 넣어, 30μl 의 Nuclease-free Water를 QIAquick 스핀 컬럼의 멤브레인상에 직접 첨가하고, 1분간 정치 후 13,000 rpm으로 1분간 원심분리하며, 이 과정을 재차 반복하였다(합계 60μl로 용출). 진공 건조기로, cDNA 용액을 9.5μl 이하까지 농축하고, Nuclease-free Water로 9.5μl로 조정하였다.
(2) cDNA로부터 표지된 cRNA의 합성
계속해서 CodeLink Expression Assay Reagent Kit(GEhealthcare bioscience사 제품)의 프로토콜에 따라 비오틴으로 표지한 뉴클레오티드 존재하에서 in vitro transcription (IVT) 반응을 실시하여, cRNA를 합성하였다. 즉, 해당 키트에 포함되는 10 × T7 Reaction 완충용액 4.0μl, T7 ATP Solution 4.0μl, T7 GTP Solution 4.0μl, T7 CTP Solution 4.0μl, T7 UTP Solution 3.0μl을 혼합하고, 10 mM Biotin-11-UTP(Perkin Elmer사 제품) 7.5μl도 더하여 합계 26.5μl를 (1)에서 조정한 9.5μl cDNA 용액에 첨가하였다. 아울러 해당 키트에 포함된 10 × T7 Enzyme Mix 4.0μl를 가하여, 합계 40.0μl를 잘 혼합하고, 증기 상태(vapor phase)에서 37℃로 14 시간동안 가온하였다. 반응 종료 후, RNeasy Mini Kit(QIAGEN사 제품)를 이용하여 첨부된 프로토콜에 따라, 합성한 cRNA를 정제하였다. 즉, IVT 반응액(40μl)에 Nuclease-free Water 60μl를 첨가하고, 해당 키트에 포함된 완충용액 RLT 350μl를 합계 100μl의 용액에 첨가하고 잘 혼합하고, 거기에 100% 에탄올 250μl을 첨가하여 잘 혼합하고, 전체 양(700 μl)을 해당 키트에 포함된 RNeasy 미니 스핀 컬럼에 첨가하여, 12,000 rpm으로 15 초간 원심분리하였다. RNeasy 미니 스핀 컬럼을 새로운 2 ml 튜브에 넣고, 해당 키트에 포함된 완충용액 RPE 500μl를 컬럼에 첨가하여 12,000 rpm으로 15 초간 원심분리하며, 이 조작을 두 번 반복하였다. 용출액을 제거한 후, 다시 RNeasy 미니 스핀 컬럼을 2 ml 원심분리 겔(튜브)에 넣고, 12,000 rpm으로 2 분간 원심분리하여 컬럼 내의 멤브레인을 건조시킨 후, RNeasy 미니 스핀 컬럼을 또다른 1.5 ml 튜브로 옮겨, Nuclease-free Water 50μl를 멤브레인 상에 직접 첨가하였다. 실온에서 10 분간 정치 한 후, 12,000 rpm로 1분간 원심분리해, 이 과정을 두 번 반복하였다(합계 100μl로 용출함).
샘플을 잘 혼합하여, 2μl는 Agilent 2100 Bioanalyzer 에 의한 cRNA 품질 체크용으로, 2μl는 멸균 증류수로 50배 희석해 cRNA 정량용으로 조제하고, 나머지는 -80℃에서 보존하였다. 정량은 50배 희석 용액의 260 nm 및 280 nm 흡광도를 측정해, cRNA 농도를 정량하고, 260 nm/280 nm 의 흡광도비가 1.8이상인 것을 확인하였다. cRNA 농도가 0.5μg/μl 이하인 경우는 진공 건조기로 농축하였다. cRNA의 품질 체크는 Agilent 2100 Bioanalyzer 및 RNA LabChip를 이용하여 첨부된 프로토콜에 따라 전기영동하여, 스메어 피크(smear peak)의 길이가 500 염기 이상인 것을 확인하여 수행하였다.
(3) 표지된 cRNA의 단편화
계속해서 CodeLink Expression Assay Reagent Kit(GEhealthcare bioscience사 제품)의 프로토콜에 따라, cRNA를 약 100~200 염기로 단편화하였다. 즉, cRNA 10μg가 20μl가 되도록, 뉴클레아제가 없는 물(Nuclease-free Water)를 첨가하고, 해당 키트에 포함된 5 × 분절화 완충용액(Fragmentation 완충용액) 5μl을 첨가해, 94℃로 20분간 가열 후, 빙상(on ice)에서 급냉하였다. 단편화된 cRNA 10μg가 포함된 용액 25μl에, 해당 키트에 포함된 하이브리드화 완충용액 A(Hybridization 완충용액 A) 78μl, 하이브리드화 완충용액(Hybridization 완충용액 B) 130μl, 뉴클레아제가 없는 물(Nuclease-free Water) 27μl을 가하여 합계 260μl의 하이브리다이제이션 용액을 제조하였다. 최고 속도로 5 초간 볼텍스(vortex)하고 속도를 감소시켜(spin-down), 90℃으로 5분간 가열해 cRNA 의 열변성을 실시하고, 빙상에서 냉각하였다.
(4) 단편화 cRNA와 마이크로 어레이와의 하이브리다이즈
CodeLink Shaker Kit(GEhealthcare bioscience사 제품) 및 CodeLink INNOVA 진탕기(shaker)를 이용하여 프로토콜에 따라 하이브리다이즈를 실시하였다. 즉, CodeLink UniSet Human 20K I Bioarray를 해당 키트에 포함된 12 Slide Shaker Tray에 넣었다. (3)에서 조정한 하이브리다이제이션 용액을 최고 속도로 5초간 볼텍스한 후 속도를 감소시켜(spin-down), 하이브리다이제이션 용액 250μl를 어레이의 씰링 챔버(sealing chamber)의 오른쪽-아래의 구멍에 주입하고, 어레이의 부속인 씰링 스트립(sealing strip)(sticker)으로 구멍을 밀봉하였다. 어레이를 실은 진탕기 받침(shaker tray)를 CodeLink INNOVA 진탕기 안에 설치하고, 37℃, 300 rpm로 선회시키면서 18시간 동안 가온하였다.
(5) 마이크로 어레이의 염색
CodeLink Parallel Processing Kit(GEhealthcare bioscience사 제품)를 이용하여 프로토콜에 따라, 어레이의 염색 및 세정을 실시하였다. 즉, 상기 하이브리다이즈가 끝난 어레이에서 씰 챔버(seal chamber)를 제거하고, 실온에서 0.75 × TNT 완충용액 (0.1 M Tris-HCl(pH 7.6), 0.15 M NaCl, 0.05% Tween 20) 13 ml를 가하였고, 반응액을 해당 키트에 포함된 바이오어레이 랙(Bioarray Rack)을 이용하여 중형 시약 저장소(medium reagent reservoir)의 슬롯으로 나누었다. 몇 차례 랙(rack)을 상하로 움직여 여분의 하이브리다이제이션 용액을 어레이에서 떨어 뜨리, 46℃에 가온한 0.75 × TNT 완충용액 240 ml로 채운 대형 시약 저장소(large reagent reservoir)로 어레이를 옮겼다. 바이오어레이 랙을 46℃에서 1 시간 동안 가온하였다.
염색액으로는, 어레이 1매당 뉴클레아제가 오염되지 않은 증류수(Nuclease-free Water)에 1 mg/ml의 농도로 용해한 스트렙타비딘(Streptavidin)-Cy5액 6.8μl를 TNB 완충용액(0.1 M Tris-HCl(pH 7.6), 0.15 M NaCl, 0.5 % TSA 차단시약(Blocking Reagent) (Perkin Elmer사 제품)) 3393.2μl로 실온에서 500배로 희석하여, 합계 3.4 ml를 해당 키트에 포함되는 소형 시약 저장소(Small Reagent reservoir)의 슬롯에 채웠다. 이 소형 시약 저장소에, 어레이가 보관된 바이오어레이 랙을 옮기고, 알루미늄 등으로 차광하며 실온(23℃±2℃)에서 30 분간 염색하였다.
염색 후, 바이오어레이 랙을 TNT 완충용액(실온) 240 ml를 채운 대형 시약 저장소로 옮겨, 몇 차례 움직인 후(moved up and down) 실온에서 5 분간 보관하였다. 그리고 새로운 TNT 완충용액(실온)를 채운 대형 시약 저장소로 옮겨 몇 차례 상하로 움직인 후 실온에서 5 분간 보관하며, 이를 총4회 반복하여 세정하였다. 마지막으로 0.05% Tween 20 용액 240 ml을 이용하여 5초간 상하로 움직이면서 세정하고, 이를 두 번 반복하였다. 건조한 중형 시약 저장소에 바이오어레이 랙을 넣어, 600 × g, 실온에서 3분간 원심분리하여 건조시켰다.
(6) 마이크로 어레이의 스캔
염색한 각 어레이를 어질런트 G2565(Agilent G2565 (Agilent사 제품)) 스캐너를 이용하여 염색 패턴을 읽어내어 TIFF 이미지로 보존하였다. TIFF 이미지를 코드링크 발현 분석 소프트웨어(codeLink Expression Analysis software)로 처리하여, 어레이 상의 각 유전자 스팟(spot)을 신호 크기로 수치화(digitize)하였다.
(7) 유전자 발현 분석
상기에서 얻은 신호 강도 데이터를 GeneSpring GX (Agilent사 제품) 마이크로 어레이 유전자 발현 분석 소프트를 이용하여 표준화(Normalization)하여 해석하였다. 즉, 스팟 신호에서 배경 신호를 제거하였고, 그 값이 0.01 미만인 것은 0.01로 보정하고, 어레이의 전체 스팟 신호의 중앙치로 나눈 값을 각각의 유전자의 표준화한 상대적 발현량으로 하였다. 이 상대적 발현량이 정상세포(도 1, 왼쪽 위)에 비해 불사화 암세포주(도 1, 오른쪽 아래)에서 전체적으로(universally) 증가한 유전자를 하기와 같이 선택하였다. 다양한 장기에서 보편적으로 발현이 강화된 유전자는, 정상 체세포(도 1, 왼쪽 위)의 암화(도 1 가운데, 흰색, 파란색 화살표)에 관련된 유전자보다는, 암세포의 불사화(도 1 가운데, 오른쪽 방향 빨강 화살표)와 관련된 유전자일 것으로 예상되었다.
9종의 폐암 세포주 중 8종 이상에서 2종의 정상 기도 표피의 중앙치보다 2배 이상 높게 발현하고, 21종의 식도암 세포주 중 19종 이상에서 2종의 비종양성 식도 표피의 중앙치보다 2배 이상 높게 발현하며, 한편 9종의 소화기암 외 다양한 암(위암, 대장암, 머리 경부암, 백혈병) 세포주 중 8종 이상에서, 상기 4종의 비종양성 표피(2종의 기도 표피와 2종의 식도 표피)의 중앙치보다 2배 이상 높게 발현하고 있는 유전자인 51개 유전자를 추출하였다(도 2, 왼쪽 위). 한편, 이들 3 개 군의 장기별 암세포주의 발현 레벨의 평균치가, 각각 대조군으로 한 정상 표피의 평균치의 2배 이상(단, 이 평균치에 의한 선택에 이용한 식도암 세포주는 최초로 분석을 한 7종임)이고, 또한 불사화 폐암 세포로 구성된 전이 폐암 조직에 있어서의 발현 레벨이, 동일 증세의 비불사화 폐암 세포로 구성되는 원발성 조직 및 전이 조직의 평균치의 2배 이상인 유전자를 80개 유전자 추출하였다(도 2, 오른쪽 위). 스크리닝된 이들 2군에서, 7개 유전자가 양쪽 군에서 공통적으로 추출되었다.
암세포주가 모두 불사화한 세포라는 것은 이미 알려져 있으며, 이 때, 이용한 불사화·비불사화 폐암 조직은, 텔로메라제 활성(Hiyama K등, J Natl Cancer Inst 87: 895-902, 1995, Case G), 텔로미어 길이(Hiyama K등, Oncogene 10: 937-44, 1995, Case 92-D), 및 hTERT 단백질의 in situ 발현(Hiyama E등, Neoplasia 3: 17-26, 2001, Fig 6A, B) 분석에 의하여, 동일 증세의 원발성(도 3 가운데, 「D2Pr」) 및 간 전이병소(hepatic metastasis focus)(도 3 가운데, 「D5M3」)는 불사화하지 않았으며(텔로메라제 활성은 음성이며, 텔로미어 길이 단축됨, hTERT 단백질 발현은 관찰되지 않음), 림프절 전이병소(lymph node metastasis focus)들 중 하나(도 3중, 「D4M2」)는 거의 불사화 세포만으로 구성되고(고텔로메라제 활성, 텔로미어 쵸엔장, 거의 모든 세포로 hTERT 단백 발현), 또 다른 하나의 전이병소(metastasis focus) (도 3 중, 「D3M1」)는, 불사화 세포가 비불사화 세포안에 혼재되었다는 것(텔로메라제 활성 낮음, hTERT 단백 발현 세포가 비발현 세포 안에 혼재됨)을 확인하였다.
게다가 유방암 11개 세포주, 난소암 10개 세포주, 췌장암 10개 세포주에 대해서도 공통적으로 높게 발현되는 유전자의 범위를 좀더 좁혀, 최종적으로, (1)유비퀴틴-콘쥬게이트 효소 E2S(ubiquitin-conjugating enzyme E2S)(UBE2S), (2) 복제인자 C(replication factor C) (activator 1) 4, 37 kDa(RFC4) (3) 프로스타글란딘 E 합성효소 2(prostaglandin E synthase 2)(PTGES2), (4) MAF1 동족계(homolog) (S. cerevisiae)(MAF1), (5) 액티빈 A 수용체(activin A receptor), type IIB(ACVR2B), (6) 서열 상동성 119, 멤버 A의 계열(family with sequence similarity 119, member A)(FAM119A), (7) 류코트리엔 B4 12-하이드록시디하이드로게나제(leukotriene B4 12-hydroxydehydrogenase)(LTB4DH), (8) 돌리치-파스페이트 만노실트렌스페라제 폴리펩타이드 2, 조절부위 (dolichyl-phosphate mannosyltransferase polypeptide 2, regulatory subunit)(DPM2), (9) 셀레노프로틴 X (selenoprotein X), 1(SEPX1), (10) 프로테오좀(proteasome) (프로좀(prosome), 마크로파인(macropain)) 부위(subunit), 알파 타입(alpha type), 3(PSMA3), (11) 코일드-코일-헬릭스-코일드-코일-헬릭스 도메인 콘테이닝 3(coiled-coil-helix-coiled-coil-helix domain containing 3)(CHCHD3), (12) LSM3 동족체(homolog), U6 작은 핵 RNA 결합(small nuclear RNA associated) (S. cerevisiae)(LSM3), 및 (13) G-2 및 S-기 발현 1(G-2 and S-phase expressed 1)(GTSE1)의 합계 13개 유전자가, 폐암 세포주, 식도암 세포주, 소화기암 세포주, 유방암 세포주, 난소암 세포주, 췌장암 세포주, 그 외 암세포주의 대부분에서 공통적으로, 유한한 수명의 비종양성 세포와 비교하여 높게 발현되며, 텔로메라제 양성 폐암 전이 조직(불사화 암세포)에서 동일 증세의 텔로메라제 음성 폐암 전이 조직 및 원발성 조직(비불사화 암세포)보다 높게 발현하고, 불사화 세포 및 불사화하지 않은 세포가 혼재한 췌장암조직보다 불사화한 세포만으로 구성되는 췌장 암세포주에서 더 높게 발현되는 것을 확인하였다(도 3). 이때, 이용한 췌장암조직은, 동일 증세의 정상 췌장 조직과 비교해서, 텔로메라제를 코딩하는 유전자 TERT의 전체 길이 mRNA(full length mRNA) 발현량이 많지만, 불사화 췌장 암 세포주에 비교해서는 확실히 낮아, 불사화하지 않은 세포가 혼재하고 있다고 생각된다.
도 3~15에 나타난 것과 같이, 상기의 13개 유전자는,
(1) 불사화 세포(도 3~15 검은색：MCF-12 A, SV11e, SV11-106 외 모두 인간 암 유래 세포주)에서는, 유한 수명의 비종양성 세포(도 3~15 탈색)에 비교해 강하게 발현되었다.
(2) 인간 암유래 불사화 암세포(도 3~15, MCF-12 A, SV11e, SV11-106 이외 검은 막대)에서는 유한 수명 암세포(도 3~15, SV12e, SV12-72 이외 사선)보다 강하게 발현되었다.
(3) 정상인 폐 섬유모세포(lung fibroblasts)에 텔로메라제를 코딩하는 유전자 TERT를 도입해 얻은 비종양성 텔로메라제 발현 수명-연장(life-extension) 세포(도 3~15, 다이아몬드 모양의 점박이 무늬 막대, TERT6e, TERT6-85)에서는, 부모 세포(TIG-1)에 비교해 덜 강하게 발현되었다.
이들 유전자들은 암세포 특이적으로 텔로메라제 양성 불사화 세포에서 높게 발현하는 유전자이다. 이로써 이들 유전자는, 암세포의 불사화를 규정하는 유전자(불사화 규정 유전자)라고 생각된다.
게다가 정상 폐 섬유모세포에 텔로메라제를 코드하는 유전자 TERT 및 SV40 조기항원(early antigen)을 코드 하는 유전자를 도입해 얻은 불사화 형질전환 세포(도 3내지 15, SV11e, SV11-106: 반고형 한천으로 콜로니 형성 분석(colony formation assay with soft agar) 결과, 콜로니를 만들며, 300 PDL 이상에서 통과가 가능하다(passage capability)는 것을 확인하였음)에서는, 부모 세포(TIG-1)나 비종양성 연명 세포(TERT6e, TERT6-85：반고형 한천으로 콜로니 형성 분석(colony formation assay with soft agar)한 결과 콜로니를 만들지 않고, 100 PDL 미만에서 세포 증식이 정지하는 것을 확인하였음)와 비교할 때, MAF1, LTB4DH 이외에는 강하게 발현하였다. 이들 2개 유전자는, in vitro로 형질전환시킨 세포가 반드시 인간의 암과 동일하게 성장하는 것은 아니기 때문인 것으로 생각된다.
불사화 규정 유전자의 siRNA(small interfering RNA)에 의한 암세포 증식 억제
실시예 1에서 특정한 13종의 불사화 규정 유전자의 암세포 증식과의 관련성을 해석하기 위해서 각 유전자 서열 특이적 siRNA를 설계, 제작하여, 3종의 암세포주(HeLa: 자궁경암, KYSE150: 식도암, HCC50:대장암)에 유전자를 도입하고, 불사화 규정 유전자의 mRNA 발현의 억제 및 도입 후 96시간 후 세포 증식에 미치는 영향을 검토하였다.
(1) 불사화 규정 유전자 서열 특이적 siRNA(small interfering RNA)의 설계 및 제작
13종의 각 불사화 규정 유전자에 대하여, 2종 또는 4종의 특이적인 siRNA 서열을 설정하고, 센스 가닥과 안티센스 가닥에 의해 이중가닥이 형성된 siRNA를 Qiagen사 및 일본 바이오 서비스사부터 구입하였다. 각각의 제작된 siRNA의 서열 가운데, 센스 가닥만을 표 2 및 3에 나타내었다. 각 유전자의 siRNA-1은 2 종류의 siRNA가 동일한 몰라 농도로 혼합된 것(equimolar mixture)이었다.
Gene Symbol siRNA Name Position Sequence SEQ ID No.
UBE2S siRNA-1 44-64
146-166		 CCGGCCGGCCGCAGCCAUGAA
UGGCAUCAAGGUCUUUCCCAA		 27
　28
siRNA-2 473-491 GGAGAACUACGAGGAGUAU 　29
siRNA-3 659-677 UGGCGAGCGCGAUAAGAAG 　30
RFC4 siRNA-1 897-917
189-209		 AGGGAAUAGCUUAUCUUGUUA
CUGCACGAGAAGCCAGGCUAA		 　31
　32
siRNA-2 745-763 CCGAUUCUGUCUUAUCUGU 　33
siRNA-3 1023-1041 GGGUAAUACCAGCUGAGAA 　34
PTGES2 siRNA-1 2003-2023
1105-1125		 CUGGGACAUGUUUGCAAUAAA
CUGGCUCAUGCUCAACGAGAA		 　35
　36
siRNA-2 943-961 AGGAGAAAGCUCGCAACAA 　37
siRNA-3 1086-1104 CCGAGUUCGGCAAUAAGUA 　38
MAF1 siRNA-1 1538-1558
1031-1051		 CAGCUGGACCGCAGAGUUUAU
UAGCCUCUGGUCCUUCAACUA		 　39
　40
siRNA-2 604-622 ACGACAAACACAUGUUCAA 　41
siRNA-3 856-874 GCCUUAGCUGGGUGGUGAA 　42
ACVR2B siRNA-1 626-646
208-228		 CAGCUCAUGAAUGACUUUGUA
CACCAUCGAGCUCGUGAAGAA		 　43
　44
siRNA-2 684-702 GGCAGAGUGAACGGGAGAU 　45
siRNA-3 840-858 GGAACAUCAUCACAUGGAA 　46
FAM119A siRNA-1 754-774
1068-1088		 AAGGUUCACUACGAUCCUGAA
UCGAUUUAUGCUAUUUGUGUA		 　47
　48
siRNA-2 201-219 GGAAUUUGGGUUGCAGAAA 　49
siRNA-3 810-828 CCAGAAGGAGGACUUAUAA 　50
LTB4DH siRNA-1 775-795
658-678		 CACUGUUAUCGGCCAGAUGAA
UGGAUUUGAUGUCGUCUUUAA		 　51
　52
siRNA-2 263-281 GCCAAAAGAUUGAAGGAAG 　53
siRNA-3 725-743 CCUGAUGGUUAUGAUUGUU 54
DPM2 siRNA-1 145-165
84-104		 CAGCAUGUCAUCCACAAGUAU
UAGCCUGAUCAUCUUCACCUA		 　55
　56
siRNA-2 116-134 GGGUGAUUCUCUUGCCAUU 　57
siRNA-3 224-242 UGUUUGUGGGACUGUUCAU 　58
SEPX1 siRNA-1 870-890
794-814		 CAGACUCUCGUCCUCACCGAA
CUGAAUGACGUUACACCCUCA		 　59
　60
siRNA-2 161-179 GGGCGAGGUUUUCCAGAAU 　61
siRNA-3 179-197 UCACUUUGAACCUGGCGUU 　62
PSMA3 siRNA-1 853-873
686-706		 CCAGUCCAAUGUAACUAUUUA
CUCAGCUGGGUUGGUGAAUUA		 　63
　64
siRNA-2 291-309 UGGCAGAUGCUCGUUCUUU 　65
siRNA-3 512-530 GGUGUUUCAUACGGUUAUU 　66
CHCHD3 siRNA-1 546-566
1450-1470		 CAGGAUGCAUUCUACAAAGAA
CUGGAAUAAUGUUUAUGAUUA		 　67
　68
siRNA-2 374-392 CGAAGAUCAGAAACGACUA 　69
siRNA-3 522-540 GAGAAAGACCGAGUGCUAA 　70
LSM3 siRNA-1 540-560
37-57		 UCCAAUAAAUAUGACCACCAA
ACGACGUAGACCAGCAACAAA		 　71
　72
siRNA-2 39-57 GACGUAGACCAGCAACAAA 　73
siRNA-3 261-279 ACGAAACGGAAUAUUCCAA 　74
GTSE1 siRNA-2 1082-1100 GGGCAAAGCUAAAUCAAGU 　75
siRNA-3 2116-2134 UGACAAACACUCCAGACAU 　76
(2) 인간 암세포주의 배양
3종의 암세포주(HeLa: 자궁경암, KYSE150: 식도암, HCC50:대장암)는 각각 하기의 조건으로 배양하였다. HeLa는 10% 소태아혈청(Fetal Bovine Serum)(Sigma사 제품) 및 젠타마이신(gentamycin)(Sigma사 제품)을 포함한 DMEM 배지(Nacalai Tesque사 제품)를 이용하고, KYSE150와 HCC50는 10% 소태아혈청(Fetal Bovine Serum) 및 젠타마이신을 포함한 RPMI 1640 배지(Nacalai Tesque사 제품)를 이용하여 배양하였다.
(3) 불사화 규정 유전자 서열 특이적 siRNA의 암 세포주에의 유전자 도입
형질전환하기 전 날, 미리 배양한 각 암세포를 트립신을 처리하여 회수하고, (2)에 기재한 배지에 현탁한 후, 24 웰 플레이트의 1 웰 당, HeLa를 1.2×104개, KYSE150를 2×104개, HCC50를 1.5×104개의 세포를 접종하였다. 형질전환 당일에 무혈청배지　Opti-MEM(Invitrogen사 제품)로 교환하여, 올리고펙타민(Oligofectamine)(Invitrogen사 제품) 또는 리포펙타민 2000(Lipofectamine 2000)(Invitrogen사 제품)을 이용하여 표 2 및 표 3에 나타낸 siRNA로 형질전환하였다. 형질전환 시 siRNA의 농도는 1 웰 당, 40 nM로 하였다. 음성 대조군으로 대조군 (Control)(non-silencing) siRNA(Qiagen사 제품)를 사용하였다.
(4) 불사화 규정 유전자의 상대적 mRNA 발현량의 억제 해석
(3)의 형질전환 후 1일 후 각 암세포주로부터, RNeasy Mini(Qiagen사 제품)를 이용하여 제품의 설명서에 따라, 전체 RNA(total RNA)를 추출하였다. QuantiTect Probe RT-PCR(Qiagen사 제품) 및 불사화 규정 유전자 서열 특이적 TaqMan Probe(ABI사 제품)를 이용하여, 하기 조건에서 정량 RT-PCR(ABI사 제품, ABI PRISM 7000 sequence detection system를 사용)를 실시하였다.
i) 50℃, 30분간,
ii) 95℃, 15분간,
iii) 94℃, 15초간　→　60℃, 1분간을 35~45 사이클.
내부적인 표준으로 β-액틴 사용해, 각각의 증폭 곡선으로부터 발현량을 수치화하였다. 대조군으로는 NS서열 siRNA를 도입한 세포의 수치를 이용하였다. 아울러 불사화 규정 유전자의 상대적 mRNA량의 측정은, 동일 표적 유전자, 동일 암세포주에 대하여 동일한 조건으로 2회씩 실시하였다.
대조군에서의 각 불사화 규정 유전자의 mRNA량을 100%로 했을 때, 각 siRNA를 도입한 세포에 있어 각 불사화 규정 유전자의 상대적 mRNA량을, 도 16~28에 mRNA 정량 1 및 mRNA 정량 2로 표시하였다. 모든 표적 유전자에서, siRNA들(siRNA-1 내지 siRNA-3)중 어느 하나에 의해 mRNA 발현량이 억제된 것이 관찰되었다.
(5) 암세포주의 증식 측정
암세포주의 증식은 생존 세포수 측정 시약 SF(viable cell count measurement reagent SF, Nacalai Tesque사 제품)를 이용하여 측정하였다. (3)에서 형질전환 후 96시간 후, 1 웰 당, WST 시약을 10μl첨가하고, 37℃으로 3시간 배양한 후에 플레이트 리더(Perkin Elmer사 제품, Wallac ARVO MX1420 Multilabel Counter)로 450 nm 및 595 nm(참조 파장)의 흡광도를 측정하였다. 450 nm의 흡광도-595 nm의 흡광도-BG(배지만)의 흡광도로 수치화하여, 3 웰 당 평균치를 구하고 NS서열 siRNA 도입 세포의 값을 100%로서 표시하였다. 아울러 암세포주의 증식 측정은, 동일 표적 유전자 및 동일 암세포주에 대하여 동일한 조건으로 2회씩 실시하였다.
NS서열 siRNA 도입 시 세포수를 100%로 했을 때, 각 siRNA 도입시의 세포수를 도 16~28에 MTT-1 및 MTT-2로 표시하였다. 모든 표적 유전자에서, 몇 개의 siRNA에 의해 3종의 암세포에서 증식이 억제되는 것이 관찰되었으며, 이것으로부터 이들 13종의 불사화 규정 유전자가, 보편적으로 불사화 암세포의 증식을 억제를 억제하는 분자 표적이 될 수 있는 것으로 나타났다.
본 발명은　치료약으로 개발하는 것뿐 아니라, 암세포에서 불사화와 유한 수명을 감별하는 질환 마커로서의 의의도 크다. 통상 암의 진단은 병리 소견에 의하여 분화도(differentiation)나 이형성(atypism) 등이 진단 가능하지만, 그 세포가 불사화하고 있는지 아닌지, 즉 무한 수명을 획득하고 있는지 아닌지는 통상의 병리 해석에서는 판정할 수 없다. 종래 인간 텔로메라제의 활성화가 불사화의 마커로서 주목받아 왔지만, 전술한 것과 같이, 정상세포의 일부에서도 텔로메라제가 활성화 되는바, 텔로메라제의 활성화만으로 반드시 세포가 불사화하는 것은 아니라는 것이 밝혀지고 있다. 게다가 면역 조직 염색법이 확립되었음에도 불구하고 텔로메라제의 발현량이 매우 낮아, 일부 연구실에서만 성공적으로 수행되고 있다(Hiyama E등, Neoplasia 3: 17-26, 2001). 상기 본 발명의 불사화 규정 유전자의 발현을 마커로 이용함으로써, 통상의 병리 진단에서는 판정할 수 없었던 불사화 암세포를 유한 수명 세포로부터 감별하는 것이 가능해져, 암의 조기진단·치료 선택·예후 예측에의 임상 응용이 기대된다.
<110> KABUSHIKI KAISHA YAKULT HONSHA <120> GENE INVOLVED IN IMMORTALIZATION OF HUMAN CANCER CELL AND USE THEREOF <130> 10FPI-12-21 <150> JP 2006-161350 <151> 2006-06-09 <160> 76 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 890 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 ggcggaccga agaacgcagg aagggggccg gggggacccg cccccggccg gccgcagcca 60 tgaactccaa cgtggagaac ctacccccgc acatcatccg cctggtgtac aaggaggtga 120 cgacactgac cgcagaccca cccgatggca tcaaggtctt tcccaacgag gaggacctca 180 ccgacctcca ggtcaccatc gagggccctg aggggacccc atatgctgga ggtctgttcc 240 gcatgaaact cctgctgggg aaggacttcc ctgcctcccc acccaagggc tacttcctga 300 ccaagatctt ccacccgaac gtgggcgcca atggcgagat ctgcgtcaac gtgctcaaga 360 gggactggac ggctgagctg ggcatccgac acgtactgct gaccatcaag tgcctgctga 420 tccaccctaa ccccgagtct gcactcaacg aggaggcggg ccgcctgctc ttggagaact 480 acgaggagta tgcggctcgg gcccgtctgc tcacagagat ccacgggggc gccggcgggc 540 ccagcggcag ggccgaagcc ggtcgggccc tggccagtgg cactgaagct tcctccaccg 600 accctggggc cccagggggc ccgggagggg ctgagggtcc catggccaag aagcatgctg 660 gcgagcgcga taagaagctg gcggccaaga aaaagacgga caagaagcgg gcgctgcggg 720 cgctgcggcg gctgtagtgg gctctcttcc tccttccacc gtgaccccaa cctctcctgt 780 cccctccctc caactctgtc tctaagttat ttaaattatg gctggggtcg gggagggtac 840 agggggcact gggacctgga tttgtttttc taaataaagt tggaaaagca 890 <210> 2 <211> 1427 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2 accggcgtat tcccgccctg cttttcgccc gccgttccgt ggcgggaact gaggcgactg 60 tggggacatc agtgatcgta agtctcctgg gcccgttatt ctcagattag gtgacggagc 120 taagacttcg agaccatctc gtcctttttg tatcgcggaa acctgaggaa cgagccggcg 180 gcggtgacct gcacgagaag ccaggctaac tgggtgaagt accatgcaag catttcttaa 240 aggtacatcc atcagtacta aacccccgct gaccaaggat cgaggagtag ctgccagtgc 300 gggaagtagc ggagagaaca agaaagccaa acccgttccc tgggtggaaa aatatcgccc 360 aaaatgtgtg gatgaagttg ctttccagga agaagtggtt gcagtgctga aaaaatcttt 420 agaaggagca gatcttccta atctcttgtt ttacggacca cctggaactg gaaaaacatc 480 cactattttg gcagcagcta gagaactctt tgggcctgaa cttttccgat taagagttct 540 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1620 gcgcagagca gagggaaggc agcggaagac gccagctgcc agggcctggg gccactgggc 1680 cagcgcctgg cgatactggt tgggggcagg atcattctgc cccttgtcca cgcaccccca 1740 ccagccctct cgcttctaac acagggcacc tgctggggct cagggatgtt agggacgagt 1800 tccagccctg ccactgccct ggggcgaccc ctccctgtcc ctgcctccct gctctgccgc 1860 ccctcttcct ggaccctcag tggctgtccc atggctacat cctgtgggtg ggggccctcg 1920 acaggacagc aggacggttt gttttcagtg gaatcccatc cctgggttcc cctggttccc 1980 actcttccca agcctcccgg gactgggaca tgtttgcaat aaaggaaagg tttgtggcgc 2040 ctgtcatggc aggcatctca tggaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2100 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2120 <210> 4 <211> 1766 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 4 acccgatggc tattcgagct ctcgatctcg gagactggag cgggccattc agaggcgcgg 60 ggccgggccc ggcggacgct tgttgttgtc cggccggggg aggcggaggt cgctcgctcg 120 ctcgctcggc tcgctgactc gccggagcgc tctgtggcgg tcggcggcag gtcggtcgcg 180 agagcgggct ctgtggaagg gggcgaggct atgtcgcggt ggcagcccgg atgggccggc 240 agggccggga gtaacgggac gtcgccgcgg agcttcttcc cccggataca gtgcggcccg 300 agcggaggcc gcggcgccgc cctccgatct tgaagagccc gcgctgcgcg gagcccgccc 360 ccgcctgcgc accggcaccg acgcggagcg acccagccca gccagacccg gcccggcgcg 420 gcctgatcta acccagccag gcaggcaata ctagcccctc tggagcacgg agctccttcc 480 ccaaagacat gaagctattg gagaactcga gctttgaagc catcaactca cagctgactg 540 tggagaccgg agatgcccac atcattggca ggattgagag ctactcatgt aagatggcag 600 gagacgacaa acacatgttc aagcagttct gccaggaggg ccagccccac gtgctggagg 660 cactttctcc accccagact tcaggactga gccccagcag actcagcaaa agccaaggcg 720 gtgaggagga gggccccctc agtgacaagt gcagccgcaa gaccctcttc tacctgattg 780 ccacgctcaa tgagtccttc aggcctgact atgacttcag cacagcccgc agccatgagt 840 tcagccggga gcccagcctt agctgggtgg tgaatgcagt caactgcagt ctgttctcag 900 ctgtgcggga ggacttcaag gatctgaaac cacagctgtg gaacgcggtg gacgaggaga 960 tctgcctggc tgaatgtgac atctacagct ataacccaga cttggactca gatcccttcg 1020 gggaggatgg tagcctctgg tccttcaact acttcttcta caacaagcgg ctcaagcgaa 1080 tcgtcttctt tagctgccgt tccatcagtg gctccaccta cacaccctca gaggcaggca 1140 acgagctgga 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120 atggaccctg aagaagcact ttgttggcta tcctactaat agtgactttg agttgaagac 180 atctgagctc ccacccttaa aaaatggaga ggtcctgctt gaagctttgt tcctcaccgt 240 ggatccctac atgagagtgg cagccaaaag attgaaggaa ggtgatacaa tgatggggca 300 gcaagtggcc aaagttgtgg aaagtaaaaa tgtagcccta ccaaaaggaa ctattgtact 360 ggcttctcca ggctggacaa cgcactccat ttctgatggg aaagatctgg aaaagctgct 420 gacagagtgg ccagacacaa taccactgtc tttggctctg gggacagttg gcatgccagg 480 cctgactgcc tactttggcc tacttgaaat ctgtggtgtg aagggtggag aaacagtgat 540 ggttaatgca gcagctggag ctgtgggctc agtcgtgggg cagattgcaa agctcaaggg 600 ctgcaaagtt gttggagcag tagggtctga tgaaaaggtt gcctaccttc aaaagcttgg 660 atttgatgtc gtctttaact acaagacggt agagtctttg gaagaaacct tgaagaaagc 720 gtctcctgat ggttatgatt gttattttga taatgtaggt ggagagtttt caaacactgt 780 tatcggccag atgaagaaat ttggaaggat tgccatatgt ggagccatct ctacatataa 840 cagaaccggc ccacttcccc caggcccacc cccagagatt gttatctatc aggagcttcg 900 catggaagct tttgtcgtct accgctggca aggagatgcc cgccaaaaag ctctgaagga 960 cttgctgaaa 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ggcctggcca tataggaggg tgggtgatgc tgaaatcacc ccccatctta agtaattact 1320 ttctggagta atcaggtgga aatccataga caaatgaaac attcagaaaa aaaaaaaaaa 1380 aaaaaa 1386 <210> 10 <211> 949 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 10 gcgctccggg cctggaatcc ctacgcgtcc ctttgggttt agcacgatga gctcaatcgg 60 cactgggtat gacctgtcag cctctacatt ctctcctgac ggaagagttt ttcaagttga 120 atatgctatg aaggctgtgg aaaatagtag tacagctatt ggaatcagat gcaaagatgg 180 tgttgtcttt ggggtagaaa aattagtcct ttctaaactt tatgaagaag gttccaacaa 240 aagacttttt aatgttgatc ggcatgttgg aatggcagta gcaggtttgt tggcagatgc 300 tcgttcttta gcagacatag caagagaaga agcttccaac ttcagatcta actttggcta 360 caacattcca ctaaaacatc ttgcagacag agtggccatg tatgtgcatg catatacact 420 ctacagtgct gttagacctt ttggctgcag tttcatgtta gggtcttaca gtgtgaatga 480 cggtgcgcaa ctctacatga ttgacccatc aggtgtttca tacggttatt ggggctgtgc 540 catcggcaaa gccaggcaag ctgcaaagac ggaaatagag aagcttcaga tgaaagaaat 600 gacctgccgt gatatcgtta aagaagttgc aaaaataatt tacatagtac atgacgaagt 660 taaggataaa 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<220> <223> siRNA-2 oligonucleotide (sense) for human ACVR2B mRNA <400> 45 ggcagaguga acgggagau 19 <210> 46 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA-3 oligonucleotide (sense) for human ACVR2B mRNA <400> 46 ggaacaucau cacauggaa 19 <210> 47 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA-1(754-774) oligonucleotide (sense) for human LOC151194 mRNA <400> 47 aagguucacu acgauccuga a 21 <210> 48 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA-1(1068-1088) oligonucleotide (sense) for human LOC151194 mRNA <400> 48 ucgauuuaug cuauuugugu a 21 <210> 49 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA-2 oligonucleotide (sense) for human LOC151194 mRNA <400> 49 ggaauuuggg uugcagaaa 19 <210> 50 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA-3 oligonucleotide (sense) for human LOC151194 mRNA <400> 50 ccagaaggag gacuuauaa 19 <210> 51 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA-1(705-725) oligonucleotide (sense) for human LTB4DH mRNA <400> 51 cacuguuauc ggccagauga a 21 <210> 52 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA-1(588-608) oligonucleotide (sense) for human LTB4DH mRNA <400> 52 uggauuugau gucgucuuua a 21 <210> 53 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA-2 oligonucleotide (sense) for human LTB4DH mRNA <400> 53 gccaaaagau ugaaggaag 19 <210> 54 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA-3 oligonucleotide (sense) for human LTB4DH mRNA <400> 54 ccugaugguu augauuguu 19 <210> 55 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA-1(145-165)oligonucleotide (sense) for human DPM2 mRNA <400> 55 cagcauguca uccacaagua u 21 <210> 56 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA-1(84-104)oligonucleotide (sense) for human DPM2 mRNA <400> 56 uagccugauc aucuucaccu a 21 <210> 57 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA-2 oligonucleotide (sense) for human DPM2 mRNA <400> 57 gggugauucu cuugccauu 19 <210> 58 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA-3 oligonucleotide (sense) for human DPM2 mRNA <400> 58 uguuuguggg acuguucau 19 <210> 59 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA-1(870-890)oligonucleotide (sense) for human SEPX1 mRNA <400> 59 cagacucucg uccucaccga a 21 <210> 60 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA-1(794-814)oligonucleotide (sense) for human SEPX1 mRNA <400> 60 cugaaugacg uuacacccuc a 21 <210> 61 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA-2 oligonucleotide (sense) for human SEPX1 mRNA <400> 61 gggcgagguu uuccagaau 19 <210> 62 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA-3oligonucleotide (sense) for human SEPX1 mRNA <400> 62 ucacuuugaa ccuggcguu 19 <210> 63 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA-1(853-873)oligonucleotide (sense) for human PSMA3 mRNA <400> 63 ccaguccaau guaacuauuu a 21 <210> 64 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA-1(686-706)oligonucleotide (sense) for human PSMA3 mRNA <400> 64 cucagcuggg uuggugaauu a 21 <210> 65 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA-2 oligonucleotide (sense) for human PSMA3 mRNA <400> 65 uggcagaugc ucguucuuu 19 <210> 66 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA-3 oligonucleotide (sense) for human PSMA3 mRNA <400> 66 gguguuucau acgguuauu 19 <210> 67 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA-1(546-566)oligonucleotide (sense) for human CHCHD3 mRNA <400> 67 caggaugcau ucuacaaaga a 21 <210> 68 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA-1(1450-1470)oligonucleotide (sense) for human CHCHD3 mRNA <400> 68 cuggaauaau guuuaugauu a 21 <210> 69 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA-2 oligonucleotide (sense) for human CHCHD3 mRNA <400> 69 cgaagaucag aaacgacua 19 <210> 70 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA-3 oligonucleotide (sense) for human CHCHD3 mRNA <400> 70 gagaaagacc gagugcuaa 19 <210> 71 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA-1(540-560)oligonucleotide (sense) for human LSM3 mRNA <400> 71 uccaauaaau augaccacca a 21 <210> 72 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA-1(37-57)oligonucleotide (sense) for human LSM3 mRNA <400> 72 acgacguaga ccagcaacaa a 21 <210> 73 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA-2 oligonucleotide (sense) for human LSM3 mRNA <400> 73 gacguagacc agcaacaaa 19 <210> 74 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA-3 oligonucleotide (sense) for human LSM3 mRNA <400> 74 acgaaacgga auauuccaa 19 <210> 75 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA-2 oligonucleotide (sense) for human GTSE1 mRNA <400> 75 gggcaaagcu aaaucaagu 19 <210> 76 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA-3 oligonucleotide (sense) for human GTSE1 mRNA <400> 76 ugacaaacac uccagacau 19

Claims (12)

  1. 서열번호 1로 기재되는 염기서열 내의 15 염기 길이 이상의 연속적인 염기서열과, 「1 X SSC, 0.1% SDS, 37℃」의 조건하에서 세정 후에도 특이적으로 하이브리다이즈 상태를 유지하며, 15 염기 길이 이상의 염기 서열을 갖는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는,
    정상세포 중 텔로머라제를 과발현하지 않는 비불사화 정상세포, 정상세포 중 텔로머라제를 과발현하는 불사화 정상세포, 암세포 중 텔로머라제를 과발현하지 않는 비불사화 암세포 및 암세포 중 텔로머라제를 과발현하는 불사화 암세포 중에서, 상기 텔로머라제를 과발현하는 불사화 암세포의 존재를 확인하고, 예후가 나쁜 암인지 아닌지를 판정하기 위한 조성물.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오타이드는 프로브 또는 프라이머인 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 조성물.
  3. 하기 단계 (1) 내지 (4)을 포함하는, 정상세포 중 텔로머라제를 과발현하지 않는 비불사화 정상세포, 정상세포 중 텔로머라제를 과발현하는 불사화 정상세포, 암세포 중 텔로머라제를 과발현하지 않는 비불사화 암세포 및 암세포 중 텔로머라제를 과발현하는 불사화 암세포 중에서, 상기 텔로머라제를 과발현하는 불사화 암세포의 존재를 판정해, 예후가 나쁜 암인지 아닌지를 판정하기 위한 방법:
    (1) 피험자로부터 채취되었고, 암세포가 포함된 생체 시료로부터 수득된 RNA 또는 이의 파생물과 제 1항 또는 제 2항의 폴리뉴클레오타이드를 결합시키는 단계;
    (2) 상기 폴리뉴클레오타이드를 지표로 사용하여, 상기 폴리뉴클레오타이드에 결합한 RNA 또는 이의 유도체의 양을 측정하는 단계;
    (3) 상기 단계 (2)에서 얻은 RNA 또는 이의 파생물의 양(이하, 「RNA량」)과, 불사화되지 않은 정상세포 또는 암세포 또는 불사화한 정상세포에 있어서 상응하는 RNA 또는 이의 파생물의 양(이하, 「대조 RNA량」)을 비교하는 단계; 및,
    (4) 상기 단계 (2)에서 수득한 RNA량이 대조 RNA량 보다 높은 경우에, 피험자의 암세포가 불사화되었다고 판정하고, 높지 않은 경우에 피험자의 암세포가 불사화되지 않았다고 판정하는 단계.
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 하기 단계 (1') 내지 (4’)를 포함하는, 정상세포 중 텔로머라제를 과발현하지 않는 비불사화 정상세포, 정상세포 중 텔로머라제를 과발현하는 불사화 정상세포, 암세포 중 텔로머라제를 과발현하지 않는 비불사화 암세포 및 암세포 중 텔로머라제를 과발현하는 불사화 암세포 중에서, 상기 텔로머라제를 과발현하는 불사화 암세포의 존재를 판정해, 예후가 나쁜암인지 아닌지를 판정하기 위한 방법:
    (1') 피험자로부터 채취되었고, 암세포가 포함된 생체 시료로부터 수득된 폴리펩티드를 포함하는 단백질 함유 분획(protein-containing fraction)과, 서열번호 14로 기재되는 아미노산 서열로 구성되는 폴리펩티드를 인식하는 항체를 결합시키는 단계;
    (2') 상기 항체를 지표로 하여, 상기 항체에 결합한 폴리펩티드의 양을 측정하는 단계;
    (3') 상기 단계 (2')에서 수득한 폴리펩티드량과, 불사화되지 않은 정상세포 또는 암세포 또는 불사화한 정상세포에 있어서 상응하는 폴리펩티드의 양(이하, 「대조 폴리펩티드량」)을 비교하는 단계; 및
    (4') 상기 단계 (2')에서 수득한 폴리펩티드량이 대조 폴리펩티드량보다 높은 경우에 피험자의 암세포가 불사화되었다고 판정하고, 높지 않은 경우에 피험자의 암세포가 불사화되지 않았다고 판정하는 단계.
  7. 삭제
  8. 제 1항의 폴리뉴클레오타이드 및 서열번호 14로 기재되는 아미노산 서열로 구성되는 폴리펩티드를 인식하는 항체로 구성되는 군으로부터 선택되는 1개 이상을 포함하는, 정상세포 중 텔로머라제를 과발현하지 않는 비불사화 정상세포, 정상세포 중 텔로머라제를 과발현하는 불사화 정상세포, 암세포 중 텔로머라제를 과발현하지 않는 비불사화 암세포 및 암세포 중 텔로머라제를 과발현하는 불사화 암세포 중에서, 상기 텔로머라제를 과발현하는 불사화 암세포의 존재를 판정해, 예후가 나쁜암인지 아닌지를 판정하기 위한 시약 키트.
  9. 삭제
  10. 삭제
  11. 삭제
  12. 삭제
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