JP2003230388A - 糖・脂質代謝異常疾患マーカーおよびその利用 - Google Patents

糖・脂質代謝異常疾患マーカーおよびその利用

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準二 市原
Hidehito Sugaru
英仁 須軽
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Abstract

(57)【要約】 【課題】糖・脂質代謝異常疾患を反映する疾患マーカ
ー、該疾患マーカーを利用した糖・脂質代謝異常疾患の
検出方法、該疾患の改善に有用な薬物のスクリーニング
方法を提供する。 【解決手段】MLTK遺伝子の塩基配列中の連続する少なく
とも15塩基を有するポリヌクレオチドおよび／または該
ポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドを、糖・
脂質代謝異常疾患の疾患マーカーとして利用する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は糖・脂質代謝異常疾
患の診断に有用な疾患マーカーに関する。より詳細に
は、本発明は糖・脂質代謝異常疾患、例えば糖尿病、特
に2型糖尿病、高脂質血症、肥満症などの疾患の遺伝子
診断において、プライマーまたは検出プローブとして有
効な疾患マーカーに関する。
【０００２】また本発明は、上記疾患マーカーを利用し
て、糖・脂質代謝異常疾患を検出する方法(診断方法)、
糖・脂質代謝異常疾患の予防、改善または治療薬として
有効な物質をスクリーニングする方法および該方法によ
って得られる物質を有効成分とする糖・脂質代謝異常疾
患の予防、改善または治療薬に関する。
【０００３】
【従来の技術】近年、食生活の西洋化、社会的ストレス
の増加などにより、例えば肥満、それに付随する生活習
慣病などの糖・脂質代謝異常疾患、特に糖代謝異常疾患
の代表例である2型糖尿病に罹患する患者が増加してい
る。
【０００４】現在、この2型糖尿病の治療では、まず運
動療法および食事療法によって摂食量および体重が管理
され、これらの療法によっても体重コントロールなどが
不十分な場合は、更に薬物療法が行われている。この薬
物療法には、特に血糖値を十分に低下させることができ
且つ安全な治療薬が望まれている。
【０００５】一方、筋肉および脂肪は、インスリンなど
の糖代謝調節因子により制御されており、全身の糖代謝
に重要な役割を演じている。特に、ヒトでは、筋肉の全
身に対する割合は大きく、従って、筋肉の糖代謝の変化
(異常)が血糖値変化に与える影響は非常に大きいと考え
られる。このことは、2型糖尿病患者において筋肉のイ
ンスリン抵抗性が観察されることからも明らかである。
【０００６】このような観点から、筋肉などの臓器は、
糖尿病の病態に重大な影響を与える因子のひとつとして
着目できる。即ち、筋肉などの臓器におけるインスリン
抵抗性の解除、糖代謝の改善などを行うことができる薬
剤は、糖尿病の病態改善に大きく貢献すると考えられ
る。
【０００７】しかしながら、このような作用機序をもつ
薬剤は、現在のところ上市されておらず、そのような作
用機序をもつ薬剤の研究、開発が当業界で望まれてい
る。
【０００８】また、最近の医療現場では、糖・脂質代謝
異常疾患に限らず、個々の患者の症状に合わせて治療法
を的確に選択することが望まれるようになってきてい
る。高齢化社会でのQOL(Quality of life)向上の必要性
が認識されてきた近年では、特に、万人に共通した治療
ではなく、個々の患者の症状に合わせた適切な治療が強
く求められている。このような所謂テイラーメイド治療
を行うためには、個々の疾患について患者の症状やその
原因(遺伝的背景)を的確に反映する疾患マーカーが有用
であり、その探索並びに開発を目指した研究が精力的に
行われているのが現状である。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、糖尿病など
の糖・脂質代謝異常疾患を反映し、それ故、この疾患の
診断および治療に有用な疾患マーカーを提供することを
目的とする。また、本発明は該疾患マーカーを利用した
糖・脂質代謝異常疾患の検出方法（遺伝子診断方法）、
該疾患の予防、改善または治療に有用な薬物をスクリー
ニングする方法、並びに該疾患の予防、改善または治療
に有用な薬物を提供することを目的とする。
【００１０】
【課題を解決するための手段】本発明者は、上述したよ
うに筋肉などの臓器と糖尿病などの糖・脂質代謝異常疾
患との関連に着目し、この関連性について鋭意研究を行
う過程において、正常状態の筋肉に比して、糖尿病状態
の筋肉において、その発現が有意に上昇する因子を同定
した。本発明者は、この因子がシグナル伝達因子MAPキ
ナーゼキナーゼキナーゼ(MAPKKK)のひとつであるMLTK
(MLK-like mitogen-activated protein triple kinase)
蛋白質をコードする遺伝子(J. Biol. Chem., Vol.276,
No.6, pp.4276-4286 (Feb. 9, 2001)など参照)であるこ
とを見出した。更に、本発明者は、正常マウスと比較し
て、高脂肪食負荷モデルおよび肥満糖尿病モデル(db/db
マウス、KKAyマウスなど)において、上記MLTK遺伝子の
発現が有意に上昇することを認めると共に、糖尿病治療
薬の投与によって病態が改善されると、上記MLTK遺伝子
の発現量が低下(正常化)することも確認した。
【００１１】これらのことから、本発明者は、上記MLTK
遺伝子が、糖尿病をはじめとする糖・脂質代謝異常疾患
の疾患マーカーとなり得ることを確認し、この知見を基
礎として本発明を完成するに至った。
【００１２】本発明の要旨は、下記(1)-(20)の点にあ
る。
【００１３】項1. 配列番号1乃至4のいずれかに示され
るMLTK遺伝子の塩基配列中の連続する少なくとも15塩基
を有するポリヌクレオチドおよび／または該ポリヌクレ
オチドに相補的なポリヌクレオチドである糖・脂質代謝
異常疾患の疾患マーカー。
【００１４】項2. 糖・脂質代謝異常疾患の検出におい
てプローブまたはプライマーとして使用される項1に記
載の疾患マーカー。
【００１５】項3. 配列番号5乃至8のいずれかに示され
るアミノ酸配列よりなるMLTK蛋白質を認識する抗体であ
る糖・脂質代謝異常疾患の疾患マーカー。
【００１６】項4. 糖・脂質代謝異常疾患の検出におい
てプローブとして使用される項3に記載の疾患マーカ
ー。
【００１７】項5. 下記の工程(a)、(b)および(c)を含む
糖・脂質代謝異常疾患の検出方法： (a) 被験者の生体試料から調製されたRNAまたは該RNAか
ら転写された相補的ポリヌクレオチドと項1または2に記
載の疾患マーカーとを結合させる工程、(b) 該疾患マー
カーに結合した生体試料由来のRNAまたは該RNAから転写
された相補的ポリヌクレオチドを、上記疾患マーカーを
指標として測定する工程、(c) 上記(b)の測定結果に基
づいて、糖・脂質代謝異常疾患の罹患を判断する工程。
【００１８】項6. 工程(c)における糖・脂質代謝異常疾
患の罹患の判断が、被験者について得られる測定結果を
正常者について得られる測定結果と対比して、疾患マー
カーへの結合量が増大していることを指標として行われ
る項5に記載の糖・脂質代謝異常疾患の検出方法。
【００１９】項7. 下記の工程(a)、(b)および(c)を含む
糖・脂質代謝異常疾患の検出方法： (a) 被験者の生体試料から調製された蛋白質と項3また
は4に記載の疾患マーカーとを結合させる工程、(b) 該
疾患マーカーに結合した生体試料由来の蛋白質またはそ
の部分ペプチドを、上記疾患マーカーを指標として測定
する工程、(c) 上記(b)の測定結果に基づいて、糖・脂
質代謝異常疾患の罹患を判断する工程。
【００２０】項8. 工程(c)における糖・脂質代謝異常疾
患の罹患の判断が、被験者について得られる測定結果を
正常者について得られる測定結果と対比して、疾患マー
カーへの結合量が増大していることを指標として行われ
る項7に記載の糖・脂質代謝異常疾患の検出方法。
【００２１】項9. 下記の工程(a)、(b)および(c)を含む
MLTK遺伝子の発現を抑制する物質のスクリーニング方
法： (a) 被験物質とMLTK遺伝子を発現可能な細胞とを接触さ
せる工程、(b) 被験物質を接触させた細胞のMLTK遺伝子
の発現量を測定し、該発現量を被験物質を接触させない
対照細胞の上記遺伝子の発現量と比較する工程、(c) 上
記(b)の比較結果に基づいて、MLTK遺伝子の発現量を減
少させる被験物質を選択する工程。
【００２２】項10. 下記の工程(a)、(b)および(c)を含
むMLTK蛋白質の発現量を低下させる物質のスクリーニン
グ方法： (a)被験物質とMLTK蛋白質を発現可能な細胞または該細
胞から調製した細胞画分とを接触させる工程、(b)被験
物質を接触させた細胞または細胞画分におけるMLTK蛋白
質の発現量を測定し、該発現量を被験物質を接触させな
い対照細胞もしくは細胞画分における上記MLTK蛋白質の
発現量と比較する工程、(c)上記(b)の比較結果に基づい
て、MLTK蛋白質の発現量を低下させる被験物質を選択す
る工程。
【００２３】項11. 下記の工程(a)、(b)および(c)を含
むMLTK蛋白質の機能または活性を抑制する物質のスクリ
ーニング方法： (a)被験物質とMLTK蛋白質を含む水溶液、細胞または該
細胞から調製した細胞画分とを接触させる工程、(b)被
験物質を接触させた水溶液、細胞または細胞画分におけ
るMLTK蛋白質の機能または活性を測定し、該機能または
活性を被験物質を接触させない対照水溶液、対照細胞ま
たは対照細胞画分における上記MLTK蛋白質の機能または
活性と比較する工程、(c)上記(b)の比較結果に基づい
て、MLTK蛋白質の機能または活性を抑制する被験物質を
選択する工程。
【００２４】項12. 下記の工程(a)、(b)および(c)を含
むMLTK蛋白質の機能または活性を抑制する物質のスクリ
ーニング方法： (a)被験物質の存在下および非存在下でMLTK遺伝子を発
現可能な細胞を培養する工程、(b)被験物質の存在下に
おける細胞培養物中のリン酸化MAPキナーゼ量を測定
し、該測定値を被験物質の非存在下における細胞培養液
中のリン酸化MAPキナーゼ量と比較する工程、(c)上記
(b)の比較結果に基づいて、MLTK蛋白質の機能または活
性を抑制する被験物質を選択する工程。
【００２５】項13. MLTK遺伝子を発現可能な細胞が、筋
筒細胞、脂肪細胞または心筋細胞である項12に記載のス
クリーニング方法。
【００２６】項14. 下記の工程(a)、(b)および(c)を含
むMLTK蛋白質の機能または活性を抑制する物質のスクリ
ーニング方法： (a)MLTK遺伝子を発現可能な細胞にMAPキナーゼにより制
御されるレポーター遺伝子を導入し、該細胞を被験物質
の存在下および非存在下で培養する工程、(b)被験物質
の存在下で培養した細胞培養物中のレポーター遺伝子発
現産物の量を測定し、該量を被験物質の非存在下で培養
した細胞培養物中のレポーター遺伝子発現産物の量と比
較する工程、(c)上記(b)の比較結果に基づいて、MLTK蛋
白質の機能または活性を抑制する被験物質を選択する工
程。
【００２７】項15. MLTK遺伝子を発現可能な細胞が、ML
TK遺伝子を導入した発現ベクターを保有する哺乳動物細
胞である項14に記載のスクリーニング方法。
【００２８】項16. 糖・脂質代謝異常疾患の予防、改善
または治療剤の有効成分を探索するための方法である、
項9乃至15のいずれかに記載のスクリーニング方法。
【００２９】項17. MLTK遺伝子の発現を抑制する物質を
有効成分とする糖・脂質代謝異常疾患の予防、改善また
は治療剤。
【００３０】項18. MLTK遺伝子の発現を抑制する物質が
項9に記載のスクリーニング法により得られるものであ
る項17に記載の糖・脂質代謝異常疾患の予防、改善また
は治療剤。
【００３１】項19. MLTK蛋白質の発現量、機能または活
性を抑制する物質を有効成分とする糖・脂質代謝異常疾
患の予防、改善または治療剤。
【００３２】項20. MLTK蛋白質の発現量、機能または活
性を抑制する物質が、項10乃至15のいずれかに記載のス
クリーニング方法により得られるものである、項19に記
載の糖・脂質代謝異常疾患の予防、改善または治療剤。
【００３３】上記のように、本発明によれば、糖・脂質
代謝異常疾患の疾患マーカー、該疾患の検出系、MLTK遺
伝子の発現を抑制する物質およびMLTKの発現量、機能も
しくは活性を抑制する物質のスクリーニング系、および
これらの物質を有効成分とする糖・脂質代謝異常疾患の
予防、改善および治療剤が提供される。
【００３４】前述したように、MLTK遺伝子は、正常状態
の筋肉に比して、糖・脂質代謝異常疾患の筋肉において
特異的にその発現が上昇し、しかもその発現は糖・脂質
代謝異常疾患治療剤の投与による病態の改善に伴って低
下（正常化）することから、これらの遺伝子およびその
発現産物〔蛋白質、(ポリ)(オリゴ)ペプチド〕は、糖・
脂質代謝異常疾患の解明、診断などに有効に利用するこ
とができ、この利用によって医学並びに臨床学上、有用
な情報、手段などを得ることができる。即ち、個体また
は組織における、上記遺伝子の発現またはその発現産物
の検出、または該遺伝子の変異またはその発現不全の検
出は、糖・脂質代謝異常疾患の解明、診断などに有効に
利用することができる。
【００３５】また、これらの遺伝子およびその発現産物
並びにそれらからの派生物(例えば、遺伝子断片、抗体
など)は、MLTK遺伝子の発現を抑制する物質およびMLTK
の発現量、機能もしくは活性を抑制する物質のスクリー
ニングに有用であり、該スクリーニングによって得られ
る物質は、糖・脂質代謝異常疾患の予防、改善および治
療薬として有効である。更に、MLTK遺伝子のアンチセン
ス核酸(アンチセンスヌクレオチド)は、糖・脂質代謝異
常疾患の予防、改善および治療薬として有用である。
【００３６】尚、MLTKは、前記文献に報告されているよ
うに、核内転写因子の活性化を伴う細胞シグナル伝達系
で働いており、細胞生存(細胞の増殖、分化などの生物
活性の発現)に必須の役割を果たし、また、サイトカイ
ン、物理学的ストレスなどの刺激により活性化され、ce
ll cycle arrest、アポトーシスなどの誘導に寄与する
ことが知られている。しかるに、該MLTKが糖・脂質代謝
と関連することについては、今まで何ら判っておらず、
かかる関連を示唆する報文も皆無である。
【００３７】
【発明の実施の形態】以下、本明細書において、アミノ
酸、(ポリ)ペプチド、(ポリ)ヌクレオチドなどの略号に
よる表示は、IUPAC-IUBの規定〔IUPAC-IUB Communicati
on on Biological Nomenclature, Eur. J. Biochem., 1
38: 9 (1984)〕、「塩基配列又はアミノ酸配列を含む明
細書等の作成のためのガイドライン」(日本国特許庁編)
および当該分野における慣用記号に従う。
【００３８】本明細書において「遺伝子」または「DN
A」とは、2本鎖DNAのみならず、それを構成するセンス
鎖およびアンチセンス鎖という各1本鎖DNAを包含する趣
旨で用いられる。またその長さによって特に制限される
ものではない。従って、本明細書において遺伝子(DNA)
とは、特に言及しない限り、ヒトゲノムDNAを含む2本鎖
DNAおよびcDNAを含む1本鎖DNA(正鎖)並びに該正鎖と相
補的な配列を有する1本鎖DNA(相補鎖)、およびこれらの
断片のいずれもが含まれる。
【００３９】また当該「遺伝子」または「DNA」には、
特定の塩基配列で示される「遺伝子」または「DNA」だ
けでなく、これらによりコードされる蛋白質と生物学的
機能が同等であることを限度として、その同族体(ホモ
ログ)、誘導体および変異体をコードする「遺伝子」ま
たは「DNA」が包含される。これら同族体(ホモログ)、
誘導体および変異体をコードする「遺伝子」または「DN
A」とは、具体的には、後述の(1-1)項に記載のストリン
ジェントな条件下で、前記特定塩基配列で示される「遺
伝子」または「DNA」とハイブリダイズするものが挙げ
られる。また、前記同族体(ホモログ)をコードする遺伝
子、例えばヒト遺伝子に対応するマウスやラットなどの
他生物種の遺伝子は、HomoloGene（http://www.ncbi.nl
m.nih.gov/HomoloGene/）により同定することができ
る。具体的には、特定ヒト塩基配列をBLAST (Proc. Nat
l. Acad. Sci. USA., 90: 5873-5877, 1993、http://ww
w.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)にかけて一致する(Scoreが
最も高く、E-valueが0でかつIdentityが100%を示す)配
列のアクセッション番号を取得し、そのアクセッション
番号をHomoloGeneに入力して得られた他生物種遺伝子と
ヒト遺伝子との遺伝子ホモログの相関を示したリストか
ら、選抜することができる。
【００４０】なお、上記遺伝子またはDNAは機能領域の
別を問うものではなく、例えば発現制御領域、コード領
域、エキソンまたはイントロンを含むことができる。
【００４１】本明細書において「ポリヌクレオチド」と
は、RNAおよびDNAのいずれをも包含する趣旨で用いられ
る。なお、上記DNAには、cDNA、ゲノムDNAおよび合成DN
Aのいずれもが含まれる。また上記RNAには、total RN
A、mRNA、rRNAおよび合成のRNAのいずれもが含まれる。
【００４２】本明細書において「蛋白質」または「(ポ
リ)ペプチド」には、特定の塩基配列で示される「蛋白
質」または「(ポリ)ペプチド」だけでなく、これらと生
物学的機能が同等であることを限度として、その断片、
同族体(ホモログ)、誘導体および変異体が包含される。
なお、上記変異体には、天然に存在するアレル変異体、
天然に存在しない変異体および人為的に欠失、置換、付
加および挿入されることによって改変されたアミノ酸配
列を有する変異体が包含される。なお、上記変異体とし
ては、変異のない蛋白質または(ポリ)ペプチドと、少な
くとも70％、好ましくは80％、より好ましくは95％、さ
らにより好ましくは97％相同なものを挙げることができ
る。
【００４３】本明細書でいう「抗体」には、ポリクロー
ナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖抗
体、およびFabフラグメント、Fab発現ライブラリーなど
によって生成されるフラグメントのような抗原結合性を
有する上記抗体の一部が包含される。
【００４４】さらに本明細書において「疾患マーカー」
とは、糖・脂質代謝異常疾患の罹患の有無もしくは罹患
の程度を診断するために、また糖・脂質代謝異常疾患の
予防、改善または治療に有用な候補物質をスクリーニン
グするために、直接または間接的に利用されるものをい
う。これには、糖・脂質代謝異常疾患の罹患に関連して
生体内での発現が変動する遺伝子または蛋白質を特異的
に認識するか、またはこれらと結合することのできる、
(ポリ)(オリゴ)ヌクレオチドまたは抗体が包含される。
これらの(ポリ)(オリゴ)ヌクレオチドおよび抗体は、上
記性質に基づいて、生体内、組織や細胞内などで発現し
た上記遺伝子および蛋白質を検出するためのプローブと
して、また(オリゴ)ヌクレオチドは生体内で発現した上
記遺伝子を増幅するためのプライマーとして有効に利用
することができる。
【００４５】以下、MLTK遺伝子(ポリヌクレオチド)並び
にこれらの発現産物およびそれらの派生物について、具
体的な用途を説明する。
【００４６】(1)糖・脂質代謝異常疾患の疾患マーカー
およびその応用 (1-1) ポリヌクレオチド 配列番号1乃至4に示されるポリヌクレオチドは、それぞ
れヒト由来MLTKα遺伝子、ヒト由来MLTKβ遺伝子、マウ
ス由来MLTKα遺伝子およびマウス由来MLTKβ遺伝子とし
ていずれも公知の遺伝子であり、それら取得方法も、文
献に記載されている(例えば、J. Biol. Chem., Vol.27
6, No.6, pp.4276-4286 (Feb. 9, 2001)など参照)。
【００４７】本発明は、前述するように、糖・脂質代謝
異常疾患に罹患した患者の組織においては、正常な組織
に比して、MLTK遺伝子の発現量が特異的に増大してお
り、また該疾患治療薬の投与によって病態が改善される
とその発現量が低下する(正常化する)という知見を発端
に、MLTK遺伝子の発現の有無や発現の程度を検出するこ
とによって、上記糖・脂質代謝異常疾患の罹患の有無、
罹患の程度、回復の程度などが特異的に検出でき、該疾
患の診断を正確に行うことができるという発想に基づく
ものである。
【００４８】上記ポリヌクレオチドは、従って、被験者
における上記遺伝子の発現の有無またはその程度を検出
することによって、該被験者が糖・脂質代謝異常疾患に
罹患しているか否かまたはその疾患の程度を診断するこ
とのできるツール（疾患マーカー）として有用である。
【００４９】また、上記ポリヌクレオチドは、後述の(3
-1)項に記載するような糖・脂質代謝異常疾患の予防、
改善または治療に有用な候補物質のスクリーニングにお
いて、MLTK遺伝子の発現変動を検出するためのスクリー
ニングツール（疾患マーカー）としても有用である。
【００５０】本発明疾患マーカーは、配列番号1乃至4の
いずれかに記載のMLTK遺伝子の塩基配列中の連続する少
なくとも15塩基を有するポリヌクレオチドおよび／また
は該ポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドであ
ることを特徴とする。
【００５１】ここで相補的なポリヌクレオチド(相補
鎖、逆鎖)とは、配列番号1-4に示される塩基配列からな
るポリヌクレオチドの全長配列または該塩基配列におい
て少なくとも連続した15塩基長の塩基配列を有するその
部分配列(ここでは便宜上、これらを「正鎖」ともいう)
に対して、A : TおよびG : Cといった塩基対関係に基づ
き、塩基的に相補的な関係にあるポリヌクレオチドを意
味する。かかる相補鎖は、対象とする正鎖の塩基配列と
完全に相補配列を形成する場合に限らず、対象とする正
鎖とストリンジェントな条件でハイブリダイスすること
ができる程度の相補関係を有するものであってもよい。
なお、ここでストリンジェントな条件は、Berger and K
immel (1987, Guide to Molecular Cloning Techniques
Methodsin Enzymology, Vol. 152, Academic Press, S
an Diego CA) に示されるように、複合体或いはプロー
ブと結合する核酸の融解温度(Tm)に基づいて決定するこ
とができる。例えば、ハイブリダイズ後の洗浄条件とし
て、通常「1×SSC、0.1%SDS、37℃」程度の条件を挙げ
ることができる。相補鎖はかかる条件で洗浄しても対象
とする正鎖とハイブリダイズ状態を維持するものである
ことが好ましい。特に制限されないが、より厳しいハイ
ブリダイズ条件としては「0.5×SSC、0.1%SDS、42℃」
程度、さらに厳しいハイブリダイズ条件としては「0.1
×SSC、0.1%SDS、65℃」程度の洗浄条件を挙げることが
できる。具体的には、このような相補鎖として、対象の
正鎖の塩基配列と完全に相補的な関係にある塩基配列か
らなる鎖並びに該鎖と少なくとも90％、好ましくは95％
の相同性を有する塩基配列からなる鎖を例示することが
できる。
【００５２】また、正鎖側のポリヌクレオチドには、配
列番号1-4のいずれかに示されるMLTK遺伝子の塩基配列
またはその部分配列を有するものだけでなく、上記相補
鎖の塩基配列に対してさらに相補的な関係にある塩基配
列からなる鎖を含めることができる。
【００５３】上記正鎖のポリヌクレオチドおよび相補鎖
(逆鎖)のポリヌクレオチドは、各々一本鎖の形態で疾患
マーカーとして使用されても、また二本鎖の形態で疾患
マーカーとして使用されてもよい。
【００５４】本発明の糖・脂質代謝異常疾患の疾患マー
カーは、具体的にはMLTK遺伝子の配列番号に関する配列
番号1-4のいずれかに記載される各塩基配列(全長配列)
からなるポリヌクレオチドであってもよいし、その相補
配列からなるポリヌクレオチドであってもよい。また、
配列番号1-4のいずれかで示されるMLTK遺伝子もしくは
該遺伝子に由来するポリヌクレオチドを選択的に(特異
的に)認識するものであれば、上記全長配列もしくはそ
の相補配列の部分配列からなるポリヌクレオチドであっ
てもよい。この場合、部分配列としては、上記全長配列
もしくはその相補配列の塩基配列から任意に選択される
少なくとも15個の連続した塩基長を有するポリヌクレオ
チドを挙げることができる。
【００５５】ここで「選択的に(特異的に)認識する」と
は、例えばノーザンブロット法においては、MLTK遺伝子
またはこれに由来するポリヌクレオチドが特異的に検出
できること、またRT-PCR法においては、MLTK遺伝子また
はこれに由来するポリヌクレオチドが特異的に生成され
ることを意味するが、それらに限定されず、当業者が上
記検出物または生成物がこれらの遺伝子に由来するもの
であると判断できるものであればよい。
【００５６】本発明疾患マーカーは、配列番号1-4に示
されるMLTK遺伝子の塩基配列をもとに、例えばprimer 3
(http://www.genome.wi.mit.edu/cgi-bin/primer/prim
er3.cgi)あるいはベクターNTI(Infomax社製)を利用して
設計することができる。具体的には配列番号1-4のいず
れかに示される塩基配列をprimer 3またはベクターNTI
のソフトウエアにかけて得られる、プライマーまたはプ
ローブの候補配列もしくは少なくとも該配列を一部に含
む配列をプライマーまたはプローブとして使用すること
ができる。
【００５７】本発明疾患マーカーは、上述するように連
続する少なくとも15塩基の長さを有するものであればよ
く、具体的には該疾患マーカーの用途に応じて、その長
さを適宜選択し設定することができる。
【００５８】(1-2)プローブまたはプライマーとしての
ポリヌクレオチド 本発明において糖・脂質代謝異常疾患の検出(診断)は、
被験者の生体組織、特に筋肉組織などにおけるMLTK遺伝
子の発現の有無または発現レベル(発現量)を評価するこ
とによって行われる。
【００５９】この検出において、本発明疾患マーカー
は、上記遺伝子の発現によって生じたRNAまたはそれに
由来するポリヌクレオチドを特異的に認識し増幅するた
めのプライマーとして、または該RNAまたはそれに由来
するポリヌクレオチドを特異的に検出するためのプロー
ブとして利用することができる。
【００６０】糖・脂質代謝異常疾患の検出(遺伝子診断)
においてプライマーとして用いられる本発明疾患マーカ
ーは、通常15bp-100bp、好ましくは15bp-50bp、より好
ましくは15bp-35bpの塩基長を有する。また検出プロー
ブとして用いられる本発明疾患マーカーは、通常15bp-
全配列の塩基数、好ましくは15bp-1kb、より好ましくは
100bp-1kbの塩基長を有する。
【００６１】本発明疾患マーカーは、ノーザンブロット
法、RT-PCR法、in situハイブリダーゼーション法など
の、特定遺伝子を特異的に検出する公知の方法におい
て、常法に従ってプライマーまたはプローブとして利用
することができる。該利用によって糖・脂質代謝異常疾
患におけるMLTK遺伝子の発現の有無または発現レベル
(発現量)を評価することができる。
【００６２】測定対象とする試料は、使用する検出法の
種類に応じて適宜選択することができる。該試料は、例
えば、被験者の筋肉組織の一部をバイオプシなどで採取
し、そこから常法に従って調製したtotal RNAであって
もよいし、該RNAをもとにして調製される各種のポリヌ
クレオチドであってもよい。
【００６３】また、生体組織におけるMLTK遺伝子の遺伝
子発現レベルは、DNAチップを利用して検出あるいは定
量することができる。この場合、本発明疾患マーカーは
当該DNAチップのプローブとして使用することができる
(例えば、Affymetrix社のGeneChip Human Genome U95
A,B,C,D,Eの場合、25bpの長さのポリヌクレオチドプロ
ーブとして用いられる)。かかるDNAチップを、生体組織
から採取したRNAをもとに調製される標識DNAまたはRNA
とハイブリダイズさせ、該ハイブリダイズによって形成
された上記プローブ(本発明疾患マーカー)と標識DNAま
たはRNAとの複合体を、該標識DNAまたはRNAの標識を指
標として検出することにより、生体組織中でのMLTK遺伝
子の発現の有無または発現レベル(発現量)が評価でき
る。
【００６４】上記DNAチップは、配列番号1-4のいずれか
で示される塩基配列を有する遺伝子と結合し得る1種ま
たは2種以上の本発明疾患マーカーを含んでいればよ
い。複数の疾患マーカーを含むDNAチップの利用によれ
ば、ひとつの生体試料について、同時に複数の遺伝子の
発現の有無または発現レベルの評価が可能である。
【００６５】本発明疾患マーカーは、糖・脂質代謝異常
疾患の診断、検出(罹患の有無、罹患の程度の診断)に有
用である。具体的には、該疾患マーカーを利用した糖・
脂質代謝異常疾患の診断は、被験者の筋肉組織と正常者
の筋肉組織におけるMLTK遺伝子の発現レベルの違いを判
定することによって行うことができる。
【００６６】この場合、遺伝子発現レベルの違いには、
発現のある／なしの違いだけでなく、被験者の筋肉組織
と正常者の筋肉組織の両者ともに発現がある場合でも、
両者間の発現量の格差が2倍以上、好ましくは3倍以上の
場合が含まれる。より具体的には、MLTK遺伝子は、糖・
脂質代謝異常疾患患者において特異的な発現上昇を示す
ので、被験者の筋肉組織において発現されており、該発
現量が正常な筋肉組織における発現量と比べて好ましく
は2倍以上、より好ましくは3倍以上多ければ、該被験者
について糖・脂質代謝異常疾患の罹患が疑われる。
【００６７】(1-3) 抗体 本発明は、糖・脂質代謝異常疾患の疾患マーカーとして
のMLTK遺伝子の発現産物(蛋白質)(本明細書においては
「MLTK」または「MLTK蛋白質」ともいう)を特異的に認
識することができる抗体を提供する。
【００６８】MLTKとしては、配列番号1-4に示されるポ
リヌクレオチドによってコードされる蛋白質を挙げるこ
とができる。配列番号1-4に示される各ポリヌクレオチ
ドによってコードされる蛋白質の具体的態様としては、
それぞれ配列番号5-8で示されるアミノ酸配列を有する
蛋白質を挙げることができる。
【００６９】ここで配列番号5に示す蛋白質は、ヒト由
来のMLTKα遺伝子によってコードされる蛋白質である。
配列番号6に示す蛋白質は、ヒト由来のMLTKβ遺伝子に
よってコードされる蛋白質である。配列番号7に示す蛋
白質は、マウス由来のMLTKα遺伝子によってコードされ
る蛋白質である。また配列番号8に示す蛋白質は、マウ
ス由来のMLTKβ遺伝子によってコードされる蛋白質であ
る。それらの蛋白質およびそれらの蛋白質の取得方法
は、J. Biol. Chem., Vol.276, No.6, pp.4276-4286 (F
eb. 9, 2001)に記載されるように公知である。
【００７０】本発明の抗体は、その形態に特に制限はな
く、MLTKを免疫抗原とするポリクローナル抗体であって
も、モノクローナル抗体であってもよい。さらに当該ML
TKのアミノ酸配列中の少なくとも連続する8アミノ酸か
らなるポリペプチドに対して抗原結合性を有する抗体
も、本発明抗体に含まれる。
【００７１】これらの抗体の製造方法は、すでに周知で
ある。本発明抗体はこれらの常法に従って製造すること
ができる(Current protocols in Molecular Biology ed
it.Ausubel et al. (1987) Publish. John Wiley and S
ons. Section 11.12-11.13)。具体的には、ポリクロー
ナル抗体は、常法に従って大腸菌などで発現し精製した
MLTKを用いて、あるいは常法に従って当該MLTKの部分ア
ミノ酸配列を有するオリゴペプチドを合成して、家兎な
どの非ヒト動物に免疫し、該免疫動物の血清から常法に
従って得ることが可能である。一方、モノクローナル抗
体は、常法に従って大腸菌などで発現し精製したMLTKま
たは該蛋白質の部分アミノ酸配列を有するオリゴペプチ
ドをマウスなどの非ヒト動物に免疫し、得られた脾臓細
胞と骨髄腫細胞とを細胞融合させて調製したハイブリド
ーマ細胞から得ることができる(Current protocols in
Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publ
ish. John Wiley and Sons. Section 11.4-11.11)。
【００７２】抗体の作製に免疫抗原として使用されるML
TK蛋白質は、本発明により提供される遺伝子の配列情報
(配列番号1-4)に基づいて、DNAクローニング、各プラス
ミドの構築、宿主へのトランスフェクション、形質転換
体の培養および培養物からの蛋白質の回収の操作により
得ることができる。これらの操作は、当業者に既知の方
法、文献記載の方法(Molecular Cloning, T.Maniatis e
t al., CSH Laboratory (1983), DNA Cloning, DM. Glo
ver, IRL PRESS (1985))などに準じて行うことができ
る。
【００７３】具体的には、MLTKをコードする遺伝子が所
望の宿主細胞中で発現できる組み換えDNA(発現ベクタ
ー)を作製し、これを宿主細胞に導入して形質転換し、
該形質転換体を培養して、得られる培養物から、目的蛋
白質を回収することによって、本発明抗体の製造のため
の免疫抗原としての蛋白質を得ることができる。また、
MLTK蛋白質は、本発明により提供されるアミノ酸配列情
報(配列番号5-8)に従って、一般的な化学合成法(ペプチ
ド合成)によって製造することもできる。
【００７４】本発明MLTK蛋白質には、配列番号5-8に示
す各アミノ酸配列を有する蛋白質のみならず、その相同
物も包含される。該相同物としては、上記各アミノ酸配
列において、1もしくは複数(通常数個)のアミノ酸が欠
失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、且つ
もとの各アミノ酸配列の蛋白質と同等の生物学的機能を
有する蛋白質および／または同等の免疫学的活性を有す
る蛋白質を挙げることができる。
【００７５】ここで、同等の生物学的機能を有する蛋白
質としては、MLTKと生化学的または薬理学的機能におい
て同等の蛋白質を挙げることができる。また、同等の免
疫学的活性を有する蛋白質としては、適当な動物あるい
はその細胞において特定の免疫反応を誘発し、かつMLTK
に対する抗体と特異的に結合する能力を有する蛋白質を
挙げることができる。
【００７６】なお、蛋白質におけるアミノ酸の変異数お
よび変異部位は、その生物学的機能および／または免疫
学的活性が保持される限り制限はない。生物学的機能ま
たは免疫学的活性を消失することなくアミノ酸残基が、
どのように、何個置換、挿入あるいは欠失されればよい
かを決定する指標は、当業者に周知のコンピュータプロ
グラム、例えばDNA Star softwareを用いて見出すこと
ができる。例えば変異数は、典型的には、全アミノ酸の
10％以内であり、好ましくは全アミノ酸の5％以内であ
り、さらに好ましくは全アミノ酸の1％以内である。ま
た置換されるアミノ酸は、置換後に得られる蛋白質がML
TKの生物学的機能および／または免疫学的活性を保持し
ている限り、特に制限されない。この置換されるアミノ
酸は、蛋白質の構造保持の観点から、アミノ酸の極性、
電荷、可溶性、疎水性、親水性、両親媒性などにおいて
置換前のアミノ酸と似た性質を有するアミノ酸であるこ
とが好ましい。例えば、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Me
t、PheおよびTrpは互いに非極性アミノ酸に分類される
アミノ酸であり、Gly、Ser、Thr、Cys、Tyr、Asnおよび
Glnは互いに非荷電性アミノ酸に分類されるアミノ酸で
あり、AspおよびGluは互いに酸性アミノ酸に分類される
アミノ酸であり、またLys、ArgおよびHisは互いに塩基
性アミノ酸に分類されるアミノ酸である。ゆえに、これ
らを指標として同群に属するアミノ酸を適宜選択するこ
とができる。
【００７７】本発明抗体は、また、MLTKの部分アミノ酸
配列を有するオリゴペプチドを用いて調製されるもので
あってもよい。かかる抗体の製造のために用いられるオ
リゴペプチドは、機能的な生物活性を有することは要し
ないが、MLTKと同様の免疫原特性を有するものであるこ
とが望ましい。好ましくはこの免疫原特性を有し且つML
TKのアミノ酸配列において少なくとも連続する8アミノ
酸、好ましくは15アミノ酸、より好ましくは20アミノ酸
からなるオリゴペプチドを例示することができる。
【００７８】かかるオリゴペプチドに対する抗体の製造
は、宿主に応じて種々のアジュバントを用いて免疫学的
反応を高めることによって行うこともできる。限定はさ
れないが、そのようなアジュバントには、フロイントア
ジュバント、水酸化アルミニウムのようなミネラルゲ
ル、並びにリゾレシチン、プルロニックポリオル、ポリ
アニオン、ペプチド、油乳剤、キーホールリンペットヘ
モシアニンおよびジニトロフェノールのような表面活性
物質、BCG(カルメット−ゲラン桿菌)やコリネバクテリ
ウム-パルヴムなどのヒトアジュバントが含まれる。
【００７９】本発明抗体は、MLTKに特異的に結合する性
質を有することから、該抗体を利用することによって、
被験者の組織内に発現した上記蛋白質(MLTK)を特異的に
検出することができる。すなわち、当該抗体は被験者の
組織内におけるMLTKの発現の有無およびその発現の程度
を検出するためのプローブとして有用である。
【００８０】具体的には、患者の筋肉組織などの一部を
バイオプシなどで採取し、そこから常法に従って蛋白質
を調製して、例えばウェスタンブロット法、ELISA法な
ど公知の検出方法において、本発明抗体を常法に従って
プローブとして使用することによって、上記筋肉組織な
どに存在するMLTKを検出することができる。
【００８１】糖・脂質代謝異常疾患の診断に際しては、
被験者の筋肉組織などに存在するMLTK量を、正常者の筋
肉組織などに存在するMLTK量と対比して、その違いを判
定すればよい。この場合、蛋白質の量の違いには、蛋白
質のある／なしと共に、蛋白質の量の違いが2倍以上、
好ましくは3倍以上の場合が含まれる。具体的には、MLT
K遺伝子は、糖・脂質代謝異常疾患において有意な発現
誘導を示すので、被験者の筋肉組織に該遺伝子の発現産
物(MLTK)が存在しており、該存在量が正常な筋肉組織に
おける同発現産物量と比べて2倍以上、好ましくは3倍以
上多いことが判定されれば、糖・脂質代謝異常疾患の罹
患が疑われる。
【００８２】(2)糖・脂質代謝異常疾患の検出方法(診断
方法) 本発明は、前述した本発明疾患マーカーを利用した糖・
脂質代謝異常疾患の検出方法(診断方法)を提供する。
【００８３】具体的には、本発明の検出方法は、被験者
の筋肉組織などの一部をバイオプシなどで採取し、そこ
に含まれる糖・脂質代謝異常疾患に関連するMLTK遺伝子
の発現レベル(発現量)、または該遺伝子に由来するMLTK
蛋白質を検出、測定することにより、糖・脂質代謝異常
疾患の罹患の有無またはその程度を検出(診断)するもの
である。また、本発明の検出(診断)方法は、例えば糖・
脂質代謝異常疾患患者において、該疾患の改善のために
治療薬などを投与した場合における、該疾患の改善の有
無またはその程度を診断することもできる。
【００８４】本発明の検出方法は、次の(a)、(b)および
(c)の工程を含む： (a) 被験者の生体試料と本発明疾患マーカーを接触させ
る工程、(b) 生体試料中のMLTK遺伝子の遺伝子発現レベ
ルまたはMLTK蛋白質の量を、上記疾患マーカーを指標と
して測定する工程、(c) 上記(b)の結果をもとに、糖・
脂質代謝異常疾患の罹患を判断する工程。
【００８５】ここで用いられる生体試料は、被験者の筋
肉組織などのMLTK遺伝子を発現可能な細胞を含む組織、
これの組織から調製されるRNAもしくはそれらからさら
に調製されるポリヌクレオチドまたは上記組織から調製
される蛋白質である。これらのRNA、ポリヌクレオチド
および蛋白質は、例えば被験者の筋肉組織の一部をバイ
オプシなどで採取後、常法に従って調製することができ
る。
【００８６】本発明の診断方法は、測定対象として用い
る生体試料の種類に応じて、具体的には下記のようにし
て実施される。
【００８７】(2-1) 測定対象の生体試料としてRNAを利
用する場合 生体試料としてRNAを利用する場合、本発明検出方法(診
断方法)は、該RNA中のMLTK遺伝子の発現レベルを検出
し、測定することによって実施される。具体的には、前
述のポリヌクレオチドからなる本発明疾患マーカー(MLT
K遺伝子の塩基配列中の連続する少なくとも15塩基を有
するポリヌクレオチドおよび／または該ポリヌクレオチ
ドに相補的なポリヌクレオチド)をプライマーまたはプ
ローブとして用いて、ノーザンブロット法、RT-PCR法、
DNAチップ解析法、in situハイブリダイゼーション解析
法などの公知の方法を行うことにより実施できる。
【００８８】ノーザンブロット法を利用する場合、本発
明疾患マーカーをプローブとして用いることによって、
RNA中のMLTK遺伝子の発現の有無および発現レベルを検
出、測定することができる。具体的には、まず本発明疾
患マーカー(相補鎖)を放射性同位元素(32P、33Pなど：R
I)、蛍光物質などで標識する。次いで、得られる標識疾
患マーカーを常法に従ってナイロンメンブレンなどにト
ランスファーした被験者の生体組織由来のRNAとハイブ
リダイズさせる。その後、形成された標識疾患マーカー
(DNA)とRNAとの二重鎖を、該標識疾患マーカーの標識物
(RI、蛍光物質など)に由来するシグナルを放射線検出器
(BAS-1800II、富士フィルム社製)、蛍光検出器などで検
出、測定する方法を例示することができる。
【００８９】また、AlkPhos Direct Labelling and Det
ection System (Amersham Pharamcia Biotech社製)を用
いて、該プロトコールに従って疾患マーカー(プローブD
NA)を標識し、被験者の生体組織由来のRNAとハイブリダ
イズさせた後、疾患マーカーの標識物に由来するシグナ
ルをマルチバイオイメージャーSTORM860 (AmershamPhar
macia Biotech社製)で検出、測定する方法を採用するこ
ともできる。
【００９０】RT-PCR法を利用する場合、本発明疾患マー
カーをプライマーとして用いて、RNA中のMLTK遺伝子の
発現の有無および発現レベルを検出、測定することがで
きる。具体的には、まず被験者の生体組織由来のRNAか
ら常法に従ってcDNAを調製し、これを鋳型として標的の
MLTK遺伝子の領域が増幅できるように、本発明疾患マー
カーから調製した一対のプライマー(上記cDNA(−鎖)に
結合する正鎖、＋鎖に結合する逆鎖)をこれとハイブリ
ダイズさせる。その後、常法に従ってPCR法を行い、得
られた増幅二本鎖DNAを検出する。
【００９１】増幅された二本鎖DNAの検出には、予めR
I、蛍光物質などで標識しておいたプライマーを用いて
上記PCRを行うことによって産生される標識二本鎖DNAを
検出する方法、産生された二本鎖DNAを常法に従ってナ
イロンメンブレンなどにトランスファーさせて、標識し
た疾患マーカーをプローブとして使用してこれとハイブ
リダイズさせて検出する方法などを用いることができ
る。生成された標識二本鎖DNA産物はアジレント2100バ
イオアナライザ(横河アナリティカルシステムズ社製)な
どで測定することができる。また、SYBR Green RT-PCR
Reagents (Applied Biosystems社製)で該プロトコール
に従ってRT-PCR反応液を調製し、ABI PRIME 7700 Seque
nce Detection System (Applied Biosystems 社製)で反
応させて、該反応物を検出することもできる。
【００９２】DNAチップ解析を利用する場合、本発明疾
患マーカーをDNAプローブ(1本鎖または2本鎖)として貼
り付けたDNAチップを用意し、これに被験者の生体組織
由来のRNAから常法によって調製されたcRNAをハイブリ
ダイズさせ、形成されたDNAとcRNAとの二本鎖を、本発
明疾患マーカーから調製される標識プローブと結合させ
てMLTK遺伝子の発現の有無および発現レベルを検出、測
定することができる。また、上記DNAチップとして、MLT
K遺伝子の遺伝子発現レベルを検出、測定可能なDNAチッ
プを用いることもできる。該DNAチップとしては、例え
ばAffymetrix社のGene Chip Human Genome U95 A, B,
C, D, Eを挙げることができる。かかるDNAチップを用い
た、被験者RNA中のMLTK遺伝子の遺伝子発現レベルの検
出、測定については、実施例に詳述する。
【００９３】(2-2) 測定対象の生体試料として蛋白質を
用いる場合 測定対象として蛋白質を用いる場合、本発明検出(診断)
方法は、生体試料中のMLTKを検出し、その量(レベル)を
測定することによって実施される。具体的には、本発明
疾患マーカーとして抗体(配列番号5-8で示される各アミ
ノ酸配列からなる蛋白質を認識する抗体)を用いて、ウ
エスタンブロット法などの公知方法で、MLTKを検出、定
量する。
【００９４】ウエスタンブロット法は、一次抗体として
本発明疾患マーカーを用いた後、二次抗体として125Iな
どの放射性同位元素、蛍光物質などで標識した標識抗体
(一次抗体に結合する標識抗体)を用い、得られる標識結
合物の放射性同位元素、蛍光物質などに由来するシグナ
ルを放射線測定器(BAS-1800II：富士フィルム社製な
ど)、蛍光検出器などで検出し、測定することによって
実施できる。また、一次抗体として本発明疾患マーカー
を用いた後、ECL Plus Western Blotting Detction Sys
tem (Amersham Pharmacia Biotech 社製)を用いて、該
プロトコールに従って検出し、マルチバイオイメージャ
ーSTORM860 (Amersham Pharmacia Biotech 社製)で測定
することもできる。
【００９５】尚、上記において測定対象とするMLTK蛋白
質の機能または活性は、既に知られており、該蛋白質の
量と機能乃至活性とは一定の相関関係を有している。従
って、上記蛋白質の量の測定に代えて、該蛋白質の機能
または活性の測定を行うことによっても、本発明の糖・
脂質代謝異常疾患の検出(診断)を実施することができ
る。すなわち、本発明は、MLTK蛋白質の機能または活性
を指標として、これを公知の方法に従って測定、評価す
ることからなる、糖・脂質代謝異常疾患の検出(診断)方
法をも包含する。
【００９６】(2-3)糖・脂質代謝異常疾患の診断 糖・脂質代謝異常疾患の診断は、被験者の筋肉組織など
におけるMLTK遺伝子の遺伝子発現レベルまたはMLTK遺伝
子の発現産物である蛋白質(MLTK)の量、機能もしくは活
性(以下これらを合わせて「蛋白質レベル」ということ
がある)を、正常な筋肉組織などにおける当該遺伝子発
現レベルまたは当該蛋白質レベルと比較し、両者の違い
を判定することによって行うことができる。
【００９７】この場合、正常な筋肉組織などから採取、
調製した生体試料(RNAまたは蛋白質)が必要であるが、
これは糖・脂質代謝異常疾患に罹患していない人の筋肉
組織などをバイオプシなどで採取することによって取得
することができる。なお、ここで「糖・脂質代謝異常疾
患に罹患していない人」とは、少なくとも糖・脂質代謝
異常疾患の自覚症状がなく、好ましくは他の検査方法、
例えば経口糖負荷試験法などによる検査の結果、糖・脂
質代謝異常疾患でないと診断された人をいう。当該「糖
・脂質代謝異常疾患に罹患していない人」を、本明細書
では単に正常者という場合もある。
【００９８】被験者の組織と正常組織(糖・脂質代謝異
常疾患に罹患していない人の組織)との遺伝子発現レベ
ルまたは蛋白質レベルの比較は、被験者の生体試料と正
常者の生体試料を対象とした測定を並行して行うことで
実施できる。また、並行して行わなくても、複数(少な
くとも2、好ましくは3以上、より好ましくは5以上)の正
常組織を用いて均一な測定条件で測定して得られたMLTK
遺伝子の遺伝子発現レベルもしくは該遺伝子の発現産物
であるMLTK蛋白質レベルの平均値または統計的中間値を
予め求めておき、これを正常者の遺伝子発現レベルもし
くは蛋白質レベル(正常値)として、被験者における測定
値の比較に用いることができる。
【００９９】被験者が、糖・脂質代謝異常疾患であるか
どうかの判断は、該被験者の組織におけるMLTK遺伝子の
遺伝子発現レベルまたはその発現産物であるMLTK蛋白質
レベルが、正常者のそれらと比較して2倍以上、好まし
くは3倍以上多いことを指標として行うことができる。
被験者の遺伝子発現レベルまたは蛋白質レベルが正常者
のそれらのレベルに比べて多ければ、該被験者は糖・脂
質代謝異常疾患であると判断できるか、該疾患の罹患が
疑われる。
【０１００】(3)候補薬のスクリーニング方法 (3-1)遺伝子発現レベルを指標とするスクリーニング方
法 本発明は、配列番号1-4に記載の塩基配列で代表されるM
LTK遺伝子の発現を抑制する物質をスクリーニングする
方法を提供する。
【０１０１】本発明のスクリーニング方法は、次の工程
(a)、(b)および(c)を含む： (a) 被験物質とMLTK遺伝子を発現可能な細胞とを接触さ
せる工程、(b) 被験物質を接触させた細胞のMLTK遺伝子
の発現量を測定し、該発現量を被験物質を接触させない
対照細胞の上記遺伝子の発現量と比較する工程、(c) 上
記(b)の比較結果に基づいて、MLTK遺伝子の発現量を減
少させる被験物質を選択する工程。
【０１０２】かかるスクリーニングに用いられる細胞と
しては、内在性および外来性を問わず、MLTK遺伝子を発
現可能な細胞を挙げることができる。具体的にはMLTK遺
伝子は正常組織では筋肉、心臓および脂肪で特異的に発
現しているので、これらの組織に由来する細胞が挙げら
れ、特に筋肉由来の細胞が挙げられる。その例として
は、L6筋筒細胞などを挙げることができる。また、脂肪
由来の細胞である3T3-L1脂肪細胞株も挙げることができ
る。さらに、高脂肪食を負荷して作製した高脂肪食負荷
マウスもしくは肥満糖尿病モデルマウスであるC57BL/Ks
j-db/db Jclマウス(日本クレア)、KKAy/Ta Jclマウス
(日本クレア)から単離・調製した初代筋肉培養細胞など
も挙げることができる。なお、本発明スクリーニング法
に用いられる細胞には、細胞の集合体である組織、例え
ば筋肉組織、心臓組織、脂肪組織なども含まれる。
【０１０３】本発明スクリーニング方法によってスクリ
ーニングされる被験物質(候補物質)は、制限されない
が、核酸(MLTK遺伝子のアンチセンスヌクレオチドを含
む)、ペプチド、蛋白質、有機化合物、無機化合物など
であり、本発明スクリーニングは、具体的にはこれらの
被験物質またはこれらを含む試料(被験試料)を上記細胞
および／または組織と接触させることにより行われる。
被験試料としては、被験物質を含む、細胞抽出液、遺伝
子ライブラリーの発現産物、合成低分子化合物、合成ペ
プチド、天然化合物などが挙げられるが、これらに制限
されない。
【０１０４】本発明スクリーニングに際して、被験物質
と細胞とを接触させる条件は、特に制限されないが、該
細胞が死滅せず且つMLTK遺伝子を発現できる培養条件
(温度、pH、培地組成など)を選択するのが好ましい。
【０１０５】実施例に示すように、糖・脂質代謝異常疾
患に罹患した患者の筋肉組織では、正常な筋肉組織に比
して、MLTK遺伝子の発現レベルの有意な上昇が認められ
る。また、高脂肪食負荷モデル動物および肥満糖尿病モ
デル動物の筋肉組織においても、同様のMLTK遺伝子の発
現上昇が認められ、しかも糖尿病治療薬の投与によって
病態が改善されると、このMLTK遺伝子の発現量の低下
（正常化）が認められる。本発明スクリーニング方法に
は、このMLTK遺伝子の発現レベルを指標として、その発
現を抑制する物質(発現レベルを正常レベルに戻す物質)
を探索する方法が包含される。このスクリーニング方法
によって、糖・脂質代謝異常疾患の予防、改善乃至治療
薬の有効成分となる候補物質を提供することができる。
【０１０６】候補物質は、具体的には、被験物質(候補
物質)の存在下で培養した細胞におけるMLTK遺伝子の発
現レベルが、被験物質(候補物質)の非存在下で培養した
対照細胞におけるMLTK遺伝子の発現レベルに比して低く
なる場合に、選択することができる。
【０１０７】なお、本発明スクリーニング法に従うMLTK
遺伝子の発現レベルの検出および定量は、前記細胞から
調製したRNAまたは該RNAから転写された相補的ポリヌク
レオチドと、本発明疾患マーカーとを用いて、前記(2-
1)項に記述したように、ノーザンブロット法、RT-PCR法
など公知の方法、DNAチップなどを利用する方法などに
従って実施できる。指標とする遺伝子発現レベルの低下
(抑制、減少)の程度は、被験物質(候補物質)を存在させ
た細胞におけるMLTK遺伝子の発現が、被験物質(候補物
質)を存在させない対照細胞におけるMLTK遺伝子発現量
と比較して、10%、好ましくは30%、特に好ましくは50%
以上の低下(抑制、減少)を例示することができる。
【０１０８】MLTK遺伝子の発現レベルの検出および定量
は、MLTK遺伝子の発現を制御する遺伝子領域(発現制御
領域)に、例えばルシフェラーゼ遺伝子などのマーカー
遺伝子をつないだ融合遺伝子を導入した細胞株を用い
て、マーカー遺伝子由来の蛋白質の活性を測定すること
によっても実施できる。本発明のMLTK遺伝子の発現抑制
物質のスクリーニング方法には、かかるマーカー遺伝子
の発現量を指標として標的物質を探索する方法も包含さ
れる。この意味において、請求項9に記載する「MLTK遺
伝子」の概念には、MLTK遺伝子の発現制御領域とマーカ
ー遺伝子との融合遺伝子が含まれる。
【０１０９】上記マーカー遺伝子としては、発光反応や
呈色反応を触媒する酵素の構造遺伝子が好ましい。具体
的には、上記ルシフェラーゼ遺伝子、分泌型アルカリフ
ォスファターゼ遺伝子、クロラムフェニコール・アセチ
ルトランスフェラーゼ遺伝子、βグルクロニダーゼ遺伝
子、βガラクトシダーゼ遺伝子、エクオリン遺伝子など
のレポーター遺伝子を例示できる。ここでMLTK遺伝子の
発現制御領域としては、例えば該遺伝子の転写開始部位
上流約1kb、好ましくは約2kbを用いることができる。融
合遺伝子の作成およびマーカー遺伝子由来の活性測定
は、公知の方法で行うことができる。
【０１１０】本発明スクリーニング方法により選択され
る物質は、MLTK遺伝子の遺伝子発現抑制剤として位置づ
けることができる。これらの物質は、MLTK遺伝子の発現
を抑制することによって、糖・脂質代謝異常疾患を緩
和、抑制(改善、治療)する薬物の有力な候補物質とな
る。
【０１１１】(3-2) 蛋白質の発現量を指標とするスクリ
ーニング方法 本発明は、配列番号：5-8に記載のアミノ酸配列で代表
されるMLTK(MLTK蛋白質)の発現量を抑制する物質をスク
リーニングする方法を提供する。
【０１１２】本発明スクリーニング方法は、次の工程
(a)、(b)および(c)を含む： (a) 被験物質とMLTKを発現可能な細胞または該細胞から
調製した細胞画分とを接触させる工程、(b) 被験物質を
接触させた細胞または細胞画分におけるMLTKの発現量を
測定し、該発現量を被験物質を接触させない対照細胞ま
たは細胞画分におけるMLTKの発現量と比較する工程、
(c) 上記(b)の比較結果に基づいて、MLTKの発現量を抑
制する被験物質を選択する工程。
【０１１３】本発明スクリーニングに用いられる細胞
は、内在性および外来性を問わず、MLTK遺伝子を発現
し、発現産物としてのMLTKを有する細胞を挙げることが
できる。該細胞としては、具体的には、分化させた筋肉
細胞、脂肪細胞、心筋細胞などを用いることができる。
細胞画分とは、上記細胞に由来する各種の画分を意味
し、これには、例えば、細胞膜画分、細胞質画分、細胞
核画分などが含まれる。
【０１１４】実施例に示すように、糖・脂質代謝異常疾
患の一種である糖尿病に罹患した患者の筋肉組織では、
正常な筋肉組織に比して、MLTK遺伝子の発現上昇が観察
され、該遺伝子の発現産物であるMLTKの増加がみられ
る。同様のことは、高脂肪食負荷モデル動物および肥満
糖尿病モデル動物の筋肉組織においても観察される。し
かもこれらのモデル動物では、糖尿病治療薬の投与によ
って病態が改善されると、上記MLTK遺伝子の発現産物で
あるMLTK蛋白質量が低下（正常化）する。この知見か
ら、MLTK遺伝子がコードする蛋白質の発現量は、糖・脂
質代謝異常疾患に関連すると考えられる。本発明スクリ
ーニング方法は、MLTK遺伝子の発現産物である蛋白質の
発現量が、糖・脂質代謝異常疾患と関連することを利用
して、該蛋白質の量を指標として、該蛋白質の量を低下
させる物質（正常レベルに戻す物質）を探索する方法を
包含する。
【０１１５】本発明スクリーニング方法によれば、MLTK
を抑制する物質を探索することによって、糖・脂質代謝
異常疾患の予防薬、改善薬または治療薬の有効成分とな
る候補物質、即ち、該疾患の緩和／抑制作用を有する
(糖・脂質代謝異常疾患に対して改善／治療効果を発揮
する)物質が提供される。
【０１１６】上記MLTKの量は、前述したように、例え
ば、本発明疾患マーカーとして抗体(配列番号5-8で示さ
れる各アミノ酸配列からなる蛋白質を認識する抗体)を
用いたウエスタンブロット法などの公知方法に従って定
量できる。ウエスタンブロット法は、一次抗体として本
発明疾患マーカーを用いた後、二次抗体として125Iなど
の放射性同位元素、蛍光物質などで標識した一次抗体に
結合する抗体を用いて標識し、これら標識物質由来のシ
グナルを放射線測定器(BAS-1800II：富士フィルム社製
など)、蛍光検出器などで測定することによって実施で
きる。また、一次抗体として本発明疾患マーカーを用い
た後、ECL Plus Western Blotting Detction System (A
mersham Pharmacia Biotech 社製)を利用して、該プロ
トコールに従って検出し、マルチバイオイメージャーST
ORM860(Amersham Pharmacia Biotech 社製)で測定する
こともできる。
【０１１７】本発明スクリーニング方法によってスクリ
ーニングされる被験物質(候補物質)は、制限されない
が、核酸、ペプチド、蛋白質、有機化合物、無機化合物
などであり、本発明スクリーニングは、具体的にはこれ
らの被験物質またはこれらを含む試料(被験試料)を上記
細胞または細胞画分と接触させることにより行われる。
被験試料としては、被験物質を含む、細胞抽出液、遺伝
子ライブラリーの発現産物、合成低分子化合物、合成ペ
プチド、天然化合物などが挙げられるが、これらに制限
されない。
【０１１８】(3-3) 蛋白質の機能(活性)を指標とするス
クリーニング方法 本発明は、またMLTKの機能(活性)を抑制する物質をスク
リーニングする方法を提供する。
【０１１９】本発明スクリーニング方法は、次の工程
(a)、(b)および(c)を含む： (a) 被験物質とMLTKを含む水溶液、細胞または該細胞か
ら調製した細胞画分とを接触させる工程、(b) 被験物質
を接触させた水溶液、細胞または細胞画分におけるMLTK
の機能(活性)を測定し、該機能(活性)を被験物質を接触
させない対照水溶液、対照細胞または細胞画分における
MLTKの機能(活性)と比較する工程、(c) 上記(b)の比較
結果に基づいて、MLTKの機能(活性)を抑制する被験物質
を選択する工程。
【０１２０】本発明スクリーニングに用いられるMLTKを
含む水溶液は、MLTKを含むものであればよく特に制限さ
れない。その具体例としては、例えばMLTKの水溶液の
他、MLTKを含む細胞溶解液、核抽出液あるいは細胞の培
養上清などを例示することができる。本発明スクリーニ
ングに用いられる細胞は、内在性および外来性を問わ
ず、MLTK遺伝子を発現し、発現産物としてのMLTKを有す
る細胞を挙げることができる。該細胞としては、具体的
には、前記(3-2)項に示されるような分化させた筋肉細
胞、脂肪細胞、心筋細胞などを用いることができる。該
細胞には、MLTK遺伝子(発現ベクター)で形質転換された
形質転換細胞も包含される。該形質転換に用いられる宿
主細胞としては、例えばL6、COS、CHO、L、Sf9などの周
知の細胞を挙げることができる。また細胞画分とは、上
記細胞に由来する各種の画分を意味し、これには、例え
ば細胞膜画分、細胞質画分、細胞核画分などが含まれ
る。
【０１２１】上記(3-2)項に記載したように、糖・脂質
代謝異常疾患の一種である糖尿病に罹患した患者の筋肉
組織では、正常な筋肉組織に比して、MLTK遺伝子の発現
上昇が観察され、該遺伝子の発現産物であるMLTK量の増
加とともに、該蛋白質の機能(活性)の亢進、活性化がみ
られる。同様に、高脂肪食負荷モデル動物および肥満糖
尿病モデル動物の筋肉組織においても、MLTK遺伝子の発
現産物であるMLTKの増加および該蛋白質の機能の亢進、
活性化が認められる。しかもこれらのモデル動物では、
糖尿病治療薬の投与によって病態が改善されると、MLTK
の機能は正常化する。この知見から、MLTK遺伝子がコー
ドする蛋白質の機能(活性)は、糖・脂質代謝異常疾患に
関連すると考えられる。本発明スクリーニング方法は、
MLTK遺伝子がコードする蛋白質の機能(活性)を指標とし
て、該蛋白質の機能(活性)を抑制する物質(正常レベル
に戻す物質)を探索する方法を包含する。本発明スクリ
ーニング方法によれば、MLTKの機能または活性を抑制す
る物質を探索でき、かくして、糖・脂質代謝異常疾患の
予防薬、改善薬または治療薬の有効成分となる候補物質
が提供される。
【０１２２】本発明スクリーニング方法によってスクリ
ーニングされる被験物質(候補物質)は、制限されない
が、核酸、ペプチド、蛋白質(MLTKに対する抗体を含
む)、有機化合物、無機化合物などであり、本発明スク
リーニングは、具体的にはこれらの被験物質またはこれ
らを含む試料(被験試料)を上記水溶液、細胞または細胞
画分と接触させることにより行われる。被験試料として
は、被験物質を含む、細胞抽出液、遺伝子ライブラリー
の発現産物、合成低分子化合物、合成ペプチド、天然化
合物などが挙げられるが、これらに制限されない。
【０１２３】ところで、MLTKは様々なシグナル伝達系に
関与するMAPキナーゼ(p38など)をリン酸化することによ
って活性化する作用を有している(J. Biol. Chem., Vo
l.276, No.6, pp.4276-4286 (Feb. 9, 2001)など参
照)。
【０１２４】従って、この公知の性質に基づいて、MLTK
の機能を抑制する候補物質のスクリーニングは、リン酸
化されたMAPキナーゼ量の減少(低下)を指標にして行う
こともできる。この場合、候補物質は、具体的には、被
験物質(候補物質)の存在下で培養した細胞培養液中のリ
ン酸化MAPキナーゼ量が、被験物質(候補物質)の非存在
下で培養した細胞培養液中のリン酸化MAPキナーゼ量に
比して低くなる場合に、選択することができる。リン酸
化MAPキナーゼ量の測定は、これを認識する抗体を利用
して常法に従い実施することができる。
【０１２５】リン酸化MAPキナーゼを認識する抗体とし
ては、例えば免疫原としてリン酸化MAPキナーゼを用い
て、前述した本発明抗体の製造法と同様にして製造する
ことができる。代表的市販品としては、例えばphospho-
p38 MAPK抗体(Cell Signaling社製)などを挙げることが
できる。
【０１２６】上記リン酸化MAPキナーゼ量の減少(低下)
を指標とする本発明スクリーニング方法は、筋肉細胞な
どのMLTK遺伝子発現細胞に代えて、MLTK遺伝子を挿入し
た発現用ベクターで形質転換した動物細胞などの、MLTK
発現能を付与した細胞株を利用して実施することもでき
る。
【０１２７】発現用ベクターとしては、公知の各種のも
の、例えばpcDNA4/His MAX、pcDNA3.1(いずれもインビ
トロジェン社)などを使用することができる。形質転換
する動物細胞としても、公知の各種のもの、例えばCOS
1、COS7、L6、3T3L1細胞などを利用することができる。
MLTK遺伝子のベクターへの挿入、ベクターによる動物細
胞の形質転換などの操作は、いずれも常法に従うことが
できる(例えば、J. Biol. Chem., Vol.276, No.6, pp.4
276-4286 (Feb. 9, 2001)など参照)。
【０１２８】更に、前記リン酸化MAPキナーゼ量の測定
に代えて、例えば上記MLTK発現能を付与した細胞株に、
更にMAPキナーゼのリン酸化に応答するリポーター遺伝
子を導入し、該リポーター遺伝子産物の測定を行うこと
によっても、本発明スクリーニング方法を実施すること
ができる。この方法はその効率面より好ましい方法であ
る。
【０１２９】上記リポーター遺伝子としては、発光反応
や呈色反応を触媒する酵素の構造遺伝子が好ましく、具
体的にはルシフェラーゼ遺伝子、分泌型アルカリフォス
ファターゼ遺伝子、クロラムフェニコール・アセチルト
ランスフェラーゼ遺伝子、βグルクロニダーゼ遺伝子、
βガラクトシダ−ゼ遺伝子およびエクオリン遺伝子など
を挙げることができる。これらを利用するアッセイ技術
は公知(例えば、Biochem. Cell. Biol. 74, 585-593 (1
996), Biologicals 26, 1-5 (1998)など参照)であり、
本発明スクリーニング方法は、この公知の方法に準じて
行うことができる。
【０１３０】リポーター遺伝子産物の測定は、用いるリ
ポーター遺伝子の種類に応じて、それぞれ知られてい
る。例えば、ルシフェラーゼ遺伝子、エクオリン遺伝子
などでは発光強度の測定によることができる。分泌型ア
ルカリフォスファターゼ遺伝子、βガラクトシダ−ゼ遺
伝子では、発色反応の定量によることができる。クロラ
ムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼ遺伝子で
は、放射標識されたクロラムフェニコールのアセチル化
をTLCで測定する方法によることができる。より具体的
には、リポーター遺伝子産物の測定は、市販のキット、
例えばMercuryTMIn vivo Kinase Assay Kits、ルシフェ
ラーゼ基質(LucLite; パッカード社製)などを用いて、
実施することができる。
【０１３１】上記リポーター遺伝子産物量の測定により
候補物質をスクリーニングする場合、候補物質は、その
存在下で培養した細胞培養液中のリポーター遺伝子発現
産物の量が、該候補物質の非存在下で培養した細胞培養
液中のリポーター遺伝子発現産物量に比して低い場合
に、選択することができる。
【０１３２】かくして選抜取得される被験物質は、糖・
脂質代謝異常疾患を緩和、抑制(改善、治療)する薬物の
有力な候補となる。
【０１３３】上記(3-1)乃至(3-3)に記載する本発明スク
リーニング方法によって選別された候補物質は、さらに
糖・脂質代謝異常疾患モデル動物を用いた薬効試験、安
全性試験、糖・脂質代謝異常疾患患者への臨床試験に供
してもよく、これらの試験を実施することによって、よ
り実用的な糖・脂質代謝異常疾患改善または治療薬を取
得することができる。このようにして選別された物質
は、さらにその構造解析結果に基づいて、化学的合成、
生物学的合成（発酵）または遺伝子学的操作によって、
工業的に製造することができる。
【０１３４】(4)糖・脂質代謝異常疾患の改善・治療剤 本発明は、糖・脂質代謝異常疾患の予防、改善および治
療剤を提供する。本発明により提供される糖・脂質代謝
異常疾患には、具体的には、糖代謝異常疾患、糖尿病、
高脂質血症、肥満症などが包含される。
【０１３５】本発明はMLTK遺伝子および該遺伝子により
コードされる蛋白質が、糖・脂質代謝異常疾患と関連し
ているという新たな知見から、MLTK遺伝子(配列番号1-
4)の発現を抑制する物質またはMLTK(配列番号5-8)の発
現量もしくは機能(活性)を低下させる物質が、上記疾患
の予防、改善または治療に有効であるという考えに基づ
くものである。すなわち、本発明の糖・脂質代謝異常疾
患の予防、改善および治療剤は、MLTK遺伝子の発現を抑
制する物質あるいはMLTKの発現量もしくは機能(活性)を
抑制する物質を有効成分とする。
【０１３６】当該有効成分とするMLTK遺伝子の発現抑制
物質あるいはMLTKの発現量もしくは機能(活性)の抑制物
質は、本発明スクリーニング方法を利用して選別された
もののみならず、この選別された物質に関する情報に基
づいて常法に従って化学・生化学的手法により、もしく
は工業的に製造されたものであってもよい。
【０１３７】当該有効成分は、そのままもしくは自体公
知の薬学的に許容される担体(賦形剤、増量剤、結合
剤、滑沢剤などが含まれる)、慣用の添加剤などと混合
して医薬組成物として調製することができる。当該医薬
組成物は、調製する形態(錠剤、丸剤、カプセル剤、散
剤、顆粒剤、シロップ剤などの経口投与剤；注射剤、点
滴剤、外用剤、坐剤などの非経口投与剤)などに応じて
経口投与または非経口投与することができる。また投与
量は、有効成分の種類、投与経路、投与対象または患者
の年齢、体重、症状などによって異なり一概に規定でき
ない。通常、1日投与用量として、数mg-2g程度、好まし
くは数十mg程度を、1日1回投与することもでき、また数
回に分けて投与することができる。
【０１３８】上記有効成分物質がDNAによりコードされ
るものである場合は、該DNAを遺伝子治療用ベクターに
組込み、遺伝子治療を行うことも考えられる。更に、上
記有効成分物質がMLTK遺伝子に対するアンチセンスヌク
レオチドの場合は、そのままもしくは遺伝子治療用ベク
ターにこれを組込むことにより、遺伝子治療を行うこと
もできる。これらの場合も、遺伝子治療用組成物の投与
量、投与方法は患者の体重、年齢、症状などにより変動
し、当業者であれば適宜選択することが可能である。
【０１３９】上記アンチセンスヌクレオチドを利用する
遺伝子治療につき詳述すれば、該遺伝子治療は、通常の
この種の遺伝子治療と同様にして、例えばアンチセンス
オリゴヌクレオチドまたはその化学的修飾体を直接患者
の体内に投与することにより目的遺伝子の発現を制御す
る方法、もしくはアンチセンスRNAを患者の標的細胞に
導入することにより該細胞による目的遺伝子の発現を制
御する方法により実施できる。
【０１４０】ここで「アンチセンスヌクレオチド」に
は、MLTK遺伝子の少なくとも8塩基以上の部分に対応す
るアンチセンスオリゴヌクレオチド、アンチセンスRN
A、アンチセンスDNAなどが含まれる。その化学修飾体に
は、例えばホスホロチオエート、ホスホロジチオエー
ト、アルキルホスホトリエステル、アルキルホスホナー
ト、アルキルホスホアミデートなどの、細胞内への移行
性または細胞内での安定性を高め得る誘導体（"Antisen
se RNA and DNA" WILEY-LISS刊、1992年、pp.1-50、J.
Med. Chem. 36, 1923-1937(1993))が含まれる。これら
は常法に従い合成することができる。
【０１４１】アンチセンスヌクレオチドまたはその化学
的修飾体は、細胞内でセンス鎖mRNAに結合して、目的遺
伝子の発現、即ちMLTKの発現を制御することができ、か
くしてMLTKの機能(活性)を制御することができる。
【０１４２】アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはそ
の化学的修飾体を直接生体内に投与する方法において、
用いられるアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはその
化学修飾体は、好ましくは5-200塩基、さらに好ましく
は8-25塩基、最も好ましくは12-25塩基の長さを有する
ものとすればよい。その投与に当たり、アンチセンスオ
リゴヌクレオチドまたはその化学的修飾体は、通常慣用
される安定化剤、緩衝液、溶媒などを用いて製剤化され
得る。
【０１４３】アンチセンスRNAを患者の標的細胞に導入
する方法において、用いられるアンチセンスRNAは、好
ましくは100塩基以上、より好ましくは300塩基以上、さ
らに好ましくは500塩基以上の長さを有するものとすれ
ばよい。また、この方法は、生体内の細胞にアンチセン
ス遺伝子を導入するin vivo法および一旦体外に取り出
した細胞にアンチセンス遺伝子を導入し、該細胞を体内
に戻すex vivo法を包含する(日経サイエンス, 1994年4
月号, 20-45頁、月刊薬事, 36 (1), 23-48 (1994)、実
験医学増刊, 12 (15), 全頁 (1994)など参照）。この内
ではin vivo法が好ましく、これには、ウイルス的導入
法(組換えウイルスを用いる方法)と非ウイルス的導入法
がある（前記各文献参照)。
【０１４４】上記組換えウイルスを用いる方法として
は、例えばレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関
連ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、
ポリオウイルス、シンビスウイルスなどのウイルスゲノ
ムにMLTK遺伝子のアンチセンスヌクレオチドを組込んで
生体内に導入する方法が挙げられる。この中では、レト
ロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルスなど
を用いる方法が特に好ましい。非ウイルス的導入法とし
ては、リポソーム法、リポフェクチン法などが挙げら
れ、特にリポソーム法が好ましい。他の非ウイルス的導
入法としては、例えばマイクロインジェクション法、リ
ン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法なども挙
げられる。
【０１４５】遺伝子治療用製剤組成物は、上述したアン
チセンスヌクレオチドまたはその化学修飾体、これらを
含む組換えウイルスおよびこれらウイルスが導入された
感染細胞などを有効成分とするものである。該組成物の
患者への投与形態、投与経路などは、治療目的とする疾
患、症状などに応じて適宜決定できる。例えば注射剤な
どの適当な投与形態で、静脈、動脈、皮下、筋肉内など
に投与することができ、また患者の疾患対象部位に直接
投与、導入することもできる。in vivo法を採用する場
合、遺伝子治療用組成物は、MLTK遺伝子のアンチセンス
ヌクレオチドを含む注射剤などの投与形態の他に、例え
ばMLTK遺伝子のアンチセンスヌクレオチドを含有するウ
イルスベクターをリポソームまたは膜融合リポソームに
包埋した形態(センダイウイルス(HVJ)-リポソームなど)
とすることができる。これらのリポソーム製剤形態に
は、懸濁剤、凍結剤、遠心分離濃縮凍結剤などが含まれ
る。また、遺伝子治療用組成物は、上記MLTK遺伝子のア
ンチセンスヌクレオチドを含有するベクターを導入され
たウイルスで感染された細胞培養液の形態とすることも
できる。これら各種形態の製剤中の有効成分の投与量
は、治療目的である疾患の程度、患者の年齢、体重など
により適宜調節することができる。通常、MLTK遺伝子に
対するアンチセンスヌクレオチドの場合は、患者成人1
人当たり約0.0001-100mg、好ましくは約0.001-10mgが数
日ないし数カ月に1回投与される量とすればよい。アン
チセンスヌクレオチドを含むレトロウイルスベクターの
場合は、レトロウイルス力価として、1日患者体重1kg当
たり約1×103pfu-1×1015pfuとなる量範囲から選ぶこと
ができる。アンチセンスヌクレオチドを導入した細胞の
場合は、1×104細胞/body-1×1015細胞/body程度を投与
すればよい。
【０１４６】
【実施例】次に、本発明を実施例によりさらに具体的に
説明する。しかし、本発明はこれらの実施例になんら限
定されるものではない。
【０１４７】実施例1 正常および糖尿病状態の筋肉で
の遺伝子発現の変動解析 ヒト2型糖尿病患者の筋肉組織4サンプルとヒトの正常な
筋肉組織25サンプルからそれぞれ調製したtotalRNAを用
いて、DNAチップ解析を行った。DNAチップ解析は、Affy
metrix社Gene Chip Human Genome U95A,B,C,D,Eを用い
て行った。具体的には、解析は、(1) total RNAからのc
DNAの調製、(2) 該cDNAからラベル化cRNAの調製、(3)
ラベル化cRNAのフラグメント化、(4) フラグメント化cR
NAとプローブアレイとのハイブリダイズ、(5) プローブ
アレイの染色、(6) プローブアレイのスキャンおよび
(7) 遺伝子発現解析の手順で行った。
【０１４８】(1) total RNAからのcDNAの調製 ヒト2型糖尿病患者の筋肉組織4サンプルおよびヒトの正
常な筋肉組織25サンプルから調製した各total RNA 10μ
gおよびT7-(dT)24プライマー(Amersham社製) 100pmolを
含む11μLの混合液を、70℃で10分間加熱した後、氷上
で冷却した。冷却後、SuperScript Choice System for
cDNA Synthesis(Gibco-BRL社製)に含まれる5×First St
rand cDNA Buffer 4μL、該キットに含まれる0.1M DTT
（dithiothreitol）2μLおよび該キットに含まれる10mM
dNTP Mix 1μLを添加し、42℃で2分間加熱した。更
に、該キットに含まれるSuper ScriptII RT 2μL(400U)
を添加し、42℃で1時間加熱した後、氷上で冷却した。
冷却後、DEPC処理水(ナカライテスク社製)91μL、該キ
ットに含まれる5×Second Strand Reaction Buffer 30
μL、10mM dNTP Mix 3μL、該キットに含まれるE. coli
DNA Ligase 1μL(10U)、該キットに含まれるE. coli D
NA Polymerase I 4μL(40U)および該キットに含まれる
E. coli RNaseH 1μL(2U)を添加し、16℃で2時間反応さ
せた。次いで、該キットに含まれるT4 DNA Polymerase
2μL(10U)を加え、16℃で5分間反応させた後、0.5M EDT
A 10μLを添加した。次いで、フェノール/クロロホルム
/イソアミルアルコール溶液(ニッポンジーン社製)162μ
Lを添加して混合した。該混合液を、予め室温、14,000r
pm、30秒間遠心分離しておいたPhase Lock Gel Light
(エッペンドルフ社製)に移し、室温で14,000rpm、2分間
遠心分離した後、145μLの水層をエッペンドルフチュー
ブに移した。得られた溶液に、7.5M酢酸アンモニウム溶
液72.5μLおよびエタノール362.5μLを加えて混合した
後、4℃、14,000rpm、20分間遠心分離した。遠心分離
後、上清を捨て、作製したcDNAを含むDNAペレットを得
た。その後、該ペレットに80%エタノール0.5mLを添加
し、4℃、14,000rpm、5分間遠心分離した後、上清を捨
てた。再度同様の操作を行った後、該ペレットを乾燥さ
せ、DEPC処理水12μLに溶解した。
【０１４９】以上の操作によって、ヒト2型糖尿病患者
の筋肉組織4サンプルおよびヒトの正常な筋肉組織25サ
ンプル由来のtotalRNAからcDNAを取得した。
【０１５０】(2) cDNAからラベル化cRNAの調製 上記(1)で調製した各cDNA溶液5μLに、DEPC処理水17μ
L、BioArray High Yield RNA Transcript Labeling Kit
(ENZO社製)に含まれる10×HY Reaction Buffer4μL、該
キットに含まれる10×Biotin Labeled Ribonucleotides
4μL、該キットに含まれる10×DTT 4μL、該キットに
含まれる10×RNase Inhibitor Mix 4μLおよび該キット
に含まれる20×T7 RNA Polymerase 2μLを混合し、37℃
で5時間反応させた。反応後、該反応液にDEPC処理水60
μLを加えた後、RNeasy Mini Kitを用いて添付プロトコ
ールに従って、調製したラベル化cRNAを精製した。
【０１５１】(3) ラベル化cRNAのフラグメント化 上記(3)で精製した各ラベル化cRNA 20μgを含む溶液
に、5×Fragmentation Buffer(200mMトリス-酢酸, pH8.
1(Sigma社製)、500mM酢酸カリウム(Sigma社製)および15
0mM酢酸マグネシウム(Sigma社製))8μLを加え、得られ
る反応液40μLを、94℃で35分間加熱した後、氷中に置
いた。これによってラベル化cRNAをフラグメント化し
た。
【０１５２】(4) フラグメント化cRNAとプローブアレイ
とのハイブリダイズ 上記(3)で得た各フラグメント化cRNA 40μLに、5nM Con
tol Oligo B2(Amersham社製) 4μL、100×Control cRNA
Cocktail 4μL、Herring sperm DNA(Promega社製) 40
μg、Acetylated BSA(Gibco-BRL社製) 200μg、2×MES
HybridizationBuffer (200mM MES、2M [Na+]、40mM EDT
A、0.02% Tween20 (Pierce社製)、pH6.5-6.7) 200μLお
よびDEPC処理水144μLを混合し、400μLのハイブリカク
テルを得た。得られた各ハイブリカクテルを99℃で5分
間加熱し、更に45℃で5分間加熱した。加熱後、室温で1
4,000rpm、5分間遠心分離し、ハイブリカクテル上清を
得た。
【０１５３】一方、1×MESハイブリダイゼーションバッ
ファーで満たしたHuman genome U95プローブアレイ(Aff
ymetrix社製)を、ハイブリオーブン内で、45℃、60rpm
で10分間回転させた後、1×MESハイブリダイゼーション
バッファーを除去してプローブアレイを調製した。上記
で得られたハイブリカクテル上清200μLを該プローブア
レイにそれぞれ添加し、ハイブリオーブン内で45℃、60
rpmで16時間回転させ、フラグメント化cRNAとハイブリ
ダイズしたプローブアレイを得た。
【０１５４】(5) プローブアレイの染色 上記(4)で得たハイブリダイズ済みプローブアレイのそ
れぞれから、ハイブリカクテルを回収除去した後、Non-
Stringent Wash Buffer(6×SSPE(20×SSPE(ナカライテ
スク社製)を希釈)、0.01%Tween20および0.005%Antifoam
0-30(Sigma社製))で満たした。次に、Non-Stringent Wa
sh BufferおよびStringent Wash Buffer(100mM MES、0.
1M NaClおよび0.01%Tween20)をセットしたGeneChip Flu
idics Station 400 (Affymetrix社製)の所定の位置に、
フラグメント化cRNAとハイブリダイズしたプローブアレ
イを装着した。その後、染色プロトコールEuKGE-WS2に
従って、一次染色液 (10μg/mL Streptavidin Phycoery
thrin (SAPE)(MolecμLar Probe社製)、2mg/mL Acetyla
ted BSA、100mM MES、1M NaCl(Ambion社製)、0.05%Twee
n20および0.005%Antifoam0-30)、および二次染色液(100
μg/mL Goat IgG(Sigma社製)、3μg/mL Biotinylated A
nti-Streptavidin antibody (Vector Laboratories社
製)、2mg/mL Acetylated BSA、100mM MES、1M NaCl、0.
05%Tween20および0.005%Antifoam0-30)でそれぞれ染色
した。
【０１５５】(6) プローブアレイのスキャンおよび(7)
遺伝子発現解析 上記(5)で染色した各プローブアレイをHP GeneArray Sc
anner (Affymetrix社製)に供し、染色パターンを読み取
った。
【０１５６】染色パターンをもとにGeneChip Workstati
on System(Affymetrix社製)によってプローブアレイ上
の遺伝子の発現を解析した。次に、解析プロトコールに
従ってNormalizationおよび遺伝子発現の比較解析を行
った。
【０１５７】以上のDNAチップ解析による遺伝子発現の
比較解析結果から、正常筋肉組織に比べて2型糖尿病患
者の筋肉組織で3倍以上の発現増を示したプローブを選
抜した。
【０１５８】選抜したプローブの中から、さらにヒト2
型糖尿病患者の筋肉組織で高頻度発現上昇しているプロ
ーブを選抜した。具体的には、DNAチップ解析結果から
得られるAbs Callを指標にして、ヒト2型糖尿病患者の
筋肉組織でのAbs Callが "Present"である例数が2例以
上であるプローブを選抜した。
【０１５９】その結果、MLK-like mitogen-activated p
rotein triple kinase (MLTK)遺伝子(プローブ名:76950
#at)を選抜した。MLTKは正常状態の筋肉と比較して糖尿
病患者の筋肉では3.2倍の発現上昇が観察された。
【０１６０】実施例2 高脂肪食負荷マウスの作製と肥
満糖尿病動物への糖尿病治療薬の投与 正常マウスC57BL/6j(日本クレア)に4週齢から高脂肪食
(リサーチダイエット社製、D12492)を7ヶ月間負荷し、
高脂肪食負荷マウスを作成した。作成した高脂肪食負荷
マウスより筋肉を採取した(高脂肪食負荷群、n=2)。
【０１６１】また、通常食(リサーチダイエット社製、D
124508)で飼育した正常マウスC57BL/6j(32週齢、日本ク
レア)より筋肉を採取した(正常群、n=2)。
【０１６２】また、肥満糖尿病モデルマウス(遺伝的糖
尿病モデルマウス)であるC57BL/Ksj-db/db Jcl(日本ク
レア)の10週齢の雌より筋肉を採取した(遺伝的糖尿病
群、n=2)。
【０１６３】更に、肥満糖尿病モデルマウスであるKKAy
/Ta Jcl(日本クレア)の7週齢の雄に、ロシグリタゾン(A
vandia, スミスクライン・ビーチャム(SKB))を10mg/kg/
dayの投与量で1日/1回、37日間経口投与した(ロシグリ
タゾン投与群、n=3)。血糖値は同じ肥満糖尿病モデルモ
デルマウスに溶媒のみを同様に投与した溶媒投与群(n=
3)が平均362mg/dlであったのに対して、ロシグリタゾン
投与群では平均205mg/kgに低下していた。各群マウスか
ら筋肉を採取した。
【０１６４】実施例3 ノーザンブロット法によるMLTK
βの発現変化の評価 実施例2で作製した各群マウスの筋肉から、Isogen(日本
ジーン)を用いてtotalRNAを単離した。得られた各RNA 1
0μgを電気泳導後、ナイロンメンブレンに転写し、MLTK
βに特異的なcDNAをプローブとしてノーザンブロット法
を実施し、転写レベルはBASを用いて定量的に解析し
た。
【０１６５】得られた結果(MLTKβ発現量、比放射活性
の相対量)を下記表1に示す。
【０１６６】
【表1】
【０１６７】表1に示す結果より、高脂肪食負荷群、遺
伝的糖尿病群(db/dbマウス)および溶媒投与群(KKAyマウ
ス)においては、正常群と比較して、MLTKβ発現量の上
昇が観察されたが、ロシグリタゾン投与群(KKAyマウス)
では、MLTKβ発現量の低下が認められた。
【０１６８】実施例4 MLTK遺伝子の発現を抑制する物
質のスクリーニング ラット筋芽細胞株L6を6×103cells/ウェルの濃度で、96
穴プレートに播種し、10%FBSを含むα-MEM培地で培養す
る。十分コンフルエントになった時点(Day0)で、培地を
2%FBS含有α-MEM培地に交換し、Day2およびDay3の細胞
を筋筒細胞として使用する。
【０１６９】上記で調整した筋筒細胞の本培養液(2% FB
S含有α-MEM)に、それぞれ100μM、10μMおよび1μMの
濃度になるように被験物質を添加して、37℃、CO2濃度5
％で細胞を2日間培養する。対照として、被検物質無添
加の本培養液でも同様に細胞を培養する(コントロー
ル)。
【０１７０】得られる各培養細胞からRNAを抽出し、こ
の抽出されたRNAについて実施例1に記載の方法で、MLTK
遺伝子の発現量を調べる。
【０１７１】コントロールと比べて、MLTK遺伝子の発現
量が10％、好ましくは30％、特に好ましくは50以上減少
している系について、被検物質を糖・脂質代謝異常疾患
の緩和、抑制(改善、治療)のための候補物質として選択
する。
【０１７２】実施例5 MLTKの機能(活性)を抑制する物
質のスクリーニング この例は、分化した筋肉細胞の培養物中のリン酸化され
たp38 (基質としてのMAPK)の量を測定することにより実
施される、MLTKの機能または活性を抑制する物質(MLTK
阻害剤)のスクリーニング法の例である。
【０１７３】被検物質として供試化合物の溶媒溶液を用
い、その存在下および非存在下(溶媒のみ)で、筋肉細胞
L6(ATCC受託細胞)を24時間培養(培地：2% FBS含有α-ME
M、5% CO2、37℃、静置培養)する。得られる細胞培養液
にRIPA bufferを添加して細胞を溶解し、細胞溶解液をS
DS-PAGE法にて電気泳動した後、リン酸化p38を認識する
抗体（phospho-p38 MAPK抗体、Cell Signaling社製）を
用いてウエスタンブロット法を実施し、細胞溶解液にお
けるリン酸化p38の量を測定する。
【０１７４】この方法に従い、被験物質の存在下で培養
した細胞培養液中のリン酸化p38量が、被検物質の非存
在下で培養した細胞培養液中のそれに比して低下してい
る場合に、供試化合物をMLTK阻害剤の有力な候補化合物
として選択する。
【０１７５】実施例6 MLTKの機能(活性)を抑制する物
質のスクリーニング (1)MLTK安定発現株の樹立 (1-1)導入遺伝子ベクターの構築 MLTKのコード領域をAmpliTaq(パーキンエルマー社)にて
PCR法で増幅する。増幅した遺伝子断片を動物細胞で機
能するプロモーター(pcDAN4/HisMax, invitrogen社)の
下流に導入する。レポーター遺伝子(SEAP遺伝子)はp38
応答配列を有するプロモーター下流に挿入して使用す
る。
【０１７６】(1-2)細胞株の樹立 COS細胞を10cm2培養皿に播種し、60-70％コンフルエン
トになるまで培養する。その後、無血清培地に転換し、
上記で構築したMLTK導入遺伝子とレポーター遺伝子をLi
poofectamine-Plus (Gibco)と複合体を形成させたのち
に培地に添加する。5時間インキュベート後、10％FBSを
含む培地に転換し、さらに8時間培養する。その後トリ
プシンEDTAで細胞を培養皿から剥離させ、ゼオシンと10
％FBSを含む培地に懸濁し、10cm2培養皿に播種する。数
日後に形成されるコロニーを単離し、MLTKスクリーニン
グ用安定発現株とする。
【０１７７】(2)MLTK阻害剤のスクリーニング (2-1)細胞の調製 上記(1-2)で得たMLTKスクリーニング用安定発現株を96
穴培養皿に播種し、10％FBS(Gibco)を培地中で60-70％
コンフルエントになるまで培養する。これを発現細胞と
して使用する。
【０１７８】(2-2)被験物質の添加 上記(2-1)で調製した発現細胞の培地を使用前日に無血
清の培地に交換する。使用当日に、培養皿の培地を除去
し、その代わりに被験物質(2.5mM DMSO溶液)を適当な濃
度で含有するD-MEM培地を添加し、37℃で24時間培養す
る。
【０１７９】コントロールとして、被検物質を含まない
D-MEM培地を用いて上記発現細胞同様にして培養する。
【０１８０】(2-3)蛍光測定によるSEAP量の定量 上記(2-2)で得た細胞培養物より上清を分取し、該上清
中に含まれるSEAP量を基質の蛍光量変化により測定、定
量する。
【０１８１】この方法に従い、被験物質の存在下で培養
した細胞培養物の上清中のSEAP量が、コントロールであ
る被検物質の非存在下で培養した細胞培養物上清中のそ
れに比して低下している場合に、被験物質をMLTK阻害剤
の有力な候補物質として選択する。
【０１８２】
【発明の効果】本発明によって、糖・脂質代謝異常疾
患、例えば糖代謝異常疾患、糖尿病、高脂血症、肥満症
などの疾患で発現が有意に上昇している遺伝子(MLTK遺
伝子)が明らかになった。この遺伝子は糖・脂質代謝異
常疾患の疾患マーカー遺伝子(プローブおよびプライマ
ー)として有用である。該マーカー遺伝子の利用によれ
ば、糖・脂質代謝異常疾患が検出でき、またその病因の
究明および高精度の診断が可能であり、これらによりよ
り適切な治療を施すことも可能となる。
【０１８３】また、上記遺伝子の発現上昇と糖・脂質代
謝異常疾患との関連から、該遺伝子の発現を抑制する化
合物は、糖・脂質代謝異常疾患の治療薬として有用と考
えられる。従って、この遺伝子の発現の抑制もしくは減
少を指標とすることによって、糖・脂質代謝異常疾患の
治療薬となり得る候補薬をスクリーニング選別すること
が可能である。本発明は、このような糖・脂質代謝異常
疾患治療薬の開発技術をも提供する。
【０１８４】
【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Sumitomo Pharmaceuticals <120> A marker of abnormal sugar-lipid disorders and use thereof <130> 6102JP <140> <141> <150> JP 2001-371420 <151> 2001-12-05 <160> 8 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 2403 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(2403) <400> 1 atg tcg tct ctc ggt gcc tcc ttt gtg caa att aaa ttt gat gac ttg 48 Met Ser Ser Leu Gly Ala Ser Phe Val Gln Ile Lys Phe Asp Asp Leu 1 5 10 15 cag ttt ttt gaa aac tgc ggt gga gga agt ttt ggg agt gtt tat cga 96 Gln Phe Phe Glu Asn Cys Gly Gly Gly Ser Phe Gly Ser Val Tyr Arg 20 25 30 gcc aaa tgg ata tca cag gac aag gag gtg gct gta aag aag ctc ctc 144 Ala Lys Trp Ile Ser Gln Asp Lys Glu Val Ala Val Lys Lys Leu Leu 35 40 45 aaa ata gag aaa gag gca gaa ata ctc agt gtc ctc agt cac aga aac 192 Lys Ile Glu Lys Glu Ala Glu Ile Leu Ser Val Leu Ser His Arg Asn 50 55 60 atc atc cag ttt tat gga gta att ctt gaa cct ccc aac tat ggc att 240 Ile Ile Gln Phe Tyr Gly Val Ile Leu Glu Pro Pro Asn Tyr Gly Ile 65 70 75 80 gtc aca gaa tat gct tct ctg gga tca ctc tat gat tac att aac agt 288 Val Thr Glu Tyr Ala Ser Leu Gly Ser Leu Tyr Asp Tyr Ile Asn Ser 85 90 95 aac aga agt gag gag atg gat atg gat cac att atg acc tgg gcc act 336 Asn Arg Ser Glu Glu Met Asp Met Asp His Ile Met Thr Trp Ala Thr 100 105 110 gat gta gcc aaa gga atg cat tat tta cat atg gag gct cct gtc aag 384 Asp Val Ala Lys Gly Met His Tyr Leu His Met Glu Ala Pro Val Lys 115 120 125 gtg att cac aga gac ctc aag tca aga aac gtt gtt ata gct gct gat 432 Val Ile His Arg Asp Leu Lys Ser Arg Asn Val Val Ile Ala Ala Asp 130 135 140 gga gta ttg aag atc tgt gac ttt ggt gcc tct cgg ttc cat aac cat 480 Gly Val Leu Lys Ile Cys Asp Phe Gly Ala Ser Arg Phe His Asn His 145 150 155 160 aca aca cac atg tcc ttg gtt gga act ttc cca tgg atg gct cca gaa 528 Thr Thr His Met Ser Leu Val Gly Thr Phe Pro Trp Met Ala Pro Glu 165 170 175 gtt atc cag agt ctc cct gtg tca gaa act tgt gac aca tat tcc tat 576 Val Ile Gln Ser Leu Pro Val Ser Glu Thr Cys Asp Thr Tyr Ser Tyr 180 185 190 ggt gtg gtt ctc tgg gag atg cta aca agg gag gtc ccc ttt aaa ggt 624 Gly Val Val Leu Trp Glu Met Leu Thr Arg Glu Val Pro Phe Lys Gly 195 200 205 ttg gaa gga tta caa gta gct tgg ctt gta gtg gaa aaa aac gag aga 672 Leu Glu Gly Leu Gln Val Ala Trp Leu Val Val Glu Lys Asn Glu Arg 210 215 220 tta acc att cca agc agt tgc ccc aga agt ttt gct gaa ctg tta cat 720 Leu Thr Ile Pro Ser Ser Cys Pro Arg Ser Phe Ala Glu Leu Leu His 225 230 235 240 cag tgt tgg gaa gct gat gcc aag aaa cgg cca tca ttc aag caa atc 768 Gln Cys Trp Glu Ala Asp Ala Lys Lys Arg Pro Ser Phe Lys Gln Ile 245 250 255 att tca atc ctg gag tcc atg tca aat gac acg agc ctt cct gac aag 816 Ile Ser Ile Leu Glu Ser Met Ser Asn Asp Thr Ser Leu Pro Asp Lys 260 265 270 tgt aac tca ttc cta cac aac aag gcg gag tgg agg tgc gaa att gag 864 Cys Asn Ser Phe Leu His Asn Lys Ala Glu Trp Arg Cys Glu Ile Glu 275 280 285 gca act ctt gag agg cta aag aaa cta gag cgt gat ctc agc ttt aag 912 Ala Thr Leu Glu Arg Leu Lys Lys Leu Glu Arg Asp Leu Ser Phe Lys 290 295 300 gag cag gag ctt aaa gaa cga gaa aga cgt tta aag atg tgg gag caa 960 Glu Gln Glu Leu Lys Glu Arg Glu Arg Arg Leu Lys Met Trp Glu Gln 305 310 315 320 aag ctg aca gag cag tcc aac acc ccg ctg ctg cct tcc ttt gag att 1008 Lys Leu Thr Glu Gln Ser Asn Thr Pro Leu Leu Pro Ser Phe Glu Ile 325 330 335 ggt gca tgg acg gaa gac gat gtg tat tgn tgg gtt cag cag ctc gtc 1056 Gly Ala Trp Thr Glu Asp Asp Val Tyr Xaa Trp Val Gln Gln Leu Val 340 345 350 aga aaa ggt gac tct tca gca gag atg agt gta tat gca agc ttg ttt 1104 Arg Lys Gly Asp Ser Ser Ala Glu Met Ser Val Tyr Ala Ser Leu Phe 355 360 365 aaa gaa aac aac att aca ggg aag cgg ctg ctg ctg ctg gag gaa gaa 1152 Lys Glu Asn Asn Ile Thr Gly Lys Arg Leu Leu Leu Leu Glu Glu Glu 370 375 380 gac ctg aaa gac atg ggc att gtc tcc aag ggg cat atc att cac ttc 1200 Asp Leu Lys Asp Met Gly Ile Val Ser Lys Gly His Ile Ile His Phe 385 390 395 400 aag tca gcc att gag aaa tta acc cat gat tac ata aat ttg ttt cac 1248 Lys Ser Ala Ile Glu Lys Leu Thr His Asp Tyr Ile Asn Leu Phe His 405 410 415 ttc cca cca cta att aag gac tca gga ggt gaa cct gaa gaa aat gag 1296 Phe Pro Pro Leu Ile Lys Asp Ser Gly Gly Glu Pro Glu Glu Asn Glu 420 425 430 gaa aaa ata gtg aac ctg gaa ctg gtt ttt ggt ttt cac ttg aaa cca 1344 Glu Lys Ile Val Asn Leu Glu Leu Val Phe Gly Phe His Leu Lys Pro 435 440 445 gga act ggc cca cag gat tgt aag tgg aaa atg tat atg gag atg gat 1392 Gly Thr Gly Pro Gln Asp Cys Lys Trp Lys Met Tyr Met Glu Met Asp 450 455 460 ggg gat gaa att gca ata acc tac ata aaa gat gtg aca ttc aac act 1440 Gly Asp Glu Ile Ala Ile Thr Tyr Ile Lys Asp Val Thr Phe Asn Thr 465 470 475 480 aac cta cct gat gcg gag att tta aag atg aca aag cca cca ttt gta 1488 Asn Leu Pro Asp Ala Glu Ile Leu Lys Met Thr Lys Pro Pro Phe Val 485 490 495 atg gag aag tgg att gta gga ata gca aaa agt cag act gtg gag tgc 1536 Met Glu Lys Trp Ile Val Gly Ile Ala Lys Ser Gln Thr Val Glu Cys 500 505 510 act gtc aca tat gag agt gat gtt aga act cca aaa agc act aaa cat 1584 Thr Val Thr Tyr Glu Ser Asp Val Arg Thr Pro Lys Ser Thr Lys His 515 520 525 gtc cat ttg att cag tgg agt aga aca aaa cct cag gat gaa gtg aaa 1632 Val His Leu Ile Gln Trp Ser Arg Thr Lys Pro Gln Asp Glu Val Lys 530 535 540 gca gtc caa ctt gcc att cag aca tta ttc acc aat tca gat ggc aac 1680 Ala Val Gln Leu Ala Ile Gln Thr Leu Phe Thr Asn Ser Asp Gly Asn 545 550 555 560 cct gga agc agg tcc gac tca agt gct gat tgc cag tgg tta gat act 1728 Pro Gly Ser Arg Ser Asp Ser Ser Ala Asp Cys Gln Trp Leu Asp Thr 565 570 575 ctg agg atg cgg cag att gca tcc aac act tct tta cag cgt tcc cag 1776 Leu Arg Met Arg Gln Ile Ala Ser Asn Thr Ser Leu Gln Arg Ser Gln 580 585 590 agc aat cct att ctg ggg tca ccg ttc ttc tca cac ttt gat ggc cag 1824 Ser Asn Pro Ile Leu Gly Ser Pro Phe Phe Ser His Phe Asp Gly Gln 595 600 605 gat tcc tac gct gct gct gtg aga cgg ccc cag gtg ccc att aag tat 1872 Asp Ser Tyr Ala Ala Ala Val Arg Arg Pro Gln Val Pro Ile Lys Tyr 610 615 620 caa cag att aca cct gtg aac cag tcc aga agc tcg tct cct act cag 1920 Gln Gln Ile Thr Pro Val Asn Gln Ser Arg Ser Ser Ser Pro Thr Gln 625 630 635 640 tat gga ctg acc aaa aac ttc tct tcc cta cat ctc aac tct agg gac 1968 Tyr Gly Leu Thr Lys Asn Phe Ser Ser Leu His Leu Asn Ser Arg Asp 645 650 655 agt ggc ttt tcc agt ggc aat act gac acc tct tca gag agg ggt cga 2016 Ser Gly Phe Ser Ser Gly Asn Thr Asp Thr Ser Ser Glu Arg Gly Arg 660 665 670 tac tca gac aga agc agg aac aaa tat gga cgt ggt agt ata tca ctc 2064 Tyr Ser Asp Arg Ser Arg Asn Lys Tyr Gly Arg Gly Ser Ile Ser Leu 675 680 685 aat tct tct cct aga gga aga tac agt gga aag agt cag cat tcc act 2112 Asn Ser Ser Pro Arg Gly Arg Tyr Ser Gly Lys Ser Gln His Ser Thr 690 695 700 cct tca aga gga aga tac cct gga aag ttc tac agg gtt tct cag tca 2160 Pro Ser Arg Gly Arg Tyr Pro Gly Lys Phe Tyr Arg Val Ser Gln Ser 705 710 715 720 gca ctc aat cct cac cag tcg cct gac ttc aag aga agc ccc agg gac 2208 Ala Leu Asn Pro His Gln Ser Pro Asp Phe Lys Arg Ser Pro Arg Asp 725 730 735 ctc cac caa ccc aac acc ata cca ggg atg cct ttg cac cct gag act 2256 Leu His Gln Pro Asn Thr Ile Pro Gly Met Pro Leu His Pro Glu Thr 740 745 750 gac tca aga gcc agt gaa gag gac agc aaa gtc agc gaa ggg ggc tgg 2304 Asp Ser Arg Ala Ser Glu Glu Asp Ser Lys Val Ser Glu Gly Gly Trp 755 760 765 aca aaa gtg gaa tac cgg aaa aag ccc cac agg cca tct ccc gcc aaa 2352 Thr Lys Val Glu Tyr Arg Lys Lys Pro His Arg Pro Ser Pro Ala Lys 770 775 780 acc aat aaa gag aga gcc aga ggg gac cac cgt gga tgg aga aac ttt 2400 Thr Asn Lys Glu Arg Ala Arg Gly Asp His Arg Gly Trp Arg Asn Phe 785 790 795 800 tga 2403 <210> 2 <211> 1368 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(1368) <400> 2 atg tcg tct ctc ggt gcc tcc ttt gtg caa att aaa ttt gat gac ttg 48 Met Ser Ser Leu Gly Ala Ser Phe Val Gln Ile Lys Phe Asp Asp Leu 1 5 10 15 cag ttt ttt gaa aac tgc ggt gga gga agt ttt ggg agt gtt tat cga 96 Gln Phe Phe Glu Asn Cys Gly Gly Gly Ser Phe Gly Ser Val Tyr Arg 20 25 30 gcc aaa tgg ata tca cag gac aag gag gtg gct gta aag aag ctc ctc 144 Ala Lys Trp Ile Ser Gln Asp Lys Glu Val Ala Val Lys Lys Leu Leu 35 40 45 aaa ata gag aaa gag gca gaa ata ctc agt gtc ctc agt cac aga aac 192 Lys Ile Glu Lys Glu Ala Glu Ile Leu Ser Val Leu Ser His Arg Asn 50 55 60 atc atc cag ttt tat gga gta att ctt gaa cct ccc aac tat ggc att 240 Ile Ile Gln Phe Tyr Gly Val Ile Leu Glu Pro Pro Asn Tyr Gly Ile 65 70 75 80 gtc aca gaa tat gct tct ctg gga tca ctc tat gat tac att aac agt 288 Val Thr Glu Tyr Ala Ser Leu Gly Ser Leu Tyr Asp Tyr Ile Asn Ser 85 90 95 aac aga agt gag gag atg gat atg gat cac att atg acc tgg gcc act 336 Asn Arg Ser Glu Glu Met Asp Met Asp His Ile Met Thr Trp Ala Thr 100 105 110 gat gta gcc aaa gga atg cat tat tta cat atg gag gct cct gtc aag 384 Asp Val Ala Lys Gly Met His Tyr Leu His Met Glu Ala Pro Val Lys 115 120 125 gtg att cac aga gac ctc aag tca aga aac gtt gtt ata gct gct gat 432 Val Ile His Arg Asp Leu Lys Ser Arg Asn Val Val Ile Ala Ala Asp 130 135 140 gga gta ctg aag atc tgt gac ttt ggt gcc tct cgg ttc cat aac cat 480 Gly Val Leu Lys Ile Cys Asp Phe Gly Ala Ser Arg Phe His Asn His 145 150 155 160 aca aca cac atg tcc ttg gtt gga act ttc cca tgg atg gct cca gaa 528 Thr Thr His Met Ser Leu Val Gly Thr Phe Pro Trp Met Ala Pro Glu 165 170 175 gtt atc cag agt ctc cct gtg tca gaa act tgt gac aca tat tcc tat 576 Val Ile Gln Ser Leu Pro Val Ser Glu Thr Cys Asp Thr Tyr Ser Tyr 180 185 190 ggt gtg gtt ctc tgg gag atg cta aca agg gag gtc ccc ttt aaa ggt 624 Gly Val Val Leu Trp Glu Met Leu Thr Arg Glu Val Pro Phe Lys Gly 195 200 205 ttg gaa gga tta caa gta gct tgg ctt gta gtg gaa aaa aac gag aga 672 Leu Glu Gly Leu Gln Val Ala Trp Leu Val Val Glu Lys Asn Glu Arg 210 215 220 tta acc att cca agc agt tgc ccc aga agt ttt gct gaa ctg tta cat 720 Leu Thr Ile Pro Ser Ser Cys Pro Arg Ser Phe Ala Glu Leu Leu His 225 230 235 240 cag tgt tgg gaa gct gat gcc aag aaa cgg cca tca ttc aag caa atc 768 Gln Cys Trp Glu Ala Asp Ala Lys Lys Arg Pro Ser Phe Lys Gln Ile 245 250 255 att tca atc ctg gag tcc atg tca aat gac acg agc ctt cct gac aag 816 Ile Ser Ile Leu Glu Ser Met Ser Asn Asp Thr Ser Leu Pro Asp Lys 260 265 270 tgt aac tca ttc cta cac aac aag gcg gag tgg agg tgc gaa att gag 864 Cys Asn Ser Phe Leu His Asn Lys Ala Glu Trp Arg Cys Glu Ile Glu 275 280 285 gca act ctt gag agg cta aag aaa cta gag cgt gat ctc agc ttt aag 912 Ala Thr Leu Glu Arg Leu Lys Lys Leu Glu Arg Asp Leu Ser Phe Lys 290 295 300 gag cag gag ctt aaa gaa cga gaa aga cgt tta aag atg tgg gag caa 960 Glu Gln Glu Leu Lys Glu Arg Glu Arg Arg Leu Lys Met Trp Glu Gln 305 310 315 320 aag ctg aca gag cag tcc aac acc ccg ctt ctc ttg cct ctt gct gca 1008 Lys Leu Thr Glu Gln Ser Asn Thr Pro Leu Leu Leu Pro Leu Ala Ala 325 330 335 aga atg tct gag gag tct tac ttt gaa tct aaa aca gag gag tca aac 1056 Arg Met Ser Glu Glu Ser Tyr Phe Glu Ser Lys Thr Glu Glu Ser Asn 340 345 350 agt gca gag atg tca tgt cag atc aca gca aca agt aac ggg gag ggc 1104 Ser Ala Glu Met Ser Cys Gln Ile Thr Ala Thr Ser Asn Gly Glu Gly 355 360 365 cat ggc atg aac cca agt ctg cag gcc atg atg ctg atg ggc ttt ggg 1152 His Gly Met Asn Pro Ser Leu Gln Ala Met Met Leu Met Gly Phe Gly 370 375 380 gat atc ttc tca atg aac aaa gca gga gct gtg atg cat tct ggg atg 1200 Asp Ile Phe Ser Met Asn Lys Ala Gly Ala Val Met His Ser Gly Met 385 390 395 400 cag ata aac atg caa gcc aag cag aat tct tcc aaa acc aca tct aag 1248 Gln Ile Asn Met Gln Ala Lys Gln Asn Ser Ser Lys Thr Thr Ser Lys 405 410 415 aga agg ggg aag aaa gtc aac atg gct ctg ggg ttc agt gat ttt gac 1296 Arg Arg Gly Lys Lys Val Asn Met Ala Leu Gly Phe Ser Asp Phe Asp 420 425 430 ttg tca gaa ggt gac gat gat gat gat gat gac ggt gag gag gag gat 1344 Leu Ser Glu Gly Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Gly Glu Glu Glu Asp 435 440 445 aat gac atg gat aat agt gaa tga 1368 Asn Asp Met Asp Asn Ser Glu 450 455 <210> 3 <211> 3146 <212> DNA <213> Mouse <220> <221> CDS <222> (37)..(2445) <400> 3 cgattttgtg gacgtttact actttgtcat tatgag atg tcg tct ctc gga gcc 54 Met Ser Ser Leu Gly Ala 1 5 tcc ttt gtg caa att aag ttc gac gac ttg cag ttt ttt gaa aac tgc 102 Ser Phe Val Gln Ile Lys Phe Asp Asp Leu Gln Phe Phe Glu Asn Cys 10 15 20 ggt gga gga agt ttt ggg agt gtg tat cga gcc aaa tgg ata tca cag 150 Gly Gly Gly Ser Phe Gly Ser Val Tyr Arg Ala Lys Trp Ile Ser Gln 25 30 35 gac aag gag gtg gct gta aag aag tta ctc aaa ata gag aaa gag gca 198 Asp Lys Glu Val Ala Val Lys Lys Leu Leu Lys Ile Glu Lys Glu Ala 40 45 50 gaa atc ctg agc gtc ctc agt cac aga aac atc atc cag ttt tat gga 246 Glu Ile Leu Ser Val Leu Ser His Arg Asn Ile Ile Gln Phe Tyr Gly 55 60 65 70 gtg att ctg gaa cct ccc aac tat ggc atc gtc aca gaa tat gct tcc 294 Val Ile Leu Glu Pro Pro Asn Tyr Gly Ile Val Thr Glu Tyr Ala Ser 75 80 85 ctg ggc tcc ctg tat gat tac att aac agc aac agg agt gaa gag atg 342 Leu Gly Ser Leu Tyr Asp Tyr Ile Asn Ser Asn Arg Ser Glu Glu Met 90 95 100 gac atg gaa cac atc atg acc tgg gcc act gac gta gcc aaa ggg atg 390 Asp Met Glu His Ile Met Thr Trp Ala Thr Asp Val Ala Lys Gly Met 105 110 115 cat tac tta cac atg gaa gct cct gtc aag gtg atc cac 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cac cag tgt tgg gag gct gat 774 Cys Pro Arg Ser Phe Ala Glu Leu Leu His Gln Cys Trp Glu Ala Asp 235 240 245 gcc aag aaa cgg cca tcg ttc aag caa atc att tca atc ctg gag tct 822 Ala Lys Lys Arg Pro Ser Phe Lys Gln Ile Ile Ser Ile Leu Glu Ser 250 255 260 atg tca aat gac acg aac ctt cct gac cag tgt aac tca ttt tta cac 870 Met Ser Asn Asp Thr Asn Leu Pro Asp Gln Cys Asn Ser Phe Leu His 265 270 275 aac aag gcg gag tgg agg tgt gaa att gag gca acc ctt gag cga ctg 918 Asn Lys Ala Glu Trp Arg Cys Glu Ile Glu Ala Thr Leu Glu Arg Leu 280 285 290 aag aaa cta gag cga gat ctc agc ttt aaa gag cag gag ctc aaa gaa 966 Lys Lys Leu Glu Arg Asp Leu Ser Phe Lys Glu Gln Glu Leu Lys Glu 295 300 305 310 cgg gag aga cgt ctc aag atg tgg gag cag aag ctg acg gag caa tcc 1014 Arg Glu Arg Arg Leu Lys Met Trp Glu Gln Lys Leu Thr Glu Gln Ser 315 320 325 aac acc ccg ctg ctg cct tcc ttt gag att ggt gcg tgg act gaa gac 1062 Asn Thr Pro Leu Leu Pro Ser Phe Glu Ile Gly Ala Trp Thr Glu Asp 330 335 340 gat gtg tat ttt tgg gtt cag cag ctc gtc aga aaa ggc gag tct tca 1110 Asp Val Tyr Phe Trp Val Gln Gln Leu Val Arg Lys Gly Glu Ser Ser 345 350 355 gta gag atg agt gga tac gca agt ttg ttt aag gag aac aac atc aca 1158 Val Glu Met Ser Gly Tyr Ala Ser Leu Phe Lys Glu Asn Asn Ile Thr 360 365 370 ggc aag cgg ttg ctg ctt ctg gaa gag gaa gat ctg aaa gac atg ggc 1206 Gly Lys Arg Leu Leu Leu Leu Glu Glu Glu Asp Leu Lys Asp Met Gly 375 380 385 390 atc gtc tcc aag gga cac atc att cac ttt aag tca gct att gag aag 1254 Ile Val Ser Lys Gly His Ile Ile His Phe Lys Ser Ala Ile Glu Lys 395 400 405 cta acc cac gat tat ctg aac ctg ttt cac ttc cca cca ctg att aag 1302 Leu Thr His Asp Tyr Leu Asn Leu Phe His Phe Pro Pro Leu Ile Lys 410 415 420 gat tca gga ggg gaa cct gaa gaa aat gag gaa aaa ata gtg aac ctt 1350 Asp Ser Gly Gly Glu Pro Glu Glu Asn Glu Glu Lys Ile Val Asn Leu 425 430 435 gaa ctt gtt ttt ggt ttt cac ttg aag cca gga act ggc cca cag gat 1398 Glu Leu Val Phe Gly Phe His Leu Lys Pro Gly Thr Gly Pro Gln Asp 440 445 450 tgc aaa tgg aaa atg tat atg gag atg gat ggg gac gaa gtt gca atc 1446 Cys Lys Trp Lys Met Tyr Met Glu Met Asp Gly Asp Glu Val Ala Ile 455 460 465 470 acg tac ata aaa gat gtg act ttc aac acg agc ctc cct gat gca gag 1494 Thr Tyr Ile Lys Asp Val Thr Phe Asn Thr Ser Leu Pro Asp Ala Glu 475 480 485 att tta aag atg aca aag cca cca ttt gta atg gag aag tgg atc gtg 1542 Ile Leu Lys Met Thr Lys Pro Pro Phe Val Met Glu Lys Trp Ile Val 490 495 500 gga ata gcg gag gat cag act gtg gag tgc acg gtc acc tat gag aat 1590 Gly Ile Ala Glu Asp Gln Thr Val Glu Cys Thr Val Thr Tyr Glu Asn 505 510 515 gat gtc aga aca cca aaa ctc act aag cac gtg cac tcc ata cag tgg 1638 Asp Val Arg Thr Pro Lys Leu Thr Lys His Val His Ser Ile Gln Trp 520 525 530 gac aga acg aag cct cag gat gag gtg aag gcg gtc cag ctt gcc att 1686 Asp Arg Thr Lys Pro Gln Asp Glu Val Lys Ala Val Gln Leu Ala Ile 535 540 545 550 cag act ctg ttc tcc agc tca gag ggc aac cct ggc agc aga tcc gac 1734 Gln Thr Leu Phe Ser Ser Ser Glu Gly Asn Pro Gly Ser Arg Ser Asp 555 560 565 tcc agt gcg gac tgc caa tgg tta gac act ctg cgc atg cgg cag att 1782 Ser Ser Ala Asp Cys Gln Trp Leu Asp Thr Leu Arg Met Arg Gln Ile 570 575 580 gca tcc cac act tct cta cag cgt tcc caa agc aac cct atc ttg ggg 1830 Ala Ser His Thr Ser Leu Gln Arg Ser Gln Ser Asn Pro Ile Leu Gly 585 590 595 tct cct ttc ttc cct tac ttt gcc aac cag gat tcc tat gct gct gcg 1878 Ser Pro Phe Phe Pro Tyr Phe Ala Asn Gln Asp Ser Tyr Ala Ala Ala 600 605 610 gtg agg agg acc cag act ccg gtg aag tac cag cag att aca cca agc 1926 Val Arg Arg Thr Gln Thr Pro Val Lys Tyr Gln Gln Ile Thr Pro Ser 615 620 625 630 atc aac cct tcc cgg agc tcc tcc ccc acg cag tat ggg ctg tcc aga 1974 Ile Asn Pro Ser Arg Ser Ser Ser Pro Thr Gln Tyr Gly Leu Ser Arg 635 640 645 aac ttc tcc tcc ctg aac ctc agc tcc agg gac agc ggc ttc tcc agc 2022 Asn Phe Ser Ser Leu Asn Leu Ser Ser Arg Asp Ser Gly Phe Ser Ser 650 655 660 ctc aat gac agc tcc tcc gag agg ggc cgc tac tca gac cga agc aga 2070 Leu Asn Asp Ser Ser Ser Glu Arg Gly Arg Tyr Ser Asp Arg Ser Arg 665 670 675 aac aag tac tac cgt ggt agt gtg tcc ctc aat tct tcc ccg aaa gga 2118 Asn Lys Tyr Tyr Arg Gly Ser Val Ser Leu Asn Ser Ser Pro Lys Gly 680 685 690 aga tat ggt ggg aaa agt cag cat tcc aca cct tca aga gaa aga tat 2166 Arg Tyr Gly Gly Lys Ser Gln His Ser Thr Pro Ser Arg Glu Arg Tyr 695 700 705 710 tct gga aag ttc tac agg ctg ccc cag tca gcg ctg aac act cat cag 2214 Ser Gly Lys Phe Tyr Arg Leu Pro Gln Ser Ala Leu Asn Thr His Gln 715 720 725 tcc cct gac ttc aag agg agc cca aat gac cat gac cgc cgt gtg ccc 2262 Ser Pro Asp Phe Lys Arg Ser Pro Asn Asp His Asp Arg Arg Val Pro 730 735 740 agg acc ata ccc ggg atg cct ctg cac cct gag act gcc tcc aaa gca 2310 Arg Thr Ile Pro Gly Met Pro Leu His Pro Glu Thr Ala Ser Lys Ala 745 750 755 ggg gaa gag gag agc agg gtg agc gaa ggg ggc tgg act aaa gtg gaa 2358 Gly Glu Glu Glu Ser Arg Val Ser Glu Gly Gly Trp Thr Lys Val Glu 760 765 770 tat cgg aag aag aca cac agg caa ctt tcg gcc aag act agc aag gag 2406 Tyr Arg Lys Lys Thr His Arg Gln Leu Ser Ala Lys Thr Ser Lys Glu 775 780 785 790 aga acc cgt ggc aac tac cgt ggg cgg cgg aat ttt tga gggattgggt 2455 Arg Thr Arg Gly Asn Tyr Arg Gly Arg Arg Asn Phe 795 800 cagatgcgct tttccaagcg ggttagtagt gctttgtgca atggattttt ggtaataagg 2515 tatcttgagg ttatagggac caaaaaaaga ctagttctgg gcttgggaaa caccttttaa 2575 ctgaaaggac aaccaaagca gggcctcaat tatggctgtt agtcagtcaa ctagaggtgg 2635 caattaaact tgacaataac tgccaatgtt ttgtcccctg aattactatt gaggtgggga 2695 gggctatgac attgcctgct gggaacattc gagcaggctt ggggccagga taaagctagt 2755 gagaaccgca gaaaaatcat atttctggac aaaacaggat tcatctatct tctctttcat 2815 ctaagttcca agatggctct gcaaagcact gtggacgatt cttgagttaa aatttgtttt 2875 ttgattttgg ggttttgttt ttttttttta acctactggg ataaaatatc atttatcttg 2935 attgctgagg gattttttta aaatgcctcc ctaaatgttg tgcccaaggc aagtgcctca 2995 ctcatctcca ctgtgtcagt atttatttta gtgagatatt tgtgttttct gccatggtca 3055 gtattgaact gatttggctt gtcattttta ggtaataaaa aaaaagatta ttgaagttaa 3115 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 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Ile Asn Ser Asn Arg Ser Glu Glu Met 90 95 100 gac atg gaa cac atc atg acc tgg gcc act gac gta gcc aaa ggg atg 390 Asp Met Glu His Ile Met Thr Trp Ala Thr Asp Val Ala Lys Gly Met 105 110 115 cat tac tta cac atg gaa gct cct gtc aag gtg atc cac aga gac ctc 438 His Tyr Leu His Met Glu Ala Pro Val Lys Val Ile His Arg Asp Leu 120 125 130 aag tca aga aac gtt gtt atc gct gct gac gga gtg ctg aag atc tgt 486 Lys Ser Arg Asn Val Val Ile Ala Ala Asp Gly Val Leu Lys Ile Cys 135 140 145 150 gac ttc ggt gcc tcg cgg ttc cat aac cac aca aca cac atg tcc ttg 534 Asp Phe Gly Ala Ser Arg Phe His Asn His Thr Thr His Met Ser Leu 155 160 165 gtt gga act ttc cca tgg atg gct cca gaa gtt atc cag agt ctc cct 582 Val Gly Thr Phe Pro Trp Met Ala Pro Glu Val Ile Gln Ser Leu Pro 170 175 180 gtg tct gaa acc tgt gac acg tat tcc tat ggt gtg gtt ctc tgg gag 630 Val Ser Glu Thr Cys Asp Thr Tyr Ser Tyr Gly Val Val Leu Trp Glu 185 190 195 atg cta aca agg gag gtc ccc ttt aaa ggt ttg gaa gga tta caa gta 678 Met Leu Thr Arg Glu Val Pro Phe Lys Gly Leu Glu Gly Leu Gln Val 200 205 210 gct tgg ctt gta gtg gaa aaa aac gag aga tta acc att cca agc agc 726 Ala Trp Leu Val Val Glu Lys Asn Glu Arg Leu Thr Ile Pro Ser Ser 215 220 225 230 tgc ccc aga agc ttt gct gaa ctg cta cac cag tgt tgg gag gct gat 774 Cys Pro Arg Ser Phe Ala Glu Leu Leu His Gln Cys Trp Glu Ala Asp 235 240 245 gcc aag aaa cgg cca tcg ttc aag caa atc att tca atc ctg gag tct 822 Ala Lys Lys Arg Pro Ser Phe Lys Gln Ile Ile Ser Ile Leu Glu Ser 250 255 260 atg tca aat gac acg aac ctt cct gac cag tgt aac tca ttt tta cac 870 Met Ser Asn Asp Thr Asn Leu Pro Asp Gln Cys Asn Ser Phe Leu His 265 270 275 aac aag gcg gag tgg agg tgt gaa att gag gca acc ctt gag cga ctg 918 Asn Lys Ala Glu Trp Arg Cys Glu Ile Glu Ala Thr Leu Glu Arg Leu 280 285 290 aag aaa cta gag cga gat ctc agc ttt aaa gag cag gag ctc aaa gaa 966 Lys Lys Leu Glu Arg Asp Leu Ser Phe Lys Glu Gln Glu Leu Lys Glu 295 300 305 310 cgg gag aga cgt ctc aag atg tgg gag cag aag ctg acg gag caa tcc 1014 Arg Glu Arg Arg Leu Lys Met Trp Glu Gln Lys Leu Thr Glu Gln Ser 315 320 325 aac acc ccg ctt ctc ttg cct ctc tct gca aga atg tct gag gag tct 1062 Asn Thr Pro Leu Leu Leu Pro Leu Ser Ala Arg Met Ser Glu Glu Ser 330 335 340 tac ttt gaa tct aaa aca gag gag tca aac agt gca gag atg tca tgc 1110 Tyr Phe Glu Ser Lys Thr Glu Glu Ser Asn Ser Ala Glu Met Ser Cys 345 350 355 cag atc act gca gca agt aac ggg gag ggc cat ggc atg aac cca ggc 1158 Gln Ile Thr Ala Ala Ser Asn Gly Glu Gly His Gly Met Asn Pro Gly 360 365 370 ctg cag gcc atg atg ctc atg ggc ttt ggg gat gtc ttc tca atg aac 1206 Leu Gln Ala Met Met Leu Met Gly Phe Gly Asp Val Phe Ser Met Asn 375 380 385 390 aaa gca gga gct gtg ctg cat tct ggg atg cag ata aac atg caa gcc 1254 Lys Ala Gly Ala Val Leu His Ser Gly Met Gln Ile Asn Met Gln Ala 395 400 405 aag cag aat tca tcc aaa acc aca tgt aag agg aga ggg aag aaa gtc 1302 Lys Gln Asn Ser Ser Lys Thr Thr Cys Lys Arg Arg Gly Lys Lys Val 410 415 420 aac atg gcc ctg ggg ttc agt gac ttt gac ctg tca gaa ggt gac gat 1350 Asn Met Ala Leu Gly Phe Ser Asp Phe Asp Leu Ser Glu Gly Asp Asp 425 430 435 gat gac cat gat ggt gac gat gct gag aat gat gtg gat aat agt gaa 1398 Asp Asp His Asp Gly Asp Asp Ala Glu Asn Asp Val Asp Asn Ser Glu 440 445 450 tga caccagaaag gaaaaaaaaa aaaaaaaa 1429 455 <210> 5 <211> 800 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Met Ser Ser Leu Gly Ala Ser Phe Val Gln Ile Lys Phe Asp Asp Leu 1 5 10 15 Gln Phe Phe Glu Asn Cys Gly Gly Gly Ser Phe Gly Ser Val Tyr Arg 20 25 30 Ala Lys Trp Ile Ser Gln Asp Lys Glu Val Ala Val Lys Lys Leu Leu 35 40 45 Lys Ile Glu Lys Glu Ala Glu Ile Leu Ser Val Leu Ser His Arg Asn 50 55 60 Ile Ile Gln Phe Tyr Gly Val Ile Leu Glu Pro Pro Asn Tyr Gly Ile 65 70 75 80 Val Thr Glu Tyr Ala Ser Leu Gly Ser Leu Tyr Asp Tyr Ile Asn Ser 85 90 95 Asn Arg Ser Glu Glu Met Asp Met Asp His Ile Met Thr Trp Ala Thr 100 105 110 Asp Val Ala Lys Gly Met His Tyr Leu His Met Glu Ala Pro Val Lys 115 120 125 Val Ile His Arg Asp Leu Lys Ser Arg Asn Val Val Ile Ala Ala Asp 130 135 140 Gly Val Leu Lys Ile Cys Asp Phe Gly Ala Ser Arg Phe His Asn His 145 150 155 160 Thr Thr His Met Ser Leu Val Gly Thr Phe Pro Trp Met Ala Pro Glu 165 170 175 Val Ile Gln Ser Leu Pro Val Ser Glu Thr Cys Asp Thr Tyr Ser Tyr 180 185 190 Gly Val Val Leu Trp Glu Met Leu Thr Arg Glu Val Pro Phe Lys Gly 195 200 205 Leu Glu Gly Leu Gln Val Ala Trp Leu Val Val Glu Lys Asn Glu Arg 210 215 220 Leu Thr Ile Pro Ser Ser Cys Pro Arg Ser Phe Ala Glu Leu Leu His 225 230 235 240 Gln Cys Trp Glu Ala Asp Ala Lys Lys Arg Pro Ser Phe Lys Gln Ile 245 250 255 Ile Ser Ile Leu Glu Ser Met Ser Asn Asp Thr Ser Leu Pro Asp Lys 260 265 270 Cys Asn Ser Phe Leu His Asn Lys Ala Glu Trp Arg Cys Glu Ile Glu 275 280 285 Ala Thr Leu Glu Arg Leu Lys Lys Leu Glu Arg Asp Leu Ser Phe Lys 290 295 300 Glu Gln Glu Leu Lys Glu Arg Glu Arg Arg Leu Lys Met Trp Glu Gln 305 310 315 320 Lys Leu Thr Glu Gln Ser Asn Thr Pro Leu Leu Pro Ser Phe Glu Ile 325 330 335 Gly Ala Trp Thr Glu Asp Asp Val Tyr Xaa Trp Val Gln Gln Leu Val 340 345 350 Arg Lys Gly Asp Ser Ser Ala Glu Met Ser Val Tyr Ala Ser Leu Phe 355 360 365 Lys Glu Asn Asn Ile Thr Gly Lys Arg Leu Leu Leu Leu Glu Glu Glu 370 375 380 Asp Leu Lys Asp Met Gly Ile Val Ser Lys Gly His Ile Ile His Phe 385 390 395 400 Lys Ser Ala Ile Glu Lys Leu Thr His Asp Tyr Ile Asn Leu Phe His 405 410 415 Phe Pro Pro Leu Ile Lys Asp Ser Gly Gly Glu Pro Glu Glu Asn Glu 420 425 430 Glu Lys Ile Val Asn Leu Glu Leu Val Phe Gly Phe His Leu Lys Pro 435 440 445 Gly Thr Gly Pro Gln Asp Cys Lys Trp Lys Met Tyr Met Glu Met Asp 450 455 460 Gly Asp Glu Ile Ala Ile Thr Tyr Ile Lys Asp Val Thr Phe Asn Thr 465 470 475 480 Asn Leu Pro Asp Ala Glu Ile Leu Lys Met Thr Lys Pro Pro Phe Val 485 490 495 Met Glu Lys Trp Ile Val Gly Ile Ala Lys Ser Gln Thr Val Glu Cys 500 505 510 Thr Val Thr Tyr Glu Ser Asp Val Arg Thr Pro Lys Ser Thr Lys His 515 520 525 Val His Leu Ile Gln Trp Ser Arg Thr Lys Pro Gln Asp Glu Val Lys 530 535 540 Ala Val Gln Leu Ala Ile Gln Thr Leu Phe Thr Asn Ser Asp Gly Asn 545 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760 765 Thr Lys Val Glu Tyr Arg Lys Lys Pro His Arg Pro Ser Pro Ala Lys 770 775 780 Thr Asn Lys Glu Arg Ala Arg Gly Asp His Arg Gly Trp Arg Asn Phe 785 790 795 800 <210> 6 <211> 455 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Met Ser Ser Leu Gly Ala Ser Phe Val Gln Ile Lys Phe Asp Asp Leu 1 5 10 15 Gln Phe Phe Glu Asn Cys Gly Gly Gly Ser Phe Gly Ser Val Tyr Arg 20 25 30 Ala Lys Trp Ile Ser Gln Asp Lys Glu Val Ala Val Lys Lys Leu Leu 35 40 45 Lys Ile Glu Lys Glu Ala Glu Ile Leu Ser Val Leu Ser His Arg Asn 50 55 60 Ile Ile Gln Phe Tyr Gly Val Ile Leu Glu Pro Pro Asn Tyr Gly Ile 65 70 75 80 Val Thr Glu Tyr Ala Ser Leu Gly Ser Leu Tyr Asp Tyr Ile Asn Ser 85 90 95 Asn Arg Ser Glu Glu Met Asp Met Asp His Ile Met Thr Trp Ala Thr 100 105 110 Asp Val Ala Lys Gly Met His Tyr Leu His Met Glu Ala Pro Val Lys 115 120 125 Val Ile His Arg Asp Leu Lys Ser Arg Asn Val Val Ile Ala Ala Asp 130 135 140 Gly Val Leu Lys Ile Cys Asp Phe Gly Ala Ser Arg Phe His Asn His 145 150 155 160 Thr Thr His Met Ser Leu Val Gly Thr Phe Pro Trp Met Ala Pro Glu 165 170 175 Val Ile Gln Ser Leu Pro Val Ser Glu Thr Cys Asp Thr Tyr Ser Tyr 180 185 190 Gly Val Val Leu Trp Glu Met Leu Thr Arg Glu Val Pro Phe Lys Gly 195 200 205 Leu Glu Gly Leu Gln Val Ala Trp Leu Val Val Glu Lys Asn Glu Arg 210 215 220 Leu Thr Ile Pro Ser Ser Cys Pro Arg Ser Phe Ala Glu Leu Leu His 225 230 235 240 Gln Cys Trp Glu Ala Asp Ala Lys Lys Arg Pro Ser Phe Lys Gln Ile 245 250 255 Ile Ser Ile Leu Glu Ser Met Ser Asn Asp Thr Ser Leu Pro Asp Lys 260 265 270 Cys Asn Ser Phe Leu His Asn Lys Ala Glu Trp Arg Cys Glu Ile Glu 275 280 285 Ala Thr Leu Glu Arg Leu Lys Lys Leu Glu Arg Asp Leu Ser Phe Lys 290 295 300 Glu Gln Glu Leu Lys Glu Arg Glu Arg Arg Leu Lys Met Trp Glu Gln 305 310 315 320 Lys Leu Thr Glu Gln Ser Asn Thr Pro Leu Leu Leu Pro Leu Ala Ala 325 330 335 Arg Met Ser Glu Glu Ser Tyr Phe Glu Ser Lys Thr Glu Glu Ser Asn 340 345 350 Ser Ala Glu Met Ser Cys Gln Ile Thr Ala Thr Ser Asn Gly Glu Gly 355 360 365 His Gly Met Asn Pro Ser Leu Gln Ala Met Met Leu Met Gly Phe Gly 370 375 380 Asp Ile Phe Ser Met Asn Lys Ala Gly Ala Val Met His Ser Gly Met 385 390 395 400 Gln Ile Asn Met Gln Ala Lys Gln Asn Ser Ser Lys Thr Thr Ser Lys 405 410 415 Arg Arg Gly Lys Lys Val Asn Met Ala Leu Gly Phe Ser Asp Phe Asp 420 425 430 Leu Ser Glu Gly Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Gly Glu Glu Glu Asp 435 440 445 Asn Asp Met Asp Asn Ser Glu 450 455 <210> 7 <211> 802 <212> PRT <213> Mouse <400> 7 Met Ser Ser Leu Gly Ala Ser Phe Val Gln Ile Lys Phe Asp Asp Leu 1 5 10 15 Gln Phe Phe Glu Asn Cys Gly Gly Gly Ser Phe Gly Ser Val Tyr Arg 20 25 30 Ala Lys Trp Ile Ser Gln Asp Lys Glu Val Ala Val Lys Lys Leu Leu 35 40 45 Lys Ile Glu Lys Glu Ala Glu Ile Leu Ser Val Leu Ser His Arg Asn 50 55 60 Ile Ile Gln Phe Tyr Gly Val Ile Leu Glu Pro Pro Asn Tyr Gly Ile 65 70 75 80 Val Thr Glu Tyr Ala Ser Leu Gly Ser Leu Tyr Asp Tyr Ile Asn Ser 85 90 95 Asn Arg Ser Glu Glu Met Asp Met Glu His Ile Met Thr Trp Ala Thr 100 105 110 Asp Val Ala Lys Gly Met His Tyr Leu His Met Glu Ala Pro Val Lys 115 120 125 Val Ile His Arg Asp Leu Lys Ser Arg Asn Val Val Ile Ala Ala Asp 130 135 140 Gly Val Leu Lys Ile Cys Asp Phe Gly Ala Ser Arg Phe His Asn His 145 150 155 160 Thr Thr His Met Ser Leu Val Gly Thr Phe Pro Trp Met Ala Pro Glu 165 170 175 Val Ile Gln Ser Leu Pro Val Ser Glu Thr Cys Asp Thr Tyr Ser Tyr 180 185 190 Gly Val Val Leu Trp Glu Met Leu Thr Arg Glu Val Pro Phe Lys Gly 195 200 205 Leu Glu Gly Leu Gln Val Ala Trp Leu Val Val Glu Lys Asn Glu Arg 210 215 220 Leu Thr Ile Pro Ser Ser Cys Pro Arg Ser Phe Ala Glu Leu Leu His 225 230 235 240 Gln Cys Trp Glu Ala Asp Ala Lys Lys Arg Pro Ser Phe Lys Gln Ile 245 250 255 Ile Ser Ile Leu Glu Ser Met Ser Asn Asp Thr Asn Leu Pro Asp Gln 260 265 270 Cys Asn Ser Phe Leu His Asn Lys Ala Glu Trp Arg Cys Glu Ile Glu 275 280 285 Ala Thr Leu Glu Arg Leu Lys Lys Leu Glu Arg Asp Leu Ser Phe Lys 290 295 300 Glu Gln Glu Leu Lys Glu Arg Glu Arg Arg Leu Lys Met Trp Glu Gln 305 310 315 320 Lys Leu Thr Glu Gln Ser Asn Thr Pro Leu Leu Pro Ser Phe Glu Ile 325 330 335 Gly Ala Trp Thr Glu Asp Asp Val Tyr Phe Trp Val Gln Gln Leu Val 340 345 350 Arg Lys Gly Glu Ser Ser Val Glu Met Ser Gly Tyr Ala Ser Leu Phe 355 360 365 Lys Glu Asn Asn Ile Thr Gly Lys Arg Leu Leu Leu Leu Glu Glu Glu 370 375 380 Asp Leu Lys Asp Met Gly Ile Val Ser Lys Gly His Ile Ile His Phe 385 390 395 400 Lys Ser Ala Ile Glu Lys Leu Thr His Asp Tyr Leu Asn Leu Phe His 405 410 415 Phe Pro Pro Leu Ile Lys Asp Ser Gly Gly Glu Pro Glu Glu Asn Glu 420 425 430 Glu Lys Ile Val Asn Leu Glu Leu Val Phe Gly Phe His Leu Lys Pro 435 440 445 Gly Thr Gly Pro Gln Asp Cys Lys Trp Lys Met Tyr Met Glu Met Asp 450 455 460 Gly Asp Glu Val Ala Ile Thr Tyr Ile Lys Asp Val Thr Phe Asn Thr 465 470 475 480 Ser Leu Pro Asp Ala Glu Ile Leu Lys Met Thr Lys Pro Pro Phe Val 485 490 495 Met Glu Lys Trp Ile Val Gly Ile Ala Glu Asp Gln Thr Val Glu Cys 500 505 510 Thr Val Thr Tyr Glu Asn Asp Val Arg Thr Pro Lys Leu Thr Lys His 515 520 525 Val His Ser Ile Gln Trp Asp Arg Thr Lys Pro Gln Asp Glu Val Lys 530 535 540 Ala Val Gln Leu Ala Ile Gln Thr Leu Phe Ser Ser Ser Glu Gly Asn 545 550 555 560 Pro Gly Ser Arg Ser Asp Ser Ser Ala Asp Cys Gln Trp Leu Asp Thr 565 570 575 Leu Arg Met Arg Gln Ile Ala Ser His Thr Ser Leu Gln Arg Ser Gln 580 585 590 Ser Asn Pro Ile Leu Gly Ser Pro Phe Phe Pro Tyr Phe Ala Asn Gln 595 600 605 Asp Ser Tyr Ala Ala Ala Val Arg Arg Thr Gln Thr Pro Val Lys Tyr 610 615 620 Gln Gln Ile Thr Pro Ser Ile Asn Pro Ser Arg Ser Ser Ser Pro Thr 625 630 635 640 Gln Tyr Gly Leu Ser Arg Asn Phe Ser Ser Leu Asn Leu Ser Ser Arg 645 650 655 Asp Ser Gly Phe Ser Ser Leu Asn Asp Ser Ser Ser Glu Arg Gly Arg 660 665 670 Tyr Ser Asp Arg Ser Arg Asn Lys Tyr Tyr Arg Gly Ser Val Ser Leu 675 680 685 Asn Ser Ser Pro Lys Gly Arg Tyr Gly Gly Lys Ser Gln His Ser Thr 690 695 700 Pro Ser Arg Glu Arg Tyr Ser Gly Lys Phe Tyr Arg Leu Pro Gln Ser 705 710 715 720 Ala Leu Asn Thr His Gln Ser Pro Asp Phe Lys Arg Ser Pro Asn Asp 725 730 735 His Asp Arg Arg Val Pro Arg Thr Ile Pro Gly Met Pro Leu His Pro 740 745 750 Glu Thr Ala Ser Lys Ala Gly Glu Glu Glu Ser Arg Val Ser Glu Gly 755 760 765 Gly Trp Thr Lys Val Glu Tyr Arg Lys Lys Thr His Arg Gln Leu Ser 770 775 780 Ala Lys Thr Ser Lys Glu Arg Thr Arg Gly Asn Tyr Arg Gly Arg Arg 785 790 795 800 Asn Phe <210> 8 <211> 454 <212> PRT <213> Mouse <400> 8 Met Ser Ser Leu Gly Ala Ser Phe Val Gln Ile Lys Phe Asp Asp Leu 1 5 10 15 Gln Phe Phe Glu Asn Cys Gly Gly Gly Ser Phe Gly Ser Val Tyr Arg 20 25 30 Ala Lys Trp Ile Ser Gln Asp Lys Glu Val Ala Val Lys Lys Leu Leu 35 40 45 Lys Ile Glu Lys Glu Ala Glu Ile Leu Ser Val Leu Ser His Arg Asn 50 55 60 Ile Ile Gln Phe Tyr Gly Val Ile Leu Glu Pro Pro Asn Tyr Gly Ile 65 70 75 80 Val Thr Glu Tyr Ala Ser Leu Gly Ser Leu Tyr Asp Tyr Ile Asn Ser 85 90 95 Asn Arg Ser Glu Glu Met Asp Met Glu His Ile Met Thr Trp Ala Thr 100 105 110 Asp Val Ala Lys Gly Met His Tyr Leu His Met Glu Ala Pro Val Lys 115 120 125 Val Ile His Arg Asp Leu Lys Ser Arg Asn Val Val Ile Ala Ala Asp 130 135 140 Gly Val Leu Lys Ile Cys Asp Phe Gly Ala Ser Arg Phe His Asn His 145 150 155 160 Thr Thr His Met Ser Leu Val Gly Thr Phe Pro Trp Met Ala Pro Glu 165 170 175 Val Ile Gln Ser Leu Pro Val Ser Glu Thr Cys Asp Thr Tyr Ser Tyr 180 185 190 Gly Val Val Leu Trp Glu Met Leu Thr Arg Glu Val Pro Phe Lys Gly 195 200 205 Leu Glu Gly Leu Gln Val Ala Trp Leu Val Val Glu Lys Asn Glu Arg 210 215 220 Leu Thr Ile Pro Ser Ser Cys Pro Arg Ser Phe Ala Glu Leu Leu His 225 230 235 240 Gln Cys Trp Glu Ala Asp Ala Lys Lys Arg Pro Ser Phe Lys Gln Ile 245 250 255 Ile Ser Ile Leu Glu Ser Met Ser Asn Asp Thr Asn Leu Pro Asp Gln 260 265 270 Cys Asn Ser Phe Leu His Asn Lys Ala Glu Trp Arg Cys Glu Ile Glu 275 280 285 Ala Thr Leu Glu Arg Leu Lys Lys Leu Glu Arg Asp Leu Ser Phe Lys 290 295 300 Glu Gln Glu Leu Lys Glu Arg Glu Arg Arg Leu Lys Met Trp Glu Gln 305 310 315 320 Lys Leu Thr Glu Gln Ser Asn Thr Pro Leu Leu Leu Pro Leu Ser Ala 325 330 335 Arg Met Ser Glu Glu Ser Tyr Phe Glu Ser Lys Thr Glu Glu Ser Asn 340 345 350 Ser Ala Glu Met Ser Cys Gln Ile Thr Ala Ala Ser Asn Gly Glu Gly 355 360 365 His Gly Met Asn Pro Gly Leu Gln Ala Met Met Leu Met Gly Phe Gly 370 375 380 Asp Val Phe Ser Met Asn Lys Ala Gly Ala Val Leu His Ser Gly Met 385 390 395 400 Gln Ile Asn Met Gln Ala Lys Gln Asn Ser Ser Lys Thr Thr Cys Lys 405 410 415 Arg Arg Gly Lys Lys Val Asn Met Ala Leu Gly Phe Ser Asp Phe Asp 420 425 430 Leu Ser Glu Gly Asp Asp Asp Asp His Asp Gly Asp Asp Ala Glu Asn 435 440 445 Asp Val Asp Asn Ser Glu 450
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ０７Ｋ 16/40 Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｃ１２Ｑ 1/02 1/68 Ａ 1/68 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ Ｇ０１Ｎ 33/15 33/50 Ｚ 33/50 33/53 Ｄ 33/53 Ｍ 33/573 Ａ 33/573 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (72)発明者 泰地 睦夫 大阪府大阪市此花区春日出中３丁目１番98 号 住友製薬株式会社内 Ｆターム(参考） 2G045 AA25 AA40 BA13 BB20 CB01 DA12 DA13 DA14 DA20 DA36 DA77 FB01 FB02 FB03 4B024 AA11 CA04 CA09 CA11 CA12 CA20 DA02 FA10 GA11 GA18 HA12 4B063 QA01 QA05 QA18 QA19 QQ03 QQ08 QQ13 QQ20 QQ27 QQ42 QQ52 QR56 QR62 QR66 QR77 QR80 QS16 QS24 QS36 QX02 4C084 AA13 AA17 BA35 CA18 NA14 ZC33 ZC35 4H045 AA11 BA10 DA75 EA50

Claims (20)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】配列番号1乃至4のいずれかに示されるMLTK
    遺伝子の塩基配列中の連続する少なくとも15塩基を有す
    るポリヌクレオチドおよび／または該ポリヌクレオチド
    に相補的なポリヌクレオチドである糖・脂質代謝異常疾
    患の疾患マーカー。
  2. 【請求項2】糖・脂質代謝異常疾患の検出においてプロ
    ーブまたはプライマーとして使用される請求項1に記載
    の疾患マーカー。
  3. 【請求項3】配列番号5乃至8のいずれかに示されるアミ
    ノ酸配列よりなるMLTK蛋白質を認識する抗体である糖・
    脂質代謝異常疾患の疾患マーカー。
  4. 【請求項4】糖・脂質代謝異常疾患の検出においてプロ
    ーブとして使用される請求項3に記載の疾患マーカー。
  5. 【請求項5】下記の工程(a)、(b)および(c)を含む糖・脂
    質代謝異常疾患の検出方法： (a) 被験者の生体試料から調製されたRNAまたは該RNAか
    ら転写された相補的ポリヌクレオチドと請求項1または2
    に記載の疾患マーカーとを結合させる工程、(b) 該疾患
    マーカーに結合した生体試料由来のRNAまたは該RNAから
    転写された相補的ポリヌクレオチドを、上記疾患マーカ
    ーを指標として測定する工程、(c) 上記(b)の測定結果
    に基づいて、糖・脂質代謝異常疾患の罹患を判断する工
    程。
  6. 【請求項6】工程(c)における糖・脂質代謝異常疾患の罹
    患の判断が、被験者について得られる測定結果を正常者
    について得られる測定結果と対比して、疾患マーカーへ
    の結合量が増大していることを指標として行われる請求
    項5に記載の糖・脂質代謝異常疾患の検出方法。
  7. 【請求項7】下記の工程(a)、(b)および(c)を含む糖・脂
    質代謝異常疾患の検出方法： (a) 被験者の生体試料から調製された蛋白質と請求項3
    または4に記載の疾患マーカーとを結合させる工程、(b)
    該疾患マーカーに結合した生体試料由来の蛋白質また
    はその部分ペプチドを、上記疾患マーカーを指標として
    測定する工程、(c) 上記(b)の測定結果に基づいて、糖
    ・脂質代謝異常疾患の罹患を判断する工程。
  8. 【請求項8】工程(c)における糖・脂質代謝異常疾患の罹
    患の判断が、被験者について得られる測定結果を正常者
    について得られる測定結果と対比して、疾患マーカーへ
    の結合量が増大していることを指標として行われる請求
    項7に記載の糖・脂質代謝異常疾患の検出方法。
  9. 【請求項9】下記の工程(a)、(b)および(c)を含むMLTK遺
    伝子の発現を抑制する物質のスクリーニング方法： (a) 被験物質とMLTK遺伝子を発現可能な細胞とを接触さ
    せる工程、(b) 被験物質を接触させた細胞のMLTK遺伝子
    の発現量を測定し、該発現量を被験物質を接触させない
    対照細胞の上記遺伝子の発現量と比較する工程、(c) 上
    記(b)の比較結果に基づいて、MLTK遺伝子の発現量を減
    少させる被験物質を選択する工程。
  10. 【請求項10】下記の工程(a)、(b)および(c)を含むMLTK
    蛋白質の発現量を低下させる物質のスクリーニング方
    法： (a)被験物質とMLTK蛋白質を発現可能な細胞または該細
    胞から調製した細胞画分とを接触させる工程、(b)被験
    物質を接触させた細胞または細胞画分におけるMLTK蛋白
    質の発現量を測定し、該発現量を被験物質を接触させな
    い対照細胞もしくは細胞画分における上記MLTK蛋白質の
    発現量と比較する工程、(c)上記(b)の比較結果に基づい
    て、MLTK蛋白質の発現量を低下させる被験物質を選択す
    る工程。
  11. 【請求項11】下記の工程(a)、(b)および(c)を含むMLTK
    蛋白質の機能または活性を抑制する物質のスクリーニン
    グ方法： (a)被験物質とMLTK蛋白質を含む水溶液、細胞または該
    細胞から調製した細胞画分とを接触させる工程、(b)被
    験物質を接触させた水溶液、細胞または細胞画分におけ
    るMLTK蛋白質の機能または活性を測定し、該機能または
    活性を被験物質を接触させない対照水溶液、対照細胞ま
    たは対照細胞画分における上記MLTK蛋白質の機能または
    活性と比較する工程、(c)上記(b)の比較結果に基づい
    て、MLTK蛋白質の機能または活性を抑制する被験物質を
    選択する工程。
  12. 【請求項12】下記の工程(a)、(b)および(c)を含むMLTK
    蛋白質の機能または活性を抑制する物質のスクリーニン
    グ方法： (a)被験物質の存在下および非存在下でMLTK遺伝子を発
    現可能な細胞を培養する工程、(b)被験物質の存在下に
    おける細胞培養物中のリン酸化MAPキナーゼ量を測定
    し、該測定値を被験物質の非存在下における細胞培養液
    中のリン酸化MAPキナーゼ量と比較する工程、(c)上記
    (b)の比較結果に基づいて、MLTK蛋白質の機能または活
    性を抑制する被験物質を選択する工程。
  13. 【請求項13】MLTK遺伝子を発現可能な細胞が、筋筒細
    胞、脂肪細胞または心筋細胞である、請求項12に記載の
    スクリーニング方法。
  14. 【請求項14】下記の工程(a)、(b)および(c)を含むMLTK
    蛋白質の機能または活性を抑制する物質のスクリーニン
    グ方法： (a)MLTK遺伝子を発現可能な細胞にMAPキナーゼにより制
    御されるレポーター遺伝子を導入し、該細胞を被験物質
    の存在下および非存在下で培養する工程、(b)被験物質
    の存在下で培養した細胞培養物中のレポーター遺伝子発
    現産物の量を測定し、該量を被験物質の非存在下で培養
    した細胞培養物中のレポーター遺伝子発現産物の量と比
    較する工程、(c)上記(b)の比較結果に基づいて、MLTK蛋
    白質の機能または活性を抑制する被験物質を選択する工
    程。
  15. 【請求項15】MLTK遺伝子を発現可能な細胞が、MLTK遺伝
    子を導入した発現ベクターを保有する哺乳動物細胞であ
    る、請求項14に記載のスクリーニング方法。
  16. 【請求項16】糖・脂質代謝異常疾患の予防、改善または
    治療剤の有効成分を探索するための方法である、請求項
    9乃至15のいずれかに記載のスクリーニング方法。
  17. 【請求項17】MLTK遺伝子の発現を抑制する物質を有効成
    分とする糖・脂質代謝異常疾患の予防、改善または治療
    剤。
  18. 【請求項18】MLTK遺伝子の発現を抑制する物質が請求項
    9に記載のスクリーニング法により得られるものである
    請求項17に記載の糖・脂質代謝異常疾患の予防、改善ま
    たは治療剤。
  19. 【請求項19】MLTK蛋白質の発現量、機能または活性を抑
    制する物質を有効成分とする糖・脂質代謝異常疾患の予
    防、改善または治療剤。
  20. 【請求項20】MLTK蛋白質の発現量、機能または活性を抑
    制する物質が、請求項10乃至15のいずれかに記載のスク
    リーニング方法により得られるものである、請求項19に
    記載の糖・脂質代謝異常疾患の予防、改善または治療
    剤。
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