CN102618545B - 与人癌细胞的永生化相关的基因及其应用 - Google Patents

与人癌细胞的永生化相关的基因及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供与癌细胞永生化相关的基因(永生化规定基因)以及对将具有该基因的永生化癌细胞作为靶标的选择性癌治疗有用的方法。使用与序列编号1～13中的任一个所示的碱基序列内的至少15个碱基长的连续碱基序列特异性杂交、且具有15个碱基长以上的碱基序列的多核苷酸，判断永生化癌细胞。该多核苷酸在该判断方法中，作为用于检测在永生化癌细胞中特异性地高度表达的永生化规定基因的引物、探针来使用。

Description

与人癌细胞的永生化相关的基因及其应用
本申请是于2008年12月5日进入中国国家阶段的申请号为200780020862.9的PCT发明申请的分案申请，母案的发明名称为“与人癌细胞的永生化相关的基因及其应用”，其相应的国际申请号为PCT/JP2007/061652，其要求于2006年6月9日提交的申请号为2006-161350的日本专利申请的优先权，上述申请的全部内容完全结合于此作为参考。
技术领域
本发明涉及与癌细胞的永生化相关的基因(永生化规定基因)以及对以具有该基因的永生化癌细胞为靶标的选择性癌治疗有用的方法。更具体而言，本发明涉及以永生化规定基因为指标的永生化癌细胞的判断方法、以及该判断中使用的试剂。本发明还涉及筛选以永生化癌细胞为靶标的选择性抗癌剂(永生化癌细胞增殖抑制剂)的有效成分的方法、以及该抗癌剂(永生化癌细胞增殖抑制剂)。
背景技术
人实体癌除非进行根治手术，否则就会预后不良，其主要原因是因为目前的化学疗法效果并不充分。以往的化学疗法药物以核酸合成过程、DNA、微管为作用点，以抑制从核酸至蛋白质生成过程为基本，因此不仅对癌细胞进行抑制，也无法避免对进行细胞增殖的再生性组织正常细胞的抑制。最近，逐渐鉴定出在癌细胞中特异性表达的分子，以其为靶标的抑制剂能够使对正常细胞的有害反应止于最小限度，其结果是给药量也能够增大。对这样的分子靶标治疗药也进行了开发，但其最大的缺点是，并非对大多病例有效，而是因各个病例的不同而效果不同，给药前所进行的预测是不完全的。作为分子靶标治疗药的效果因各个病例而大不相同的原因，可以举出被作为治疗靶标的分子是与癌症发生过程、转移相关的基因。癌症发生过程不仅因癌类型的不同而不同，即使在同类型癌中也是多种多样的，因此可以认为，作为靶标的分子与癌增殖相关的程度因各个病例而不同。因此，如果能鉴定出无论癌类型而普遍地发挥核心作用的分子，就可以开发出能够期待对多种癌症具有普遍效果的分子靶标治疗药。
包括人在内的所有脊椎动物的染色体的两末端连续有称为“TTAGGG”的简单重复序列(人中约为10kb，小鼠约为数倍)，在每次伴随细胞分裂的DNA复制时不能完全复制末端而每次少量(人中约为200碱基)缩短。该末端结构为“端粒”，当端粒随着细胞分裂而缩短至一定(人非癌细胞中约为5kb)以下时，细胞就已经变得无法分裂。如果癌化则能够继续分裂，但如果端粒缩短到极限(约2kb)，则细胞消亡。通过将该缩短的端粒延长而稳定保持端粒长度能够延长细胞分裂寿命的是逆转录酶“端粒酶”(参照非专利文献1)，该端粒酶不在通常的正常体细胞中表达，因此能够分裂的次数仅限于数十次，而在能够无限增殖的生殖细胞和永生化癌细胞中高度表达。以往普遍认为癌细胞均永生化，但由如下的情况，即，存在即使是临床上明显的癌也未必检测出端粒酶活性的例子(参照非专利文献2和3等)；即便使端粒酶成分TERT在非癌细胞中强制表达，也不显现癌细胞的性状(参照非专利文献4)等情况，目前认为癌化与永生化是不同的现象。
非专利文献1：Harley CB，Mutation Res，256：271-82，1991
非专利文献2：Kim NW等，Science 266：2011-5，1994
非专利文献3：Hiyama K等，J Natl Cancer Inst 87：895-902，1995
非专利文献4：Morales CP等，Nat Genet 21：115-8，1999
非专利文献5：Shay JW，Bacchetti S，Eur J Cancer 33：787-91，1997
非专利文献6：Hiyama K等，J Immunol 155：3711-5，1995
非专利文献7：Hiyama E等，Int J Oncol 9：453-8，1996
非专利文献8：Forsyth NR等，Aging Cell 2：235-43，2003
非专利文献9：Bodnar AG等，Exp Cell Res 228：58-64，1996
非专利文献10：Hiyama K等，Int J Oncol 27：87-95，2005
发明内容
本发明涉及永生化癌细胞的判断方法、以及该判断中使用的试剂。本发明还涉及筛选具有特异性抑制永生化癌细胞的增殖的作用、且作为选择性抗癌剂而有用的永生化癌细胞增殖抑制剂的有效成分的方法以及该永生化癌细胞增殖抑制剂。
本发明人等致力于能够期待对癌治疗、尤其是普遍对多种癌病例具有效果的分子靶标治疗药的开发，着眼于与癌细胞的癌化(恶性化)性状不同的另一性状“永生化”。即，即使体内出现癌细胞，只要抑制无限增殖，则不仅不会增大、转移直至使宿主死亡，而且还可以期待通过采用通常的化学疗法、非根治性手术来减少一定程度残留的癌细胞数，从而使在其再次增大之前分裂寿命耗尽而自然消亡。由如下的情况等，即，在迄今为止检测的数千样本中临床癌样本的80％以上表达端粒酶(参照非专利文献5)；在迄今为止检测的所有癌类型中均确认了端粒酶的表达；来源于人癌的细胞株几乎全部都表达端粒酶(参照非专利文献2)；一度表达了端粒酶的癌细胞不能自然转为阴性等情况，从而可以认为，与多种多样的癌症发生过程不同，该永生化过程是在多数癌细胞中极普遍地共有存在的过程。即，通过将规定永生化的分子作为靶标，能够期待无论癌类型而普遍对多数病例有效的癌的无限增殖抑制成为可能。在此意义上，也尝试了以端粒酶本身为靶标的抗癌战略。
然而，本发明人等由如下的情况等，即，已发现即使是正常体细胞，在再生性组织的前体细胞、淋巴细胞中也检测出了端粒酶活性(参照非专利文献6和7)；而且即便使端粒酶成分TERT在非癌细胞中强制表达，也未必会永生化(参照非专利文献8)；表达端粒酶的正常前体细胞、淋巴细胞也并非永生化，而仅是延长寿命(参照非专利文献6和9)等情况，从而表明，仅凭端粒酶的表达细胞并不能永生化。即，要使人细胞永生化，延长染色体末端端粒的酶即端粒酶的活化几乎是必须的，但却并不充分，除了端粒酶活化之外，还存在永生化所不可或缺的分子，可以设想该分子在癌细胞中特异性地发挥作用。事实上，本发明人等确认，在正常体细胞中导入TERT而使端粒酶强制表达从而永生化的克隆中，特异性地表达变化的基因与已报道的癌细胞中的表达变化完全不同(参照非专利文献10)。由这样的事实也可以说与正常细胞的永生化和癌细胞的永生化相关的基因是不同的。如果以端粒酶本身作为靶标，则淋巴细胞、血液前体细胞和消化道粘膜隐窝细胞等的分裂能力受到抑制，作为癌治疗的有害现象而致命的免疫功能、造血功能和消化道功能受损害的危险性高，但如果以仅在癌细胞中起作用的永生化规定因子作为靶标，则可以认为能够在不损害端粒酶活性阳性的正常干/前体细胞、淋巴细胞等的功能的情况下进行癌细胞特异性无限增殖的抑制。
在该见解的基础上，本发明人等为了发现与人癌细胞的永生化普遍相关的基因进行了悉心研究。其结果是想到，该基因与正常细胞中基于端粒酶活化而延续生命无关，而是对癌细胞的增殖维持起特异性作用，从而特定了该永生化规定基因13个基因(参照表1)。其概要如下。首先，将无论癌类型而普遍表达增强的基因通过基因芯片分析而提取出来，从得到的基因中，选择如下的13种基因，即，在由永生化的癌细胞构成的临床癌组织中，比由未永生化的癌细胞构成的癌组织的表达水平表达增强，并且在正常细胞中导入端粒酶而使其表达的细胞中表达未增强的基因。然后，在永生化癌细胞内通过siRNA来抑制得到的13种基因的表达，确认永生化癌细胞的增殖均得到了抑制。
本发明人等在上述见解的基础上进一步进行了反复研究，结果完成了本发明。即，本发明具有下述方式。
第1项.一种用于判断癌细胞的永生化的基因标记，由多核苷酸构成，该多核苷酸与序列编号1～13中任一个所示的碱基序列内的至少15个碱基长的连续碱基序列特异性杂交、且具有15个碱基长以上的碱基序列。
第2项.根据第1项所述的用于判断癌细胞的永生化的基因标记，是探针或引物。
第3项.一种永生化癌细胞的判断方法，包括下述工序(1)～(3)：
(1)使RNA或该RNA的衍生物与第1或2项中任一项所述的基因标记结合的工序，其中，所述RNA由从被测者采集的能够含有癌细胞的机体试样制备；
(2)以上述基因标记为指标测定与上述基因标记结合的RNA或其衍生物的量；
(3)将上述工序(2)中得到的RNA或该RNA的衍生物的量(以下，将其总称为“RNA量”)与未永生化的正常或癌细胞中相应的RNA或该RNA衍生物的量(以下，将其总称为“对照RNA量”)进行比较的工序。
第4项.根据第3项所述的永生化癌细胞的判断方法，还包括下述工序(4)：
(4)当工序(2)的RNA量比对照RNA量高时，判断为被测者的癌细胞永生化，当不高时，判断为被测者的癌细胞未永生化的工序。
第5项.一种抗体，识别由序列编号14～26中任一个所示的氨基酸序列构成的多肽。该抗体优选用于判断癌细胞的永生化。
第6项.一种永生化癌细胞的判断方法，包括下述工序(1’)～(3’)：
(1’)使含有多肽的蛋白质含有级分与第5项所述的抗体结合的工序，其中，所述含有多肽的蛋白质含有级分由从被测者采集的能够含有癌细胞的机体试样制备；
(2’)以该抗体为指标测定与所述抗体结合的多肽的量的工序；
(3’)将上述工序(2’)中得到的多肽量与未永生化的正常或癌细胞中相应的多肽量(以下，称为“对照多肽量”)进行比较的工序。
第7项.根据第6项所述的永生化癌细胞的判断方法，还包括下述工序(4’)：
(4’)当工序(2’)的多肽量比对照多肽量高时，判断为被测者的癌细胞永生化，当不高时，判断为被测者的癌细胞未永生化的工序。
第8项.一种永生化癌细胞判断用试剂盒，含有选自第1项所述的基因标记和第5项所述的抗体中的至少1种作为永生化细胞判断用试剂。
第9项.一种抑制永生化癌细胞增殖的物质的筛选方法，包括下述工序(A)～(D)：
(A)使被测物质与能够表达由序列编号1～13中任一个所示的碱基序列构成的基因的细胞接触的工序；
(B)对于与被测物质接触的细胞，测定由序列编号1～13中任一个所示的碱基序列构成的基因的表达量的工序；
(C)将上述工序(B)中得到的基因的表达量与未与被测物质接触的对照细胞中相应的基因的表达量进行比较的工序；以及
(D)当上述工序(B)中得到的基因的表达量比对照表达量低时，选择该被测物质作为抑制永生化癌细胞增殖的物质的工序。
第10项.一种抑制永生化癌细胞增殖的物质的筛选方法，包括下述工序(A’)～(D’)：
(A’)使被测物质与由序列编号14～26中任一个所示的氨基酸序列构成的多肽接触的工序；
(B’)测定与被测物质接触的由序列编号14～26中任一个所示的氨基酸序列构成的多肽的活性的工序；
(C’)将上述工序(B’)中得到的多肽的活性与未与被测物质接触的对照的活性进行比较的工序；
(D’)当上述工序(B’)中得到的多肽的活性比对照的活性低时，选择该被测物质作为抑制永生化癌细胞增殖的物质的工序。
第11项.一种永生化癌细胞增殖抑制剂，以多核苷酸作为有效成分，该多核苷酸与序列编号1～13中任一个所示的碱基序列的至少15个碱基长以上的连续碱基序列特异性杂交、且由15个碱基以上的碱基序列构成。
第12项.根据第11项所述的永生化癌细胞增殖抑制剂，所述多核苷酸是由序列编号27～76中任一个所示的碱基序列构成的多核苷酸。
第13项.一种抗癌疗法，具有将第11或12项所述的永生化癌细胞增殖抑制剂导入患者的癌细胞中的工序。
第14项.一种多核苷酸在制造永生化癌细胞增殖抑制剂中的应用，该多核苷酸与序列编号1～13中的任一个所示的碱基序列的至少15个碱基长以上的连续碱基序列特异性杂交、且具有15个碱基以上的碱基序列。
第15项.根据第14项所述的应用，所述多核苷酸是由序列编号27～76中任一个所示的碱基序列构成的多核苷酸。
根据本发明，弄清了在多数癌类型中，在永生化癌细胞中特异性地表达增强、且无论癌类型而普遍地控制癌细胞的永生化的基因。根据本发明的永生化癌细胞的判断方法以及在该判断方法中使用的试剂，能够识别该永生化规定基因的表达程度，并由该程度鉴别用通常的病理诊断无法判断的永生化细胞和有限寿命细胞。而且根据该鉴别，在癌的早期诊断、治疗选择、预后预测中的临床应用成为可能。
根据本发明的以永生化规定基因作为靶标的筛选方法，还能够得到能够特异性抑制永生化癌细胞增殖的抗癌剂的有效成分。
附图说明
图1是表示人细胞的癌化永生化的机制的概略图。
图2是表示在本发明中进行的靶标基因提取方法的概略图。
图3表示基于寡阵列的各种永生化癌细胞的UBE2S基因的表达水平。
图4表示基于寡阵列的各种永生化癌细胞的RFC4基因的表达水平。
图5表示基于寡阵列的各种永生化癌细胞的PTGES2基因的表达水平。
图6表示基于寡阵列的各种永生化癌细胞的MAF1基因的表达水平。
图7表示基于寡阵列的各种永生化癌细胞的ACVR2B基因的表达水平。
图8表示基于寡阵列的各种永生化癌细胞的FAM119A基因的表达水平。
图9表示基于寡阵列的各种永生化癌细胞的LTB4DH基因的表达水平。
图10表示基于寡阵列的各种永生化癌细胞的DPM2基因的表达水平。
图11表示基于寡阵列的各种永生化癌细胞的SEPX1基因的表达水平。
图12表示基于寡阵列的各种永生化癌细胞的PSMA3基因的表达水平。
图13表示基于寡阵列的各种永生化癌细胞的CHCHD3基因的表达水平。
图14表示基于寡阵列的各种永生化癌细胞的LSM3基因的表达水平。
图15表示基于寡阵列的各种永生化癌细胞的GTSE1基因的表达水平。
图16表示癌细胞株中基于siRNA的UBE2S基因的表达抑制及其增殖抑制效果(实施例2)。
图17表示癌细胞株中基于siRNA的RFC4基因的表达抑制及其增殖抑制效果(实施例2)。
图18表示癌细胞株中基于siRNA的PTGES2基因的表达抑制及其增殖抑制效果(实施例2)。
图19表示癌细胞株中基于siRNA的MAF1基因的表达抑制及其增殖抑制效果(实施例2)。
图20表示癌细胞株中基于siRNA的ACVR2B基因的表达抑制及其增殖抑制效果(实施例2)。
图21表示癌细胞株中基于siRNA的FAM119A基因的表达抑制及其增殖抑制效果(实施例2)。
图22表示癌细胞株中基于siRNA的LTB4DH基因的表达抑制及其增殖抑制效果(实施例2)。
图23表示癌细胞株中基于siRNA的DPM2基因的表达抑制及其增殖抑制效果(实施例2)。
图24表示癌细胞株中基于siRNA的SEPX1基因的表达抑制及其增殖抑制效果(实施例2)。
图25表示癌细胞株中基于siRNA的PSMA3基因的表达抑制及其增殖抑制效果(实施例2)。
图26表示癌细胞株中基于siRNA的CHCHD3基因的表达抑制及其增殖抑制效果(实施例2)。
图27表示癌细胞株中基于siRNA的LSM3基因的表达抑制及其增殖抑制效果(实施例2)。
图28表示癌细胞株中基于siRNA的GTSE1基因的表达抑制及其增殖抑制效果(实施例2)。
序列编号27表示与UBE2S基因相关的siRNA-1(44-64)的有义链的碱基序列。
序列编号28表示与UBE2S基因相关的siRNA-1(146-166)的有义链的碱基序列。
序列编号29表示与UBE2S基因相关的siRNA-2的有义链的碱基序列。
序列编号30表示与UBE2S基因相关的siRNA-3的有义链的碱基序列。
序列编号31表示与RFC4基因相关的siRNA-1(897-917)的有义链的碱基序列。
序列编号32表示与RFC4基因相关的siRNA-1(189-209)的有义链的碱基序列。
序列编号33表示与RFC4基因相关的siRNA-2的有义链的碱基序列。
序列编号34表示与RFC4基因相关的siRNA-3的有义链的碱基序列。
序列编号35表示与PTGES2基因相关的siRNA-1(2003-2023)的有义链的碱基序列。
序列编号36表示与PTGES2基因相关的siRNA-1(1105-1125)的有义链的碱基序列。
序列编号37表示与PTGES2基因相关的siRNA-2的有义链的碱基序列。
序列编号38表示与PTGES2基因相关的siRNA-3的有义链的碱基序列。
序列编号39表示与MAF1基因相关的siRNA-1(1538-1558)的有义链的碱基序列。
序列编号40表示与MAF1基因相关的siRNA-1(1031-1051)的有义链的碱基序列。
序列编号41表示与MAF1基因相关的siRNA-2的有义链的碱基序列。
序列编号42表示与MAF1基因相关的siRNA-3的有义链的碱基序列。
序列编号43表示与ACVR2B基因相关的siRNA-1(626-646)的有义链的碱基序列。
序列编号44表示与ACVR2B基因相关的siRNA-1(208-228)的有义链的碱基序列。
序列编号45表示与ACVR2B基因相关的siRNA-2的有义链的碱基序列。
序列编号46表示与ACVR2B基因相关的siRNA-3的有义链的碱基序列。
序列编号47表示与FAM119A基因相关的siRNA-1(754-774)的有义链的碱基序列。
序列编号48表示与FAM119A基因相关的siRNA-1(1068-1088)的有义链的碱基序列。
序列编号49表示与FAM119A基因相关的siRNA-2的有义链的碱基序列。
序列编号50表示与FAM119A基因相关的siRNA-3的有义链的碱基序列。
序列编号51表示与LTB4DH基因相关的siRNA-1(775-795)的有义链的碱基序列。
序列编号52表示与LTB4DH基因相关的siRNA-1(658-678)的有义链的碱基序列。
序列编号53表示与LTB4DH基因相关的siRNA-2的有义链的碱基序列。
序列编号54表示与LTB4DH基因相关的siRNA-3的有义链的碱基序列。
序列编号55表示与DPM2基因相关的siRNA-1(145-165)的有义链的碱基序列。
序列编号56表示与DPM2基因相关的siRNA-1(84-104)的有义链的碱基序列。
序列编号57表示与DPM2基因相关的siRNA-2的有义链的碱基序列。
序列编号58表示与DPM2基因相关的siRNA-3的有义链的碱基序列。
序列编号59表示与SEPX1基因相关的siRNA-1(870-890)的有义链的碱基序列。
序列编号60表示与SEPX1基因相关的siRNA-1(794-814)的有义链的碱基序列。
序列编号61表示与SEPX1基因相关的siRNA-2的有义链的碱基序列。
序列编号62表示与SEPX1基因相关的siRNA-3的有义链的碱基序列。
序列编号63表示与PSMA3基因相关的siRNA-1(853-873)的有义链的碱基序列。
序列编号64表示与PSMA3基因相关的siRNA-1(686-706)的有义链的碱基序列。
序列编号65表示与PSMA3基因相关的siRNA-2的有义链的碱基序列。
序列编号66表示与PSMA3基因相关的siRNA-3的有义链的碱基序列。
序列编号67表示与CHCHD3基因相关的siRNA-1(546-566)的有义链的碱基序列。
序列编号68表示与CHCHD3基因相关的siRNA-1(1450-1470)的有义链的碱基序列。
序列编号69表示与CHCHD3基因相关的siRNA-2的有义链的碱基序列。
序列编号70表示与CHCHD3基因相关的siRNA-3的有义链的碱基序列。
序列编号71表示与LSM3基因相关的siRNA-1(540-560)的有义链的碱基序列。
序列编号72表示与LSM3基因相关的siRNA-1(37-57)的有义链的碱基序列。
序列编号73表示与LSM3基因相关的siRNA-2的有义链的碱基序列。
序列编号74表示与LSM3基因相关的siRNA-3的有义链的碱基序列。
序列编号75表示与GTSE1基因相关的siRNA-2的有义链的碱基序列。
序列编号76表示与GTSE1基因相关的siRNA-3的有义链的碱基序列。
具体实施方式
(1)永生化规定基因
本发明中，所谓“未永生化癌细胞”，是指癌细胞中，(1)端粒酶活性为阴性、(2)端粒长度缩短、且(3)不能确认端粒酶蛋白的表达的有限寿命细胞。另一方面，本发明中，所谓“永生化癌细胞”，是指癌细胞中，不具有上述(1)～(3)中的至少一项特征的细胞，即，是指端粒酶活性为阳性、或者端粒长度延长、或者能够确认端粒酶蛋白的表达的细胞，是能够无限地进行细胞增殖的细胞。
本发明中，所谓“永生化规定基因”，是指规定癌细胞的永生化的基因。
作为本发明对象的癌细胞没有特别限制，作为其来源，可以列举例如肺癌、乳癌、食道癌、头颈部癌、胃癌、结肠癌、直肠癌、肝癌、胆囊、胆管癌、胰腺癌、膀胱癌、前列腺癌、子宫颈癌等。
作为永生化规定基因，具体来说，可以列举(1)UBE2S基因、(2)RFC4基因、(3)PTGES2基因、(4)MAF1基因、(5)ACVR2B基因、(6)FAM119A基因、(7)LTB4DH基因、(8)DPM2基因、(9)SEPX1基因、(10)PSMA3基因、(11)CHCHD3基因、(12)LSM3基因以及(13)GTSE1基因，这些基因的基因库登记号、正式的基因名、基因符号以及表示这些基因的碱基序列的序列编号示于下述表1。此外，表中的基因名、基因符号等根据NCBI中互联网公开(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)的数据来记载。
[表1]
如实施例1所示，上述各种永生化规定基因均在来源于肺癌、食道癌和乳癌等多种癌类型的永生化癌细胞中特异性地高度表达。此外，如实施例2所示，在永生化细胞内通过siRNA来抑制这13种基因的表达，则永生化癌细胞的增殖均得到抑制。由这些结果可以认为，上述13种永生化规定基因均为规定癌细胞的永生化的基因(永生化规定基因)。
(II)用于判断癌细胞的永生化的试剂(基因标记)
如上所述，由于由序列编号1～13所示的碱基序列构成的各永生化规定基因((1)～(13))均在来源于多种癌类型的永生化癌细胞中特异性地高度表达，因此通过将其作为指标(标记基因)，可以判断癌细胞永生化的有无。
本发明提供为了判断所述癌细胞的永生化而优选使用的工具(试剂)，作为永生化规定基因标记(在本发明中，省略称为“基因标记”)。该基因标记以与上述序列编号1～13中任一个所示的永生化规定基因的碱基序列内的至少15个碱基长的连续碱基序列特异性杂交的方式，设计为具有至少15个碱基长的多核苷酸。此外，本发明的基因标记的方式可以根据目的进行适当设定，可以是单链DNA、单链RNA、双链DNA、双链RNA和DNA:RNA杂合体中的任一种。
该基因标记包括在判断永生化癌细胞时对检测癌细胞中的永生化规定基因的表达的有无、其程度(表达量)有用的探针、引物。此外，这些探针、引物在筛选抑制永生化癌细胞的增殖的物质时，作为检测永生化规定基因的表达变化的工具(检测试剂)也是有用的。
(II-1)探针
癌细胞的永生化的判断通过检测在永生化癌细胞中特异性地高度表达的上述永生化规定基[(1)UBE2S基因、(2)RFC4基因、(3)PTGES2基因、(4)MAF1基因、(5)ACVR2B基因、(6)FAM119A基因、(7)LTB4DH基因、(8)DPM2基因、(9)SEPX1基因、(10)PSMA3基因、(11)CHCHD3基因、(12)LSM3基因或(13)GTSE1基因]中的至少任一个来进行。
为了检测出这些永生化规定基因，将与这些各基因的碱基序列特异性地杂交、而能够特异性地检测出该永生化规定基因的多核苷酸作为探针使用。此外，在本发明中，术语“多核苷酸”中还包括由多个碱基序列构成的寡核苷酸。
该多核苷酸以与各永生化规定基因的碱基序列内的至少15个碱基长～各永生化规定基因的总碱基长、优选20个碱基长～各永生化规定基因的总碱基长、更优选30个碱基长～各永生化规定基因的总碱基长的连续碱基序列特异性杂交的方式，设计为具有与上述对应的碱基长的多核苷酸。
本说明书通篇、及权利要求书中，所谓“特异性杂交”，是指在严谨杂交条件下，形成特异性的杂合体，不形成非特异性的杂合体。严谨杂交条件可以根据按照常法形成杂合体的核酸的熔解温度(Tm)等来确定。作为具体的能够维持杂交状态的洗净条件，可以列举通常为“1×SSC、0.1％SDS、37℃”程度的条件，更严格为“0.5×SSC、0.1％SDS、42℃”程度的条件，进一步严格为“0.1×SSC、0.1％SDS、65℃”程度的条件。
此外，多核苷酸(探针)优选具有与上述永生化规定基因的至少15个碱基长的连续碱基序列互补的碱基序列，但只要能够进行上述特异性杂交即可，不必完全互补。作为该多核苷酸，优选的是，与由永生化规定基因的碱基序列中连续的至少15个碱基以上的碱基序列构成的多核苷酸或其互补多核苷酸相比，在碱基序列中具有70％以上、优选80％以上、更优选90％以上、进一步优选95％以上、特别优选98％以上的同源性的多核苷酸。这里，碱基序列的同源性可以用同源性检索、序列比对程序、BLAST、FASTA、Clustal W等进行计算。
作为本发明采用为对象的探针，具体来说，可以列举与选自下述(1)～(13)中的至少1个多核苷酸(其中，该多核苷酸为RNA时，序列中的碱基“t”替换为“u”)进行杂交、且由15个碱基长～各永生化规定基因的总碱基长、优选20个碱基长～各永生化规定基因的总碱基长、更优选30个碱基长～各永生化规定基因的总碱基长的连续碱基序列构成的寡或多核苷酸。
(1)由UBE2S基因的碱基序列(序列编号1)中15个碱基长以上的连续碱基序列构成的多核苷酸、
(2)由RFC4基因的碱基序列(序列编号2)中15个碱基长以上的连续碱基序列构成的多核苷酸、
(3)由PTGES2基因的碱基序列(序列编号3)中15个碱基长以上的连续碱基序列构成的多核苷酸、
(4)由MAF1基因的碱基序列(序列编号4)中15个碱基长以上的连续碱基序列构成的多核苷酸、
(5)由ACVR2B基因的碱基序列(序列编号5)中15个碱基长以上的连续碱基序列构成的多核苷酸、
(6)由FAM119A基因的碱基序列(序列编号6)中15个碱基长以上的连续碱基序列构成的多核苷酸、
(7)由LTB4DH基因的碱基序列(序列编号7)中15个碱基长以上的连续碱基序列构成的多核苷酸、
(8)由DPM2基因的碱基序列(序列编号8)中15个碱基长以上的连续碱基序列构成的多核苷酸、
(9)由SEPX1基因的碱基序列(序列编号9)中15个碱基长以上的连续碱基序列构成的多核苷酸、
(10)由PSMA3基因的碱基序列(序列编号10)中15个碱基长以上的连续碱基序列构成的多核苷酸、
(11)由CHCHD3基因的碱基序列(序列编号11)中15个碱基长以上的连续碱基序列构成的多核苷酸、
(12)由LSM3基因的碱基序列(序列编号12)中15个碱基长以上的连续碱基序列构成的多核苷酸、
(13)由GTSE1基因的碱基序列(序列编号13)中15个碱基长以上的连续碱基序列构成的多核苷酸。
此外，这些多核苷酸(探针)可以基于各永生化规定基因的碱基序列，使用例如市售的核苷酸合成机，按照常法进行制备。还可以将永生化规定基因的碱基序列作为模板，用PCR法进行制备。
进而优选的是，为了能够容易地检测出各永生化规定基因，该探针可以用放射性物质、荧光物质、化学发光物质、或酶进行标记(详细内容后述)。
此外，这些探针还可以固定化于任意的固相来使用。因此，本发明采用为对象的探针中，还包括将上述多核苷酸固定化于任意的固相的探针(例如将探针固定化的基因芯片、cDNA微阵列、寡DNA阵列、滤膜等)。该探针可以优选作为永生化规定基因检测用、即永生化癌细胞检测用的DNA芯片来利用。
上述探针(多核苷酸)的固定化中使用的固相，只要能够将多核苷酸固定化就没有特别限制，可以列举例如玻璃板、尼龙膜、微珠、硅片、毛细管或其它基板等。多核苷酸向固相的固定可以是使预先合成的多核苷酸置于固相上的方法，还可以是在固相上合成目标多核苷酸的方法。固定方法，例如为DNA微阵列时，利用市售的点样仪(COSMOBIO公司制等)等，根据固定化探针的种类而在该技术领域为公知[例如，采用光刻技术(Affymetrix公司)、喷墨技术(Rosetta Inpharmatics公司)的多核苷酸的原位合成等]。
(II-2)引物
本发明作为基因标记提供作为用于特异性地扩增各永生化规定基因的碱基序列区域的引物而使用的多核苷酸。
作为该多核苷酸，可以列举如下的多核苷酸，即，与选自下述(1)～(13)中至少1个的多核苷酸(其中，该多核苷酸为RNA时，序列中的碱基“t”替换为“u”)的一部分特异性地杂交，用于特异性地扩增该多核苷酸或其一部分区域，且由15个碱基长、优选15～100个碱基长、更优选15～50个碱基长、进一步优选15～35个碱基长的连续碱基序列构成。
(1)由UBE2S基因的碱基序列(序列编号1)中15个碱基长以上的连续碱基序列构成的多核苷酸、
(2)由RFC4基因的碱基序列(序列编号2)中15个碱基长以上的连续碱基序列构成的多核苷酸、
(3)由PTGES2基因的碱基序列(序列编号3)中15个碱基长以上的连续碱基序列构成的多核苷酸、
(4)由MAF1基因的碱基序列(序列编号4)中15个碱基长以上的连续碱基序列构成的多核苷酸、
(5)由ACVR2B基因的碱基序列(序列编号5)中15个碱基长以上的连续碱基序列构成的多核苷酸、
(6)由FAM119A基因的碱基序列(序列编号6)中15个碱基长以上的连续碱基序列构成的多核苷酸、
(7)由LTB4DH基因的碱基序列(序列编号7)中15个碱基长以上的连续碱基序列构成的多核苷酸、
(8)由DPM2基因的碱基序列(序列编号8)中15个碱基长以上的连续碱基序列构成的多核苷酸、
(9)由SEPX1基因的碱基序列(序列编号9)中15个碱基长以上的连续碱基序列构成的多核苷酸、
(10)由PSMA3基因的碱基序列(序列编号10)中15个碱基长以上的连续碱基序列构成的多核苷酸、
(11)由CHCHD3基因的碱基序列(序列编号11)中15个碱基长以上的连续碱基序列构成的多核苷酸、
(12)由LSM3基因的碱基序列(序列编号12)中15个碱基长以上的连续碱基序列构成的多核苷酸、
(13)由GTSE1基因的碱基序列(序列编号13)中15个碱基长以上的连续碱基序列构成的多核苷酸。
这样的多核苷酸(引物)与探针同样，优选具有与上述各永生化规定基因的至少15个碱基长的连续碱基序列互补的碱基序列，但只要能够进行上述特异性杂交即可，不必完全互补。作为该多核苷酸，优选的是，与具有永生化规定基因的碱基序列中连续的至少15个碱基以上的碱基序列的多核苷酸或其互补多核苷酸相比，在碱基序列中具有70％以上、优选80％以上、更优选90％以上、进一步优选95％以上、特别优选98％以上的同源性的多核苷酸。
此外，这些多核苷酸与探针同样，可以基于上述各永生化规定基因的碱基序列，使用市售的核苷酸合成机，按照常法进行制备。
(II-3)标记物
上述本发明的基因标记(探针或引物)中，包括在上述多核苷酸中添加有用于检测永生化规定基因的适当的标记物，例如荧光色素、酶、蛋白质、放射性同位素、化学发光物质、生物素等的基因标记。
例如，作为在本发明中使用的荧光色素、放射性同位素或化学发光物质等标记物，可以优选使用一般标记核苷酸并在核酸的检测、定量中使用的标记物。例如，作为荧光色素，可以列举，HEX(4，7，2’，4’，5’，7’-hexachloro-6-carboxylfluorescein、绿色荧光色素)、荧光素(fluorescein)、NED(商品名、Applied Biosystems公司制、黄色荧光色素)、或者6-FAM(商品名、Applied Biosystems公司制、黄绿色荧光色素)、若丹明(rhodamin)或其衍生物〔例如、四甲基若丹明(TMR)〕，但不限于这些。用荧光色素标记核苷酸的方法可以使用公知的标记法中适当的方法[参照Nature Biotechnology，14，303-308(1996)]。此外，还可以使用市售的荧光标记试剂盒(例如，AmershamPharmacia公司制寡核苷酸ECL 3’-oligo labeling system等)。
以上的基因标记(未标记或标记的探针或引物)可以用作永生化规定基因检测用试剂，换言之即永生化癌细胞检测用试剂。
(II-4)永生化癌细胞检测用试剂盒
本发明还将上述永生化癌细胞检测用试剂[基因标记(未标记或标记的探针或引物)]作为试剂盒而提供。该试剂盒作为上述探针或引物使用。含有未标记或标记的多核苷酸(另外它们也可以固定化于固相)中的至少1个。本发明的试剂盒除了上述基因标记(探针或引物)之外，根据需要还可以适当含有杂交用试剂、探针的标记、标记体检测剂、缓冲液等、实施后述的本发明方法所必须的试剂、器具等。
(III)永生化癌细胞的判断方法
(III-1)通过使用上述本发明的基因标记(探针或引物)，可以对从被测者采集的癌细胞测定永生化规定基因(标记基因)的表达量，进而，可以基于该表达量来判断该癌细胞为“永生化癌细胞”或“未永生化癌细胞”。用以往的病理诊断无法判定永生化癌细胞，但根据本发明的永生化癌细胞的判断方法，能够判断即使是进展前的早期的永生化癌细胞，由此能够尽早促成适于患者的癌治疗。
这时，上述本发明的引物用作用于特异性地识别并扩增由上述永生化规定基因的表达而生成的RNA或由其制备的多核苷酸(例如，cDNA)的引物，而本发明的探针用作用于特异性地检测该RNA或由其衍生的多核苷酸(例如cDNA或由RNA、cDNA扩增的DNA)的探针。
即，本发明的基因标记(探针或引物)可以用作用于通过称为RNA印迹法、RT-PCR法、原位杂交法等的特异性地检测特定基因的公知方法，来特异性地检测永生化规定基因的引物和探针。此外，癌细胞中永生化规定基因的表达量可以使用DNA芯片进行检测或定量。这时，本发明的探针可以作为该DNA芯片的探针来使用。
例如，采用RNA印迹法的永生化规定基因的表达量的测定可以通过使用本发明的探针、优选经放射性同位素、荧光物质或化学发光物质等标记物标记的探针来进行。具体来说，将由被测者的癌细胞制备的RNA转移至尼龙膜等中，使经标记的探针与其杂交。然后，将形成的探针与RNA的双链的量以来源于该探针的标记物的信号进行测定。信号的测定可以根据探针的标记物而采用常法，例如可以用放射性检测器、荧光检测器等测定来进行。此外，还可以利用市售的RNA印迹法用试剂盒，按照该试剂盒的方案进行。
此外，采用RT-PCR法的永生化规定基因的表达量的测定可以通过使用本发明的引物、优选经放射性同位素、荧光物质或化学发光物质等标记物标记的引物来进行。具体来说，将由被测者的癌细胞制备的RNA所制备的cDNA作为模板，使经标记的一对引物与其杂交，根据常法进行PCR。然后，将得到的扩增双链DNA的量以来源于该引物的标记的信号进行测定。信号的检测可以采用常法，例如用放射性检测器、荧光检测器等测定来进行。此外，还可以利用市售的RT-PCR用试剂盒，按照该试剂盒的方案进行。
采用DNA芯片分析的永生化规定基因的表达量的测定，可以通过使用本发明的探针，优选经放射性同位素、荧光物质等标记物标记的探针来进行。具体来说，首先，准备使经放射性同位素、荧光物质或化学发光物质等标记的探针固定在适当的载体上而成的DNA芯片。然后，使基于由被测者的癌细胞制备的RNA所制备的标记DNA或RNA与该DNA芯片杂交。然后，将形成的探针与标记DNA或RNA的双链的量以来源于该探针的标记物的信号进行测定。信号的检测可以采用常法，例如用放射性检测器、荧光检测器等测定而进行。此外，只要是固定有与本发明的探针相当的DNA的DNA芯片，也可以使用市售的DNA芯片。
这些永生化规定基因的表达量的测定基本上具有下述工序(1)和(2)。
(1)使由从被测者采集的能够含有癌细胞的机体试样制备的RNA或该RNA的衍生物与本发明的探针或引物结合的工序；
(2)以该探针或引物为指标测定与探针或引物结合的RNA或该RNA的衍生物的量的工序。
此外，在上述工序(1)中，机体试样是被测者本身的试样，只要是有可能含有癌细胞的试样就没有特别限制，可以例示体液(血液、尿等)、组织、其提取物和采集的组织的培养物等。此外，机体试样的采集方法可以根据机体试样的种类、癌类型相应的方法来适当进行选择。由机体试样制备RNA可以通过常法来进行。
此外，本说明书通篇、及权利要求书中，所谓“RNA衍生物”，是指以由机体试样制备的RNA为原料而制备的物质，包括由RNA转录制备的互补多核苷酸(cDNA)、以及由该RNA或cDNA通过PCR法而扩增的DNA。cDNA可以通过常法来制备，而上述DNA可以通过对上述各永生化规定基因使用本发明的引物进行PCR来制备。此外，工序(1)中使用的本发明的探针或引物优选经放射性同位素、荧光物质或化学发光物质等标记物进行标记。
上述工序(2)中得到的RNA或该RNA的衍生物的量反映被测者的永生化规定基因的表达量。因此，通过将上述工序(2)中得到的RNA或该RNA的衍生物的量(以下，也将这些总称而简单地称为“RNA量”)与未永生化的正常或癌细胞中相应的RNA或该RNA的衍生物的量(以下，也将这些总称而简单地称为“对照RNA量”)进行比较，能够判断被测者的癌细胞是否永生化。即，上述工序(2)中得到的被测者的RNA量(永生化规定基因的表达量)比对照RNA量(对照的永生化规定基因的表达量)高时，可以判断为被测者的癌细胞永生化，不高时可以判断为被测者的癌细胞未永生化。
因此，本发明的永生化癌细胞的判断方法除了上述工序(1)和(2)之外，还包括下述的工序(3)，更优选包括工序(4)。
(3)将上述工序(2)中得到的RNA或该RNA的衍生物的量(RNA量)与未永生化的正常或癌细胞中相应的RNA或该RNA的衍生物的量(对照RNA量)进行比较的工序；
(4)工序(2)的RNA量比对照RNA量高时，判断为被测者的癌细胞永生化，RNA量不比对照RNA量高时，判断为被测者的癌细胞未永生化的工序。
此外，未永生化的正常或癌细胞中的永生化规定基因的RNA量(对照RNA量)，可以在均一条件下预先测定多个未永生化的正常细胞或癌细胞中的永生化规定基因的RNA量，采用该RNA量的平均值或中间值。
(III-2)此外，癌细胞的永生化的判断可以基于本发明的永生化规定基因的表达产物、即由该基因所编码的多肽(以下，称为“永生化规定多肽”)的产量来进行。该永生化规定多肽的产量可以通过使用识别该多肽的抗体来进行测定。
这里，作为本发明采用为对象的永生化规定多肽，可以列举与上述的各种永生化规定基因[(1)～(13)]对应的下述多肽。
(14)UBE2S多肽：由序列编号1所示的碱基序列构成的UBE2S基因(1)所编码的多肽，具体为由序列编号14所示的氨基酸序列构成的多肽；
(15)RFC4多肽：由序列编号2所示的碱基序列构成的RFC4基因(2)所编码的多肽，具体为由序列编号15所示的氨基酸序列构成的多肽；
(16)PTGES2多肽：由序列编号3所示的碱基序列构成的PTGES2基因(3)所编码的多肽，具体为由序列编号16所示的氨基酸序列构成的多肽；
(17)MAF1多肽：由序列编号4所示的碱基序列构成的MAF1基因(4)所编码的多肽，具体为由序列编号17所示的氨基酸序列构成的多肽；
(18)ACVR2B多肽：由序列编号5所示的碱基序列构成的ACVR2B基因(5)所编码的多肽，具体为由序列编号18所示的氨基酸序列构成的多肽；
(19)FAM119A多肽：由序列编号6所示的碱基序列构成的FAM119A基因(6)所编码的多肽，具体为由序列编号19所示的氨基酸序列构成的多肽；
(20)LTB4DH多肽：由序列编号7所示的碱基序列构成的LTB4DH基因(7)所编码的多肽，具体为由序列编号20所示的氨基酸序列构成的多肽；
(21)DPM2多肽：由序列编号8所示的碱基序列构成的DPM2基因(8)所编码的多肽，具体为由序列编号21所示的氨基酸序列构成的多肽；
(22)SEPX1多肽：由序列编号9所示的碱基序列构成的SEPX1基因(9)所编码的多肽，具体为由序列编号22所示的氨基酸序列构成的多肽；
(23)PSMA3多肽：由序列编号10所示的碱基序列构成的PSMA3基因(10)所编码的多肽，具体为由序列编号23所示的氨基酸序列构成的多肽；
(24)CHCHD3多肽：由序列编号11所示的碱基序列构成的CHCHD3基因(11)所编码的多肽，具体为由序列编号24所示的氨基酸序列构成的多肽；
(25)LSM3多肽：由序列编号12所示的碱基序列构成的LSM3基因(12)所编码的多肽，具体为由序列编号25所示的氨基酸序列构成的多肽；
(26)GTSE1多肽：由序列编号13所示的碱基序列构成的GTSE1基因(13)所编码的多肽，具体为由序列编号26所示的氨基酸序列构成的多肽。
这里，(14)UBE2S多肽是公知的多肽，其获得方法也如J.Biol.Chem.267(22)，15829-15835(1992)中所记载而公知。同样地，(15)RFC4多肽也如Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.89(12)，5211-5215(1992)中所记载而公知，以下，(16)PTGES2多肽如Biochem.Biophys.Res.Commun.291(4)，884-889(2002)；(18)ACVR2B多肽如Mol.Cell Biol.16(3)，1066-1073(1996)；(20)LTB4DH多肽如J.Biol.Chem.271(5)，2844-2850(1996)；(21)DPM2多肽如EMBOJ.19(11)，2475-2482(2000)；(22)SEPX1多肽如J.Biol.Chem.274(48)，33888-33897(1999)；(23)PSMA3多肽如Biochem.Biophys.Res.Commun.207(1)，318-323(1995)；(25)LSM3多肽如EMBOJ.18(12)，3451-3462(1999)；(26)GTSE1多肽如Gene 254(1-2)，229-236(2000)中所记载，均为公知的多肽。
此外，这些永生化规定多肽[(14)～(26)]也可以如下进行制备，即，克隆对应的永生化规定基因[(1)～(13)]，与细菌质粒进行连接后，向大肠杆菌等宿主细胞进行转化，培养得到的转化细胞，从培养物中进行回收。
本发明中使用的抗体只要是识别上述永生化规定多肽的抗体就没有特别限制，可以是单克隆抗体和多克隆抗体中的任一种。此外，抗体可以是以上述永生化规定多肽为免疫抗原而制备的抗体，还可以是对由构成该永生化规定多肽的氨基酸序列中的至少连续8个氨基酸、优选15个氨基酸、更优选20个氨基酸构成的多肽具有抗原结合性的抗体。该多肽可以根据本发明的永生化规定多肽的氨基酸序列、编码其的碱基序列，用通常公知的方法进行合成。例如，可以例举采用氨基酸合成机的化学合成方法、基因工程学的方法。
本发明的抗体可以通过常法制造(例如，Current protocols inMolecular Biology edit.Ausubel et al.(1987)，Publish.John Wiley andSons.Section 11.12-11.13)。例如，为多克隆抗体时，可以如下得到，即，使用按照常法在大肠杆菌中表达而纯化的上述多肽，或者使用按照常法以具有这些的部分氨基酸序列的方式合成的多肽，对实验动物进行免疫，由该免疫动物的血清按照常法得到。另一方面，例如为单克隆抗体时，可以如下得到，即，使用按照常法在大肠杆菌等中表达而纯化的上述多肽，或者使用按照常法以具有这些的部分氨基酸序列的方式合成的多肽，对实验动物进行免疫，使由该实验动物得到的脾细胞和骨髓瘤细胞融合而合成杂交瘤细胞，从该细胞中得到。
此外，这些抗体还可以含有用于判断上述癌细胞的永生化的试剂和试剂盒的一成分。
永生化癌细胞的判断具体可以通过下述工序(1’)～(2’)进行。
(1’)将由从被测者采集的能够含有癌细胞的机体试样制备的含有多肽的蛋白质含有级分和识别本发明的永生化规定多肽的抗体混合的工序；
(2’)以该抗体为指标测定与上述抗体结合的多肽的量的工序。
此外，上述工序(2’)中得到的多肽的量反映永生化规定多肽的产生量。
在上述工序(2’)中，机体试样是被测者本身的试样，只要是有可能含有癌细胞的试样就没有特别限制，可以例示体液(血液、尿等)、组织、其提取物和采集的组织的培养物等。此外，机体试样的采集方法可以根据与机体试样的种类、癌类型相应的方法来适当进行选择。由机体试样制备蛋白质含有级分(含有多肽)，可以将公知的分离、纯化方法适当组合来进行。在对该蛋白质含有级分进行的例如蛋白质印迹法、酶免疫法(EIA)、放射免疫法(RIA)、荧光免疫法等免疫学的检测方法时，通过使用上述抗体作为探针，能够检测出永生化规定多肽。
以使用蛋白质印迹法测定多肽量(永生化规定多肽的产生量)的情况为例，对工序(1’)及(2’)详细进行说明，首先，将该永生化规定多肽的抗体作为一次抗体，与由被测者的机体试样制备的蛋白质含有级分混合，与该蛋白质含有级分中含有的永生化规定多肽结合。然后，使经放射性同位素、荧光物质或化学发光物质等标记物标记的二次抗体与一次抗体结合。接着，将永生化规定多肽的量作为来源于二次抗体的标记的信号进行测定。信号的检测可以采用常法，例如用放射性检测器、荧光检测器等测定而进行。
通过将上述工序(2’)中得到的被测者中的多肽量(永生化规定多肽的产生量)与未永生化的正常或癌细胞中相应的多肽量(对照多肽量)(即，对照的永生化规定多肽的产生量(对照产生量))进行比较，并识别其程度，从而能够判断被测者的癌细胞是否永生化。即，上述工序(2’)中得到的被测者中的多肽量(永生化规定多肽的产生量)比对照多肽量(对照产生量)高时，判断为被测者的癌细胞永生化，不高时判断为被测者的癌细胞未永生化。
因此，本发明的永生化癌细胞的判断方法，除了上述工序(1’)和(2’)之外，还包括下述的工序(3)，更优选包括工序(4)。
(3’)将上述工序(2’)中得到的多肽量与未永生化的正常或癌细胞中相应的多肽量(对照多肽量)进行比较的工序；
(4’)上述工序(2’)的多肽量比对照多肽量高时，判断为被测者的癌细胞永生化，不高时，判断为被测者的癌细胞未永生化的工序。
在此，作为未永生化的正常或癌细胞中的永生化规定多肽的产生量，可以在均一条件下预先测定多个未永生化的正常细胞或癌细胞中的永生化规定多肽的产生量，采用该产生量的平均值或中间值。
(IV)永生化癌细胞增殖抑制剂的筛选方法
(IV-1)如实施例所示，本发明的永生化规定基因((1)～(13))在永生化癌细胞中特异性地高度表达，而且，通过使用该各永生化规定基因的siRNA来抑制其表达，能够抑制永生化癌细胞的增殖。这一情况显示，具有抑制永生化规定基因((1)～(13))的表达的作用的物质，能够成为永生化癌细胞增殖抑制剂(抗癌剂)。即，通过将上述的永生化规定基因((1)～(13))的表达抑制作为指标，能够筛选具有抑制永生化癌细胞增殖的作用的物质。
因此，本发明提供以上述永生化规定基因((1)～(13))的表达抑制作为指标的永生化癌细胞增殖抑制剂的筛选方法。
该方法可以具有下述工序(A)～(D)。
(A)使被测物质与能够表达(1)～(13)中的任一个永生化规定基因的细胞接触的工序；
(B)测定与被测物质接触的细胞中该永生化规定基因的表达量的工序；
(C)将上述工序(B)中得到的永生化规定基因的表达量与未与被测物质接触的细胞中该永生化规定基因的表达量(对照表达量)进行比较的工序；
(D)当上述工序(B)中得到的基因的表达量比对照表达量低时，选择该被测物质作为抑制永生化癌细胞增殖的物质的工序。
本发明中使用的细胞只要能够表达上述(1)～(13)中的至少任一种永生化规定基因，就可以是来源于任意组织的细胞，作为其来源，可以列举例如肺、胃、结肠、直肠、肝、胆囊、胆管、胰腺、肾、膀胱、前列腺、子宫、骨髓、淋巴结、血液等。细胞的来源可以是哺乳类或鸟类中的任一种，更优选哺乳类，进一步优选人。此外，永生化规定基因的表达可以是内原性也可以是外源性。
作为被测物质没有特别限制，可以是核酸(包括多核苷酸)、肽(包括多肽)、有机化合物、无机化合物等中的任一种。筛选可以具体通过使被测物质或含有该被测物质的试样(被测试样)与能够表达上述永生化规定基因的细胞接触而进行。作为该被测试样，包括细胞提取液、基因文库的表达产物、植物或动物的天然物的提取物等。
此外，筛选时，使细胞与被测物质接触的条件只要是细胞不会死亡且在该细胞中永生化规定基因能够表达的条件就没有特别限制。
上述工序(B)和(C)中永生化规定基因的表达量，可以使用上述的本发明的探针或引物，通过RNA印迹法或RT-PCR法等方法，来测定永生化规定基因的mRNA或由其衍生的cDNA、双链DNA的量。此外，作为上述工序(B)和(C)中的永生化规定基因的表达量，可以采用作为永生化规定基因的表达产物的永生化规定多肽的量。永生化规定多肽的量可以使用上述的永生化规定多肽的抗体，通过进行蛋白质印迹法、酶免疫法(EIA)、放射免疫法(RIA)、荧光免疫法等免疫学的检测方法来测定。
在工序(C)中，通过将上述工序(B)中得到的永生化规定基因的表达量与未使被测物质与细胞接触时的永生化规定基因的表达量(对照表达量)进行比较，能够选择抑制永生化癌细胞增殖的物质。即，当上述工序(B)中得到的永生化规定基因的表达量比对照表达量低时，选择该被测物质作为抑制永生化癌细胞增殖的物质。
(IV-2)永生化癌细胞的增殖抑制剂的筛选还可以通过将作为本发明的永生化规定基因((1)～(13))的表达产物的永生化规定多肽((14)～(26))的活性抑制作为指标来进行。例如，已知(14)UBE2S多肽具有泛素化活性(E2)(J.Biol.Chem.267(22)，15829-15835(1992))。同样地，分别已知，(16)PTGES2多肽具有将前列腺素H2转化为前列腺素E2的活性(Biochem.Biophys.Res.Commun.291(4)，884-889(2002))；(18)ACVR2B多肽为跨膜受体，其细胞内结构域中具有Ser/Thr激酶活性(Mol.Cell Biol.16(3)，1066-1073(1996))；(20)LTB4DH多肽具有将白三烯B4转化为2-氧-白三烯B4的活性(J.Biol.Chem.271(5)，2844-2850(1996))；(22)SEPX1多肽具有甲硫氨酸亚砜还原活性(Mol.Biol.Cell 15(3)，1055-1064(2004))。因此，永生化癌细胞的增殖抑制剂的筛选，特别是可以通过以这些永生化规定多肽的活性抑制为指标来进行。
具体来说，通过下述工序(A’)～(D’)，能够筛选抑制永生化癌细胞增殖的物质。
(A’)使被测物质与(14)～(26)中的任一种永生化规定多肽接触的工序；
(B’)测定与被测物质接触的永生化规定多肽的活性的工序；
(C’)将上述工序(B’)中得到的永生化规定多肽的活性与未与被测物质接触的水溶液、细胞或细胞级分中的细胞中的永生化规定多肽的活性(对照活性)进行比较的工序；
(D’)当上述工序(B’)中得到的永生化规定多肽的活性比对照活性低时，选择该被测物质作为抑制永生化癌细胞增殖的物质的工序。
该筛选以永生化规定多肽的活性作为指标，可以将含有(14)～(26)[优选(14)、(16)、(18)、(20)或(22)]中的任一种永生化规定多肽、或者能够含有其的物质作为对象来进行，具体来说，根据永生化规定多肽的功能(活性)，可以列举含有(14)～(26)[优选(14)、(16)、(18)、(20)或(22)]中的任一种永生化规定多肽的水溶液；能够表达(1)～(13)[优选(1)、(3)、(5)、(7)或(9)]中的任一种永生化规定基因的细胞或者由该细胞制备的细胞级分中的任一形式。这里所谓水溶液，只要含有永生化规定多肽即可，没有限制，例如，除了通常的水溶液外，还包括细胞溶解液、核提取液、或培养上清液等。此外，作为细胞，可以列举无论是内原性和外源性等来源，只要处于能够表达永生化规定基因的状态的细胞。此外所谓细胞级分，是指来源于该细胞的各种级分，可以列举例如细胞膜级分、细胞质级分、细胞核级分等。
此外，筛选中使用的细胞和作为对象的被测物质可以使用与上述的筛选方法同样的细胞和被测物质。
工序(B’)中的UBE2S多肽(14)的泛素化活性的测定可以通过公知的方法进行，例如可以如J.Biol.Chem.267(22)，15829-15835(1992)所述，通过在含有泛素、泛素活化酶(E1)和UBE2S多肽的体系中，进行UBE2S多肽的泛素化反应，测定与UBE2S多肽结合的泛素的量来进行。这里，泛素量的测定可以用公知的方法进行，例如，可以通过使用经放射性物质、酶等标记的泛素进行上述反应，测定该标记物的量来进行(J.Biol.Chem.267(22)，15829-15835(1992)、J.Biol.Chem.279(51)，52970-52977(2004))。此外，还可以通过用抗泛素抗体进行检测来测定(J.Biol.Chem.279(51)，52970-52977(2004))。泛素和泛素活化酶(E1)可以通过公知的蛋白质合成法获得，还可以使用市售品。
工序(B’)中的PTGES2多肽(16)的前列腺素E2合成活性的测定可以用公知的方法进行，例如可以如Biochem.Biophys.Res.Commun.291(4)，884-889(2002)所述，通过在含有PTGES2多肽和前列腺素H2的体系中进行基于PTGES2多肽的前列腺素E2转化反应，测定产生的前列腺素E2的量来进行。这里，前列腺素E2的量的测定可以用公知的方法进行，例如，可以通过使用经放射性物质、酶等标记的前列腺素H2进行上述反应，测定产生的前列腺素E2的标记物的量来进行(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.96(13)，7220-7225(1999))。此外，还可以通过用抗前列腺素E2抗体进行检测来测定(J.Dairy.Sci.87(7)，2197-2210(2004))。前列腺素H2可以通过公知的合成法获得，还可以使用市售品。
工序(B’)中的ACVR2B多肽(18)的Ser/Thr激酶活性的测定可以用公知的方法进行，例如可以如Mol.Cell Biol.16(3)，1066-1073(1996)所述，通过在含有ACVR2B多肽的体系中，在基质和ATP的存在下进行激酶反应，测定基质的磷酸化量来进行。这里，基质的磷酸化量的测定可以用公知的方法进行，例如可以通过将γ32P-ATP或γ33P-ATP作为示踪物使用来测定放射活性，从而测定磷酸化量(Mol.CellBiol.16(3)，1066-1073(1996))。此外，还可以通过使用经荧光物质、生物素等标记的基质进行磷酸化反应，测定磷酸化标记物的量来进行。作为基质，可以列举ACVR2B多肽、特异性基质或肽。
工序(B’)中的LTB4DH多肽(20)的白三烯B4转化活性的测定可以用公知的方法进行，例如可以如J.Biol.Chem.271(5)，2844-2850(1996)所述，通过在含有LTB4DH多肽和白三烯B4的体系中进行基于LTB4DH多肽的白三烯B4转化反应，测定产生的12-氧-白三烯B4的量来进行。这里，12-氧-白三烯B4的量的测定可以用公知的方法进行，例如可以通过HPLC等公知的方法进行测定。白三烯B4可以通过公知的化学合成法获得，还可以使用市售品。
工序(B’)中的SEPX1多肽(22)的甲硫氨酸亚砜还原活性的测定可以用公知的方法进行，例如可以如Mol.Biol.Cell 15(3)，1055-1064(2004)所述，通过在含有SEPX1多肽和甲硫氨酸亚砜的体系中进行基于SEPX1多肽的甲硫氨酸亚砜还原反应，测定产生的甲硫氨酸的量来进行。这里，甲硫氨酸的量的测定可以用公知的方法进行，例如可以通过HPLC等公知的方法进行测定。甲硫氨酸亚砜可以通过公知的化学合成法获得，还可以使用市售品。
在工序(C’)和(D’)中，通过将上述工序(B’)中得到的永生化规定多肽的活性与对照活性进行比较，能够选择抑制永生化癌细胞增殖的物质。即，当上述工序(B’)中得到的永生化规定多肽的活性比对照活性低时，选择该被测物质作为抑制永生化癌细胞增殖的物质。
如实施例中所说明，表2所示的反义多核苷酸(siRNA)(序列编号27～76)，通过在癌细胞内与本发明的永生化规定基因进行杂交，抑制该永生化规定基因的表达，其结果是抑制永生化癌细胞的增殖。因此，这些反义多核苷酸(siRNA)可以作为永生化癌细胞增殖抑制剂使用。因此，本发明提供以该反义多核苷酸作为有效成分的永生化癌细胞增殖抑制剂。
该反义多核苷酸由15个碱基长以上的多核苷酸构成，该多核苷酸与由(1)～(13)的永生化规定基因中的任一碱基序列的至少15个碱基以上的连续碱基序列构成的多核苷酸特异性杂交。较理想的是，该多核苷酸具有与上述(1)～(13)的永生化规定基因中的至少15个碱基以上的连续碱基序列互补的碱基序列，但只要能够进行上述特异性杂交，且能够通过与该永生化规定基因杂交来抑制该永生化规定基因的表达即可，不必完全互补。例如，可以是如下的多核苷酸，即，与该永生化规定基因的互补序列相比，在碱基序列中具有70％以上、优选80％以上、更优选90％以上、进一步优选95％以上、特别优选98％以上的同源性，并且能够通过与该永生化规定基因的RNA杂交而抑制该永生化规定基因的表达。此外，本发明的反义多核苷酸的碱基长优选为15～1000个碱基长，更优选15～500个碱基长，特别优选16～30个碱基长。
本发明的反义多核苷酸优选为由序列编号27～76中的任一碱基序列构成的多核苷酸，更优选它们的双链RNA。
此外，为了提高稳定性和细胞透过性，本发明的反义多核苷酸可以进行公知的修饰。例如，为了防止因核酸酶等水解酶所致的分解，各核苷酸的磷酸残基可以取代为硫代磷酸酯、甲基磷酸酯、二硫代磷酸酯等化学修饰磷酸残基。
本发明的反义多核苷酸的形式可以是单链DNA、单链RNA、双链DNA、双链RNA和DNA:RNA杂合体中的任一种。
本发明的反义多核苷酸通常可以用公知的方法合成，例如，可以使用合成机来化学合成。
本发明的反义多核苷酸可以利用逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺病毒伴随病毒载体等病毒载体、脂质体等非病毒载体等，通过回体(ex vivo)法、体内(in vivo)法等导入患者的癌细胞中，从而可以很好地用于抗癌疗法中。因此，本发明中包括抗癌疗法，其含有对癌患者给予以该反义多核苷酸为有效成分的永生化癌细胞增殖抑制剂的工序。
本发明的永生化癌细胞增殖抑制剂以上述反义多核苷酸为有效成分，在不损害其细胞增殖抑制作用的范围内可以含有稳定化剂、悬浮剂、冷冻剂、缓冲液、溶剂等。此外，本发明的永生化癌细胞增殖抑制剂对患者的给药量和给药计划可以根据对象患者、患者的年龄、体重等由本领域技术人员来适当设定。作为这样的给药计划，例如，可以举出以3周为1疗程，其中以2～3周连续静脉给药2～10mg/kg/day的上述反义多核苷酸的给药计划；以1周为1疗程，其中以5天连续静脉给药80～120mg/m2/day的上述反义多核苷酸的给药计划；以及以4周为1疗程，其中以3周连续静脉给药80～120mg/m2/day的上述反义多核苷酸的给药计划。
实施例
以下，示出实施例，对本发明进一步详细进行说明，但本发明的范围并不受这些实施例的限制。
实施例1 永生化规定基因的鉴定
1.由人组织样品和人癌细胞株、人非肿瘤性培养细胞制备总RNA
使用RNeasyTM Mini kit(Qiagen公司制)，按照附带的方案从9种肺癌细胞株、21种食道癌细胞株、9种消化器癌、其它各种癌(胃癌、大肠癌、头颈部癌、白血病)细胞株以及2种非肿瘤性食道上皮细胞、2种正常呼吸道上皮提取总RNA，在-80℃保存。
然后，同样地从11种乳癌细胞株、10种卵巢癌细胞株、10种胰腺癌细胞株、1种非肿瘤性永生化乳腺上皮、1种非肿瘤性乳腺上皮、来源于同一胰腺癌患者的胰腺癌组织和非癌部胰腺组织10组、来源于同一非小细胞性肺癌患者的原发灶和3处转移肺癌组织提取总RNA并保存。总RNA使用2100 Bioanalyzer(Agilent Technologies公司制)和RNALabChip(Agilent Technologies公司制)确认18S和28S rRNA的峰鲜明且为高品质后，供微阵列分析。
2.微阵列分析
使用上述中制备的总RNA，进行采用微阵列的全基因表达分析。微阵列使用CodeLink UniSet Human 20K I Bioarray(19881探针)，按照(1)由总RNA合成cDNA、(2)由cDNA合成标记化cRNA、(3)标记化cRNA的片断化、(4)片断化cRNA和微阵列的杂交、(5)微阵列的染色、(6)微阵列的扫描、(7)基因表达分析的顺序进行。
(1)由总RNA合成cDNA
使用CodeLink Expression Assay Reagent Kit(GE HealthcareBioscience公司制)，按照其方案进行第一链(first-strand)cDNA合成。即，将1中得到的各总RNA 1μg用无核酸酶的水(Nuclease-freeWater)调整至1μl，混合该试剂盒中含有的1μl Bacterial ControlmRNA稀释溶液、1μl T7 Oligo(dT)Primer，将合计12μl在70℃加热10分钟后，在冰上迅速冷却3分钟。在冰上加入该试剂盒中含有的2μl的10×first-strand Buffer、4μl的5mM dNTP Mix、1μl的RNaseInhibitor、1μl的Reverse Transcriptase(200U/μl)，将合计20μl在42℃加热2小时。
然后，按照方案分解RNA-DNA杂合体中的RNA，将RNA链置换为DNA链而合成Second-strand cDNA(双链cDNA)。即，在上述20μl第一链cDNA反应液中加入63μl无核酸酶的水、该试剂盒中含有的10×Second-strand Buffer(10μl)、5mM dNTP Mix(4μl)、DNAPolymerase Mix(2μl：10U/μl)、1μl RNase H，将合计100μl混合良好，在16℃加热2小时。
反应结束后，使用QIAquick PCR purification Kit(QIAGEN公司制)，按照附带的方案，纯化合成的双链cDNA。即，在cDNA溶液100μl中添加混合该试剂盒中含有的500μl的Buffer PB，添加入安装于2ml离心管中的QIAquick离心柱中，以13,000rpm离心50秒。除去洗脱液后再次安装QIAquick离心柱，添加该试剂盒中含有的700μl的Buffer PE，以13,000rpm离心1分钟。除去洗脱液后再次安装QIAquick离心柱，再次以13,000rpm离心1分钟而完全除去Buffer PE。将QIAquick离心柱安装于新的1.5ml试管中，将30μl的无核酸酶的水直接添加在QIAquick离心柱的膜上，静置1分钟后以13,000rpm离心1分钟，再次重复该操作(合计用60μl洗脱)。用真空干燥机，将cDNA溶液浓缩至9.5μl以下，用无核酸酶的水定容至9.5μl。
(2)由cDNA合成标记化cRNA
然后，按照CodeLink Expression Assay Reagent Kit(GEHealthcareBioscience公司制)的方案，在生物素标记核苷酸的存在下进行体外转录反应(IVT)反应，合成cRNA。即，将该试剂盒中含有的4.0μl的10×T7Reaction Buffer、4.0μl的T7 ATP Solution、4.0μl的T7 GTP Solution、4.0μl的T7 CTP Solution、3.0μl的T7 UTP Solution混合，再加入7.5μl的10mMBiotin-11-UTP(Perkin Elmer公司制)，将合计26.5μl添加入(1)中制备的9.5μl cDNA溶液中。再加入该试剂盒中含有的4.0μl的10×T7 EnzymeMix，将合计40.0μl混合良好，在气相中在37℃加热14小时。反应结束后，使用RNeasy Mini Kit(QIAGEN公司制)，按照附带方案，纯化合成的cRNA。即，在IVT反应液(40μl)中添加60μl的无核酸酶的水，在合计100μl的溶液中添加该试剂盒中含有的350μl的Buffer RLT并混合良好，再添加250μl的100％乙醇并混合良好，将总量(700μl)添加到该试剂盒中含有的RNeasy小型离心柱上，以12,000rpm离心15秒。将RNeasy小型离心柱安装在新的2ml试管中，将该试剂盒中含有的500μl的BufferRPE添加在柱上，以12,000rpm离心15秒，再次重复该操作。除去洗脱液后，再次将RNeasy小型离心柱安装在原来的2ml试管中，以12,000rpm离心2分钟，使柱内的膜干燥后，将RNeasy小型离心柱转移至新1.5ml试管中，将50μl的无核酸酶的水直接添加在膜上。在室温静置10分钟后，以12,000rpm离心1分钟，再次重复该操作(合计用100μl洗脱)。
将样品混合良好，2μl移液用于采用Agilent 2100 Bioanalyzer的cRNA品质检查，2μl用灭菌蒸馏水稀释50倍并移液用于cRNA定量，剩余在-80℃保存。定量是测定50倍稀释溶液的260nm和280nm的吸光度，定量cRNA浓度，并确认260nm/280nm的吸光度比在1.8以上。cRNA浓度在0.5μg/μl以下时用真空于燥机进行浓缩。cRNA的品质检查使用Agilent 2100 Bioanalyzer和RNA LabChip，按照附带的方案进行电泳，确认弥散峰的长度为500个碱基以上。
(3)标记化cRNA的片断化
然后，按照CodeLink Expression Assay Reagent Kit(GEHealthcareBioscience公司制)的方案，将cRNA片断化为约100～200个碱基。即，用无核酸酶的水使10μg的cRNA定容为20μl，添加该试剂盒中含有的5μl的5×Fragmentation Buffer，在94℃加热20分钟后，在冰上迅速冷却。在含有片断化的10μg的cRNA的25μl溶液中，加入该试剂盒中含有的78μlHybridization Buffer A、130μl Hybridization Buffer B、27μl无核酸酶的水，制备合计260μl的杂交溶液。以最高速度涡旋5秒并旋转减弱后，在90℃加热5分钟，进行cRNA的热变性，在冰上冷却。
(4)片断化cRNA和微阵列的杂交
使用CodeLink Shaker Kit(GEHealthcare Bioscience公司制)、CodeLink INNOVA Shaker，按照方案进行杂交。即，将CodeLink UniSetHuman 20K I Bioarray安装在该试剂盒中含有的12 Slide Shaker Tray上。将(3)中制备的杂交溶液以最高速度涡旋5秒并旋转减弱后，将杂交溶液250μl从阵列的密封型腔右下的孔注入，用阵列附带的Sealing strip(密封条)将孔密封。将装载了阵列的Shaker Tray设置在CodeLink INNOVAShaker中，一边以37℃、300rpm回旋一边加热18小时。
(5)微阵列的染色
使用CodeLink Parallel Processing Kit(GEHealthcare Bioscience公司制)，按照方案进行阵列的染色和洗净。即，将上述得到的完成杂交的阵列的密封腔剥下，在室温下充满13ml的0.75×TNT Buffer(0.1 M Tris-HCl(pH7.6)、0.15M NaCl、0.05％ Tween 20)，插入安装有该试剂盒中含有的Bioarray Rack的Medium Reagent Reservoir的各狭槽中。上下振动Rack数次使残余部分的杂交溶液从阵列落下，将保持阵列的BioarrayRack转移至充满了加热至46℃的240ml 0.75×TNT Buffer的LargeReagent Reservoir中，在46℃加热1小时。
作为染色液，将用无核酸酶的水将每片阵列溶解为1mg/ml而得的Streptavidin-Cy5液6.8μl，用室温的3393.2μl的TNB Buffer(0.1M Tris-HCl(pH7.6)、0.15M NaCl、0.5％ TSA Blocking Reagent(Perkin Elmer公司制)稀释500倍，将3.4ml充满该试剂盒中含有的Small Reagent Reservoir的狭缝中。将保持阵列的Bioarray Rack转移至该Small Reagent Reservoir中，用铝等遮光并在室温(23℃±2℃)下染色30分钟。
染色后，将Bioarray Rack转移至充满了240ml的TNT Buffer(室温)的Large Reagent Reservoir中，上下数次后在室温放置5分钟，转移至充满了新的TNT Buffer(室温)的Large Reagent Reservoir中上下数次后在室温放置5分钟，将该操作重复4次进行洗净。最后一边用240ml的0.05％ Tween 20溶液上下振动5秒一边进行洗净，再次重复该操作。将Bioarray Rack安装在干燥的Medium Reagent Reservoir中，以600×g、室温离心3分钟使其干燥。
(6)微阵列的扫描
将染色的各阵列供给Agilent G2565(Agilent公司制)扫描仪，读取染色蛋白质，保存为TIFF image。将TIFF image用CodeLinkExpressionAnalysis软件进行处理，将阵列上的各基因点的信号强度数值化。
(7)基因表达分析
将上述中得到的信号强度数据使用GeneSpring GX(Agilent公司制)微阵列基因表达分析软件进行标准化分析。即，从点信号中减去背景信号，该值小于0.01则取0.01，将除以阵列的全部点信号的中值而得的值作为各个基因的标准化的相对表达量。如下所述选择该相对表达量与正常细胞(图1，左上)相比同时在永生化癌细胞株(图1，右下)中增加的基因。可以设想，无论脏器而普遍地表达增强的基因与其说是与正常体细胞(图1，左上)的癌化(图1中，向下的蓝色箭头)相关的基因，毋宁为与癌细胞的永生化(图1中，向右的红色箭头)相关的基因。
作为在9种肺癌细胞株中的8种以上中，比2种的正常呼吸道上皮的中值高度表达2倍以上；在21种食道癌细胞株中的19种以上中，比2种非肿瘤性食道上皮的中值高度表达2倍以上；并且在9种消化器癌、其它各种癌(胃癌、大肠癌、头颈部癌、白血病)细胞株中的8种以上中，比上述4种非肿瘤性上皮(2种呼吸道上皮和2种食道上皮)的中值高度表达2倍以上的基因，提取出51个基因(图2，左上)。另一方面，作为这三组的各脏器癌细胞株的表达水平的平均值分别为作为对照的正常上皮的平均值的2倍以上(其中，基于该平均值而选择使用的食道癌细胞株为最初进行分析的7种)、并且由永生化肺癌细胞构成的转移肺癌组织中的表达水平是由同一病例的非永生化肺癌细胞构成的原发组织及转移组织的平均值的2倍以上的基因，提取出80个基因(图2，右上)。在这些两组中提取出的基因中，7个基因为两组共有而被提取出。
癌细胞株均为已永生化的细胞是公知事实，这里使用的永生化、非永生化肺癌组织，通过端粒酶活性(Hiyama K等、J Natl Cancer Inst 87：895-902，1995，Case G)、端粒长(Hiyama K等、Oncogene 10：937-44，1995，Case 92-D)、及hTERT蛋白原位表达(Hiyama E等、Neoplasia 3：17-26，2001，Fig 6A，B)分析，确认同一病例的原发灶(图3中，“D2Pr”)和肝转移灶(图3中，“D5M3”)并未永生化(端粒酶活性阴性、端粒长缩短、未确认hTERT蛋白表达)；淋巴结转移灶中的一个(图3中，“D4M2”)几乎仅由永生化细胞构成(高端粒酶活性、端粒长延长、在几乎全部的细胞中hTERT蛋白表达)，而另一个转移灶(图3中，“D3M1”)则永生化细胞混在于非永生化细胞之中(低端粒酶活性、hTERT蛋白表达细胞混在于非表达细胞之中)。
进而，筛得了在乳癌11细胞株、卵巢癌10细胞株、胰腺癌10细胞株中共同高度表达的基因，最终确认，(1)ubiquitin-conjugating enzymeE2S(UBE2S)、(2)replication factor C(activator 1)4,37kDa(RFC4)(3)prostaglandin E synthase 2(PTGES2)、(4)MAF1 homolog(S.cerevisiae)(MAF1)、(5)activin A receptor，type IIB(ACVR2B)、(6)family with sequence similarity 119，member A(FAM119A)、(7)leukotriene B4 12-hydroxydehydrogenase(LTB4DH)、(8)dolichyl-phosphate mannosyltransferase polypeptide 2，regulatory subunit(DPM2)、(9)selenoprotein X，1(SEPX1)、(10)proteasome(prosome，macropain)subunit，alpha type，3(PSMA3)、(11)coiled-coil-helix-coiled-coil-helix domain containing 3(CHCHD3)、(12)LSM3 homolog，U6 small nuclear RNA associated(S.cerevisiae)(LSM3)、和(13)G-2 and S-phase expressed 1(GTSE1)合计13个基因，在肺癌细胞株、食道癌细胞株、消化器癌细胞株、乳癌细胞株、卵巢癌细胞株、胰腺癌细胞株、其他的癌细胞株的大部分中，共同地比有限寿命非肿瘤性细胞高度表达，在端粒酶阳性肺癌转移组织(永生化癌细胞)中比在同一病例的端粒酶阴性肺癌肺癌转移组织和原发组织(非永生化癌细胞)中高度表达，进而与在混在有未永生化的癌细胞的胰腺癌组织相比，在仅由永生化的细胞构成的胰腺癌细胞株中高度表达(图3)。这里使用的胰腺癌组织，与同一病例的正常胰腺组织相比，编码端粒酶的基因TERT的全长mRNA表达量高，但与永生化胰腺癌细胞株相比明显低，可以认为是混在有未永生化的细胞。
如图3～15所示，上述的13个基因是如下的基因，即，
(1)在永生化细胞(图3～15涂黑处：除MCF-12A、SV11e、SV11-106以外全部为来源于人癌的细胞株)中，与有限寿命的非肿瘤性细胞(图3～15留白处)相比，表达亢进；
(2)来源于人癌的永生化癌细胞(图3～15除MCF-12A、SV11e、SV11-106以外的涂黑处)中，比有限寿命癌细胞(图3～15除SV12e、SV12-72以外的斜线)表达亢进；
(3)在将正常肺纤维芽细胞中导入编码端粒酶的基因TERT而得的非肿瘤性端粒酶表达延命细胞(图3～15菱形点TERT6e、TERT6-85)中，与亲细胞(TIG-1)相比，没有表达亢进；
是特异性地在癌细胞端粒酶阳性永生化细胞中高度表达的基因。由此可以认为，这些基因是规定癌细胞的永生化的基因(永生化规定基因)。
进而、在将编码端粒酶的基因TERT和编码SV40 early antigen的基因导入正常肺纤维芽细胞中而得的永生化转化细胞(从图3 15 SV11e、SV11-106：确认用软琼脂集落形成试验(colony formation assay with softagar)制作菌落，而且能够续代300 PDL以上)中、与亲细胞(TIG-1)、非肿瘤性延命细胞(TERT6e，TERT6-85：确认不能用软琼脂集落形成试验制作菌落，且在小于100 PDL时细胞增殖停止)相比，除MAF1、LTB4DH以外表达亢进。可以认为，对于这两个基因，体外转化的细胞未必与人的癌同一性状。
实施例2利用永生化规定基因的siRNA(small interfering RNA)的癌细胞增殖抑制
为了分析实施例1中特定的13种永生化规定基因与癌细胞增殖的关联性，设计、制作各基因序列特异性siRNA后，在3种癌细胞株(HeLa：子宫颈癌、KYSE150：食道癌、HCC50：大肠癌)中导入基因，研究永生化规定基因的mRNA表达抑制以及对导入后96小时后的细胞增殖能力的影响。
(1)永生化规定基因序列特异性siRNA(small interfering RNA)的设计和制作
对于13种各永生化规定基因，设定2种或4种特异性siRNA序列，由有义链和反义链构成的形成有双链的siRNA从Qiagen公司和Japan BioService公司购得。制成的各siRNA序列中，仅将有义链示于表2和表3中。各基因的siRNA-1为2种等摩尔混合。
表2
表3
2)人癌细胞株的培养
3种癌细胞株(HeLa：子宫颈癌、KYSE150：食道癌、HCC50：大肠癌)分别在以下条件下进行培养。HeLa使用含有10％胎牛血清(FetalBovine Serum)(Sigma公司制)和庆大霉素(Sigma公司制)的DMEM培养基(Nacalai Tesque公司制)，KYSE150和HCC50使用含有10％胎牛血清和庆大霉素的RPMI 1640培养基(Nacalai Tesque公司制)进行培养。
(3)永生化规定基因序列特异性siRNA向癌细胞株的基因导入
在转染前一天，将预培养的各癌细胞用胰蛋白酶处理回收，悬浮于(2)中所述的培养基中后，在24孔板的每孔中，以HeLa为1.2×104个、KYSE150为2×104个、HCC50为1.5×104个的细胞数进行接种。转染当天交换为无血清培养基Opti-MEM(Invitrogen公司制)，使用Oligofectamine(Invitrogen公司制)或Lipofectamine 2000(Invitrogen公司制)转染表2所示的siRNA。此外，转染时的siRNA的浓度为每孔40nM。作为阴性对照，使用Control(non-silencing)siRNA(Qiagen公司制)。
(4)永生化规定基因的相对mRNA表达量的抑制分析
使用RNeasy Mini(Qiagen公司制)，按照产品的说明书，从(3)中进行的转染1天后的各癌细胞株中提取总RNA。使用QuantiTect ProbeRT-PCR(Qiagen公司制)和永生化规定基因序列特异性TaqMan Probe(ABI公司制)，采用以下条件进行定量RT-PCR(使用ABI公司制ABIPRISM 7000 sequence detection system)。
i)50℃、30分钟；
ii)95℃、15分钟；
iii)94℃、15秒→60℃、1分钟进行35～45循环。
作为内标使用β-actin，由各扩增曲线将表达量数值化。作为对照使用导入了NS序列siRNA的细胞的值。此外，永生化规定基因的相对mRNA量的测定，在同一目标基因、同一癌细胞株中，在相同条件下各进行2次。
将以对照中的各永生化规定基因的mRNA量为100％时导入了各siRNA的细胞中的各永生化规定基因的相对mRNA量，在图16～28中以mRNA定量1、mRNA定量2示出。在全部目标基因中，确认了由siRNA导致的mRNA表达量的抑制。
(5)癌细胞株的增殖测定
癌细胞株的增殖使用活细胞数测定试剂SF(Nacalai Tesque公司制)来进行。在(3)中进行的转染96小时后，每孔添加WST试剂10μl，在37℃培养3小时后，使用酶标仪(Perkin Elmer公司制、Wallac ARVOMX1420 Multilabel Counter)测定450nm和595nm(参考波长)的吸光度。用450nm吸光度-595nm的吸光度-BG(仅培养基)的吸光度进行数值化，求出每3孔的平均值，将NS序列siRNA导入细胞的值作为100％来表示。此外，癌细胞株的增殖测定，在同一目标基因、同一癌细胞株中，在相同条件下各进行2次。
将NS序列siRNA导入时的细胞数作为100％时的各siRNA导入时的细胞数，在图16～28中以MTT assay1、MTT assay2示出。在全部的目标基因中，均确认了由siRNA所致的3种癌细胞中的增殖抑制，由此显示，这些13种永生化规定基因能够成为普遍性地导致永生化癌细胞的增殖抑制的分子靶标。
在癌细胞中鉴别永生化和有限寿命，不仅在治疗药的开发中意义重大，作为疾病标记的意义也重大。通常的癌诊断通过病理所见而进行，虽然也能够诊断分化度、非典型性，但对于该细胞是否永生化、即是否获得了无限寿命，通过通常的病理分析却无法判断。以往，人端粒酶的活化作为永生化的标志而受到瞩目，但如上所述，也已知即使是正常细胞的一部分端粒酶也被活化，仅凭端粒酶的活化细胞也未必永生化。而且，端粒酶的表达量非常低，虽然已确立了免疫组织染色法，但仅在部分研究室中获得了成功(Hiyama E等，Neoplasia 3：17-26，2001)。通过将上述本发明的永生化规定基因的表达作为标记使用，能够将用通常的病理诊断无法判断的永生化癌细胞与有限寿命细胞鉴别开来，期待在癌的早期诊断、治疗选择、预后预测中的临床应用。

Claims (7)

1.基因标记用于制备判断癌细胞中的永生化癌细胞的试剂的应用，其中所述基因标记由多核苷酸构成，该多核苷酸与序列编号13所示的碱基序列内的至少15个碱基长的连续碱基序列特异性杂交、且具有15个碱基长以上的碱基序列。 
2.根据权利要求1所述的应用，其中所述基因标记为探针或引物。 
3.如权利要求1或2中所述的基因标记用于制备判断癌细胞中的永生化癌细胞的试剂的应用，其中： 
(1)如权利要求1或2中所述的基因标记用于与RNA或该RNA的衍生物结合，其中，所述RNA由从被测者采集的含有癌细胞的机体试样制备； 
(2)将如权利要求1或2中所述的基因标记用作测定与所述基因标记结合的RNA或该RNA的衍生物的量的指标；以及 
(3)将通过如权利要求1或2中所述的基因标记测定的RNA或该RNA的衍生物的量用于与未永生化的癌细胞中相应的RNA或该RNA的衍生物的量进行比较，其中，将通过如权利要求1或2中所述的基因标记测定的RNA或该RNA的衍生物的量总称为“RNA量”，将未永生化的癌细胞中相应的RNA或该RNA的衍生物的量总称为“对照RNA量”， 
其中以上步骤(1)-(3)中的RNA的衍生物是通过RNA转录制备的cDNA，或由所述RNA或cDNA使用PCR法而扩增的DNA。 
4.根据权利要求3所述的应用，其中： 
(4)当通过如权利要求1或2中所述的基因标记测定的RNA量比对照RNA量高时，判断为被测者的癌细胞为永生化的，当通过如权利要求1或2中所述的基因标记测定的RNA量不比对照RNA量高时，判断为被测者的癌细胞为未永生化的。 
5.识别氨基酸序列由序列编号26所示的多肽的抗体用于制备判断癌细胞中的永生化癌细胞的试剂的应用，其中： 
(1’)所述识别氨基酸序列由序列编号26所示的多肽的抗体用于与含有多肽的含蛋白质级分结合，其中，所述含有多肽的含蛋白质级分由从被测者采集的含有癌细胞的机体试样制备； 
(2’)所述抗体用作测定与所述抗体结合的多肽的量的指标；以及 
(3’)将通过所述抗体测定的多肽量用于与未永生化的癌细胞中相应的多肽量进行比较，其中，将通过所述抗体测定的多肽量总称为“多肽量”，将未永生化的癌细胞中相应的多肽量总称为“对照多肽量”。 
6.根据权利要求5所述的应用，其中： 
(4’)当通过所述抗体测定的多肽量比对照多肽量高时，判断被测者的癌细胞为永生化的，当通过所述抗体测定的多肽量不比对照多肽量高时，判断被测者的癌细胞为未永生化的。 
7.选自如权利要求1中所述的基因标记和识别氨基酸序列由序列编号26所示的多肽的抗体中的至少一种用于制备判断癌细胞中的永生化癌细胞的试剂盒的应用。 
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