WO2018236065A1 - 대장암 환자의 항암제 치료 반응성 예측용 마커 - Google Patents

대장암 환자의 항암제 치료 반응성 예측용 마커 Download PDF

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WO2018236065A1
WO2018236065A1 PCT/KR2018/006150 KR2018006150W WO2018236065A1 WO 2018236065 A1 WO2018236065 A1 WO 2018236065A1 KR 2018006150 W KR2018006150 W KR 2018006150W WO 2018236065 A1 WO2018236065 A1 WO 2018236065A1
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WO
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slc22a18
gene
mrna
expression level
protein
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PCT/KR2018/006150
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조용범
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사회복지법인 삼성생명공익재단
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    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
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    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
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    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer

Definitions

  • the present invention relates to a marker composition for predicting the anticancer drug therapeutic response, which comprises a SLC22A18 (Solute carrier family 22 member 18) gene or a protein encoded by the gene in a colorectal cancer patient, A composition for predicting anticancer drug therapeutic reactivity comprising a drug or an agent for measuring the level of a gene or protein, and a method for providing information for anticancer agent therapeutic response prediction.
  • a marker composition for predicting the anticancer drug therapeutic response which comprises a SLC22A18 (Solute carrier family 22 member 18) gene or a protein encoded by the gene in a colorectal cancer patient
  • a composition for predicting anticancer drug therapeutic reactivity comprising a drug or an agent for measuring the level of a gene or protein, and a method for providing information for anticancer agent therapeutic response prediction.
  • anticancer drugs against various cancers have been developed so far, cancer that can be cured only by an anticancer agent is only a minority cancer, because cancer cells do not respond to an anticancer drug when treated with an anticancer drug, But they are resistant to anticancer drugs during or after treatment. Therefore, for effective chemotherapy, resistance to anticancer drugs, such as resistance to cancer cells against cancer drugs, must be overcome.
  • colorectal cancer is a very common cancer in the world.
  • Surgical resection is the primary treatment method for colorectal cancer 1-3, and secondary chemotherapy for lowering the recurrence rate after surgery It is standard therapy. It is known that recurrence rate is 50-60% if not treated with chemotherapy in stage III colorectal cancer, but recurrence rate can be reduced to 30-40% with chemotherapy and survival rate is improved by 10%.
  • 5-fluorouracil a well-known anticancer drug for the treatment of colorectal cancer
  • oxaliplatin or irinotecan in combination with 5-FU (FOLFOX, FOLFIRI)
  • 5-FU 5-fluorouracil
  • FOLFOX, FOLFIRI 5-fluorouracil
  • a marker composition for predicting the anticancer drug response which comprises a SLC22A18 (Solute carrier family 22 member 18) gene or a protein encoded by the gene.
  • composition for predicting anticancer drug therapeutic reactivity which comprises an agent for measuring mRNA of SLC22A18 (Solute carrier family 22 member 18) gene or a protein encoded by the gene.
  • the present invention relates to a method for detecting a therapeutic reactivity to an anticancer agent, comprising the step of measuring the expression level of the mRNA of the SLC22A18 (Solute carrier family 22 member 18) gene or the protein encoded by the gene on a biological sample derived from a human subject to provide an information providing method for predicting the information of a user.
  • a method for detecting a therapeutic reactivity to an anticancer agent comprising the step of measuring the expression level of the mRNA of the SLC22A18 (Solute carrier family 22 member 18) gene or the protein encoded by the gene on a biological sample derived from a human subject
  • the present invention also provides a method for producing a cell, which comprises: (1) treating a candidate substance to cells in vitro; And (2) measuring an expression level of mRNA of the SLC22A18 gene or a protein thereof in the cell.
  • the present invention provides a marker composition for predicting the anticancer drug response, which comprises a SLC22A18 (Solute carrier family 22 member 18) gene or a protein encoded by the gene.
  • a marker composition for predicting the anticancer drug response which comprises a SLC22A18 (Solute carrier family 22 member 18) gene or a protein encoded by the gene.
  • the SLC22A18 gene may comprise the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1.
  • the anticancer agent may be selected from the group consisting of 5-fluorouracil (5-FU), oxaliplatin, and irinotecan.
  • the present invention provides a composition for predicting anticancer drug response, which comprises an agent for measuring an expression level of mRNA of SLC22A18 (Solute carrier family 22 member 18) gene or a protein encoded by the gene.
  • a composition for predicting anticancer drug response which comprises an agent for measuring an expression level of mRNA of SLC22A18 (Solute carrier family 22 member 18) gene or a protein encoded by the gene.
  • the agent for measuring the level of the mRNA of the gene may be a sense and antisense primer that binds complementarily to the mRNA of the gene, or a probe.
  • the agent for measuring the level of the protein may be an antibody that specifically binds to the protein.
  • the present invention also provides a kit for predicting the therapeutic response of an anticancer drug comprising the above composition.
  • the present invention relates to a method for detecting a therapeutic reactivity to an anticancer agent, comprising the step of measuring the expression level of the mRNA of the SLC22A18 (Solute carrier family 22 member 18) gene or the protein encoded by the gene on a biological sample derived from a human subject Based on the result of the analysis.
  • SLC22A18 Solute carrier family 22 member 18
  • the level of the mRNA can be measured by PCR, reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR), or real-time PCR .
  • RT-PCR reverse transcription polymerase chain reaction
  • real-time PCR real-time PCR
  • the protein expression level is determined by Western blotting, radioimmunoassay (RIA), radioimmunodiffusion, enzyme immunoassay (ELISA), immunoprecipitation, Or flow cytometry, or immunofluorescence.
  • RIA radioimmunoassay
  • ELISA enzyme immunoassay
  • immunoprecipitation Or flow cytometry, or immunofluorescence.
  • the present invention also provides a method for producing a cell, which comprises: (1) treating a candidate substance to cells in vitro; And (2) measuring an expression level of mRNA of the SLC22A18 gene or a protein thereof in the cell.
  • the method may further include the step of selecting a substance that increases the expression level of mRNA of the SLC22A18 gene or a protein thereof compared to the candidate substance-untreated group as an antitumor agent-resistant inhibitor.
  • the candidate substance may be selected from the group consisting of a nucleic acid, a compound, a microorganism culture or extract, a natural product extract, a peptide, a substrate analog, an aptamer, and an antibody.
  • the anticancer agent therapeutic response predictive technique according to the present invention can predict the therapeutic response of the anticancer agent by measuring the expression level of SLC22A18 and can also propose the possibility of concurrent treatment with other target anticancer agents, And it is expected that it can be usefully used to enhance the therapeutic effect of the therapy.
  • FIG. 1A shows the result of reading the low expression group (0, +1) and the high expression group (+2, +3) according to the expression level after staining SLC22A18 using 337 colon cancer tissue.
  • FIG. 1B shows the results of measurement of mortality and recurrence rate according to the degree of SLC22A18 expression by the Kaplan-Meier analysis method for SLC22A18 low expression and high expression group.
  • FIG. 2A shows the results of Western blotting of the expression level of SLC22A18 in various colon cancer cell lines.
  • FIG. 2B shows the results of comparing the drug reactivity with oxaliplatin between cell lines with low expression level of SLC22A18 (SW480 and HT29) and high expression level cell lines (HCT116 and SW48).
  • FIG. 2C shows the results of inhibiting the expression level of SLC22A18 and confirming the change of drug reactivity through siRNA using SW48 cell line with high SLC22A18 expression level.
  • FIG. 2d shows the result of confirming the change of drug reactivity by overexpressing SLC22A18 using HT29 cell line with low expression level of SLC22A18.
  • FIG. 2E shows the results of Western blotting of the expression level of SLC22A18 in two of the patient derived cells (PDC39 and PDC41) cells.
  • FIG. 2f shows the result of comparing the drug reactivity to oxaliplatin between PDC cells (PDC41) with low SLC22A18 expression level and PDC cells with high expression level (PDC39).
  • FIG. 3 shows the expression of SLC22A18 in the SW48 cell line with high expression level of SLC22A18.
  • the expression of SLC22A18 was overexpressed and the increase and decrease of ERK and AKT active protein were confirmed by western blotting Results.
  • Figure 4A shows the results of treatment with cetuximab while inhibiting SLC22A18 expression levels through siRNA in SW48 cell lines with high SLC22A18 expression levels.
  • FIG. 4B shows the results of the simultaneous administration of oxaliplatin alone, cetuximab alone, and oxaliplatin / cetuximab in the HT29 cell line with low SLC22A18 expression level. The result is confirmed.
  • FIG. 4c shows the results of the simultaneous treatment with oxaliplatin alone, cetuximab alone, and oxaliplatin / cetuximab treatment after lowering SLC22A18 expression in the SW48 cell line with high expression of SLC22A18 , and western blotting revealed changes in ERK and AKT active protein.
  • the present invention provides a marker composition for predicting anticancer drug therapeutic reactivity, comprising a SLC22A18 (Solute carrier family 22 member 18) gene or a protein encoded by the gene.
  • SLC22A18 Solute carrier family 22 member 18
  • the present invention also relates to a composition for predicting the anticancer drug response predictive composition
  • a composition for predicting the anticancer drug response predictive composition comprising an agent for measuring the mRNA of SLC22A18 (Solute carrier family 22 member 18) gene or a protein encoded by the gene, and a kit for predicting the anticancer agent therapeutic response Lt; / RTI >
  • the SLC22A18 gene (NM_002555.5; Homo sapiens solute carrier family 22 member 18 (SLC22A18), transcript variant 1, mRNA) according to the present invention may comprise the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, Homologues of base sequences are included within the scope of the present invention. More specifically, the gene comprises a nucleotide sequence having at least 70%, preferably at least 80%, more preferably at least 90%, and most preferably at least 95% sequence identity with the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 .
  • the term 'anticancer drug reactivity prediction marker' in the present invention refers to a substance used for predicting whether anticancer drug administration is useful for the treatment of cancer, and its expression level is measured to predict reactivity to anticancer drug do.
  • markers may include organic biomolecules such as nucleic acids, polypeptides, proteins, lipids or sugars, and the like.
  • the anticancer drug response predictive marker is a nucleic acid or polypeptide marker capable of predicting the response to chemotherapeutic treatment in colon cancer patients.
  • the anticancer agent may be selected from the group consisting of 5-fluorouracil (5-FU), oxaliplatin and irinotecan, but is not limited thereto.
  • the present inventors have a close relationship between the expression level of SLC22A18 (Solute carrier family 22 member 18) and the anticancer drug resistance, and firstly described the signal transduction pathway for the above-mentioned association.
  • the mortality and recurrence rates of SLC22A18 were compared, and it was found that the lower the expression of SLC22A18, the higher the mortality and recurrence rate in colorectal cancer patients (see Example 2).
  • the anticancer drug response to the SLC22A18 expression was compared with that of the colon cancer cell line and the patient-derived cell (PDC).
  • PDC patient-derived cell
  • SLC22A18 gene or the protein encoded by the gene can be usefully used as a marker for predicting the therapeutic response of an anticancer agent in colorectal cancer.
  • the agent for measuring the mRNA level of the SLC22A18 gene may be a sense or antisense primer that binds complementarily to mRNA, or a probe, but is not limited thereto.
  • the term 'primer' refers to a short gene sequence which is a starting point for DNA synthesis, and means an oligonucleotide synthesized for diagnosis, DNA sequencing and the like.
  • the primers may be synthesized to have a length of 15 to 30 base pairs.
  • the primers may be used depending on the purpose of use, and can be modified by methylation, capping or the like by a known method.
  • probe refers to a nucleic acid capable of specifically binding with mRNA of a length of several hundreds to several hundreds of nucleotides prepared through enzymatic chemical separation purification or synthesis. Radioactive isotopes or enzymes can be labeled to confirm the presence or absence of mRNA and can be designed and modified by known methods.
  • the agent for measuring the protein level may be an antibody that specifically binds to a protein encoded by the gene, but is not limited thereto.
  • the term " antibody " includes immunoglobulin molecules immunologically reactive with specific antigens and includes both monoclonal antibodies and polyclonal antibodies.
  • the antibody also includes forms produced by genetic engineering such as chimeric antibodies (e. G., Humanized murine antibodies) and heterologous binding antibodies (e. G., Bispecific antibodies).
  • the anticancer drug therapeutic response prediction kit of the present invention may be composed of one or more other component compositions, solutions or devices suitable for the assay method.
  • the kit of the present invention includes a genomic DNA derived from a sample to be analyzed, a primer set specific for the marker gene of the present invention, an appropriate amount of a DNA polymerase, a dNTP mixture, a PCR buffer solution and water May be included.
  • the PCR buffer may contain KCl, Tris-HCl and MgCl 2.
  • components necessary for conducting electrophoresis to confirm whether the PCR product is amplified can be further included in the kit of the present invention.
  • kit of the present invention may be a kit containing essential elements necessary for performing RT-PCR.
  • RT-PCR kits can be used for the detection of enzymes such as test tubes or other appropriate containers, reaction buffers, deoxynucleotides (dNTPs), Taq polymerase and reverse transcriptase, DNase, RNase inhibitors, DEPC DEPC-water, sterile water, and the like. It may also contain a primer pair specific for the gene used as a quantitative control.
  • the kit of the present invention may be a kit containing essential elements necessary for performing a DNA chip.
  • the DNA chip kit may include a substrate to which a cDNA corresponding to a gene or a fragment thereof is attached as a probe, and the substrate may include a cDNA corresponding to a quantitative structural gene or a fragment thereof.
  • the kit of the present invention may be in the form of a microarray having a substrate on which the marker gene of the present invention is immobilized.
  • the present invention includes a step of measuring the expression level of the mRNA of the SLC22A18 (Solute carrier family 22 member 18) gene or the protein encoded by the gene on a biological sample derived from a human subject Which provides information for predicting therapeutic response to an anticancer agent.
  • SLC22A18 Solute carrier family 22 member 18
  • the biological sample derived from the subject may include, but is not limited to, tissues, cells, whole blood, blood, saliva, sputum, cerebrospinal fluid and urine.
  • the expression level of mRNA can be measured by a conventional method known in the art, such as PCR, reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR), real-time polymerase chain reaction , But is not limited thereto.
  • protein expression levels can be determined by conventional methods known in the art, such as western blotting, radioimmunoassay (RIA), radioimmunodiffusion, enzyme immunoassay (ELISA), immunoprecipitation but are not limited to, immunoprecipitation, flow cytometry, immunofluorescence, and the like.
  • RIA radioimmunoassay
  • ELISA enzyme immunoassay
  • immunoprecipitation but are not limited to, immunoprecipitation, flow cytometry, immunofluorescence, and the like.
  • SLC22A18 expression level when SLC22A18 expression level is inhibited by siRNA, the drug reactivity is significantly lowered by increasing ERK and AKT active protein, whereas when overexpressed SLC22A18, ERK and AKT activity are decreased (See Examples 3 and 4), substances that increase the expression or activity of SLC22A18 can be used as an effective ingredient of a composition that inhibits the anticancer drug resistance, and SLC22A18 is an anticancer drug resistance inhibitor Can be used for screening.
  • the method for screening an anticancer drug resistance-inhibiting agent according to the present invention may further include a step of selecting an anticancer drug resistance-suppressing substance when the level of mRNA of the SLC22A18 gene or a protein thereof is increased as compared with the candidate substance-untreated group.
  • the candidate substance may be selected from the group consisting of a compound, a microorganism culture or extract, a natural product extract, a nucleic acid, and a peptide
  • the nucleic acid preferably includes siRNA, shRNA, microRNA, antisense RNA, aptamer ), LNA (locked nucleic acid), PNA (peptide nucleic acid), and morpholino, but the present invention is not limited thereto.
  • Tissue microarray and immunohistochemistry were performed to analyze the staining state of SLC22A18.
  • a 2 mm diameter tissue core was carefully transferred to a paraffin block with 24 holes per block.
  • the filled block was placed on a paraffin, cut into 4- ⁇ m-thick sections, and placed on a slide.
  • the TMA slides were heated at 55 ° C for 30 minutes to remove the wax, washed with xylene three times for 5 minutes each for xanthan gum treatment, and sequentially washed with 100%, 95% and 80% ethanol and third distilled water for 5 minutes each.
  • Antigen retrieval was obtained by heating in 10 mM sodium citrate (pH 6.0) at 95 ° C for 30 minutes.
  • Endogenous peroxidase activity was blocked in 3% hydrogen peroxide for 30 min. background reactivity was removed for 30 min at room temperature using universal blocking serum (Dako Diagnostics, Glostrup, Denmark).
  • the slides were reacted with antibodies specific for SLC22A18 (LS-C119205, LS Bio, Seattle, WA, USA) for 1 hour. Then, they were reacted with biotin labeled secondary antibody for 30 minutes. Streptabvidin-peroxidase (Dako Diagnostics) was used to compare protein expression with hematoxylin. The slides were dehydrated and coverslips were mounted for microscopic examination. Expression of SLC22A18 was evaluated by the intensity of immunohistochemical staining.
  • the pathologist evaluated the intensity of stained epithelial cells and divided the scores into 0 (no staining), +1 (weak), +2 (normal), and +3 (strong). Patients were divided into two groups according to their scores: low expression group (score 0, +1) and high expression group (score +2, +3).
  • Colon cancer cells were purchased from the American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, Va.) And cultured in RPMI 1640 (Gibco, Grand Island, NY (Gibco, Grand Island, NY, USA) and 1% penicillin-streptomycin (Gibco, Grand Island, NY, USA) were placed in a 5% CO 2 incubator at 37 ° C. Oxaliplatin and cetuximab were purchased from selleckchem (Houston, TX, USA).
  • Cell proliferation was measured three times using fluorescence wavelength analysis to determine cell viability by evaluating the metabolic conversion of water-soluble tetrazolium salt WST-1 (Roche, Indianapolis, Ind.). Viability was assessed in colon cancer cells at various times, and analysis was performed by adding WST-1 directly to the cell culture medium and incubating at 37 ° C for 60-120 minutes. Absorbance was measured at a wavelength of 450 nm. Three experiments were performed for each experimental condition.
  • siRNAs for SLC22A18 and scrambled control siRNA were purchased from bioneer (Korea).
  • the two target sequences of the SLC22A18 siRNA used for transfection are as follows:
  • SLC22A18 expression vector and control pcDNA3.1 vector were provided by Dr. Jae Sang Kim (Department of Life Science, Ewha Mans University). The transfection experiments were performed using Lipofectamine 2000 or Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen), and 1x10 5 cells per well of a 6-well plate were grown for 18 hours and then made 60-70% of the bottom surface. Lipofectamine-plasmid complexes were prepared according to the manufacturer's instructions. After 24-72 hours, transfection efficiency and cell viability were analyzed.
  • Proliferation data were analyzed using GraphPad Prism 5.0 software (CA, USA) with ANOVA with post-hoc analysis using the Bonferroni post hoc test. All experiments were performed at least three times. Statistical analysis was performed using SPSS version 19.0 software (SPSS Inc., Chicago, Illinois, USA) for clinical data analysis. Survival rates were estimated using the Kaplan-Meier method and compared using the log-rank test. The difference between the groups was considered statistically significant at p ⁇ 0.05.
  • SLC22A18 was stained according to the above Example 1-2 using 337 colon cancer tissues collected in Example 1-1, and the result was read as 0, +1, +2, +3 depending on the degree of expression. And the read score was 0, +1 for low expression group, and for +2 and +3 for high readout group (FIG. 1A).
  • the survival rate of SLC22A18 expression was measured by Kaplan-Meier analysis for the low-expression group and the high-strain group. As a result, as shown in FIG. 1B, it was confirmed that the mortality and recurrence rate of the SLC22A18 low expression group were significantly higher than those of the high incidence group.
  • the expression level of SLC22A18 was examined by western blotting in various colorectal cancer cell lines. As shown in FIG. 2A, the expression level of SLC22A18 was found to vary according to the colorectal cancer cell line. Especially, in SW480 and HT29, expression of SLC22A18 While HCT116 and SW48 showed high levels of SLC22A18 expression.
  • the drug reactivity to oxaliplatin between the cell lines (SW480 and HT29) with low SLC22A18 expression level and the cell lines with high expression level (HCT116 and SW48) was confirmed.
  • the cell lines (HCT116 and SW48) having high SLC22A18 expression level showed good drug response to the anticancer drug and the cell lines (SW480 and HT29) having low SLC22A18 expression level showed poor drug reactivity Respectively.
  • SLC22A18 expression level was inhibited by siRNA in the case of SW48 cell line with high expression level of SLC22A18, and SLC22A18 was inhibited in case of HT29 cell line with low SLC22A18 expression level
  • siRNA siRNA in the case of SW48 cell line with high expression level of SLC22A18
  • SLC22A18 was inhibited in case of HT29 cell line with low SLC22A18 expression level
  • FIG. 3 when the expression level of SLC22A18 was lowered through siRNA in SW48, ERK and AKT-activated protein were increased, whereas when overexpressing SLC22A18 in HT29, ERK and AKT-activated protein were decreased in western blotting screening Respectively. From these results, it can be seen that the ERK and AKT signaling systems are involved in SLC22A18 mediated drug responsiveness.
  • Cetuximab is a target treatment that blocks ERK and AKT signaling by blocking epidermal growth factor (EGFR), which is highly expressed in cancer cells.
  • EGFR epidermal growth factor
  • cetuximab showed a decrease in the drug reactivity even when the expression of SLC22A18 was lowered, as shown in Fig. 4A Respectively.
  • HT29 cell lines with low SLC22A18 expression levels were treated with oxaliplatin alone, cetuximab alone, oxaliplatin / cetuximab, and then drug resistance
  • oxaliplatin alone treatment group had low drug reactivity while cetuximab alone treatment group had high drug reactivity.
  • cetuximab alone treatment group had high drug reactivity.
  • oxaliplatin / cetuximab combination treatment group showed significantly better effect than single treatment alone. From the results, it was found that treatment with cetuximab (concurrent treatment with cetuximab) , Overcome the drug resistance of the cells to oxaliplatin.
  • SLC22A18 expression was decreased in the SW48 cell line expressing SLC22A18, followed by oxaliplatin alone, cetuximab alone, and oxaliplatin / cetuximab concurrent treatment , And Western blotting revealed that ERK and AKT active protein were changed.
  • FIG. 4C when the expression of SLC22A18 was lowered, the increased active protein of ERK / AKT was slightly reduced by oxaliplatin, Cetuximab reduced the expression of active protein by more than half and concurrent treatment with oxaliplatin and cetuximab resulted in a similar or lower expression of ERK / AKT active protein in the control group Respectively.
  • the anticancer agent therapeutic response predictive technique according to the present invention can predict the therapeutic response of the anticancer agent by measuring the expression level of SLC22A18 and can also propose the possibility of concurrent treatment with other target anticancer agents, And it is expected that it can be usefully used to enhance the therapeutic effect of the therapy.

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Abstract

본 발명은 항암제 치료 반응성 예측용 마커 및 이의 용도에 관한 것으로서, 본 발명에 따른 항암제 치료 반응성 예측 기술은 SLC22A18의 발현 수준을 측정함으로써 항암제의 치료 반응성을 효과적으로 예측할 수 있을 뿐만 아니라, 다른 표적 항암제와의 병행 치료의 가능성도 제안할 수 있는바, 대장암의 항암화학요법의 치료효과를 높이는데 유용하게 이용될 수 있을 것으로 기대된다.

Description

대장암 환자의 항암제 치료 반응성 예측용 마커
본 발명은 항암제 치료 반응성 예측용 마커에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 대장암 환자에서 SLC22A18(Solute carrier family 22 member 18) 유전자 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질을 포함하는 항암제 치료 반응성 예측용 마커 조성물, 상기 유전자 또는 단백질 수준을 측정하는 제제를 포함하는 항암제 치료 반응성 예측용 조성물, 및 항암제 치료 반응성 예측을 위한 정보제공방법 등에 관한 것이다.
현재까지 다양한 암에 대한 많은 항암제가 개발되었음에도 불구하고, 항암제만으로 완치가 가능한 암은 소수암에 불과한데, 그 이유는 항암제를 이용한 암 치료 시 항암제에 암 세포가 반응하지 않거나, 초기에는 효과적으로 종양이 줄어들지만 치료 도중 또는 치료 후에 항암제에 대한 내성이 생기기 때문이다. 따라서, 효과적인 항암 치료를 위해서는 항암제에 대한 암세포의 내성 등 항암제에 대한 저항성을 극복하여야 한다.
한편, 대장암은 전 세계적으로 매우 빈번하게 발생하는 암으로서, 대장암 1-3기인 경우 수술적 절제가 근본적 치료 방법이며, 3기인 경우에는 수술 후 재발률을 낮추기 위해 보조 항암화학요법을 시행하는 것이 표준 치료이다. 3기 대장암에서 수술 후 항암제 치료를 하지 않으면 재발률이 50-60%이나, 항암화학요법을 하면 재발률을 30-40% 정도로 줄일 수 있으며 생존율은 10% 정도 향상시킨다고 알려져 있다.
현재, 대장암 치료에 잘 알려진 항암제는 5-플루오르우라실(5-FU)인데, 주사약제인 옥사리플라틴(oxaliplatin) 또는 이리노테칸(irinotecan)을 5-FU와 함께 사용하는 병합요법 (FOLFOX, FOLFIRI)이 표준치료로 이용되고 있다. 이러한 치료법은 치료반응을 관찰하여, 약물 반응성이 좋을 경우 지속하고, 약물 반응성이 없으면 항암제를 변경하게 되는데, 이 과정 중 암이 더욱 진행되는 경우가 많다. 또한, 비슷한 임상적 특징을 가지는 환자들 중에서도 항암화학요법에 대한 반응이 다양하게 나타나고, 같은 병기의 환자라 할지라도 환자의 생존에 상당한 차이를 보인다. 더욱이, 항암제에 대한 치료 반응은 개인 별로 달라, 환자의 유전 상태에 따라 항암제를 선택하여 사용하는 개인 맞춤형 치료의 개념이 부상되고 있으나, 환자 개개인의 특성에 입각한 항암 치료의 반응성을 예측하는 방법은 전무한 실정이다.
따라서 대장암 환자에서 항암 치료의 반응성을 예측할 수 있는 표지자 개발이 절실한 실정이고, 이에 대한 연구가 이루어지고 있으나(특허공개번호 10-2017-0012816 등), 아직 미흡한 실정이다.
상기와 같은 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로서, 본 발명자들은 대장암 환자에서 항암제 치료 반응성과 관련성을 갖는 바이오마커를 발굴하기 위해 연구 노력한 결과, SLC22A18(Solute carrier family 22 member 18) 발현 수준과 항암제 내성간의 상관관계가 있음을 확인하고, 이에 기초하여 본 발명을 완성하였다.
이에, 본 발명은 SLC22A18(Solute carrier family 22 member 18) 유전자 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질을 포함하는, 항암제 치료 반응성 예측용 마커 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 SLC22A18(Solute carrier family 22 member 18) 유전자의 mRNA 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질의 발현수준을 측정하는 제제를 포함하는, 항암제 치료 반응성 예측용 조성물을 제공하는 것을 다른 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 인간 피검체 유래의 생물학적 시료에 대하여, SLC22A18(Solute carrier family 22 member 18) 유전자의 mRNA 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질의 발현수준을 측정하는 단계를 포함하는, 항암제에 대한 치료 반응성을 예측하기 위한 정보제공방법을 제공하는 것을 또 다른 목적으로 한다.
또한, 본 발명은, (1) in vitro 상에서 세포에 후보물질을 처리하는 단계; 및 (2) 상기 세포에서 SLC22A18 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질의 발현수준을 측정하는 단계를 포함하는, 항암제 내성 억제제 스크리닝 방법을 제공하는 것을 또 다른 목적으로 한다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 SLC22A18(Solute carrier family 22 member 18) 유전자 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질을 포함하는, 항암제 치료 반응성 예측용 마커 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구현예로, 상기 SLC22A18 유전자는 서열번호 1로 표시되는 염기서열로 이루어질 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로, 상기 항암제는 5-플루오르우라실(5-FU), 옥사리플라틴(oxaliplatin) 및 이리노테칸(irinotecan)으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
또한, 본 발명은 SLC22A18(Solute carrier family 22 member 18) 유전자의 mRNA 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질의 발현수준을 측정하는 제제를 포함하는, 항암제 치료 반응성 예측용 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구현예로, 상기 유전자의 mRNA의 수준을 측정하는 제제는 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 센스 및 안티센스 프라이머, 또는 프로브일 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로, 상기 단백질의 수준을 측정하는 제제는 상기 단백질에 특이적으로 결합하는 항체일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 항암제 치료 반응성 예측용 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 인간 피검체 유래의 생물학적 시료에 대하여, SLC22A18(Solute carrier family 22 member 18) 유전자의 mRNA 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질의 발현수준을 측정하는 단계를 포함하는, 항암제에 대한 치료 반응성을 예측하기 위한 정보제공방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현예로, 상기 mRNA 수준은 중합효소연쇄반응(PCR), 역전사 중합효소연쇄반응(RT-PCR) 또는 실시간 중합효소연쇄반응(Real-time PCR)의 방법을 통해 측정될 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로, 상기 단백질 발현수준은 웨스턴 블롯팅(western blotting), 방사선면역분석법(radioimmunoassay; RIA), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion), 효소면역분석법(ELISA), 면역침강법(immunoprecipitation) 또는 유세포분석법(flow cytometry), 면역형광염색법(immunofluorescence)을 통해 측정될 수 있다.
또한, 본 발명은, (1) in vitro 상에서 세포에 후보물질을 처리하는 단계; 및 (2) 상기 세포에서 SLC22A18 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질의 발현수준을 측정하는 단계를 포함하는, 항암제 내성 억제제 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현예로, 후보물질 비처리군에 비해 상기 SLC22A18 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질의 발현수준을 증가시키는 물질을 항암제 내성 억제제로 선정하는 단계를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로, 상기 후보물질은 핵산, 화합물, 미생물 배양액 또는 추출물, 천연물 추출물, 펩타이드, 기질 유사체, 압타머(aptamer), 및 항체로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
본 발명에 따른 항암제 치료 반응성 예측 기술은 SLC22A18의 발현 수준을 측정함으로써 항암제의 치료 반응성을 효과적으로 예측할 수 있을 뿐만 아니라, 다른 표적 항암제와의 병행 치료의 가능성도 제안할 수 있는바, 대장암의 항암화학요법의 치료효과를 높이는데 유용하게 이용될 수 있을 것으로 기대된다.
도 1a는 337명의 대장암 환자 조직을 이용하여 SLC22A18을 염색한 후, 발현 정도에 따라 저발현군(0, +1)과 고발현군(+2, +3)을 판독한 결과이다.
도 1b는 SLC22A18 저발현 및 고발현군에 대해 Kaplan-Meier 분석방법을 통해 SLC22A18 발현 정도에 따른 사망률 및 재발률을 측정한 결과이다.
도 2a는 다양한 대장암 세포주를 대상으로 SLC22A18 발현 정도를 western blotting을 통해 확인한 결과이다.
도 2b는 SLC22A18 발현 수준이 낮은 세포주(SW480 및 HT29)와 발현 수준이 높은 세포주(HCT116 및 SW48)간의 옥사리플라틴(oxaliplatin)에 대한 약물 반응성을 비교한 결과이다.
도 2c는 SLC22A18 발현 수준이 높은 SW48 세포주를 사용하여 siRNA를 통해 SLC22A18 발현 수준을 억제시키고 약물 반응성 변화를 확인한 결과이다.
도 2d는 SLC22A18 발현 수준이 낮은 HT29 세포주를 사용하여 SLC22A18을 과발현시키면서 약물 반응성 변화를 확인한 결과이다.
도 2e는 환자유래 세포 (Patient derived cell; PDC) 중 두 종류 (PDC39 및 PDC41)세포를 대상으로 SLC22A18 발현 정도를 western blotting을 통해 확인한 결과이다.
도 2f는 SLC22A18 발현 수준이 낮은 PDC 세포 (PDC41)와 발현 수준이 높은 PDC 세포 (PDC39)간의 옥살리플라틴(oxaliplatin)에 대한 약물 반응성을 비교한 결과이다.
도 3은 SLC22A18 발현 수준이 높은 SW48 세포주의 경우에는 siRNA를 통해 SLC22A18 발현 수준을 억제시키고, SLC22A18 발현 수준이 낮은 HT29 세포주의 경우에는 SLC22A18을 과발현시키면서 western blotting을 통해 ERK와 AKT 활성단백의 증감을 확인한 결과이다.
도 4a는 SLC22A18 발현 수준이 높은 SW48 세포주에서 siRNA를 통해 SLC22A18 발현 수준을 억제시키면서 세툭시맙(cetuximab)을 처리한 결과이다.
도 4b는 SLC22A18 발현 수준이 낮은 HT29 세포주에 옥사리플라틴(oxaliplatin) 단독, 세툭시맙(cetuximab) 단독, 옥사리플라틴(oxaliplatin)/세툭시맙(cetuximab) 병행 처리를 각각 실시한 후, 약물 반응성을 확인한 결과이다.
도 4c는 SLC22A18 발현이 높은 SW48 세포주에서 SLC22A18 발현을 낮춘 후 옥사리플라틴(oxaliplatin) 단독, 세툭시맙(cetuximab) 단독, 옥사리플라틴(oxaliplatin)/세툭시맙(cetuximab) 병행 처리를 각각 실시한 후, western blotting으로 ERK와 AKT 활성단백의 변화를 확인한 결과이다.
본 발명은 SLC22A18(Solute carrier family 22 member 18) 유전자 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질을 포함하는, 항암제 치료 반응성 예측용 마커 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 SLC22A18(Solute carrier family 22 member 18) 유전자의 mRNA 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질의 발현수준을 측정하는 제제를 포함하는 항암제 치료 반응성 예측용 조성물 및 이를 포함하는 항암제 치료 반응성 예측용 키트를 제공한다.
본 발명에 따른 SLC22A18(Solute carrier family 22 member 18) 유전자 (NM_002555.5; Homo sapiens solute carrier family 22 member 18 (SLC22A18), transcript variant 1, mRNA)는 서열번호 1의 염기서열로 이루어질 수 있으며, 상기 염기서열의 상동체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 보다 구체적으로, 상기 유전자는 서열번호 1의 염기서열과 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기서열을 포함할 수 있다.
본 발명에서 용어 '항암제 반응성 예측용 마커'란 항암제 투약이 암의 치료에 유용할 수 있는지의 여부를 투약 전에 예측하는데 사용하기 위한 물질로서, 이의 발현량을 측정하여 항암제에 대한 반응성을 예측하는데 사용된다. 이러한 마커에는 핵산, 폴리펩타이드, 단백질, 지질 또는 당 등과 같은 유기 생체 분자 등이 포함될 수 있다. 본 발명의 목적상, 항암제 치료 반응성 예측용 마커는 대장암 환자에서 항암제 치료 반응성을 예측할 수 있는 핵산 또는 폴리펩타이드 마커이다.
본 발명에서, 항암제는 5-플루오르우라실(5-FU), 옥사리플라틴(oxaliplatin) 및 이리노테칸(irinotecan)으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으나, 이것으로 제한되는 것은 아니다.
본 발명자들은 SLC22A18(Solute carrier family 22 member 18) 발현 수준과 항암제 내성이 밀접한 연관성이 있고, 상기 연관성에 대한 신호전달경로를 최초로 규명하였다.
본 발명의 일 실시예에서는 SLC22A18 발현에 따른 사망률 및 재발률 변화를 비교한 결과, SLC22A18 발현이 낮을수록 대장암 환자에서 사망률 및 재발률이 유의적으로 높음을 확인하였다(실시예 2 참조).
본 발명의 다른 실시예에서는 SLC22A18 발현에 따른 항암제 반응성을 대장암 세포주 및 환자유래 세포 (PDC)에 처리하여 비교한 결과, SLC22A18 발현이 낮을 때 항암제에 대한 저항성을 증가시킴으로써 약물 반응성이 낮으며, 반대의 경우에는 약물 반응성이 유의하게 높아지는 것을 확인하였다(실시예 3 참조).
상기 결과들을 통해 SLC22A18 유전자 또는 상기 유전자가 암호화하는 단백질이 대장암에서 항암제의 치료 반응성을 예측할 수 있는 마커로 유용하게 이용될 수 있음을 알 수 있다.
본 발명에서, SLC22A18 유전자의 mRNA 수준을 측정하는 제제는 mRNA에 상보적으로 결합하는 센스 및 안티센스 프라이머, 또는 프로브일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 사용되는 용어, '프라이머'란 DNA 합성의 기시점이 되는 짧은 유전자 서열로써, 진단, DNA 시퀀싱 등에 이용할 목적으로 합성된 올리고뉴클레오티드를 의미한다. 상기 프라이머들은 통상적으로 15 내지 30 염기쌍의 길이로 합성하여 사용할 수 있으나, 사용 목적에 따라 달라질 수 있으며, 공지된 방법으로 메틸화, 캡화 등으로 변형시킬 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어, '프로브'란 효소 화학적인 분리정제 또는 합성과정을 거쳐 제작된 수 염기 내지 수백 염기길이의 mRNA와 특이적으로 결합할 수 있는 핵산을 의미한다. 방사성 동위원소나 효소 등을 표지하여 mRNA의 존재 유무를 확인할 수 있으며, 공지된 방법으로 디자인하고 변형시켜 사용할 수 있다.
상기 단백질 수준을 측정하는 제제는 유전자가 코딩하는 단백질에 특이적으로 결합하는 항체일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 사용되는 용어, '항체'는 면역학적으로 특정 항원과 반응성을 갖는 면역글로불린 분자를 포함하며, 단클론(monoclonal) 항체 및 다클론(polyclonal) 항체를 모두 포함한다. 또한, 상기 항체는 키메라성 항체(예를 들면, 인간화 뮤린 항체) 및 이종결합항체(예를 들면, 양특이성 항체)와 같은 유전공학에 의해 생산된 형태를 포함한다.
본 발명의 항암제 치료 반응성 예측용 키트는 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성성분 조성물, 용액 또는 장치로 구성될 수 있다.
예컨대, 본 발명의 키트는 PCR을 수행하기 위해, 분석하고자 하는 시료로부터 유래된 게놈 DNA, 본 발명의 마커 유전자에 대해 특이적인 프라이머 세트, 적당량의 DNA 중합 효소, dNTP 혼합물, PCR 완충용액 및 물을 포함하는 키트일 수 있다. 상기 PCR 완충용액은 KCl, Tris-HCl 및 MgCl2를 함유할 수 있다. 이외에 PCR 산물의 증폭 여부를 확인할 수 있는 전기영동 수행에 필요한 구성 성분들이 본 발명의 키트에 추가로 포함될 수 있다.
또한, 본 발명의 키트는 RT-PCR을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 키트일 수 있다. RT-PCR 키트는 마커 유전자에 대한 특이적인 각각의 프라이머 쌍 외에도 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액, 데옥시뉴클레오티드(dNTPs), Taq-폴리머레이즈 및 역전사 효소와 같은 효소, DNase, RNase 억제제, DEPC-수(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다. 또한 정량 대조군으로 사용되는 유전자에 특이적인 프라이머 쌍을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 키트는 DNA 칩을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 키트일 수 있다. DNA 칩 키트는, 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA가 프로브로 부착되어 있는 기판을 포함하고, 기판은 정량구조 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA를 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 키트는 본 발명의 마커 유전자가 고정화되어 있는 기판을 갖는 마이크로어레이 형태일 수 있다.
또한, 본 발명의 다른 양태로서, 본 발명은 인간 피검체 유래의 생물학적 시료에 대하여, SLC22A18(Solute carrier family 22 member 18) 유전자의 mRNA 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질의 발현수준을 측정하는 단계를 포함하는, 항암제에 대한 치료 반응성을 예측하기 위한 정보제공방법을 제공한다.
본 발명에서, 피검체 유래의 생물학적 시료는 조직, 세포, 전혈, 혈액, 타액, 객담, 뇌척수액 및 뇨 등을 포함할 수 있으나, 이것으로 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서, mRNA의 발현수준은 당업계에 알려진 통상적인 방법으로 중합효소연쇄반응(PCR), 역전사 중합효소연쇄반응(RT-PCR), 실시간 중합효소연쇄반응등의 방법을 통해 측정될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서, 단백질 발현수준은 당업계에 알려진 통상적인 방법으로 웨스턴 블롯팅(western blotting), 방사선면역분석법(radioimmunoassay; RIA), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion), 효소면역분석법(ELISA), 면역침강법(immunoprecipitation), 유세포분석법(flow cytometry), 면역형광염색법(immunofluorescence) 등의 방법을 통해 측정될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명의 또 다른 실시예에서는 siRNA를 통해 SLC22A18 발현 수준을 억제시키는 경우에는 ERK와 AKT 활성단백이 증가하면서 약물 반응성이 유의하게 낮아지는 반면, 반대로 SLC22A18을 과발현시켰을 때는 ERK와 AKT 활성이 감소하면서 약물 반응성이 유의하게 높아지는 것을 확인하였는바(실시예 3 및 4 참조), SLC22A18 발현 또는 활성을 증가시키는 물질은 항암제 내성을 억제하는 조성물의 유효성분으로 사용될 수 있는바, SLC22A18는 항암제 내성 억제제를 스크리닝하는데 이용될 수 있다.
이에, 본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은,
(1) in vitro 상에서 세포에 후보물질을 처리하는 단계; 및
(2) 상기 세포에서 SLC22A18 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질의 발현수준을 측정하는 단계를 포함하는, 항암제 내성 억제제 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 항암제 내성 억제제 스크리닝 방법은 후보물질 비처리군에 비해 SLC22A18 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질의 발현수준을 증가시키는 경우, 항암제 내성을 억제하는 물질로 선정하는 단계를 더 포함할 수 있다.
본 발명에서, 상기 후보물질은 화합물, 미생물 배양액 또는 추출물, 천연물 추출물, 핵산, 및 펩타이드로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있고, 상기 핵산은 바람직하게 siRNA, shRNA, microRNA, 안티센스 RNA, 앱타머(aptamer), LNA(locked nucleic acid), PNA(peptide nucleic acid), 및 모폴리노(morpholino)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
[실시예]
실시예 1. 실험준비 및 실험방법
1-1. 환자 및 데이터 수집
2006년부터 2007년까지 삼성서울병원(성균관대학교 의과대학)에 방문한 1기(76명), 2기(87명), 3기(91명), 4기(83명)의 대장암 환자에서 paraffin embedded sample을 만들었다. 모든 환자는 대장암으로 외과 수술을 받았고, 데이터베이스에 입력되었다. 수집된 의학기록 및 수술기록을 바탕으로 임상데이터를 후향적 분석하였고, 본 실험은 삼성의료원 기관윤리심의위원회(IRB No. 2010-09-017)의 승인을 받았다.
1-2. Tissue micro array (TMA) 분석
조직 microarray 및 면역조직화학은 SLC22A18의 염색 상태를 분석하기 위해 시행되었다. 직경 2mm의 조직 core를 블럭당 24개의 구멍이 있는 파라핀 블록에 조심스럽게 옮겼다. 채워진 블록을 파라핀에 끼우고 4μm 두께의 절편으로 잘라내어 슬라이드 위에 올려놓았다. TMA 슬라이드를 55℃에서 30 분 동안 가열하여 왁스를 제거한 후, 가수 처리를 위해 xylene으로 5분씩 3회 세척하고 순차적으로 100%, 95% 및 80% 에탄올과 3차 증류수까지 각 5분씩 세척하였다. Antigen retrieval은 10 mM 시트르산 나트륨 (pH 6.0)에서 95℃에서 30분 동안 가열하여 얻었다. Endogenous peroxidase 활성은 30분 동안 3% 과산화수소에 넣어두어서 차단하였다. universal blocking serum (Dako Diagnostics, Glostrup, Denmark)을 사용하여 실온에서 30분 동안 background 반응성을 제거하였다. 슬라이드를 SLC22A18(LS-C119205, LS Bio, Seattle, WA, USA)에 특이적인 항체와 1시간 동안 반응시켰다. 이어서, 이들을 biotin 표지된 2차 항체로 30분 동안 반응시켰다. Streptabvidin-peroxidase (Dako Diagnostics)를 적용하여 단백질 발현을 확인하고자 hematoxylin으로 대조염색을 실시한 후, 슬라이드를 탈수시키고 현미경 검사를 위해 coverslips을 장착 하였다. 면역조직화학 염색의 강도에 의해 SLC22A18 발현을 평가 하였다. 염색 된 상피 세포의 강도를 병리학자가 평가하고 0 (무 착색), +1 (약한), +2 (보통) 및 +3 (강한)으로 점수를 나누었다. 환자는 평가 점수에 따라 낮은 발현 군 (점수 0, +1)과 높은 발현 군 (점수 +2, +3)으로 2 개의 군으로 나누었다.
1-3. 세포배양 및 시약
American Type Culture Collection(ATCC, Manassas, VA)에서 SW480, HT29, HCT116, SW48, RKO, DLD-1, LoVo, HCT15, Colo205, LS513 및 SW620 대장암 세포를 구매하고 RPMI 1640 (Gibco, Grand Island, NY, USA)에 10% FBS (Gibco, Grand Island, NY, USA)와 1% 페니실린-스트렙토 마이신 (Gibco, Grand Island, NY, USA)을 넣고 37℃, 5% CO2 배양기에서 배양하였다. Oxaliplatin과 cetuximab은 selleckchem (Houston, TX, USA)에서 구입했다.
1-4. 세포 증식 분석
세포 증식은 water-soluble tetrazolium salt인 WST-1(Roche, Indianapolis, IN)의 대사 전환을 평가함으로써 세포 생존력을 결정하는 형광파장분석을 사용하여 3회 측정되었다. 생존력은 대장암 세포에서 다양한 시간에 평가되었고, 분석은 WST-1을 세포배양배지에 직접 첨가하여 37℃에서 60-120분 동안 배양 하였다. 흡광도는 파장 450 nm에서 측정 하였다. 세 가지 실험이 각 실험 조건에 대해 수행되었다.
1-5. siRNA와 벡터의 형질주입
SLC22A18 및 scrambled control siRNA에 대한 특정 siRNA는 bioneer(한국)로부터 구입하였다. 형질주입에 사용된 SLC22A18 siRNA의 두 가지 표적 염기서열은 다음과 같다:
5'- GACUGGCAAUAAACUCCUA - 3' (서열번호 2)
5'- CAGAACUUACCUGCCUCUU-3' (서열번호 3)
SLC22A18 발현 벡터 및 대조군 pcDNA3.1 벡터는 김재상 박사(이화여자대학교 생명과학부)가 제공하였다. Lipofectamine 2000 또는 Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen)를 사용하여 형질주입 실험을 하였고, 6 well plate의 1개 well당 1x105세포를 18시간 성장시킨 후 바닥면의 60-70% 농도로 만들었다. Lipofectamine-plasmid 복합체는 제조자의 지시에 따라 제조하였다. 24-72시간 후에 형질주입 효율과 세포 생존율을 분석했다.
1-6. 세포용해 및 Western blot 분석
전체 세포 추출물을 얻기 위해 Pro-prep buffer (Intron Biotechnology, Seoul, Korea)에 protease inhibitor와 phosphatase inhibitor를 포함하여 세포를 용해시켰다. 10-60μg의 단백질 추출물을 SDS-PAGE로 분석하고 PVDF membrane으로 옮긴 후 BSA와 skim milk를 사용하여서 blocking 및 antibody를 반응시켰다. SLC22A18 (LS-C119205, LS bio), phospho ERK (# 612358 BD biosciences), phospho ERK (#612358, BD biosciences), ERK (#9102, Cell Signaling), phospho AKT (#4060, Cell Signaling), AKT (#4691, Cell Signaling) and β-actin (#3700, Cell Signaling)을 1차 항체로 사용하였고, 1차 항체 반응 후에 horseradish peroxidase (Santa-Cruz)에 접합 된 2 차 항체를 반응시켰다. β-actin은 western blot 분석에서 대조군으로 사용되었다.
1-7. 통계 분석
Bonferroni post hoc test를 사용하여 post-hoc 분석과 함께 ANOVA을 적용한 GraphPad Prism 5.0 소프트웨어 (CA, USA)를 사용하여 증식 데이터를 분석했다. 모든 실험은 적어도 세 번 이상 수행되었다. 임상 데이터 분석을 위해 SPSS 버전 19.0 소프트웨어 (SPSS Inc., Chicago, Illinois, USA)를 사용하여 통계 처리를 수행했다. 생존율은 Kaplan-Meier 방법을 사용하여 추정하고 log-rank test로 비교 하였다. 그룹 간의 차이는 p <0.05 일 때 통계적으로 유의하다고 간주했다.
실시예 2. 대장암 환자에서 SLC22A18 발현에 따른 사망률 및 재발률 변화 비교
상기 실시예 1-1에 의해 수집된 337명의 대장암 환자 조직을 이용하여 상기 실시예 1-2에 따라 SLC22A18을 염색한 후, 발현 정도에 따라 0, +1, +2, +3으로 판독을 하였고, 판독 점수가 0, +1 인 경우를 저발현군으로, +2, +3 인 경우를 고발현군으로 분류하였다(도 1a).
그 결과, 하기 표 1에 나타낸 바와 같이, 전체 대상 환자 337명 중 SLC22A18 저발현군은 233명, 고발현군은 104명 이었다. SLC22A18 저발현군, SLC22A18 고발현군의 임상적 특징을 비교 분석해 보니, 남성이 여성보다 SLC22A18발현이 낮았고(p=0.008), CEA 레벨은 SLC22A18 저발현 군에서 유의하게 높음을 확인하였다(p=0.015). 또한, 환자의 병기가 증가할수록, SLC22A18 발현이 낮은 군이 유의하게 많았으며(p<0.001), 미분화 대장암 환자수도 SLC22A18 발현이 낮은 군에서 유의하게 높았고(p=0.001), 혈관침습도도 저발현군에서 유의하게 높음을 확인하였다(p=0.021).
[표 1]
Figure PCTKR2018006150-appb-I000001
더욱이, 저발현군 및 고발현군에 대해 Kaplan-Meier 분석방법을 통해 SLC22A18 발현 정도에 따른 생존율을 측정하였다. 그 결과, 도 1b에 나타낸 바와 같이, SLC22A18 저발현군의 사망률 및 재발률이 고발현군에 비해 유의성 있게 높음을 확인하였다.
실시예 3. SLC22A18 발현에 따른 항암제 반응성 비교 검증(in vitro)
3-1. 대장암 세포주에서 SLC22A18 발현에 따른 항암제 반응성 확인
먼저, 다양한 대장암 세포주를 대상으로 SLC22A18 발현 정도를 western blotting을 통해 확인한 결과, 도 2a에 나타낸 바와 같이, 대장암 세포주에 따라 SLC22A18의 발현 정도가 다양함을 확인하였고, 특히 SW480 및 HT29에서는 SLC22A18 발현이 낮은 반면, HCT116 및 SW48에서는 SLC22A18 발현 수준이 높음을 확인하였다.
다음으로, SLC22A18 발현 수준이 낮았던 세포주(SW480 및 HT29)와 발현 수준이 높았던 세포주(HCT116 및 SW48)간의 옥사리플라틴(oxaliplatin)에 대한 약물 반응성을 확인하였다. 그 결과, 도 2b에 나타낸 바와 같이, SLC22A18 발현 수준이 높았던 세포주(HCT116 및 SW48)의 경우 항암제에 대한 약물 반응성이 좋았고, SLC22A18 발현 수준이 낮았던 세포주(SW480 및 HT29)의 경우엔 약물 반응성이 좋지 않음을 확인하였다.
다음으로, SLC22A18 발현 수준이 높은 SW48 세포주의 경우에는 siRNA를 통해 SLC22A18 발현 수준을 억제시키고, SLC22A18 발현 수준이 낮은 HT29 세포주의 경우에는 SLC22A18을 과발현시키면서 약물 반응성 변화를 확인한 결과, 도 2c 및 2d에 나타낸 바와 같이, siRNA를 통해 SLC22A18의 발현을 낮추었을 때, 대조군에 비해 약물 반응성이 유의하게 낮아지는 반면, 반대로 SLC22A18을 과발현 시켰을 때는 약물 반응성이 유의하게 높아지는 것을 확인하였다.
3-2. 환자유래 세포 (patient derived cell; PDC)에서 SLC22A18 발현에 따른 항암제 반응성 확인
또한, 환자로부터 분리한 환자유래 세포(patient derived cell; PDC) 두 종류 (PDC39, PDC41)에서의 SLC22A18의 발현을 확인하였으며, 그 결과, 2e에 나타낸 바와 같이, PDC41이 PDC39의 발현보다 상대적으로 낮은 것을 확인하였다.
상기 결과를 바탕으로 옥사리플라틴(oxaliplatin)을 각각 세포에 처리하여 세포 생존율을 확인한 결과, 도 2f에 나타낸 바와 같이, SLC22A18 발현이 상대적으로 낮은 PDC41의 경우, 옥사리플라틴에 대한 저항성이 높은 것을 확인하였고, 반대로 SLC22A18 발현이 상대적으로 높은 PDC39의 경우 옥사리플라틴에 대한 저항성이 낮은 것을 확인하였다.
아울러, 상기 결과는 옥사리플라틴의 농도 (50, 100, 200, 400μM) 가 높을수록 저항성의 유의한 차이를 보이는 것을 확인할 수 있었다.
상기 결과로부터, SLC22A18와 항암제 치료 반응성 간의 상관관계가 있음을 알 수 있었다.
실시예 4. SLC22A18 매개 항암제 치료 반응성과 관련된 신호전달체계 분석
SLC22A18과 약물 반응성간 관계는 어떤 신호전달체계가 매개 하는지 확인하기 위하여, SLC22A18 발현 수준이 높은 SW48 세포주의 경우에는 siRNA를 통해 SLC22A18 발현 수준을 억제시키고, SLC22A18 발현 수준이 낮은 HT29 세포주의 경우에는 SLC22A18을 과발현시키면서 western blotting 스크리닝을 진행 한 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, SW48에서 siRNA를 통해 SLC22A18 발현 수준을 낮추면 ERK와 AKT 활성단백이 증가되는 반면, HT29에서 SLC22A18을 과발현시키면 ERK와 AKT 활성단백이 감소됨을 확인하였다. 상기 결과로부터, ERK와 AKT 신호전달 체계가 SLC22A18 매개 약물반응성에 관련된다는 것을 알 수 있었다.
실시예 5. SLC22A18 발현에 따른 항암제 병행 치료 효과 확인
세툭시맙(cetuximab)은 암세포에서 많이 발현되는 표피세포 성장인자 수용체 (Epidermal growth factor, EGFR)를 차단함으로써 ERK, AKT 신호전달을 차단하는 표적치료제이다. 상기 치료제를 항암제와 병행 치료하면, 생존율을 높이고, 질병의 진행을 더디게 할 수 있다.
이에, SW48 세포주에서 siRNA를 통해 SLC22A18 발현 수준을 억제시키면서 세툭시맙(cetuximab)을 처리한 결과, 도 4a에 나타낸 바와 같이, 세툭시맙(cetuximab)은 SLC22A18의 발현을 낮춰도 약물 반응성이 감소하지 않음을 확인하였다. 상기 결과로부터, 세툭시맙(cetuximab)은 SLC22A18 발현 정도와 관계없이 동일한 약물 반응성을 나타내며, 이는 SLC22A18이 낮은 군에서 보이는 ERK/AKT 활성 증가를 세툭시맙(cetuximab)이 억제하므로 나타나는 결과인 것임을 알 수 있었다.
다음으로, SLC22A18 발현 수준이 낮은 HT29 세포주에 옥사리플라틴(oxaliplatin) 단독, 세툭시맙(cetuximab) 단독, 옥사리플라틴(oxaliplatin)/세툭시맙(cetuximab) 병행 처리를 각각 실시한 후, 약물 반응성을 확인한 결과, 도 4b에 나타낸 바와 같이, 옥사리플라틴(oxaliplatin) 단독 처리군은 약물 반응성이 낮은 반면, 세툭시맙(cetuximab) 단독 처리군은 약물 반응성이 높은 것을 확인하였다. 특히, 옥사리플라틴(oxaliplatin)/세툭시맙(cetuximab) 병행 처리 군의 경우, 하나의 항암제만 단독 처리하는 것보다 유의적으로 우수한 효과를 나타내었고, 상기 결과로부터 세툭시맙(cetuximab) 병행 처리는 세포의 옥사리플라틴(oxaliplatin)에 대한 약물 저항성을 극복시킨다는 것을 알 수 있었다.
다음으로, SLC22A18 발현이 높은 SW48 세포주에서 SLC22A18 발현을 낮춘 후 옥사리플라틴(oxaliplatin) 단독, 세툭시맙(cetuximab) 단독, 옥사리플라틴(oxaliplatin)/세툭시맙(cetuximab) 병행 처리를 각각 실시한 후, Western blotting으로 ERK와 AKT 활성단백의 변화를 확인한 결과, 도 4c에 나타낸 바와 같이, SLC22A18 발현을 낮췄을 때 증가된 ERK/AKT의 활성단백이 옥사리플라틴(oxaliplatin)에 의해 근소하게 줄어든 반면, 세툭시맙(cetuximab)은 활성단백 발현을 반 이상 감소 시켰고, 옥사리플라틴(oxaliplatin)과 세툭시맙(cetuximab)을 병행 처리 한 결과, 대조군의 ERK/AKT 활성 단백 발현과 비슷하거나 더 낮아짐을 확인하였다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.
본 발명에 따른 항암제 치료 반응성 예측 기술은 SLC22A18의 발현 수준을 측정함으로써 항암제의 치료 반응성을 효과적으로 예측할 수 있을 뿐만 아니라, 다른 표적 항암제와의 병행 치료의 가능성도 제안할 수 있는바, 대장암의 항암화학요법의 치료효과를 높이는데 유용하게 이용될 수 있을 것으로 기대된다.

Claims (16)

  1. SLC22A18(Solute carrier family 22 member 18) 유전자 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질을 포함하는, 항암제 치료 반응성 예측용 마커 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 SLC22A18 유전자는 서열번호 1로 표시되는 염기서열로 이루어지는 것을 특징으로 하는, 마커 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 항암제는 5-플루오르우라실(5-FU), 옥사리플라틴(oxaliplatin) 및 이리노테칸(irinotecan)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 마커 조성물.
  4. SLC22A18(Solute carrier family 22 member 18) 유전자의 mRNA 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질의 발현수준을 측정하는 제제를 포함하는, 항암제 치료 반응성 예측용 조성물.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 유전자의 mRNA의 수준을 측정하는 제제는 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 센스 및 안티센스 프라이머, 또는 프로브인 것을 특징으로 하는, 예측용 조성물.
  6. 제4항에 있어서,
    상기 단백질의 수준을 측정하는 제제는 상기 단백질에 특이적으로 결합하는 항체인 것을 특징으로 하는, 예측용 조성물.
  7. 제4항에 있어서,
    상기 항암제는 5-플루오르우라실(5-FU), 옥사리플라틴(oxaliplatin) 및 이리노테칸(irinotecan)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 예측용 조성물.
  8. 제4항의 조성물을 포함하는 항암제 치료 반응성 예측용 키트.
  9. 인간 피검체 유래의 생물학적 시료에 대하여, SLC22A18(Solute carrier family 22 member 18) 유전자의 mRNA 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질의 발현수준을 측정하는 단계를 포함하는, 항암제에 대한 치료 반응성을 예측하기 위한 정보제공방법.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 mRNA 수준은 중합효소연쇄반응(PCR), 역전사 중합효소연쇄반응(RT-PCR) 또는 실시간 중합효소연쇄반응(Real-time PCR)의 방법을 통해 측정되는 것을 특징으로 하는, 정보제공방법.
  11. 제9항에 있어서,
    상기 단백질 발현수준은 웨스턴 블롯팅(western blotting), 방사선면역분석법(radioimmunoassay; RIA), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion), 효소면역분석법(ELISA), 면역침강법(immunoprecipitation) 또는 유세포분석법(flow cytometry), 면역형광염색법(immunofluorescence)을 통해 측정되는 것을 특징으로 하는, 정보제공방법.
  12. 제9항에 있어서,
    상기 항암제는 5-플루오르우라실(5-FU), 옥사리플라틴(oxaliplatin) 및 이리노테칸(irinotecan)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 정보제공방법.
  13. (1) in vitro 상에서 세포에 후보물질을 처리하는 단계; 및
    (2) 상기 세포에서 SLC22A18 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질의 발현수준을 측정하는 단계를 포함하는, 항암제 내성 억제제 스크리닝 방법.
  14. 제13항에 있어서,
    후보물질 비처리군에 비해 상기 SLC22A18 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질의 발현 수준을 증가시키는 물질을 항암제 내성 억제제로 선정하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 스크리닝 방법.
  15. 제13항에 있어서,
    상기 항암제는 5-플루오르우라실(5-FU), 옥사리플라틴(oxaliplatin) 및 이리노테칸(irinotecan)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 스크리닝 방법.
  16. 제13항에 있어서,
    상기 후보물질은 핵산, 화합물, 미생물 배양액 또는 추출물, 천연물 추출물, 펩타이드, 기질 유사체, 압타머(aptamer), 및 항체로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 스크리닝 방법.
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