KR102157895B1 - 대장암 환자의 항암제 치료 반응성 예측용 마커 - Google Patents

Abstract

본 발명은 항암제 치료 반응성 예측용 마커 및 이의 용도에 관한 것으로서, 본 발명에 따른 항암제 치료 반응성 예측 기술은 SLC22A18의 발현 수준을 측정함으로써 항암제의 치료 반응성을 효과적으로 예측할 수 있을 뿐만 아니라, 다른 표적 항암제와의 병행 치료의 가능성도 제안할 수 있는바, 대장암의 항암화학요법의 치료효과를 높이는 데 유용하게 이용될 수 있을 것으로 기대된다.

Description

대장암 환자의 항암제 치료 반응성 예측용 마커{Markers for predicting the response of a patient with colorectal cancer to anti-cancer drugs}

본 발명은 항암제 치료 반응성 예측용 마커에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 대장암 환자에서 SLC22A18(Solute carrier family 22 member 18) 유전자 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질을 포함하는 항암제 치료 반응성 예측용 마커 조성물, 상기 유전자 또는 단백질 수준을 측정하는 제제를 포함하는 항암제 치료 반응성 예측용 조성물, 및 항암제 치료 반응성 예측을 위한 정보제공방법 등에 관한 것이다.

현재까지 다양한 암에 대한 많은 항암제가 개발되었음에도 불구하고, 항암제만으로 완치가 가능한 암은 소수암에 불과한데, 그 이유는 항암제를 이용한 암 치료 시 항암제에 암 세포가 반응하지 않거나, 초기에는 효과적으로 종양이 줄어들지만 치료 도중 또는 치료 후에 항암제에 대한 내성이 생기기 때문이다. 따라서, 효과적인 항암 치료를 위해서는 항암제에 대한 암세포의 내성 등 항암제에 대한 저항성을 극복하여야 한다.

한편, 대장암은 전 세계적으로 매우 빈번하게 발생하는 암으로서, 대장암 1-3기인 경우 수술적 절제가 근본적 치료 방법이며, 3기인 경우에는 수술 후 재발률을 낮추기 위해 보조 항암화학요법을 시행하는 것이 표준 치료이다. 3기 대장암에서 수술 후 항암제 치료를 하지 않으면 재발률이 50-60%이나, 항암화학요법을 하면 재발률을 30-40% 정도로 줄일 수 있으며 생존율은 10% 정도 향상시킨다고 알려져 있다.

현재, 대장암 치료에 잘 알려진 항암제는 5-플루오르우라실(5-FU)인데, 주사약제인 옥사리플라틴(oxaliplatin) 또는 이리노테칸(irinotecan)을 5-FU와 함께 사용하는 병합요법 (FOLFOX, FOLFIRI)이 표준치료로 이용되고 있다. 이러한 치료법은 치료반응을 관찰하여, 약물 반응성이 좋을 경우 지속하고, 약물 반응성이 없으면 항암제를 변경하게 되는데, 이 과정 중 암이 더욱 진행되는 경우가 많다. 또한, 비슷한 임상적 특징을 가지는 환자들 중에서도 항암화학요법에 대한 반응이 다양하게 나타나고, 같은 병기의 환자라 할지라도 환자의 생존에 상당한 차이를 보인다. 더욱이, 항암제에 대한 치료 반응은 개인별로 달라, 환자의 유전 상태에 따라 항암제를 선택하여 사용하는 개인 맞춤형 치료의 개념이 부상되고 있으나, 환자 개개인의 특성에 입각한 항암 치료의 반응성을 예측하는 방법은 전무한 실정이다.

따라서 대장암 환자에서 항암 치료의 반응성을 예측할 수 있는 표지자 개발이 절실한 실정이고, 이에 대한 연구가 이루어지고 있으나(특허공개번호 10-2017-0012816 등), 아직 미흡한 실정이다.

상기와 같은 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로서, 본 발명자들은 대장암 환자에서 항암제 치료 반응성과 관련성을 갖는 바이오마커를 발굴하기 위해 연구 노력한 결과, SLC22A18(Solute carrier family 22 member 18) 발현 수준과 항암제 내성간의 상관관계가 있음을 확인하고, 이에 기초하여 본 발명을 완성하였다.

이에, 본 발명은 SLC22A18(Solute carrier family 22 member 18) 유전자 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질을 포함하는, 항암제 치료 반응성 예측용 마커 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 SLC22A18(Solute carrier family 22 member 18) 유전자의 mRNA 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질의 발현수준을 측정하는 제제를 포함하는, 항암제 치료 반응성 예측용 조성물을 제공하는 것을 다른 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 인간 피검체 유래의 생물학적 시료에 대하여, SLC22A18(Solute carrier family 22 member 18) 유전자의 mRNA 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질의 발현수준을 측정하는 단계를 포함하는, 항암제에 대한 치료 반응성을 예측하기 위한 정보제공방법을 제공하는 것을 또 다른 목적으로 한다.

또한, 본 발명은, (1) in vitro 상에서 세포에 후보물질을 처리하는 단계; 및 (2) 상기 세포에서 SLC22A18 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질의 발현수준을 측정하는 단계를 포함하는, 항암제 내성 억제제 스크리닝 방법을 제공하는 것을 또 다른 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 옥사리플라틴(oxaliplatin)을 유효성분으로 포함하는, SLC22A18 유전자를 갖는 대장암 환자의 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것을 또 다른 목적으로 한다.

그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 SLC22A18(Solute carrier family 22 member 18) 유전자 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질을 포함하는, 항암제 치료 반응성 예측용 마커 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 구현예로, 상기 SLC22A18 유전자는 서열번호 1로 표시되는 염기서열로 이루어질 수 있다.

본 발명의 다른 구현예로, 상기 항암제는 5-플루오르우라실(5-FU), 옥사리플라틴(oxaliplatin) 및 이리노테칸(irinotecan)으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.

또한, 본 발명은 SLC22A18(Solute carrier family 22 member 18) 유전자의 mRNA 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질의 발현수준을 측정하는 제제를 포함하는, 항암제 치료 반응성 예측용 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 구현예로, 상기 유전자의 mRNA의 수준을 측정하는 제제는 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 센스 및 안티센스 프라이머, 또는 프로브일 수 있다.

본 발명의 다른 구현예로, 상기 단백질의 수준을 측정하는 제제는 상기 단백질에 특이적으로 결합하는 항체일 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 항암제 치료 반응성 예측용 키트를 제공한다.

또한, 본 발명은 인간 피검체 유래의 생물학적 시료에 대하여, SLC22A18(Solute carrier family 22 member 18) 유전자의 mRNA 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질의 발현수준을 측정하는 단계를 포함하는, 항암제에 대한 치료 반응성을 예측하기 위한 정보제공방법을 제공한다.

본 발명의 일 구현예로, 상기 mRNA 수준은 중합효소연쇄반응(PCR), 역전사 중합효소연쇄반응(RT-PCR) 또는 실시간 중합효소연쇄반응(Real-time PCR)의 방법을 통해 측정될 수 있다.

본 발명의 다른 구현예로, 상기 단백질 발현수준은 웨스턴 블롯팅(western blotting), 방사선면역분석법(radioimmunoassay; RIA), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion), 효소면역분석법(ELISA), 면역침강법(immunoprecipitation) 또는 유세포분석법(flow cytometry), 면역형광염색법(immunofluorescence)을 통해 측정될 수 있다.

또한, 본 발명은, (1) in vitro 상에서 세포에 후보물질을 처리하는 단계; 및 (2) 상기 세포에서 SLC22A18 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질의 발현수준을 측정하는 단계를 포함하는, 항암제 내성 억제제 스크리닝 방법을 제공한다.

본 발명의 일 구현예로, 후보물질 비처리군에 비해 상기 SLC22A18 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질의 발현수준을 증가시키는 물질을 항암제 내성 억제제로 선정하는 단계를 더 포함할 수 있다.

본 발명의 다른 구현예로, 상기 후보물질은 핵산, 화합물, 미생물 배양액 또는 추출물, 천연물 추출물, 펩타이드, 기질 유사체, 압타머(aptamer), 및 항체로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.

또한, 본 발명은 옥사리플라틴(oxaliplatin)을 유효성분으로 포함하는, SLC22A18 유전자를 갖는 대장암 환자의 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 항암제 치료 반응성 예측 기술은 SLC22A18의 발현 수준을 측정함으로써 항암제의 치료 반응성을 효과적으로 예측할 수 있을 뿐만 아니라, 다른 표적 항암제와의 병행 치료의 가능성도 제안할 수 있는바, 대장암의 항암화학요법의 치료효과를 높이는 데 유용하게 이용될 수 있을 것으로 기대된다.

도 1a는 337명의 대장암 환자 조직을 이용하여 SLC22A18을 염색한 후, 발현 정도에 따라 저발현군(0, +1)과 고발현군(+2, +3)을 판독한 결과이다.
도 1b는 SLC22A18 저발현 및 고발현군에 대해 Kaplan-Meier 분석방법을 통해 SLC22A18 발현 정도에 따른 사망률 및 재발률을 측정한 결과이다.
도 2a는 다양한 대장암 세포주를 대상으로 SLC22A18 발현 정도를 western blotting을 통해 확인한 결과이다.
도 2b는 SLC22A18 발현 수준이 낮은 세포주(SW480 및 HT29)와 발현 수준이 높은 세포주(HCT116 및 SW48)간의 옥사리플라틴(oxaliplatin)에 대한 약물 반응성을 비교한 결과이다.
도 2c는 SLC22A18 발현 수준이 높은 SW48 세포주를 사용하여 siRNA를 통해 SLC22A18 발현 수준을 억제시키고 약물 반응성 변화를 확인한 결과이다.
도 2d는 SLC22A18 발현 수준이 낮은 HT29 세포주를 사용하여 SLC22A18을 과발현시키면서 약물 반응성 변화를 확인한 결과이다.
도 2e는 환자유래 세포 (Patient derived cell; PDC) 중 두 종류 (PDC39 및 PDC41)세포를 대상으로 SLC22A18 발현 정도를 western blotting을 통해 확인한 결과이다.
도 2f는 SLC22A18 발현 수준이 낮은 PDC 세포 (PDC41)와 발현 수준이 높은 PDC 세포 (PDC39)간의 옥살리플라틴(oxaliplatin)에 대한 약물 반응성을 비교한 결과이다.
도 3은 SLC22A18 발현 수준이 높은 SW48 세포주의 경우에는 siRNA를 통해 SLC22A18 발현 수준을 억제시키고, SLC22A18 발현 수준이 낮은 HT29 세포주의 경우에는 SLC22A18을 과발현시키면서 western blotting을 통해 ERK와 AKT 활성단백의 증감을 확인한 결과이다.
도 4a는 SLC22A18 발현 수준이 높은 SW48 세포주에서 siRNA를 통해 SLC22A18 발현 수준을 억제시키면서 세툭시맙(cetuximab)을 처리한 결과이다.
도 4b는 SLC22A18 발현 수준이 낮은 HT29 세포주에 옥사리플라틴(oxaliplatin) 단독, 세툭시맙(cetuximab) 단독, 옥사리플라틴(oxaliplatin)/세툭시맙(cetuximab) 병행 처리를 각각 실시한 후, 약물 반응성을 확인한 결과이다.
도 4c는 SLC22A18 발현이 높은 SW48 세포주에서 SLC22A18 발현을 낮춘 후 옥사리플라틴(oxaliplatin) 단독, 세툭시맙(cetuximab) 단독, 옥사리플라틴(oxaliplatin)/세툭시맙(cetuximab) 병행 처리를 각각 실시한 후, western blotting으로 ERK와 AKT 활성단백의 변화를 확인한 결과이다.

본 발명은 SLC22A18(Solute carrier family 22 member 18) 유전자 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질을 포함하는, 항암제 치료 반응성 예측용 마커 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 SLC22A18(Solute carrier family 22 member 18) 유전자의 mRNA 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질의 발현수준을 측정하는 제제를 포함하는 항암제 치료 반응성 예측용 조성물 및 이를 포함하는 항암제 치료 반응성 예측용 키트를 제공한다.

본 발명에 따른 SLC22A18(Solute carrier family 22 member 18) 유전자 (NM_002555.5; Homo sapiens solute carrier family 22 member 18 (SLC22A18), transcript variant 1, mRNA)는 서열번호 1의 염기서열로 이루어질 수 있으며, 상기 염기서열의 상동체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 보다 구체적으로, 상기 유전자는 서열번호 1의 염기서열과 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기서열을 포함할 수 있다.

본 발명에서 용어 '항암제 반응성 예측용 마커'란 항암제 투약이 암의 치료에 유용할 수 있는지의 여부를 투약 전에 예측하는데 사용하기 위한 물질로서, 이의 발현량을 측정하여 항암제에 대한 반응성을 예측하는데 사용된다. 이러한 마커에는 핵산, 폴리펩타이드, 단백질, 지질 또는 당 등과 같은 유기 생체 분자 등이 포함될 수 있다. 본 발명의 목적상, 항암제 치료 반응성 예측용 마커는 대장암 환자에서 항암제 치료 반응성을 예측할 수 있는 핵산 또는 폴리펩타이드 마커이다.

본 발명에서, 항암제는 5-플루오르우라실(5-FU), 옥사리플라틴(oxaliplatin) 및 이리노테칸(irinotecan)으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으나, 이것으로 제한되는 것은 아니다.

본 발명자들은 SLC22A18(Solute carrier family 22 member 18) 발현 수준과 항암제 내성이 밀접한 연관성이 있고, 상기 연관성에 대한 신호전달경로를 최초로 규명하였다.

본 발명의 일 실시예에서는 SLC22A18 발현에 따른 사망률 및 재발률 변화를 비교한 결과, SLC22A18 발현이 낮을수록 대장암 환자에서 사망률 및 재발률이 유의적으로 높음을 확인하였다(실시예 2 참조).

본 발명의 다른 실시예에서는 SLC22A18 발현에 따른 옥사리플라틴 반응성을 대장암 세포주 및 환자유래 세포 (PDC)에 처리하여 비교한 결과, SLC22A18 발현이 낮을 때 옥사리플라틴에 대한 저항성을 증가시킴으로써 약물 반응성이 낮으며, 반대의 경우에는 약물 반응성이 유의하게 높아지는 것을 확인하였다(실시예 3 참조).

상기 결과들을 통해 SLC22A18 유전자 또는 상기 유전자가 암호화하는 단백질이 대장암에서 옥사리플라틴의 치료 반응성을 예측할 수 있는 마커로 유용하게 이용될 수 있고, 옥사리플라틴의 항암 치료 효과가 SLC22A18 유전자를 갖는 특정 환자군에서 유의적으로 우수하다는 것을 알 수 있다(실시예 3 참조).

본 발명에서, SLC22A18 유전자의 mRNA 수준을 측정하는 제제는 mRNA에 상보적으로 결합하는 센스 및 안티센스 프라이머, 또는 프로브일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 사용되는 용어, '프라이머'란 DNA 합성의 기시점이 되는 짧은 유전자 서열로써, 진단, DNA 시퀀싱 등에 이용할 목적으로 합성된 올리고뉴클레오티드를 의미한다. 상기 프라이머들은 통상적으로 15 내지 30 염기쌍의 길이로 합성하여 사용할 수 있으나, 사용 목적에 따라 달라질 수 있으며, 공지된 방법으로 메틸화, 캡화 등으로 변형시킬 수 있다.

본 발명에서 사용되는 용어, '프로브'란 효소 화학적인 분리정제 또는 합성과정을 거쳐 제작된 수 염기 내지 수백 염기길이의 mRNA와 특이적으로 결합할 수 있는 핵산을 의미한다. 방사성 동위원소나 효소 등을 표지하여 mRNA의 존재 유무를 확인할 수 있으며, 공지된 방법으로 디자인하고 변형시켜 사용할 수 있다.

상기 단백질 수준을 측정하는 제제는 유전자가 코딩하는 단백질에 특이적으로 결합하는 항체일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 사용되는 용어, '항체'는 면역학적으로 특정 항원과 반응성을 갖는 면역글로불린 분자를 포함하며, 단클론(monoclonal) 항체 및 다클론(polyclonal) 항체를 모두 포함한다. 또한, 상기 항체는 키메라성 항체(예를 들면, 인간화 뮤린 항체) 및 이종결합항체(예를 들면, 양특이성 항체)와 같은 유전공학에 의해 생산된 형태를 포함한다.

본 발명의 항암제 치료 반응성 예측용 키트는 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성성분 조성물, 용액 또는 장치로 구성될 수 있다.

예컨대, 본 발명의 키트는 PCR을 수행하기 위해, 분석하고자 하는 시료로부터 유래된 게놈 DNA, 본 발명의 마커 유전자에 대해 특이적인 프라이머 세트, 적당량의 DNA 중합 효소, dNTP 혼합물, PCR 완충용액 및 물을 포함하는 키트일 수 있다. 상기 PCR 완충용액은 KCl, Tris-HCl 및 MgCl₂를 함유할 수 있다. 이외에 PCR 산물의 증폭 여부를 확인할 수 있는 전기영동 수행에 필요한 구성 성분들이 본 발명의 키트에 추가로 포함될 수 있다.

또한, 본 발명의 키트는 RT-PCR을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 키트일 수 있다. RT-PCR 키트는 마커 유전자에 대한 특이적인 각각의 프라이머 쌍 외에도 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액, 데옥시뉴클레오티드(dNTPs), Taq-폴리머레이즈 및 역전사 효소와 같은 효소, DNase, RNase 억제제, DEPC-수(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다. 또한, 정량 대조군으로 사용되는 유전자에 특이적인 프라이머 쌍을 포함할 수 있다.

또한, 본 발명의 키트는 DNA 칩을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 키트일 수 있다. DNA 칩 키트는, 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA가 프로브로 부착되어 있는 기판을 포함하고, 기판은 정량구조 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA를 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 키트는 본 발명의 마커 유전자가 고정화되어 있는 기판을 갖는 마이크로어레이 형태일 수 있다.

또한, 본 발명의 다른 양태로서, 본 발명은 인간 피검체 유래의 생물학적 시료에 대하여, SLC22A18(Solute carrier family 22 member 18) 유전자의 mRNA 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질의 발현수준을 측정하는 단계를 포함하는, 항암제에 대한 치료 반응성을 예측하기 위한 정보제공방법을 제공한다.

본 발명에서, 피검체 유래의 생물학적 시료는 조직, 세포, 전혈, 혈액, 타액, 객담, 뇌척수액 및 뇨 등을 포함할 수 있으나, 이것으로 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서, mRNA의 발현수준은 당업계에 알려진 통상적인 방법으로 중합효소연쇄반응(PCR), 역전사 중합효소연쇄반응(RT-PCR), 실시간 중합효소연쇄반응등의 방법을 통해 측정될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에서, 단백질 발현수준은 당업계에 알려진 통상적인 방법으로 웨스턴 블롯팅(western blotting), 방사선면역분석법(radioimmunoassay; RIA), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion), 효소면역분석법(ELISA), 면역침강법(immunoprecipitation), 유세포분석법(flow cytometry), 면역형광염색법(immunofluorescence) 등의 방법을 통해 측정될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 본 발명의 또 다른 실시예에서는 siRNA를 통해 SLC22A18 발현 수준을 억제시키는 경우에는 ERK와 AKT 활성단백이 증가하면서 약물 반응성이 유의하게 낮아지는 반면, 반대로 SLC22A18을 과발현 시켰을 때는 ERK와 AKT 활성단백이 감소하면서 약물 반응성이 유의하게 높아지는 것을 확인하였는바(실시예 3 및 4 참조), SLC22A18 발현 또는 활성을 증가시키는 물질은 항암제 내성을 억제하는 조성물의 유효성분으로 사용될 수 있는바, SLC22A18는 항암제 내성 억제제를 스크리닝하는데 이용될 수 있다.

이에, 본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은,

(1) in vitro 상에서 세포에 후보물질을 처리하는 단계; 및

(2) 상기 세포에서 SLC22A18 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질의 발현수준을 측정하는 단계를 포함하는, 항암제 내성 억제제 스크리닝 방법을 제공한다.

본 발명에 따른 항암제 내성 억제제 스크리닝 방법은 후보물질 비처리군에 비해 SLC22A18 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질의 발현수준을 증가시키는 경우, 항암제 내성을 억제하는 물질로 선정하는 단계를 더 포함할 수 있다.

본 발명에서, 상기 후보물질은 화합물, 미생물 배양액 또는 추출물, 천연물 추출물, 핵산, 및 펩타이드로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있고, 상기 핵산은 바람직하게 siRNA, shRNA, microRNA, 안티센스 RNA, 앱타머(aptamer), LNA(locked nucleic acid), PNA(peptide nucleic acid), 및 모폴리노(morpholino)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 옥사리플라틴(oxaliplatin)을 유효성분으로 포함하는, SLC22A18 유전자를 갖는 대장암 환자의 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

[실시예]

실시예 1. 실험준비 및 실험방법

1-1. 환자 및 데이터 수집

2006년부터 2007년까지 삼성서울병원(성균관대학교 의과대학)에 방문한 1기(76명), 2기(87명), 3기(91명), 4기(83명)의 대장암 환자에서 paraffin embedded sample을 만들었다. 모든 환자는 대장암으로 외과 수술을 받았고, 데이터베이스에 입력되었다. 수집된 의학기록 및 수술기록을 바탕으로 임상데이터를 후향적 분석하였고, 본 실험은 삼성의료원 기관윤리심의위원회(IRB No. 2010-09-017)의 승인을 받았다.

1-2. Tissue microarray (TMA) 분석

조직 microarray 및 면역조직화학은 SLC22A18의 염색 상태를 분석하기 위해 시행되었다. 직경 2mm의 조직 core를 블럭당 24개의 구멍이 있는 파라핀 블록에 조심스럽게 옮겼다. 채워진 블록을 파라핀에 끼우고 4μm 두께의 절편으로 잘라내어 슬라이드 위에 올려놓았다. TMA 슬라이드를 55℃에서 30분 동안 가열하여 왁스를 제거한 후, 가수 처리를 위해 xylene으로 5분씩 3회 세척하고 순차적으로 100%, 95% 및 80% 에탄올과 3차 증류수까지 각 5분씩 세척하였다. Antigen retrieval은 10mM 시트르산 나트륨 (pH 6.0)에서 95℃에서 30분 동안 가열하여 얻었다. Endogenous peroxidase 활성은 30분 동안 3% 과산화수소에 넣어두어서 차단하였다. universal blocking serum (Dako Diagnostics, Glostrup, Denmark)을 사용하여 실온에서 30분 동안 background 반응성을 제거하였다. 슬라이드를 SLC22A18(LS-C119205, LS Bio, Seattle, WA, USA)에 특이적인 항체와 1시간 동안 반응시켰다. 이어서, 이들을 biotin 표지된 2차 항체로 30분 동안 반응시켰다. Streptabvidin-peroxidase (Dako Diagnostics)를 적용하여 단백질 발현을 확인하고자 hematoxylin으로 대조염색을 실시한 후, 슬라이드를 탈수시키고 현미경 검사를 위해 coverslips을 장착하였다. 면역조직화학 염색의 강도에 의해 SLC22A18 발현을 평가하였다. 염색 된 상피 세포의 강도를 병리학자가 평가하고 0 (무 착색), +1 (약한), +2 (보통) 및 +3 (강한)으로 점수를 나누었다. 환자는 평가 점수에 따라 낮은 발현 군 (점수 0, +1)과 높은 발현 군 (점수 +2, +3)으로 2개의 군으로 나누었다.

1-3. 세포배양 및 시약

American Type Culture Collection(ATCC, Manassas, VA)에서 SW480, HT29, HCT116, SW48, RKO, DLD-1, LoVo, HCT15, Colo205, LS513 및 SW620 대장암 세포를 구매하고 RPMI 1640 (Gibco, Grand Island, NY, USA)에 10% FBS (Gibco, Grand Island, NY, USA)와 1% 페니실린-스트렙토마이신 (Gibco, Grand Island, NY, USA)을 넣고 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 배양하였다. Oxaliplatin과 cetuximab은 selleckchem (Houston, TX, USA)에서 구입했다.

1-4. 세포 증식 분석

세포 증식은 water-soluble tetrazolium salt인 WST-1(Roche, Indianapolis, IN)의 대사 전환을 평가함으로써 세포 생존력을 결정하는 형광파장분석을 사용하여 3회 측정되었다. 생존력은 대장암 세포에서 다양한 시간에 평가되었고, 분석은 WST-1을 세포배양배지에 직접 첨가하여 37℃에서 60-120분 동안 배양하였다. 흡광도는 파장 450nm에서 측정하였다. 세 가지 실험이 각 실험 조건에 대해 수행되었다.

1-5. siRNA와 벡터의 형질주입

SLC22A18 및 scrambled control siRNA에 대한 특정 siRNA는 bioneer(한국)로부터 구입하였다. 형질주입에 사용된 SLC22A18 siRNA의 두 가지 표적 염기서열은 다음과 같다:

5'- GACUGGCAAUAAACUCCUA - 3' (서열번호 2)

5'- CAGAACUUACCUGCCUCUU-3' (서열번호 3)

SLC22A18 발현 벡터 및 대조군 pcDNA3.1 벡터는 김재상 박사(이화여자대학교 생명과학부)가 제공하였다. Lipofectamine 2000 또는 Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen)를 사용하여 형질주입 실험을 하였고, 6 well plate의 1개 well당 1x10⁵세포를 18시간 성장시킨 후 바닥면의 60-70% 농도로 만들었다. Lipofectamine-plasmid 복합체는 제조자의 지시에 따라 제조하였다. 24-72시간 후에 형질주입 효율과 세포 생존율을 분석했다.

1-6. 세포용해 및 Western blot 분석

전체 세포 추출물을 얻기 위해 Pro-prep buffer (Intron Biotechnology, Seoul, Korea)에 protease inhibitor와 phosphatase inhibitor를 포함하여 세포를 용해시켰다. 10-60μg의 단백질 추출물을 SDS-PAGE로 분석하고 PVDF membrane으로 옮긴 후 BSA와 skim milk를 사용하여서 blocking 및 antibody를 반응시켰다. SLC22A18 (LS-C119205, LS bio), phospho ERK (# 612358 BD biosciences), phospho ERK (#612358, BD biosciences), ERK (#9102, Cell Signaling), phospho AKT (#4060, Cell Signaling), AKT (#4691, Cell Signaling) and β-actin (#3700, Cell Signaling)을 1차 항체로 사용하였고, 1차 항체 반응 후에 horseradish peroxidase (Santa-Cruz)에 접합된 2차 항체를 반응시켰다. β-actin은 western blot 분석에서 대조군으로 사용되었다.

1-7. 통계 분석

Bonferroni post hoc test를 사용하여 post-hoc 분석과 함께 ANOVA을 적용한 GraphPad Prism 5.0 소프트웨어 (CA, USA)를 사용하여 증식 데이터를 분석했다. 모든 실험은 적어도 세 번 이상 수행되었다. 임상 데이터 분석을 위해 SPSS 버전 19.0 소프트웨어 (SPSS Inc., Chicago, Illinois, USA)를 사용하여 통계 처리를 수행했다. 생존율은 Kaplan-Meier 방법을 사용하여 추정하고 log-rank test로 비교하였다. 그룹 간의 차이는 p <0.05 일 때 통계적으로 유의하다고 간주했다.

실시예 2. 대장암 환자에서 SLC22A18 발현에 따른 사망률 및 재발률 변화 비교

상기 실시예 1-1에 의해 수집된 337명의 대장암 환자 조직을 이용하여 상기 실시예 1-2에 따라 SLC22A18을 염색한 후, 발현 정도에 따라 0, +1, +2, +3으로 판독을 하였고, 판독 점수가 0, +1인 경우를 저발현군으로, +2, +3인 경우를 고발현군으로 분류하였다(도 1a).

그 결과, 하기 표 1에 나타낸 바와 같이, 전체 대상 환자 337명 중 SLC22A18 저발현군은 233명, 고발현군은 104명이었다. SLC22A18 저발현군, SLC22A18 고발현군의 임상적 특징을 비교 분석해 보니, 남성이 여성보다 SLC22A18발현이 낮았고(p=0.008), CEA 레벨은 SLC22A18 저발현 군에서 유의하게 높음을 확인하였다(p=0.015). 또한, 환자의 병기가 증가할수록, SLC22A18 발현이 낮은 군이 유의하게 많았으며(p<0.001), 미분화 대장암 환자수도 SLC22A18 발현이 낮은 군에서 유의하게 높았고(p=0.001), 혈관침습도도 저발현군에서 유의하게 높음을 확인하였다(p=0.021).

[표 1]

더욱이, 저발현군 및 고발현군에 대해 Kaplan-Meier 분석방법을 통해 SLC22A18 발현 정도에 따른 생존율을 측정하였다. 그 결과, 도 1b에 나타낸 바와 같이, SLC22A18 저발현군의 사망률 및 재발률이 고발현군에 비해 유의성 있게 높음을 확인하였다.

실시예 3. SLC22A18 발현에 따른 항암제 반응성 비교 검증(in vitro)

3-1. 대장암 세포주에서 SLC22A18 발현에 따른 항암제 반응성 확인

먼저, 다양한 대장암 세포주를 대상으로 SLC22A18 발현 정도를 western blotting을 통해 확인한 결과, 도 2a에 나타낸 바와 같이, 대장암 세포주에 따라 SLC22A18의 발현 정도가 다양함을 확인하였고, 특히 SW480 및 HT29에서는 SLC22A18 발현이 낮은 반면, HCT116 및 SW48에서는 SLC22A18 발현 수준이 높음을 확인하였다.

다음으로, SLC22A18 발현 수준이 낮았던 세포주(SW480 및 HT29)와 발현 수준이 높았던 세포주(HCT116 및 SW48)간의 옥사리플라틴(oxaliplatin)에 대한 약물 반응성을 확인하였다. 그 결과, 도 2b에 나타낸 바와 같이, SLC22A18 발현 수준이 높았던 세포주(HCT116 및 SW48)의 경우 항암제에 대한 약물 반응성이 좋았고, SLC22A18 발현 수준이 낮았던 세포주(SW480 및 HT29)의 경우엔 약물 반응성이 좋지 않음을 확인하였다.

다음으로, SLC22A18 발현 수준이 높은 SW48 세포주의 경우에는 siRNA를 통해 SLC22A18 발현 수준을 억제시키고, SLC22A18 발현 수준이 낮은 HT29 세포주의 경우에는 SLC22A18을 과발현시키면서 약물 반응성 변화를 확인한 결과, 도 2c 및 2d에 나타낸 바와 같이, siRNA를 통해 SLC22A18의 발현을 낮추었을 때, 대조군에 비해 약물 반응성이 유의하게 낮아지는 반면, 반대로 SLC22A18을 과발현 시켰을 때는 약물 반응성이 유의하게 높아지는 것을 확인하였다.

3-2. 환자유래 세포 (patient derived cell; PDC)에서 SLC22A18 발현에 따른 항암제 반응성 확인

또한, 환자로부터 분리한 환자유래 세포(patient derived cell; PDC) 두 종류 (PDC39, PDC41)에서의 SLC22A18의 발현을 확인하였으며, 그 결과, 2e에 나타낸 바와 같이, PDC41이 PDC39의 발현보다 상대적으로 낮은 것을 확인하였다.

상기 결과를 바탕으로 옥사리플라틴(oxaliplatin)을 각각 세포에 처리하여 세포 생존율을 확인한 결과, 도 2f에 나타낸 바와 같이, SLC22A18 발현이 상대적으로 낮은 PDC41의 경우, 옥사리플라틴에 대한 저항성이 높은 것을 확인하였고, 반대로 SLC22A18 발현이 상대적으로 높은 PDC39의 경우 옥사리플라틴에 대한 저항성이 낮은 것을 확인하였다.

아울러, 상기 결과는 옥사리플라틴의 농도 (50, 100, 200, 400μM) 가 높을수록 저항성의 유의한 차이를 보이는 것을 확인할 수 있었다.

상기 결과로부터, SLC22A18와 항암제 치료 반응성 간의 상관관계가 있음을 알 수 있었다.

실시예 4. SLC22A18 매개 항암제 치료 반응성과 관련된 신호전달체계 분석

SLC22A18과 약물 반응성간 관계는 어떤 신호전달체계가 매개 하는지 확인하기 위하여, SLC22A18 발현 수준이 높은 SW48 세포주의 경우에는 siRNA를 통해 SLC22A18 발현 수준을 억제시키고, SLC22A18 발현 수준이 낮은 HT29 세포주의 경우에는 SLC22A18을 과발현시키면서 western blotting 스크리닝을 진행한 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, SW48에서 siRNA를 통해 SLC22A18 발현 수준을 낮추면 ERK와 AKT 활성단백이 증가되는 반면, HT29에서 SLC22A18을 과발현시키면 ERK와 AKT 활성단백이 감소됨을 확인하였다. 상기 결과로부터, ERK와 AKT 신호전달 체계가 SLC22A18 매개 약물반응성에 관련된다는 것을 알 수 있었다.

실시예 5. SLC22A18 발현에 따른 항암제 병행 치료 효과 확인

세툭시맙(cetuximab)은 암세포에서 많이 발현되는 표피세포 성장인자 수용체 (Epidermal growth factor, EGFR)를 차단함으로써 ERK, AKT 신호전달을 차단하는 표적치료제이다. 상기 치료제를 항암제와 병행 치료하면, 생존율을 높이고, 질병의 진행을 더디게 할 수 있다.

이에, SW48 세포주에서 siRNA를 통해 SLC22A18 발현 수준을 억제시키면서 세툭시맙(cetuximab)을 처리한 결과, 도 4a에 나타낸 바와 같이, 세툭시맙(cetuximab)은 SLC22A18의 발현을 낮춰도 약물 반응성이 감소하지 않음을 확인하였다. 상기 결과로부터, 세툭시맙(cetuximab)은 SLC22A18 발현 정도와 관계없이 동일한 약물 반응성을 나타내며, 이는 SLC22A18이 낮은 군에서 보이는 ERK/AKT 활성 증가를 세툭시맙(cetuximab)이 억제하므로 나타나는 결과인 것임을 알 수 있었다.

다음으로, SLC22A18 발현 수준이 낮은 HT29 세포주에 옥사리플라틴(oxaliplatin) 단독, 세툭시맙(cetuximab) 단독, 옥사리플라틴(oxaliplatin)/세툭시맙(cetuximab) 병행 처리를 각각 실시한 후, 약물 반응성을 확인한 결과, 도 4b에 나타낸 바와 같이, 옥사리플라틴(oxaliplatin) 단독 처리군은 약물 반응성이 낮은 반면, 세툭시맙(cetuximab) 단독 처리군은 약물 반응성이 높은 것을 확인하였다. 특히, 옥사리플라틴(oxaliplatin)/세툭시맙(cetuximab) 병행 처리 군의 경우, 하나의 항암제만 단독 처리하는 것보다 유의적으로 우수한 효과를 나타내었고, 상기 결과로부터 세툭시맙(cetuximab) 병행 처리는 세포의 옥사리플라틴(oxaliplatin)에 대한 약물 저항성을 극복시킨다는 것을 알 수 있었다.

다음으로, SLC22A18 발현이 높은 SW48 세포주에서 SLC22A18 발현을 낮춘 후 옥사리플라틴(oxaliplatin) 단독, 세툭시맙(cetuximab) 단독, 옥사리플라틴(oxaliplatin)/세툭시맙(cetuximab) 병행 처리를 각각 실시한 후, Western blotting으로 ERK와 AKT 활성단백의 변화를 확인한 결과, 도 4c에 나타낸 바와 같이, SLC22A18 발현을 낮췄을 때 증가된 ERK/AKT의 활성단백이 옥사리플라틴(oxaliplatin)에 의해 근소하게 줄어든 반면, 세툭시맙(cetuximab)은 활성단백 발현을 반 이상 감소 시켰고, 옥사리플라틴(oxaliplatin)과 세툭시맙(cetuximab)을 병행 처리한 결과, 대조군의 ERK/AKT 활성 단백 발현과 비슷하거나 더 낮아짐을 확인하였다.

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

<110> SAMSUNG LIFE PUBLIC WELFARE FOUNDATION <120> Markers for predicting the response of a patient with colorectal cancer to anti-cancer drugs <130> PD17-085-P1-D1 <150> KR 10-2017-0078527 <151> 2017-06-21 <160> 3 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1555 <212> DNA <213> SLC22A18 <400> 1 atcccggaag gaccggtgtc taggtcaccc tggagcgctc accccaccgg cacccgtgcc 60 caagcccgcc cctgcaaagg caggcaaggc caggcgggtg ctgcctggga cccagtgact 120 cagcacccct gcccggatca actggacttt tgccccctgc tccgccagcc tcctgcttgg 180 atctctcctg ggtctccctg ctgcgcctgt ccaggatgca gggagctcgg gctcccaggg 240 accagggccg gtcccccggc aggatgagcg ctctaggccg gtcctcggtc atcttgctta 300 cctacgtgct ggccgccaca gaacttacct gcctcttcat gcagttctcc atcgtgccat 360 acctgtctcg gaaactgggc ctggattcca ttgccttcgg ctacctgcaa accaccttcg 420 gggtgctgca gctgctgggc gggccggtat ttggcaggtt cgcagaccag cgcggggcgc 480 gggcggcgct cacgctctcc ttcctggctg ccttggcgct ctacctgctc ctggcggccg 540 cctccagccc ggccctgccc ggggtctacc tgctcttcgc ctcgcgcctg cccggagcgc 600 tcatgcacac gctgccagcc gcccagatgg tcatcacgga cctgtcggca cccgaggagc 660 ggcccgcggc cctgggccgg ctgggcctct gcttcggcgt cggagtcatc ctcggctccc 720 tgctgggcgg gaccctggtc tccgcgtacg ggattcagtg cccggccatc ctggctgccc 780 tggccaccct cctgggagct gtcctcagct tcacctgcat ccccgccagc accaaagggg 840 ccaaaactga cgcccaggct ccactgccag gcggcccccg ggccagtgtg ttcgacctga 900 aggccatcgc ctccctgctg cggctgccag acgtcccgag gatcttcctg gtgaaggtgg 960 cctccaactg ccccacaggg ctcttcatgg tcatgttctc catcatctcc atggacttct 1020 tccagctgga ggccgcccaa gctggctacc tcatgtcctt cttcgggctc ctccagatgg 1080 tgacccaggg cctggtcatc gggcagctga gcagccactt ctcggaggag gtgctgctcc 1140 gggccagcgt gctggtcttc atcgtggtgg gcctggccat ggcctggatg tccagcgtct 1200 tccacttctg cctcctggtg cccggcctgg tgttcagcct ctgcaccctc aacgtggtca 1260 ccgacagcat gctgatcaag gctgtctcca cctcggacac agggaccatg ctgggcctct 1320 gcgcctctgt acaaccactg ctccgaactc tgggacccac ggtcggcggc ctcctgtacc 1380 gcagctttgg cgtccccgtc ttcggccacg tgcaggttgc tatcaatacc cttgtcctcc 1440 tggtcctctg gaggaaacct atgccccaga ggaaggacaa agtccggtga ccgctgccca 1500 gacacagact ggcaataaac tcctactaaa tccctccgaa aaaaaaaaaa aaaaa 1555 <210> 2 <211> 19 <212> RNA <213> SLC22A18_siRNA1 <400> 2 gacuggcaau aaacuccua 19 <210> 3 <211> 19 <212> RNA <213> SLC22A18_siRNA2 <400> 3 cagaacuuac cugccucuu 19

Claims (2)

1. 옥사리플라틴(oxaliplatin)을 유효성분으로 포함하는, SLC22A18 유전자를 보유하는 대장암 환자의 치료용 약학적 조성물.
2. 제1항에 있어서,
   상기 SLC22A18 유전자는 서열번호 1로 표시되는 염기서열로 이루어지는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
   

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