KR20230166775A - 신규한 MFSD7-ATP5l 융합유전자 및 이의 용도 - Google Patents

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KR20230166775A
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Abstract

본 발명은 육종암 진단용 마커로서, 신규한 MFSD7-ATP5l 융합유전자 또는 이로부터 발현되는 융합단백질에 관한 것이다. 본 발명에 따른 MFSD7-ATP5l 융합단백질 또는 이를 암호화하는 융합유전자는 육종암에서 특이적으로 발현되는 것이 확인되어 육종암에 대해 유의성 있는 진단 또는 육종암의 예후예측, 예방 용으로서 유용하게 활용할 수 있다.

Description

신규한 MFSD7-ATP5l 융합유전자 및 이의 용도{Novel MFSD7-ATP5l fusion gene and uses thereof}
본 발명은 육종암 진단용 마커로서, 신규한 MFSD7-ATP5l 융합유전자 또는 이로부터 발현되는 융합단백질에 관한 것이다.
융합 유전자(fusion gene)는 두 개의 유전자가 한 개의 유전자로 재구성되어 전혀 새로운 기능을 수행하는 유전자이다. 융합 유전자가 형성되는 기작은 크게 3 가지로 분류되며, 서로 다른 염색체의 일부분이 위치 이동하면서 생성될 수 있고, 같은 염색체내에서 일부가 위치 이동하여 생성될 수 있으며, 또는 동일하거나 서로 다른 염색체 내에서 유전자가 각각의 전사체를 만들고 상기 각각의 전사체가 그대로 융합되어 융합 유전자를 생성할 수 있다.
이러한 융합 유전자들은 암 세포를 비롯한 비정상적인 조직 세포에서 발현되는 것으로 알려져 있어, 최근 암의 진단 및 치료를 위한 표적으로 주목받고 있다. 암 세포에서 융합 유전자의 발현은 혈액암에서 최초 보고된 이래로, 융합 유전자 및 이로부터 발현되는 융합 단백질에 대한 연구가 계속되고 있다. 폐암과 같은 고형암에서는 ALK, ROS1 등 타이로신 키나아제를 암호화하는 유전자가 융합된 형태의 융합 유전자의 발현이 보고되어, 진단에 사용될 뿐 아니라 암 조직에서 융합 유전자가 발현되는 환자에서 타이로신 키나아제의 억제제를 적용하여 효과적인 임상적 치료 효과를 확인한 것으로 보고된 바 있다. 따라서, 융합 유전자는 암 환자에서 낮은 빈도로 발견되나 암 특이적 마커로 판단되며, 동시에 표적 치료제로서의 대상이 될 수 있어, 이에 대한 지속적인 연구가 필요한 실정이다.
본 발명이 해결하고자 하는 과제는 MFSD7-ATP5I 융합단백질 또는 이를 암호화하는 MFSD7-ATP5I 융합유전자를 제공하는 것이다.
또 다른 과제는 MFSD7-ATP5I 융합단백질 또는 이를 암호화하는 MFSD7-ATP5I 융합유전자를 포함하는 육종암 진단용 바이오마커 조성물, 육종암 진단용 조성물, 육종암 진단용 키트 및 육종암 진단에 대한 정보 제공 방법을 제공하는 것이다.
본 발명은 N-[MFSD7(Major facilitator superfamily domain containing 7)의 N 말단을 포함하는 단편]-[ATP5I(ATP Synthase Membrane Subunit E)의 C 말단을 포함하는 단편]-C의 구조식으로 이루어진 MFSD7-ATP5I 융합단백질을 제공한다.
상기 MFSD7의 N 말단을 포함하는 단편은 서열번호 3으로 표시되는 것일 수 있다.
상기 ATP5I의 C 말단을 포함하는 단편은 서열번호 5로 표시되는 것일 수 있다.
상기 MFSD7-ATP5I 융합단백질은 서열번호 1로 표시되는 것일 수 있다.
상기 융합단백질은 육종암의 진단에 사용되는 것일 수 있다.
또한 본 발명은 MFSD7-ATP5I 융합단백질을 암호화하는, 5'-[MFSD7(Major facilitator superfamily domain containing 7)을 암호화하는 유전자의 5' 말단을 포함하는 단편]-[ATP5I(ATP Synthase Membrane Subunit E)을 암호화하는 유전자의 3' 말단을 포함하는 단편]-3'의 구조식으로 이루어진 MFSD7-ATP5I 융합유전자를 제공한다.
상기 MMFSD7을 암호화하는 유전자의 5’ 말단을 포함하는 단편은 서열번호 4로 표시되는 것일 수 있다.
상기 ATP5I을 암호화하는 유전자의 3’ 말단을 포함하는 단편은 서열번호 6으로 표시되는 것일 수 있다.
상기 MFSD7-ATP5I 융합유전자는 서열번호 2로 표시되는 것일 수 있다.
상기 융합유전자는 육종암의 진단에 사용되는 것일 수 있다.
또한 본 발명은 MFSD7-ATP5I 융합단백질 또는 이를 암호화하는 융합유전자를 포함하는, 육종암 진단용 바이오마커 조성물을 제공한다.
상기 MFSD7-ATP5I 융합단백질 또는 이를 암호화하는 융합유전자는 육종암 세포에서 과발현되는 것일 수 있다.
또한 본 발명은 MFSD7-ATP5I 융합단백질 또는 이를 암호화하는 융합유전자의 발현을 측정하는 제제를 포함하는, 육종암 진단용 조성물을 제공한다.
상기 발현을 측정하는 제제는 상기 MFSD7-ATP5I 융합단백질에 특이적으로 결합하는 올리고펩타이드, 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 키메릭(chimeric) 항체, 리간드, PNA(Peptide nucleic acid) 또는 앱타머(aptamer)인 것일 수 있다.
상기 발현을 측정하는 제제는 상기 MFSD7-ATP5I 융합단백질을 암호화하는 융합유전자에 특이적으로 결합하는 안티센스 올리고뉴클레오티드, 프라이머 쌍 또는 프로브인 것일 수 있다.
상기 프라이머 쌍은 서열번호 7 및 서열번호 8로 표시되는 것일 수 있다.
또한 본 발명은 상기 육종암 진단용 조성물을 포함하는 육종암 진단용 키트를 제공한다.
상기 키트는 RT-PCR 키트, DNA 칩 키트 또는 단백질 칩 키트인 것일 수 있다.
또한 본 발명은 생물학적 시료로부터 MFSD7-ATP5I 융합단백질 또는 이를 암호화하는 융합유전자의 발현을 측정하는 단계를 포함하는, 육종암 진단에 대한 정보 제공 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 MFSD7-ATP5l 융합단백질 또는 이를 암호화하는 융합유전자는 육종암에서 특이적으로 발현되는 것이 확인되어 육종암에 대해 유의성 있는 진단 또는 육종암의 예후예측, 예방용으로서 유용하게 활용할 수 있다.
도 1은 MFSD7-ATP5I 융합단백질의 아미노산 서열 및 이를 암호화하는 융합유전자의 염기 서열을 나타낸 도이다.
도 2는 정상 세포(IMP-90)와 육종암 세포(KHOS/NP)에서의 MFSD7-ATP5I 발현 비교를 나타낸 도이다. a: PCR 반응결과 (1: KHOS/NP, 2: IMR-90), b: 정량화 그래프.
도 3은 MFSD7-ATP5I siRNA를 처리한 육종암 세포에서의 MFSD7-ATP5I 발현을 나타낸 도이다.
도 4는 siMFSD7-ATP5I로 형질주입된 육종암 세포의 세포이동(migration)을 나타낸 도이다.
도 5는 MFSD7-ATP5I shRNA를 처리한 육종암 세포에서의 MFSD7-ATP5I 발현을 나타낸 도이다.
도 6은 shMFSD7-ATP5I로 형질주입된 육종암 세포의 세포침윤(invasion)을 나타낸 도이다.
달리 정의되지 않는 한, 기술적이거나 과학적인 용어를 포함해서 여기서 사용되는 모든 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖고 있다.
일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 것과 같은 용어들은 관련 기술의 문맥상 갖는 의미와 일치하는 의미를 갖는 것으로 해석되어야 하며, 본 출원에서 명백하게 정의하지 않는 한, 이상적이거나 과도하게 형식적인 의미로 해석되지 않는다. 또한, 본 발명을 설명함에 있어서 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략한다.
본 발명자들은 다수의 육종암 환자 조직을 이용하여 NGS(next-generation sequencing) 기반의 RNA-시퀀싱 및 알고리즘을 통하여 육종암 조직에서 특이적으로 발현하는 발암성 융합유전자들을 스크리닝하였고, 이중 신규한 융합유전자 MFSD7-ATP5I를 선별하였다. 상기 MFSD7-ATP5I 융합유전자 및 이에 의해 암호화되는 융합전사산물 및 융합단백질은 육종암의 진단을 결정하는 인자로서 활용될 수 있음을 확인하였다.
따라서 본 발명은 MFSD7-ATP5I 융합단백질 또는 이를 암호화하는 융합유전자에 관한 것이다.
본 발명의 목적상 상기 융합유전자는 동일한 염색체 상에 존재하는 두개의 유전자가 head-to-tail의 형태로 결합된 핵산서열을 포함하거나 또는 서로 다른 염색체 상에 존재하는 두개의 유전자가 head-to-tail의 형태로 결합된 핵산서열을 포함할 수 있다. 이때, 두개의 유전자가 head-to-tail의 형태로 결합된 융합유전자는 온전한 염기서열의 각 유전자가 결합된 형태로 구성될 수도 있고, 일부 염기서열이 결실, 치환 등으로 변이된 염기서열을 가지는 각 유전자가 결합된 형태로 구성될 수도 있다. 이때, 변이된 염기서열 영역은 특별히 이에 제한되지 않으나, 일 예로서, 전체 염기서열의 1 내지 50%일 수 있고, 다른 예로서, 1 내지 20%일 수 있으며, 또 다른 예로서 1 내지 10%일 수 있다.
예를 들어, 본 발명에서 제공하는 상기 MFSD7-ATP5I 융합유전자는 특별히 이에 제한되지 않으나, 서열번호 2의 염기서열로 표시되고, head 유전자로서 MFSD7 유전자와 tail 유전자로서 ATP5I 유전자가 융합된 MFSD7-ATP5I로서 서열번호 4의 염기서열로 표시되는 MFSD7 유전자의 단편과 서열번호 6으로 표시되는 ATP5I 유전자의 단편이 융합된 MFSD7-ATP5I 융합유전자일수 있다.
또한, 본 발명에서 제공하는 상기 MFSD7-ATP5I 융합단백질은 특별히 이에 제한되지 않으나, 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되고, 서열번호 3의 아미노산 서열로 표시되는 MFSD7 단백질의 단편과 서열번호 5로 표시되는 ATP5I 단백질의 단편이 융합된 MFSD7-ATP5I 융합단백질일수 있다.
상기 MFSD7-ATP5I 융합유전자에 의해 암호화되는 MFSD7-ATP5I 융합단백질은 서열번호 1로 표시되는 것일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 MFSD7-ATP5I 융합단백질은 MFSD7의 단편 및 ATP5I의 단편이 연결된 융합단백질로 하기의 구조식으로 이루어질 수 있다.
N-[MFSD7(Major facilitator superfamily domain containing 7)의 N 말단을 포함하는 단편]-[ATP5I(ATP Synthase Membrane Subunit E)의 C 말단을 포함하는 단편]-C.
상기 MFSD7-ATP5I 융합단백질을 암호화하는 융합유전자는 하기의 구조식으로 이루어질 수 있다.
5'-[MFSD7(Major facilitator superfamily domain containing 7)을 암호화하는 유전자의 5' 말단을 포함하는 단편]-[ATP5I(ATP Synthase Membrane Subunit E)을 암호화하는 유전자의 3' 말단을 포함하는 단편]-3'.
본 발명에서 별다른 언급이 없는 한, 본 명세서에 기재된 유전자, 전사산물 또는 전사산물 유래 cDNA 또는 DNA 분자를 시퀀싱하여 결정된 모든 뉴클레오타이드 서열들은 자동화된 차세대 염기서열 시퀀서 또는 생거법 염기서열 시퀀서를 사용하여 결정될 수 있고, 결정된 뉴클레오타이드 서열에 의하여 암호화되는 모든 아미노산 서열들은 자동화된 펩타이드 시퀀서를 사용하여 결정될 수 있다. 이 자동화된 접근에 의하여 결정된 뉴클레오타이드 서열은 실제 서열과 비교하여 일부 에러를 포함할 수 있다. 예컨대, 자동에 의하여 결정된 뉴클레오타이드 서열들은 시퀀싱된 cDNA 또는 DNA 분자의 실제 뉴클레오타이드 서열과 전형적으로 약 90% 이상, 구체적으로 약 95% 이상, 보다 구체적으로 약 99% 이상, 더욱 구체적으로 약 99.9% 이상의 서열 상동성을 가질 수 있다. 실제 서열과 비교하여 결정된 뉴클레오타이드에서 하나의 삽입 또는 결손은 포함할 수 있으며, 이와 같은 삽입 또는 결손에 의하여 뉴클레오타이드 서열 번역시의 프레임시프트(frameshift)가 야기되어, 암호화되는 아미노산 서열이 실제 아미노산 서열과 다르게 될 수 있다.
본 발명은 다른 양태로, MFSD7-ATP5I 융합단백질 또는 이를 암호화하는 융합유전자를 포함하는, 육종암 진단용 바이오마커 조성물에 관한 것이다.
상기 융합단백질 및 융합유전자는 전술한 바와 같다.
본 발명에서 "육종암(Sarcoma)"이란 뼈, 연골, 근육, 지방, 신경, 혈관 등의 비상피성 결합조직에서 발생한 종양으로, 뼈에 발생하는 골육종(Osteosarcoma), 뼈를 제외한 연부조직(근육, 힘줄, 혈관, 신경, 림프조직, 관절주변조직, 근막 등)에서 발생하는 연부조직육종(Soft tissue sarcoma)을 통칭하는 의미이다.
본 발명에서, "진단"은 병리상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미하여, 특정 질병 또는 질환에 대한 한 객체의 감수성(susceptibility)을 판정하는 것, 한 객체가 특정 질병 또는 질환을 현재 가지고 있는 지 여부를 판정하는 것, 특정 질병 또는 질환에 걸린 한 객체의 예후(prognosis)(예컨대, 전-전이성 또는 전이성 암 상태의 동정, 암의 단계 결정 또는 치료에 대한 암의 반응성 결정)를 판정하는 것, 또는 테라메트릭스(therametrics)(예컨대, 치료 효능에 대한 정보를 제공하기 위하여 객체의 상태를 모니터링 하는 것)를 포함한다. 본 발명의 목적에서는 상기 특정 질병 또는 질환은 육종암에 대한 것일 수 있다.
본 발명에서 "육종암 진단용 바이오마커"란 육종암 세포를 정상 세포와 구분하여 진단할 수 있는 물질로, 정상 세포에 비하여 육종암을 가진 세포에서 증가 양상을 보이는 폴리펩타이드 또는 핵산(예: mRNA 등), 지질, 당지질, 당단백질, 당(단당류, 이당류, 올리고당류 등) 등과 같은 유기 생체 분자 등을 포함한다. 본 발명의 목적상, 육종암 조직 또는 세포에서 발현이 증가하는 유전자 또는 단백질이다.
본 발명에서는 상기 MFSD7-ATP5I 융합단백질 또는 이를 암호화하는 융합유전자가 육종암 세포에서 과발현되는 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 따르면, MFSD7-ATP5I 융합단백질 또는 이를 암호화하는 융합유전자는 육종암 환자에게서 특이적으로 발견되거나 발현되는 것을 확인하였으며, 육종암 세포에서 상기 MFSD7-ATP5I 단백질의 발현을 억제하였을 때 육종암 세포의 세포이동(migration) 및 침윤(invasion) 능력이 현저히 억제됨을 확인하였다. 이러한 결과로 MFSD7-ATP5I 융합단백질 또는 이를 암호화하는 융합유전자가 육종암에 대해 유의성 있는 진단 마커 또는 육종암의 예후예측, 예방 또는 치료용으로서 유용할 수 있음을 확인하였다.
유의성 있는 진단 마커의 선택과 적용은 진단 결과의 신뢰도를 결정짓는 것으로, 유의성 있는 진단 마커란, 진단하여 얻은 결과가 정확하여 타당도(validity)가 높고 반복 측정시에도 일관된 결과를 나타내도록 신뢰도가(reliability)가 높은 마커를 의미한다. 본 발명의 육종암 진단 마커는, 육종암의 발병과 함께 직접적 또는 간접적 요인으로 발현이 항상 증가하는 유전자들로 반복된 실험에도 동일한 결과를 나타내며, 발현 수준의 차이가 대조군과 비교할 때 매우 커서 잘못된 결과를 내린 확률이 거의 없는 신뢰도가 높은 마커들이다. 그러므로 본 발명의 유의성 있는 진단 마커의 발현 정도를 측정하여 얻은 결과를 토대로 진단된 결과는 타당하게 신뢰할 수 있다. 이때, 정상 세포와 육종암 세포에서 거의 동일한 양으로 발현되는 유전자 또는 단백질들은 제외하고, 예를 들어 대조군으로 사용한 정상 조직에서 발현되는 유전자 또는 단백질들에 비해 육종암 조직에서 발현이 2배 이상으로 증가되는 유전자 또는 단백질들을 선별할 수 있다.
본 발명은 또 다른 양태로 MFSD7-ATP5I 융합단백질 또는 이를 암호화하는 융합유전자의 발현을 측정하는 제제를 포함하는, 육종암 진단용 조성물에 관한 것이다.
상기 융합단백질 및 융합유전자는 전술한 바와 같다.
본 발명에서, "발현을 측정하는 제제"란 육종암의 진단을 위하여 생물학적 시료에서 마커 유전자에서 발현된 단백질 또는 마커 유전자의 mRNA 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로, 상기 MFSD7-ATP5I 융합단백질에 특이적으로 결합하는 올리고펩타이드, 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 키메릭(chimeric) 항체, 리간드, PNA(Peptide nucleic acid) 또는 앱타머(aptamer)를 이용해 단백질의 양을 확인하거나, 상기 MFSD7-ATP5I 융합단백질을 암호화하는 융합유전자에 특이적으로 결합하는 안티센스 올리고뉴클레오티드, 프라이머 쌍 또는 프로브를 이용해 상기 융합유전자의 mRNA의 양을 측정할 수 있다.
단배질의 양을 확인하기 위한 분석 방법으로는 웨스턴블롯팅(western blotting), 조직면역 염색, 면역 침전분석법(immunoprecipitation assay), 보체 고정 분석법(complete fixation assay), FACS, 단백질 칩(protein chip) 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
단백질 발현 수준의 측정은 ELISA 방법(직접적 ELISA, 간접적 ELISA 또는 샌드위치 ELISA 등), 웨스턴 블랏 또는 단백질 칩을 이용할 수 있다. 상기 단백질 칩은 마커에 대한 하나 이상의 항체가 기판 위에 정해진 위치에 배열되어 고밀도록 고정화되어있는 단백질을, 단백질칩과 혼성화시켜서 항원-항체 복합체를 형성시키고, 이를 판독하여, 단백질의 존재 또는 발현 정도를 확인할 수 있다. 본 발명에서는 이러한 방법을 통하여 정상 대조군 개체와 육종암 의심 개체에서의 MFSD7-ATP5I 융합단백질 발현 수준을 비교할 수 있고, MFSD7-ATP5I 융합단백질의 발현이 증가되는 것으로 확인되는 경우, 대상 환자가 육종암인 것으로 진단할 수 있다.
마커 유전자의 mRNA의 양을 확인하기 위한 분석방법으로는 RT-PCR, 경쟁적 RT-PCR(competitive RT-PCR), 실시간 RT-PCR(Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA; RNase protection assay), 노던 블랏팅(northern blotting), 또는 DNA 마이크로어레이 칩 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명에서는 이러한 검출 방법을 통하여, 정상 대조군 개체와 육종암 의심 개체에서의 mRNA 발현 수준을 비교할 수 있고, 마커 유전자인 MFSD7-ATP5I 융합유전자의 발현이 증가되는 것으로 확인되는 경우, 대상 환자가 육종암인 것으로 진단할 수 있다.
따라서, 상기 발현을 측정하는 제제는 MFSD7-ATP5I 융합단백질에 특이적으로 결합하는 올리고펩타이드, 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 키메릭(chimeric) 항체, 리간드, PNA(Peptide nucleic acid) 또는 앱타머(aptamer)일 수 있고, 상기 MFSD7-ATP5I 융합단백질을 암호화하는 융합유전자에 특이적으로 결합하는 안티센스 올리고뉴클레오티드, 프라이머 쌍 또는 프로브일 수 있다.
상기 "프라이머"는 짧은 자유 3말단 수산화기(free 3`hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로 상보적인 주형(template)과 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 주형의 복사를 위한 시작지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(즉, DNA 중합효소 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재하에서 DNA 합성이 개시할 수 있다. 본 발명에서는 상기 본 발명 마커 폴리뉴클레오티드의 센스 및 안티센스 프라이머를 이용하여 PCR 증폭을 실시하여 원하는 생성물의 생성 여부를 통해 육종암 여부를 진단하거나 예후 예측이 가능하다. PCR 조건, 센스 및 안티센스 프라이머의 길이는 당업계에 공지된 것을 기초로 변형할 수 있다.
상기 "프로브"란 mRNA와 특이적 결합을 이룰 수 있는 짧게는 수 염기 내지 길게는 수백 염기에 해당하는 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 의미하며 표지(Labelling)되어 있어서 특정 mRNA의 존재 유무를 확인할 수 있다. 프로브는 올리고 뉴클레오티드 프로브, 단쇄 DNA(single stranded DNA) 프로브, 이중쇄 DNA(double stranded DNA) 프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있다. 본 발명에서는 본 발명의 마커 폴리뉴클레오티드와 상보적인 프로브를 이용하여 혼성화를 실시하여, 혼성화 여부를 통해 육종암의 진단 또는 예후를 예측할수 있다. 적당한 프로브의 선택 및 혼성화 조건은 당업계에 공지된 것을 기초로 변형할 수 있다.
이러한 핵산 서열은 또한 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 비-제한적인 예로는 메틸화, 캡화, 천연 뉴클레오티드 하나 이상의 동족체로의 치환, 및 뉴클레오티드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체(예: 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미 데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형이 있다.
본 발명에서 상기 프라이머 쌍 또는 프로브는 MFSD7-ATP5I 융합단백질을 암호화하는 융합유전자의 핵산 서열을 바탕으로 디자인할 수 있으며, 이들 유전자의 특정 영역을 특이적으로 증폭하는 것으로 본 발명의 프라이머쌍은 서열번호 7 및 서열번호 8로 표시되는 것일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명은 또 다른 양태로, 상기 육종암 진단용 조성물을 포함하는 육종암 진단용 키트에 관한 것이다. 구체적으로, 상기 육종암 진단용 키트는 역전자 중합효소-PCR(RT-PCR) 키트, DNA 칩 키트 또는 단백질 칩 키트 일 수 있다.
상기 육종암 진단용 키트는 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성성분 조성 물, 용액 또는 장치를 더 포함하여 구성될 수 있다. 상기 진단용 키트는 역전사 중합효소반응을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 것을 특징으로 하는 진단용 키트일 수 있다. 역전사 중합효소반응 키트는 마커 유전자에 대한 특이적인 각각의 프라이머 쌍을 포함한다. 프라이머는 각 마커 유전자의 핵산서열에 특이적인 서열을 가지는 뉴클레오타이드로서, 약 7 bp 내지 50 bp의 길이, 보다 바람직하게는 약 10 bp 내지 30 bp의 길이이다. 또한 대조군 유전자의 핵산 서열에 특이적인 프라이머를 포함할 수 있다. 그 외 역전사 중합효소반응 키트는 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액(pH 및 마그네슘 농도는 다양), 데옥시뉴클레오타이드(dNTPs), Taq-폴리머라아제 및 역전사효소와 같은 효소, DNAse, RNAse 억제제 DEPC-수(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다.
또한 DNA 칩을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 것을 특징으로 하는 진단 키트일 수 있다. DNA 칩 키트는 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA 또는 올리고뉴클레오티드 (oligonucleotide)가 부착되어 있는 기판, 및 형광표식 프로브를 제작하기 위한 시약, 제제, 효소 등을 포함할 수 있다. 또한 기판은 대조군 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA 또는 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
또한 단백질 칩을 수행하거나, ELISA를 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 것을 특징으로 하는 진단 키트일 수 있다. 단백질 칩 키트나 ELISA 키트는 마커 단백질에 대한 특이적인 항체를 포함한다. 항체는 각 마커 단백질에 대한 특이성 및 친화성이 높고 다른 단백질에 대한 교차 반응성이 거의 없는 항체로, 단클론 항체, 다클론 항체 또는 재조합 항체이다. 또한 ELISA 키트는 대조군 단백질에 특이적인 항체를 포함할 수 있다. 그 외 ELISA 키트는 결합된 항체를 검출할 수 있는 시약, 예를 들면, 표지된 2차 항체, 발색단 (chromophores), 효소(예: 항체와 컨주게이트됨) 및 그의 기질 또는 항체와 결합할 수 있는 다른 물질 등을 포함할 수 있다.
본 발명은 또 다른 양태로, 생물학적 시료로부터 MFSD7-ATP5I 융합단백질 또는 이를 암호화하는 융합유전자의 발현을 측정하는 단계를 포함하는, 육종암 진단에 대한 정보 제공 방법에 관한 것이다.
상기 융합단백질 및 융합유전자는 전술한 바와 같다.
본 발명의 육종암 진단을 위한 정보제공 방법에 있어서, 구체적으로 MFSD7-ATP5I 융합단백질을 암호화하는 융합유전자의 mRNA 발현 수준 또는 이로부터 발현되는 융합단백질 수준을 검출할 수 있으며, 환자로부터 분리된 생물학적 시료에서 mRNA 또는 단백질을 분리하여 공지의 공정을 통해 발현 수준을 검출할 수 있다. 여기에서, 환자로부터 분리된 생물학적 시료는 MFSD7-ATP5I 융합단백질을 암호화하는 융합유전자의 mRNA 또는 이의 단백질의 수준이 차이나는 조직, 예를 들면, 세포, 조직, 장기, 체액(혈액, 림프액 등), 소화액, 객담, 폐포-기관지 세정액, 뇨, 변뿐만 아니라, 이들의 생체 시료로부터 얻어지는 핵산 추출물(유전체 추출물, 전사체 추출물, 전사체 추출물로부터 조제된 cDNA 조제물이나 aRNA 조제물 등)이나 단백질 추출물도 포함등을 포함하며, 이에 제한되지 않는다. 또한, 상기 시료는, 포르말린 고정 처리, 알코올 고정 처리, 동결 처리 또는 파라핀 포매 처리가 실시되어 있는 것이어도 된다. 또한, 유전자, 전사산물, cDNA 또는 단백질은, 상기 시료의 종류 및 상태 등을 고려하여, 거기에 적합한 공지의 수법을 선택하여 조제하는 것이 가능하다.
상기 검출 방법들을 통하여, MFSD7-ATP5I 융합단백질을 암호화하는 융합유전자, 이의 전사산물 또는 이의 단백질의 발현 수준을 정상 대조군 및 육종암 의심 개체에서 비교함으로써 육종암 의심 개체의 실제 육종암 여부를 진단할 수 있다. 즉, 상기 방법에서 육종암이 의심되는 개체의 분리된 시료로부터 측정된 MFSD7-ATP5I 융합단백질을 암호화하는 융합유전자, 이의 전사산물 또는 이의 단백질의 발현 수준이 정상 대조군 시료의 MFSD7-ATP5I 융합단백질을 암호화하는 융합유전자, 이의 전사산물 또는 이의 단백질의 발현 수준보다 높을 경우, 육종암으로 진단하는 것을 특징으로 할 수 있다.
이하 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.
실시예 1: 육종암 특이적 융합유전자 선별
총 64개의 육종암 및 인접 정상 조직을 2011년부터 2022년까지 삼성서울병원에서 육종암을 진단받은, 정보를 제공하고 동의한 육종암 환자로부터 수집하였다. 병리학자가 확인한 바에 따라, 괴사성 조직을 피하여 종양의 중심 부위와 인접한 정상 조직을 본 발명의 실시예에 이용하였다.
환자 조직에서 총 RNA를 추출하고 NGS 분석을 실시하며 3개의 알고리즘 프로그램을 사용하였다. 먼저 Defuse 프로그램에서 probability 0.9 이상인 융합유전자를 분류하고, Arriba 프로그램에서 confidence high로 구분하여 융합유전자를 분류한 다음, 각각의 프로그램에서 분류한 융합유전자를 FusionCatcher 프로그램에서 중복 여부를 확인하여 최종 분류한 다음 악성 육종암에서 공통적으로 발현되는 유의한 융합유전자 MFSD7-ATP5I를 동정한 결과를 표 1에 나타내었다.
Fusion gene 예측프로그램으로 분석한 결과 표 1에 나타난 바와 같이, MFSD7-ATP5I는 52개의 육종암 조직 중에서 27개(51.9%)의 조직에서 발현하였고 12개의 정상조직에서는 1개(8.3%)의 조직에서 발현되어 육종암에 특이적으로 발현율이 높음을 확인하였다.
상기 MFSD7-ATP5I 융합단백질의 및 이를 암호화하는 유전자의 서열정보와 이를 구성하는 MFSD7 및 ATP5I 단편 정보를 표 2에 나타내고, MFSD7-ATP5I 융합단백질 및 MFSD7-ATP5I 융합유전자의 서열정보를 도 1에 나타냈다.
MFSD7 단백질 단편
(서열번호 3)		 MAGPTEAETG LAEPRALCAQ RGHRTYARRW VFLLAISLLN CSNATLWLSF APVADVIAED LVLSMEQINW LSLVYLVVST PFGVAAIWIL DSVGLRAA
ATP5I 단백질 단편(서열번호 5) IT
MFSD7 유전자 단편(서열번호 4) atggcggggc cgacggaggc cgagacgggg ttggccgagc cccgggccct gtgcgcgcag
cggggccacc gcacctacgc gcgccgctgg gtgttcctgc tcgcgatcag cctgctcaac
tgctccaacg ccacgctgtg gctcagcttt gcacctgtgg ctgacgtcat tgctgaggac
ttggtcctgt ccatggagca gatcaactgg ctgtcactgg tctacctcgt ggtatccacc
ccatttggcg tggcggccat ctggatcctg gactccgtcg ggctccgtgc ggcg
ATP5I 유전자 단편(서열번호 6) attacctaa
실시예 2: MFSD7-ATP5I 융합유전자의 육종암 세포 특이 발현 검증
육종암 세포 KHOS/NP(ATCC, 미국) 및 정상세포 IMR-90(ATCC, 미국)에서의 MFSD7-ATP5I 융합유전자 발현을 비교하기 위해 PCR반응을 수행하였다.
NGS 분석(마크로젠, 서울, 한국) 결과를 토대로 MFSD7-ATP5I융합유전자의 융합 접합(fusion junction) 구간이 포함되도록 정방향, 역방향 프라이머를 제작(바이오닉스, 서울, 한국)하였다.
프라이머쌍의 서열은 하기와 같다.
MFSD7-ATP5I_F: GCTGAGGACTTGGTCCTGTC (서열번호 7)
MFSD7-ATP5I_R: GTCGCAGGGTCACTCACTTT (서열번호 8)
RNA 샘플을 역전사효소(Invitrogen superscript IV)를 이용하여 cDNA로 합성하고 GoldHotstart PCR premix(바이오니아, 대전, 한국)를 이용하여 어닐링 온도 60℃ 35cycle로 PCR을 진행하였다. 1% 아가로스 겔에 7ul 로딩 조건으로 밴드 확인 후 PCR 산물을 생어 시퀀싱(Sanger sequencing) 분석(마크로젠, 서울, 한국)하였다.
도 2는 정상 세포와 육종암 세포에서의 MFSD7-ATP5I 발현 비교를 나타낸 도이다. 도 2a에서 보는 바와 같이 MFSD7-ATP5I는 육종암 세포주인 KHOS/NP 세포에서 특이적으로 현저히 발현되고(1번 밴드), 정상 세포주인 IMR-90 세포에서는 발현되지 않는 것(2번 밴드)을 확인하였다. 유전자 발현을 농도계 정량화한 도 2b를 살펴보면, MFSD7-ATP5I는 육종암 세포에서 매우 높게 발현됨을 확인할 수 있다.
이러한 결과로, MFSD7-ATP5I 융합단백질 또는 이를 암호화하는 융합유전자를 육종암 특이적 진단에 사용할 수 있음을 확인하였다.
실시예 3: MFSD7-ATP5I 발현 억제에 따른 육종암 세포 특징 변화
3-1. MFSD7-ATP5I siRNA의 MFSD7-ATP5I발현 억제 확인
융합유전자 MFSD7-ATP5I의 접합(junction) 부분이 포함되도록 siRNA(thermofishe, 미국)를 제작하였다.
MFSD7-ATP5I siRNA의 서열은 하기와 같다.
(5' to 3') GGG CUC CGU GCG GCG AUU ACC UAA A (서열번호 9)
KHOS/NP 세포를 5x105 cells/6well로 접종하고, 37℃ 인큐베이션에서 밤새 배양하였다. 150 ul의 환원 혈정 배지(opti-MEM medium, Gibco)로 세포를 옮기고 리포펙타민 RNAiMAX 시약(Lipofectamine RNAiMAX reagent, Invitrogen, 미국) 9 ul를 1.5 ㎖ 튜브에 넣어 섞은 다음, 또 다른 1.5 ㎖ 튜브에 150 ul의 환원 혈정 배지(opti-MEM medium)와 siRNA(stock conc. 10uM) 3 ul를 넣고 섞은 뒤 두 튜브의 내용물을 섞어 5분간 RT에서 인큐베이션을 실시하였다.
혼합물 250 ul를 6well 플레이트에 처리(최종 siRNA의 농도는 25 pmol/well)하고 48시간 37℃인큐베이션을 실시하고 세포를 수득한 다음 RNA 분리키트(Rneasy mini kit, Qiagen, 독일)를 이용하여 RNA를 추출하였다. RNA 샘플을 역전사효소(superscript IV, Invitrogen, 미국)를 이용하여 cDNA로 합성하고, GoldHotstart PCR premix를 이용해 어닐링 온도 60℃ 35cycle로 PCR을 실시하여 증폭한 다음, 밴드를 확인하였다.
제작한 siRNA가 MFSD7-ATP5I의 발현을 효과적으로 억제함을 도 3에 나타내었다.
3-2. 세포 이동(migration) 감소
실시예 3-1에서 MFSD7-ATP5I 발현 억제를 확인한 siRNA를 육종암 세포인 KHOS/NP 세포에 형질주입(transfection)하고 세포 이동 분석을 진행하였다.
KHOS/NP 세포를 5x105 cells/6well로 접종하고, 37℃인큐베이션에서 밤새 배양하였다. 150 ul의 환원 혈정 배지(opti-MEM medium)로 세포를 옮기고 리포펙타민 RNAiMAX 시약(Lipofectamine RNAiMAX reagent) 9 ul를 1.5 ㎖ 튜브에 넣어 섞은 다음, 또 다른 1.5 ㎖ 튜브에 150 ul의 환원 혈정 배지(opti-MEM medium)와 siRNA(stock conc. 10uM) 3 ul를 넣고 섞은 뒤 두 튜브의 내용물을 섞어 5분간 RT에서 인큐베이션을 실시하였다.
혼합물 250 ul를 6well 플레이트에 처리(최종 siRNA의 농도는 25 pmol/well)하고 10 ul 마이크로 볼륨 팁을 이용하여 스크래치를 내어 세포에 상처를 유발한 다음, 상처 치유 분석으로 세포 이동을 평가하였다.
도 4는 siMFSD7-ATP5I로 형질주입된 육종암 세포의 세포이동(migration)을 나타낸 도이다. 도 4에서 보는 바와 같이, 현미경으로 0h, 24h, 48h 동안 세포 이동을 관찰한 결과, 형질주입되지 않은 대조군(KHOS/NP w/o transfection) 및 스크램블 siRNA 음성대조군(siNC)과 비교하여 siRNA가 형질주입된 육종암 세포(KHOS/NP-_siMFSD7/ATP5I)의 세포 이동(migration)이 감소하였음을 확인하였다.
3-3. 세포 침윤(invasion) 감소
실시예 3-1에서 MFSD7-ATP5I 발현 억제를 확인한 siRNA와 동일한 서열로 shRNA를 제작하고 동일한 방법으로 shRNA를 육종암 세포주에 처리하여 PCR을 수행한 결과, shMFSD7-ATP5I에 의해 MFSD7-ATP5I의 발현이 효과적으로 억제됨을 도 5에 나타내었다.
상기 MFSD7-ATP5I 발현 억제를 확인한 shMFSD7-ATP5I를 플라스미드 벡터 pLKO.1에 클로닝(세랜텍, 서울, 한국)하여 KHOS/NP 세포에 형질주입 하고 트랜스웰 분석을 통해 세포 침윤을 분석하였다.
Trans-well(corning, pore size 6.5mm, 24well plaste)에 마트리겔(Matrigel) 15 ul를 도포하여 RT에서 1시간 굳힌 다음 KHOS/NP 세포를 1x105 cells/24well에 200ul, 무혈청 배지(serum-free EMEM)에 현탁하였다. 트랜스웰 챔버의 하부 챔버(lower chamber)에 500ul EMEM(w/1% FBS) 넣고 37℃ 인큐베이션을 20-22시간 진행한 후, 4% 파라포름알데히드를 30분간 반응시키고 H&E 염색을 실시하였다.
도 6은 shMFSD7-ATP5I로 형질주입된 육종암 세포의 세포침윤(invation)을 나타낸 도이다. 도 6에서 보는 바와 같이, 형질주입되지 않은 대조군(KHOS/NP_shCONT)과 비교하여 shMFSD7-ATP5I로 형질주입된 육종암 세포(KHOS/NP-_shMFSD7/ATP5I)는 세포이동 및 침윤이 현저히 감소함을 확인하였다.
이러한 결과로 siMFSD7/ATP5I 또는 shMFSD7/ATP5I는 육종암 세포의 이동(migration) 및 침윤 능력(invasion)을 효과적으로 억제함을 확인하고 MFSD7-ATP5I 융합단백질 또는 이를 암호화하는 융합유전자가 육종암에 대해 유의성 있는 진단 마커 또는 육종암의 예후예측, 예방용으로서 유용할 수 있음을 확인하였다.
<110> SAMSUNG LIFE PUBLIC WELFARE FOUNDATION <120> Novel MFSD7-ATP5l fusion gene and uses thereof <130> H2021P-163-KR_1.94P <160> 9 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 100 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MFSD7-ATP5I <400> 1 Met Ala Gly Pro Thr Glu Ala Glu Thr Gly Leu Ala Glu Pro Arg Ala 1 5 10 15 Leu Cys Ala Gln Arg Gly His Arg Thr Tyr Ala Arg Arg Trp Val Phe 20 25 30 Leu Leu Ala Ile Ser Leu Leu Asn Cys Ser Asn Ala Thr Leu Trp Leu 35 40 45 Ser Phe Ala Pro Val Ala Asp Val Ile Ala Glu Asp Leu Val Leu Ser 50 55 60 Met Glu Gln Ile Asn Trp Leu Ser Leu Val Tyr Leu Val Val Ser Thr 65 70 75 80 Pro Phe Gly Val Ala Ala Ile Trp Ile Leu Asp Ser Val Gly Leu Arg 85 90 95 Ala Ala Ile Thr 100 <210> 2 <211> 303 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MFSD7-ATP5I <400> 2 atggcggggc cgacggaggc cgagacgggg ttggccgagc cccgggccct gtgcgcgcag 60 cggggccacc gcacctacgc gcgccgctgg gtgttcctgc tcgcgatcag cctgctcaac 120 tgctccaacg ccacgctgtg gctcagcttt gcacctgtgg ctgacgtcat tgctgaggac 180 ttggtcctgt ccatggagca gatcaactgg ctgtcactgg tctacctcgt ggtatccacc 240 ccatttggcg tggcggccat ctggatcctg gactccgtcg ggctccgtgc ggcgattacc 300 taa 303 <210> 3 <211> 98 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MFSD7 <400> 3 Met Ala Gly Pro Thr Glu Ala Glu Thr Gly Leu Ala Glu Pro Arg Ala 1 5 10 15 Leu Cys Ala Gln Arg Gly His Arg Thr Tyr Ala Arg Arg Trp Val Phe 20 25 30 Leu Leu Ala Ile Ser Leu Leu Asn Cys Ser Asn Ala Thr Leu Trp Leu 35 40 45 Ser Phe Ala Pro Val Ala Asp Val Ile Ala Glu Asp Leu Val Leu Ser 50 55 60 Met Glu Gln Ile Asn Trp Leu Ser Leu Val Tyr Leu Val Val Ser Thr 65 70 75 80 Pro Phe Gly Val Ala Ala Ile Trp Ile Leu Asp Ser Val Gly Leu Arg 85 90 95 Ala Ala <210> 4 <211> 294 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MFSD7 <400> 4 atggcggggc cgacggaggc cgagacgggg ttggccgagc cccgggccct gtgcgcgcag 60 cggggccacc gcacctacgc gcgccgctgg gtgttcctgc tcgcgatcag cctgctcaac 120 tgctccaacg ccacgctgtg gctcagcttt gcacctgtgg ctgacgtcat tgctgaggac 180 ttggtcctgt ccatggagca gatcaactgg ctgtcactgg tctacctcgt ggtatccacc 240 ccatttggcg tggcggccat ctggatcctg gactccgtcg ggctccgtgc ggcg 294 <210> 5 <211> 2 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ATP5I <400> 5 Ile Thr 1 <210> 6 <211> 9 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ATP5I <400> 6 attacctaa 9 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MFSD7-ATP5I_F <400> 7 gctgaggact tggtcctgtc 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MFSD7-ATP5I_R <400> 8 gtcgcagggt cactcacttt 20 <210> 9 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MFSD7-ATP5I siRNA <400> 9 gggcuccgug cggcgauuac cuaaa 25

Claims (19)

  1. 하기의 구조식으로 이루어진 MFSD7-ATP5I 융합단백질;
    N-[MFSD7(Major facilitator superfamily domain containing 7)의 N 말단을 포함하는 단편]-[ATP5I(ATP Synthase Membrane Subunit E)의 C 말단을 포함하는 단편]-C.
  2. 제1항에 있어서, 상기 MFSD7의 N 말단을 포함하는 단편은 서열번호 3으로 표시되는 것인, MFSD7-ATP5I 융합단백질.
  3. 제1항에 있어서, 상기 ATP5I의 C 말단을 포함하는 단편은 서열번호 5로 표시되는 것인, MFSD7-ATP5I 융합단백질.
  4. 제1항에 있어서, 상기 MFSD7-ATP5I 융합단백질은 서열번호 1로 표시되는 것인, MFSD7-ATP5I 융합단백질.
  5. 제1항에 있어서, 상기 융합단백질은 육종암의 진단에 사용되는 것인, MFSD7-ATP5I 융합단백질.
  6. MFSD7-ATP5I 융합단백질을 암호화하는, 하기의 구조식으로 이루어진 MFSD7-ATP5I 융합유전자;
    5’-[MFSD7(Major facilitator superfamily domain containing 7)을 암호화하는 유전자의 5’ 말단을 포함하는 단편]-[ATP5I(ATP Synthase Membrane Subunit E)을 암호화하는 유전자의 3’ 말단을 포함하는 단편]-3’.
  7. 제6항에 있어서, 상기 MFSD7을 암호화하는 유전자의 5’ 말단을 포함하는 단편은 서열번호 4로 표시되는 것인, MFSD7-ATP5I 융합유전자.
  8. 제6항에 있어서, 상기 ATP5I을 암호화하는 유전자의 3’ 말단을 포함하는 단편은 서열번호 6으로 표시되는 것인, MFSD7-ATP5I 융합유전자.
  9. 제6항에 있어서, 상기 MFSD7-ATP5I 융합유전자는 서열번호 2로 표시되는 것인, MFSD7-ATP5I 융합유전자.
  10. 제6항에 있어서, 상기 융합유전자는 육종암의 진단에 사용되는 것인, MFSD7-ATP5I 융합유전자.
  11. MFSD7-ATP5I 융합단백질 또는 이를 암호화하는 융합유전자를 포함하는, 육종암 진단용 바이오마커 조성물.
  12. 제11항에 있어서, MFSD7-ATP5I 융합단백질 또는 이를 암호화하는 융합유전자는 육종암 세포에서 과발현되는 것인, 육종암 진단용 바이오마커 조성물.
  13. MFSD7-ATP5I 융합단백질 또는 이를 암호화하는 융합유전자의 발현을 측정하는 제제를 포함하는, 육종암 진단용 조성물.
  14. 제13항에 있어서, 상기 발현을 측정하는 제제는 상기 MFSD7-ATP5I 융합단백질에 특이적으로 결합하는 올리고펩타이드, 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 키메릭(chimeric) 항체, 리간드, PNA(Peptide nucleic acid) 또는 앱타머(aptamer)인 것인, 육종암 진단용 조성물.
  15. 제13항에 있어서, 상기 발현을 측정하는 제제는 상기 MFSD7-ATP5I 융합단백질을 암호화하는 융합유전자에 특이적으로 결합하는 안티센스 올리고뉴클레오티드, 프라이머 쌍 또는 프로브인 것인, 육종암 진단용 조성물.
  16. 제15항에 있어서, 상기 프라이머 쌍은 서열번호 7 및 서열번호 8로 표시되는 것인, 육종암 진단용 조성물.
  17. 제13항의 조성물을 포함하는 육종암 진단용 키트.
  18. 제17항에 있어서, 상기 키트는 RT-PCR 키트, DNA 칩 키트 또는 단백질 칩 키트인, 육종암 진단용 키트.
  19. 생물학적 시료로부터 MFSD7-ATP5I 융합단백질 또는 이를 암호화하는 융합유전자의 발현을 측정하는 단계를 포함하는, 육종암 진단에 대한 정보 제공 방법.

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