KR20230107484A - 대장암 전이 억제제 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 대장암 억제제 스크리닝 방법에 관한 것으로서, 보다 구체적으로 ICAM-1와 SRC의 결합수준을 감소시키는 물질을 치료물질로 선정하는 대장암 억제제 스크리닝 방법에 관한 것이다. 본 발명은 ICAM-1이 SRC에 의존적으로 암 전이능 및 혈관신생을 조절할 수 있음을 확인함으로써, ICAM-1이 대장암 치료제 개발의 잠재적 표적인자가 될 수 있음을 보여주었다. 이에, 본 발명의 방법으로 스크리닝된 표적인자를 이용한 대장암 치료제를 이용하여 대장암 환자의 치료효과를 높일 수 있다.

Description

대장암 전이 억제제{Inhibitor for metastasis of colorectal cancer}
본 발명은 대장암 전이 억제제 스크리닝 방법에 관한 것으로서, 보다 구체적으로 ICAM-1와 SRC의 결합수준을 감소시키는 물질을 치료물질로 선정하는 대장암 전이 억제제 스크리닝 방법에 관한 것이다.
대장암은 세계에서 세번째로 흔히 진단되는 암이며 네번째로 많은 사망원인으로 알려져 있으며, 국내 대장암 사망률은 점차 증가하는 추세로 사망률이 73%에 이르는 것으로 집계되고 있다. 대장암은 발병 요인에 따라 산발적 대장암(sporadic colon cancer)과 염증성 대장암(colitis associated colorectal cancer)으로 구별할 수 있다. 산발적 대장암은 유전적 요인, 노화, 2형 당뇨, 과체중, 음주 및 흡연 등 여러 요인에 의해 발병되고, 염증성 대장암은 크론병(Crohn's disease)과 궤양성 대장염(ulcerative colitis) 같은 지속적인 염증성 장 질환(inflammatory bowel disease)이 주된 원인이다. 산발적 대장암은 대부분 노화 혹은 유전적 요인에 의해 발병되기 때문에 주로 고령의 환자에게 나타나지만, 염증성 대장암은 젊은 층의 환자에게도 발병되기 쉬우며 산발적 대장암보다 사망률이 더 높은 것으로 알려져 있다.
한편, 용종을 식별하고 제거할 수 있는 선별방법으로는 대장 내시경이 일반적이나 장천공, 장출혈, 수면무호흡증 등 많은 부작용을 야기시키며, 종양을 정확하게 선별하기에는 많은 어려움이 있다. 따라서, 대장암을 진단하거나 치료하기 위한 마커의 개발이 필요한 실정이다.
최근 E3 ligase의 조절 억제가 대장암에 성장, 전이 및 암 줄기 세포 증식을 증가시키는 연구보고가 있으나(비특허문헌), 구체적으로 암세포의 전이 및 혈관생성에 대한 매커니즘은 아직 알려지지 않은 실정이다.
Christina L et al, Surgery, 2007, June, 705-707. (2007.06)
상기와 같은 문제점을 해결하기 위하여, 본 발명자들은 대장암 전이 억제제 후보물질에 대해 연구한 결과, ICAM-1이 SRC에 의존적으로 암 전이능 및 혈관신생을 조절하는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
이에, 본 발명은 대장암 전이 억제제 스크리닝 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 ICAM-1 유전자의 mRNA 수준을 측정하는 제제 또는 상기 유전자가 암호화하는 단백질 수준을 측정하는 제제를 포함하는 대장암 전이 예측용 조성물을 제공하는 것을 다른 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 ICAM-1 유전자 또는 상기 유전자가 암호화하는 단백질 억제제를 유효성분으로 포함하는 대장암 전이 억제용 약학 조성물을 제공하는 것을 또 다른 목적으로 한다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (a) In Vitro 상에서 세포에 후보물질을 처리하는 단계; (b) 상기 세포에서 ICAM-1(Intracellular adhesion molecule 1)과 SRC와의 결합수준을 측정하는 단계; 및 (c) 상기 후보물질의 비처리군에 비해 ICAM-1과 SRC의 결합수준을 감소시키는 물질을 치료물질로 선정하는 단계를 포함하는 대장암 전이 억제제 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현예로, 상기 세포는 대장암 세포일 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로, 상기 후보물질은 화합물, 미생물 배양액 또는 추출물, 천연물 추출물, 핵산, 및 펩타이드로 이루어진 군으로부터 선택할 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 핵산은 siRNA, shRNA, microRNA, 안티센스 RNA, 앱타머(aptamer), LNA(locked nucleic acid), PNA(peptide nucleic acid), 및 모폴리노(morpholino)로 이루어진 군으로부터 선택할 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 ICAM-1과 SRC의 결합수준 측정은 ICAM-1 및 SRC 유전자의 mRNA 수준을 측정하는 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 mRNA 수준은 중합효소연쇄반응(PCR), 역전사 중합효소연쇄반응(RT-PCR), 실시간 중합효소연쇄반응(Real-time PCR), RNase 보호 분석법(RNase protection assay; RPA), 마이크로어레이(microarray), 및 노던 블롯팅(northern blotting)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 방법을 통해 측정할 수 있다.
또한, 본 발명은 ICAM-1 유전자의 mRNA 수준을 측정하는 제제 또는 상기 유전자가 암호화하는 단백질 수준을 측정하는 제제를 포함하는 대장암 전이 예측용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 ICAM-1 유전자 또는 상기 유전자가 암호화하는 단백질 억제제를 유효성분으로 포함하는 대장암 전이 억제용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명은 ICAM-1이 SRC에 의존적으로 암 전이능 및 혈관신생을 조절할 수 있음을 확인함으로써, ICAM-1이 대장암 치료제 개발의 잠재적 표적인자가 될 수 있음을 보여주었다. 이에, 본 발명의 방법으로 스크리닝된 표적인자를 이용한 대장암 치료제를 이용하여 대장암 환자의 치료효과를 높일 수 있다.
도 1은 대장암 형성 단계에서 ICAM-1 발현을 확인한 것으로, 도 1a는 정상인 및 염증성 장 질환 환자의 ICAM-1 발현 차이를 확인한 결과이고, 도 1b는 정상인 및 암 환자에서 ICAM-1 발현 차이를 확인한 결과이고, 도 1c 및 1d는 면역시냅스를 기준으로 ICAM-1 및 다른 부착 인자들의 발현 정도를 히트맵을 통해 나타낸 결과이고, 도 1e는 in vitro에서 ICAM-1의 발현량을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 대장암 세포에서 ICAM-1이 전이 및 혈관신생에 관여하는 것을 확인한 것으로, 도 2a는 ICAM-1 발현이 높은 세포에 ICAM-1을 억제시키고 ICAM-1의 발현이 낮은 세포에 ICAM-1을 과발현시킨 후 이동 및 침윤능의 변화를 확인한 결과이고, 도 2b는 웨스턴블랏을 통해 ICAM-1 발현 수준에 따라 EMT 마커 및 조절인자의 발현을 확인한 결과이고, 도 2c는 ICAM-1 발현 수준에 따라 혈관신생능의 변화를 확인한 것이고, 도 2d ICAM-1 발현 수준에 따라 혈관신생에 관여하는 성장인자들의 발현 변화를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 ICAM-1이 SRC와 결합하는 것을 확인한 것으로, 도 3a는 대장암 세포에서 ICAM-1을 억제시킨후 SRC 발현 정도를 확인한 결과이고, 도 3b는 TCGA 데이터베이스를 통해 ICAM-1 발현에 따른 SRC 활성을 확인한 결과이고, 도 3c는 대장암 세포주에서 ICAM-1과 SRC의 endogenous한 결합을 확인한 것이고, 도 3d는 PLA 염색을 통해 ICAM-1 및 SRC의 결합을 확인한 것이고, 도 3e는 ICAM-1의 Tyr 512번 인산화 잔기를 억제시키거나 활성화 시킨 후 면역침강 반응을 통해 SRC와의 결합 정도를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 ICAM-1이 SRC에 의존적으로 전이능 및 혈관신생을 조절하는 것을 확인한 것으로, 도 4a는 ICAM-1을 과발현시킨 후 SRC를 넉다운시켜 암 전이능을 확인한 결과이고, 도 4b 및 4c는 RT-PCR 및 웨스턴블랏을 통해 ICAM-1을 과발현시킨 후 SRC를 넉다운시킨 다음 EMT 마커 및 전사 인자의 발현 수준을 확인한 결과이고, 도 4d는 ICAM-1을 과발현시킨 후 SRC를 넉다운시킨 다음 혈관신생능을 유도하는 성장인자의 발현을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 대장암 환자를 기반으로 ICAM-1 발현에 따른 대장암세포 생존율 및 암 악성화 정도를 확인한 것으로, 도 5a는 ICAM-1 발현에 따른 대장암의 생존율을 확인한 결과이고, 도 5b는 ICAM-1 발현에 따른 대장암 grade를 분석한 결과이고, 도 5c는 ICAM-1 발현에 따른 종양크기를 분석한 결과를 나타낸 것이다.
본 발명자들은 대장암 전이 억제제 후보물질에 대해 연구한 결과, ICAM-1이 SRC에 의존적으로 암 전이능 및 혈관신생을 조절하는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
이에, 본 발명은 (a) In Vitro 상에서 세포에 후보물질을 처리하는 단계; (b) 상기 세포에서 ICAM-1(Intracellular adhesion molecule 1)과 SRC와의 결합수준을 측정하는 단계; 및 (c) 상기 후보물질의 비처리군에 비해 ICAM-1과 SRC의 결합수준을 감소시키는 물질을 치료물질로 선정하는 단계를 포함하는 대장암 전이 억제제 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명에서 "대장암 전이 억제"는 대장암에 의한 세포 증식을 억제하는 작용을 할 뿐 아니라, 대장암의 전이 및 이동성을 억제할 수 있음을 의미한다. 상기 대장암 전이 억제제는 예를 들어, 단백질, 올리고펩티드, 소형 유기 분자, 다당류, 폴리뉴클레오타이드 및 광범위한 화합물 등 임의 분자를 포함할 수 있다.
본 발명에서 상기 "세포"는 대장 조직 유래 세포일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, ICAM-1 및 SRC의 결합 수준을 비교하기 위해 사용되는 것이고, 바람직하게는 대장암 세포일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 사용되는 용어 "후보물질"이란 ICAM-1 및 SRC의 결합수준을 감소시킬 것으로 예상되는 물질을 의미하고, 상기 후보물질은 화합물, 미생물 배양액 또는 추출물, 천연물 추출물, 핵산, 및 펩타이드로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 핵산은 siRNA, shRNA, microRNA, 안티센스 RNA, 앱타머(aptamer), LNA(locked nucleic acid), PNA(peptide nucleic acid), 및 모폴리노(morpholino)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 상기 ICAM-1과 SRC의 결합수준 측정은 ICAM-1 및 SRC 유전자의 mRNA 수준을 측정하는 것일 수 있다.
본 발명에서 상기 mRNA 수준은 중합효소연쇄반응(PCR), 역전사 중합효소연쇄반응(RT-PCR), 실시간 중합효소연쇄반응(Real-time PCR), RNase 보호 분석법(RNase protection assay; RPA), 마이크로어레이(microarray), 및 노던 블롯팅(northern blotting)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 방법을 통해 측정할 수 있다.
본 발명자들은 구체적인 실시예를 통해 ICAM-1이 SRC에 의존적으로 전이능 및 혈관생성능을 조절하는 것을 규명하였다.
본 발명의 일 실시예서는, ICAM-1을 억제시키는 경우 SRC가 감소하는 것을 확인하였으며, ICAM-1을 발현시키는 경우 SRC의 활성이 증가하는 것을 확인하였고, 면역침강반응을 통해 ICAM-1의 Tyr512 잔기와 SRC가 결합하는 것을 확인하였다(실시예 3 참조).
본 발명의 다른 실시예에서는, ICAM-1을 과발현시킨 후 SRC를 넉다운 시켰을 때 ICAM-1의 발현이 증가되었어도 SRC가 감소함에 따라 전이능이 감소하는 것을 확인하였으며, EMT 마커, 전사인자의 발현 및 혈관신생능 유도 성장인자의 발현 수준이 감소하는 것을 확인함으로써, ICAM-1이 SRC에 의존적으로 전이능과 혈관신생을 조절하는 것을 확인하였다(실시예 4 참조).
상기 실시예로부터 ICAM-1이 대장암의 전이능 및 혈관신생능에 관여하는 것을 확인할 수 있으며, ICAM-1의 대장암 억제 효능은 SRC에 의존적으로 조절된다는 것을 유추할 수 있다.
이에, 본 발명의 다른 양태로서 본 발명은 ICAM-1 유전자의 mRNA 수준을 측정하는 제제 또는 상기 유전자가 암호화하는 단백질 수준을 측정하는 제제를 포함하는 대장암 전이 예측용 조성물 및 이를 포함하는 키트를 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 ICAM-1 유전자는 서열번호 2의 염기서열로 이루어질 수 있으며, 상기 염기서열의 상동체도 본 발명의 범위 내에 포함된다. 구체적으로, 상기 유전자는 서열번호 2의 염기서열과 각각 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기서열을 포함할 수 있다.
또한, 상기 ICAM-1 유전자가 암호화하는 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어질 수 있으며, 서열번호 1에 기재된 서열과 실질적인 동일성 (substantial identity)을 나타내는 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 상기의 실질적인 동일성은, 상기한 본 발명의 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 최소 80%의 상동성, 보다 바람직하게는 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%의 상동성, 가장 바람직하게는 96%, 97%, 98%, 99%의 상동성을 나타내는 서열을 의미한다.
본 발명에서, 상기 mRNA 수준을 측정하는 제제는 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 센스 및 안티센스 프라이머, 또는 프로브일 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어, "프라이머"란 DNA 합성의 기시점이 되는 짧은 유전자 서열로써, 진단, DNA 시퀀싱 등에 이용할 목적으로 합성된 올리고뉴클레오티드를 의미한다. 상기 프라이머들은 통상적으로 15 내지 30 염기쌍의 길이로 합성하여 사용할 수 있으나, 사용 목적에 따라 달라질 수 있으며, 공지된 방법으로 메틸화, 캡화 등으로 변형시킬 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어, "프로브"란 효소 화학적인 분리정제 또는 합성과정을 거쳐 제작된 수 염기 내지 수백 염기길이의 mRNA와 특이적으로 결합할 수 있는 핵산을 의미한다. 방사성 동위원소나 효소 등을 표지하여 mRNA의 존재 유무를 확인할 수 있으며, 공지된 방법으로 디자인하고 변형시켜 사용할 수 있다.
본 발명에서, 상기 단백질 수준을 측정하는 제제는 유전자가 암호화하는 단백질에 특이적으로 결합하는 항체일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 사용되는 용어, "항체"는 면역학적으로 특정 항원과 반응성을 갖는 면역글로불린 분자를 포함하며, 단클론(monoclonal) 항체 및 다클론(polyclonal) 항체를 모두 포함한다. 또한, 상기 항체는 키메라성 항체(예를 들면, 인간화 뮤린 항체) 및 이종결합항체(예를 들면, 양특이성 항체)와 같은 유전공학에 의해 생산된 형태를 포함한다.
본 발명의 예측용 키트는 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성성분 조성물, 용액 또는 장치로 구성된다.
예컨대, 본 발명의 키트는 PCR을 수행하기 위해, 분석하고자 하는 시료로부터 유래된 게놈 DNA, 본 발명의 마커 유전자에 대해 특이적인 프라이머 세트, 적당량의 DNA 중합 효소, dNTP 혼합물, PCR 완충용액 및 물을 포함하는 키트일 수 있다. 상기 PCR 완충용액은 KCl, Tris-HCl 및 MgCl2를 함유할 수 있다. 이외에 PCR 산물의 증폭 여부를 확인할 수 있는 전기영동 수행에 필요한 구성 성분들이 본 발명의 키트에 추가로 포함될 수 있다.
또한, 본 발명의 키트는 RT-PCR을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 키트일 수 있다. RT-PCR 키트는 마커 유전자에 대한 특이적인 각각의 프라이머 쌍 외에도 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액, 데옥시뉴클레오티드(dNTPs), Taq-폴리머레이즈 및 역전사 효소와 같은 효소, DNase, RNase 억제제, DEPC-수(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다. 또한 정량 대조군으로 사용되는 유전자에 특이적인 프라이머 쌍을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 키트는 DNA 칩을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 키트일 수 있다. DNA 칩 키트는, 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA가 프로브로 부착되어 있는 기판을 포함하고, 기판은 정량구조 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA를 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 키트는 본 발명의 마커 유전자가 고정화되어 있는 기판을 갖는 마이크로어레이 형태일 수 있다.
또한, 본 발명의 키트는 ELISA를 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 것을 특징으로 하는 키트일 수 있다. ELISA 키트는 마커 단백질에 대한 특이적인 항체를 포함하며, 상기 단백질 수준을 측정하는 제제를 포함한다. 상기 ELISA 키트는 "항원-항체 복합체"를 형성한 항체를 검출할 수 있는 시약, 예를 들면 표지된 2차 항체, 발색단(chromopores), 효소, 및 그의 기질을 포함할 수 있다. 또한, 정량 대조군 단백질에 특이적인 항체를 포함할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 "항원-항체 복합체"란 유전자가 코딩하는 단백질과 이에 특이적인 항체의 결합물을 의미한다. 항원-항체 복합체의 형성량은 검출 라벨(detection label)의 시그널의 크기를 통해서 정량적으로 측정할 수 있다. 이러한 검출 라벨은 효소, 형광물, 리간드, 발광물, 미세입자(microparticle), 레독스 분자 및 방사선 동위원소로 이루어진 그룹 중에서 선택할 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 피검자 유래의 생물학적 시료에서 ICAM-1 유전자의 mRNA 또는 상기 유전자가 암호화하는 단백질의 발현수준을 측정하는 단계를 포함하는 대장암의 전이 예측을 위한 정보제공방법을 제공한다.
본 발명에서 사용되는 용어 "대장암의 전이 예측을 위한 정보제공방법"은 진단을 위한 예비적 단계로써 대장암 전이 진단을 위하여 필요한 객관적인 기초정보를 제공하는 것이며 의사의 임상학적 판단 또는 소견은 제외된다.
상기 피검체 유래의 생물학적 시료는 조직, 세포, 전혈, 혈액, 타액, 객담, 뇌척수액 및 뇨 등을 포함할 수 있으나, 이것으로 제한되는 것은 아니다.
상기 mRNA의 발현수준은 나노스트링 엔카운터 분석(NanoString nCounter analysis), 중합효소연쇄반응(PCR), 역전사 중합효소연쇄반응(RT-PCR), 실시간 중합효소연쇄반응(Real-time PCR), RNase 보호 분석법(RNase protection assay; RPA), 마이크로어레이(microarray), 및 노던 블롯팅(northern blotting)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 방법을 통해 측정될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 단백질 발현수준은 당업계에 알려진 통상적인 방법에 따라 웨스턴 블롯팅(western blotting), 방사선면역분석법(radioimmunoassay; RIA), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion), 효소면역분석법(ELISA), 면역침강법(immunoprecipitation), 유세포분석법(flow cytometry), 면역형광염색법(immunofluorescence), 오우크테로니(ouchterlony), 보체 고정 분석법(complement fixation assay), 및 단백질 칩(protein chip)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 방법을 통해 측정되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
*본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 ICAM-1 유전자 또는 상기 유전자가 암호화하는 단백질 억제제를 유효성분으로 포함하는 대장암 전이 억제용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명에서 사용되는 용어, "전이 억제"란 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 대장암의 전이 억제 및 혈관신생 억제를 비롯하여 대장암의 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에 따른 상기 약학적 조성물은 ICAM-1 유전자 또는 상기 유전자가 암호화하는 단백질 억제제를 유효성분으로 포함하며, 약학적으로 허용 가능한 담체를 더 포함할 수 있다. 상기 약학적으로 허용 가능한 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 사이클로덱스트린, 덱스트로즈 용액, 말토덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올, 리포좀 등을 포함하지만 이에 한정되지 않으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액 등 다른 통상의 첨가제를 더 포함할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제, 윤활제 등을 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구투여(예를 들어, 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)할 수 있으나, 바람직하게는 경구투여할 수 있으며, 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 시간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에 있어서 "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료 또는 진단에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료 또는 진단하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 질환 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명에 다른 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
구체적으로 본 발명의 약학적 조성물의 유효량은 환자의 연령, 성별, 상태, 체중, 체내에 활성 성분의 흡수도, 불활성률 및 배설속도, 질병종류, 병용되는 약물에 따라 달라질 수 있으며, 일반적으로는 체중 1 ㎏ 당 0.001 내지 150 ㎎, 바람직하게는 0.01 내지 100 ㎎을 매일 또는 격일 투여하거나, 1일 1 내지 3회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나 투여 경로, 비만의 중증도, 성별, 체중, 연령 등에 따라서 증감 될 수 있으므로 상기 투여량이 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
[실시예]
실시예 1. 대장 질환 및 대장암에서 ICAM-1의 발현 확인
GEO 데이터베이스를 토대로 ICAM-1의 발현을 확인한 결과, 도 1a에 나타낸 바와 같이 GSE4183에서는 대장암 형성단계인 염증성 장질환(inflammatory bowel disease, IBD) 단계부터 ICAM-1의 발현이 높은 것으로 나타났으며, GSE59071에서도 크론병(Crohn's disease) 및 궤양성 대장염(active ulcerative colitis)에서 ICAM-1의 발현이 높게 나타나는 것을 확인하였다.
또한, GSE 41258에서 ICAM-1 발현을 확인한 결과 도 1b에 나타낸 바와 같이 정상인보다 암 환자에서 ICAM-1발현이 높게 나타나는 것을 확인하였으며, GSE44706 및 GSE41258에서 면역시냅스를 기준으로 ICAM-1의 발현을 다른 부착 분자(adhesion molecule)들과 비교하였을 때, 도 1c 및 1d에 나타낸 바와 같이 암환자에서 ICAM-1 발현이 높게 나타나는 것을 히트맵(heatmap)을 통해 확인하였다.
이에 더하여, in vitro에서 ICAM-1의 발현량을 확인하기 위하여, 정상세포주인 CCD-841과 대장암 세포주(HT-29, HCT-116, SW-620, SW-480, DLD-1)를 이용해 RT-PCR을 진행한 결과, 도 1e에 나타낸 바와 같이 정상세포주인 CCD-841에 비해 대장암 세포에서 ICAM-1의 발현이 증가되어 있음을 확인하였다.
실시예 2. ICAM-1 발현에 따른 대장암 세포의 전이 및 혈관신생 확인
ICAM-1의 발현과 전이능 및 혈관신생능의 상관성을 규명하기 위하여, ICAM-1의 발현을 억제하거나 과발현시킨 후 침윤능 및 혈관신생능의 변화를 확인하였다.
먼저, ICAM-1의 발현수준이 높은 DLD-1 세포에 ICAM-1을 억제시키고, ICAM-1의 발현수준이 낮은 HT-29 세포에 ICAM-1을 과발현시킨 후 세포수의 백분율을 분석하여 침윤능 및 이동 변화를 확인한 결과, 도 2a에 나타낸 바와 같이 ICAM-1을 억제시킨 DLD-1 세포의 경우 이동 및 침윤능이 감소하는 것을 확인할 수 있었으며, ICAM-1을 과발현시킨 HT-29 세포의 경우 이동 및 침윤능이 증가하는 것을 확인하였다.
다음으로, 웨스턴블랏을 통해 ICAM-1 발현 수준에 따라 EMT 마커 및 조절인자의 변화를 확인한 결과, 도 2b에 나타낸 바와 같이 ICAM-1의 발현이 감소하는 경우 피브로넥틴(Fibronectin), N-캐드헤린(N-cadherin), 스네일(snail), 슬러그(slug), 트위스트(Twist)의 발현이 감소되는 것을 확인하였다.
다음으로, ICAM-1의 발현수준에 따른 혈관신생능을 확인한 결과, 도 2c에 나타낸 바와 같이 ICAM-1이 발현이 억제되는 경우 혈관신생이 저감되었으며, 도 2d에 나타낸 바와 같이 혈관신생과 관여되는 성장인자 발현의 경우 ICAM-1의 발현이 감소에 따라 발현의 변화를 나타내는 것을 확인하였다.
상기 결과들로부터 ICAM-1이 발현이 억제되는 경우 전이능 및 혈관신생능이 저감되는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 3. ICAM-1과 SRC의 결합 확인
대장암세포에서 ICAM-1이 전이능과 혈관신생능을 조절하는 신호 기전을 확인하기 위해, DLD-1 세포에 ICAM-1을 억제시킨뒤 phospho-kinase array를 진행한 결과, 도 3a에 나타낸 바와 같이 p-SRC가 감소하는 것을 확인하였다.
이에 더하여, TCGA 데이터베이스를 통해 ICAM-1 발현과 SRC의 활성화 연관성을 확인한 결과, 도 3b에 나타낸 바와 같이 ICAM-1 발현이 높을수록 SRC 활성이 증가하며, SRC의 oncogene signature가 증가하는 것을 확인하였으며, 대장암 세포인 DLD-1 및 SW-480에서 ICAM-1과 SRC의 발현 상관성을 확인한 결과 도 3c에 나타낸 바와 같이 ICAM-1과 SRC가 endogenous하게 결합하고 있는 것을 확인하였으며, 도 4d와 같이 PLA 염색으로 상기 결합을 확인하였다.
나아가, ICAM-1이 특정 잔기에 의해 SRC와 결합한다는 것을 확인하기 위해, ICAM-1의 Tyr512번 인산화 잔기를 억제시키거나(Y512A), 활성화시키는(Y512D) Phosphomimeitc한 변이 형태를 이용해 면역침강반응을 진행한 결과, 도 4e와 같이 Phospho 잔기가 활성화될수록 SRC와 더욱 강하게 결합되어 있음을 확인하였다.
실시예 4. SRC에 의존적인 ICAM-1의 전이능 및 혈관신생능 확인
ICAM-1이 SRC에 의존적으로 암의 전이능 및 혈관신생능을 조절하는지 확인하였다.
먼저, ICAM-1을 과발현시킨 후 rescue 실험으로 SRC를 넉다운한 후 전이능을 확인한 결과, 도 4a에 나타낸 바와 같이 ICAM-1 발현이 증가되었어도 SRC가 감소함에 따라 전이능이 감소하는 것을 확인하였다.
다음으로, RT-PCR 및 웨스턴블랏을 사용하여 EMT 마커 및 전사인자의 발현을 확인한 결과, 도 4b에 나타낸 바와 같이 SRC 발현이 감소함에 따라 EMT 마커 및 전사인자의 발현이 감소되는 것을 확인하였다.
이에 더하여, 혈관신생능의 변화를 확인하기 위해 혈관신생능을 유도하는 성장인자의 발현을 확인한 결과, 도 4d에 나타낸 바와 같이 SRC 발현이 감소함에 따라 성장인자의 발현도 감소되는 것을 확인하였다.
상기 결과로부터, ICAM-1의 전이능 및 혈관신생능은 SRC에 의존적으로 조절된다는 것을 유추할 수 있다.
실시예 5. ICAM-1 발현에 따른 환자의 생존율 및 암 악성화 정도 확인
In vitro 실험과 더불어 환자에 직접 적용하는 경우에도 ICAM-1의 발현이 대장암과의 상관성을 나타내는지 확인하기 위해, TCGA 데이터 베이스를 통해 대장암 환자의 생존율을 확인하였다. 그 결과, 도 5a에 나타낸 바와 같이 ICAM-1이 높게 발현되는 경우 대장암 환자의 생존율이 낮아지는 것을 확인하였다.
이에 더하여, GSE 17538에서 ICAM-1 발현에 따른 대장암 환자의 암 grade를 확인한 결과, 도 5b에 나타낸 바와 같이 ICAM-1이 낮은 경우에 비해 ICAM-1이 높은 경우에 3기에 해당하는 환자가 더 많은 것을 확인하였다.
나아가, GDC TCGA를 통해 암의 악성화 정도를 확인 하였으며, 이때 TNM stage 중 종양 크기에 따라 구분되는 T 단계로 표시하였으며 각 단계는 T1, T2, T3, T4로 구분되며, 숫자가 높을수록 암의 악성화가 더욱 진행된 것을 의미한다. 그 결과, 도 5c에 나타낸 바와 같이 ICAM-1의 발현이 높을수록 T3 및 T4에 해당하는 환자가 더 많게 나타나는 것을 확인하였다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.
<110> IUCF-HYU (Industry-University Cooperation Foundation Hanyang University) <120> Method for screening an inhibitor for metastasis of colorectal cancer <130> PD20-113 <160> 2 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 532 <212> PRT <213> ICAM-1 <400> 1 Met Ala Pro Ser Ser Pro Arg Pro Ala Leu Pro Ala Leu Leu Val Leu 1 5 10 15 Leu Gly Ala Leu Phe Pro Gly Pro Gly Asn Ala Gln Thr Ser Val Ser 20 25 30 Pro Ser Lys Val Ile Leu Pro Arg Gly Gly Ser Val Leu Val Thr Cys 35 40 45 Ser Thr Ser Cys Asp Gln Pro Lys Leu Leu Gly Ile Glu Thr Pro Leu 50 55 60 Pro Lys Lys Glu Leu Leu Leu Pro Gly Asn Asn Arg Lys Val Tyr Glu 65 70 75 80 Leu Ser Asn Val Gln Glu Asp Ser Gln Pro Met Cys Tyr Ser Asn Cys 85 90 95 Pro Asp Gly Gln Ser Thr Ala Lys Thr Phe Leu Thr Val Tyr Trp Thr 100 105 110 Pro Glu Arg Val Glu Leu Ala Pro Leu Pro Ser Trp Gln Pro Val Gly 115 120 125 Lys Asn Leu Thr Leu Arg Cys Gln Val Glu Gly Gly Ala Pro Arg Ala 130 135 140 Asn Leu Thr Val Val Leu Leu Arg Gly Glu Lys Glu Leu Lys Arg Glu 145 150 155 160 Pro Ala Val Gly Glu Pro Ala Glu Val Thr Thr Thr Val Leu Val Arg 165 170 175 Arg Asp His His Gly Ala Asn Phe Ser Cys Arg Thr Glu Leu Asp Leu 180 185 190 Arg Pro Gln Gly Leu Glu Leu Phe Glu Asn Thr Ser Ala Pro Tyr Gln 195 200 205 Leu Gln Thr Phe Val Leu Pro Ala Thr Pro Pro Gln Leu Val Ser Pro 210 215 220 Arg Val Leu Glu Val Asp Thr Gln Gly Thr Val Val Cys Ser Leu Asp 225 230 235 240 Gly Leu Phe Pro Val Ser Glu Ala Gln Val His Leu Ala Leu Gly Asp 245 250 255 Gln Arg Leu Asn Pro Thr Val Thr Tyr Gly Asn Asp Ser Phe Ser Ala 260 265 270 Lys Ala Ser Val Ser Val Thr Ala Glu Asp Glu Gly Thr Gln Arg Leu 275 280 285 Thr Cys Ala Val Ile Leu Gly Asn Gln Ser Gln Glu Thr Leu Gln Thr 290 295 300 Val Thr Ile Tyr Ser Phe Pro Ala Pro Asn Val Ile Leu Thr Lys Pro 305 310 315 320 Glu Val Ser Glu Gly Thr Glu Val Thr Val Lys Cys Glu Ala His Pro 325 330 335 Arg Ala Lys Val Thr Leu Asn Gly Val Pro Ala Gln Pro Leu Gly Pro 340 345 350 Arg Ala Gln Leu Leu Leu Lys Ala Thr Pro Glu Asp Asn Gly Arg Ser 355 360 365 Phe Ser Cys Ser Ala Thr Leu Glu Val Ala Gly Gln Leu Ile His Lys 370 375 380 Asn Gln Thr Arg Glu Leu Arg Val Leu Tyr Gly Pro Arg Leu Asp Glu 385 390 395 400 Arg Asp Cys Pro Gly Asn Trp Thr Trp Pro Glu Asn Ser Gln Gln Thr 405 410 415 Pro Met Cys Gln Ala Trp Gly Asn Pro Leu Pro Glu Leu Lys Cys Leu 420 425 430 Lys Asp Gly Thr Phe Pro Leu Pro Ile Gly Glu Ser Val Thr Val Thr 435 440 445 Arg Asp Leu Glu Gly Thr Tyr Leu Cys Arg Ala Arg Ser Thr Gln Gly 450 455 460 Glu Val Thr Arg Lys Val Thr Val Asn Val Leu Ser Pro Arg Tyr Glu 465 470 475 480 Ile Val Ile Ile Thr Val Val Ala Ala Ala Val Ile Met Gly Thr Ala 485 490 495 Gly Leu Ser Thr Tyr Leu Tyr Asn Arg Gln Arg Lys Ile Lys Lys Tyr 500 505 510 Arg Leu Gln Gln Ala Gln Lys Gly Thr Pro Met Lys Pro Asn Thr Gln 515 520 525 Ala Thr Pro Pro 530 <210> 2 <211> 1625 <212> DNA <213> ICAM-1 <400> 2 atggctccca gcagcccccg gcccgcgctg cccgcactcc tggtcctgct cggggctctg 60 ttcccaggac ctggcaatgc cgaattcccc tcaaaagtca tcctgccccg gggaggctcc 120 gtgctggtga catgcagcac ctcctgtgac cagcccaagt tgttgggcat agagaccccg 180 ttgcctaaaa aggagttgct cctgcctggg aacaaccgga aggtgtatga actgagcaat 240 gtgcaagaag atagccaacc aatgtgctat tcaaactgcc ctgatgggca gtcaacagct 300 aaaaccttcc tcaccgtgta ctggactcca gaacgggtgg aactggcacc cctcccctct 360 tggcagccag tgggcaagaa ccttacccta cgctgccagg tggagggtgg ggcaccccgg 420 gccaacctca ccgtggtgct gctccgtggg gagaaggagc tgaaacggga gccagctgtg 480 ggggagcccg ctgaggtcac gaccacggtg ctggtgagga gagatcacca tggagccaat 540 ttctcgtgcc gcactgaact ggacctgcgg ccccaagggc tggagctgtt tgagaacacc 600 tcggccccct accagctcca gacctttgtc ctgccagcga ctcccccaca acttgtcagc 660 ccccgggtcc tagaggtgga cacgcagggg accgtggtct gttccctgga cgggctgttc 720 ccagtctcgg aggcccaggt ccacctggca ctgggggacc agaggttgaa ccccacagtc 780 acctatggca acgactcctt ctcggccaag gcctcagtca gtgtgaccgc agaggacgag 840 ggcacccagc ggctgacgtg tgcagtaata ctggggaacc agagccagga gacactgcag 900 acagtgacca tttacagttt tccggcgccc aacgtgattc tgacgaagcc agaggtctca 960 gaagggaccg aggtgacagt gaagtgtgag gcccacccta gagccaaggt gacgctgaat 1020 ggggttccag cccagccact gggcccgagg gcccagctcc tgctgaaggc caccccagag 1080 gacaacgggc gcagcttctc ctgctctgca accctggagg tggccggcca gcttatacac 1140 aagaaccaga cccgggagct tcgtgtcctg tatggccccc gactggacga gagggattgt 1200 ccgggaaact ggacgtggcc agaaaattcc cagcagactc caatgtgcca ggcttggggg 1260 aacccattgc ccgagctcaa gtgtctaaag gatggcactt tcccactgcc catcggggaa 1320 tcagtgactg tcactcgaga tcttgagggc acctacctct gtcgggccag gagcactcaa 1380 ggggaggtca cccgcgaggt gaccgtgaat gtgctctccc cccggtatga gattgtcatc 1440 atcactgtgg tagcagccgc agtcataatg ggcactgcag gcctcagcac gtacctctat 1500 aaccgccagc ggaagatcaa gaaatacaga ctacaacagg cccaaaaagg gacccccatg 1560 aaaccgaaca cacaagccac gcctccctac ccatacgatg ttccagatta cgcttgagcg 1620 gccgc 1625

Claims (5)

  1. ICAM-1(Intracellular adhesion molecule 1)에 대한 억제제의 치료학적 유효량을 포함하는 대장암 전이 억제용 약학적 조성물로,
    상기 억제제는 다음 중 선택된 적어도 하나에 의해 대장암의 전이를 억제할 수 있는 대장암 전이 억제용 약학적 조성물:
    대장암의 EMT(epithelial to mesenchymal transition)의 억제; 및
    대장암에 의해 유도되는 혈관 신생의 억제.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 EMT의 억제는 피브로넥틴(Fibronectin), N-캐드헤린(N-cadherin), 스네일 (snail), 슬러그(slug), 및 트위스트(Twist) 중 선택된 하나 이상의 마커의 발현을 감소시키는 것인, 대장암 전이 억제용 약학적 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 혈관 신생의 억제는 PDGFB, VEGF-1, FGF-2, ANG-1 및 ANG-2 중 선택된 하나 이상의 마커의 발현을 감소시키는 것인, 대장암 전이 억제용 약학적 조성물.
  4. ICAM-1(Intracellular adhesion molecule 1)에 대한 억제제의 치료학적 유효량을 포함하는 대장암 전이 억제용 약학적 조성물로,
    상기 억제제는 ICAM-1와 SRC의 결합수준에 의존적인 대장암의 전이를 억제하는, 대장암 전이 억제용 약학적 조성물.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 ICAM-1와 SRC의 결합은 ICAM-1의 512번 티로신에서 형성되는, 대장암 전이 억제용 약학적 조성물.
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