KR102434324B1 - 전이성 유방암 진단 또는 예후 예측용 마커 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 전이성 유방암 진단 또는 예후 예측용 마커 및 이의 용도에 관한 것으로서, 보다 구체적으로 FBXO15 유전자 또는 상기 유전자가 암호화하는 단백질을 포함하는 전이성 유방암 진단 또는 예후 예측용 마커 조성물, 및 이를 이용한 전이성 유방암 진단 또는 예후 예측용 조성물, 전이성 유방암 진단 또는 예후 예측을 위한 정보제공방법 등에 관한 것이다. 본 발명은 FBXO15가 SOX2와의 결합을 통해 유비퀴틴화 및 분해를 유도함으로써, 암세포의 전이능 및 줄기세포능을 감소시키는 것을 확인하였다. 이에, 본 발명에 따른 FBXO15는 호르몬 수용체 타겟 치료제를 비롯한 전이성 유방암 치료제로 활용이 가능하다.

Description

전이성 유방암 진단 또는 예후 예측용 마커 및 이의 용도{Biomarker for diagnosis or prognosis prediction of metastatic breast cancer and use thereof}

본 발명은 전이성 유방암 진단 또는 예후 예측용 마커 및 이의 용도에 관한 것으로서, 보다 구체적으로 FBXO15 유전자 또는 상기 유전자가 암호화하는 단백질을 포함하는 전이성 유방암 진단 또는 예후 예측용 마커 조성물, 및 이를 이용한 전이성 유방암 진단 또는 예후 예측용 조성물, 전이성 유방암 진단 또는 예후 예측을 위한 정보제공 방법 등에 관한 것이다.

유방암은 폐암에 이어 두번째로 흔히 발생되는 암이며, 사망률은 5위에 해당하는 악성 종양이다. 전세계에서 유방암의 발병 원인은 다양하지만, 알려진 원인은 약 20%에 불과한 실정이다. 나머지 약 80%는 원인이 알려지지 않았지만, 외부적인 환경에 의한 원인일 가능성이 높다는 의견이 중론이다. 외부 환경에 의한 질병은 발병 원인이 너무 다양하여 한가지 원인으로 설명하기 어렵다. 따라서 복합적인 외부 환경이 유방암의 주된 원인일 것으로 받아들여지고 있다. 외부 환경적 원인으로 발병된 질병은 미리 예측하여 예방할 수 없고 질병 진단이 이뤄진 다음에야 치료 과정이 이뤄지기 때문에, 비용, 기간 및 회복에 상당한 시간이 소요되는 문제가 있다 유방암의 경우 일단 암세포가 주변 조직에 침범하거나 림프절로 전이가 시작되면 완치가 어렵기 때문에 조기 발견이 다른 암보다 더 중요하다고 할 수 있으며, 이에 대한 연구가 활발히 진행중이다(대한민국 등록특허 10-1966493).

한편, 이질성을 갖는 유방암 세포들은 다양한 바이오마커의 발현양상에 따라 다른 서브 타입을 가지며 그에 따른 약물치료뿐만 아니라 방사선 치료를 진행하고 있다.

유방암 세포 발현 양상에 따른 서브 타입은 에스트로젠 수용체(ER), 프로게스테론 수용체(PR) 및 인간 상피 성장인자 수용체(HER2)의 발현 유무에 따라 나누어진다고 알려져 있다. 3가지 호르몬 수용체를 모두 갖는 유형(ER+, PR+, HER2+)을 내강형(luminal type)이라고 하며 그 수용체를 타겟으로 하는 약물치료가 효과적으로 진행되고 있지만, 3가지 수용체에 대해 음성을 보이는 조직(ER-, PR-, HER2-)인 기저형(basal type) 유방암 조직은 약물치료가 쉽지 않을 뿐만 아니라 내강형과 비교하였을 때 침투능이 높고 전이가 잘 일어남으로써 좋지 않은 예후를 나타낸다. 이에, 상기와 같은 유방암 세포 발현양상에 따른 수용체에 음성을 나타내는 전이성 유방암 세포를 치료할 수 있는 새로운 표적이 필요한 실정이다.

대한민국 등록특허 10-1966493 (2019.04.01)

상기와 같은 문제점을 해결하기 위하여, 본 발명자들은 유방암 세포를 치료할 수 있는 표적을 연구한 결과, 유방암 유형에 따라 가장 큰 발현 차이를 나타내는 E3 접합유전자(ligase) FBXO15를 선별하고, FBXO15의 발현에 따른 암 줄기세포능 및 암 전이 억제능을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

이에, 본 발명은 FBXO15 유전자 또는 상기 유전자가 암호화하는 단백질을 포함하는, 전이성 유방암 진단 또는 예후 예측용 마커 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 FBXO15 유전자의 mRNA 또는 상기 유전자가 암호화하는 단백질 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 전이성 유방암 진단 또는 예후 예측용 조성물 및 상기 조성물을 포함하는 키트를 제공하는 것을 다른 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 피검자 유래의 생물학적 시료에서 FBXO15 유전자의 mRNA 또는 상기 유전자가 암호화하는 단백질의 발현수준을 측정하는 단계를 포함하는 전이성 유방암 진단 또는 예후 예측을 위한 정보제공 방법을 제공하는 것을 또 다른 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 본 발명은 FBXO15 유전자 또는 상기 유전자가 암호화하는 단백질을 유효성분으로 포함하는, 전이성 유방암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것을 또 다른 목적으로 한다.

그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 FBXO15 유전자 또는 상기 유전자가 암호화하는 단백질을 포함하는, 전이성 유방암 진단 또는 예후 예측용 마커 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 FBXO15 유전자의 mRNA 또는 상기 유전자가 암호화하는 단백질 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 전이성 유방암 진단 또는 예후 예측용 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 구현예로, 상기 유전자의 mRNA 수준을 측정하는 제제는 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 센스 및 안티센스 프라이머, 또는 프로브일 수 있다.

본 발명의 다른 구현예로, 상기 단백질 수준을 측정하는 제제는 상기 유전자가 암호화하는 단백질에 특이적으로 결합하는 항체일 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는, 전이성 유방암 진단 또는 예후 예측용 키트를 제공한다.

또한, 본 발명은 피검자 유래의 생물학적 시료에서 FBXO15 유전자의 mRNA 또는 상기 유전자가 암호화하는 단백질의 발현수준을 측정하는 단계를 포함하는 전이성 유방암 진단 또는 예후 예측을 위한 정보제공 방법을 제공한다.

본 발명의 일 구현예로, 상기 mRNA 발현수준은 나노스트링 엔카운터 분석(NanoString nCounter analysis), 중합효소연쇄반응(PCR), 역전사 중합효소연쇄반응(RT-PCR), 실시간 중합효소연쇄반응(Real-time PCR), RNase 보호 분석법(RNase protection assay; RPA), 마이크로어레이(microarray), 및 노던 블롯팅(northern blotting)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 방법을 통해 측정될 수 있다.

본 발명의 다른 구현예로, 상기 상기 단백질 발현수준은 웨스턴 블롯팅(western blotting), 방사선면역분석법(radioimmunoassay; RIA), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion), 효소면역분석법(ELISA), 면역침강법(immunoprecipitation), 유세포분석법(flow cytometry), 면역형광염색법(immunofluorescence), 오우크테로니(ouchterlony), 보체 고정 분석법(complement fixation assay), 및 단백질 칩(protein chip)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 방법을 통해 측정될 수 있다.

또한, 본 발명은 FBXO15 유전자 또는 상기 유전자가 암호화하는 단백질을 유효성분으로 포함하는, 전이성 유방암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 구현예로, 상기 약학적 조성물은 유방암 세포의 이동(migration) 및 침습(invasion)능을 억제하거나, 또는 유방암 줄기세포의 줄기세포능을 억제하는 것일 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 조성물은 단백질 수준에서 SOX2의 분해를 유도하는 것일 수 있다.

또한, 본 발명은 전이성 유방암 치료제를 스크리닝하는 방법을 제공한다.

본 발명은 FBXO15가 SOX2와의 결합을 통해 유비퀴틴화 및 분해를 유도함으로써, 암세포의 전이능 및 줄기세포능을 감소시키는 것을 확인하였다. 이에, 본 발명에 따른 FBXO15는 호르몬 수용체 타겟 치료제를 비롯한 전이성 유방암 치료제로 활용이 가능하다.

도 1은 기저형 및 내강형 유방암에서의 FBXO15의 발현정도를 나타낸 것으로, 도 1a는 기저형 및 내강형 유방암에서 발현하는 E3 접합유전자를 확인한 결과이고, 도 1b는 TCGA 데이터베이스를 통해 유방암 유형별 FBXO15의 발현을 확인한 결과이고, 도 1c는 GSE 데이터베이스를 통해 내강형 유방암 세포주에서 FBXO15의 발현을 확인한 결과이고, 도 1d는 조직염색을 통해 유방암 유형을 확인한 결과이며, 도 1e는 Kaplan-Meier 분석을 통해 FBXO15의 발현에 따른 환자의 생존율을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 FBXO15와 유방암 세포의 침윤능을 확인한 결과로서, 도 2a는 MCF7 내강형 유방암 세포에 si-RNA를 사용하여 FBXO15를 억제하였을 때 boyden chamber assay를 통해 침윤능을 확인한 결과를 나타낸 것이고, 도 2b 및 2c는 EMT 마커 및 조절인자를 mRNA 및 단백질 수준에서 확인한 결과를 나타낸 것이고, 도 2d 내지 2f는 In vitro 결과를 기반으로 LM-1(lung meta-MDAMB231) 세포에 sh-RNA를 사용하여 FBXO15를 억제하였을 때 폐로 전이되는 여부를 In vivo 실험을 통해 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 FBXO15와 유방암 세포의 줄기세포능과의 관계를 확인한 결과로서, 도 3a는 FBXO15의 발현이 높은 내강형 세포인 MCF7 세포에서 FBXO15를 억제하였을 때, 구체(Sphere)의 크기를 나타낸 결과이고, 도 3b 및 3c는 기저형 유방암 세포인 MDA-MB-231 세포에 FBXO15를 과발현한 후 줄기세포능을 조절하는 주요인자인 SOX2, OCT4 및 Nanog의 mRNA 및 단백질 발현수준을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 FBXO15와 SOX2의 결합에 의한 유비퀴틴화 및 분해 유도를 확인한 것으로서, 도 4a 및 4b는 HEK293T 세포에 SOX2와 FBXO15를 과발현시킨 후 IP를 진행하여 단백질의 결합여부를 확인한 것이고, 도 4c는 MDA-MB-231 세포에 FBXO15를 과발현시킨 후 사이클로헥시마이드(Cycloheximide, CHX)를 처리하여 SOX2 단백질의 안정화를 확인한 것이고, 도 4d는 HEK293T 세포에 SOX2와 FBXO15를 과발현시킨 후 유비퀴틴화 분석(ubiquitination assay) 결과를 나타낸 것이고, 도 4e는 MDA-MB-231 세포에 FBXO15 및 SOX2의 발현여부에 따른 EMT 마커 발현 변화를 나타낸 것이고, 도 4f는 FBXO15가 SOX2를 억제함으로써 암 줄기세포능 및 폐 전이를 감소시키는 것에 대한 개략도를 나타낸 것이다.

본 발명자들은 유방암 세포를 치료할 수 있는 표적을 연구한 결과, 유방암 유형에 따라 가장 큰 발현 차이를 나타내는 E3 접합유전자(ligase) FBXO15를 선별하고, FBXO15의 발현에 따른 암 줄기세포능 및 암 전이 억제능을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

이에, 본 발명은 FBXO15 유전자 또는 상기 유전자가 암호화하는 단백질을 포함하는, 전이성 유방암 진단 또는 예후 예측용 마커 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 FBXO15 유전자의 mRNA 또는 상기 유전자가 암호화하는 단백질 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 전이성 유방암 진단 또는 예후 예측용 조성물 및 이를 포함하는 전이성 유방암 진단 또는 예후 예측용 키트를 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 FBXO15 유전자는 서열번호 1의 염기서열로 이루어질 수 있으며, 상기 염기서열의 상동체도 본 발명의 범위 내에 포함된다. 구체적으로, 상기 유전자는 서열번호 1의 염기서열과 각각 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기서열을 포함할 수 있다.

또한, 상기 FBXO15 유전자가 암호화하는 단백질은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어질 수 있으며, 서열번호 2에 기재된 서열과 실질적인 동일성 (substantial identity)을 나타내는 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 상기의 실질적인 동일성은, 상기한 본 발명의 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 최소 80%의 상동성, 보다 바람직하게는 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%의 상동성, 가장 바람직하게는 96%, 97%, 98%, 99%의 상동성을 나타내는 서열을 의미한다.

본 발명에서 대상으로 하는 질병인 "전이성 유방암"은 유방암의 유형 중 하나로서 내강형과 비교하였을 때 침투능이 높고 전이가 잘 일어나는 3가지 호르몬 수용체에 음성을 보이는 조직(ER-, PR-, HER2-)인 기저형(basal type) 유형의 유방암을 의미하며, 최소한 하나의 원발성 유방 종양에서 유래된 변형된, 즉 암성 세포가 그 원발성 종양에서 분리되어 원발성 종양과 떨어진 위치(이하 "원격 부위"라 한다)에서 암으로 계속 성장하는 질병으로서, 상기 원격 부위는 예를 들면 원발성 종양이 위치된 동일한 유방(동측 유방; ipsilateral breast) 또는 다른 유방(반대측 유방; contralateral breast) 내일 수 있다. 또한, 예를 들어 상기 원격 부위는 하나 이상의 림프절 내일 수 있으며, 이들은 이동성이거나 고정되어 있을 수 있고, 상기 원발성 종양에 대해 동측이거나 반대측일 수 있으며, 쇄골 위이거나 겨드랑이 등에 있는 것일 수 있다.

본 발명에서 사용되는 용어 "예후 예측"은 유방암에 의한 세포 생존율 및 세포 증식을 예측하는 작용뿐만 아니라 유방암 전이의 위험성을 예측할 수 있음을 의미한다.

본 발명에서 사용되는 용어, "진단(diagnosis)"이란 넓은 의미로는 환자의 병의 실태를 모든 면에 걸쳐서 판단하는 것을 의미한다. 판단의 내용은 병명, 병인, 병형, 경중, 병상의 상세한 양태, 및 합병증의 유무 등이다. 본 발명에서 진단은 전이성 유방암의 발병 여부 및 진행단계 수준 등을 판단하는 것이다.

본 발명에서, 상기 mRNA 수준을 측정하는 제제는 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 센스 및 안티센스 프라이머, 또는 프로브일 수 있다.

본 발명에서 사용되는 용어, "프라이머"란 DNA 합성의 기시점이 되는 짧은 유전자 서열로써, 진단, DNA 시퀀싱 등에 이용할 목적으로 합성된 올리고뉴클레오티드를 의미한다. 상기 프라이머들은 통상적으로 15 내지 30 염기쌍의 길이로 합성하여 사용할 수 있으나, 사용 목적에 따라 달라질 수 있으며, 공지된 방법으로 메틸화, 캡화 등으로 변형시킬 수 있다.

본 발명에서 사용되는 용어, "프로브"란 효소 화학적인 분리정제 또는 합성과정을 거쳐 제작된 수 염기 내지 수백 염기길이의 mRNA와 특이적으로 결합할 수 있는 핵산을 의미한다. 방사성 동위원소나 효소 등을 표지하여 mRNA의 존재 유무를 확인할 수 있으며, 공지된 방법으로 디자인하고 변형시켜 사용할 수 있다.

본 발명에서, 상기 단백질 수준을 측정하는 제제는 유전자가 암호화하는 단백질에 특이적으로 결합하는 항체일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 사용되는 용어, "항체"는 면역학적으로 특정 항원과 반응성을 갖는 면역글로불린 분자를 포함하며, 단클론(monoclonal) 항체 및 다클론(polyclonal) 항체를 모두 포함한다. 또한, 상기 항체는 키메라성 항체(예를 들면, 인간화 뮤린 항체) 및 이종결합항체(예를 들면, 양특이성 항체)와 같은 유전공학에 의해 생산된 형태를 포함한다.

본 발명의 예측용 키트는 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성성분 조성물, 용액 또는 장치로 구성된다.

예컨대, 본 발명의 키트는 PCR을 수행하기 위해, 분석하고자 하는 시료로부터 유래된 게놈 DNA, 본 발명의 마커 유전자에 대해 특이적인 프라이머 세트, 적당량의 DNA 중합 효소, dNTP 혼합물, PCR 완충용액 및 물을 포함하는 키트일 수 있다. 상기 PCR 완충용액은 KCl, Tris-HCl 및 MgCl₂를 함유할 수 있다. 이외에 PCR 산물의 증폭 여부를 확인할 수 있는 전기영동 수행에 필요한 구성 성분들이 본 발명의 키트에 추가로 포함될 수 있다.

또한, 본 발명의 키트는 RT-PCR을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 키트일 수 있다. RT-PCR 키트는 마커 유전자에 대한 특이적인 각각의 프라이머 쌍 외에도 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액, 데옥시뉴클레오티드(dNTPs), Taq-폴리머레이즈 및 역전사 효소와 같은 효소, DNase, RNase 억제제, DEPC-수(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다. 또한 정량 대조군으로 사용되는 유전자에 특이적인 프라이머 쌍을 포함할 수 있다.

또한, 본 발명의 키트는 DNA 칩을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 키트일 수 있다. DNA 칩 키트는, 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA가 프로브로 부착되어 있는 기판을 포함하고, 기판은 정량구조 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA를 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 키트는 본 발명의 마커 유전자가 고정화되어 있는 기판을 갖는 마이크로어레이 형태일 수 있다.

또한, 본 발명의 키트는 ELISA를 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 것을 특징으로 하는 키트일 수 있다. ELISA 키트는 마커 단백질에 대한 특이적인 항체를 포함하며, 상기 단백질 수준을 측정하는 제제를 포함한다. 상기 ELISA 키트는 "항원-항체 복합체"를 형성한 항체를 검출할 수 있는 시약, 예를 들면 표지된 2차 항체, 발색단(chromopores), 효소, 및 그의 기질을 포함할 수 있다. 또한, 정량 대조군 단백질에 특이적인 항체를 포함할 수 있다.

본 발명에서 사용되는 용어 "항원-항체 복합체"란 유전자가 코딩하는 단백질과 이에 특이적인 항체의 결합물을 의미한다. 항원-항체 복합체의 형성량은 검출 라벨(detection label)의 시그널의 크기를 통해서 정량적으로 측정할 수 있다. 이러한 검출 라벨은 효소, 형광물, 리간드, 발광물, 미세입자(microparticle), 레독스 분자 및 방사선 동위원소로 이루어진 그룹 중에서 선택할 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 다른 양태로서, 본 발명은 피검자 유래의 생물학적 시료에서 FBXO15 유전자의 mRNA 또는 상기 유전자가 암호화하는 단백질의 발현수준을 측정하는 단계를 포함하는 전이성 유방암 진단 또는 예후 예측을 위한 정보제공방법을 제공한다.

본 발명에서 사용되는 용어 "전이성 유방암의 진단 또는 예후 예측을 위한 정보제공방법"은 진단을 위한 예비적 단계로써 전이성 유방암의 진단을 위하여 필요한 객관적인 기초정보를 제공하는 것이며 의사의 임상학적 판단 또는 소견은 제외된다.

상기 피검체 유래의 생물학적 시료는 조직, 세포, 전혈, 혈액, 타액, 객담, 뇌척수액 및 뇨 등을 포함할 수 있으나, 이것으로 제한되는 것은 아니다.

상기 mRNA의 발현수준은 나노스트링 엔카운터 분석(NanoString nCounter analysis), 중합효소연쇄반응(PCR), 역전사 중합효소연쇄반응(RT-PCR), 실시간 중합효소연쇄반응(Real-time PCR), RNase 보호 분석법(RNase protection assay; RPA), 마이크로어레이(microarray), 및 노던 블롯팅(northern blotting)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 방법을 통해 측정될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 단백질 발현수준은 당업계에 알려진 통상적인 방법에 따라 웨스턴 블롯팅(western blotting), 방사선면역분석법(radioimmunoassay; RIA), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion), 효소면역분석법(ELISA), 면역침강법(immunoprecipitation), 유세포분석법(flow cytometry), 면역형광염색법(immunofluorescence), 오우크테로니(ouchterlony), 보체 고정 분석법(complement fixation assay), 및 단백질 칩(protein chip)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 방법을 통해 측정되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명자들은 구체적인 실시예를 통해 전이성 유방암을 진단 및 치료하기 위한 신규한 표적으로써 본 발명에 따른 FBXO15의 용도를 규명하였다.

본 발명의 일 실시예서는 유방암 유형별 FBXO15의 발현량을 확인한 결과 전이성이 높은 기저형 조직에서 FBXO15의 발현이 유의적으로 낮으며, 유방암이 악성화 될수록 FBXO15의 발현이 감소하는 것을 확인하였다(실시예 1 및 2 참조).

본 발명의 다른 실시예에서는, FBXO15가 유방암 세포의 EMT 및 전이에 영향에 대해 분석하기 위해 Boyden chamber assay를 통해 침윤능을 확인한 결과, FBXO15가 억제된 si-FBXO15의 경우 침윤능이 증가되는 것을 확인하였다(실시예 3 참조).

또한, 본 발명의 또 다른 실시예에서는 기저형 유방암 세포인 MDA-MB-231 세포에 FBXO15를 과발현한 후 줄기세포능을 조절하는 주요인자인 SOX2, OCT4 및 NANOG의 mRNA 및 단백질 발현 수준을 확인하여 FBXO15와 암 줄기세포가 연관성을 분석한 결과, SOX2의 조절이 FBXO15와 직접적인 연관성이 있을 수 있다는 것을 확인하였다(실시예 4 참조).

또한, 본 발명의 또 다른 실시예에서는 HEK293T 세포에 SOX 및 FBXO15를 과발현시킨 후 유비퀴틴화 분석(ubiquitination assay)을 진행한 결과 두 단백질을 과발현시킨 그룹에서 유비퀴틴화가 증가함을 확인함으로써 FBXO15는 SOX2를 단백질 수준에서 직접적으로 분해를 유도해 억제함으로써 암 줄기세포능 및 암 전이능을 감소시키는 것을 확인하였다(실시예 5 참조).

이에, 본 발명의 다른 양태로서 본 발명은 FBXO15 유전자 또는 상기 유전자가 암호화하는 단백질을 유효성분으로 포함하는, 전이성 유방암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명에서 사용되는 용어, "예방"이란 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 전이성 유방암을 억제시키거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미한다.

본 발명에서 사용되는 용어, "치료"란 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 전이성 유방암에 대한 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.

본 발명에 따른 상기 약학적 조성물은 FBXO15 유전자 또는 상기 유전자가 암호화하는 단백질을 유효성분으로 포함하며, 약학적으로 허용 가능한 담체를 더 포함할 수 있다. 상기 약학적으로 허용 가능한 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 사이클로덱스트린, 덱스트로즈 용액, 말토덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올, 리포좀 등을 포함하지만 이에 한정되지 않으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액 등 다른 통상의 첨가제를 더 포함할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제, 윤활제 등을 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구투여(예를 들어, 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)할 수 있으나, 바람직하게는 경구투여할 수 있으며, 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 시간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에 있어서 "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료 또는 진단에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료 또는 진단하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 질환 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명에 다른 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

구체적으로 본 발명의 약학적 조성물의 유효량은 환자의 연령, 성별, 상태, 체중, 체내에 활성 성분의 흡수도, 불활성률 및 배설속도, 질병종류, 병용되는 약물에 따라 달라질 수 있으며, 일반적으로는 체중 1 ㎏ 당 0.001 내지 150 ㎎, 바람직하게는 0.01 내지 100 ㎎을 매일 또는 격일 투여하거나, 1일 1 내지 3회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나 투여 경로, 비만의 중증도, 성별, 체중, 연령 등에 따라서 증감 될 수 있으므로 상기 투여량이 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

또한, 본 발명에 따르면, FBXO15가 단백질 수준에서 SOX2의 분해를 유도함으로써 유방암의 침투능 및 이동능을 억제시킬 수 있음을 확인하였는바, 미지의 물질들 중에서 FBXO15와 SOX2의 결합을 증가시키는 물질을 선택함으로써 전이성 유방암 치료제를 선별할 수 있다.

이에, 본 발명의 또 다른 양태로서, 하기의 단계를 포함하는, 전이성 유방암 치료제 스크리닝 방법을 제공한다.

(a) In vitro 상에서 세포에 후보물질을 처리하는 단계;

(b) 상기 세포의 FBXO15 및 SOX2의 결합수준을 측정하는 단계; 및

(c) 후보물질 비처리군에 비해 FBXO15 및 SOX2의 결합수준을 증가시키는 물질을 선별하는 단계.

상기 세포는 유방 조직 유래 세포일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 후보물질은 화합물, 미생물 배양액 또는 추출물, 천연물 추출물, 핵산, 및 펩타이드로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

[실시예]

실시예 1. E3 접합유전자(ligase) 선별

유방암 유형에 따른 E3 접합유전자(ligase) 발현의 차이를 확인하기 위하여, 도 1a에 나타낸 TCGA 데이터베이스를 통해 기저형 유방암 대비 내강형 유방암에서 발현이 높은 6개의 E3 접합유전자(FBXO15, FBXW12, FBXO40, FBXO36, FBXL7, FBXO16)를 확인하였으며, 6개의 접합유전자 중 가장 큰 발현차이를 나타내는 FBXO15를 선별하였다.

실시예 2. 유방암 유형에 따른 FBXO15의 발현 차이 확인

먼저 FBXO15가 유방암의 유형에 따라 발현에 차이를 나타내는지 확인하기 위해 유방암 유형별 TCGA 및 GSE 데이터베이스를 활용하여 FBXO15의 발현 정도를 확인한 결과, 도 1b에 나타낸 바와 같이 TCGA 데이터베이스에서는 각 유방암 유형이 악성화될수록 FBXO15의 발현이 감소하는 것을 확인하였으며, 도 1c에 나타낸 바와 같이 GSE 데이터베이스에서는 내강형 유방암 세포주에서 FBXO15의 발현이 높게 나타났으며, 이로부터 FBXO15는 내강형에서 발현이 높고 기저형에서 발현이 낮게 나타나는 것을 확인하였다.

다음으로, 상기와 같은 데이터베이스 결과를 직접적으로 확인하기 위해 유방암 환자 조직을 염색하고 FBXO15의 발현 정도를 분석한 결과, 도 1d에 나타낸 바와 같이 유방암 환자 조직에서도 TCGA 및 GSE 데이터베이스 결과와 같이 내강형 유방암 세포주에서 FBXO15 발현이 높고, 기저형 유방암 세포주에서 FBXO15 발현이 낮게 나타나는 것을 확인하였다.

다음으로, 카플란-마이어(Kaplan-Meier) 생존율 분석을 통해 FBXO15 발현과 유방암 환자의 생존율의 상관성을 확인한 결과, 도 1e에 나타낸 바와 같이 FBXO15의 발현은 환자의 생존율과 반비례한다는 것을 확인하였다.

실시예 3. FBXO15 발현에 따른 유방암세포의 침윤능 확인

FBXO15가 유방암 세포의 EMT 및 전이에 영향을 미치는지 확인하기 위하여, 내강형 유방암 세포(MCF7)에 si-RNA (Sense: 5'-CGUGAAUUCUCUACUCAAAUU-3'(서열번호3), Antisense: 5'-UUUGAGUAGAGAAUUCACGUU-3')(서열번호 4)를 이용하여 FBXO15를 억제시키고 Boyden chamber assay를 통해 침윤능을 확인한 결과, 도 2a에 나타낸 바와 같이 FBXO15가 억제된 si-FBXO15의 경우 침윤능이 증가되는 것을 확인하였다.

다음으로, si-RNA를 이용하여 FBXO15를 억제시킨 세포에서 EMT와 관련된 FN, VIM, ZEB1가 mRNA 및 단백질 수준에서 변화를 나타내는지 확인한 결과, 도 2b 및 2c에 나타낸 바와 같이 대조군(si-Cont)에 비해 si-RNA를 이용하여 FBXO15를 억제시킨 세포(si-FBXO15)에서 EMT 마커 및 조절인자가 모두 증가한 것을 확인할 수 있었다.

다음으로, 상기 in vitro 실험결과를 보다 명확히 하기 위해 도 2d에 나타낸 개략도와 같이 이종이식 마우스를 이용하여 in vivo에서 LM-1(lung meta-MDAMB231) 세포에 서열번호 5에 표기된 FBXO15 과발현 벡터를 사용하여 FBXO15를 과발현화시킨 cell line을 만든 후, 이를 쥐의 fat pad에 주입하고 전이 경과를 분석하였다. 그 결과, 도 2e 및 2f에 나타낸 바와 같이 대조군(LM1-Cont)에 비해 FBXO15를 과발현한 경우(LM1-FBXO15) 폐로의 전이가 감소되는 것을 확인하였다.

실시예 4. FBXO15 발현에 따른 유방암 세포의 줄기세포능 확인

FBXO15와 암 줄기세포가 연관성이 있는지 확인하기 위해 내강형 유방암 세포(MCF7)에 si-RNA를 이용하여 FBXO15를 억제시키고 구체(sphere) 크기의 증가를 확인한 결과, 도 3a에 나타낸 바와 같이 구체의 사이즈가 증가되는 것을 확인하였다.

이에 더하여, 기저형 유방암 세포인 MDA-MB-231 세포에 FBXO15를 과발현한 후 줄기세포능을 조절하는 주요인자인 SOX2, OCT4 및 NANOG의 mRNA 및 단백질 발현 수준을 확인한 결과, 도 3b 및 3c에 나타낸 바와 같이 SOX2의 mRNA 수준은 변함이 없었지만 단백질 양만이 조절되었으며, 이로부터 단백질 수준에서 SOX2가 조절된다는 것을 알 수 있으며, SOX2의 조절이 FBXO15와 직접적인 연관성이 있을 수 있다는 것을 확인하였다.

실시예 5. FBXO15 및 SOX2 결합에 따른 유비퀴틴화 및 분해 유도 활성 확인

SOX2 및 FBXO15의 연관성을 확인하기 위해 IP를 진행하였다. 먼저 HEK293T 세포에 SOX2 및 FBXO15를 과발현시킨 결과 도 4a 및 4b에 나타낸 바와 같이 두 단백질이 결합하는 것을 확인하였다.

이에 더하여, MDA-MB-231 세포에 FBXO15를 과발현시킨 후 Cycloheximide(CHX)를 처리하여 SOX2 단백질의 안정화를 확인한 결과, 도 4c에 나타낸 바와 같이 FBXO15를 과발현한 그룹에서 SOX2 단백질의 분해가 더 빨리 수행되는 것을 확인하였다.

나아가, HEK293T 세포에 SOX 및 FBXO15를 과발현시킨 후 유비퀴틴화 분석(ubiquitination assay)을 진행한 결과 도 4d에 나타낸 바와 같이 두 단백질을 과발현시킨 그룹에서 유비퀴틴화가 증가함을 알 수 있었으며, MDA-MB-231 세포에 FBXO15 및 SOX2의 과발현에 따른 EMT 마커의 발현 변화를 분석한 결과, 도 4e에 나타낸 바와 같이 FBXO15만을 과발현 하였을 때 감소하던 EMT 마커가 FBXO15 및 SOX2를 함께 과발현시킨 경우에는 다시 발현이 증가되는 것을 확인하였다.

상기 결과들로부터 도 4f에 나타낸 개략도와 같이 FBXO15는 SOX2를 단백질 수준에서 직접적으로 분해를 유도해 억제함으로써 암 줄기세포능 및 암 전이능을 감소시키는 것을 확인할 수 있었다.

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

<110> IUCF-HYU (Industry-University Cooperation Foundation Hanyang University) <120> Biomarker for diagnosis or prognosis prediction of metastatic breast cancer and use thereof <130> PD20-104 <160> 5 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1305 <212> DNA <213> FBXO15 <400> 1 atgccttcag aaatcttgct gaagatattt tcctacttgg atgctgtgag ccttctgtgt 60 actggatgtg tgagcaggcg cttttatcat ctagccaatg acaattttat ttggatcgga 120 atctactcaa ctgctttttc acctgcaaga tcaaattgga aatttaattc agtagagaag 180 atagctatgt ctatgagctt tctgtcagtt caggataaag aagctggtta ttggaagaaa 240 gaatatatca caaaacaaat agcatctgta aaagccgcac tagctgacat tctcaaacct 300 gtcaaccctt acacaggcct tccagttaag accaaagagg ccctcagaat atttggttta 360 ggttgggcaa ttatactgaa agaaaaaggt ggaaaagaat atatcatgga gcatgttgat 420 ctttccataa atgacacatc agttactgtt atatggtatg gcaaaaaatg gccatgccta 480 gcatcattgt caaccttaga tttatgtggc atgacaccag tttttaccga ctggtataaa 540 actcccacca aacatagact ccgatggcat tctttaattg caaagtacaa tctgagtcat 600 ttgaccatat ctaccatgat 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His His Leu Val Glu Arg Ser Thr Leu Gly Ser Ala Thr Ile 245 250 255 Pro Tyr Glu Leu Pro Pro His Ser Pro Phe Leu Asp Asp Ser Pro Glu 260 265 270 Tyr Gly Leu His Gly Tyr Gln Leu His Val Asp Leu His Ser Gly Gly 275 280 285 Val Phe Tyr Leu Cys Gly Thr Phe Arg Asn Leu Phe Thr Lys Arg Gly 290 295 300 Asn Ile Glu Asn Gly His Val Lys Leu Ile Val Ile His Leu Lys Asn 305 310 315 320 Asn Arg Glu His Leu Pro Leu Ile Gly Lys Val Gly Leu Ser Trp Lys 325 330 335 Thr Asp Ile Phe Asp Gly Cys Ile Lys Ser Cys Ser Met Met Asp Val 340 345 350 Thr Leu Leu Asp Glu His Gly Lys Pro Phe Trp Cys Phe Ser Ser Pro 355 360 365 Val Cys Leu Arg Ser Pro Ala Thr Pro Ser Asp Ser Ser Ser Phe Leu 370 375 380 Gly Gln Thr Tyr Asn Val Asp Tyr Val Asp Ala Glu Gly Arg Val His 385 390 395 400 Val Glu Leu Val Trp Ile Arg Glu Thr Glu Glu Tyr Leu Ile Val Asn 405 410 415 Leu Val Leu Tyr Leu Ser Ile Ala Lys Ile Asn His Trp Phe Gly Thr 420 425 430 Glu Tyr <210> 3 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> si-RNA 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Claims (12)

1. FBXO15 유전자 또는 상기 유전자가 암호화하는 단백질을 유효성분으로 포함하는, 전이성 유방암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
2. 청구항 1에 있어서, 상기 약학적 조성물은 유방암 세포의 이동(migration) 및 침습(invasion)능을 억제하거나, 또는 유방암 줄기세포의 줄기세포능을 억제하는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
3. 청구항 1에 있어서, 상기 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 더 포함하는, 약학적 조성물.
4. 청구항 3에 있어서, 상기 약학적으로 허용 가능한 담체는 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 사이클로덱스트린, 덱스트로즈 용액, 말토덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 리포좀으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인, 약학적 조성물.
5. 청구항 1에 있어서, 상기 조성물은 단백질 수준에서 SOX2 분해를 유도하는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
6. 하기의 단계를 포함하는, 전이성 유방암 치료제 스크리닝 방법:
   In vitro 상에서 세포에 후보물질을 처리하는 단계;
   상기 세포의 FBXO15 및 SOX2의 결합수준을 측정하는 단계; 및
   후보물질 비처리군에 비해 FBXO15 및 SOX2의 결합수준을 증가시키는 물질을 선별하는 단계.
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