KR101918515B1 - 유방암의 예후 진단 및 치료를 위한 fbxo41의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 유방암의 예후 진단 및 치료를 위한 FBXO41의 용도에 관한 것이다. 본 발명에 따르면, Luminal type 및 Basal type 유방암간 FBXO41 발현 양상은 유의적인 차이를 나타내었으며, 상기 FBXO41은 유방암 세포의 이주능, 침윤성, 및 전이성과 직접적인 상관 관계에 있음을 확인할 수 있었다. 따라서, 본 발명에 따른 FBXO41은 유방암의 예후를 보다 정확히 예측 가능하게 할 뿐만 아니라, 종양억제인자로서 유방암의 치료를 위한 핵심 인자로 이용될 수 있을 것이다.

Description

유방암의 예후 진단 및 치료를 위한 FBXO41의 용도 {Use of FBXO41 for the prognosis and treatment of breast cancer}

본 발명은 유방암의 예후 진단 및 치료를 위한 FBXO41의 용도에 관한 것이다.

유방암은 2012년 발표된 중앙 암 등록 본부 통계에 따르면, 2010년 대한민국에서 총 14,277 건이 발생되었으며, 전체 암 발생의 7.1%(6위)를 차지하는 수위의 암 중 하나이다. 또한, 여성에서 유방암의 발생 건수는 연 14,208 건으로 여성암 중에서는 2위를 차지하고 있으며, 유방암의 발생 연령대는 40대가 36.2%로 가장 많고, 50대가 28.4%, 60대가 13.7%의 순으로 나타났다. 유방암의 5년 생존률은 0기 암의 경우 100%에 가까우나 4기의 경우 20% 미만에 불과하여, 유방암의 진단 시점 및 그 성격에 따라 다양한 경과를 보인다. 유방암 환자의 40%는 초기에 뼈 전이가 일어나며, 뼈 전이가 일어난 환자의 15%는 병적인 골절이 생긴다. 뼈 전이 또는 척추 전이로 신경학적 이상이 일어나는 경우 심한 통증을 수반하기 때문에 환자들의 삶의 질이 크게 떨어지게 된다.

한편, 유방암은 자가 진단이 가능하고 자가 진단의 중요성이 많이 홍보되면서 초기에 발견되는 경우가 많다. 이러한 초기 유방암 환자들에 대해 수술 후 항암치료의 여부를 결정하기 어려웠다. 병리학적 관찰로 대략적인 예후를 예측할 수 있으나, 관찰 결과에 대한 표준화와 정량화가 어렵고, 예후 예측에 대한 신뢰성이 낮아, 실제 임상에서는 대부분의 초기 유방암 환자에게 항암 치료를 권하고 있다. 항암 치료의 특성상 환자가 겪는 고통이 매우 크고 경제적 지출이 요구되는데, 초기 유방암의 경우, 항암 치료가 필요하지 않은 환자가 절반 이상일 것으로 추측된다. 따라서, 초기 유방암의 특성을 분석하여 환자의 예후를 예측하여 불필요한 항암 치료를 줄인다면, 환자의 삶의 질에 큰 도움이 될 것이다. 마이크로어레이를 이용하여 유방암에 대한 수만 개의 유전자 발현량에 대한 정보를 한 번에 얻을 수 있게 되면서, 분자 수준에서 유방암을 분류하고, 암의 발생과 발달에 대한 메커니즘을 밝히고자 하는 연구가 활발하게 수행되고 있다. 초기 유방암 환자의 예후를 예측하는 것은 임상에서 중요한 일이고, 마이크로어레이를 이용하여 예후를 예측하는 유전자를 발굴하는 일은 이미 2000년대 초부터 시작되었다. 마이크로어레이를 이용한 연구가 고비용임에도 불구하고, 상당한 수의 유방암 조직에 대한 발현 profiles이 생산되었고, 연구자들에게 공개되어왔다. 2002년, 78명의 초기유방암 조직과 10여년 동안 추적된 환자의 생존 정보를 분석하여 70개의 예후 예측 유전자가 발굴된 것을 시작으로 하여, 이후 십여 가지의 예후 예측 유전자들이 발표되었고, 그 중 몇 개의 유전자는 이미 상용화되어 임상에서 활용되고 있다.

이러한 배경 하에서, 유방암의 예후 진단을 위한 제품으로 mammaprint (Agendia)와 Oncotype DX(genomic health)가 임상에서 활용되고, 이와 관련 연구가 활발히 진행 중에 있으나 (한국등록특허 제10-0786759호), 아직은 미비한 실정이다.

본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로서, 본 발명자들은, 유방암의 예후 예측의 신뢰성을 향상시키고, 상기 결과에 기반한 환자 맞춤형 치료를 위하여 예의 노력한 결과, FBXO41의 발현 양상과 유방암의 진행간 높은 관련성을 확인하고, 이에 기초하여 본 발명을 완성하게 되었다.

이에, 본 발명의 목적은, FBXO41 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자를 이용한 유방암의 예후 진단용 조성물을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 조성물을 유방암 환자로부터 분리된 시료에 처리하는 단계를 포함하는, 유방암의 예후 진단을 위한 정보제공방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 FBXO41 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자를 이용한 유방암의 예방 또는 치료용 의약의 스크리닝 방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 FBXO41 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자를 유효성분으로 포함하는, 유방암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는데 있다.

그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 FBXO41 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 수준을 측정하기 위한 프로브를 포함하는, 유방암의 예후 진단용 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 구현 예로서, 상기 FBXO41 단백질의 수준을 측정하기 위한 프로브는, 상기 단백질에 대한 항체일 수 있다.

본 발명의 다른 구현 예로서, 상기 FBXO41 유전자의 수준을 측정하기 위한 프로브는, 상기 유전자에 대한 핵산 프로브 또는 프라이머일 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 조성물을 유방암 환자로부터 분리된 시료에 처리하는 단계를 포함하며, 상기 분리된 시료 내 FBXO41 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자 수준이 대조군에 비해 낮은 경우, 예후가 좋지 않은 것으로 판정하는 것을 특징으로 하는, 유방암의 예후 진단을 위한 정보제공방법을 제공한다.

본 발명의 일 구현 예로서, 상기 시료는 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 뇨, 객담, 림프액, 세포, 및 이들의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다.

또한, 본 발명은 체외(in vitro)에서, FBXO41 단백질을 발현하는 세포와 후보물질을 함께 배양시키고, 상기 세포에서 FBXO41 단백질의 발현을 측정하는 단계를 포함하며, 상기 후보물질이 FBXO41 단백질의 발현을 상향 조절할 때, 유방암 예방 또는 치료용 의약으로 판별하는 것을 특징으로 하는, 유방암의 예방 또는 치료용 의약의 스크리닝 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 FBXO41 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자를 유효성분으로 포함하는, 유방암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 구현예로서, 상기 조성물은, 항암제 또는 방사선과 병용투여될 수 있다.

본 발명의 다른 구현예로서, 상기 조성물은, Snail, Slug, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 인자를 하향 조절할 수 있다.

또한, 본 발명은 유방암의 예후 진단 및 치료를 위한 FBXO41 유전자의 신규한 의약적 용도를 제공한다.

본 발명에 따르면, Luminal type 및 Basal type 유방암간 FBXO41 발현 양상은 유의적인 차이를 나타내었으며, 상기 FBXO41은 유방암 세포의 이주능, 침윤성, 및 전이성과 직접적인 상관 관계에 있음을 확인할 수 있었다. 따라서, 본 발명에 따른 FBXO41은 유방암의 예후를 보다 정확히 예측가능하게 할 뿐만 아니라, 종양억제인자로서 유방암의 치료를 위한 핵심 인자로 이용될 수 있을 것이다.

도 1은, 유방암의 생물학적 아형간 (Luminal type, Basal type, Triple negative type 등) FBXO41의 발현 양상을 GOBO database로 비교한 결과이다.
도 2는, 유방암의 세포주별 FBXO41의 발현 양상을 (a) GOBO database, (b) conventional PCR, 및 (c) 실시간 PCR로 확인한 결과이다.
도 3은, FBXO41의 발현과 유방암 환자의 생존율간 관련성을 Kaplan meier survival을 실시하여 확인한 결과이다.
도 4는, FBXO41의 발현 양상에 따른 유방암 세포의 이주능 및 침윤성의 변화를 invasion/migration assay를 실시하여 확인한 결과이다.
도 5는, FBXO41의 발현 양상에 따른 유방암 세포 내 상피간엽 표지인자 (E-cadherin) 및 중배엽 표지인자(Fibronectin, Vimentin)의 변화를 웨스턴 블랏 및 PCR로 확인한 결과이다.
도 6은, FBXO41의 발현 양상에 따른 유방암 세포 내 상피간엽 표지인자 (E-cadherin) 및 중배엽 표지인자(Fibronectin, Vimentin)의 변화를 면역형광염색을 이용하여 확인한 결과이다.
도 7은, FBXO41의 발현 양상에 따른 유방암 세포 내 상피간엽이행 조절인자 (Zeb1, Twist, Snail, Slug)의 변화를 웨스턴 블랏으로 확인한 결과이다.
도 8은, FBXO41의 발현 양상에 따른 유방암 세포 내 상피간엽이행 조절인자 (Zeb1, Twist, Snail, Slug)의 변화를 PCR로 확인한 결과이다.
도 9는, FBXO41의 발현 양상에 따른 유방암 세포 내 상피간엽이행 조절인자 (Snail, Slug)의 변화를 면역형광염색을 이용하여 확인한 결과이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명하기로 한다.

본 발명은 FBXO41 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 수준을 측정하기 위한 프로브를 포함하는, 유방암의 예후 진단용 조성물; 및 유방암의 예후 진단을 위한 FBXO41 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 용도를 제공한다.

본 발명에서 사용되는 용어, "예후"는 암의 조직 내 이주 및 침윤, 다른 조직으로의 전이, 및 질병에 기인한 사망 등의 병의 경과 및 완치 여부를 의미한다. 본 발명의 목적상 예후는 유방암 환자의 병의 경과 또는 생존 예후를 의미한다. 본 발명의 상기 방법을 이용하면, 유방암에 따른 생존 예후를 손쉽게 판단할 수 있어, 추가적인 치료 방법의 사용 여부를 손쉽게 결정할 수 있다. 궁극적으로 유방암 발병 후의 생존율을 향상시킬 수 있다.

본 발명에서, "FBXO41"은 E3 접합유전자 중 하나로서, E3 접합유전자는 HECT, RING finger로 분류된다. 이 중에서도 가장 활발히 연구되고 있는 SCF 복합체는 기질과 접합하는 F box 단백질을 가지고 있다. 현재까지 보고된 F box 단백질은 약 70여 가지가 있으며, 어느 F box를 포함하는지에 따라 E3 접합유전자의 역할이 결정된다. 한편, 본 발명에서 개시하고 있는, 유방암의 예후 예측 유전자로서 FBXO41의 기능에 대해서는 전혀 보고되어 있지 않다.

본 발명에서, 상기 FBXO41 단백질의 발현을 측정하기 위한 프로브는 바람직하게 FBXO41 단백질과 특이적으로 결합하는 항체일 수 있고, 상기 FBXO41 유전자의 수준을 측정하기 위한 프로브는 바람직하게 FBXO41 유전자와 특이적으로 결합하는 핵산 프로브 또는 프라이머일 수 있으나, FBXO41 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현을 직접 또는 간접적으로 측정할 수 있는 물질이라면, 제한없이 포함될 수 있다.

상기 FBXO41 단백질을 코딩하는 유전자는 바람직하게, FBXO41 아미노산을 코딩할 수 있는 모든 종류의 염기서열을 포함할 수 있고, 가장 바람직하게, 서열번호 1로 표시되는 염기서열로 이루어질 수 있으며, 상기 서열번호 1로 표시되는 염기서열과 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기서열을 포함할 수 있다.

상기 항체는 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체, 인간항체 및 인간화 항체, 또는 이들의 단편을 사용할 수 있다. 또한 상기 항체 단편은 Fab, Fab', F(ab')2 및 Fv 단편; 디아바디 (diabody); 선형 항체; 단일쇄 항체 분자; 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이성 항체 등을 포함할 수 있다.

상기 핵산 프로브는 자연의 또는 변형된 모노머 또는 연쇄 (linkages)의 선형 올리고머를 의미하며, 디옥시리보뉴클레오타이드 및 리보뉴클레오타이드를 포함하고 타켓 뉴클레오타이드 서열에 특이적으로 혼성화할 수 있으며, 자연적으로 존재하거나 또는 인위적으로 합성된 것을 말한다. 본 발명에 따른 프로브는 단일쇄일 수 있으며, 바람직하게는 올리고디옥시리보뉴클레오티드일 수 있다. 본 발명의 프로브는 자연 dNMP (즉, dAMP, dGMP, dCMP 및 dTMP), 뉴클레오타이드 유사체 또는 유도체를 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 프로브는 리보뉴클레오타이드도 포함할 수 있다. 예컨대, 본 발명의 프로브는 골격 변형된 뉴클레오타이드, 예컨대, 펩타이드 핵산 (PNA), 포스포로티오에이트 DNA, 포스포로디티오에이트 DNA, 포스포로아미데이트 DNA, 아마이드-연결된 DNA, MMI-연결된 DNA, 2'-O-메틸 RNA, 알파-DNA 및 메틸포스포네이트 DNA, 당 변형된 뉴클레오타이드 예컨대, 2'-O-메틸 RNA, 2'-플루오로 RNA, 2'-아미노 RNA, 2'-O- 알킬 DNA, 2'-O-알릴 DNA, 2'-O-알카이닐 DNA, 헥소스 DNA, 피라노실 RNA 및 안히드로헥시톨 DNA, 및 염기 변형을 갖는 뉴클레오타이드 예컨대, C-5 치환된 피리미딘 (치환기는 플루오로-, 브로모-, 클로로-, 아이오도-, 메틸-, 에틸-, 비닐-, 포르밀-, 에티틸-, 프로피닐-, 알카이닐-, 티아조릴-, 이미다조릴-, 피리딜- 포함), C-7 치환기를 갖는 7-데아자퓨린 (치환기는 플루오로-, 브로모-, 클로로-, 이오도-, 메틸-, 에틸-, 비닐-, 포르밀-, 알카이닐-, 알켄일-, 티아조릴-, 이미다조릴-, 피리딜-), 이노신 및 디아미노퓨린을 포함할 수 있다.

상기 프라이머는 적합한 온도 및 적합한 완충액 내에서 적합한 조건 (즉, 4종의 다른 뉴클레오시드 트리포스페이트 및 중합반응 효소) 하에서 주형-지시 DNA 합성의 개시점으로 작용할 수 있는 단일-가닥 올리고뉴클레오타이드를 의미한다. 프라이머의 적합한 길이는 다양한 요소, 예컨대, 온도와 프라이머의 용도에 따라 변화가 있을 수 있다. 또한, 프라이머의 서열은 주형의 일부 서열과 완전하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, 주형과 혼성화되어 프라이머 고유의 작용을 할 수 있는 범위 내에서의 충분한 상보성을 가지면 충분하다. 따라서 본 발명에서의 프라이머는 주형인 유전자의 뉴클레오타이드 서열에 완벽하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, 이 유전자 서열에 혼성화되어 프라이머 작용을 할 수 있는 범위 내에서 충분한 상보성을 가지면 충분하다. 또한, 본 발명에 따른 프라이머는 유전자 증폭 반응에 이용될 수 있는 것이 좋다. 상기 증폭 반응은 핵산 분자를 증폭하는 반응을 말하며, 이러한 유전자의 증폭 반응들에 대해서는 당업계에 잘 알려져 있고, 예컨대, 중합효소 연쇄반응 (PCR), 역전사 중합효소 연쇄반응 (RT-PCR), 리가아제 연쇄반응 (LCR), 전자 중재 증폭 (TMA), 핵산 염기서열 기판 증폭 (NASBA) 등이 포함될 수 있다.

본 발명에 따른 유방암의 예후 진단용 조성물은 키트 형태로 마련될 수 있다.

상기 키트는 FBXO41 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현을 측정할 수 있는 항체, 프로브 또는 프라이머 등을 포함할 수 있고, 이들의 정의는 상술한 바와 같다. 상기 키트가 PCR 증폭 과정에 적용되는 경우 선택적으로, PCR 증폭에 필요한 시약, 예컨대, 완충액, DNA 중합효소 (예컨대, Thermus aquaticus (Taq), Thermus thermophilus (Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis 또는 Pyrococcus furiosus (Pfu)로부터 수득한 열 안정성 DNA 중합효소), DNA 중합효소 보조인자 및 dNTPs를 포함할 수 있으며, 상기 키트가 면역 분석에 적용되는 경우, 본 발명의 키트는 선택적으로, 이차 항체 및 표지의 기질을 포함할 수 있다. 나아가, 본 발명에 따른 키트는 상기한 시약 성분을 포함하는 다수의 별도 패키징 또는 컴파트먼트로 제작될 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 유방암의 예후 진단용 조성물은 마이크로어레이의 형태로 마련될 수 있다.

본 발명의 마이크로어레이에 있어서, 상기 FBXO41 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현을 측정할 수 있는 항체, 프로브 또는 프라이머 등은 혼성화 어레이 요소 (hybridizable array element)로서 이용되며, 기질 (substrate) 상에 고정화된다. 바람직한 기질은 적합한 견고성 또는 반-견고성 지지체로서, 예컨대, 막, 필터, 칩, 슬라이드, 웨이퍼, 파이버, 자기성 비드 또는 비자기성 비드, 겔, 튜빙, 플레이트, 고분자, 미소입자 및 모세관을 포함할 수 있다. 상기 혼성화 어레이 요소는 상기 기질 상에 배열되고 고정화되며, 이와 같은 고정화는 화학적 결합 방법 또는 UV와 같은 공유 결합적 방법에 의해 수행될 수 있다. 예를 들어, 상기 혼성화 어레이 요소는 에폭시 화합물 또는 알데히드기를 포함하도록 변형된 글래스 표면에 결합될 수 있고, 또한 폴리라이신 코팅 표면에서 UV에 의해 결합될 수 있다. 또한, 상기 혼성화 어레이 요소는 링커 (예: 에틸렌 글리콜 올리고머 및 디아민)를 통해 기질에 결합될 수 있다.

한편, 본 발명의 마이크로어레이에 적용되는 시료가 핵산일 경우에는 표지될 수 있고, 마이크로어레이 상의 어레이 요소와 혼성화 될 수 있다. 혼성화 조건은 다양할 수 있으며, 혼성화 정도의 검출 및 분석은 표지 물질에 따라 다양하게 실시될 수 있다.

본 발명의 다른 양태로서, 전술한 조성물을 유방암 환자로부터 분리된 시료에 처리하는 단계를 포함하며, 상기 분리된 시료 내 FBXO41 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자 수준이 대조군에 비해 낮은 경우, 예후가 좋지 않은 것으로 판정하는 것을 특징으로 하는, 유방암의 예후 진단을 위한 정보제공방법을 제공한다.

본 발명의 유방암의 예후 진단을 위한 정보제공방법은 전술한 유방암의 예후 진단용 조성물에서 기술한 바 있는 기술적 구성을 이용하기 때문에 이 둘 사이에 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.

상기 대조군은 유방암의 예후 진단과 관련하여, 시료 내 FBXO41 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 수준에 대한 기준점을 제시하며, 바람직하게, 정상 환자군 또는 Luminal type의 유방암 환자군일 수 있다.

상기 시료는 람직하게 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 뇨, 객담, 림프액, 또는 종양 조직 또는 세포일 수 있으며, 가장 바람직하게 유방암 조직으로부터 채취한 유방암 세포일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 FBXO41 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자를 유효성분으로 포함하는, 유방암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물; 유방암의 예방 또는 치료를 위한 FBXO41 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 용도; 및 치료상 유효량의 상기 조성물을 개체에게 투여하는 것을 포함하는 유방암의 치료방법을 제공한다

본 발명에서 사용되는 용어, "예방"은 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 유방암을 억제시키거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미한다.

본 발명에서 사용되는 용어, "치료"는 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 유방암에 대한 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다. 보다 구체적으로, 본 발명에 따른 조성물은 상피간엽이행 조절인자인 Snail 및 Slug을 타겟으로하여, 유방암의 이주능, 침윤성, 및 전이성을 억제시킬 수 있다.

본 발명에서, "개체"는 염증성 질환 치료를 필요로 하는 대상을 의미하며, 보다 구체적으로 인간 또는 비-인간인 영장류, 생쥐 (mouse), 개, 고양이, 말 및 소 등의 포유류를 의미한다.

본 발명에 따른 유방암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물은 천연형 또는 재조합 FBXO41, 이들과 실질적으로 동등한 생리 활성을 갖는 FBXO41 단백질을 포함할 수 있다. 상기 실질적으로 동등한 생리 활성을 갖는 단백질에는 천연형/재조합 FBXO41과 그 기능적 동등물 (functional equivalent) 및 기능적 유도체 (functional derivative)가 포함된다.

상기 "기능적 동등물"에는 천연형 단백질의 아미노산 중 일부 또는 전부가 치환되거나, 아미노산의 일부가 결실 또는 부가된 아미노산 서열 변형체로서 천연형 FBXO41와 실질적으로 동등한 생리활성을 갖는 것을 말한다. "기능적 유도체"는 상기 FBXO41 단백질의 물리 화학적 성질을 증가 또는 감소시키기 위한 변형을 가한 단백질로서 천연형 FBXO41과 실질적으로 동등한 생리 활성을 갖는 것을 의미한다. 본 발명의 FBXO41 단백질의 유래는 특별히 제한되지 않으나, 바람직하게는 척추동물, 바람직하게는 인간, 생쥐, 랫트 등으로부터 기원하는 단백질일 수 있다.

일 구체예에 따르면, 본 발명에 사용된 FBXO41은 공지의 서열로부터 당업자에 공지된 유전공학적 방법으로 제조할 수 있다.

천연형의 FBXO41을 유전자 재조합 방법에 의하여 단백질을 제조하는 경우 대장균 (E. coli)이나 곤충 세포를 이용하는 것보다 포유동물 세포를 이용하는 경우가 단백질의 활성도나 용해성 측면에서 천연형의 것과 유사할 것으로 여겨진다.

상기 재조합 FBXO41 단백질은 통상의 컬럼 크로마토그라피 방법 등을 이용하여 분리할 수 있다. 또한 단백질의 정제 정도는 소듐 도데실 술페이트-폴리아크릴아마이드 젤 전기영동 (SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE))등으로 확인할 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 유효 성분 이외에 약제학적으로 적합하고 생리학적으로 허용되는 첨가제를 사용하여 제조될 수 있으며, 상기 첨가제로는 부형제, 붕해제, 감미제, 결합제, 피복제, 팽창제, 윤활제, 활택제 또는 향미제 등의 가용화제를 사용할 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 투여를 위해서 유효 성분 이외에 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 의약 조성물로 바람직하게 제제화할 수 있다.

액상 용액으로 제제화되는 조성물에 있어서 허용 가능한 약제학적 담체로는, 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 더 나아가 해당분야의 적절한 방법으로 Remington's Pharmaceutical Science, Mack Publishing Company, Easton PA에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물의 약제 제제 형태는 과립제, 산제, 피복정, 정제, 캡슐제, 좌제, 시럽, 즙, 현탁제, 유제, 점적제 또는 주사 가능한 액제 및 활성 화합물의 서방출형 제제 등이 될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 정맥내, 동맥내, 복강내, 근육내, 복강내, 흉골내, 경피, 비측내, 흡입, 국소, 직장, 경구, 안구내 또는 피내 경로를 통해 통상적인 방식으로 투여할 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물에 따른 유효성분의 유효량은 유방암의 예방 또는 치료 효과를 달성하는데 요구되는 양을 의미한다. 따라서, 질환의 종류, 질환의 중증도, 조성물에 함유된 유효 성분 및 다른 성분의 종류 및 함량, 제형의 종류 및 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자에 따라 조절될 수 있다. 이에 제한되는 것은 아니나, 예컨대, 성인의 경우, 1일 1회 내지 수회 투여시, 폴리펩타이드, 단백질일 경우 0.1ng/kg~10g/kg 용량으로 투여할 수 있다.

본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 체외(in vitro)에서, FBXO41 단백질을 발현하는 세포와 후보물질을 함께 배양시키고, 상기 세포에서 FBXO41 단백질의 발현을 측정하는 단계를 포함하며, 상기 후보물질이 FBXO41 단백질의 발현을 상향 조절할 때, 유방암 예방 또는 치료용 의약으로 판별하는 것을 특징으로 하는, 유방암의 예방 또는 치료용 의약의 스크리닝 방법을 제공한다.

상기 후보물질은 통상적인 선정방식에 따라 FBXO41 단백질로의 전사 또는 번역을 촉진하는 물질, 또는 FBXO41 단백질 활성을 촉진하는 의약으로서의 가능성을 지닌 것으로 추정되거나 또는 무작위적으로 선정된 개별적인 핵산, 단백질, 펩타이드, 기타 추출물 또는 천연물, 화합물 등이 될 수 있다.

이후, 후보물질이 처리된 세포에서 상기 유전자의 발현양, 단백질의 양 또는 단백질의 활성을 측정할 수 있으며, 측정 결과, 상기 유전자의 발현양, 단백질의 양 또는 단백질의 활성이 증가되는 것이 측정되면 상기 후보물질은 유방암을 예방 또는 치료할 수 있는 물질로 판단할 수 있다.

상기에서 유전자의 발현양, 단백질의 양 또는 단백질의 활성을 측정하는 방법은 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 수행될 수 있는데, 예를 들면, 이에 제한되지는 않으나, 역전사 중합효소 연쇄반응 (reverse transcriptase-polymerase chain reaction), 실시간 중합효소 연쇄반응 (real time-polymerase chain reaction), 웨스턴 블럿, 노던 블럿, ELISA (enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석 (RIA: radioimmunoassay), 방사 면역 확산법 (radioimmunodiffusion) 및 면역침전분석법 (immunoprecipitation assay) 등을 이용하여 수행할 수 있다.

본 발명의 스크리닝 방법을 통해 얻은, FBXO41 단백질의 발현을 촉진시키거나 단백질의 기능을 향상시키는 후보물질이 유방암의 예방 또는 치료용 의약의 후보물질이 될 수 있다. 이와 같은 유방암의 예방 또는 치료용 의약의 후보물질은 이후의 유방암 치료제 개발과정에서 선도물질 (leading compound)로서 작용하게 되며, 선도물질이 FBXO41 단백질의 기능 촉진 효과를 나타낼 수 있도록 그 구조를 변형시키고 최적화함으로써, 새로운 유방암 치료제를 개발할 수 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

[ 실시예 ]

실시예 1. FBXO41의 발현과 유방암의 예후간 관련성 확인

유방암은, 임상적으로 좋은 예후를 보여주는 Luminal type (ER+/HER-), 상대적으로 좋지 않은 예후를 나타내는 Basal type (ER-/HER-), 가장 나쁜 예후를 지닌 Triple negative type (ER-/HER-/PR-) 등으로 분류될 수 있다. 본 실시예에서는, 상기와 같은 유방암의 생물학적 아형이 지닌 특성에 기반하여 FBXO41의 발현 양상과 유방암의 예후간 관련성을 구체적으로 확인하고자 하였다.

우선, GOBO database에 기초하여 FBXO41의 발현 양상을 비교한 결과, 도 1에 나타낸 바와 같이, Luminal type에 비해, 다른 기관으로의 전이 등을 수반하는 Basal type에서 FBXO41의 발현이 상대적으로 낮았으며 (도 1의 왼쪽), 가장 악성화된 상태로 알려져 있는 Triple negative type에서 FBXO41의 발현이 다른 type의 유방암 (HER, HR)들에 비해 낮게 관찰되었다 (도 2의 오른쪽). 또한, 유방암의 세포주별 FBXO41의 발현을 GOBO database (도 2의 (a)), conventional PCR (도 2의 (b)), 및 실시간 PCR (도 2의 (c))을 통해 확인한 결과, 도 1의 결과와 마찬가지로, HS578T, BT549, BT20,MDAMB231와 같은 Basal type의 유방암 세포주에서 FBXO41의 발현이 상대적으로 낮게 관찰되었다.

이와 더불어, FBXO41의 발현 양상과 유방암의 예후간 관련성을 임상적으로 확인하기 위하여, 본 실시예에서는 총 3951명의 유방암 환자를 대상으로, Kaplan meier survival 분석을 실시하였다. 그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, 총 3951명의 유방암 환자 중 상대적으로 FBXO41을 높게 발현하는 1969명의 환자의 생존율이 FBXO41을 낮게 발현하는 환자에 비해 유의적으로 높은 것을 확인할 수 있었다.

상기 결과들은, 유방암 세포 내 FBXO41 발현이 증가될수록 유방암의 예후가 향상됨을 의미하는 것으로, 이러한 FBXO41 발현의 경향성을 통해 유방암의 예후를 예측할 수 있고, 더 나아가 유방암의 치료를 위한 종양억제인자로 FBXO41가 활용될 수 있음을 알 수 있다.

실시예 2. FBXO41의 발현에 따른 유방암 세포의 변화

본 실시예에서는 FBXO41의 발현 변화가 유방암 세포의 특성 (이주능, 침윤성, 전이성)에 미치는 영향을 확인하고자 하였다.

실시예 2-1. 유방암 세포의 이주능 및 침윤성 변화

Luminal type인 SKBR3 세포에 FBXO41 siRNA를 처리하여 FBXO41의 발현을 인위적으로 감소시킨 반면, Basal type인 MDA-MB231 세포에 대해서는 FBXO41을 과발현시킨 뒤, invasion/migration assay를 실시하였다. 그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이, 유방암 세포의 type과 관계없이 FBXO41의 발현이 감소된 경우 암 세포의 이주능 및 침윤성이 증가되고, FBXO41의 발현이 증가된 경우 암 세포의 이주능 및 침윤성이 감소됨을 확인할 수 있었다.

실시예 2-2. 유방암 세포의 전이성 변화

우선, 상기와 마찬기지로, Luminal type인 MCF7 및 SKBR3 세포의 FBXO41 발현을 감소시키고, Basal type인 MDA-MB231 및 BT549 세포의 FBXO41 발현을 증가시킨 뒤, 상피간엽 표지인자인 E-cadherin과 중배엽성 표지인자인 Fibronectin과 Vimentin의 발현 양상을 확인하였다. 그 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이, 전자의 경우 E-cadherin은 감소되고 Fibronectin과 Vimentin은 증가되어 암세포의 전이가 촉진된 반면, 후자의 경우 FBXO41 발현 변화에 따라 상기와 상반된 결과를 보여주었다.

이와 함께, FBXO41이 저발현된 MCF7 세포, FBXO41이 과발현된 MDA-MB231 세포를 대상으로 면역형광 염색을 실시하여, 중배엽성 표지인자인 Fibronectin과 Vimentin의 발현 양상을 형광 현미경으로 관찰한 결과, 상기 결과와 마찬가지로, 도 6에 나타낸 바와 같이, FBXO41을 억제시켰을 때, E-cadherin의 감소, Vimentin 및 Fibronectin의 증가를 확인할 수 있었고, FBXO41을 증가시켰을 때, 이와 반대의 경향성을 보여주었다.

상기 결과들을 종합해 보면, FBXO41은 유방암의 예후와 밀접되어 있는 이주성, 침윤성, 및 전이성과 유의적인 관련성 (negative)을 나타내며, 이를 토대로 FBXO41은 유방암 세포에서 종양 억제인자로 작용함을 알 수 있었다.

실시예 3. FBXO41의 작용 기전 확인

본 실시예에서는 유방암 세포에서 FBXO41의 기능이 발휘되는 작용 기전을 확인하고자 하였다. 우선, Luminal type인 MCF7 및 SKBR3 세포의 FBXO41 발현을 감소시키고, Basal type인 MDA-MB231 및 BT549 세포의 FBXO41 발현을 증가시킨 뒤, 상피간엽이행 조절인자로 알려져 있는 Zeb1, Twist, Snail, Slug의 발현 양상을 웨스턴 블랏으로 확인하였다. 그 결과, 다양한 상피간엽이행 조절인자 중에서도, Snail 및 Slug이 FBXO41 발현에 민감하게 변화함을 확인할 수 있었으며, 상기 실시예 2-2의 결과와 마찬가지로, 이들은 FBXO4의 발현이 증가함에 따라 감소되었다.

아울러, FBXO41이 저발현된 MCF7 세포, FBXO41이 과발현된 MDA-MB231 세포를 대상으로 Snail, Slug의 발현 양상을 PCR 및 면역형광염색을 통해 각각 확인한 결과, 도 8 및 도 9에 나타낸 바와 같이, FBXO41의 발현과 Snail 및 Slug간 유의성을 재차 검증할 수 있었다.

상기 결과들을 종합해 보면, FBXO41은 상피간엽이행 조절인자인 Snail 및 Slug에 작용하여, 유방암의 임상적 증상의 진전에 직접적으로 관여함을 알 수 있었다.

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

<110> Industry-university Cooperation Foundation Hanyang University <120> Use of FBXO41 for the prognosis and treatment of breast cancer <130> P17U10C0591_P20170449OP <160> 1 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 2628 <212> DNA <213> Abedus herberti <400> 1 atggcctcgc tggacctgcc gtaccgctgc ccccgctgcg gggagcacaa gcgcttccgg 60 agcctgtcgt cgctgcgcgc gcacctggag tacagccaca cctacgagac gctctacatc 120 ctctccaaga ccaacagcat ctgcgacggc gccgccgccg ccgcggccgc cgccgccgct 180 gcctcggggt tcccgctggc tcccgagccc gccgccctgc tggccgtgcc cggcgcccgg 240 cgagaggtct tcgagagcac ttccttccag ggcaaggagc aggcggccgg gccgtcgccc 300 gcggcgccgc acctgctgca ccaccaccat caccacgctc ccctcgccca cttccccggc 360 gacctggtgc ccgctagcct gccctgtgag gagttggccg agccgggcct tgtgcccgcc 420 gcagcagcgc gctatgcgct gcgcgagatc gagatcccgc tgggggagct gttcgcccgc 480 aagtccgtgg cgtcctcggc gtgctcgacg ccgccgcctg gccccggccc cggcccttgc 540 cccgggcctg cctccgcttc gcccgcgtcc ccctcacccg ctgatgtggc ctacgaagag 600 ggcctggcgc gcctcaagat ccgcgcgctg gagaagctgg aggtggaccg gcggctggag 660 cggctgagcg aggaggtgga gcagaagatc gcgggccagg tgggccggct gcaggccgag 720 ctggagcgca aggcggccga actggagact gcgcggcagg agagtgcgag gctcgggcgc 780 gagaaggagg agctggagga gcgcgcgtct gagctctccc gccaggtgga cgtgagcgta 840 gagctgctgg cctcactcaa gcaggacctg gtgcacaagg aacaggagct gagccgcaag 900 cagcaggagg tggtgcagat cgaccagttc ctgaaggaga cggcggcgcg ggaggccagc 960 gccaagctgc ggctgcagca gttcattgag gagctccttg agcgggctga ccgtgccgag 1020 cggcagctgc aggtcatcag cagcagctgt ggcagcacgc ccagcgccag cctgggccgt 1080 ggaggtgggg gcggtggtgc tggacccaat gcccggggcc caggcagaat gcgagaacac 1140 cacgtgggcc cggccgtgcc taacacatat gcagtgtcac ggcatggctc ctctccgagc 1200 acaggggcct ccagccgtgt gccagccgca tcccagagct caggctgcta tgacagtgac 1260 agtctggagc tgcccaggcc agaggagggg gcccctgagg acagtggccc tgggggcttg 1320 ggcacacggg cccaggctgc caacgggggc tcagagcggt cccagccccc tcgcagctca 1380 ggcctgcggc gccaggccat ccagaactgg cagcgcagac cccgccgaca cagcactgag 1440 ggggaagagg gtgatgtctc cgacgttggc tcccgaacca ctgagtcaga ggctgagggc 1500 ccgttggatg cgccccgccc cgggcctgct atggctgggc cattgagcag ctgccggctc 1560 tcagcccgcc ccgagggagg cagtgggcgg ggtcggcgag cagagagggt cagcccctca 1620 cgctccaatg aggtcatcag cccagagatc ctgaagatgc gagctgccct cttctgcatc 1680 ttcacctacc tggacacgcg cacactgctg catgctgccg aggtctgccg ggactggcgc 1740 ttcgtggccc gccaccccgc agtctggaca agggtgctgc ttgagaatgc ccgtgtctgc 1800 tccaagttcc tggcaatgct ggctcagtgg tgcacccagg cccactctct gacgctgcag 1860 aacttgaagc cccggcagcg gggaaagaag gagagcaagg aggagtatgc ccggagcacc 1920 cggggctgcc tggaagctgg gctggagtcc ctgctgaagg cagctggggg gaacctgctg 1980 atcctgcgca tctcccactg tccaaacatc ctcaccgacc gctcgctctg gctggccagc 2040 tgctactgcc gtgccctgca ggctgtcacg tacaggagtg ccacagaccc cgtgggccat 2100 gaggtcattt gggccctggg cgcaggctgc agagagatcg tctccctcca agtggcacca 2160 cttcacccct gccagcagcc cacacgcttc agtaaccgct gcctgcagat gattggtcgc 2220 tgttggcccc acctgcgggc cctgggggtc gggggtgccg gctgtggggt gcagggcctg 2280 gcatcactcg cgagaaactg catgcggctg caggtcctgg agcttgacca cgtgtcagag 2340 atcacccagg aggtggcagc agaggtctgc cgggaaggcc tgaagggact ggagatgctg 2400 gtgctcacgg cgactcccgt cacccctaag gccctactgc acttcaacag catctgccgg 2460 aacctcaagt ccattgtggt ccagattggg attgcggatt atttcaaaga gcccagcagc 2520 cctgaggccc agaagctgtt tgaggacatg gtgacaaaac tccaggctct gcgacggagg 2580 cccggcttct ctaagattct gcacatcaag gtggaaggcg gctgctaa 2628

Claims (9)

1. FBXO41 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 수준을 측정하기 위한 프로브를 포함하는, 유방암의 예후 진단용 조성물.
   
2. 제1항에 있어서,
   상기 FBXO41 단백질의 수준을 측정하기 위한 프로브는, 상기 단백질에 대한 항체인 것인, 유방암의 예후 진단용 조성물.
   
3. 제1항에 있어서,
   상기 FBXO41 유전자의 수준을 측정하기 위한 프로브는, 상기 유전자에 대한 핵산 프로브 또는 프라이머인 것인, 유방암의 예후 진단용 조성물.
   
4. 제1항 내지 제3항 중 어느 하나의 조성물을 유방암 환자로부터 분리된 시료에 처리하는 단계를 포함하며,
   상기 분리된 시료 내 FBXO41 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자 수준이 대조군에 비해 낮은 경우, 예후가 좋지 않은 것으로 판정하는 것을 특징으로 하는, 유방암의 예후 진단을 위한 정보제공방법.
   
5. 제4항에 있어서,
   상기 시료는, 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 뇨, 객담, 림프액, 세포, 및 이들의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것인, 유방암의 예후 진단을 위한 정보제공방법.
   
6. 체외(in vitro)에서, FBXO41 단백질을 발현하는 세포와 후보물질을 함께 배양시키고, 상기 세포에서 FBXO41 단백질의 발현을 측정하는 단계를 포함하며,
   상기 후보물질이 FBXO41 단백질의 발현을 상향 조절할 때, 유방암 예방 또는 치료용 의약으로 판별하는 것을 특징으로 하는, 유방암의 예방 또는 치료용 의약의 스크리닝 방법.
   
7. FBXO41 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자를 유효성분으로 포함하는, 유방암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
   
8. 제7항에 있어서,
   상기 조성물은, 항암제 또는 방사선과 병용투여되는 것인, 유방암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
   
9. 제7항에 있어서,
   상기 조성물은, Snail, Slug, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 인자를 하향 조절하는 것인, 유방암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.

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