JP6551967B2

JP6551967B2 - 肝細胞がんの転移性再発リスクの予測方法

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Publication number: JP6551967B2
Application number: JP2015016586A
Authority: JP
Inventors: 正朗岡; 彰一硲; 亮一恒富
Original assignee: NATIONAL UNIVERSITY CORPORATION YAMAGUCHI UNIVERSITY
Current assignee: NATIONAL UNIVERSITY CORPORATION YAMAGUCHI UNIVERSITY
Priority date: 2015-01-30
Filing date: 2015-01-30
Publication date: 2019-07-31
Anticipated expiration: 2035-01-30
Also published as: JP2016140262A

Description

本発明は、肝細胞がんの転移性再発リスクを予測する方法や、かかる方法に用いるためのキットに関する。

我が国では死亡原因の第１位はがんであり、その対策は国民の健康という観点から最重要課題となっている。肝細胞がん（hepatocellular carcinoma；ＨＣＣ、以下、「ＨＣＣ」ともいう）の発生率は世界で第６位であり、死亡率もがん関連死の第３位であることが報告されている。ＨＣＣは、その殆どがウイルス感染に起因する慢性肝炎や、慢性肝炎から進行した肝硬変を背景として発症することが知られており、ＨＣＣ患者の中で、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）に陽性である人の割合は約７０％にのぼる（非特許文献１）。肝炎ウイルスがＨＣＣを引き起こすメカニズムの詳細は明らかにされていないが、ウイルスの持続感染が慢性肝炎や肝硬変等を引き起こす過程で、肝細胞のがん化が起こると考えられている。

現在のところ、ＨＣＣ治療法としては外科的な摘除手術が有効であるとされているが、術後５年以内の再発率は４０〜８０％ときわめて高く、しかも予後不良であることが知られている（非特許文献２）。この再発率の高さは、肝炎ウイルス感染を素地とするde novoによる再発（多中心性再発）に加えて、肝内転移による再発の２つが要因となっている。以上のように、ＨＣＣの治療には、高い再発の危険性が伴っており、特に肝内転移による術後早期の再発は予後不良で有り、外科的な摘除手術の治療後の再発を予測するためのバイオマーカーの開発は同時に転移抑制法の開発にもつながり、ＨＣＣ患者のＱＯＬ（quality of life）の観点から非常に重要であると共に、外科的な摘除手術の治療後は再発を怖れずに安心して暮らせる術後補助療法が求められている。

また、これまでにＤＮＡチップ法等の網羅的解析から、がん細胞での遺伝子発現プロファイルが構築され、がん特異的遺伝子が多数同定されてきた。そこで、がん特異的遺伝子のｍＲＮＡ発現量を指標として、がんに対する早期検出・分類・予後予測等の診断法が開発されている（特許文献１参照）。しかしながら、現在までに実用化されたものは、米国食品医薬品局に認可された、乳がんの再発リスクを７０の遺伝子の発現から予測するMammaPrint（登録商標：Agendia社製）にとどまっているのが現状である。また、これまでに本発明者らは、ＣＹＰ２Ａ６、ＳＬＣ１０Ａ１、ＳＬＣ２２Ａ１、ＥＳＲ１、ＧＬＹＡＴ、ＴＳＰＡＮ８、又はＮＱＯ１遺伝子のｍＲＮＡの発現の増減を検出することによるＨＣＣ発症リスクの判定方法（特許文献２参照）を提案して開発を進めているが、実用化には至っていない。

一方、がん組織における一部のがん細胞には、胚性幹細胞や体性幹細胞等の幹細胞に特徴的な性質である、自身と同じ細胞を作り出す自己複製能と多種類の細胞に分化できる多分化能とを有するがん幹細胞（cancer stem cells；ＣＳＣｓ）が存在し、かかるがん幹細胞が、自己複製能により自身と同じ細胞を維持しながら、多分化能によりがん組織における多数の分化したがん細胞を生み出していると考えられている。したがって、外科的な摘除手術等によってがん細胞を除いても、体内にごく少数のがん幹細胞が生き残っていれば再発が起こりうることになる。

上記がん幹細胞はがん細胞のなかでごく少数しか含まれていないため、がん幹細胞の研究はあまり進んでいなかった。そこで本発明者らは、血清を含有しない動物細胞培養用基礎培地に、神経生存因子−１（ＮＳＦ−１）を添加した無血清培地を用いた消化器系がん幹細胞の増殖方法（特許文献３参照）を提案した。かかる方法を用いれば、がん幹細胞がほとんど含まれていないＳＫ−ＨＥＰ−１等の低分化型のＨＣＣ由来細胞株からＨＣＣ幹細胞を効率よく誘導・濃縮することや、ＨＣＣ幹細胞を長期間安定して増殖培養することが可能となり、ＨＣＣ幹細胞をターゲットとしたＨＣＣ治療薬の開発が期待されている。

特開２０１０−１７８６５０号公報特開２０１４−０２７８９８号公報特開２０１３−２０８１０４号公報

Umeura T. et al., Journal of Gastroenterology 44:102-107 (2009) Hashimoto N. et al., BMC Cancer 14:722(2014)

ＨＣＣは再発率が高い疾患であり、また、de novoによる再発に比べて転移性再発は予後が悪いため、早期に転移性再発リスクを予測することが肝要である。そこで、本発明の課題は、ＨＣＣの転移性再発リスクを予測する方法や、かかる方法に用いるためのキットを提供することにある。

これまでにがんの再発予測リスクの判定方法が実用化に至っていない背景として、がん細胞のみならず、がん細胞集団の中でも極少数であるがん幹細胞においても多様性（heterogeneity）が存在することが挙げられ、真に転移性再発の原因となる細胞に対する特異的特徴を明らかとする必要がある。上記、ＨＣＣ幹細胞の誘導・濃縮によって得られた肝転移能の亢進を示す細胞に共通し、また、術後肝内再発を来したヒト臨床検体においても共通する発現プロファイルは、ＨＣＣの再発予測リスクを予測する方法及びＨＣＣ治療薬開発において有用である。

本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を続けていく過程において、ＨＣＣ細胞株であるＳＫ−ＨＥＰ−１細胞株と、該ＳＫ−ＨＥＰ−１細胞株を上記特許文献３記載の方法で培養して得られた細胞塊（sphere：ＨＣＣ幹細胞）を、それぞれＲａｇ欠損（Ragnull）マウスとＩＬ−２ｒγノックアウトマウスを交配して作製された免疫不全のＮＲＧマウス（Pearson, T. et al., Clin. Exp. Immunol 154: 270-284(2008)）に投与した試験により、ＳＫ−ＨＥＰ−１細胞株由来の浮遊細胞塊はＳＫ−ＨＥＰ−１細胞株と比較して肝転移能が亢進することを見いだした。そこで、ＳＫ−ＨＥＰ−１細胞株由来の浮遊細胞塊に、転移性再発に関与する遺伝子が含まれていると考え、ＳＫ−ＨＥＰ−１細胞株とＳＫ−ＨＥＰ−１細胞株由来の浮遊細胞塊におけるｍＲＮＡ発現解析を行って比較したところ、ｍＲＮＡの発現量の増減が３倍以上となる遺伝子が１２５種類あることを確認した。さらに、摘除手術後１年以内肝内再発ＨＣＣ患者と摘除手術後２年以上肝内無再発ＨＣＣ患者からの摘除標本（摘除した肝組織）におけるｍＲＮＡ発現解析を行うことで、上記１２５遺伝子のうち、ＴＭ４ＳＦ１９遺伝子、ＨＩＬＰＤＡ遺伝子、ＫＩＳＳ１遺伝子、ＰＡＰＰＡ遺伝子が再発と相関があることを見いだした。また、ＳＫ−ＨＥＰ−１細胞株とＳＫ−ＨＥＰ−１細胞株由来の浮遊細胞塊におけるタンパク質発現解析を行って比較したところ、発現量の増減量が２倍以上となるタンパク質が５９種類あることを確認し、そのうちＲＡＢ２７Ｂが摘除標本においても再発と相関があることを見いだし、本発明を完成した。

すなわち、本発明は以下に示すとおりである。
（１）被検者から採取した生体試料中のＴＭ４ＳＦ１９遺伝子、ＨＩＬＰＤＡ遺伝子、ＫＩＳＳ１遺伝子、ＰＡＰＰＡ遺伝子又はＲＡＢ２７Ｂ遺伝子のｍＲＮＡの発現量、又は前記ｍＲＮＡがコードするタンパク質の発現量を指標として、肝細胞がんの転移性再発リスクを予測する方法。
（２）生体試料が、肝組織であることを特徴とする上記（１）記載の方法。
（３）上記（１）又は（２）記載の方法に用いるためのキットであって、被検者から採取した生体試料中のＴＭ４ＳＦ１９遺伝子、ＨＩＬＰＤＡ遺伝子、ＫＩＳＳ１遺伝子、ＰＡＰＰＡ遺伝子又はＲＡＢ２７Ｂ遺伝子のｍＲＮＡの発現量を検出するためのプライマー対若しくはプローブ、又はそれらの標識物を備えることを特徴とするキット。
（４）上記（１）又は（２）記載の方法に用いるためのキットであって、被検者から採取した生体試料中のＴＭ４ＳＦ１９遺伝子、ＨＩＬＰＤＡ遺伝子、ＫＩＳＳ１遺伝子、ＰＡＰＰＡ遺伝子又はＲＡＢ２７Ｂ遺伝子のｍＲＮＡがコードするタンパク質に特異的に結合する抗体、又はこれらの標識物を備えることを特徴とするキット。

なお、上記本発明のＨＣＣの転移性再発リスクを予測する方法には医師による診断行為は含まれず、また上記ＨＣＣの転移性再発リスクを予測する方法のその他の態様としては、ＨＣＣの再発リスクの予測を補助する方法や、ＨＣＣの再発リスクを予測するためのデータを収集する方法を挙げることができる。

本発明によると、ＨＣＣ治療における術後のＨＣＣの転移性再発リスクを予測することが可能となり、ＨＣＣ治療の術後の治療方針を決定することができる。また、本発明によりＨＣＣの転移性再発リスクを予測することで、ＨＣＣの転移性再発の予防及び早期発見のために有用な情報を提供することができる。

ＳＫ−ＨＥＰ−１細胞株、及びＳＫ−ＨＥＰ−１細胞株由来の浮遊細胞塊（ＳＫ−ｓｐｈｅｒｅ）の写真である。ＤＮＡチップ法により、ＫＩＳＳ１遺伝子、ＴＭ４ＳＦ１９遺伝子、ＰＡＰＰＡ遺伝子、又はＨＩＬＰＤＡ遺伝子について、摘除手術後１年以内肝内再発ＨＣＣ患者（with IHR）と摘除手術後２年以上肝内無再発ＨＣＣ患者（without IHR）の摘除標本におけるがん部肝組織、及び非がん部肝組織（non-Tumor）におけるｍＲＮＡの発現量を調べた結果示す図である。定量ＰＣＲにより、ＫＩＳＳ１遺伝子、ＴＭ４ＳＦ１９遺伝子、ＰＡＰＰＡ遺伝子、又はＨＩＬＰＤＡ遺伝子について、ＳＫ−ＨＥＰ−１細胞株（左カラム：ＳＫ−ＨＥＰ−１）とＳＫ−ＨＥＰ−１細胞株由来の浮遊細胞塊（右カラム：ＳＫ−ｓｐｈｅｒｅ）におけるｍＲＮＡの発現量を示す図である。定量ＰＣＲにより、ＫＩＳＳ１遺伝子、ＴＭ４ＳＦ１９遺伝子、又はＨＩＬＰＤＡ遺伝子について、摘除手術後１年以内肝内再発ＨＣＣ患者（with IHR）と摘除手術後２年以上肝内無再発ＨＣＣ患者（without IHR）の摘除標本におけるがん部肝組織（Tumor）、及び非がん部肝組織（non-Tumor）のｍＲＮＡの発現量を調べた結果示す図である。定量ＰＣＲにより、ＫＩＳＳ１遺伝子、ＴＭ４ＳＦ１９遺伝子について、高分化型ＨＣＣ（ＨＣＣ（Ｇ１））患者、中分化型ＨＣＣ（ＨＣＣ（Ｇ２））患者、低分化型ＨＣＣ（ＨＣＣ（Ｇ３））患者の摘除標本における非がん部肝組織（non-Tumor）及びがん部肝組織（Ｇ１，Ｇ２，Ｇ３）のｍＲＮＡの発現量を調べた結果示す図である。定量ＰＣＲにより、ＲＡＢ２７Ｂ遺伝子について、摘除手術後１年以内肝内再発ＨＣＣ患者（with IHR）と摘除手術後２年以上肝内無再発ＨＣＣ患者（without IHR）の摘除標本におけるがん部肝組織（Tumor）、及び非がん部組織（non-Tumor）のｍＲＮＡの発現量を調べた結果示す図である。

本発明のＨＣＣの転移性再発リスクを予測する方法としては、被検者から採取した生体試料中のＴＭ４ＳＦ１９遺伝子、ＨＩＬＰＤＡ遺伝子（別名：ＨＩＧ２遺伝子）、ＫＩＳＳ１遺伝子、ＰＡＰＰＡ遺伝子又はＲＡＢ２７Ｂ遺伝子（以下、「本件ＨＣＣバイオマーカー遺伝子」ともいう）のｍＲＮＡの発現量、又は前記ｍＲＮＡがコードするタンパク質の発現量を指標として、ＨＣＣの転移性再発リスクを予測する方法であれば特に制限されず、ここで、本発明において「ＨＣＣの転移性再発」とは、肝炎ウイルス感染を素地とするde novoによる再発とは異なり、肝内転移巣や血液からの遺残がん細胞の再増殖によるＨＣＣの再発を意味し、主として摘除手術後１年若しくは２年以内の再発である。

また、本発明のＨＣＣの転移性再発リスクを予測する方法に用いるためのキットとしては、被検者から採取した生体試料中の本件ＨＣＣバイオマーカー遺伝子のｍＲＮＡの発現量を検出するためのプライマー対若しくはプローブ、又はそれらの標識物を備えたキット（以下、「本件キット１」ともいう）や、被検者から採取した生体試料中の本件ＨＣＣバイオマーカー遺伝子のｍＲＮＡがコードするタンパク質に特異的に結合する抗体、又はこれらの標識物を備えたキット（以下、「本件キット２」ともいう）であれば特に制限されず、かかるキットを用いることで、ＨＣＣの転移性再発リスクを容易に予測することが可能となる。

本発明のＨＣＣの転移性再発リスクを予測する方法、本件キット１及び本件キット２における本件ＨＣＣバイオマーカー遺伝子は、１種でも２種以上組み合わせてもよく、また、本件ＨＣＣバイオマーカー遺伝子に、ＨＣＣの転移性再発リスクを予測可能な他の遺伝子を組み合わせてもよい。

本発明において、生体試料としては、肝組織、細胞等の非液性試料や、血液、血清、唾液等の液性試料を例示することができ、肝組織であることを好適に例示することができ、ＴＭ４ＳＦ１９遺伝子、ＨＩＬＰＤＡ遺伝子、ＫＩＳＳ１遺伝子又はＰＡＰＰＡ遺伝子のｍＲＮＡの発現量や、前記ｍＲＮＡがコードするタンパク質の発現量を指標とする場合には、がん部肝組織であることが好ましく、ＲＡＢ２７Ｂ遺伝子のｍＲＮＡの発現量や、ＲＡＢ２７Ｂ遺伝子のｍＲＮＡがコードするタンパク質の発現量を指標とする場合には、非がん部肝組織であることが好ましい。なお、転移生再発は血行性転移でもあることから、上記細胞として血液中の循環がん細胞を用いてもよい。また、上記肝組織は、被検者より採取された後に、凍結処理が施された凍結組織であっても、病理組織学的処理が施された病理組織であってもよく、かかる病理組織としては、ホルマリン固定組織や、ホルマリン固定パラフィン包埋組織等を例示することができる。

本発明のＨＣＣの転移性再発リスクを予測する方法におけるＨＣＣの転移性再発リスクの予測は、被検者から採取された生体試料中の本件ＨＣＣバイオマーカー遺伝子のｍＲＮＡの発現量、又は前記ｍＲＮＡがコードするタンパク質の発現量を測定することによって行うことができる。例えば、事前に摘除手術後１年以上肝内無再発ＨＣＣ患者、好ましくは摘除手術後２年以上肝内無再発ＨＣＣ患者と、摘除手術後２年以内肝内再発ＨＣＣ患者、好ましくは摘除手術後１年以内肝内再発ＨＣＣ患者それぞれ２検体以上、好ましくは４検体以上、より好ましくは５検体以上から採取された生体試料中の本件ＨＣＣバイオマーカー遺伝子のｍＲＮＡの発現量、又は前記ｍＲＮＡがコードするタンパク質の発現量を測定し、かかる発現量の中央値又は平均値を算出し、前記中央値又は平均値を基にカットオフ値を定める。次いで被検者から採取された生体試料中の本件ＨＣＣバイオマーカー遺伝子のｍＲＮＡの発現量、又は前記ｍＲＮＡがコードするタンパク質の発現量を測定し、被検者から採取された生体試料中のｍＲＮＡの発現量、又は前記ｍＲＮＡがコードするタンパク質の発現量と前記カットオフ値とを比較することで、被検者におけるＨＣＣの転移性再発リスクを予測することが可能である。

被検者から採取された生体試料中のｍＲＮＡの発現量、又は前記ｍＲＮＡがコードするタンパク質の発現量がカットオフ値以上であれば、被検者のＨＣＣの転移性再発リスクが高い、或いは被検者におけるＨＣＣ治療の予後が悪い（予後不良）と予測することができる。一方、被検者から採取された生体試料中のｍＲＮＡの発現量、又は前記ｍＲＮＡがコードするタンパク質の発現量がカットオフ値未満であれば、被検者のＨＣＣの転移性再発リスクが低い、或いは被検者におけるＨＣＣ治療の予後がよい（予後良好）と予測することができる。

この他、被検者から採取された生体試料中のｍＲＮＡの発現量、又は前記ｍＲＮＡがコードするタンパク質の発現量、及び、摘除手術後１年以上肝内無再発ＨＣＣ患者、好ましくは摘除手術後２年以上肝内無再発ＨＣＣ患者と、摘除手術後２年以内肝内再発ＨＣＣ患者、好ましくは摘除手術後１年以内肝内再発ＨＣＣ患者それぞれ２検体以上、好ましくは４検体以上、より好ましくは５検体以上から採取された生体試料中の本件ＨＣＣバイオマーカー遺伝子のｍＲＮＡの発現量、又は前記ｍＲＮＡがコードするタンパク質の発現量とを組み合わせた判別式をロジスティック回帰分析等により構築して予測する方法を挙げることができる。

なお、上記ＨＣＣの転移性再発リスクの予測方法において、本件ＨＣＣバイオマーカー遺伝子のｍＲＮＡ又はタンパク質の発現量の代わりに、本件ＨＣＣバイオマーカー遺伝子のｍＲＮＡ又はタンパク質の発現量と相関又は逆相関の関係にあるフリーＤＮＡ又はフリーＲＮＡの発現量を測定してもよい。

本発明のＨＣＣの転移性再発リスクを予測する方法において、遺伝子のｍＲＮＡの発現量を検出する方法としては、本件ＨＣＣバイオマーカー遺伝子のｍＲＮＡの一部若しくは全部を特異的に検出できる方法であればどのような方法であってもよく、具体的には、被検者から採取された生体試料中の全ＲＮＡを抽出・精製し、本件ＨＣＣバイオマーカー遺伝子のｍＲＮＡに相補的な塩基配列からなるプローブを用いたノーザンブロッティング法で検出する方法や、被検者から採取された生体試料中の細胞における全ＲＮＡを抽出・精製し、逆転写酵素を用いてｃＤＮＡを合成した後、かかるｃＤＮＡを特異的に増幅するプライマー対を用いた、競合的ＰＣＲ法、リアルタイムＰＣＲ法等の定量ＰＣＲ法で検出する方法や、被検者から採取された生体試料中の全ＲＮＡを抽出・精製し、逆転写酵素を用いてｃＤＮＡを合成した後、ビオチン（biotin）やジゴキシゲニン（digoxigenin）等でｃＤＮＡをラベルし、蛍光物質が標識されたビオチンに対する親和性の高いアビジン（avidin）やジゴキシゲニンを認識する抗体等で間接的にｃＤＮＡを標識した後、ガラス、シリコン、プラスチック等のハイブリダイゼーションに使用可能な支持体上に固定化された、本件ＨＣＣバイオマーカー遺伝子のｃＤＮＡに相補的な塩基配列からなるプローブを用いたマイクロアレイで検出する方法や、被検者から採取された生体試料中の全ＲＮＡを抽出・精製し、逆転写酵素を用いてｃＤＮＡを合成した後、ｃＤＮＡを制限酵素（ＭｓｐＩ、ＭｓｅＩ等）によって切断し、アダプター配列を結合した後、これらを鋳型ＤＮＡとしたＰＣＲを行い、それぞれのＰＣＲ産物をキャピラリー電気泳動により展開し、得られたＰＣＲ産物由来のピークを検証するＨｉＣＥＰ法等の方法を挙げることができる。なお、本件ＨＣＣバイオマーカー遺伝子のｍＲＮＡやｃＤＮＡの配列情報は、例えば本件ＨＣＣバイオマーカー遺伝子名を基に、ＮＣＢＩ（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/guide/）のデータベースで検索することにより得ることができる。

本発明のＨＣＣの転移性再発リスクを予測する方法において、タンパク質の発現量を検出する方法としては、本件ＨＣＣバイオマーカー遺伝子のｍＲＮＡがコードするタンパク質（以下、「本件ＨＣＣバイオマーカータンパク質」という）の一部若しくは全部を特異的に検出できる方法であればどのような方法であってもよく、具体的には、本件ＨＣＣバイオマーカータンパク質を特異的に認識する抗体を用いた免疫学的測定法や、本件ＨＣＣバイオマーカータンパク質を構成するペプチドを検出する質量分析法を挙げることができる。なお、本件ＨＣＣバイオマーカータンパク質のアミノ酸配列情報は、例えば本件ＨＣＣバイオマーカータンパク質名を基に、ＮＣＢＩ（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/guide/）のデータベースで検索することにより得ることができる。

本件キット１におけるプライマー対としては、本件ＨＣＣバイオマーカー遺伝子から合成されるｃＤＮＡの上流及び下流の配列の一部とアニーリングしうる相補的なプライマー対であれば、プライマー配列の長さ、かかるｃＤＮＡとアニーリングする部位、増幅するｃＤＮＡの長さ等は、ＤＮＡの増幅効率や特異性を考慮して適宜選択することができる。例えば、プライマー配列の長さとしては、１５〜３０塩基を選択することができ、また、増幅するｃＤＮＡの長さとしては、５０〜３００塩基を選択することができる。

本件キット１におけるプローブとしては、本件ＨＣＣバイオマーカー遺伝子、又はかかる遺伝子から合成したｃＤＮＡの一部若しくは全部がハイブリダイゼーションするプローブであれば、プローブの長さ、かかるスプライシングバリアントとハイブリダイズする部位等は、ハイブリダイゼーションの効率や特異性を考慮して適宜選択することができる。また、本件キット１には、必要と目的に応じた緩衝液、ｐＨ調製剤、反応容器、ＨＣＣの転移性再発リスクを予測する方法を記載した説明書等をさらに備えたものであってもよい。

本件キット２における抗体としては、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、ヒト抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体等の抗体であってもよく、また、この中には、Ｆ（ａｂ’）₂、Ｆａｂ、ｄｉａｂｏｄｙ、Ｆｖ、ＳｃＦｖ、Ｓｃ（Ｆｖ）₂等の抗体の一部からなる抗体断片も含まれる。また、本件キット２には、本件ＨＣＣバイオマーカータンパク質のアミノ酸残基に結合した本件キット２における抗体を検出するための、蛍光物質、酵素等の標識物質をコンジュゲートした２次抗体を含めることや、本件キット２における抗体とは異なるエピトープと反応する少なくとも１種類の抗体を含めることができる。また、本件キット２には、必要と目的に応じた緩衝液、ｐＨ調製剤、反応容器、ＨＣＣの転移性再発リスクを予測する方法を記載した説明書等をさらに備えたものであってもよい。

本件キット１におけるプライマー対の標識物やプローブの標識物としては、標識物質が結合した上記プライマー対や標識物質が結合した上記プローブであればよく、本件キット２における抗体の標識物としては、標識物質が結合した上記抗体であればよく、かかる標識物質としては、例えばビオチン、緑色蛍光タンパク質（Green Fluorescent Protein；ＧＦＰ）、西洋ワサビペルオキシダーゼ(Horse Radish Peroxidase;ＨＲＰ)、３２Ｐ等を具体的に挙げることができる。

以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。

［細胞塊の調製］
転移に関わるがん幹細胞様細胞を誘導するために、まずはＨＣＣ由来細胞株から浮遊細胞塊を調製した。

（無血清培地の作製）
ＳＫ−ＨＥＰ−１を培養して浮遊細胞塊を作製するための無血清培地として、以下の成分Ａ、Ｂ、及びＣからなるものを作製した。
（１）成分Ａ
ＤＭＥＭ／Ｆ１２（シグマ−アルドリッチ社製社製）８６ｍＬ
１ＭＨｅｐｅｓ（4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid）９００μｌ
Antibiotic/antimycotic liquid（１００倍濃度）９００μｌ
３０％グルコース１．７ｍｌ
（２）成分Ｂ
ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（シグマ−アルドリッチ社製）８．６ｍｌ
３０％グルコース（シグマ−アルドリッチ社製）２００μｌ
トランスフェリン（シグマ−アルドリッチ社製）１０ｍｇ＋Ｈ₂Ｏ２００μｌ
インスリン（シグマ−アルドリッチ社製）２．５ｍｇ＋０．１ＮＨＣｌ１００μｌ（先にインスリンを溶解）＋Ｈ₂Ｏ９００μｌ（溶解後に加える）計１ｍｌ
プトレシン（Alexis Biochemicals社製）１９．３３ｍｇ
０．３ｍＭ亜セレン酸ナトリウム（シグマ−アルドリッチ社製）１０μｌ
２ｍＭプロゲステロン（シグマ−アルドリッチ社製）１μｌ
（３）成分Ｃ
２００μｇ／ｍｌヒトＥＧＦ（シグマ−アルドリッチ社製）１０μｌ
４μｇ／ｍｌＢａｓｉｃＦＧＦ（和光純薬工業社製）５００μｌ
１ｍｇ／ｍｌヘパリン（シグマ−アルドリッチ社製）２００μｌ
１０μｇ／ｍｌＬＩＦ（ケミコン社製）１００μｌ
ＮＳＦ−１（５０倍濃度）（カンブレックス社製）２ｍｌ（最終濃度；２％［ｗ／ｖ］）
６０ｍｇ／ｍｌＮ−アセチルシステイン（N-acetylcysteine）（シグマ−アルドリッチ社製）１００μｌ

なお、ここでは約１００ｍｌの無血清培地を作製する場合の組成を記載している。また、無血清培地は、成分Ａ、Ｂ及びＣをそれぞれ個別に作製した後、混合して作製した。

（ＳＫ−ＨＥＰ−１細胞株由来の細胞塊の形成）
ＳＫ−ＨＥＰ−１細胞株の生細胞数をトリパンブルー染色より計測し、１．０ｘ１０^５個／ｍｌとなるように上記で作製した無血清培地に懸濁した後、ベントキャップタイプフラスコ（BDファルコン社製）、又は超低接着表面フラスコカントネックベントキャップ（Corning社製）に播種し、３７℃、５％ＣＯ₂条件下で培養した。培養後７日目には、ＳＫ−ＨＥＰ−１細胞株由来の浮遊細胞塊を形成した。ＳＫ−ＨＥＰ−１細胞株、及び形成したＳＫ−ＨＥＰ−１細胞株由来の浮遊細胞塊（ＳＫ−ｓｐｈｅｒｅ）を図１に示す。

［ＤＮＡチップ法によるｍＲＮＡ発現解析］
（ＳＫ−ＨＥＰ−１細胞株とＳＫ−ＨＥＰ−１細胞株由来の浮遊細胞塊におけるｍＲＮＡ発現解析）
ＤＮＡチップ法により、ＳＫ−ＨＥＰ−１細胞株とＳＫ−ＨＥＰ−１細胞株由来の浮遊細胞塊のｍＲＮＡ発現量を調べて比較した。

まず、ＳＫ−ＨＥＰ−１細胞株とＳＫ−ＨＥＰ−１細胞株由来の浮遊細胞塊から、miRNeasy（QIAGEN社製）により全ＲＮＡの抽出・精製を行った。次にｃＲＮＡを３Ｄ−Ｇｅｎｅ（登録商標）全遺伝子型ＤＮＡチップ（東レ社製）を用いて、そのプロトコルに従ってＤＮＡチップ解析を行った。その後の統計学的解析は、GeneSpring GX（アジレント・テクノロジー社製）を用いて行った。選択基準（Fold-change＞３．０、Ｐ値＜０．０５）を基に、ＨＣＣ再発に関わる候補遺伝子を同定した。Ｐ値は、漸近計算した対応のないｔ−検定（unpaired t-test）とBenjamini-Hochberg FDR多重検定（multiple-testing correction）により算出した。

ＳＫ−ＨＥＰ−１細胞株由来の浮遊細胞塊における各ｍＲＮＡの発現量をＳＫ−ＨＥＰ−１細胞株における各ｍＲＮＡの発現量と比較したところ、ｍＲＮＡの発現量の増減が３倍以上となる遺伝子が１２５種類あることが確認された。

（肝組織におけるｍＲＮＡ発現解析）
摘除手術後２年以上肝内無再発ＨＣＣ患者（without IHR）及び摘除手術後１年以内肝内再発ＨＣＣ患者（with IHR）からの摘除標本におけるがん部肝組織、及び非がん部肝組織（non-Tumor）（それぞれｎ＝５）から、TRIzol Reagent（Life Technologies社製）とPureLink Micro-to-Midi Total RNA Purification Kit（Life Technologies社製）を用いて全ＲＮＡの抽出・精製及びｃＤＮＡ合成を行い、DNA Labeling Kits（Roche Applied Science社製）を用いてＣｙ３で上記ｃＤＮＡを蛍光標識した後、かかるｃＤＮＡをHuman Gene Expression 4x72K Arrays（Roche Diagnostics社製）にハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーションは、Hybridization Kits（Roche Applied Science社製）及びNimbleGen Hybridization Systems（Roche Applied Science社製）を用いて４２℃にて１６時間の条件下で行った。蛍光シグナルのスキャニングは、GenePix 4000B（Molecular Devices社製）を用いて行い、取得した蛍光シグナルの画像解析は、NimbleScan Software（Roche Applied Science社製）を用いて行った。その後の統計学的解析は、GeneSpring GX（アジレント・テクノロジー社製)を用いて行った。

摘除手術後１年以内肝内再発ＨＣＣ患者と摘除手術後２年以上肝内無再発ＨＣＣ患者の摘除標本におけるがん部肝組織のｍＲＮＡの発現量を比較したところ、ｍＲＮＡの発現量の増減が２倍以上となる遺伝子が３１６６種類あることが確認された。このうち、ＫＩＳＳ１遺伝子、ＴＭ４ＳＦ１９遺伝子、ＰＡＰＰＡ遺伝子、ＨＩＬＰＤＡ遺伝子は、上述のＳＫ−ＨＥＰ−１細胞株とＳＫ−ＨＥＰ−１細胞株由来の浮遊細胞塊におけるｍＲＮＡ発現解析によって得られた１２５種類のＨＣＣ再発に関わる候補遺伝子に含まれていた。４種類それぞれの遺伝子の摘除手術後１年以内肝内再発ＨＣＣ患者と摘除手術後２年以上肝内無再発ＨＣＣ患者の摘除標本におけるがん部肝組織、及び非がん部肝組織におけるｍＲＮＡの発現量を図２に示す。図２において、縦軸はＤＮＡチップ解析から得られた発現量をGlobal normalization法により標準化した数値を任意の値（Arbitrary Unit）として示したものである。

図２に示すように、ＫＩＳＳ１遺伝子、ＴＭ４ＳＦ１９遺伝子、ＰＡＰＰＡ遺伝子、ＨＩＬＰＤＡ遺伝子は、ＨＣＣ患者の非がん部肝組織や摘除手術後２年以上肝内無再発ＨＣＣ患者の摘除標本におけるがん部肝組織と比較して摘除手術後１年以内肝内再発ＨＣＣ患者の摘除標本におけるがん部肝組織において発現量が多く、ＫＩＳＳ１遺伝子、ＴＭ４ＳＦ１９遺伝子、ＰＡＰＰＡ遺伝子、又はＨＩＬＰＤＡ遺伝子の発現量を調べることで、ＨＣＣの転移性再発を予測できることが明らかとなった。

［定量ＰＣＲ法によるｍＲＮＡ発現解析］
（ＳＫ−ＨＥＰ−１細胞株とＳＫ−ＨＥＰ−１細胞株由来の浮遊細胞塊におけるｍＲＮＡ発現解析）
上述のＫＩＳＳ１遺伝子、ＴＭ４ＳＦ１９遺伝子、ＰＡＰＰＡ遺伝子、又はＨＩＬＰＤＡ遺伝子の４種類について、定量ＰＣＲによりＳＫ−ＨＥＰ−１細胞株とＳＫ−ＨＥＰ−１細胞株由来の浮遊細胞塊のｍＲＮＡ発現を調べて比較した。まず、ＳＫ−ＨＥＰ−１細胞株とＳＫ−ＨＥＰ−１細胞株由来の浮遊細胞塊を用いて、miRNeasy（QIAGEN社製）を用いて全ＲＮＡを抽出・精製し、さらにPrimeScript RT reagent Kit（TaKaRa Bio社製）を用いてｃＤＮＡを合成した。合成したｃＤＮＡを鋳型として、LightCycler 480 Probe Master（Roche Diagnostics社製）、Universal ProbeLibrary（Roche Diagnostics社製）、及びLightCycler480 System II（Roche Diagnostics社製）を用いて定量ＰＣＲを行った。結果を図３に示す。図３において、縦軸の各ｍＲＮＡの発現量（mRNA level）はＧＡＰＤＨ及びＰＧＫ１を参照遺伝子として標準化した後に、ＳＫ−ＨＥＰ−１細胞株からの発現量を基準（１．０）とした相対値である。

図３に示すように、いずれの遺伝子もＳＫ−ＨＥＰ−１細胞株と比べて肝転移能が高いＳＫ−ＨＥＰ−１細胞株由来の浮遊細胞塊で発現量が高いことが定量ＰＣＲ法においても確認された。

（肝組織におけるｍＲＮＡ発現解析１）
摘除手術後２年以上肝内無再発ＨＣＣ患者（without IHR）及び摘除手術後１年以内肝内再発ＨＣＣ患者（with IHR）からの摘除標本において、それぞれ摘除した非がん部肝組織（non-Tumor）及びがん部肝組織（Tumor）（それぞれｎ＝６）から全ＲＮＡを抽出・精製し、上記と同様の方法で定量ＰＣＲを行ってＫＩＳＳ１遺伝子、ＴＭ４ＳＦ１９遺伝子、又はＨＩＬＰＤＡ遺伝子のｍＲＮＡの発現量を測定した。結果を図４に示す。図４において、縦軸はＧＡＰＤＨ及びＰＧＫ１を参照遺伝子として標準化した後に、非がん部肝組織１２例の平均値を基準（１．０）とした相対値である。また、カラムの中の太線は中央値であり、fold chargeは平均値を用いて示している。

図４に示すように、ＫＩＳＳ１遺伝子、ＴＭ４ＳＦ１９遺伝子、ＨＩＬＰＤＡ遺伝子は、摘除手術後２年以上肝内無再発ＨＣＣ患者の摘除標本におけるがん部肝組織と比較して摘除手術後１年以内肝内再発ＨＣＣ患者の摘除標本におけるがん部肝組織において発現量が多く、がん部肝組織のＫＩＳＳ１遺伝子、ＴＭ４ＳＦ１９遺伝子、又はＨＩＬＰＤＡ遺伝子の発現量を調べることで、ＨＣＣの転移性再発を予測できることが確認された。

（肝組織におけるｍＲＮＡ発現解析２）
高分化型ＨＣＣ（ＨＣＣ（Ｇ１））患者、中分化型ＨＣＣ（ＨＣＣ（Ｇ２））患者、低分化型ＨＣＣ（ＨＣＣ（Ｇ３））患者の摘除標本における非がん部肝組織（non-Tumor）及びがん部肝組織（Ｇ１，Ｇ２，Ｇ３）から全ＲＮＡを抽出・精製し、上記と同様の方法で定量ＰＣＲを行ってＫＩＳＳ１遺伝子、ＴＭ４ＳＦ１９遺伝子のｍＲＮＡの発現量を測定した。結果を図５に示す。図５において、縦軸はＧＡＰＤＨ及びＰＧＫ１を参照遺伝子として標準化した後に、非がん部肝組織１２例の平均値を基準（１．０）とした相対値である。また、カラムの中の太線は中央値である。

図５に示すように、ＫＩＳＳ１遺伝子、ＴＭ４ＳＦ１９遺伝子は、非がん部肝組織と比べて転移性再発の可能性が高い低分化型ＨＣＣ患者のがん部肝組織において発現量が多いことが明らかとなり、ＫＩＳＳ１遺伝子やＴＭ４ＳＦ１９遺伝子の発現量と転移性再発に相関があることが確認された。

（ｉＴＲＡＱ標識（登録商標）２Ｄ−ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ解析によるタンパク質発現解析）
ｉＴＲＡＱ標識２Ｄ−ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ解析により、ＳＫ−ＨＥＰ−１細胞株とＳＫ−ＨＥＰ−１細胞株由来の浮遊細胞塊のタンパク質発現量を調べて比較した。

まず、ＳＫ−ＨＥＰ−１細胞株とＳＫ−ＨＥＰ−１細胞株由来の浮遊細胞塊からタンパク質画分を調製し、トリプシン消化の後に安定同位体標識ｉＴＲＡＱ試薬（Applied Biosystems社製）で処理して、２Ｄ−ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ解析を行った。得られたペプチド配列について、ＮＣＢＩのタンパク質データベースとタンパク質同定ソフトウェアProteinPlotを用いてタンパク質を同定した。

ＳＫ−ＨＥＰ−１細胞株由来の浮遊細胞塊における各タンパク質の発現量をＳＫ−ＨＥＰ−１細胞株における各タンパク質の発現量と比較したところ、５９種類のタンパク質において、発現量の増減が２倍以上であることが確認され、そのうち、ＲＡＢ２７ＢはＳＫ−ＨＥＰ−１細胞株と比較してＳＫ−ＨＥＰ−１細胞株由来の浮遊細胞塊において発現量が４．７倍であった。さらに実施例２におけるＤＮＡチップ法によるｍＲＮＡ発現解析により、ＳＫ−ＨＥＰ−１細胞株と比較してＳＫ−ＨＥＰ−１細胞株由来の浮遊細胞塊においてＲＡＢ２７Ｂ遺伝子のｍＲＮＡの発現量は２．２倍であったことから、ＲＡＢ２７Ｂ遺伝子をＨＣＣ再発に関わる候補遺伝子とした。

（肝組織におけるＲＡＢ２７Ｂ遺伝子のｍＲＮＡ発現解析）
摘除手術後２年以上肝内無再発ＨＣＣ患者（without IHR）及び摘除手術後１年以内肝内再発ＨＣＣ患者（with IHR）からの摘除標本において、それぞれ摘除した非がん部肝組織（non-Tumor）及びがん部肝組織（Tumor）（それぞれｎ＝６）から全ＲＮＡを抽出・精製し、実施例３と同様の方法で定量ＰＣＲを行ってＲＡＢ２７Ｂ遺伝子のｍＲＮＡの発現量を測定した。結果を図６に示す。図６において、縦軸はＧＡＰＤＨ及びＰＧＫ１を参照遺伝子として標準化した後に、非がん部肝組織１２例の平均値を基準（１．０）とした相対値である。また、カラムの中の太線は中央値であり、fold chargeは平均値を用いて示している。

図６に示すように、ＲＡＢ２７Ｂ遺伝子は、摘除手術後２年以上肝内無再発ＨＣＣ患者の摘除標本における非がん部肝組織と比較して摘除手術後１年以内肝内再発ＨＣＣ患者の摘除標本における非がん部肝組織において発現量が多く、非がん部肝組織のＲＡＢ２７Ｂ遺伝子の発現量を調べることで、ＨＣＣの転移性再発を予測できることが確認された。

以上の結果から、ＫＩＳＳ１遺伝子、ＴＭ４ＳＦ１９遺伝子、ＰＡＰＰＡ遺伝子、ＨＩＬＰＤＡ遺伝子又はＲＡＢ２７Ｂ遺伝子や、ＲＡＢ２７Ｂ遺伝子をコードするタンパク質はin vitro解析において転移能が高いＨＣＣ幹細胞において発現量が多く、さらにＨＣＣ再発や進展といった臨床所見を伴うヒト臨床検体においてもそれらの発現量と臨床所見との相関が確認された。したがって、ＫＩＳＳ１遺伝子、ＴＭ４ＳＦ１９遺伝子、ＰＡＰＰＡ遺伝子、ＨＩＬＰＤＡ遺伝子又はＲＡＢ２７Ｂ遺伝子や、これら遺伝子をコードするタンパク質の発現量を調べることにより、ＨＣＣの転移性再発リスクを予測することができることが明らかとなった。本構成要素により予測されるＨＣＣの再発は、転移生再発の根源的原因と考えられるがん幹細胞の発生を予測するものであり、従来の門脈浸潤や門脈塞栓などよりも早い段階でのがんの悪性化を検出するものである。

本発明によると、ＨＣＣ治療における術後のＨＣＣの転移性再発リスクを予測することが可能となり、ＨＣＣ治療の術後の治療方針を決定する場合に利用可能である。

Claims

被検者から採取した生体試料中のＴＭ４ＳＦ１９遺伝子のｍＲＮＡの発現量、又は前記ｍＲＮＡがコードするタンパク質の発現量を指標として、肝細胞がんの転移性再発リスクを予測する方法。
生体試料が、肝組織であることを特徴とする請求項１記載の方法。