WO2020054782A1 - 乳癌細胞存在率の推定方法 - Google Patents

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cytosine residue
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弘喜 石原
牛島　俊和
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国立研究開発法人国立がん研究センター
合同会社みらか中央研究所
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    • C12Q2600/154—Methylation markers

Definitions

  • the present invention relates to a method for estimating the abundance rate of breast cancer cells.
  • Evaluation of the cancer cell fraction in a cancer tissue sample is performed by diagnosing cancer using a cancer marker (eg, determining the risk of developing cancer, determining the presence or absence of cancer, predicting the effect of drug therapy on cancer (for example, It is important to eliminate the decrease in determination accuracy due to the mixture of unnecessary fractions (normal cells) in the literature 1) and the evaluation of prognosis of drug therapy for cancer).
  • a cancer marker eg, determining the risk of developing cancer, determining the presence or absence of cancer, predicting the effect of drug therapy on cancer (for example, It is important to eliminate the decrease in determination accuracy due to the mixture of unnecessary fractions (normal cells) in the literature 1) and the evaluation of prognosis of drug therapy for cancer).
  • Methods for evaluating the cancer cell fraction include, for example, (1) pathological diagnosis, and (2) a cancer tissue sample (including cancer cells and non-cancerous cells) collected by biopsy using a predetermined method.
  • a cancer tissue sample including cancer cells and non-cancerous cells collected by biopsy using a predetermined method.
  • the method (1) requires the involvement of a skilled physician, and the method (2) has problems such as complexity.
  • a cancer cell fraction by analyzing a cancer tissue sample using a marker ("fraction marker") specific to the cancer cell fraction.
  • a marker for example, methylation markers TFAP2B, ARHGEF4, and RAPGEFL1 in esophageal cancer (Non-patent document 2) and methylation markers OSR2, PPFIA3, and VAV3 in gastric cancer (Non-patent document 3) have been reported. I have.
  • An object of the present invention is to provide a cancer marker for determining the content of breast cancer cells contained in breast cancer tissue. Another object of the present invention is to improve the accuracy of an index for predicting the effect of drug therapy on breast cancer by determining the content of breast cancer cells.
  • the present inventors first evaluated breast cancer cell fractions, so that breast cancer cells that were highly methylated in breast cancer cells but were completely or only slightly methylated in normal cells (non-breast cancer cells) The idea was to search for specific CpG sites, and in this search to select CpG sites that do not have a high incidence of copy number changes between cells and that can target a wide range of patients. . Thus, the present inventors have conducted extensive and comprehensive studies on more than 450,000 methylation candidate sites present on autosomes and sex chromosomes. As a result, such CpG sites were found in the SIM1 gene, CCDC181 gene, and CFTR gene. Specific CpG sites. The present inventors have succeeded in using the methylation rate of these CpG sites as an index of the abundance rate of breast cancer cells, and have completed the present invention.
  • a method for estimating the abundance of breast cancer cells including the following (1) and (2): (1) In a sample derived from a human subject, the following: (A) a cytosine residue in the CG portion consisting of nucleotides 1000 and 1001 in the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1; (B) a cytosine residue in the CG portion consisting of nucleotides 1000 and 1001 in the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2; (C) a cytosine residue in the CG portion consisting of nucleotides 1001 and 1002 in the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3; or (d) analyzing the methylation rate of these combinations; and (2) (1) Estimating the abundance of breast cancer cells in a sample derived from a human subject based on the methylation rate analyzed in [1].
  • the analysis is performed using one or more means selected from the group consisting of bisulfite, one or more primers, one or more nucleic acid probes, restriction enzymes, anti-methylated cytosine antibodies, and nanopores; The method of [1].
  • [3] Analysis includes bisulfite sequencing, bisulfite pyrosequencing, methylation-specific PCR, restriction enzyme landmark genome scanning (RLGS), single nucleotide primer extension (SNuPE) , CpG island microarray method, methylite method, COBRA method, mass spectrometry (mass array) method, use of methylation specific restriction enzyme, high resolution melting analysis (HRM) method, nanopore analysis method, ICON probe method, methylation specific method The method according to [1] or [2], which is performed by the MLPA method or an immunoassay.
  • a method for predicting the effect of drug therapy on breast cancer including the following (1) to (4): (1) measuring the value of a breast cancer marker in a sample derived from a human subject; (2) In a sample derived from a human subject, the following: (A) a cytosine residue in the CG portion consisting of nucleotides 1000 and 1001 in the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1; (B) a cytosine residue in the CG portion consisting of nucleotides 1000 and 1001 in the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2; (C) a cytosine residue in the CG portion consisting of nucleotides 1001 and 1002 in the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3; or (d) analyzing the methylation rate of these combinations; (3) calculating the corrected value of the breast cancer marker by correcting the value of the breast cancer marker measured in (1) with the methylation rate analyzed in (2); and (4) correcting the corrected value of (3).
  • a method for determining breast cancer including the following (1) and (2): (1) In a sample derived from a human subject, the following: (A) a cytosine residue in the CG portion consisting of nucleotides 1000 and 1001 in the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1; (B) a cytosine residue in the CG portion consisting of nucleotides 1000 and 1001 in the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2; (C) a cytosine residue in the CG portion consisting of nucleotides 1001 and 1002 in the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3; or (d) analyzing the methylation rate of these combinations; and (2) (1) Assessing the likelihood of developing breast cancer based on the methylation rates analyzed in.
  • [6] The following: (A) a cytosine residue in the CG portion consisting of nucleotides 1000 and 1001 in the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1; (B) a cytosine residue in the CG portion consisting of nucleotides 1000 and 1001 in the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2; (C) a cytosine residue in the CG portion consisting of nucleotides 1001 and 1002 in the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3; For reagents.
  • the estimation method of the present invention is useful, for example, for improving the accuracy of breast cancer determination using breast cancer markers (eg, breast cancer risk determination, breast cancer determination, prediction of the effect of drug therapy, prognostic evaluation).
  • the prediction method of the present invention is useful, for example, as an index in judging the necessity of surgery for a breast cancer patient and the selection of drug therapy.
  • the determination method of the present invention is useful, for example, for diagnosing breast cancer.
  • the reagents and kits of the present invention are useful, for example, for simple implementation of the method of the present invention.
  • FIG. 1 is a graph showing the correlation between cancer cell content assessed by microscopy and the methylation levels of SIM1, CCDC181, and CFTR alone.
  • FIG. 2 is a graph showing the correlation between the cancer cell content evaluated by microscopy and the methylation level of a combination of two genes selected from SIM1, CCDC181 and CFTR (higher methylation level is selected). is there.
  • FIG. 3 is a graph showing the correlation between the cancer cell content evaluated by microscopy and the methylation level of the combination of the three genes SIM1, CCDC181, and CFTR (the highest methylation level was selected).
  • FIG. 4 shows the cancer cell content evaluated by microscopic examination of the measured value of the methylation rate of the HSD17B4 gene in a HER2-positive breast cancer tissue sample of pathological complete response (pCR) and non-complete response (Non-pCR).
  • 10 is a graph showing values corrected by the methylation rate by a combination of SIM1 and CCDC181.
  • the cancer targeted in the present invention is breast cancer.
  • Breast cancer can be classified into HER2-positive, luminal A, luminal B, and triple negative subtypes.
  • the cancer targeted in the present invention may be any type of breast cancer, but HER2 positive type is preferable in a specific aspect.
  • fraction marker refers to a cancer cell fraction specific when a cell population such as a sample derived from a subject is separated into a cancer cell fraction and a non-cancerous cell (normal cell) fraction. Refers to a marker.
  • a fraction marker is a gene, it may be referred to as a “fraction marker gene”.
  • the information of the CpG site of the SIM1 gene, the CCDC181 gene, and the CFTR gene (breast cancer fraction marker gene), which are mainly intended to be analyzed in the present invention, are as shown in Table 1 below (the genome is located in the human genome assembly). hg38).
  • the CpG sites of the SIM1 gene analyzed in the present invention are the 1000th and 1001th nucleotide residues in the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 (the 4th and 5th nucleotides in the standard nucleotide sequence ggccgact located upstream of exon 1 of the SIM1 gene). Nucleotide portion) (when the 5 ′ ggc portion and the 3 ′ act portion are not mutated).
  • the standard nucleotide sequence is intended to be referred to to identify the CpG site corresponding to the CpG site in Table 1 above (as well as the CpG sites of other genes analyzed in the present invention).
  • CpG site of SIM1 gene refers to the above CpG site unless otherwise specified.
  • the CpG sites of the CCDC181 gene analyzed in the present invention are nucleotides 1000 and 1001 in the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 (the 4th and 5th nucleotides in the standard nucleotide sequence cagcggca present in intron 2 of the CCDC181 gene). Nucleotide portion) (when the 5′-side cag portion and the 3′-side gca portion are not mutated).
  • a person skilled in the art can appropriately determine a CpG site corresponding to the CpG site existing at the above position, in consideration of the genomic DNA mutation, for a human subject having a genomic DNA mutation.
  • CpG site of CCDC181 gene when simply referred to as “CpG site of CCDC181 gene” in the present specification, the above CpG site is indicated unless otherwise specified.
  • the CpG site of the CFTR gene analyzed in the present invention is the nucleotide residues 1001 and 1002 in the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 (the 4th and 5th nucleotides in the standard nucleotide sequence ctccgggg located upstream of exon 1 of the CFTR gene). Nucleotide portion) (when the 5 'ctc portion and the 3' ggg portion are not mutated).
  • a person skilled in the art can appropriately determine a CpG site corresponding to the CpG site existing at the above position, in consideration of the genomic DNA mutation, for a human subject having a genomic DNA mutation.
  • CFTR gene CpG site when simply referred to as “CFTR gene CpG site” in the present specification, the above CpG site is indicated unless otherwise specified.
  • the present invention provides a method for estimating the abundance of breast cancer cells.
  • the estimation method of the present invention includes the following (1) and (2): (1) In a sample derived from a human subject, the following: (A) a cytosine residue in the CpG site of the SIM1 gene; (B) cytosine residues in the CpG site of the CCDC181 gene; (C) cytosine residues in the CpG site of the CFTR gene; or (d) analyzing the methylation rate of these combinations; and (2) a human test based on the methylation rate analyzed in (1). Estimating the abundance of breast cancer cells in a body-derived sample.
  • a tissue sample corresponding to the above-mentioned cancer is preferably used.
  • a specific CpG site is analyzed in genomic DNA contained in such a cancer tissue sample.
  • Genomic DNA can be appropriately extracted from a cancer tissue sample by any method.
  • a sample collected by a biopsy such as a needle biopsy can be used.
  • the cancer tissue sample may have been subjected to a preliminary treatment. Examples of such pretreatment include extraction, cell fixation, tissue fixation, tissue exfoliation, cell dissociation treatment, heating, freezing, refrigeration, and liquefaction.
  • a cancer tissue sample is usually a sample of a cell population containing cancer cells and normal cells (non-cancerous cells).
  • the methylation analyzed in the present invention is methylation at the 5-position of a cytosine residue.
  • the analysis of the methylation rate can be performed by any method known in the art.
  • the analysis can be performed using one or more analysis means selected from the group consisting of bisulfite, a primer, a nucleic acid probe, a restriction enzyme, an anti-methylated cytosine antibody, and a nanopore.
  • bisulfite converts unmethylated cytosine to uracil while not converting methylated cytosine to uracil. Therefore, bisulfite is widely used in combination with other analysis means in the analysis of methylated cytosine due to such properties.
  • the primer is a sequencing primer, a gene amplification primer (eg, a PCR primer), or a combination thereof.
  • the primer can be appropriately designed so that the target CpG site can be analyzed.
  • the primer may be a downstream region of the CpG site of interest (an arbitrary region in the portion consisting of nucleotide residues 1002 to 2001 in the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 for the SIM1 gene, and a nucleotide of SEQ ID NO: 2 for the CCDC181 gene).
  • Anneals to any region in the portion consisting of nucleotides 1002 to 2001 in the sequence, or to the CFTR gene (any region in the portion consisting of nucleotides 1003 to 2001 in the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3)
  • any region in the region consisting of nucleotide residues 1 to 999 in the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 for the SIM1 gene is used.
  • the sense and antisense strands can be designed to anneal in any region in the portion) and in the downstream region (any region shown above as a downstream region).
  • the nucleic acid probe is a region containing the CpG site of interest (for the SIM1 gene, a portion containing a CG portion consisting of the 1000th and 1001th nucleotide residues in the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1; for the CCDC181 gene, a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2)
  • a portion containing a CG portion consisting of the 1000th and 1001th nucleotide residues in the above, a portion containing a CG portion consisting of the 1001th and 1002th nucleotide residues in the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 for the CFTR gene or It can be designed to hybridize to its upstream region (any region shown above as an upstream region) or downstream region (any region shown above as a downstream region).
  • the nucleic acid probe can be used in a free form or a form immobilized on a solid phase.
  • the solid phase include particles (eg, magnetic particles); supports such as arrays, membranes (eg, nitrocellulose membranes, filter papers) and columns; and containers such as plates (eg, multiwell plates) and tubes.
  • Can be Solid phase materials include, for example, glass, plastic, and metal.
  • the nucleic acid probe may also be a nucleic acid probe as detailed in the analysis of methylated cytosine using an anti-methylated cytosine antibody.
  • the restriction enzyme is a methylation-specific or non-specific restriction enzyme, and can be used in an appropriate combination with the above-mentioned bisulfite, primer, and nucleic acid probe.
  • examples of analysis methods using the above-described analysis means include DNA methylation sequencing, bisulfite sequencing, bisulfite pyrosequencing, methylation-specific PCR, and restriction enzyme land.
  • Analysis can also be performed using anti-methylated cytosine antibodies. Analysis of methylated cytosine using an anti-methylated cytosine antibody is well known in the art (eg, WO2015 / 025862; WO2015 / 025863; WO2015 / 025864; WO2016 / 052368; JP-A-2012-230019; DNA @ Research # 13). Chem., 37-42 (2006); Anal. Chem. @ 2012, 84, 7533-7538). Anti-methylated cytosine antibodies may be used in combination with one or more analysis means as described above.
  • a method using such analysis means for example, a method using a combination of an anti-methylated cytosine antibody and a heterologous nucleic acid probe (eg, a normal RNA probe, a modified RNA probe) (eg, WO2015 / 025862) A) a method using a combination of an anti-methylated cytosine antibody, and a solid phase probe and a capture probe (eg, WO2015 / 025863); a method using a combination of an anti-methylated cytosine antibody, and an absorbent polynucleotide and a capture probe (eg, WO2015 / 025864); a method using a combination of an anti-methylated cytosine antibody and a modified nucleic acid base-pairing heterologous nucleic acid probe (eg, WO2016 / 052368).
  • a heterologous nucleic acid probe eg, a normal RNA probe, a modified RNA probe
  • the nucleic acid probe used in combination with the anti-methylated cytosine antibody hybridizes with the DNA chain containing the above-described CpG site analyzed in the present invention, and forms a double-stranded structure portion comprising the DNA chain and the nucleic acid probe.
  • it may be designed so that the methylcytosine residue in the CpG site forms an unpaired portion with the nucleic acid probe (in other words, does not bind complementarily) (eg, WO2015 / 025862).
  • the nucleic acid probe may be used as a nucleotide residue corresponding to an unpaired portion other than a guanine residue capable of binding complementarily to a methylcytosine residue (eg, a cytosine residue, a thymine residue, an adenine residue). , A uracil residue).
  • the nucleic acid probe may be designed so that such an unpaired portion is not formed (eg, WO2016 / 052368).
  • the method using an anti-methylated cytosine antibody can be performed by any immunological method known in the art.
  • examples of such a method include enzyme immunoassay (EIA) (eg, CLEIA, ELISA), fluorescence immunoassay, chemiluminescence immunoassay, electrochemiluminescence immunoassay, agglutination, Examples include immunostaining, flow cytometry, biolayer interferometry, In situ PLA, chemical amplified luminescence proximity homogeneous assay, line blotting, and western blotting.
  • EIA enzyme immunoassay
  • fluorescence immunoassay eg, CLEIA, ELISA
  • fluorescence immunoassay eg, chemiluminescence immunoassay
  • electrochemiluminescence immunoassay agglutination
  • Examples include immunostaining, flow cytometry, biolayer interferometry, In situ PLA, chemical amplified luminescence proximity homogeneous as
  • the methylation rate analyzed in the present invention is the rate of methylation of cytosine residues in CpG in cancer cells.
  • the measurement of the methylation rate is well known in the art (eg, JP-A-2012-090555, JP-A-2014-036672, JP-T-2010-538638, and Table-A-2009 / 136501).
  • the methylation rate analyzed in the present invention may be a combination of the methylation rates of cytosine residues in the CpG site of the SIM1 gene, CCDC181 gene, and CFTR gene.
  • the combination of the methylation rates as shown in the above (d) is a combination consisting of two or more of these methylation rates (ie, 2 or 3), and specifically, a combination of the SIM1 gene and the CCDC181 gene, The methylation rates of cytosine residues in CpG sites in the combination of the SIM1 gene and the CFTR gene, the combination of the CCDC181 gene and the CFTR gene, and the combination of the SIM1 gene, the CCDC181 gene, and the CFTR gene.
  • the methylation rate in the combination for example, any of the highest methylation rate, the lowest methylation rate, and the average methylation rate in the combination may be employed, but the highest methylation rate is preferably employed.
  • step (2) the percentage of breast cancer cells in a sample derived from a human subject can be estimated based on the analyzed methylation rate.
  • the present invention also provides a method for predicting the effect of drug therapy on breast cancer.
  • ⁇ ⁇ Pharmacotherapy for breast cancer includes, for example, treatment with anticancer agents.
  • the anticancer agent include a microtubule inhibitor, an anticancer antibiotic, a topoisomerase inhibitor, a platinum preparation, and an alkylating agent.
  • the anti-cancer agent may also be a molecular targeted drug.
  • molecular targeted drugs examples include HER2 inhibitors, EGFR inhibitors (eg, gefitinib, lapatinib, erlotinib, cetuximab), c-MET inhibitors (eg, PHA-665752, SU11274, XL-880), ALK Inhibitors (eg, WHI-P154, TAE684, PF-2341066), PDGFR inhibitors (eg, imatinib, desatinib, valatinib), c-KIT inhibitors (eg, sunitinib, macitinib, motesanib).
  • EGFR inhibitors eg, gefitinib, lapatinib, erlotinib, cetuximab
  • c-MET inhibitors eg, PHA-665752, SU11274, XL-880
  • ALK Inhibitors eg, WHI-P154, TAE684, PF-2341066
  • PDGFR inhibitors
  • ⁇ ⁇ Drug therapy for breast cancer can be appropriately selected according to the subtype of breast cancer.
  • HER2 positive breast cancer includes, for example, treatment with a HER2 inhibitor.
  • HER2 is a receptor tyrosine kinase that belongs to the same family as epidermal growth factor (EGFR).
  • EGFR epidermal growth factor
  • HER2 has a structure in which an extracellular domain, a transmembrane domain, and an intracellular domain having tyrosine kinase activity are linked by a single chain (eg, Coussens et al., Science, 1985, Vol. 230, No. 4730, pp. 1132). -1139, and Genebank accession number: NP_001005862.1).
  • HER2 inhibitor examples include antibodies (eg, trastuzumab, pertuzumab), low molecular weight organic compounds (eg, HER2 tyrosine kinase inhibitors such as lapatinib, neratinib, afatinib, etc.), and drug-binding antibodies (eg, T-DM1).
  • antibodies eg, trastuzumab, pertuzumab
  • low molecular weight organic compounds eg, HER2 tyrosine kinase inhibitors such as lapatinib, neratinib, afatinib, etc.
  • drug-binding antibodies eg, T-DM1.
  • Medications for luminal type A breast cancer include, for example, treatment with hormone therapy or chemotherapy.
  • Hormone therapy includes, for example, therapy using LH-RH agonist preparations, antiestrogens, progestin, and aromatase inhibitors.
  • Chemotherapy includes, for example, therapies using topoisomerase inhibitors, microtubule acting drugs, alkylating drugs, antimetabolites.
  • Pharmacotherapy for luminal B-type breast cancer includes, for example, treatment with hormone therapy or chemotherapy.
  • Hormone therapy includes, for example, therapy using LH-RH agonist preparations, antiestrogens, progestin, and aromatase inhibitors.
  • Chemotherapy includes, for example, therapies using topoisomerase inhibitors, microtubule acting drugs, alkylating drugs, antimetabolites.
  • ⁇ ⁇ Pharmacotherapy for triple negative breast cancer includes, for example, treatment with chemotherapy.
  • Chemotherapy includes, for example, therapies using topoisomerase inhibitors, microtubule acting drugs, alkylating drugs, antimetabolites.
  • a plurality of anticancer drugs can be used in combination.
  • the plurality of anticancer agents used in combination include a combination of two or more anticancer agents described above and a combination of one or more anticancer agents described above and another anticancer agent.
  • other anticancer agents include microtubule inhibitors such as taxane anticancer agents (eg, paclitaxel), anthracyclines (eg, adriacin), and aromatase inhibitors (eg, letrozole).
  • the prediction method of the present invention includes the following (1) to (4): (1) measuring the value of a breast cancer marker in a sample derived from a human subject; (2) In a sample derived from a human subject, the following: (A) a cytosine residue in the CpG site of the SIM1 gene; (B) cytosine residues in the CpG site of the CCDC181 gene; (c) cytosine residues in the CpG site of the CFTR gene; or (d) analyzing the methylation rate of these combinations; (3) calculating the corrected value of the breast cancer marker by correcting the value of the breast cancer marker measured in (1) with the methylation rate analyzed in (2); and (4) correcting the corrected value of (3). Predicting the effect of drug therapy on breast cancer based on corrected values of breast cancer markers.
  • the breast cancer marker in step (1) is a marker that serves as an indicator of breast cancer, and examples thereof include a DNA methylation rate (eg, cg15896301 of HSD17B4: Non-Patent Document 3).
  • the means for analyzing the CpG site of the fraction marker gene (SIM1 gene, CCDC181 gene, or CFTR gene) in step (2) and the methylation rate are as described above.
  • the correction of the value of the breast cancer marker in the step (3) corresponds to a pureer breast cancer cell based on the value of the breast cancer marker measured in a sample (sample containing breast cancer cells and non-breast cancer cells) derived from a human subject. This means calculating the value of the obtained breast cancer marker. Therefore, the correction value of the breast cancer marker can be obtained, for example, by the following equation.
  • Correction value of breast cancer marker (value of breast cancer marker measured in sample derived from human subject) / (presence of breast cancer cells in sample derived from human subject)
  • the step (4) can be performed by using a correction value of the breast cancer marker instead of the value of the breast cancer marker in a method of predicting the effect of the pharmacotherapy on the breast cancer based on the value of the breast cancer marker.
  • a correction value of the breast cancer marker instead of the value of the breast cancer marker in a method of predicting the effect of the pharmacotherapy on the breast cancer based on the value of the breast cancer marker.
  • the present invention also provides a method for determining breast cancer.
  • Determination of breast cancer refers to evaluating whether a human subject is more or less likely to have breast cancer.
  • the determination method of the present invention includes the following (1) and (2): (1) In a sample derived from a human subject, the following: (A) a cytosine residue in the CpG site of the SIM1 gene; (B) cytosine residues in the CpG site of the CCDC181 gene; (C) a cytosine residue in the CpG site of the CFTR gene; or (d) analyzing the methylation rate of these combinations; and (2) a breast cancer tumor based on the methylation rate analyzed in (1). Assess morbidity.
  • the human subject-derived sample, the CpG site of the fraction marker gene (SIM1 gene, CCDC181 gene or CFTR gene) in step (1), and the means for analyzing the methylation rate are as described above.
  • the human subject may be suffering from breast cancer when the methylation rate is equal to or higher than the reference value, and / or the human subject may have breast cancer when the methylation rate is lower than the reference value. It can be evaluated that the possibility of suffering is low.
  • a cutoff value appropriately set so that a breast cancer patient and a healthy person can be distinguished can be used.
  • the cut-off value of the methylation rate for example, any percentage value within the range of 10 to 30% can be employed, but any percentage value within the range of 15 to 25% is employed. And preferably 20%.
  • the present invention also provides a reagent for estimating the abundance of breast cancer cells.
  • the estimation reagent of the present invention includes the following: (A) a cytosine residue in the CpG site of the SIM1 gene; (B) cytosine residues in the CpG site of the CCDC181 gene; (C) a cytosine residue in the CpG site of the CFTR gene; or (d) a means for analyzing the methylation rate of these combinations.
  • the means for analyzing the CpG site of the fraction marker gene (SIM1 gene, CCDC181 gene, or CFTR gene) in the estimation reagent of the present invention, and the methylation rate are as described above.
  • the estimation reagent of the present invention analyzes the methylation rate of the fraction marker gene in the human subject-derived sample using a methylation rate analysis means, and based on the analyzed methylation rate, the human subject-derived sample It can be used to estimate the abundance of breast cancer cells in.
  • the present invention also provides a reagent for determining breast cancer.
  • the determination reagent of the present invention includes the following: (A) a cytosine residue in the CpG site of the SIM1 gene; (B) cytosine residues in the CpG site of the CCDC181 gene; (C) a cytosine residue in the CpG site of the CFTR gene; or (d) a means for analyzing the methylation rate of these combinations.
  • the means for analyzing the CpG site of the fraction marker gene (SIM1 gene, CCDC181 gene, or CFTR gene) and the methylation rate in the determination reagent of the present invention are as described above.
  • the determination reagent of the present invention analyzes the methylation rate of a fraction marker gene in a sample derived from a human subject using a methylation rate analysis means, and based on the analyzed methylation rate, a breast cancer in a human subject. Can be used to determine
  • the present invention also provides a kit.
  • the kit of the present invention comprises the following (1) and (2): (1) The following: (A) a cytosine residue in the CpG site of the SIM1 gene; (B) cytosine residues in the CpG site of the CCDC181 gene; (C) a cytosine residue in the CpG site of the CFTR gene; or (d) means for analyzing the methylation rate of a combination thereof; and (2) means for measuring a breast cancer marker.
  • the means for analyzing the CpG site of the fraction marker gene (SIM1 gene, CCDC181 gene, or CFTR gene) in the reagent for judging breast cancer of the present invention, the methylation rate, and the means for measuring the breast cancer marker are as described above.
  • the kit of the present invention can be used for various purposes, and can be used, for example, for predicting the effect of drug therapy on breast cancer.
  • Sample 1-1 Biologically-derived sample
  • 195 breast cancer tissue samples were obtained from 195 breast cancer patients.
  • Breast cancer tissue samples from each patient were collected by needle biopsy from patients diagnosed with breast cancer.
  • Samples were fixed using the PAX gene tissue system (Qiagen, Hilden, Germany) and embedded in low melting paraffin.
  • Ten 10 ⁇ m thin sections were prepared and DNA was extracted.
  • microscopic examination of the samples was performed to determine the cancer cell fraction.
  • the therapeutic response to trastuzumab was determined, and the state in which no cancer cells remained in the sample was determined as a complete pathological response (pCR). It was defined as incomplete response (Non-pCR).
  • 10 of the 61 samples were separated into cancer and non-cancer cells by laser capture microdissection (LCM).
  • HMECs Human breast epithelial cells
  • the bisulfite-modified DNA was suspended in 40 ⁇ l of TE buffer, and a 1 ⁇ l aliquot was previously reported (Yoshida T, Yamashita S, Takamura-Enya T, Niwa T, Anato T, Alcoa, and other sickness. pylori-infected gastric mucosae. International journal of cancer. 2011; 128 (1): 33-9).
  • Target genomic regions were amplified with biotinylated primers. Biotin-labeled PCR products were annealed to 0.2 ⁇ M pyrosequencing primers and biosequencing was performed using the PSQ 96 pyrosequencing system (QIAGEN, Valencia, CA, USA). Methylation levels were obtained using PSQ assay design software (QIAGEN).
  • HSD17B4 methylation level by breast cancer cell fraction 3-1. Measurement of the value of breast cancer marker The methylation level of the HSD17B4 gene was measured for 61 HER2-positive breast cancer samples for which pCR and Non-pCR were determined in 1-1 above. HSD17B4 methylation level was measured by bisulfite pyrosequencing according to 2-1 (see Non-Patent Document 3).
  • SEQ ID NO: 1 shows the nucleotide sequence of a 1000 bp genomic region before and after the CpG site for measuring the methylation level of the SIM1 gene (nucleotide residues at positions 1000 and 1001).
  • SEQ ID NO: 2 shows the nucleotide sequence of a genomic region of 1000 bp before and after the CpG site (the 1000th and 1001th nucleotide residues) for measuring the methylation level of the CCDC181 gene.
  • SEQ ID NO: 3 shows the nucleotide sequence of a 1000 bp genomic region before and after the CpG site for measuring the methylation level of the CFTR gene (nucleotide residues at positions 1001 and 1002).
  • SEQ ID NOs: 4 to 6 show the nucleotide sequences of a forward primer, a reverse primer, and a sequencing primer for measuring the methylation level of the CpG site of the SIM1 gene, respectively.
  • SEQ ID NOs: 7 to 9 respectively show the nucleotide sequences of a forward primer, a reverse primer, and a sequencing primer for measuring the methylation level of the CpG site of the CCDC181 gene.
  • SEQ ID NOs: 10 to 12 show the nucleotide sequences of a forward primer, a reverse primer, and a sequencing primer for measuring the methylation level of the CpG site of the CFTR gene, respectively.

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Abstract

本発明は、乳癌に対する薬物療法の効果予測をする指標の精度の向上を提供する。具体的には、本発明は、以下（１）および（２）を含む、乳癌細胞存在率の推定方法などを提供する： （１）ヒト被験体由来サンプルにおいて、以下：　（ａ）配列番号１のヌクレオチド配列における１０００番目と１００１番目のヌクレオチドからなるＣＧ部分中のシトシン残基；　（ｂ）配列番号２のヌクレオチド配列における１０００番目と１００１番目のヌクレオチドからなるＣＧ部分中のシトシン残基；　（ｃ）配列番号３のヌクレオチド配列における１００１番目と１００２番目のヌクレオチドからなるＣＧ部分中のシトシン残基；または　（ｄ）これらの組合せ　のメチル化率を解析すること；および （２）（１）で解析されたメチル化率に基づいて、ヒト被験体由来サンプル中の乳癌細胞存在率を推定すること。

Description

乳癌細胞存在率の推定方法
　本発明は、乳癌細胞存在率の推定方法などに関する。
　癌組織サンプルにおける癌細胞画分の評価は、癌マーカーを用いた癌の診断（例、癌の発症リスクの判定、癌の罹患の有無判定、癌に対する薬物療法の効果の予測（例えば、非特許文献１）、および癌に対する薬物療法の予後の評価）における不要画分（正常細胞）の混在による判定精度の低下を排除するために重要である。
　癌細胞画分を評価する方法としては、例えば、（１）病理診断、および（２）所定の方法を用いて、生検で採取した癌組織サンプル（癌細胞および非癌性細胞を含む）から癌細胞を分離する方法などが存在する。しかし、（１）については、熟練した医師の従事が必要であり、また、（２）の方法については、煩雑であるなどの問題がある。
　上記問題を解決するため、癌細胞画分に特異的なマーカー（「画分マーカー」）を用いて癌組織サンプルを解析することにより、癌細胞画分を評価することが提案されている。このような画分マーカーとしては、例えば、食道癌におけるメチル化マーカーＴＦＡＰ２Ｂ、ＡＲＨＧＥＦ４、およびＲＡＰＧＥＦＬ１（非特許文献２）、胃癌におけるメチル化マーカーＯＳＲ２、ＰＰＦＩＡ３、ＶＡＶ３（非特許文献３）が報告されている。
Ｆｕｊｉｉ　Ｓ，　Ｙａｍａｓｈｉｔａ　Ｓ，　Ｙａｍａｇｕｃｈｉ　Ｔ，　Ｔａｋａｈａｓｈｉ　Ｍ，　Ｈｏｚｕｍｉ　Ｙ，　Ｕｓｈｉｊｉｍａ　Ｔ　ｅｔ　ａｌ．　Ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ　ｃｏｍｐｌｅｔｅ　ｒｅｓｐｏｎｓｅ　ｏｆ　ＨＥＲ２－ｐｏｓｉｔｉｖｅ　ｂｒｅａｓｔ　ｃａｎｃｅｒ　ｔｏ　ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ　ａｎｄ　ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ　ｃａｎ　ｂｅ　ｐｒｅｄｉｃｔｅｄ　ｂｙ　ＨＳＤ１７Ｂ４　ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ．　Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ．　２０１７；８（１２）：１９０３９－４８．　ｄｏｉ：１０．１８６３２／ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ．１５１１８． Ｔａｋａｈａｓｈｉ　Ｔ　ｅｔ　ａｌ．，　ＰＬｏＳ　ｏｎｅ，　２０１３；８（１２）：ｅ８２３０２ Ｚｏｎｇ　Ｌ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｇａｓｔｒｉｃ　ｃａｎｃｅｒ，　２０１６；１９（２）：３６１－９
　本発明の目的は、乳癌組織に含まれる乳癌細胞含有率を判定する癌マーカーを提供することである。本発明の目的はまた、乳癌細胞含有率を判定することにより、乳癌に対する薬物療法の効果予測をする指標の精度を向上させることである。
　本発明者らは、先ず、乳癌細胞画分を評価するため、乳癌細胞では高度にメチル化されているが、正常細胞（非乳癌細胞）では全くまたは低度にしかメチル化されていない乳癌細胞特異的なＣｐＧサイトを探索すること、ならびにこの探索において、細胞間において高発生率のコピー数変化を有さず、かつ広範な患者を対象とすることができるＣｐＧサイトを選択することを着想した。そこで、本発明者らは、常染色体および性染色体に存在する４５万を超えるメチル化候補サイトについて包括的に鋭意検討した結果、このようなＣｐＧサイトとして、ＳＩＭ１遺伝子、ＣＣＤＣ１８１遺伝子、およびＣＦＴＲ遺伝子中の特定のＣｐＧサイトを見出した。本発明者らは、これらのＣｐＧサイトのメチル化率を、乳癌細胞存在率の指標として利用することなどに成功し、本発明を完成するに至った。
　すなわち、本発明は以下のとおりである。
〔１〕以下（１）および（２）を含む、乳癌細胞存在率の推定方法：
（１）ヒト被験体由来サンプルにおいて、以下：
　（ａ）配列番号１のヌクレオチド配列における１０００番目と１００１番目のヌクレオチドからなるＣＧ部分中のシトシン残基；
　（ｂ）配列番号２のヌクレオチド配列における１０００番目と１００１番目のヌクレオチドからなるＣＧ部分中のシトシン残基；
　（ｃ）配列番号３のヌクレオチド配列における１００１番目と１００２番目のヌクレオチドからなるＣＧ部分中のシトシン残基；または
　（ｄ）これらの組合せ
　のメチル化率を解析すること；および
（２）（１）で解析されたメチル化率に基づいて、ヒト被験体由来サンプル中の乳癌細胞存在率を推定すること。
〔２〕解析が、亜硫酸水素塩、１以上のプライマー、１以上の核酸プローブ、制限酵素、抗メチル化シトシン抗体、およびナノポアからなる群より選ばれる１または２以上の手段を用いて行われる、〔１〕の方法。
〔３〕解析が、バイサルファイトシーケンシング法、バイサルファイト・パイロシーケンシング法、メチル化特異的ＰＣＲ法、制限酵素ランドマーク・ゲノム・スキャニング（ＲＬＧＳ）法、単一ヌクレオチド・プライマー伸長（ＳＮｕＰＥ）法、ＣｐＧアイランド・マイクロアレイ法、メチライト法、ＣＯＢＲＡ法、質量分析（マスアレイ）法、メチル化特異的制限酵素の使用、高解像度融解解析（ＨＲＭ）法、ナノポア解析法、ＩＣＯＮプローブ法、メチル化特異的ＭＬＰＡ法、またはイムノアッセイにより行われる、〔１〕または〔２〕の方法。
〔４〕以下（１）～（４）を含む、乳癌に対する薬物療法の効果の予測方法：
（１）ヒト被験体由来サンプルにおいて、乳癌マーカーの値を測定すること；
（２）ヒト被験体由来サンプルにおいて、以下：
　（ａ）配列番号１のヌクレオチド配列における１０００番目と１００１番目のヌクレオチドからなるＣＧ部分中のシトシン残基；
　（ｂ）配列番号２のヌクレオチド配列における１０００番目と１００１番目のヌクレオチドからなるＣＧ部分中のシトシン残基；
　（ｃ）配列番号３のヌクレオチド配列における１００１番目と１００２番目のヌクレオチドからなるＣＧ部分中のシトシン残基；または
　（ｄ）これらの組合せ
　のメチル化率を解析すること；
（３）（１）で測定された乳癌マーカーの値を（２）で解析されたメチル化率で補正して、乳癌マーカーの補正値を計算すること；および
（４）（３）で補正された乳癌マーカーの補正値に基づいて、乳癌に対する薬物療法の効果を予測すること。
〔５〕以下（１）および（２）を含む、乳癌の判定方法：
（１）ヒト被験体由来サンプルにおいて、以下：
　（ａ）配列番号１のヌクレオチド配列における１０００番目と１００１番目のヌクレオチドからなるＣＧ部分中のシトシン残基；
　（ｂ）配列番号２のヌクレオチド配列における１０００番目と１００１番目のヌクレオチドからなるＣＧ部分中のシトシン残基；
　（ｃ）配列番号３のヌクレオチド配列における１００１番目と１００２番目のヌクレオチドからなるＣＧ部分中のシトシン残基；または
　（ｄ）これらの組合せ
　のメチル化率を解析すること；および
（２）（１）で解析されたメチル化率に基づいて、乳癌の罹患可能性を評価すること。
〔６〕以下：
　（ａ）配列番号１のヌクレオチド配列における１０００番目と１００１番目のヌクレオチドからなるＣＧ部分中のシトシン残基；
　（ｂ）配列番号２のヌクレオチド配列における１０００番目と１００１番目のヌクレオチドからなるＣＧ部分中のシトシン残基；
　（ｃ）配列番号３のヌクレオチド配列における１００１番目と１００２番目のヌクレオチドからなるＣＧ部分中のシトシン残基；または
　（ｄ）これらの組合せ
　のメチル化率の解析手段を含む、乳癌細胞存在率の推定用試薬。
〔７〕以下：
　（ａ）配列番号１のヌクレオチド配列における１０００番目と１００１番目のヌクレオチドからなるＣＧ部分中のシトシン残基；
　（ｂ）配列番号２のヌクレオチド配列における１０００番目と１００１番目のヌクレオチドからなるＣＧ部分中のシトシン残基；
　（ｃ）配列番号３のヌクレオチド配列における１００１番目と１００２番目のヌクレオチドからなるＣＧ部分中のシトシン残基；または
　（ｄ）これらの組合せ
　のメチル化率の解析手段を含む、乳癌の判定用試薬。
〔８〕以下（１）および（２）を含むキット：
（１）以下：
　（ａ）配列番号１のヌクレオチド配列における１０００番目と１００１番目のヌクレオチドからなるＣＧ部分中のシトシン残基；
　（ｂ）配列番号２のヌクレオチド配列における１０００番目と１００１番目のヌクレオチドからなるＣＧ部分中のシトシン残基；
　（ｃ）配列番号３のヌクレオチド配列における１００１番目と１００２番目のヌクレオチドからなるＣＧ部分中のシトシン残基；または
　（ｄ）これらの組合せ
　のメチル化率解析手段；および
（２）乳癌マーカーの測定手段。
　本発明の推定方法は、例えば、乳癌マーカーを用いた乳癌の判定（例、乳癌リスク判定、乳癌罹患の判定、薬物療法の効果の予測、予後評価）の精度向上に有用である。
　本発明の予測方法は、例えば、乳癌患者に対する外科的手術の要否および薬物療法の選択の判断における指標として有用である。
　本発明の判定方法は、例えば、乳癌の診断に有用である。
　本発明の試薬およびキットは、例えば、本発明の方法の簡便な実施に有用である。
図１は、顕微鏡検査により評価された癌細胞含有率とＳＩＭ１、ＣＣＤＣ１８１、およびＣＦＴＲ単独のメチル化レベルとの相関を示すグラフである。 図２は、顕微鏡検査により評価された癌細胞含有率とＳＩＭ１、ＣＣＤＣ１８１、およびＣＦＴＲから選ばれる２つの遺伝子の組合せによるメチル化レベル（メチル化レベルが高いほうを選択）との相関を示すグラフである。 図３は、顕微鏡検査により評価された癌細胞含有率とＳＩＭ１、ＣＣＤＣ１８１、およびＣＦＴＲの３つの遺伝子の組合せによるメチル化レベル（最も高いメチル化レベルを選択）との相関を示すグラフである。 図４は、病理学的完全奏効（ｐＣＲ）、非完全奏功（Ｎｏｎ－ｐＣＲ）のＨＥＲ２陽性型乳癌組織サンプルのＨＳＤ１７Ｂ４遺伝子のメチル化率の測定値を、顕微鏡検査により評価された癌細胞含有率およびＳＩＭ１とＣＣＤＣ１８１の組み合わせによるメチル化率で補正した値を示すグラフである。
（一般的な説明）
　本発明において対象とされる癌は、乳癌である。乳癌は、ＨＥＲ２陽性型、ルミナルＡ型、ルミナルＢ型、およびトリプルネガティブ型のサブタイプに分類することができる。本発明において対象とされる癌は、いずれのサブタイプの乳癌であってもよいが、特定の局面ではＨＥＲ２陽性型が好ましい。
　本発明において、「乳癌細胞存在率」とは、サンプル中の全細胞の個数（すなわち、乳癌細胞の個数および非乳癌細胞の個数の合計）に対する乳癌細胞の個数の比率をいう。すなわち、乳癌細胞存在率は、下記式で表される。
　乳癌細胞存在率＝（乳癌細胞の個数）／〔（乳癌細胞の個数）＋（非乳癌細胞の個数）〕
　本明細書において、「画分マーカー」とは、被験体由来サンプル等の細胞集団を癌細胞画分と非癌性細胞（正常細胞）画分に分離した場合の癌細胞画分に特異的なマーカーをいう。画分マーカーは、遺伝子である場合に、「画分マーカー遺伝子」と呼ぶこともある。
　本発明において主に解析が意図されるＳＩＭ１遺伝子、ＣＣＤＣ１８１遺伝子、およびＣＦＴＲ遺伝子（乳癌画分マーカー遺伝子）のＣｐＧサイトの情報は、以下の表１に示すとおりである（ゲノムの位置は、ヒトゲノムアセンブリｈｇ３８に基づく）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　本発明において解析されるＳＩＭ１遺伝子のＣｐＧサイトは、配列番号１のヌクレオチド配列における１０００番目と１００１番目のヌクレオチド残基（ＳＩＭ１遺伝子のエクソン１上流に存在する標準ヌクレオチド配列ｇｇｃｃｇａｃｔ中の４および５番目のヌクレオチド）からなるＣＧ部分と定義することができる（５’側のｇｇｃ部分および３’側のａｃｔ部分が変異していない場合）。標準ヌクレオチド配列は、上記表１のＣｐＧサイトに対応するＣｐＧサイトを特定するために参照されることを意図するものである（本発明において解析される他の遺伝子のＣｐＧサイトも同様）。当業者であれば、ゲノムＤＮＡの変異が認められるヒト被験体について、ゲノムＤＮＡの変異を考慮して、上記位置に存在するＣｐＧサイトに相当するＣｐＧサイトを適宜決定することができる。以下、本明細書において単に「ＳＩＭ１遺伝子のＣｐＧサイト」と称する場合は、特に記載がない限り、上記ＣｐＧサイトを示す。
　本発明において解析されるＣＣＤＣ１８１遺伝子のＣｐＧサイトは、配列番号２のヌクレオチド配列における１０００番目と１００１番目のヌクレオチド残基（ＣＣＤＣ１８１遺伝子のイントロン２中に存在する標準ヌクレオチド配列ｃａｇｃｇｇｃａ中の４および５番目のヌクレオチド）からなるＣＧ部分と定義することもできる（５’側のｃａｇ部分および３’側のｇｃａ部分が変異していない場合）。当業者であれば、ゲノムＤＮＡの変異が認められるヒト被験体について、ゲノムＤＮＡの変異を考慮して、上記位置に存在するＣｐＧサイトに相当するＣｐＧサイトを適宜決定することができる。以下、本明細書において単に「ＣＣＤＣ１８１遺伝子のＣｐＧサイト」と称する場合は、特に記載がない限り、上記ＣｐＧサイトを示す。
　本発明において解析されるＣＦＴＲ遺伝子のＣｐＧサイトは、配列番号３のヌクレオチド配列における１００１番目と１００２番目のヌクレオチド残基（ＣＦＴＲ遺伝子のエクソン１上流に存在する標準ヌクレオチド配列ｃｔｃｃｇｇｇｇ中の４および５番目のヌクレオチド）からなるＣＧ部分と定義することもできる（５’側のｃｔｃ部分および３’側のｇｇｇ部分が変異していない場合）。当業者であれば、ゲノムＤＮＡの変異が認められるヒト被験体について、ゲノムＤＮＡの変異を考慮して、上記位置に存在するＣｐＧサイトに相当するＣｐＧサイトを適宜決定することができる。以下、本明細書において単に「ＣＦＴＲ遺伝子のＣｐＧサイト」と称する場合は、特に記載がない限り、上記ＣｐＧサイトを示す。
（乳癌細胞存在率の推定方法）
　本発明は、乳癌細胞存在率の推定方法を提供する。
　本発明の推定方法は、以下（１）および（２）を含む：
（１）ヒト被験体由来サンプルにおいて、以下：
　（ａ）ＳＩＭ１遺伝子のＣｐＧサイト中のシトシン残基；
　（ｂ）ＣＣＤＣ１８１遺伝子のＣｐＧサイト中のシトシン残基；
　（ｃ）ＣＦＴＲ遺伝子のＣｐＧサイト中のシトシン残基；または
　（ｄ）これらの組合せ
　のメチル化率を解析すること；および
（２）（１）で解析されたメチル化率に基づいて、ヒト被験体由来サンプル中の乳癌細胞存在率を推定すること。
　工程（１）において、サンプルとしては、血液、体液、組織、および細胞からなる群より選択された１または２以上のサンプルを使用することができるが、上述した癌に対応する組織サンプルを好適に使用できる。本発明では、このような癌組織サンプルに含まれるゲノムＤＮＡにおいて、特定のＣｐＧサイトが解析される。ゲノムＤＮＡは、癌組織サンプルから、任意の方法により適宜抽出することができる。癌組織サンプルとしては、例えば、針生検等の生検により採取されたものを用いることができる。癌組織サンプルは、予備処理に付されてもよい。このような予備処理としては、例えば、抽出、細胞固定、組織固定、組織薄片化、細胞解離処理、加熱、凍結、冷蔵、液状化が挙げられる。癌組織サンプルは、通常、癌細胞と正常細胞（非癌性細胞）を含む細胞集団のサンプルである。
　本発明において解析されるメチル化は、シトシン残基の５位のメチル化である。
　メチル化率の解析は、当該分野において公知である任意の方法により行うことができる。例えば、解析は、亜硫酸水素塩、プライマー、核酸プローブ、制限酵素、抗メチル化シトシン抗体、およびナノポアからなる群より選ばれる１または２以上の解析手段を用いて行うことができる。
　亜硫酸水素塩〔バイサルファイト（ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ）〕は、非メチル化シトシンをウラシルに変換する一方で、メチル化シトシンをウラシルに変換しない。よって、重亜硫酸水素塩は、このような性質のため、メチル化シトシンの解析では他の解析手段と組み合わせて汎用されている。
　プライマーは、シークエンシング用プライマー、若しくは遺伝子増幅用プライマー（例、ＰＣＲプライマー）、またはその組み合わせである。プライマーは、目的のＣｐＧサイトを解析できるように適宜設計することができる。例えば、プライマーは、目的のＣｐＧサイトの下流領域（ＳＩＭ１遺伝子については配列番号１のヌクレオチド配列における１００２～２００１番目のヌクレオチド残基からなる部分中の任意の領域、ＣＣＤＣ１８１遺伝子については配列番号２のヌクレオチド配列における１００２～２００１番目のヌクレオチド残基からなる部分中の任意の領域、ＣＦＴＲ遺伝子については配列番号３のヌクレオチド配列における１００３～２００１番目のヌクレオチド残基からなる部分中の任意の領域）にアニールするように、または目的のＣｐＧサイトを含む遺伝子領域を増幅するため、目的のＣｐＧサイトの上流領域（ＳＩＭ１遺伝子については配列番号１のヌクレオチド配列における１～９９９番目のヌクレオチド残基からなる部分中の任意の領域、ＣＣＤＣ１８１遺伝子については配列番号２のヌクレオチド配列における１～９９９番目のヌクレオチド残基からなる部分中の任意の領域、ＣＦＴＲ遺伝子については配列番号１のヌクレオチド配列における１～１０００番目のヌクレオチド残基からなる部分中の任意の領域）および下流領域（上記で下流領域として示した任意の領域）においてセンス鎖およびアンチセンス鎖がアニールするように設計することができる。
　核酸プローブは、目的のＣｐＧサイトを含む領域（ＳＩＭ１遺伝子については配列番号１のヌクレオチド配列における１０００番目と１００１番目のヌクレオチド残基からなるＣＧ部分を含む部分、ＣＣＤＣ１８１遺伝子については配列番号２のヌクレオチド配列における１０００番目と１００１番目のヌクレオチド残基からなるＣＧ部分を含む部分、ＣＦＴＲ遺伝子については配列番号３のヌクレオチド配列における１００１番目と１００２番目のヌクレオチド残基からなるＣＧ部分を含む部分を含む部分）またはその上流領域（上記で上流領域として示した任意の領域）若しくは下流領域（上記で下流領域として示した任意の領域）にハイブリダイズするように設計することができる。核酸プローブは、遊離の形態、または固相に固定された形態において用いることができる。固相としては、例えば、粒子（例、磁性粒子）；アレイ、メンブレン（例、ニトロセルロース膜、ろ紙）、カラム等の支持体；およびプレート（例、マルチウェルプレート）、チューブ等の容器が挙げられる。固相の材料としては、例えば、ガラス、プラスチック、および金属が挙げられる。核酸プローブはまた、抗メチル化シトシン抗体を用いるメチル化シトシンの解析において詳述したような核酸プローブであってもよい。
　制限酵素は、メチル化特異的または非特異的制限酵素であり、上述したような亜硫酸水素塩、プライマー、核酸プローブと適宜組み合わせて用いることができる。
　具体的には、上述したような解析手段を用いる解析方法としては、例えば、ＤＮＡメチル化シーケンス法、バイサルファイトシーケンシング法、バイサルファイト・パイロシーケンシング法、メチル化特異的ＰＣＲ法、制限酵素ランドマーク・ゲノム・スキャニング（ＲＬＧＳ）法、単一ヌクレオチド・プライマー伸長（ＳＮｕＰＥ）法、ＣｐＧアイランド・マイクロアレイ法、メチライト法、ＣＯＢＲＡ法、質量分析（マスアレイ）法、メチル化特異的制限酵素の使用、高解像度融解解析（ＨＲＭ）法、ナノポア解析法、ＩＣＯＮプローブ法、メチル化特異的ＭＬＰＡ法が挙げられる。これらの方法は、当該分野において周知である（例、特開２０１２－０９０５５５号公報、特開２０１４－０３６６７２号公報、特表２０１０－５３８６３８号公報、再表２００９／１３６５０１号公報）。
　解析はまた、抗メチル化シトシン抗体を用いて行うことができる。抗メチル化シトシン抗体を用いるメチル化シトシンの解析は、当該分野において周知である（例、ＷＯ２０１５／０２５８６２；ＷＯ２０１５／０２５８６３；ＷＯ２０１５／０２５８６４；ＷＯ２０１６／０５２３６８；特開２０１２－２３００１９号公報；ＤＮＡ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　１３，３７－４２（２００６）；Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．　２０１２，８４，７５３３－７５３８）。抗メチル化シトシン抗体は、上述したような１または２以上の解析手段と組み合わされて用いられてもよい。具体的には、このような解析手段を用いる方法としては、例えば、抗メチル化シトシン抗体、および異種核酸プローブ（例、ノーマルＲＮＡプローブ、修飾ＲＮＡプローブ）を組み合わせて用いる方法（例、ＷＯ２０１５／０２５８６２）；抗メチル化シトシン抗体、並びに固相プローブおよび捕捉プローブを組み合わせて用いる方法（例、ＷＯ２０１５／０２５８６３）；抗メチル化シトシン抗体、並びに吸収剤ポリヌクレオチドおよび捕捉プローブを組み合わせて用いる方法（例、ＷＯ２０１５／０２５８６４）；抗メチル化シトシン抗体、および修飾核酸塩基対合性異種核酸プローブを組み合わせて用いる方法（例、ＷＯ２０１６／０５２３６８）が挙げられる。抗メチル化シトシン抗体と組み合わせて用いられる核酸プローブは、本発明において解析される上記ＣｐＧサイトを含むＤＮＡ鎖ハイブリダイズして、当該ＤＮＡ鎖と核酸プローブからなる二本鎖構造部分が形成されたときに、ＣｐＧサイト中のメチルシトシン残基が核酸プローブと不対部分を形成するように（換言すれば、相補的に結合しないように）、設計されてもよい（例、ＷＯ２０１５／０２５８６２）。したがって、核酸プローブは、不対部分に対応するヌクレオチド残基として、メチルシトシン残基と相補的に結合し得るグアニン残基以外のヌクレオチド残基（例、シトシン残基、チミン残基、アデニン残基、ウラシル残基）を有していてもよい。あるいは、核酸プローブは、このような不対部分が形成されないように設計されてもよい（例、ＷＯ２０１６／０５２３６８）。
　抗メチル化シトシン抗体を用いる方法は、当該分野において公知である任意の免疫学的方法により行うことができる。具体的には、このような方法としては、例えば、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）（例、ＣＬＥＩＡ、ＥＬＩＳＡ）、蛍光免疫測定法、化学発光免疫測定法、電気化学発光免疫測定法、凝集法、免疫染色、フローサイトメトリー法、バイオレイヤー干渉法、Ｉｎ　Ｓｉｔｕ　ＰＬＡ法、化学増幅型ルミネッセンス・プロキシミティ・ホモジニアス・アッセイ、ラインブロット法、ウエスタンブロット法が挙げられる。
　本発明において解析されるメチル化率は、癌細胞における上記ＣｐＧ中のシトシン残基のメチル化の割合である。メチル化率の測定は、当該分野において周知である（例、特開２０１２－０９０５５５号公報、特開２０１４－０３６６７２号公報、特表２０１０－５３８６３８号公報、再表２００９／１３６５０１号公報）。
　本発明において解析されるメチル化率は、ＳＩＭ１遺伝子、ＣＣＤＣ１８１遺伝子、およびＣＦＴＲ遺伝子のＣｐＧサイト中のシトシン残基のメチル化率の組合せであってもよい。上記（ｄ）で示されるようなメチル化率の組合せは、これらのメチル化率の２以上（すなわち、２または３）からなる組合せであり、具体的には、ＳＩＭ１遺伝子とＣＣＤＣ１８１遺伝子の組合せ、ＳＩＭ１遺伝子およびＣＦＴＲ遺伝子の組合せ、ＣＣＤＣ１８１遺伝子およびＣＦＴＲ遺伝子の組合せ、ならびに、ＳＩＭ１遺伝子、ＣＣＤＣ１８１遺伝子、およびＣＦＴＲ遺伝子の組合せにおけるＣｐＧサイト中のシトシン残基のメチル化率である。組合せにおけるメチル化率は、例えば、組合せ中の最高メチル化率、最低メチル化率、および平均メチル化率のいずれを採用してもよいが、最高メチル化率を採用するのが好ましい。
　工程（２）において、解析されたメチル化率に基づいて、ヒト被験体由来サンプル中の乳癌細胞存在率を推定することができる。
（乳癌に対する薬物療法の効果の予測方法）
　本発明はまた、乳癌に対する薬物療法の効果の予測方法を提供する。
　乳癌に対する薬物療法としては、例えば、抗癌剤による治療が挙げられる。抗癌剤としては、例えば、微小管阻害剤、抗がん抗生物質、トポイソメラーゼ阻害剤、プラチナ製剤、アルキル化剤が挙げられる。抗癌剤はまた、分子標的薬であってもよい。このような分子標的薬としては、例えば、ＨＥＲ２阻害剤、ＥＧＦＲ阻害剤（例、ゲフィチニブ、ラパチニブ、エルロチニブ、セツキシマブ）、ｃ－ＭＥＴ阻害剤（例、ＰＨＡ－６６５７５２、ＳＵ１１２７４、ＸＬ－８８０）、ＡＬＫ阻害剤（例、ＷＨＩ－Ｐ１５４、ＴＡＥ６８４、ＰＦ－２３４１０６６）、ＰＤＧＦＲ阻害剤（例、イマチニブ、デサチニブ、ヴァラチニブ）、ｃ－ＫＩＴ阻害剤（例、スニチニブ、マシチニブ、モテサニブ）が挙げられる。
　乳癌に対する薬物療法は、乳癌のサブタイプに応じて適宜選択することができる。
　ＨＥＲ２陽性型乳癌に対する薬物療法としては、例えば、ＨＥＲ２阻害剤による治療が挙げられる。ＨＥＲ２は、上皮成長因子（ＥＧＦＲ）と同じファミリーに属する受容体型チロシンキナーゼである。ＨＥＲ２は、細胞外ドメイン、膜貫通ドメインおよびチロシンキナーゼ活性を有する細胞内ドメインが一本鎖で連結した構造を有する（例、Ｃｏｕｓｓｅｎｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８５，Ｖｏｌ．２３０，Ｎｏ．４７３０，ｐｐ．１１３２－１１３９、およびＧｅｎｅｂａｎｋアクセッション番号：ＮＰ＿００１００５８６２．１を参照）。ＨＥＲ２阻害剤としては、例えば、抗体（例、トラスツズマブ、ペルツヅマブ）、低分子有機化合物（例、ラパチニブ、ネラチニブ、アファチニブ等のＨＥＲ２チロシンキナーゼ阻害剤）、薬物結合抗体（例、Ｔ－ＤＭ１）が挙げられる。
　ルミナルＡ型乳癌に対する薬物療法としては、例えば、ホルモン療法または化学療法による治療が挙げられる。ホルモン療法としては、例えば、ＬＨ－ＲＨアゴニスト製剤、抗エストロゲン薬、黄体ホルモン薬、アロマターゼ阻害薬を用いた療法が挙げられる。化学療法としては、例えば、トポイソメラーゼ阻害薬、微小管作用薬、アルキル化薬、代謝拮抗薬を用いた療法が挙げられる。
　ルミナルＢ型乳癌に対する薬物療法としては、例えば、ホルモン療法または化学療法による治療が挙げられる。ホルモン療法としては、例えば、ＬＨ－ＲＨアゴニスト製剤、抗エストロゲン薬、黄体ホルモン薬、アロマターゼ阻害薬を用いた療法が挙げられる。化学療法としては、例えば、トポイソメラーゼ阻害薬、微小管作用薬、アルキル化薬、代謝拮抗薬を用いた療法が挙げられる。
　トリプルネガティブ型乳癌に対する薬物療法としては、例えば、化学療法による治療が挙げられる。化学療法としては、例えば、トポイソメラーゼ阻害薬、微小管作用薬、アルキル化薬、代謝拮抗薬を用いた療法が挙げられる。
　癌に対する薬物療法においては、複数の抗癌剤を併用することができる。併用される複数の抗癌剤としては、例えば、上述した２以上の抗癌剤の組み合わせ、および上述した１以上の抗癌剤と他の抗癌剤との組み合わせが挙げられる。他の抗癌剤としては、例えば、タキサン系抗癌剤（例、パクリタキセル）等の微小管阻害剤、アントラサイクリン系（例、アドリアシン）、アロマターゼ阻害剤（例、レトロゾール）が挙げられる。
　本発明の予測方法は、以下（１）～（４）を含む：
（１）ヒト被験体由来サンプルにおいて、乳癌マーカーの値を測定すること；
（２）ヒト被験体由来サンプルにおいて、以下：
　（ａ）ＳＩＭ１遺伝子のＣｐＧサイト中のシトシン残基；
　（ｂ）ＣＣＤＣ１８１遺伝子のＣｐＧサイト中のシトシン残基；　（ｃ）ＣＦＴＲ遺伝子のＣｐＧサイト中のシトシン残基；または
　（ｄ）これらの組合せ
　のメチル化率を解析すること；
（３）（１）で測定された乳癌マーカーの値を（２）で解析されたメチル化率で補正して、乳癌マーカーの補正値を計算すること；および
（４）（３）で補正された乳癌マーカーの補正値に基づいて、乳癌に対する薬物療法の効果を予測すること。
　工程（１）における乳癌マーカーは、乳癌の指標となるマーカーであり、例えば、ＤＮＡメチル化率（例、ＨＳＤ１７Ｂ４のｃｇ１５８９６３０１：非特許文献３）が挙げられる。
　工程（２）における画分マーカー遺伝子（ＳＩＭ１遺伝子、ＣＣＤＣ１８１遺伝子、またはＣＦＴＲ遺伝子）のＣｐＧサイト、ならびにメチル化率の解析手段は、上述のとおりである。
　工程（３）における乳癌マーカーの値の補正とは、ヒト被験体由来サンプル（乳癌細胞および非乳癌細胞を含むサンプル）において測定された乳癌マーカーの値に基づいて、より純粋に乳癌細胞に対応し得る乳癌マーカーの値を算出することをいう。したがって、乳癌マーカーの補正値は、例えば、下記式により求めることができる。
　乳癌マーカーの補正値＝（ヒト被験体由来サンプルにおいて測定された乳癌マーカーの値）／（ヒト被験体由来サンプル中の乳癌細胞存在率）
　工程（４）は、乳癌マーカーの値に基づいて乳癌に対する薬物療法の効果を予測する手法において、乳癌マーカーの値の代わりに乳癌マーカーの補正値を用いることにより行うことができる。乳癌マーカーの補正値を用いることにより、薬物療法の効果の高精度な予測が期待される。
（乳癌の判定方法）
　本発明はまた、乳癌の判定方法を提供する。
　乳癌の判定とは、ヒト被験体が乳癌に罹患している可能性が高いかまたは低いかを評価することをいう。
　本発明の判定方法は、以下（１）および（２）を含む：
（１）ヒト被験体由来サンプルにおいて、以下：
　（ａ）ＳＩＭ１遺伝子のＣｐＧサイト中のシトシン残基；
　（ｂ）ＣＣＤＣ１８１遺伝子のＣｐＧサイト中のシトシン残基；
　（ｃ）ＣＦＴＲ遺伝子のＣｐＧサイト中のシトシン残基；または
　（ｄ）これらの組合せ
　のメチル化率を解析すること；および
（２）（１）で解析されたメチル化率に基づいて、乳癌の罹患可能性を評価すること。
　工程（１）におけるヒト被験体由来サンプル、画分マーカー遺伝子（ＳＩＭ１遺伝子、ＣＣＤＣ１８１遺伝子、またはＣＦＴＲ遺伝子）のＣｐＧサイト、ならびにメチル化率の解析手段は、上述のとおりである。
　工程（２）において、メチル化率が基準値以上のときにヒト被験体は乳癌に罹患している可能性があり、ならびに／あるいはメチル化率が基準値より少ないときにヒト被験体は乳癌に罹患している可能性が低いと評価することができる。このような基準値としては、乳癌患者および健常人を鑑別し得るように適宜設定されたカットオフ値を利用することができる。メチル化率のカットオフ値としては、例えば、１０～３０％の範囲内にある任意の百分率の値を採用することができるが、１５～２５％の範囲内にある任意の百分率の値を採用することが好ましく、２０％がより好ましい。
（試薬およびキット）
　本発明はまた、乳癌細胞存在率の推定用試薬を提供する。
　本発明の推定用試薬は、以下：
　（ａ）ＳＩＭ１遺伝子のＣｐＧサイト中のシトシン残基；
　（ｂ）ＣＣＤＣ１８１遺伝子のＣｐＧサイト中のシトシン残基；
　（ｃ）ＣＦＴＲ遺伝子のＣｐＧサイト中のシトシン残基；または
　（ｄ）これらの組合せ
　のメチル化率の解析手段を含む。
　本発明の推定用試薬における画分マーカー遺伝子（ＳＩＭ１遺伝子、ＣＣＤＣ１８１遺伝子、またはＣＦＴＲ遺伝子）のＣｐＧサイト、ならびにメチル化率の解析手段は、上述のとおりである。
　本発明の推定用試薬は、メチル化率の解析手段を用いてヒト被験体由来サンプルにおける画分マーカー遺伝子のメチル化率を解析し、解析されたメチル化率に基づいて、ヒト被験体由来サンプル中の乳癌細胞存在率を推定するために用いることができる。
　本発明はまた、乳癌の判定用試薬を提供する。
　本発明の判定用試薬は、以下：
　（ａ）ＳＩＭ１遺伝子のＣｐＧサイト中のシトシン残基；
　（ｂ）ＣＣＤＣ１８１遺伝子のＣｐＧサイト中のシトシン残基；
　（ｃ）ＣＦＴＲ遺伝子のＣｐＧサイト中のシトシン残基；または
　（ｄ）これらの組合せ
　のメチル化率の解析手段を含む。
　本発明の判定用試薬における画分マーカー遺伝子（ＳＩＭ１遺伝子、ＣＣＤＣ１８１遺伝子、またはＣＦＴＲ遺伝子）のＣｐＧサイト、ならびにメチル化率の解析手段は、上述のとおりである。
　本発明の判定用試薬は、メチル化率の解析手段を用いてヒト被験体由来サンプルにおける画分マーカー遺伝子のメチル化率を解析し、解析されたメチル化率に基づいて、ヒト被験体の乳癌を判定するために用いることができる。
　本発明はまた、キットを提供する。
　本発明のキットは、以下（１）および（２）を含む：
（１）以下：
　（ａ）ＳＩＭ１遺伝子のＣｐＧサイト中のシトシン残基；
　（ｂ）ＣＣＤＣ１８１遺伝子のＣｐＧサイト中のシトシン残基；
　（ｃ）ＣＦＴＲ遺伝子のＣｐＧサイト中のシトシン残基；または
　（ｄ）これらの組合せ
　のメチル化率解析手段；および
（２）乳癌マーカーの測定手段。
　本発明の乳癌の判定用試薬における画分マーカー遺伝子（ＳＩＭ１遺伝子、ＣＣＤＣ１８１遺伝子、またはＣＦＴＲ遺伝子）のＣｐＧサイト、メチル化率の解析手段、ならびに乳癌マーカーの測定手段は、上述のとおりである。
　本発明のキットは、種々の用途に用いることができるが、例えば、乳癌に対する薬物療法の効果の予測するために用いることができる。
　以下、本発明を実施例により詳細に説明するが、本発明は、これらの実施例に限定されるものではない。
１．サンプル
１－１．生体由来サンプル
　乳癌患者由来サンプルとして、１９５検体の乳癌組織サンプルを１９５人の乳癌患者から取得した。各患者の乳癌組織サンプルは、乳癌と診断された患者から針生検により収集した。サンプルを、ＰＡＸ遺伝子組織システム（Ｑｉａｇｅｎ，ヒルデン，ドイツ）を用いて固定し、低融点パラフィン中に埋包した。１０枚の１０μｍ薄切切片を作成し、ＤＮＡを抽出した。同時に、サンプルの顕微鏡検査を実施し、癌細胞画分を決定した。上記の１９５検体のうち、ＨＥＲ２陽性型乳癌患者由来検体６１検体については、トラスツズマブに対する治療応答を決定し、サンプル中に癌細胞が残存しない状態を、病理学的完全奏効（ｐＣＲ）、それ以外を非完全奏功（Ｎｏｎ－ｐＣＲ）と定義した。さらに、６１個のサンプルのうち１０個のサンプルを、レーザー捕捉マイクロダイセクション（ＬＣＭ）により癌細胞および非癌細胞に分離した。
１－２．培養細胞株サンプル
　培養乳癌細胞株サンプルとして、全体で２０個の乳癌細胞株（ＢＴ－４７４、ＳＫ－ＢＲ－３、ＭＤＡ－ＭＢ－４５３、ＨＣＣ３８、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１、Ｔ－４７Ｄ、Ｈｓ　５７８Ｔ、ＭＣＦ７、ＵＡＣＣ－３１９９、ＺＲ－７５－１、ＢＴ－２０、ＭＤＡ－ＭＢ－４３６、ＨＣＣ１９３７、ＭＤＡ－ＭＢ－４６８、ＨＣＣ１４２８、ＢＴ－５４９、ＡＵ５６５、ＨＣＣ１３９５、ＭＤＡ－ＭＢ－１５７、およびＨＣＣ１９５４）を、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションから購入した（ロックビル，ＭＤ）。
　培養通常細胞株サンプルとして、ヒト乳房上皮細胞（ＨＭＥＣｓ）を、Ｃａｍｂｒｅｘ（イーストラザフォード，ＮＬ）から購入した。
２．画分マーカーのＤＮＡメチル化レベルの測定
２－１．ＤＮＡメチル化レベルの測定方法
　ゲノム特異的ＤＮＡメチル化レベルは、バイサルファイト・パイロシーケンシングにより解析した。バイサルファイト・パイロシーケンシングは、具体的には、以下の手順により行った。ゲノムＤＮＡをＢａｍＨＩで消化し、１μｇのＢａｍＨＩ消化ゲノムＤＮＡを、既報（Ｙａｍａｓｈｉｔａ　Ｓ，　Ｔａｋａｈａｓｈｉ　Ｓ，　ＭｃＤｏｎｅｌｌ　Ｎ，　Ｗａｔａｎａｂｅ　Ｎ，　Ｎｉｗａ　Ｔ，　Ｈｏｓｏｙａ　Ｋ　ｅｔ　ａｌ．　Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ　ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ　ｏｆ　ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ－ｂｅｔａ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ　ｔｙｐｅ　ＩＩ　ｉｎ　ｒａｔ　ｐｒｏｓｔａｔｅ　ｃａｎｃｅｒｓ．　Ｃａｎｃｅｒ　ｒｅｓｅａｒｃｈ．　２００８；６８（７）：２１１２－２１）のとおりバイサルファイト修飾に供した。バイサルファイト修飾ＤＮＡを４０μｌのＴＥ緩衝液中に懸濁し、１μｌのアリコートを、既報（Ｙｏｓｈｉｄａ　Ｔ，　Ｙａｍａｓｈｉｔａ　Ｓ，　Ｔａｋａｍｕｒａ－Ｅｎｙａ　Ｔ，　Ｎｉｗａ　Ｔ，　Ａｎｄｏ　Ｔ，　Ｅｎｏｍｏｔｏ　Ｓ　ｅｔ　ａｌ．　Ａｌｕ　ａｎｄ　Ｓａｔａｌｐｈａ　ｈｙｐｏｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ　ｉｎ　Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ　ｐｙｌｏｒｉ－ｉｎｆｅｃｔｅｄ　ｇａｓｔｒｉｃ　ｍｕｃｏｓａｅ．　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　ｃａｎｃｅｒ．　２０１１；１２８（１）：３３－９）のとおりバイサルファイトシーケンシングに供した。標的ゲノム領域を、ビオチニル化プライマーにより増幅した。ビオチン標識ＰＣＲ産物を、０．２μＭパイロシーケンシング・プライマーに対してアニールさせ、バイロシーケンシングを、ＰＳＱ　９６パイロシーケンシング・システム（ＱＩＡＧＥＮ，バレンシア，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いて行った。メチル化レベルは、ＰＳＱアッセイ・デザイン・ソフトウェア（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて取得した。
２－２．画分マーカーのメチル化レベルの解析
２－２－１．画分マーカーのスクリーニング
　常染色体および性染色体中の４７７，３４４のＣｐＧサイトより、１－２で調製した培養通常細胞株(非癌細胞)でメチル化率が低く、培養乳癌細胞株でメチル化率の高いＣｐＧサイトを探索し、３つのＣｐＧサイトを画分マーカーとして見出した。各ＣｐＧサイトの詳細を表１に示す。
２－２－２．画分マーカーによる乳癌評価と病理による癌細胞含有率との相関
　画分マーカーの乳癌評価の正確性を判定するために、ＨＥＲ２陽性型乳癌サンプル５１検体（ＣＦＴＲについては３３検体）について、各画分マーカー（ＳＩＭ１、ＣＣＤＣ１８１、およびＣＦＴＲ）、およびこれらの組み合わせにより評価される癌細胞画分と、顕微鏡検査により評価された癌細胞含有率との間の相関を判定した。画分マーカーを組み合わせる場合は、３つのマーカーの最高メチル化率を採用した。結果を図１～３に示す。画分マーカーにより評価された癌細胞画分および病理による癌細胞含有率の間で有意な相関を確認した（Ｒ＝０．３８～０．７７）。したがって、これらの画分マーカーは、乳癌細胞画分を評価することができるマーカーであると考えられた。
３．乳癌細胞画分によるＨＳＤ１７Ｂ４メチル化レベルの補正
３－１．乳癌マーカーの値の測定
　上記１－１でｐＣＲとＮｏｎ－ｐＣＲを判定したＨＥＲ２陽性型乳癌サンプル６１検体について、ＨＳＤ１７Ｂ４遺伝子のメチル化レベルを測定した。ＨＳＤ１７Ｂ４メチル化レベルは、上記２－１にしたがってバイサルファイト・パイロシーケンシングにより測定した（非特許文献３参照）。
３－２．乳癌マーカーの値の補正
　上記３－１で測定したＨＳＤ１７Ｂ４のメチル化レベルを、画分マーカーにより、または顕微鏡検査により評価された乳癌細胞画分により、以下のとおり補正した：［補正ＨＳＤ１７Ｂ４メチル化レベル＝１００×（ＨＳＤ１７Ｂ４メチル化レベル）／（癌細胞画分）］。
３－３．統計解析
　相関解析は、ピアソンの積率相関係数を用いて行った。トラスツズマブ応答者（ｐＣＲ）と非応答者（Ｎｏｎ－ｐＣＲ）との間のＨＳＤ１７Ｂ４の補正メチル化レベルにおける差異を、マン－ホイットニーＵ検定により評価した。全ての解析は、ＰＡＳＷ統計バージョン１８．０（ＳＰＳＳ　Ｊａｐａｎ　Ｉｎｃ．，東京，日本）を用いて行い、両側ｐ値＜０．０５を、統計学的に有意とみなした。
３－４．ＨＳＤ１７Ｂ４メチル化レベルの補正に対する癌細胞画分マーカーの応用
　癌細胞画分を評価することにより癌細胞がＨＳＤ１７Ｂ４メチル化レベルをどの程度補正できるか評価した。メチル化の生データに基づくと、ｐＣＲおよびＮｏｎ－ｐＣＲ試料間において、ＨＳＤ１７Ｂ４メチル化レベルにおいて如何なる有意な差異も認められなかった（ｐ＝０．２４５）（図４）。対照的に、補正後では、メチル化レベルは、Ｎｏｎ－ｐＣＲ試料よりもｐＣＲ試料において有意により高かった（顕微鏡検査：ｐ＝０．０００１；画分マーカー：ｐ＝０．０００４）。ｐＣＲを予測する感度および特異性（表２）に関しては、補正前はそれぞれ１３．６％および９４．９％であった。ＤＮＡメチル化マーカーによる補正後の感度および特異性（５９．１％および８４．６％）は、顕微鏡検査により補正されたもの（５９．１％および８７．２％）と同等であった。表２において、ＨＳＤ１７Ｂ４メチル化レベルを既報（前述のＦｕｊｉｉ　Ｓ　ｅｔ　ａｌ．）に基づくカットオフ値（５０％）を用いて高レベルおよび低レベルに分類した。ｐＣＲは、病理学的完全奏効を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
４．各サブタイプの乳癌への適用性の評価
　１－１でｐＣＲ／Ｎｏｎ－ｐＣＲ判定を行った６１検体を除く、１３４検体の乳癌サンプル（ＨＥＲ２陽性型、ルミナルＡ型、ルミナルＢ型、およびトリプルネガティブ型）について、非癌細胞も混入した状態で画分マーカー（ＳＩＭ１、ＣＣＤＣ１８１、およびＣＦＴＲ）メチル化率を測定した。メチル化率２０％をカットオフとして、３つのマーカーのいずれかがカットオフ以上のメチル化率を示した検体を「陽性」と判定した。結果を表３に示す。表３中、ＨＥＲ２はＨＥＲ２陽性型、ＴＮＢＣはトリプルネガティブ型を表す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　上記の結果において、各乳癌サブタイプにおいて、ＳＩＭ１、ＣＣＤＣ１８１、ＣＦＴＲ、およびこれらの組み合わせについてメチル化率（組み合わせの場合は最高メチル化率）が２０％を超えるものを陽性と判定した場合、各画分マーカーおよび乳癌判定率（メチル化陽性の乳癌患者の割合)は下記表４に示すとおりとなった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
　いずれの画分マーカー、いずれの組み合わせにおいても高い乳癌判定率（メチル化陽性の乳癌患者の割合）を示した。特に２種類以上の画分マーカーを組み合わせることで、高い確率で乳癌を判定し得ることが示唆された。
　配列番号１は、ＳＩＭ１遺伝子のメチル化レベル測定ＣｐＧサイト（１０００および１００１番目のヌクレオチド残基）前後１０００ｂｐのゲノム領域の塩基配列を示す。
　配列番号２は、ＣＣＤＣ１８１遺伝子のメチル化レベル測定ＣｐＧサイト（１０００および１００１番目のヌクレオチド残基）前後１０００ｂｐのゲノム領域の塩基配列を示す。
　配列番号３は、ＣＦＴＲ遺伝子のメチル化レベル測定ＣｐＧサイト（１００１および１００２番目のヌクレオチド残基）前後１０００ｂｐのゲノム領域の塩基配列を示す。
　配列番号４～６はそれぞれ、ＳＩＭ１遺伝子のＣｐＧサイトのメチル化レベル測定用フォワードプライマー、リバースプライマー、およびシークエンシングプライマーの塩基配列を示す。
　配列番号７～９はそれぞれ、ＣＣＤＣ１８１遺伝子のＣｐＧサイトのメチル化レベル測定用フォワードプライマー、リバースプライマー、およびシークエンシングプライマーの塩基配列を示す。
　配列番号１０～１２はそれぞれ、ＣＦＴＲ遺伝子のＣｐＧサイトのメチル化レベル測定用フォワードプライマー、リバースプライマー、およびシークエンシングプライマーの塩基配列を示す。

Claims (8)

  1. 　以下（１）および（２）を含む、乳癌細胞存在率の推定方法：
    （１）ヒト被験体由来サンプルにおいて、以下：
    　（ａ）配列番号１のヌクレオチド配列における１０００番目と１００１番目のヌクレオチドからなるＣＧ部分中のシトシン残基；
    　（ｂ）配列番号２のヌクレオチド配列における１０００番目と１００１番目のヌクレオチドからなるＣＧ部分中のシトシン残基；
    　（ｃ）配列番号３のヌクレオチド配列における１００１番目と１００２番目のヌクレオチドからなるＣＧ部分中のシトシン残基；または
    　（ｄ）これらの組合せ
    　のメチル化率を解析すること；および
    （２）（１）で解析されたメチル化率に基づいて、ヒト被験体由来サンプル中の乳癌細胞存在率を推定すること。
  2. 　解析が、亜硫酸水素塩、１以上のプライマー、１以上の核酸プローブ、制限酵素、抗メチル化シトシン抗体、およびナノポアからなる群より選ばれる１または２以上の手段を用いて行われる、請求項１に記載の方法。
  3. 　解析が、バイサルファイトシーケンシング法、バイサルファイト・パイロシーケンシング法、メチル化特異的ＰＣＲ法、制限酵素ランドマーク・ゲノム・スキャニング（ＲＬＧＳ）法、単一ヌクレオチド・プライマー伸長（ＳＮｕＰＥ）法、ＣｐＧアイランド・マイクロアレイ法、メチライト法、ＣＯＢＲＡ法、質量分析（マスアレイ）法、メチル化特異的制限酵素の使用、高解像度融解解析（ＨＲＭ）法、ナノポア解析法、ＩＣＯＮプローブ法、メチル化特異的ＭＬＰＡ法、またはイムノアッセイにより行われる、請求項１または２に記載の方法。
  4. 　以下（１）～（４）を含む、乳癌に対する薬物療法の効果の予測方法：
    （１）ヒト被験体由来サンプルにおいて、乳癌マーカーの値を測定すること；
    （２）ヒト被験体由来サンプルにおいて、以下：
    　（ａ）配列番号１のヌクレオチド配列における１０００番目と１００１番目のヌクレオチドからなるＣＧ部分中のシトシン残基；
    　（ｂ）配列番号２のヌクレオチド配列における１０００番目と１００１番目のヌクレオチドからなるＣＧ部分中のシトシン残基；
    　（ｃ）配列番号３のヌクレオチド配列における１００１番目と１００２番目のヌクレオチドからなるＣＧ部分中のシトシン残基；または
    　（ｄ）これらの組合せ
    　のメチル化率を解析すること；
    （３）（１）で測定された乳癌マーカーの値を（２）で解析されたメチル化率で補正して、乳癌マーカーの補正値を計算すること；および
    （４）（３）で補正された乳癌マーカーの補正値に基づいて、乳癌に対する薬物療法の効果を予測すること。
  5. 　以下（１）および（２）を含む、乳癌の判定方法：
    （１）ヒト被験体由来サンプルにおいて、以下：
    　（ａ）配列番号１のヌクレオチド配列における１０００番目と１００１番目のヌクレオチドからなるＣＧ部分中のシトシン残基；
    　（ｂ）配列番号２のヌクレオチド配列における１０００番目と１００１番目のヌクレオチドからなるＣＧ部分中のシトシン残基；
    　（ｃ）配列番号３のヌクレオチド配列における１００１番目と１００２番目のヌクレオチドからなるＣＧ部分中のシトシン残基；または
    　（ｄ）これらの組合せ
    　のメチル化率を解析すること；および
    （２）（１）で解析されたメチル化率に基づいて、乳癌の罹患可能性を評価すること。
  6. 　以下：
    　（ａ）配列番号１のヌクレオチド配列における１０００番目と１００１番目のヌクレオチドからなるＣＧ部分中のシトシン残基；
    　（ｂ）配列番号２のヌクレオチド配列における１０００番目と１００１番目のヌクレオチドからなるＣＧ部分中のシトシン残基；
    　（ｃ）配列番号３のヌクレオチド配列における１００１番目と１００２番目のヌクレオチドからなるＣＧ部分中のシトシン残基；または
    　（ｄ）これらの組合せ
    　のメチル化率の解析手段を含む、乳癌細胞存在率の推定用試薬。
  7. 　以下：
    　（ａ）配列番号１のヌクレオチド配列における１０００番目と１００１番目のヌクレオチドからなるＣＧ部分中のシトシン残基；
    　（ｂ）配列番号２のヌクレオチド配列における１０００番目と１００１番目のヌクレオチドからなるＣＧ部分中のシトシン残基；
    　（ｃ）配列番号３のヌクレオチド配列における１００１番目と１００２番目のヌクレオチドからなるＣＧ部分中のシトシン残基；または
    　（ｄ）これらの組合せ
    　のメチル化率の解析手段を含む、乳癌の判定用試薬。
  8. 　以下（１）および（２）を含むキット：
    （１）以下：
    　（ａ）配列番号１のヌクレオチド配列における１０００番目と１００１番目のヌクレオチドからなるＣＧ部分中のシトシン残基；
    　（ｂ）配列番号２のヌクレオチド配列における１０００番目と１００１番目のヌクレオチドからなるＣＧ部分中のシトシン残基；
    　（ｃ）配列番号３のヌクレオチド配列における１００１番目と１００２番目のヌクレオチドからなるＣＧ部分中のシトシン残基；または
    　（ｄ）これらの組合せ
    　のメチル化率解析手段；および
    （２）乳癌マーカーの測定手段。
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