CN117538544A - 检测基因Ccdc181表达量的试剂在制备精子异常诊断产品中的应用 - Google Patents
检测基因Ccdc181表达量的试剂在制备精子异常诊断产品中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本申请属于生物医学技术领域，具体涉及一种检测检测基因Ccdc181表达量的试剂在诊断生育缺陷中的应用。本申请通过建立Ccdc181基因突变敲入的小鼠模型，通过免疫荧光以及电镜观察精子发育过程中中心粒、轴丝以及轴丝旁结构的变化，确认这一突变对小鼠精子发育时期和精细结构（前端小头，条纹柱，近端中心粒，远端中心粒、轴丝和致密纤维鞘）的影响，进一步明确Ccdc181在精子发育中的重要作用。基于该发现，本申请通过将检测基因Ccdc181表达量的试剂用于制备生育缺陷诊断产品，以及促进基因Ccdc181表达量的试剂、基因Ccdc181的转录产物或基因Ccdc181的表达产物用于制备治疗精子异常药物。
Description
技术领域
本申请属于生物医学技术领域，具体涉及一种检测基因Ccdc181表达量的试剂在制备精子异常诊断产品中的应用。
背景技术
不孕不育症已经成为继心血管病和肿瘤后的困扰人类健康的三大因素之一，约五分之一的成年人受到不孕不育症的困扰。男性不育症发生率为10%左右。其中单纯女方因素约为50%，单纯男方因素约为30%，男女共有约20%。临床上把男性不育分为性功能障碍和性功能正常两类，后者依据精液分析结果可进一步分为无精子症、少精子症、弱精子症、精子无力症和精子数正常性不育。弱畸精子症是目前男性不育的常见病因。虽然已找到部分男性弱畸精子症的病因，但是大多数弱畸精子症的病因还不明确。
既往的遗传学研究表明，中心体和纤毛相关蛋白的功能缺陷是导致人类和小鼠弱畸精子症的重要原因。随着高通量测序技术的不断发展，越来越多的研究表明中心粒蛋白与精子发育密切相关，然而中心粒蛋白参与精子发育的分子机制还有诸多问题尚未阐明。
目前，暂未有研究表明基因Ccdc181与能够用于制备精子异常诊断产品。
发明内容
基于此，本申请一个实施例提供一种检测基因Ccdc181表达量的试剂在诊断精子异常中的应用。
本申请一方面提供检测Ccdc181基因表达量的试剂在制备精子异常诊断产品中的应用。
在其中一个实施例中，所述基因Ccdc181表达量的试剂包括检测基因Ccdc181蛋白表达量的试剂和mRNA表达量的试剂中的一种或两种 。
本申请另一方面还提供促进Ccdc181基因表达量的试剂、Ccdc181基因的转录产物或基因Ccdc181的表达产物在制备治疗精子异常药物中的应用。
在其中一个实施例中，所述药物包括活性成分及药学上可以接受的辅料；
在其中一个实施例中，所述辅料选自稀释剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂和湿润剂中的一种或多种。
在其中一个实施例中，所述药物的剂型为片剂、胶囊、颗粒、丸剂、注射剂和缓释制剂中的一种或多种。
在其中一个实施例中，所述精子异常包括弱畸精子症、无精子症、少精子症和精子无力症中的一种或多种。
本申请还提供一种治疗精子异常的药物，其活性成分包括促进基因Ccdc181表达量的试剂、促进基因Ccdc181的转录产物或基因Ccdc181表达产物的试剂中的一种或两种。
本申请另一方面还提供一种检测精子异常的试剂盒，所述试剂盒包括检测基因Ccdc181表达量的试剂。
在其中一个实施例中，所述试剂盒还包括检测基因Ccdc181蛋白表达量的试剂和mRNA表达量的试剂中的一种或两种。
在其中一个实施例中，所述试剂盒还包括阴性对照和阳性对照中的一种或两种。
相对于传统技术，本申请的有益效果包括：
本申请通过建立Ccdc181基因突变敲入的小鼠模型，通过免疫荧光以及电镜观察精子发育过程中中心粒、轴丝以及轴丝旁结构的变化，确认这一突变对小鼠精子发育时期和精细结构（前端小头，条纹柱，近端中心粒，远端中心粒、轴丝和致密纤维鞘）的影响，进一步明确Ccdc181在精子发育中的重要作用。
基于该发现，本申请通过将检测基因Ccdc181表达量的试剂用于制备生育缺陷诊断产品，以及促进基因Ccdc181表达量的试剂、基因Ccdc181的转录产物或基因Ccdc181的表达产物的试剂用于制备治疗精子异常药物。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例中的技术方案、更完整地理解本申请及其有益效果，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单的介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请的一些实施例，对本领域技术人员来说，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为Ccdc181在特化的中心粒中的精细定位，以及在精细胞中不同时期的定位变化；
图2为Ccdc181基因敲除小鼠精子整体结构观察；
图3为小鼠睾丸不同阶段生精上皮细胞的发育形态学观察；
图4为弱畸精子症患者中Ccdc181基因发生突变的WES测序结果；
图5为Ccdc181基因敲除雄性小鼠生殖异常；
图6为染色检测Ccdc181基因敲除雄性小鼠精子发生情况；
图7为PAS 染色检测Ccdc181基因敲除雄性小鼠生精小管中精子发生分期情况；
图8为利用抗CCDC181和抗中心体标志蛋白γ-tubulin的抗体对hTERT-RPE1细胞进行免疫荧光双标记；
其中，Uncoding region为未编码基因；Coding region为编码基因；Homo sapiens为智人；Wild-type allele为野生型等位基因；KO allele为基因敲除等位基因；Averagelitter size为平均产仔数；Body weight为体重；Testis weight为睾丸重量；rSt为roundspermatid，圆形精子；P为pachytene，粗线期；L为leptotene，细线期；M为Meiosis减数分裂。
具体实施方式
下面结合实施方式和实施例，对本申请作进一步详细的说明。应理解，这些实施方式和实施例仅用于说明本申请而不用于限制本申请的范围，提供这些实施方式和实施例的目的是使对本申请公开内容理解更加透彻全面。还应理解，本申请可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施方式和实施例，本领域技术人员可以在不违背本申请内涵的情况下作各种改动或修改，得到的等价形式同样落于本申请的保护范围。此外，在下文的描述中，给出了大量具体的细节以便提供对本申请更为充分地理解，应理解，本申请可以无需一个或多个这些细节而得以实施。
除非另有定义，本申请所使用的所有的技术和科学术语与属于本申请的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。
在本申请提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。除非与本申请的申请目的和/或技术方案相冲突，否则，本申请涉及的引用文献以全部内容、全部目的被引用。本申请中涉及引用文献时，相关技术特征、术语、名词、短语等在引用文献中的定义也一并被引用。本申请中涉及引用文献时，被引用的相关技术特征的举例、优选方式也可作为参考纳入本申请中，但以能够实施本申请为限。应当理解，当引用内容与本申请中的描述相冲突时，以本申请为准或者适应性地根据本申请的描述进行修正。
术语“Phos-tag”即Phos-tag SDS-PAGE是一种磷酸亲和电泳技术，可使用常规SDS-PAGE程序分离磷酸化和非磷酸化蛋白质。该技术使用分离凝胶，其中丙烯酰胺与作为磷酸捕获分子的Phos-tag Acrylamide共聚。试剂、蛋白质样品制备和电泳操作与常规SDS-PAGE程序相似。由于磷酸化蛋白质在电泳过程中与固定在凝胶中的Phos-tag表现出可逆结合，因此它们的迁移速度比非磷酸化蛋白质的迁移速度更慢，从而导致磷酸化蛋白质的迁移率存在可检测的差异。
本申请一方面提供检测基因Ccdc181表达量的试剂在制备精子异常诊断产品中的应用。
在一个具体的示例中，检测基因Ccdc181的试剂检测基因Ccdc181蛋白表达量的试剂和mRNA表达量的试剂中的一种或多种。
可选地，所述检测蛋白表达量的试剂包括以下方法中使用的试剂：蛋白质印迹、酶联免疫吸附测定、放射性免疫测定、夹心测定、免疫组织化学染色、质谱法、免疫沉淀分析法、补体结合分析法、流式细胞荧光分边技术和蛋白质芯片法。
在一个具体的示例中，所述检测mRNA表达量的试剂包括以下方法中使用的试剂：基于PCR的检测方法、Southern杂交方法、Northern杂交方法、点杂交方法、荧光原位杂交方法、DNA微阵列方法、ASO法和高通量测序平台方法中使用的试剂。
所述mRNA表达量辅助检测试剂包括但不限于：使所述引物对应的扩增子可视化的反应试剂，例如通过琼脂糖凝胶电泳法、酶联凝胶法、化学发光法、原位杂交法、荧光检测法等使扩增子可视化的试剂，RNA提取试剂，逆转录试剂，cDNA扩增试剂，制备标准曲线所用的标准品，阳性对照品，阴性对照品。
可选地，所述蛋白表达量辅助检测试剂包括但不限于：封闭液，抗体稀释液，洗涤缓冲液，显色终止液，制备标准曲线的标准品。
在一个具体的示例中，所述检测蛋白表达量的试剂包括以下方法中使用的试剂：蛋白质印迹、酶联免疫吸附测定、放射性免疫测定、夹心测定、免疫组织化学染色、质谱法、免疫沉淀分析法、补体结合分析法、流式细胞荧光分边技术和蛋白质芯片法。
本申请还提供促进基因Ccdc181表达量的试剂、基因Ccdc181的转录产物或基因Ccdc181的表达产物的试剂在制备治疗精子异常药物中的应用。
可选地，所述精子异常包括弱畸精子症、无精子症、少精子症和精子无力症中的一种或多种。
本申请还提供一种治疗精子异常的药物，其活性成分包括促进基因Ccdc181表达量的试剂、促进基因Ccdc181的转录产物或基因Ccdc181表达产物的试剂和促进基因Ccdc181活性的试剂中的一种或多种。
可以理解的是，本申请研究发现将在细胞水平和个体水平进一步明确中心粒蛋白Ccdc181在精子发生中的调控机制，深入了解中心粒在弱畸精子症中的重要作用。本项目的实施将进一步明确中心粒蛋白在精子发生中的重要作用，为弱畸精子症患者的诊疗提供新的思路和理论依据。
例如，明确中心粒蛋白Ccdc181在精子发育过程中例如精粒转变过程中、精子轴丝生长过程中的作用及其调控机制以及明确中心粒蛋白Ccdc181与临床弱畸精子发生发展的关系，并为临床诊疗提供可能的新靶点。
在一个具体的示例中，还包括药学上可以接受的辅料。
可选地，所述药物的剂型为片剂、胶囊、颗粒、丸剂、注射剂和缓释制剂中的一种或多种。
进一步可选地，所述药学上可接受的辅料选自稀释剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂和湿润剂中的一种或多种。
其中，所述稀释剂选自淀粉、糊精、蔗糖、葡萄糖、乳糖、甘露醇、山梨醇、木糖醇、微晶纤维素、硫酸钙、磷酸氢钙及碳酸钙中的至少一种。
所述粘合剂选自淀粉浆、糊精、糖浆、蜂蜜、葡萄糖溶液、微晶纤维素、阿拉伯胶浆、明胶浆、羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、乙基纤维素、丙烯酸树脂、卡波姆、聚乙烯吡咯烷酮和聚乙二醇中的至少一种。
所述崩解剂选自淀粉、微晶纤维素、低取代羟丙基纤维素、交联聚乙烯吡咯烷酮、交联羧甲基纤维素钠、羧甲基淀粉钠、聚氧乙烯、山梨糖醇、脂肪酸酯和十二烷基磺酸钠中的至少一种。
其中，所述润滑剂选自滑石粉、二氧化硅、硬脂酸盐、酒石酸、液体石蜡和聚乙二醇中的至少一种。
其中，所述湿润剂选自是水、乙醇及异丙醇中的至少一种。
可选地，所述药物为注射剂，所述药学上可接受的辅料选自增溶剂、pH调节剂及渗透压调节剂中的至少一种。
进一步可选地，所述增溶剂选自乙醇、异丙醇、丙二醇、聚乙二醇、泊洛沙姆、卵磷脂和羟丙基-β-环糊精中的至少一种。
可选地，所述pH调节剂选自柠檬酸盐、磷酸盐、碳酸盐、醋酸盐、盐酸和氢氧化物中的至少一种。
其中，所述渗透压调节剂选自氯化钠、甘露醇、葡萄糖、磷酸盐、柠檬酸盐和醋酸盐中的至少一种。本申请还提供一种检测精子异常的试剂盒，所述试剂盒包括检测基因Ccdc181表达量的试剂。
可选地，所述试剂盒还包括检测基因Ccdc181活性的试剂、检测基因Ccdc181蛋白表达量的试剂和mRNA表达量的试剂中的一种或多种。
进一步可选地，所述试剂盒还包括阴性对照和阳性对照中的一种或两种。
下面将结合实施例对本申请的实施方案进行详细描述。应理解，这些实施例仅用于说明本申请而不用于限制本申请的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，优先参考本申请中给出的指引，还可以按照本领域的实验手册或常规条件，还可以按照制造厂商所建议的条件，或者参考本领域已知的实验方法。
下述的具体实施例中，涉及原料组分的量度参数，如无特别说明，可能存在称量精度范围内的细微偏差。涉及温度和时间参数，允许仪器测试精度或操作精度导致的可接受的偏差。
实施例1
一、Ccdc181在精细胞和精子中的定位
1、精子获取：无菌采取分离睾丸、附睾及输精管。在含培养液的表玻皿中，用眼科剪除去睾丸、附睾及输精管周围的系膜及脂肪，并冲洗干净，避免后期影响精子观察。用眼科剪进一步分离出睾丸、附睾尾及附带的小段输精管、其余部分的输精管三部分，弃去附睾头。
采集睾丸精子时，将睾丸横切为若干段或组织块，在表面皿中，加1mL培养液，用眼科镊子轻轻挤压睾丸组织块，把精子挤入培养液中，去掉组织块。于37℃、5%CO2、饱和湿度条件下孵育20分钟，使精子自行散开；采集附睾尾精子时，将其剪成几段，用眼科镊子轻轻挤压附睾和输精管，把精子挤入培养液中，去掉附睾和输精管。
再于37℃、5%CO2、饱和湿度条件下孵育20分钟，使精子自行散开；采集输精管精子时，将输精管放入含有1mL培养液的表面皿内，在实体显微镜下撕开输精管，精子会浮游到稀释液中，将大块输精管组织拨开，用吸管连同精子吸出液体部分。
2、中心粒定位：将多种精细胞和精子中存在的中心体Marker例如中心粒远端蛋白Centrin1/2、中心粒近端蛋白Rootletin、中心体PCM蛋白γ-tubulin等与CCDC181进行共标记，利用3D-SIM（Structured Illumination Microscopy）超高分辨显微技术确定Ccdc181在特化的中心粒中的精细定位，以及在精细胞中不同时期的定位变化，如图1所示。
3、精子鞭毛的定位：将鞭毛轴丝marker乙酰化微管（acetylated microtubules）以及鞭毛膜蛋白的marker和Ccdc181进行免疫荧光标记，利用共聚焦显微技术和3D-SIM超高分辨显微技术确定Ccdc181定位于鞭毛轴丝还是鞭毛膜结构，明确Ccdc181在精子鞭毛中的精细定位。
二、Ccdc181对精子发育的影响
1、Ccdc181基因敲除小鼠的制作
利用CRISPR/Cas9系统进行Ccdc181基因敲除小鼠制作，首先在小鼠B16细胞中检测gRNA的识别效率。分别设计构建了含有gRNA的质粒，并与带有Cas9mRNA的质粒和带有puromycin抗性的质粒转染进入B16细胞。转染24小时后在细胞中加入puromycin进行细胞筛选，待细胞长出后提取基因组进行测序，观察是否出现有基因编辑。
使用带有T7启动子的引物将T7启动子插入gRNA序列前端，再使用体外转录试剂盒将带有T7启动子的gRNA序列体外转录。随后利用酶切将带有Cas9mRNA的质粒线性化后再利用体外转录试剂盒再体外转录出Cas9mRNA。最后将Cas9mRNA和gRNA混合注入小鼠的受精卵。小鼠出生后，使用琼脂糖凝聚电泳以及免疫印迹法分别对小鼠的基因型和Ccdc181的蛋白水平进行检测。
2、Ccdc181敲除小鼠生殖力检测
雌性小鼠生殖力检测：6周龄实验组和对照组雌性小鼠各12只按照♂（雄性）:♀（雌性）=1:1配生育力检测笼，雄性小鼠选用8～10周龄C57BL／6J品系雄性小鼠；雄性小鼠生殖力检测：12周龄实验组和对照组雄性小鼠各12只，按照♂:♀=1:2配生育力检测笼，雌性小鼠选用8～10周龄C57BL／6J品系小鼠。
将上述两个组小鼠合笼后，每天早上10点钟之前到动物房，对实验组和对照组雌性小鼠检测阴道内是否有阴道栓，以验证是否有交配行为。记录见栓情况，包括合笼几天见栓，以及阴道栓的颜色和大小。见栓后，将雌性小鼠编号取出，18天后记录是否产仔以及产仔数目，实验完毕后，统计分析实验结果。
3、Ccdc181基因敲除小鼠精子整体结构观察
取1小滴保存精液在载玻片上，将样品滴以拉的形式制成抹片。用0.5%龙胆紫酒精染色3min,自然干燥、水洗后镜检。镜下可观察到大多数为结构正常的精子，部分为畸形精子，如头部畸形（如头部巨大、瘦小、细长、圆形、轮廓不明显、皱缩、缺损、双头等），颈部畸形（颈部膨大、纤细、屈折、不全、双颈等），尾部中段畸形（膨大、纤细、弯曲、屈折、不全、双体等），尾部主段畸形（弯曲、屈折、回旋、短小、长大、双尾等）分类计数。有的精子尾部发育未完成，为未成熟精子，可视为畸形精子，如图2所示。
4、小鼠睾丸不同阶段生精上皮细胞的发育形态学观察
组织形态学观察睾丸用Boutin’s液固定，常规脱水、透明、浸蜡、石蜡包埋，制成5μm厚切片，进行常规PAS（PeriodicAcid-Schiff）染色，并用苏木素复染，以分析完整的曲细精管形态，中性树胶封片，光镜下观察。根据生精细胞12个阶段的典型形态特征，判定小鼠精子发育是否正常以及出现发育问题的精确分期，如图3所示。
实施例2
一、男性弱畸精子症患者中心体基因Ccdc181发生突变
为寻找男性弱畸精子症患者中新的致病基因，本项目首先招募了来自于不同家庭的男性不孕不育患者，排除生殖道梗阻、激素紊乱、药物服用治疗、全身性疾病以及吸烟酗酒等因素导致的男性不孕不育，并通过临床诊断确定非梗阻性弱畸精子症患者作为研究对象。
通过患者血液全外显子组测序（Whole Exome Sequencing，WES）技术寻找新的弱畸精子症患者的致病基因。WES测序结果发现在一例弱畸精子症患者中，CCDC181第6个外显子上第1457位的碱基发生突变（exon6:c.G1457A），第486的精氨酸（R）变为组氨酸（H），不同物种间的蛋白质同源性比对发现这一氨基酸在不同物种间高度保守，猜测CCDC181这一突变可能对于CCDC181结构功能以及精子发生有着重要的影响。
具体如图4所示：一例弱畸精子症患者中CCDC181基因发生突变，WES测序结果发现在一例弱畸精子症患者中，CCDC181第6个外显子上第1457位的碱基发生突变（exon6:c.G1457A），第486的精氨酸（R）变为组氨酸（H），蛋白质序列同源性比对发现这一氨基酸在不同物种间高度保守。
二、Ccdc181基因敲除雄性小鼠生殖异常
通过CRISPER/Cas9小鼠将Ccdc181第三第四第五个外显子敲除，获取Ccdc181基因敲除小鼠模型。PCR结果显示Ccdc181KO小鼠的条带显著减小。为了进一步验证Ccdc181KO小鼠的敲除效率，通过提取野生型小鼠和Ccdc181KO小鼠的睾丸蛋白，应用免疫印记实验检测敲除小鼠的蛋白水平。
结果显示野生型小鼠存在CCDC181蛋白，Ccdc181KO小鼠缺失此条带，证实成功制备了Ccdc181KO小鼠。
紧接着对Ccdc181KO小鼠的生殖力进行测试，分别将野生型或者Ccdc181KO成年雌鼠与成年野生型雄鼠合笼，与野生型成年雌鼠相比，Ccdc181KO成年雌鼠未发现明显的产仔异常，提示Ccdc181KO雌鼠生殖力正常；类似的分别将野生型或者Ccdc181KO成年雄鼠与成年野生型雌鼠合笼。生殖力测试实验表明与野生型雄鼠交配的雌鼠每窝产仔数平均值约为7.5只，而与Ccdc181KO雄鼠合笼的雌鼠未见小仔出生，提示Ccdc181KO雄鼠不育。
具体引物序列如下：
F1：TGCCTGGGATGTTGACTAAGATG（SEQ ID NO.1）
R1：AGCTGACAACTTGCTTGGCTTG（SEQ ID NO.2）
F2：GCTTCTTCAGACTCAAGAGCCTG（SEQ ID NO.3）
R2：GCAACTGGGAGGATTCATGTTC（SEQ ID NO.4）
具体如图5所示：Ccdc181基因敲除雄性小鼠生殖异常。其中，图5中的A为利用CRISPER/Cas9系统构建Ccdc181基因敲除小鼠的策略。图5中的B为PCR检测基因组水平Ccdc181基因敲除效率。图5中的C为免疫印迹实验检测野生型和Ccdc181基因敲除小鼠睾丸组织中Ccdc181的蛋白水平，Tubulin作为内参。图5中的D为野生型以及杂合纯合Ccdc181基因敲除雄性小鼠生殖力检测。图5中的E为野生型以及纯合Ccdc181基因敲除雄性小鼠体重、图5中的F为睾丸重量以及图5中的G为睾丸体重重量比检测。图5中的H为野生型以及纯合Ccdc181基因敲除雄性小鼠睾丸图。
即与野生型雄鼠体重相比，Ccdc181KO雄鼠体重没有明显变化，进一步验证Ccdc181KO小鼠睾丸发育是否正常，与野生型小鼠睾丸重量进行比较，发现Ccdc181KO小鼠睾丸重量显著变小，Ccdc181KO雄鼠睾丸体重比显著小于野生型小鼠的睾丸体重比，这些结果表明Ccdc181KO小鼠睾丸发育异常。
三、Ccdc181基因敲除雄性小鼠精子发生异常
为了确认Ccdc181基因敲除雄性小鼠精子发育是否出现异常，将附睾进行HE染色，发现野生型小鼠的附睾尾部充满了成熟的精子，然而Ccdc181基因敲除雄性小鼠的附睾中几步看不到精子，只有一些细胞碎片，提示Ccdc181基因敲除雄性小鼠的精子不能释放到附睾中。将睾丸进行HE染色，观察到野生型小鼠各级生精小管中精子发育正常，排列整齐有序，未发现精子发育明显的阻滞和缺失，而在Ccdc181基因敲除雄性小鼠的生精小管中，观察到精子发育出现异常，不能观察到带有鞭毛的正常精子的形成，同时生精小管中多种细胞类型比例发生显著变化，这一结果提示Ccdc181基因敲除雄性小鼠精子发育严重异常。
如图6所示：染色检测Ccdc181基因敲除雄性小鼠精子发生情况。图6中的A为野生型以及Ccdc181基因敲除雄性小鼠附睾尾部以及图6中的B为睾丸HE染色，观察精子发育情况，标尺：50μm。
通过PAS染色，进一步观察CCDC181基因敲除雄性小鼠睾丸精子发生的情况。发现Ccdc181基因敲除雄性小鼠生精小管中精细胞、圆形精子、延长精子数量显著减少，正常小鼠的精子尾部在PAS染色中呈现生精管腔中“红色细线样结构，但是在Ccdc181基因敲除雄性小鼠中生精管腔缺乏此类结构，所以提示Ccdc181基因敲除雄性小鼠的精子发育异常，另外呈现出精子细胞减少的现象。
如图7所示：PAS染色检测Ccdc181基因敲除雄性小鼠生精小管中精子发生分期情况。野生型以及Ccdc181基因敲除雄性小鼠生精小管PAS染色，观察精子各时期发生情况。rSt：圆形精子（roundspermatid）；P：粗线期（pachytene）；L：细线期（leptotene）；M：减数分裂（Meiosis），标尺：10μm。
四、CCDC181定位于中心体
使用抗CCDC181的抗体与抗中心体蛋白γ-tubulin的抗体对hTERT-RPE1细胞进行免疫荧光双标记，结果显示CCDC181与中心体蛋白γ-tubulin存在一定的共定位，表明CCDC181定位于中心体。为了进一步确认CCDC181在中心体上的精细定位，使用3D-SIM超高分辨率显微镜对CCDC181的定位进行观察，结果显示CCDC181在中心体上呈现为两个环状结构，提示CCDC181可能是一种PCM蛋白。
如图8所示，CCDC181定位于中心体。利用抗CCDC181和抗中心体标志蛋白γ-tubulin的抗体对hTERT-RPE1细胞进行免疫荧光双标记，DAPI标记DNA。标尺指示2μm。
以上所述实施例仅表达了本申请的几种实施方式，便于具体和详细地理解本申请的技术方案，但并不能因此而理解为对申请专利保护范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本申请的保护范围。此外应理解，在阅读了本申请的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本申请作各种改动或修改，得到的等价形式同样落于本申请的保护范围。还应当理解，本领域技术人员在本申请提供的技术方案的基础上，通过合乎逻辑的分析、推理或者有限的试验得到的技术方案，均在本申请所附权利要求的保护范围内。因此，本申请专利的保护范围应以所附权利要求的内容为准，说明书和附图可以用于解释权利要求的内容。
Claims (10)
1.检测Ccdc181基因表达量的试剂在制备精子异常诊断产品中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述基因Ccdc181表达量的试剂包括检测基因Ccdc181蛋白表达量的试剂和mRNA表达量的试剂中的一种或两种。
3.促进Ccdc181基因表达量的试剂、Ccdc181基因的转录产物或基因Ccdc181的表达产物在制备治疗精子异常药物中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述药物包括活性成分及药学上可以接受的辅料；
可选地，所述辅料选自稀释剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂和湿润剂中的一种或多种。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述药物的剂型为片剂、胶囊、颗粒、丸剂、注射剂和缓释制剂中的一种或多种。
6.根据权利要求1~5任一项所述的应用，其特征在于，所述精子异常包括弱畸精子症、无精子症、少精子症和精子无力症中的一种或多种。
7.一种治疗精子异常的药物，其特征在于，其活性成分包括促进基因Ccdc181表达量的试剂、促进基因Ccdc181的转录产物或基因Ccdc181表达产物的试剂中的一种或两种。
8.一种检测精子异常的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括检测基因Ccdc181表达量的试剂。
9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括检测基因Ccdc181蛋白表达量的试剂和mRNA表达量的试剂中的一种或两种。
10.根据权利要求8~9任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括阴性对照和阳性对照中的一种或两种。
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