CN117867032A - 一种再生障碍性贫血症斑马鱼模型的构建方法及应用 - Google Patents

Abstract

本申请属于基因工程领域，具体涉及一种再生障碍性贫血症斑马鱼模型构建方法及应用。本申请提供的再生障碍性贫血症斑马鱼模型构建方法构建了一种新的再生障碍性贫血的斑马鱼模型，通过CRISPR/Cas9系统针对ddx10基因进行基因编辑，设计靶向斑马鱼ddx10基因第1号外显子的sgRNA，获得了ddx10敲除的斑马鱼突变体，该再生障碍性贫血症斑马鱼模型与人类再生障碍性贫血患者的症状十分相似，不仅可以用于研究再生障碍性贫血的发生机制，还可以用于相关治疗药物的筛选。

Description

一种再生障碍性贫血症斑马鱼模型的构建方法及应用

技术领域

本申请属于基因工程领域，具体涉及一种再生障碍性贫血症斑马鱼模型的构建方法及应用。

背景技术

再生障碍性贫血是一种骨髓造血功能衰竭导致红细胞以及全血细胞减少为特征的血液系统疾病。目前已知的再生障碍性贫血的发病原因主要分为两类：一类是物理、生物或化学毒物，如放射线、病毒、细菌或某些药物等；另外一类是遗传因素，这一类也称为先天性再障，如Fanconi贫血、先天性角化不良以及Schwachman-Diamond综合征。除以上因素以外，超过半数的再生障碍性贫血患者无明显病因可查。其中，再生障碍性贫血的治疗主要包括支持治疗和目标治疗两方面，支持治疗主要目的是预防和治疗血细胞减少。再生障碍性贫血可以根据病情、血象、骨髓象及预后分为重型和非重型。其中，重型若不积极治疗，容易发生感染和出血等，并最终导致死亡。

目前已被报道的相关的致病基因包括DKC1、TERC、TERT、NHP2、NOP10、CTC1、WRAP53、TINF2、ACD、PARN、RTEL1、USB1、TCAB1、POT1、TPP1、WRD79、TR、NOLA2、NOLA3等几十个，同时还不断有新的致病基因被发现。如此多样的致病基因对应着复杂的致病机制，但目前已经构建的遗传性再障动物模型仅仅是针对其中的SBDS、FANCA等有限的几个，不足以揭示再障发生机制的多样性，同时也不能满足针对不同再障机制的药物筛选的需求。

因此，有必要探寻并构建新基因的再生障碍性贫血症动物模型。

发明内容

基于此，本申请一实施例提供一种再生障碍性贫血症斑马鱼模型的构建方法及应用。

本申请一方面提供一种再生障碍性贫血症斑马鱼模型的构建方法，包括：

制备靶向斑马鱼ddx10基因第1号外显子的sgRNA，所述sgRNA的序列如SEQ IDNO.1所示。

混合所述sgRNA与Cas9蛋白，制备Cas9/sgRNA混合物。

将所述Cas9/sgRNA混合物引入野生型斑马鱼胚胎中，获得F0代斑马鱼。

将所述F0代斑马鱼与野生型斑马鱼交配，从出生的斑马鱼中筛选出阳性杂合子F1代斑马鱼作为再生障碍性贫血症斑马鱼模型。

在其中一个实施例中，采用显微注射的方式将所述Cas9/sgRNA混合物引入野生型斑马鱼胚胎。

在其中一个实施例中，采用PCR法和Sanger测序法筛选出阳性杂合子F1代斑马鱼，所述PCR法采用如SEQ ID NO.4~SEQ ID NO.5所示的检测引物对。

本申请还提供上述的再生障碍性贫血症斑马鱼模型的构建方法建立的再生障碍性贫血症斑马鱼模型的组织。

本申请另一方面提供上述的再生障碍性贫血症斑马鱼模型的构建方法建立的再生障碍性贫血症斑马鱼模型的器官。

本申请另一方面提供特异靶向斑马鱼ddx10基因第1号外显子的sgRNA，所述sgRNA的序列如SEQ ID NO.1所示。

本申请另一方面提供一种构建再生障碍性贫血症斑马鱼模型的试剂盒，包含靶向斑马鱼ddx10基因第1号外显子的sgRNA；所述sgRNA的序列如SEQ ID NO.1所示。

在其中一个实施例中，还包括Cas9蛋白、PCR反应缓冲液和PCR反应液中的一种或多种。

在其中一个实施例中，所述PCR反应液包括Taq DNA聚合酶、dNTPs和Mg²⁺中的一种或多种。

本申请还提供上述的再生障碍性贫血症斑马鱼模型的构建方法制备的再生障碍性贫血症斑马鱼模型在高通量药物筛选中的应用。

本申请提供的再生障碍性贫血症斑马鱼模型构建方法构建了一种新的再生障碍性贫血的斑马鱼模型，通过CRISPR/Cas9系统针对ddx10基因进行基因编辑，设计靶向斑马鱼ddx10基因第1号外显子的sgRNA，获得了ddx10敲除的斑马鱼突变体，该再生障碍性贫血症斑马鱼模型与人类再生障碍性贫血患者的症状十分相似，不仅可以用于研究再生障碍性贫血的发生机制，还可以用于相关治疗药物的筛选。本申请的构建方法不仅为再障的机制研究提供了新的动物模型，有助于揭示新的发生机制，还为再障的药物筛选提供了一个稳定、活体、重复性好、成本低的动物模型。

附图说明

为了更清楚地说明本申请实施例中的技术方案、更完整地理解本申请及其有益效果，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单的介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请的一些实施例，对本领域技术人员来说，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为ddx10突变体的基因结构、突变形式与翻译预测；

图2为ddx10突变体在显微镜明场中的表型；

图3为4dpf的ddx10突变体的造血干细胞标记基因cmyb的表达减少；

图4为4dpf的ddx10突变体的尾部造血区域中造血干细胞标记基因ikzf1的表达减少；

图5为4dpf的ddx10突变体的尾部造血区域中红细胞标记基因hbae1.1的表达减少；

图6为ddx10突变体的血红蛋白减少；

其中，sgRNA：single guide RNA，单导向RNA；dpf：days post fertilization，受精后小时数；C-terminal：C末端；ATP binding：ATP结合；o-Dianisidine：3,3'-二甲氧基联苯胺。

具体实施方式

下面结合实施方式和实施例，对本申请作进一步详细的说明。应理解，这些实施方式和实施例仅用于说明本申请而不用于限制本申请的范围，提供这些实施方式和实施例的目的是使对本申请公开内容理解更加透彻全面。还应理解，本申请可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施方式和实施例，本领域技术人员可以在不违背本申请内涵的情况下作各种改动或修改，得到的等价形式同样落于本申请的保护范围。此外，在下文的描述中，给出了大量具体的细节以便提供对本申请更为充分地理解，应理解，本申请可以无需一个或多个这些细节而得以实施。

除非另有定义，本申请所使用的所有的技术和科学术语与属于本申请的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。

术语

在本申请提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。除非与本申请的申请目的和/或技术方案相冲突，否则，本申请涉及的引用文献以全部内容、全部目的被引用。本申请中涉及引用文献时，相关技术特征、术语、名词、短语等在引用文献中的定义也一并被引用。本申请中涉及引用文献时，被引用的相关技术特征的举例、优选方式也可作为参考纳入本申请中，但以能够实施本申请为限。应当理解，当引用内容与本申请中的描述相冲突时，以本申请为准或者适应性地根据本申请的描述进行修正。

除非另外说明或存在矛盾之处，本文中使用的术语或短语具有以下含义：

本文所使用的术语“和/或”、“或/和”、“及/或”的选择范围包括两个或两个以上相关所列项目中任一个项目，也包括相关所列项目的任意的和所有的组合，所述任意的和所有的组合包括任意的两个相关所列项目、任意的更多个相关所列项目、或者全部相关所列项目的组合。需要说明的是，当用至少两个选自“和/或”、“或/和”、“及/或”的连词组合连接至少三个项目时，应当理解，在本申请中，该技术方案毫无疑问地包括均用“逻辑与”连接的技术方案，还毫无疑问地包括均用“逻辑或”连接的技术方案。比如，“A及/或B”包括A、B和A+B三种并列方案。又比如，“A，及/或，B，及/或，C，及/或，D”的技术方案，包括A、B、C、D中任一项（也即均用“逻辑或”连接的技术方案），也包括A、B、C、D的任意的和所有的组合，也即包括A、B、C、D中任两项或任三项的组合，还包括A、B、C、D的四项组合（也即均用“逻辑与”连接的技术方案）。

本申请中，涉及到数值区间（也即数值范围），如无特别说明，可选的数值分布在上述数值区间内视为连续，且包括该数值范围的两个数值端点（即最小值及最大值），以及这两个数值端点之间的每一个数值。如无特别说明，当数值区间仅仅指向该数值区间内的整数时，包括该数值范围的两个端点整数，以及两个端点之间的每一个整数，在本文中，相当于直接列举了每一个整数，比如t为选自1~10的整数，表示t为选自由1、2、3、4、5、6、7、8、9和10构成的整数组的任一个整数。此外，当提供多个范围描述特征或特性时，可以合并这些范围。换言之，除非另有指明，否则本文中所公开之范围应理解为包括其中所归入的任何及所有的子范围。

术语“sgRNA”（single guide RNA）是单向导RNA（guide RNA，gRNA），是一小段非编码RNA，可以识别基因组序列，并引导Cas9蛋白对其进行切割。

术语“外显子”外显子（exon）是真核生物基因的一部分。它在剪接（Splicing）后会被保存下来，并可在蛋白质生物合成过程中被表达为蛋白质。外显子是最后出现在成熟RNA中的基因序列，又称表达序列。

既存在于最初的转录产物中，也存在于成熟的RNA分子中的核苷酸序列。术语外显子也指编码相应RNA外显子的DNA中的区域。所有的外显子一同组成了遗传信息，该信息会体现在蛋白质上。外显子虽然仅占人类基因组的1%~2%，但是在外显子上却包含了85%的已知致病突变。

术语“Sanger测序法”Sanger法是根据核苷酸在某一固定的点开始，随机在某一个特定的碱基处终止，并且在每个碱基后面进行荧光标记，产生以A、T、C、G结束的四组不同长度的一系列核苷酸，然后在尿素变性的PAGE胶上电泳进行检测，从而获得可见DNA碱基序列的一种方法。在分子生物学研究中，DNA的序列分析是进一步研究和改造目的基因的基础。

术语“显微注射”在高倍倒置显微镜下，利用显微操作器（Micromanipulator），控制显微注射针在显微镜视野内移动的机械装置，用来进行细胞或早期胚胎操作的一种方法。以细胞内微注射和微灌注技术为基础的玻璃针头（Glass Needle，精细的玻璃微量毛细移液管）的使用，已经在越来越多的实验生物学研究领域中成为一项非常普遍的操作方法，比如在体外受精、转基因中等等。描述这些技术最恰当的话应当称其为显微操作，因为这些操作是通过单个的或多个的筒状玻璃微量移液管、精确的定位装置（显微操作器）以及微量注射器或微量灌注器来在单个的细胞上进行的。

本申请一方面提供一种再生障碍性贫血症斑马鱼模型的构建方法，包括：

获取靶向斑马鱼ddx10基因第1号外显子的sgRNA，sgRNA的序列如SEQ ID NO.1所示，混合sgRNA与Cas9蛋白，制备Cas9/sgRNA混合物，将Cas9/sgRNA混合物引入野生型斑马鱼胚胎中，获得F0代斑马鱼再将F0代斑马鱼与野生型斑马鱼交配，从出生的斑马鱼中筛选出阳性杂合子F1代斑马鱼作为再生障碍性贫血症斑马鱼模型。

其中，SEQ ID NO.1的序列为5’-GCAAGGTGAAGAAACGCGAC-3’。

在一个具体的示例中，采用显微注射的方式将Cas9/sgRNA混合物引入野生型斑马鱼胚胎。

可选地，采用PCR法或Sanger测序法筛选出阳性杂合子F1代斑马鱼。

进一步可选地，PCR法采用如SEQ ID NO.4~SEQ ID NO.5所示的检测引物对。

本申请另一方面还提供上述的再生障碍性贫血症斑马鱼模型的构建方法建立的再生障碍性贫血症斑马鱼模型的组织。

本申请另一方面还提供上述的再生障碍性贫血症斑马鱼模型的构建方法建立的再生障碍性贫血症斑马鱼模型的器官。

本申请还提供一种特异靶向斑马鱼ddx10基因第1号外显子的sgRNA，其中，sgRNA序列如SEQ ID NO.1所示。

本申请另一方面还提供一种构建再生障碍性贫血症斑马鱼模型的试剂盒，包含靶向斑马鱼ddx10基因第1号外显子的sgRNA，其中，sgRNA的序列如SEQ ID NO.1所示。

可选地，该试剂盒还包括但不限于Cas9蛋白、PCR反应缓冲液和PCR反应液中的一种或多种。

进一步可选地，PCR反应液包括但不限于Taq DNA聚合酶、dNTPs和Mg²⁺中的一种或多种。

Taq DNA聚合酶是第一个被发现的热稳定DNA聚合酶，分子量65kD，最初由Saiki等从温泉中分离的一株水生噬热杆菌（thermus aquaticus）中提取获得。此酶能耐高温，在70℃反应2h后其残留活性大于原来的90%，在93℃下反应2h后其残留活性是原来的60%，在95℃下反应2h后其残留活性是原来的40%。

在分子克隆中Taq DNA聚合酶可用于DNA序列测定并可利用聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）对DNA的特定片段进行体外扩增。在PCR过程中，由于Taq DNA聚合酶在变性步骤中（约94℃）不失活，可直接进入第二轮循环，因此不必每轮循环时重新加入新酶，这使得Taq DNA聚合酶成为PCR反应中的独特用酶。

dNTP或脱氧核糖核苷酸是含有脱氧核糖作为糖分子的核苷酸。这些核苷酸称为DNA核苷酸。此外，还有四种dNTP；它们是dATP、dGTP、dGTP和dTTP。从它们的功能来看，dNTPs是DNA的前体分子。DNA核苷酸的主要功能是通过DNA将遗传信息从一代传到下一代。

此外，dNTP的三个组成部分是脱氧核糖、含氮碱基和磷酸基团。脱氧核糖含有一个3’OH基团。含氮碱基包括嘌呤碱基或嘧啶碱基。此外，含氮碱基在DNA合成过程中形成氢键以形成碱基对。在DNA合成过程中，3’OH基团与第二个脱氧核糖核苷酸的4’碳中的磷酸基团形成磷酸二酯键。

本申请还提供上述的再生障碍性贫血症斑马鱼模型的构建方法制备的再生障碍性贫血症斑马鱼模型在高通量药物筛选中的应用。

可以理解的是，高通量药物筛选技术指的是基于分子水平或细胞水平的筛选模型，以微孔板为反应载体，结合自动化的操作系统以及灵敏快速的检测方法，高效的完成对数以千万待测样品（化合物、miRNA或其他活性纳米颗粒等）的检测，最后通过计算机对海量的实验数据进行分析处理，获得阳性样品。

下面将结合实施例对本申请的实施方案进行详细描述。应理解，这些实施例仅用于说明本申请而不用于限制本申请的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，优先参考本申请中给出的指引，还可以按照本领域的实验手册或常规条件，还可以按照制造厂商所建议的条件，或者参考本领域已知的实验方法。

下述的具体实施例中，涉及原料组分的量度参数，如无特别说明，可能存在称量精度范围内的细微偏差。涉及温度和时间参数，允许仪器测试精度或操作精度导致的可接受的偏差。

应理解，在本申请的各种实施例中，上述各过程的序号的大小并不意味着执行顺序的先后，各过程的执行顺序应以其功能和内在逻辑确定，而不应对本申请实施例的实施过程构成任何限定。

实施例1

一、模型构建

1、设计sgRNA

针对斑马鱼ddx10的1号外显子的序列，设计了一条sgRNA，其靶向的DNA序列为，5’-GCAAGGTGAAGAAACGCGAC-3’（SEQ ID NO.1），同时合成sgRNA的引物。

其中，正向引物ddx10-sg1 fw序列如SEQ ID NO.2所示：

5’-taatacgactcactataGGAAGGTGAAGAAACGCGACgttttagagctagaa-3’ （SEQ IDNO.2）

反向通用引物tail primer的序列如SEQ ID NO.3所示：5’-AAAAGCACCGACTCGGTGCCACTTTTTCAAGTTGATAACGGACTAGCCTTATTTTAACTTGCTATTTCTAGCTCTAAAAC-3’（SEQ IDNO.3）

2、sgRNA转录模板的合成与纯化

由于合成的两条引物中包含互补序列、靶点序列、T7转录起始序列以及sgRNA骨架序列，利用PCR合成sgRNA的转录模板，PCR的反应体系如表1所示，PCR反应程序如表2所示。

表1

表2

反应结束后，取1μl PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳（琼脂糖浓度为1%，电压120V，时间20min），产物应为单一条带，且大小为117bp。随后利用PCR产物纯化试剂盒进行纯化。并利用酶标仪，测定纯化后的产物浓度。

3、体外转录sgRNA

所用的反应管、枪头、试剂均为无DNA酶/无RNA酶，在冰上配制如表3所示的反应体系：

表3

配制好反应体系后，置于37℃恒温烘箱中，孵育2.5小时。反应结束后，在管中加入1μl的DNase I（Roche，货号4716728001），继续置于37℃，孵育15分钟。随后向反应体系中加入10μl的乙酸铵（5M），混匀，终止反应。

4、纯化sgRNA

向反应体系中加入70μl的水，随后加入100μl酚/氯仿/异戊醇，利用漩涡混合器充分混匀液体，12000g离心，30s。

将上层的水相转移到新的离心管中，重新加入150μ氯仿，利用漩涡混合器充分混匀液体。12000g离心，30s。将上层水相，再次转移到新的离心管中，加入等体积的异丙醇。

混匀后，置于-20℃，30min。随后，12000g，4℃，离心15min。吸去上清，加入700μl70%乙醇，12000g，4℃，离心15min。吸去液体，留下沉淀，加入10μl纯水，利用酶标仪测定浓度，稀释sgRNA的浓度到100ng/μl。分装，保存于-80℃。

5、显微注射Cas9蛋白和sgRNA

将Cas9蛋白（金斯瑞，货号Z00389），稀释到200ng/μl，随后各取sgRNA和Cas9蛋白1μl，混合。得到Cas9蛋白（100ng/μl）和sgRNA（50ng/μl）的混合物。置于冰上。利用显微注射仪器（Harvard Apparatus，型号PLI-100A），像细胞期的野生型斑马鱼胚胎中注射入2nl的混合物。随后培养胚胎。

6、检测基因编辑效率

取10枚注射后1天的胚胎，置于1.5ml的离心管中，吸去培养液，加入100μl的50mM的氢氧化钠溶液，随后置于95℃金属浴中，孵育15min，随后取出置于室温，并加入10μl的1M的Tris pH7.5溶液。充分混匀，作为PCR模板。

通过公司合成DDX10的检测引物如下，扩增的片段大小为491bp。

ddx10-fw：5’-GTGTCAGCAACTCTCACCGCG-3’（SEQ ID NO.4）

ddx10-rv：5’-TACGTGAAGAGGCTTCCTGAC-3’（SEQ ID NO.5）

PCR反应体系如表4所示：

表4

PCR反应结束后，将产物进行Sanger测序，根据出现在靶位点后面的套峰，确认是否发生基因编辑。同时将剩余的胚胎饲养至性成熟，进行下一步的F0代突变体的筛选。

7、F0代突变体的筛选

将性成熟的F0代个体，分别与野生型的斑马鱼交配，分别获得F1代胚胎。类似地，通过混合10枚胚胎，裂解获得DNA模板，进行PCR，Sanger测序，确定可以遗传出突变行等位基因的F0个体，同时将其产生的F1代胚胎饲养到成年。

8、F1代突变体的筛选

利用镊子，分别夹取不同F1代个体的2~10枚鳞片，随后加入20μl的50mM氢氧化钠溶液中，制备DNA模板。

通过PCR，Sanger测序，确定F1代的基因型为删除7对碱基的突变型。

9、ddx10突变体出现明显的头小眼睛小的表型

通过观察与比较，发现ddx10纯合突变体从2dpf开始表现出头小眼睛小的表型。

10、ddx10突变体表现出造血干细胞减少

利用RNA原位杂交技术，通过检测cmyb和ikzf1的表达，从而判断造血干细胞的状态。收集4dpf的ddx10的纯合突变体胚胎和其兄弟姐妹胚胎，去除培养液，加入4%的多聚甲醛，置于4℃冰箱，过夜。随后利用PBST润洗胚胎，3次，每次10min。洗完后，加入预杂交液，60℃孵育1小时，吸去预杂交液，加入cmyb或者ikzf1的探针，这两个探针均可以标记斑马鱼的造血干细胞。60℃孵育过夜。

回收探针，清洗胚胎。用洗液1（50%甲酰胺，5x SSC，0.1% Tween-20），20x SSC: 3M氯化钠，0.3M柠檬酸三钠）。60℃润洗两次，每次30min。用洗液2（2× SSC，0.1% Tween-20），60℃润洗一次，15min。洗液3（0.2×SSC，0.1% Tween-20），60℃润洗两次，每次30min。MABT，常温润洗3次，每次5min。常温，孵育封闭液2h后，孵育Anti-DIG-AP溶液，4℃过夜。回收抗体，PBST润洗3次，每次30min。平衡缓冲液，润洗一遍，10min。加入NBT/BCIP显色液，常温显色至合适程度。

通过观察与统计可以明显看出，4dpf的ddx10纯合突变体的尾部造血组织中，cmyb和ikzf1的表达显著降低，这表明，ddx10纯合突变体发生了造血干细胞减少。

11、ddx10突变体表现出明显的贫血

利用RNA原位杂交技术，检测了hbae1.1的表达，该基因标记了红细胞。结果表明，4dpf的ddx10纯合突变体出现了明显了红细胞的减少。还实施了邻联茴香胺染色，该染色方法可以特异标记血红蛋白。结果表明，3dpf的ddx10纯合突变体的血红蛋白明显下降。因此，ddx10纯合突变体会出现明显的贫血表型。

综上，ddx10纯合突变体的造血干细胞和红细胞减少，很好地模拟了人类再生障碍性贫血的症状，是优良的人类再生障碍性贫血的动物模型。具有周期短、稳定、成本低、重复性好的优势。

其可以用于以下方面：1、人类再生障碍性贫血突变致病基因的预测与诊断；2、人类再生障碍性贫血的机制研究；3、人类再生障碍性贫血的药物筛选和验证。

二、结果验证：

1、ddx10突变体的基因结构、突变形式与翻译预测

如图1所示，斑马鱼ddx10包括18个外显子，在1号外显子的起始密码子ATG后，根据找到了sgRNA靶点。并成功完成了该靶点的基因编辑，筛选获得了删除7对碱基的突变型等位基因。突变型的等位基因会导致翻译移码，并提前终止。最终导致缺失ddx10蛋白的重要的三个结构域，包括Q结构域、ATP结合结构域和C端结构域。

2、ddx10突变体在显微镜明场中的表型

如图2所示，在2dpf、3dpf、4dpf、5dpf时，ddx10突变体的眼睛和头部的大小均小于对照胚胎。同时在4dpf还出现了明显的心包水肿。在5dpf，ddx10突变体还出现了颅面软骨缺失。

3、ddx10突变体的尾部造血区域中造血干细胞标记基因的表达显著减少

如图3和图4所示，通过RNA原位杂交染色实验，发现4dpf的ddx10突变体的造血干细胞标记基因表达明显降低，这表明，ddx10突变体的造血干细胞的显著衰竭。

4、ddx10突变体的尾部造血区域中红细胞标记基因的表达显著减少。

如图5所示，通过RNA原位杂交染色实验，发现4dpf的ddx10突变体的红细胞标记基因hbae1.1的表达显著减少，这表明ddx10突变体的红细胞存在缺陷。

5、ddx10突变体的血红蛋白明显减少

如图6所示，通过邻联茴香胺染色，发现3dpf的ddx10突变体的血红蛋白显著减少，这表明ddx10突变体存在着明显的贫血。

以上所述实施例仅表达了本申请的几种实施方式，便于具体和详细地理解本申请的技术方案，但并不能因此而理解为对申请专利保护范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本申请的保护范围。此外应理解，在阅读了本申请的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本申请作各种改动或修改，得到的等价形式同样落于本申请的保护范围。还应当理解，本领域技术人员在本申请提供的技术方案的基础上，通过合乎逻辑的分析、推理或者有限的试验得到的技术方案，均在本申请所附权利要求的保护范围内。因此，本申请专利的保护范围应以所附权利要求的内容为准，说明书和附图可以用于解释权利要求的内容。

Claims (10)

1.一种再生障碍性贫血症斑马鱼模型的构建方法，其特征在于，包括：

制备靶向斑马鱼ddx10基因第1号外显子的sgRNA，所述sgRNA的序列如SEQ ID NO.1所示；

混合所述sgRNA与Cas9蛋白，制备Cas9/sgRNA混合物；

将所述Cas9/sgRNA混合物引入野生型斑马鱼胚胎中，获得F0代斑马鱼；

将所述F0代斑马鱼与野生型斑马鱼交配，从出生的斑马鱼中筛选出阳性杂合子F1代斑马鱼作为再生障碍性贫血症斑马鱼模型。

2.根据权利要求1所述的再生障碍性贫血症斑马鱼模型的构建方法，其特征在于，采用显微注射的方式将所述Cas9/sgRNA混合物引入野生型斑马鱼胚胎。

3.根据权利要求2所述的再生障碍性贫血症斑马鱼模型的构建方法，其特征在于，采用PCR法和Sanger测序法筛选出阳性杂合子F1代斑马鱼；

所述PCR法采用如SEQ ID NO.4~ SEQ ID NO.5所示的检测引物对。

4.权利要求1~3任一项所述的再生障碍性贫血症斑马鱼模型的构建方法建立的再生障碍性贫血症斑马鱼模型的组织。

5.权利要求1~3任一项所述的再生障碍性贫血症斑马鱼模型的构建方法建立的再生障碍性贫血症斑马鱼模型的器官。

6.特异靶向斑马鱼ddx10基因第1号外显子的sgRNA，所述sgRNA的序列如SEQ ID NO.1所示。

7.一种构建再生障碍性贫血症斑马鱼模型的试剂盒，其特征在于，包含靶向斑马鱼ddx10基因第1号外显子的sgRNA；

所述sgRNA的序列如SEQ ID NO.1所示。

8.根据权利要求7所述的构建再生障碍性贫血症斑马鱼模型的试剂盒，其特征在于，还包括Cas9蛋白、PCR反应缓冲液和PCR反应液中的一种或多种。

9.根据权利要求8所述的构建再生障碍性贫血症斑马鱼模型的试剂盒，其特征在于，所述PCR反应液包括Taq DNA聚合酶、dNTPs和Mg²⁺中的一种或多种。

10.权利要求1~3任一项所述的再生障碍性贫血症斑马鱼模型的构建方法制备的再生障碍性贫血症斑马鱼模型在高通量药物筛选中的应用。