CN109913458B - circRNA及其在检测缺氧缺血性脑损伤中的应用 - Google Patents

circRNA及其在检测缺氧缺血性脑损伤中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及circRNA及其在检测缺氧缺血性脑损伤中的应用。针对目前没有有效的缺氧缺血性脑损伤诊断方法这一难题,发明人采用高通量测序技术对缺氧缺血性脑损伤模型进行circRNA转录组测序并运用生物信息学方法进行分析,寻找到与缺氧缺血性脑损伤相关的circRNA,为缺氧缺血性脑损伤的诊断提供了新的分子诊断标志物,为临床检测提供了研究基础。

Description

circRNA及其在检测缺氧缺血性脑损伤中的应用
技术领域
本发明属于疾病检测领域,具体涉及circRNA及其在制备缺氧缺血性脑损伤诊断试剂中的应用。
背景技术
近年来,环状RNA(circular RNA,circRNA)成为继miRNA与1ncRNA后的又一非编码RNA研究热点,受到国内外学者的广泛关注。目前,circRNA的生物学功能研究仍处于探索阶段,其作用机制主要包括以下4种:①miRNA海绵作用:位于胞质中的ecircRNA可通过竞争性内源RNA机制,结合miRNA阻止其与下游靶基因结合,从而调控基因表达。miRNA海绵作用是目前疾病中研究最多的circRNA作用机制。②转录及剪接调控作用:部分circRNA可以影响亲本基因的表达,现有研究显示其可能通过与线性剪接相互竞争从而负向调控亲本基因表达。③circRNA——蛋白相互作用:circRNA也可与蛋白质相关作用以调控基因表达,CircRNA可用于存储、分类、转运RNA结合蛋白到特定的亚细胞单位。④翻译蛋白:虽然circRNA一直被认为是非编码RNA,但最近研究表明部分circRNA可能具有翻译功能。
缺氧缺血性脑损伤(hypoxic-ischemic brain damage,HIBD)是因脑组织部分或完全缺氧、脑血流量减少或暂停导致的脑损伤,最终可造成神经细胞的凋亡和坏死。新生儿缺氧缺血性脑病由于围产期窒息缺氧所引起的脑损伤,严重者可造成永久性神经功能损害,是儿童神经系统损伤的常见原因之一。遗憾的是,目前对缺氧缺血性脑损伤诊断至今不甚明了,也无有效的治疗方法。因此,国内外相继成立缺氧缺血脑病研究中心进行此项研究。
高通量测序技术的广泛应用为疾病发病机理的研究提供了更加全面和快速的分析手段,发明人对缺氧缺血性脑损伤模型进行circRNA转录组测序并运用生物信息学方法进行分析,寻找与缺氧缺血性脑损伤相关的circRNA,进一步通过RT-PCR进行了验证,本申请为缺氧缺血性脑损伤的诊断提供了新的分子诊断标志物,为临床缺血缺氧性脑损伤的基因检测提供研究基础。
发明内容
本发明的目的在于提供一种与缺氧缺血性脑损伤相关的circRNA,序列与SEQ IDNO.1具有90%以上序列同源性。
术语“同源”是主要是指序列上的同源,也就是用来说明两个或多个RNA或DNA序列具有相同的祖先。同源的序列一般有相似的功能。一般来说,当相似程度高于50%时,常推测检测序列和目标序列可能是同源序列;当相似性程度低于20%时,就难以确定其是否具有同源性。
优选的,序列与SEQ ID NO.1具有95%、96%、97%、98%或99%以上序列同源性。
更优选的,circRNA序列为SEQ ID NO.1。
本发明的目的在于提供一种检测缺氧缺血性脑损伤的试剂,试剂采用测序技术、核酸杂交技术或核酸扩增技术检测样品circRNA及其调控的基因的表达水平,circRNA序列为SEQ ID NO.1。
进一步,circRNA调控的基因选自下列miRNA中的一种或几种:rno-let-7b-5p、rno-miR-10a-5p、rno-miR-10b-5p、rno-miR-1188-5p、rno-miR-1199-5p、rno-miR-122-5p、rno-miR-125a-3p、rno-miR-125b-5p、rno-miR-128-1-5p、rno-miR-128-2-5p、rno-miR-128-3p、rno-miR-138-5p、rno-miR-146b-3p、rno-miR-150-5p、rno-miR-17-1-3p、rno-miR-181a-1-3p、rno-miR-184、rno-miR-185-5p、rno-miR-194-3p、rno-miR-199a-5p、rno-miR-203a-5p、rno-miR-205、rno-miR-212-3p、rno-miR-216a-3p、rno-miR-23b-5p、rno-miR-24-1-5p、rno-miR-25-5p、rno-miR-301b-3p、rno-miR-30c-2-3p、rno-miR-324-5p、rno-miR-329-5p、rno-miR-342-5p、rno-miR-345-3p、rno-miR-349、rno-miR-34a-5p、rno-miR-34c-5p、rno-miR-351-5p、rno-miR-3543、rno-miR-3544、rno-miR-3558-3p、rno-miR-3568、rno-miR-3583-3p、rno-miR-361-3p、rno-miR-370-3p、rno-miR-382-5p、rno-miR-421-5p、rno-miR-450b-3p、rno-miR-493-3p、rno-miR-501-5p、rno-miR-505-5p、rno-miR-509-5p、rno-miR-5132-3p、rno-miR-532-3p、rno-miR-540-3p、rno-miR-541-3p、rno-miR-6316、rno-miR-6323、rno-miR-6328、rno-miR-652-3p、rno-miR-665、rno-miR-702-3p、rno-miR-7578、rno-miR-770-3p、rno-miR-7b、rno-miR-873-3p、rno-miR-883-3p、rno-miR-92b-3p、rno-miR-92b-5p。
进一步,circRNA在缺氧缺血性脑损伤样本中高表达。
本发明中的核酸杂交技术包括但不限于原位杂交(ISH)、微阵列或Northern杂交。
优选的,采用二代测序技术、三代测序技术、探针杂交技术、基因芯片技术或荧光定量PCR技术检测样本中circRNA基因及其调控的基因的表达水平。
优选的,试剂含有与circRNA杂交的探针或扩增circRNA的特异性引物。
一种缺氧缺血性脑损伤检测荧光定量PCR试剂盒,试剂盒采用特异的引物检测SEQID NO.1的表达水平。
进一步,引物序列为SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3。
进一步,该PCR试剂盒适合于目前存在市场上的所有类型荧光定量基因扩增仪,灵敏度高,定量快速准确、稳定性好,具有良好的应用前景。
进一步,上述荧光定量PCR试剂盒组分包括:特异性引物、内参引物、荧光定量PCR反应液。其中所述的特异性引物包括上游引物和下游引物,上游引物序列为SEQ ID NO.2,下游引物序列为SEQ ID NO.3。所述内参引物为GAPDH内参引物。
所述的试剂盒还包含RNA抽提试剂。优选
Figure BDA0002007528570000031
Reagent进行样本RNA提取。
本发明的目的在于提供上述试剂在制备缺氧缺血性脑损伤诊断制剂中的应用。
优选的,样本为脑组织或外周血。更优选的,样本为大鼠的脑组织。
本申请的优点:
1、本申请为缺氧缺血性脑损伤的诊断提供了新的分子诊断标志物。
2、检测发现本申请提供的circRNA在缺氧缺血性脑损伤中特异性高表达,检测准确率较高,提供了一种更加快速、准确的检测方法。
定义:
环状RNA(circular RNA,circRNA),亦称环形RNA,是最近几年研究确认的一种新型的非编码RNA(noncoding RNA,ncRNA)分子。根据RNA构成的不同,环状RNA可分为三类:外显子环状RNA(exon circular RNA,ecircRNA)、内含子环状RNA(circular intronic RNAs,ciRNAs)和外显子-内含子circRNA(exon-intron circRNA,EIciRNA)。
“探针”指能与另一分子的特定序列或亚序列或其它部分结合的分子。除非另有指出,术语“探针”通常指能通过互补碱基配对与另一多核苷酸结合的多核苷酸探针。
所述探针具有与靶点基因的特定的碱基序列互补的碱基序列。这里,所谓“互补”,只要是杂交即可,可以不是完全互补。这些多核苷酸通常相对于该特定的碱基序列具有80%以上、优选90%以上、更优选95%以上、特别优选100%的同源性。这些探针可以是DNA,也可以是RNA,另外,可以为在其一部分或全部中核苷酸通过PNA(Polyamide nucleicacid,肽核酸)、LNA(注册商标,locked nucleic acid,Bridged Nucleic Acid,交联化核酸)、ENA(注册商标,2′-O,4′-C-Ethylene-bridged nucleic acids)、GNA(Glycerolnucleic acid,甘油核酸)、TNA(Threose nucleic acid,苏糖核酸)等人工核酸置换得到的多核苷酸。
本发明中的术语“杂交”用于指代互补核酸的配对。杂交和杂交强度受诸如以下的因素影响:核酸之间的互补程度、所涉及的条件的严格性、形成的杂交体的Tm和核酸内的G:C比率。
测序技术主要为高通量测序技术(High-throughput sequencing),又称下一代测序技术(next generation sequencing),一次对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定,极大提高了测序效率。高通量测序平台的代表是罗氏公司(Roche)的454测序仪(RochGSFLX sequencer),Illumina公司的Solexa基因组分析仪(Illumina Genome Analyzer)和ABI的SOLiD测序仪(ABI SOLiD sequencer)。
Northern杂交,又称RNA印迹技术为最经典的检测真核生物RNA大小,估计其丰度的实验方法。基本原理如下:首先在载体(如硅片、微球或膜等)上固定RNA样本,再与经过标记的探针杂交,洗涤多余的杂交探针后进行信号检测;也可以在载体上先固定与靶RNA序列互补的DNA探针,然后与经过标记的样本RNA杂交,再进行信号检测。信号标记的方法包括同位素标记、荧光标记和纳米金标记等。
附图说明
图1是circRNA及其调控的miRNA网络图;
图2是circRNA在缺血缺氧组和正常对照组中差异表达图。
具体实施方式
下面结合具体实施例,进一步阐述本发明,仅用于解释本发明,而不能理解为对本发明的限制。本领域的普通技术人员可以理解:在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型,本发明的范围由权利要求及其等同物限定。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件或按照厂商所建议的条件实施检测。
实施例1缺氧缺血大鼠模型的建立和取样
7日龄新生SD大鼠,体质量10-14g。随机分成两组,假手术组(正常对照组)和缺氧缺血组,每组3只。乙醚麻醉下,颈正中切口,分离左侧颈总动脉。假手术组不再做任何处理;手术组结扎并切断左侧颈总动脉,休息1h后,置于8%氧氮混合气体中2h。于实验后1d乙醚麻醉下每组、每一时间点分别断头处死大鼠,取脑组织立即放入液氮冷冻保存。
实施例2高通量测序及数据分析
2.1组织总RNA提取及质检
(1)将各组组织在冰上剪碎,取适量(50-100mg)组织于去RNA酶的EP管中加入lml预冷的Trizol,吹打均匀后于冰上静置10min;
(2)加入200μl预冷的氯仿,剧烈震荡30sec后于冰上静置15min,4℃14000rpm/min离心20min;
(3)取出上清于新的去RNA酶的EP管中(注意避免触及中间层),加入等体积预冷的异丙醇(约500μl),混匀后冰上静置0.5-1h,4℃14000rpm/min离心20min;
(4)弃上清,加入lml预冷的75%乙醇,颠倒混匀,4℃14000rpm/min离心20min;
(5)弃上清,加入lml预冷的75%乙醇,颠倒混匀,4℃14000rpm/min离心20min;
(6)弃上清,RNA沉淀于超净台内晾干后,加入适量DEPC水充分吹打溶解沉淀。
RNA质量检测标准,A260/A280值介于1.8与2.1之间。2.0为最优,大于2.1,提示RNA降解过多,小于1.8提示存在蛋白等污染。结果表明RNA纯度较高,无蛋白质或DNA等污染。
2.2circRNA测序检测
(1)全转录组测序建链特异性文库流程,包括Ribo-Zero Deplete and FragmentRNA、Synthesize First Strand cDNA、Synthesize Second Strand cDNA、纯化、Adenylate3'Ends、Ligate Adapters、纯化、Enrich DNA Fragments、纯化、文库质检;
(2)原始测序数据及质量控制
原始测序数据及评估。高通量测序得到的原始图像数据文件经碱基识别(BaseCalling)分析转化为原始测序序列,被称为Raw Data或Raw Reads,结果以FASTQ文件格式存储,其中包含测序序列(reads)的序列信息以及其对应的测序质量信息。测序得到大量的样本数据。鉴于数据错误率对结果的影响,对原始数据进行质量预处理,并对整个质控过程中的reads数进行统计汇总。
测序序列质量评估,包括碱基质量分布和GC含量分布。
circRNA测序序列评估,包括测序饱和度分析、测序随机性评估、Reads在不同元件的富集分析、基因覆盖度分析、Reads在参考基因组上的分布。
(3)circRNA鉴定、注释、定量
测序序列使用CIRI软件进行circRNA预测,将预测结果与现有circRNA数据库比对,得到己知cricRNA和预测的cricRNA。在circRNA预测方面,主要基于数据库中释放的蛋白编码基因及转录本的注释信息,通过位置信息比对,获取与circRNA在位置上有着最大重叠的转录本,基于该转录本信息,对circRNA的序列进行预测。
CircRNA的注释主要是与已知数据比较、circRNA来源基因注释、circRNA基因结构分析。
circRNA的定量。用RPM对circRNA进行定量,对各样本circRNA表达量及丰度(RPM)进行统计。
2.3差异表达circRNA分析
利用CircSeq数据比较分析两个样品中同一个circRNA是否存在差异表达的时候,可以选取两个标准:其一,foldChange,即两组样品中同一个circRNA表达水平的变化倍数;其二,pvalue或FDR,FDR值的计算方法先要对每个circRNA进行pvalue的计算,再用FDR错误控制法对pvalue作多重假设检验校正。差异表达circRNA筛选标准:FDR<0.05,|log2FC|>1,得到9个差异表达circRNA。其中,定位于染色体1(染色体上的位置:181512313-181514227)的一circRNA上调差异表达明显,具体序列如下:
SEQ ID NO.1:
CCTGTGGTTCGATCAAGACAGGATAGAGGAACTGGAGAGTTAAGGGTGACGCTAAAATGGAGAGAAGCTATCTTCTGGGGTCTAGCCTTTGTTATTGATGGCTGAGCACCAGAAACATCAATGCAACCGACCCAGCCAAGGATGCCTGCAGAGATAGTGCCCGTTTTTCCTAAAGATATCTCAGTCGAGGCTGAGAAACACATGGGCCTGAAGAGAGAGCCCATCAGTTAAGAGCATGTTCCAAACTCGCAGGGAACCCAAATTCTGTTCTTAGGATCCACTTAAGCAGCTCACAGCTGCCTGTAAATCAGCTCCCGAGAGCCTGAGTTCCTCTTCTGGCCTCCAAGGGAATCTGCAAACAATACGCATGTTCGCACATGCGTGTGCACACACACACACACACACACACAATTGAAACTGTCCTTACTGAGGTTCAGGAAGTGTATGGCCTCTAGTTTCACGCTGTTACTAATCCACTCTCATGCCTACACCCAAATGATGTAACTCATAAAACCATCTTTGAACTTTATTTACAAAAAGAAAATCACCTAAGAGAAACAAGTCACGGGCTAGAGAGATGGGTCAGTCCTATAGAGCAATGGCTGCTCTTGCAGAGGTCCCGAGTTCCATTCCCAGCACCCACGTGGCAGCTCAGAACCATCCATAAGTCCAGTTCGAAAGGATCAGACACCCTCTTCTGATCTCTAAAGGTACCATATGCATATAGCACACGCACATAGGTGCAGGTACATATAAAATAACAAAATAAATCTAAAAAAATATTTAAATAAAAACAAGTATATTCAATCACTATATCTTACCTAATTTTTAAACTTCACTTTGTCCTTCAACCTTGCTGTAAATTATATCTTTTGAACAATGGTGCCGGAAAGCTACAGAATTGTGTATAAAGCTCTCTCTAAATGCCCATGTTCAAATCAGAAACAGTGACAGTCACCTTCTCTGTGTAATAAACTCACTGATTTCCCCCTCTGGTGTAGTAGGGGATCCAGCTTTACCTGAATGGATGTCTCTGAGTGGGACAGGAACTGCTCAGGCTCTGACTGCAGTATCCAGTGTCCCCACCACTGCTGACAAAGTACAGAGTCCTCCCCACGGGTCCCATAGACCCCAGATGCTGGTGCAATAATCGAGCCTCTTGATTTCTCTCTCTGTGAGGTAAAGGTATCCATTCACCTGGAATTCATCCAGAACCTTCAAGAGTCAGAAACATCCTGCAGAACAAAGCAGCGTCTCTGGCCCTCTCCAAGGTCCTGAGAACATCCATGAAGTCCAGATCACTGAGAAGATGAGGGCAGCCTGCCATTGCCACAACCTCCCTGGGAGCAGAGAGGGTGGGCATAGGAGGCAAACACTCTCTTTTTCCCATTCTTCATGGTTCCCATTCATTACATATTAAACATGCAACTTGCAGACTCATCAGACAAAACACCAGGGGCTGGGAGATGGCTCATTACGTTAGGGATTCAAGGATCATAATTTAAATTCTCAGCCCTGGGCACTCTGTCTGGAGCCTCAGTCATTCCGATGTGGGCTCTGCCAACAGGAGACATCCGGCTGCCCTGTACAGGGCAATACTGCAGCCCACCCCCTTTCAGTCTTACATTCACTCACTAATCAATAATCATGGGGCACAGTGCTGAGGCCACTGGCTTGAAGAAGAGCATGAGAACATCGAGTGTGTGCTAATTCAGCATGATCACACGATGTTTCTGTGATGTCAGAGCCACGGTCTCCAGGACACCACCTGGATCCATTCTCTCTCTGAGTTAACACCTTAATTGGAAAGGACATAACGGGAGGATACTGGAGAAAGTCCAGGGTAGAGCAAGTCCTGCCAAGTACCCAGTAGGGAAGTGGTCCCACAGCCACAAACCCTTTTCACCCCTCCATC
2.4差异表达circRNA作为miRNA海绵的功能分析
circRNA的一个重要作用机制是发挥miRNA海绵功能,结合miRNA反应元件(miRNAresponse element,MRE),调控基因表达,影响疾病的发生、反应发展。利用预测软件对上述circRNA与miRNA的结合位点进行分析。结果显示本申请保护的circRNA有68个MRE:rno-let-7b-5p、rno-miR-10a-5p、rno-miR-10b-5p、rno-miR-1188-5p、rno-miR-1199-5p、rno-miR-122-5p、rno-miR-125a-3p、rno-miR-125b-5p、rno-miR-128-1-5p、rno-miR-128-2-5p、rno-miR-128-3p、rno-miR-138-5p、rno-miR-146b-3p、rno-miR-150-5p、rno-miR-17-1-3p、rno-miR-181a-1-3p、rno-miR-184、rno-miR-185-5p、rno-miR-194-3p、rno-miR-199a-5p、rno-miR-203a-5p、rno-miR-205、rno-miR-212-3p、rno-miR-216a-3p、rno-miR-23b-5p、rno-miR-24-1-5p、rno-miR-25-5p、rno-miR-301b-3p、rno-miR-30c-2-3p、rno-miR-324-5p、rno-miR-329-5p、rno-miR-342-5p、rno-miR-345-3p、rno-miR-349、rno-miR-34a-5p、rno-miR-34c-5p、rno-miR-351-5p、rno-miR-3543、rno-miR-3544、rno-miR-3558-3p、rno-miR-3568、rno-miR-3583-3p、rno-miR-361-3p、rno-miR-370-3p、rno-miR-382-5p、rno-miR-421-5p、rno-miR-450b-3p、rno-miR-493-3p、rno-miR-501-5p、rno-miR-505-5p、rno-miR-509-5p、rno-miR-5132-3p、rno-miR-532-3p、rno-miR-540-3p、rno-miR-541-3p、rno-miR-6316、rno-miR-6323、rno-miR-6328、rno-miR-652-3p、rno-miR-665、rno-miR-702-3p、rno-miR-7578、rno-miR-770-3p、rno-miR-7b、rno-miR-873-3p、rno-miR-883-3p、rno-miR-92b-3p、rno-miR-92b-5p。采用Cytoscape绘制circRNA/miRNA关系图(见图1)。
实施例3RT-PCR验证对照组和模型组中circRNA相对表达量
1.模型建立
具体方法同实施例2。假手术组(正常对照组)和缺氧缺血组每组20只。
2.实验方法
2.1组织总RNA提取
参考实施例2
2.2引物设计
针对circRNA的环状闭合结构,设计背靠背引物(divergent primer),GAPDH作为内参,送往引物合成公司合成。
circRNA引物:
上游引物:5’-CCACAGCCACAAACCCTTTT-3’(SEQ ID NO.2)
下游引物:5’-TCTCCATTTTAGCGTCACCCT-3’(SEQ ID NO.3)
目标基因扩增长度:95bp。
2.3反转录
按照PimeScriptTM RT reagent Kit(Perfect Real Time)RR037A(Takara)说明书配置反转录反应体系。首先将各试剂进行瞬离,使用移液器依次添加至去RNA酶的EP管中,充分混匀,置于循环器内孵育将RNA反转为cDNA,反转录条件为37℃15min,85℃5sec,最后4℃保存。
2.4RT-PCR验证样本中circRNA的表达情况
按照SYBR.Premix Ex TaqTM(Tli RNaseH Plus)RR420A(Takara)说明书配置RT-PCR反应体系,具体见下表。首先将各试剂瞬离,使用移液器依次添加至去RNA酶的EP管中,混合均匀,置于ABI 7500PCR仪进行qRT-PCR反应。
表2 RT-PCR反应体系
Figure BDA0002007528570000091
Figure BDA0002007528570000101
反应条件:变性(95℃ 30sec);扩增35个循环(95℃ 5sec;59℃ 30sec)。2.5统计学分析
利用SPSS17.0软件对实验数据进行统计分析。数据用均值士标准差表示。P小于0.05代表差异具有统计学意义,所有实验重复三次。
实时定量PCR扩增曲线整体平行性好,表明各反应管的扩增效率相近,扩增曲线拐点清楚,极限平而无上扬现在,曲线指数期斜率较大,说明扩增效率较高;样本扩增产物溶解曲线为单峰,表明扩增产物唯一,是特异性扩增;RT-PCR的相对定量公式:2-ΔCt×100%,结果显示:circRNA在缺氧缺血模型组中表达量明显高于正常对照组,差异具有统计学意义(P<0.001),是正常组的2.4倍(具体结果见图2),在缺氧缺血的20例脑组织中80%表达趋势符合预期。RT-PCR验证实验结果与数据分析结果基本一致,显示circRNA是很好的辅助诊断分子标志物,可能具有很好的临床应用价值。
序列表
<110> 首都医科大学附属北京友谊医院
<120> circRNA及其在检测缺氧缺血性脑损伤中的应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1915
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cctgtggttc gatcaagaca ggatagagga actggagagt taagggtgac gctaaaatgg 60
agagaagcta tcttctgggg tctagccttt gttattgatg gctgagcacc agaaacatca 120
atgcaaccga cccagccaag gatgcctgca gagatagtgc ccgtttttcc taaagatatc 180
tcagtcgagg ctgagaaaca catgggcctg aagagagagc ccatcagtta agagcatgtt 240
ccaaactcgc agggaaccca aattctgttc ttaggatcca cttaagcagc tcacagctgc 300
ctgtaaatca gctcccgaga gcctgagttc ctcttctggc ctccaaggga atctgcaaac 360
aatacgcatg ttcgcacatg cgtgtgcaca cacacacaca cacacacaca attgaaactg 420
tccttactga ggttcaggaa gtgtatggcc tctagtttca cgctgttact aatccactct 480
catgcctaca cccaaatgat gtaactcata aaaccatctt tgaactttat ttacaaaaag 540
aaaatcacct aagagaaaca agtcacgggc tagagagatg ggtcagtcct atagagcaat 600
ggctgctctt gcagaggtcc cgagttccat tcccagcacc cacgtggcag ctcagaacca 660
tccataagtc cagttcgaaa ggatcagaca ccctcttctg atctctaaag gtaccatatg 720
catatagcac acgcacatag gtgcaggtac atataaaata acaaaataaa tctaaaaaaa 780
tatttaaata aaaacaagta tattcaatca ctatatctta cctaattttt aaacttcact 840
ttgtccttca accttgctgt aaattatatc ttttgaacaa tggtgccgga aagctacaga 900
attgtgtata aagctctctc taaatgccca tgttcaaatc agaaacagtg acagtcacct 960
tctctgtgta ataaactcac tgatttcccc ctctggtgta gtaggggatc cagctttacc 1020
tgaatggatg tctctgagtg ggacaggaac tgctcaggct ctgactgcag tatccagtgt 1080
ccccaccact gctgacaaag tacagagtcc tccccacggg tcccatagac cccagatgct 1140
ggtgcaataa tcgagcctct tgatttctct ctctgtgagg taaaggtatc cattcacctg 1200
gaattcatcc agaaccttca agagtcagaa acatcctgca gaacaaagca gcgtctctgg 1260
ccctctccaa ggtcctgaga acatccatga agtccagatc actgagaaga tgagggcagc 1320
ctgccattgc cacaacctcc ctgggagcag agagggtggg cataggaggc aaacactctc 1380
tttttcccat tcttcatggt tcccattcat tacatattaa acatgcaact tgcagactca 1440
tcagacaaaa caccaggggc tgggagatgg ctcattacgt tagggattca aggatcataa 1500
tttaaattct cagccctggg cactctgtct ggagcctcag tcattccgat gtgggctctg 1560
ccaacaggag acatccggct gccctgtaca gggcaatact gcagcccacc ccctttcagt 1620
cttacattca ctcactaatc aataatcatg gggcacagtg ctgaggccac tggcttgaag 1680
aagagcatga gaacatcgag tgtgtgctaa ttcagcatga tcacacgatg tttctgtgat 1740
gtcagagcca cggtctccag gacaccacct ggatccattc tctctctgag ttaacacctt 1800
aattggaaag gacataacgg gaggatactg gagaaagtcc agggtagagc aagtcctgcc 1860
aagtacccag tagggaagtg gtcccacagc cacaaaccct tttcacccct ccatc 1915
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ccacagccac aaaccctttt 20
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tctccatttt agcgtcaccc t 21

Claims (9)

1.一种与缺氧缺血性脑损伤相关的circRNA,其特征在于,所述circRNA对应的DNA序列如SEQ ID NO.1所示。
2.一种采用测序技术、核酸杂交技术或核酸扩增技术检测样品circRNA的表达水平制剂在制备检测缺氧缺血性脑损伤试剂中的应用,其特征在于,所述circRNA对应的DNA序列为SEQ ID NO.1。
3.根据权利要求2所述的应用,其特征在于,circRNA在缺氧缺血性脑损伤样品中高表达。
4.根据权利要求2所述的应用,其特征在于,采用二代测序技术、三代测序技术、探针杂交技术、基因芯片技术或荧光定量PCR技术检测样品中circRNA的表达水平。
5.根据权利要求4所述的应用,其特征在于,试剂含有与circRNA杂交的探针或扩增circRNA的特异性引物。
6.一种检测缺氧缺血性脑损伤的荧光定量PCR试剂盒,其特征在于,试剂盒采用特异的引物检测样品circRNA的表达水平,circRNA对应的DNA序列为SEQ ID NO.1。
7.根据权利要求6所述的荧光定量PCR试剂盒,其特征在于,引物序列为SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3。
8.根据权利要求6所述的荧光定量PCR试剂盒,其特征在于,试剂盒组分还包括内参引物、荧光定量PCR反应液。
9.根据权利要求2所述的应用,其特征在于,样品为脑组织或外周血。
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