CN109913545B - 一种缺氧缺血性脑损伤诊断靶点及应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种缺氧缺血性脑损伤诊断靶点及应用。新生儿缺氧缺血性脑病是儿童神经系统损伤的常见原因之一，目前没有有效的诊断方法，本申请对缺氧缺血性脑损伤模型进行circRNA转录组测序，运用生物信息学分析，发现了9个与缺氧缺血性脑损伤非常相关的circRNA，并进行了验证，本申请为缺氧缺血性脑损伤的诊断提供了潜在生物标志物，为其临床基因检测奠定基础。

Description

一种缺氧缺血性脑损伤诊断靶点及应用

技术领域

本发明属于疾病检测领域，具体涉及缺氧缺血性脑损伤分子诊断靶点及其应用。

背景技术

新生儿缺氧缺血性脑病(HIE)是儿童神经系统损伤的常见原因之一，该病是由于围产期窒息缺氧所引起的脑损伤，凡是造成母体和胎儿间的血液循环和气体交换障碍，使血氧浓度降低者均可造成窒息，窒息严重者可造成永久性神经功能损害。目前临床表现是诊断HIE的主要依据，同时具备以下4条者可确诊：1)有明确的可导致胎儿宫内窘迫的异常产科病史，以及严重的胎儿宫内窘迫表现(胎心小于100次/min，持续5min以上；和/或羊水III度污染)，或者在分娩过程中有明显的窒息；2)在出生时出现重度的窒息，指Apgar评分在1min小于等于3分，进而延续至5min时评分仍然小于等于5分，和/或患儿在出生时脐动脉血气分析结果显示pH小于7.00；3)患儿在出生后不久会出现神经系统的症状，并持续至1d以上，例如：患儿意识的改变(兴奋过度、嗜睡、昏迷)，肌张力增高或减弱的改变，吸吮反射的减弱或消失、拥抱反射减弱或消失等原始反射活动的异常，患儿病情严重时会出现惊厥，脑干征(呼吸节律改变、瞳孔改变、对光反应迟钝或消失)和前囱张力增高；4)排除电解质紊乱、产伤和颅内出血等原因引发的抽搐、代谢遗传性疾病以及宫腔感染和其他由于先天性疾病所引发的脑损伤。但是上述诊断无法及时有效的进行孕期诊断。

环状RNA(circular RNA，circRNA)是一类通过反向剪接将3’和5’末端连接起来形成的环形RNA分子，主要参与转录及转录后基因表达的调节。按照剪接来源的不同，circRNA可分为内含子来源环状RNA以及外显子来源环状RNA。目前研究表明circRNA可能在疾病的发生和发展中发挥着重要的作用，有望成为某些疾病过程的潜在的生物标志物。

发明人对缺氧缺血性脑损伤模型进行circRNA转录组测序以期发现用于该病诊断的生物标志物，通过对测序数据的生物信息学分析，发现了9个与缺氧缺血性脑损伤非常相关的circRNA，并进行了RT-PCR验证，本申请为缺氧缺血性脑损伤的诊断提供了潜在生物标志物，为临床基因检测奠定研究基础。

发明内容

本发明的目的在于提供一种与缺氧缺血性脑损伤相关的circRNA，序列与SEQ IDNO.1具有90％以上序列同源性。

术语“同源”是主要是指序列上的同源，也就是用来说明两个或多个RNA或DNA序列具有相同的祖先。同源的序列一般有相似的功能。一般来说，当相似程度高于50％时，常推测检测序列和目标序列可能是同源序列；当相似性程度低于20％时，就难以确定其是否具有同源性。

优选的，序列与SEQ ID NO.1具有95％、96％、97％、98％或99％以上序列同源性。

更优选的，circRNA序列为SEQ ID NO.1。

本发明的目的在于提供一种检测缺氧缺血性脑损伤的试剂，试剂采用测序技术、核酸杂交技术或核酸扩增技术检测样品circRNA及其调控的基因的表达水平。

进一步，circRNA调控的基因选自下列miRNA中的一种或几种：rno-let-7a-2-3p、rno-miR-103-1-5p、rno-miR-1199-3p、rno-miR-125a-5p、rno-miR-125b-5p、rno-miR-127-5p、rno-miR-138-1-3p、rno-miR-146b-3p、rno-miR-181c-3p、rno-miR-182、rno-miR-1843b-5p、rno-miR-188-5p、rno-miR-194-3p、rno-miR-1956-3p、rno-miR-212-5p、rno-miR-219b、rno-miR-25-3p、rno-miR-26a-3p、rno-miR-26b-3p、rno-miR-30b-3p、rno-miR-30c-1-3p、rno-miR-30d-3p、rno-miR-31b、rno-miR-324-5p、rno-miR-326-5p、rno-miR-328a-3p、rno-miR-328b-3p、rno-miR-343、rno-miR-347、rno-miR-349、rno-miR-351-5p、rno-miR-3542、rno-miR-3544、rno-miR-3551-5p、rno-miR-3573-3p、rno-miR-3586-3p、rno-miR-3594-5p、rno-miR-370-3p、rno-miR-380-5p、rno-miR-423-5p、rno-miR-431、rno-miR-433-3p、rno-miR-483-3p、rno-miR-487b-5p、rno-miR-488-5p、rno-miR-497-3p、rno-miR-500-5p、rno-miR-504、rno-miR-551b-3p、rno-miR-6322、rno-miR-6323、rno-miR-6326、rno-miR-665、rno-miR-668、rno-miR-674-5p、rno-miR-676、rno-miR-742-5p、rno-miR-764-5p、rno-miR-880-3p、rno-miR-92a-2-5p、rno-miR-92a-3p、rno-miR-93-5p。

进一步，circRNA在缺氧缺血性脑损伤样本中高表达。

本发明中的核酸杂交技术包括但不限于原位杂交(ISH)、微阵列或Northern杂交。

优选的，采用二代测序技术、三代测序技术、探针杂交技术、基因芯片技术或荧光定量PCR技术检测样本中circRNA及其调控的基因的表达水平。

优选的，试剂含有与circRNA杂交的探针或扩增circRNA的特异性引物。

一种缺氧缺血性脑损伤检测荧光定量PCR试剂盒，试剂盒采用特异的引物检测SEQID NO.1的表达水平。

进一步，引物序列为SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3。

进一步，该PCR试剂盒适合于目前存在市场上的所有类型荧光定量基因扩增仪，灵敏度高，定量快速准确、稳定性好，具有良好的应用前景。

进一步，上述荧光定量PCR试剂盒组分包括：特异性引物、内参引物、荧光定量PCR反应液。其中所述的特异性引物包括上游引物和下游引物，上游引物序列为SEQ ID NO.2，下游引物序列为SEQ ID NO.3。所述内参引物为GAPDH内参引物。

所述的试剂盒还包含RNA抽提试剂。优选

Reagent进行样本RNA提取。

本发明的目的在于提供上述试剂在制备缺氧缺血性脑损伤诊断制剂中的应用。

优选的，样本为脑组织或外周血。更优选的，样本为大鼠的脑组织。

本申请的优点：

1、本申请为缺氧缺血性脑损伤的诊断提供了新的分子诊断标志物。

2、检测发现本申请提供的circRNA在缺氧缺血性脑损伤中特异性高表达，检测准确率较高，提供了一种更加快速、准确的检测方法。

定义：

环状RNA(circular RNA，circRNA)，亦称环形RNA，是最近几年研究确认的一种新型的非编码RNA(noncoding RNA，ncRNA)分子。根据RNA构成的不同，环状RNA可分为三类：外显子环状RNA(exon circular RNA，ecircRNA)、内含子环状RNA(circular intronic RNAs,ciRNAs)和外显子-内含子circRNA(exon-intron circRNA,EIciRNA)。

“探针”指能与另一分子的特定序列或亚序列或其它部分结合的分子。除非另有指出，术语“探针”通常指能通过互补碱基配对与另一多核苷酸结合的多核苷酸探针。

所述探针具有与靶点基因的特定的碱基序列互补的碱基序列。这里，所谓“互补”，只要是杂交即可，可以不是完全互补。这些多核苷酸通常相对于该特定的碱基序列具有80％以上、优选90％以上、更优选95％以上、特别优选100％的同源性。这些探针可以是DNA，也可以是RNA，另外，可以为在其一部分或全部中核苷酸通过PNA(Polyamide nucleicacid，肽核酸)、LNA(注册商标，locked nucleic acid，Bridged Nucleic Acid，交联化核酸)、ENA(注册商标，2′-O,4′-C-Ethylene-bridged nucleic acids)、GNA(Glycerolnucleic acid，甘油核酸)、TNA(Threose nucleic acid，苏糖核酸)等人工核酸置换得到的多核苷酸。

本发明中的术语“杂交”用于指代互补核酸的配对。杂交和杂交强度受诸如以下的因素影响：核酸之间的互补程度、所涉及的条件的严格性、形成的杂交体的Tm和核酸内的G:C比率。

测序技术主要为高通量测序技术(High-throughput sequencing)，又称下一代测序技术(next generation sequencing)，一次对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定，极大提高了测序效率。高通量测序平台的代表是罗氏公司(Roche)的454测序仪(RochGSFLX sequencer)，Illumina公司的Solexa基因组分析仪(Illumina Genome Analyzer)和ABI的SOLiD测序仪(ABI SOLiD sequencer)。

Northern杂交，又称RNA印迹技术为最经典的检测真核生物RNA大小，估计其丰度的实验方法。基本原理如下：首先在载体(如硅片、微球或膜等)上固定RNA样本，再与经过标记的探针杂交，洗涤多余的杂交探针后进行信号检测；也可以在载体上先固定与靶RNA序列互补的DNA探针，然后与经过标记的样本RNA杂交，再进行信号检测。信号标记的方法包括同位素标记、荧光标记和纳米金标记等。

附图说明

图1是circRNA及其调控的miRNA网络图；

图2是circRNA在缺血缺氧组和正常对照组中差异表达图。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照厂商所建议的条件实施检测。

实施例1缺氧缺血大鼠模型的建立和取样

7日龄新生SD大鼠，体质量10-14g。随机分成两组，假手术组(正常对照组)和缺氧缺血组，每组3只。乙醚麻醉下，颈正中切口，分离左侧颈总动脉。假手术组不再做任何处理；手术组结扎并切断左侧颈总动脉，休息1h后，置于8％氧氮混合气体中2h。于实验后1d乙醚麻醉下每组、每一时间点分别断头处死大鼠，取脑组织立即放入液氮冷冻保存。

实施例2高通量测序及数据分析

2.1组织总RNA提取及质检

(1)将各组组织在冰上剪碎，取适量(50-100mg)组织于去RNA酶的EP管中加入lml预冷的Trizol，吹打均匀后于冰上静置10min；

(2)加入200μl预冷的氯仿，剧烈震荡30sec后于冰上静置15min，4℃14000rpm/min离心20min；

(3)取出上清于新的去RNA酶的EP管中(注意避免触及中间层)，加入等体积预冷的异丙醇(约500μl)，混匀后冰上静置0.5-1h,4℃14000rpm/min离心20min；

(4)弃上清，加入lml预冷的75％乙醇，颠倒混匀，4℃14000rpm/min离心20min；

(5)弃上清，加入lml预冷的75％乙醇，颠倒混匀，4℃14000rpm/min离心20min；

(6)弃上清，RNA沉淀于超净台内晾干后，加入适量DEPC水充分吹打溶解沉淀。

RNA质量检测标准，A260/A280值介于1.8与2.1之间。2.0为最优，大于2.1，提示RNA降解过多，小于1.8提示存在蛋白等污染。结果表明RNA纯度较高，无蛋白质或DNA等污染。

2.2 circRNA测序检测

(1)全转录组测序建链特异性文库流程，包括Ribo-Zero Deplete and FragmentRNA、Synthesize First Strand cDNA、Synthesize Second Strand cDNA、纯化、Adenylate3'Ends、Ligate Adapters、纯化、Enrich DNA Fragments、纯化、文库质检；

(2)原始测序数据及质量控制

原始测序数据及评估。高通量测序得到的原始图像数据文件经碱基识别(BaseCalling)分析转化为原始测序序列，被称为Raw Data或Raw Reads，结果以FASTQ文件格式存储，其中包含测序序列(reads)的序列信息以及其对应的测序质量信息。测序得到大量的样本数据。鉴于数据错误率对结果的影响，对原始数据进行质量预处理，并对整个质控过程中的reads数进行统计汇总。

测序序列质量评估，包括碱基质量分布和GC含量分布。

circRNA测序序列评估，包括测序饱和度分析、测序随机性评估、Reads在不同元件的富集分析、基因覆盖度分析、Reads在参考基因组上的分布。

(3)circRNA鉴定、注释、定量

测序序列使用CIRI软件进行circRNA预测，将预测结果与现有circRNA数据库比对，得到己知cricRNA和预测的cricRNA。在circRNA预测方面，主要基于数据库中释放的蛋白编码基因及转录本的注释信息，通过位置信息比对，获取与circRNA在位置上有着最大重叠的转录本，基于该转录本信息，对circRNA的序列进行预测。

CircRNA的注释主要是与已知数据比较、circRNA来源基因注释、circRNA基因结构分析。

circRNA的定量。用RPM对circRNA进行定量，对各样本circRNA表达量及丰度(RPM)进行统计。

2.3差异表达circRNA分析

利用CircSeq数据比较分析两个样品中同一个circRNA是否存在差异表达的时候，可以选取两个标准：其一，foldChange，即两组样品中同一个circRNA表达水平的变化倍数；其二，pvalue或FDR，FDR值的计算方法先要对每个circRNA进行pvalue的计算，再用FDR错误控制法对pvalue作多重假设检验校正。差异表达circRNA筛选标准：FDR<0.05，|log2FC|>1，得到9个差异表达circRNA。其中，定位于染色体3(染色体上的位置:58448049|58452428)的一circRNA上调差异表达明显，具体序列如下：

SEQ ID NO.1：

GCCCTCTCTCCAGCCCTTCTTCTTCTAATTACACTTGTCTTTTGCCCTGAAGGCCGGCATTGGAACTTAACCTCTGAAGACAAGCTGCCCTGAGCTATAGTGGTTACACAGAATTTCCTAAGTTGCCTGGTTGTATGAGTCTAGCCAGAGACAGAACTAGAATCAAGCTCCTGAAAATAACTGGGGAACCAAATGGGAATGCATGCGGGGTACTTGGGAATTGATAGTGAGGAGAGGCAAGTGGTCTTGTGTAGATAGACGTTTTTTGCAACCTACTTTTAATAGGATTCAACCTCTCCTCTAGCCCACCACCAGCAGAAGTAGTAAAAGAGAAAAGTTGACATCATCCTACAATTAGGATATGGGGGAAGCAGACCTATTTAGCAATAGTTCTTTGGAGGAGAGCTCAACCTTCTTGGGCAGCAGTTCTCCTGTAGCCAACACTAAATACGATTCAGCGGCTGCAGACCAGTTCTCTAGGCAGGCGGACACCAGGCAAGCTGTATCAATCCTGAGGAAACCACTAGGCTCACCAACTTGCCTAAGGAGAGGCCGCAGAGGCAGCAAGAGGCAGCAGGAACCTCGCTTGGGTGAGTTTCTCTCAATGGTGGTGTTACCACAAGTTGAGCTCAACAATGCTATGCAATACATGCGTGTCTTTAGCAAAGAATAGCAAGGCGGAACAAACCAAAGCTCAGTGCTCGTCTCCCACTGTCTGTGAGGTCATATTTATACTCCTTCATTAAGCGTCCTTTCACATGTTTGCTATAGCAAACTGTCCTTTCACCAGTGTCTGCTTCAGGAAAAGAACCTTTCATGTGTTTGCTTTAGCAAGATATCCTTTCACCTGTGTGCCCCAGCAAACCACCATTCGCCATAACTAACTTCCCAAAGAACTAGAAGTTTCCATTTAATTCTTGGTTATGTTTAACTTATTAGATGCACTGTTAACTACCTGTTTAATCTTTTGGGGGCCCAAGAGTCAGAGAATGGGAGTCTTGGGGTTGGTTAACACTGCTCTGGCAGGCTCTGAGATGAGTGGGAAGACTGTGTGCTATGAGGATGGGGTATGTGGCCAGCTGGGTCCCCACTGTATCTTCCTCGTGGGTTTGGGTACAGCCCTAGAGTCAAATAACTTGATCATTGTGGTTCTTCAGTGTCTGGTCATCAGGGTAACTCCTGGGGGTTCTTCCATACAAAGTAGTCTCCTGAGATTGTCCCAGATCAGTGGCATCAATTTCCATACCTGTGACCCCAGATTCTGTTCCCACAGAGCTCTGGGTTTGAACTAGAGACACATCCCTTATGTATTTGAAGGTAGTTTGTGAGGTGCCGGAGAAGAACAGAGCCTGGGGCTGGTTGGAATCATATCCTGTTCTGTCCTTTGCTACTATGGCCTTGTGTAGGATTTTTTTTTTTTTTTTTGTTCTTTTTTTCGGAGCTGGGGACCGAACCCAGGGCCTTGCGCTTCCTAGGCAAGCGCTTTACCACTGAGCTAAATCCCCAACCCCCTTGTGTAGGATTTTTAACCTTTCTCTCTCATAATGGCAAGGACAGTCTTGGGCACCTTACATCAGTTTTGGCCAGAGGAAACACATCGAGTTTGCTAAATAAACCTGGAAACCCAGGTGAGTGTGGCAAGTTGGTCTTAGTCCTACCTCTTGTGGGGAGAGCGTGCATCCTTTGGCTTTGATTTGGTTTGCGTTGGTGTGTTCATTCCCCTTTCCTCCTGTTCATCAGTTACTATGCACTGGATGGACTGTTTTCCTCAGAAGTGCTGTCTTGTAGCCGTGATGCCATCAATAAATCTCTGTGAGGTCTCAGTCCTCCTAGGAGACAAGTGGGCAGATGTGTGGGAAGGCATGAAGGGCTCCAGCACAGCCAGGTGACTGCGGAGAACACCCTTGGAGAGCAACAGGGGTGGGCTCATTAGGATTGCTGGCTGTCTGATGGCCAGGATTTGTCACACCTCTGACTGTGAATGCCCCTCCCTATTTGGGGTGGGGGTCCTGAGCCATTTACACCCTTCTTGCCAGTGCTGATTTGTGTTTCAGAGTCCCTCACGTTTATTGAACGTTTGCTAGGAAGGAACTTGTACAAATGGTGCATCTAATTGTTGTCAACGCAAGGTTGAAGGATGCATGGGAAGGTGAGGAAGCTGCATTTTCTGAGGTTTGTTAACCTGGAATTTGGTGTTTTCGAGCAGCGATCTCTTAGAACTTAGAGGCTGATTGTGAGTGAGTTAACAACAGGGGCAGGTAACTGGGCCCAGTTCCTACTTAGTCCCTGTCCGCCTAATGGCAGGATGTGATAACTAGCATTTCACCCAGTCTGGGTCTTCTGTCATAAGTAAGGGAAGATAGTCAAATCTACATGGTGATCCTGTGCCGATGTGTTCCAAGGATATCGGCTTTCATGGGAGCAGACCCTCCTCACATCATCCTCACCTGTGTCCTAGTGTCTGACTCTCTGGTCATGTCGTTAAATCCCCAACAGACAGGAGCCGTTTCTAAACCTTCACATGGCAAGACTGCTGAGAAAACGTTCTAATCCGTTAGGAAGTTAATTAACCTAGGACGTTAATTAAGAAAGAAAACTGCTCTGCTCTCAGGGTGTAGAGAGAGGGACCACTGGAGATGTGTGTAGAGGGCCAGAGGGGATAGGCCCAGGAGGGCTGTTCTCGTGCTTATCTACCAACCGGGTGGCTACGTCTTCGTGTCCTACCATCTGAAACTTCAGAAAAGGCAAACAACCCACATCAGACACAGAATAGGAAAAACGCTTCAGAGAGAAATGCACCTTTGAGAGTAGAAGGGAAAGCAATCCGTAGGTAATTTTAGAAGGACGGCTGGGCGAGCTACGTGGAGAGCAGACACTGAGGGAAGCACAGGATTGCCCGTTTACCAAATCTGCTTGCTTTGCTTGCCGATACCCATGCCACGTCACGACGTCACCACGGTTTCTCCTCGCTGACAAGCCTATTCACTGGTGCTTGGATTGTCTTCATTATCTGAGCGCTGACTGTCAGACATGATAAACGCCTCAGACTCAGAGGGGATGTTGTTACTCTAAGACTCCTCAGCCAACTACCTGTTCTCTTCAGGACATGCTGTCTTCCATTAAGAGCAGCCTTTATGTTTCTTCTAACTCATGATATGAAGTGAAGTAGAGGCCCTCAGTCACGTGACTTAGAGGCAGATGTGTGGAATGTGGGTTGAGTATGAGGCTCCTCTGTTAATGCTTTTGCTGAAGCGAAGCCTCCCTGCTGCTGATAAATCTGTCAGATGTTGGCCTAACCTATTGCTAATAGGATATACAGTGCTTGTTTCTGTAGAACAAAGGTGTCAAAGCAATTTTCCAAAACTACCAAGGGACCGAAGGTAGAGAGGAGAAAACTTTGGATCTTGGGGCATTTACCATCCAAACTGTACCATTCATGAGCCTGGAAATACAGAGATGGGTCTGAACCCTTCAGAGCCCTTCTAGAGAGGCTCAAGAGCAGAAGTGCTTCCAGAAGTGGATACTCCAGAGGTCAGCAGAGCGCCTCTTAGAGATCTGAGAGGCATCCTGATACCAAGGACATGGTAAGGTCAGCTCAGATTCCTGTGAGATAAGGCTGCCTAGGAAGAAAAGTCTTTTTGAATGCCTGCACTGTGTTTACAAAGGGCCCAGGCTGCTGCTGAGAAAGAATTGTGGGGCTGAAGAGCCATCCTACCACTCAGCTAGTGCACCCAAGAGGGAAGCAGGAGAGAGGTTGGTCCAGCTCTCTTACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACAGAGTCACCATACCTCTGGCTTAGCAGAAGACTGAAGAAATTTTTCAGTGCCCCAGGATAAGAAAATGAGGTCATTTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTTTTGAGTATCATAGGTATCATCAGAATGGGAATATGTTCTGGACCTGTCAGAGTAATCATGGCCAACCCATGCTGGTTTTTCTATAGCTGTGAATCATTGAATAGAAAGTCACTACAAACTTAGTGTGTATCAGGCACTGTTCTAGTAATGGAGCTGCTCCAGACAAATGTCCCTGTCCATCCTCTGCTGGAGAAGATAAACAATAGACAACGTAAGAAGGTGTTTTATGGTAGGCGGCAACACAAGATAAAGTGGAGAAAGGGGGTTGGGAGTGGGAATGAGGTAGGGAATGGTGGTAGTAGGTCAGTCAGGCATAACTTCACTGAAGCAGATGCTAGAAAGAATAGCTTGGGAGGGTGGAGGTGGGGAGTGGGAGAGAAAGGCAAGAGACCCATGCCTGGCATGTTCAGGAAAAGCCAGGGGAACACTAGTCTGCTT

2.4差异表达circRNA作为miRNA海绵的功能分析

circRNA的一个重要作用机制是发挥miRNA海绵功能，结合miRNA反应元件(miRNAresponse element，MRE)，调控基因表达，影响疾病的发生、反应发展。

利用预测软件对上述circRNA与miRNA的结合位点进行分析。结果显示本申请保护的circRNA有62个MRE：rno-let-7a-2-3p、rno-miR-103-1-5p、rno-miR-1199-3p、rno-miR-125a-5p、rno-miR-125b-5p、rno-miR-127-5p、rno-miR-138-1-3p、rno-miR-146b-3p、rno-miR-181c-3p、rno-miR-182、rno-miR-1843b-5p、rno-miR-188-5p、rno-miR-194-3p、rno-miR-1956-3p、rno-miR-212-5p、rno-miR-219b、rno-miR-25-3p、rno-miR-26a-3p、rno-miR-26b-3p、rno-miR-30b-3p、rno-miR-30c-1-3p、rno-miR-30d-3p、rno-miR-31b、rno-miR-324-5p、rno-miR-326-5p、rno-miR-328a-3p、rno-miR-328b-3p、rno-miR-343、rno-miR-347、rno-miR-349、rno-miR-351-5p、rno-miR-3542、rno-miR-3544、rno-miR-3551-5p、rno-miR-3573-3p、rno-miR-3586-3p、rno-miR-3594-5p、rno-miR-370-3p、rno-miR-380-5p、rno-miR-423-5p、rno-miR-431、rno-miR-433-3p、rno-miR-483-3p、rno-miR-487b-5p、rno-miR-488-5p、rno-miR-497-3p、rno-miR-500-5p、rno-miR-504、rno-miR-551b-3p、rno-miR-6322、rno-miR-6323、rno-miR-6326、rno-miR-665、rno-miR-668、rno-miR-674-5p、rno-miR-676、rno-miR-742-5p、rno-miR-764-5p、rno-miR-880-3p、rno-miR-92a-2-5p、rno-miR-92a-3p、rno-miR-93-5p。采用Cytoscape绘制circRNA/miRNA关系图(结果见图1)。

实施例3 RT-PCR验证对照组和模型组中circRNA相对表达量

1.模型建立

具体方法同实施例2。假手术组(正常对照组)和缺氧缺血组每组20只。

2.实验方法

2.1组织总RNA提取

参考实施例2

2.2引物设计

针对circRNA的环状闭合结构，设计背靠背引物(divergent primer)，GAPDH作为内参，送往引物合成公司合成。

circRNA引物：

上游引物：5’-AAGCCAGGGGAACACTAGTC-3’(SEQ ID NO.2)

下游引物：5’-GTTAAGTTCCAATGCCGGCC-3’(SEQ ID NO.3)

目标基因扩增长度：96bp。

2.3反转录

按照PimeScript^TMRT reagent Kit(Perfect Real Time)RR037A(Takara)说明书配置反转录反应体系。首先将各试剂进行瞬离，使用移液器依次添加至去RNA酶的EP管中，充分混匀，置于循环器内孵育将RNA反转为cDNA，反转录条件为37℃15min，85℃5sec，最后4℃保存。

2.4 RT-PCR验证样本中circRNA的表达情况

按照SYBR.Premix Ex TaqTM(Tli RNaseH Plus)RR420A(Takara)说明书配置RT-PCR反应体系，具体见下表。首先将各试剂瞬离，使用移液器依次添加至去RNA酶的EP管中，混合均匀，置于ABI 7500PCR仪进行qRT-PCR反应。

表2 RT-PCR反应体系

组分	体积
		SYBR Premix Ex Taq(Tli RNaseH Plu)	10μl
上游引物	1μl
		下游引物	1μl
DNA模板	2μl
		ddH<sub>2</sub>O	6μl
	补平至20μl

反应条件：变性(95℃30sec)；扩增35个循环(95℃5sec；59℃30sec)。

2.5统计学分析

利用SPSS17.0软件对实验数据进行统计分析。数据用均值士标准差表示。P小于0.05代表差异具有统计学意义，所有实验重复三次。

实时定量PCR扩增曲线整体平行性好，表明各反应管的扩增效率相近，扩增曲线拐点清楚，极限平而无上扬现在，曲线指数期斜率较大，说明扩增效率较高；样本扩增产物溶解曲线为单峰，表明扩增产物唯一，是特异性扩增；RT-PCR的相对定量公式：2-ΔCt×100％，结果显示：circRNA在缺氧缺血模型组中表达量明显高于正常对照组，差异具有统计学意义(P<0.001)，是正常组的1.7倍(具体结果见图2)，在缺氧缺血的20例脑组织中75％表达趋势符合预期。RT-PCR验证实验结果与数据分析结果基本一致，显示circRNA是很好的辅助诊断分子标志物，可能具有很好的临床应用价值。

序列表

<110> 首都医科大学附属北京友谊医院

<120> 一种缺氧缺血性脑损伤诊断靶点及应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 4380

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gccctctctc cagcccttct tcttctaatt acacttgtct tttgccctga aggccggcat 60

tggaacttaa cctctgaaga caagctgccc tgagctatag tggttacaca gaatttccta 120

agttgcctgg ttgtatgagt ctagccagag acagaactag aatcaagctc ctgaaaataa 180

ctggggaacc aaatgggaat gcatgcgggg tacttgggaa ttgatagtga ggagaggcaa 240

gtggtcttgt gtagatagac gttttttgca acctactttt aataggattc aacctctcct 300

ctagcccacc accagcagaa gtagtaaaag agaaaagttg acatcatcct acaattagga 360

tatgggggaa gcagacctat ttagcaatag ttctttggag gagagctcaa ccttcttggg 420

cagcagttct cctgtagcca acactaaata cgattcagcg gctgcagacc agttctctag 480

gcaggcggac accaggcaag ctgtatcaat cctgaggaaa ccactaggct caccaacttg 540

cctaaggaga ggccgcagag gcagcaagag gcagcaggaa cctcgcttgg gtgagtttct 600

ctcaatggtg gtgttaccac aagttgagct caacaatgct atgcaataca tgcgtgtctt 660

tagcaaagaa tagcaaggcg gaacaaacca aagctcagtg ctcgtctccc actgtctgtg 720

aggtcatatt tatactcctt cattaagcgt cctttcacat gtttgctata gcaaactgtc 780

ctttcaccag tgtctgcttc aggaaaagaa cctttcatgt gtttgcttta gcaagatatc 840

ctttcacctg tgtgccccag caaaccacca ttcgccataa ctaacttccc aaagaactag 900

aagtttccat ttaattcttg gttatgttta acttattaga tgcactgtta actacctgtt 960

taatcttttg ggggcccaag agtcagagaa tgggagtctt ggggttggtt aacactgctc 1020

tggcaggctc tgagatgagt gggaagactg tgtgctatga ggatggggta tgtggccagc 1080

tgggtcccca ctgtatcttc ctcgtgggtt tgggtacagc cctagagtca aataacttga 1140

tcattgtggt tcttcagtgt ctggtcatca gggtaactcc tgggggttct tccatacaaa 1200

gtagtctcct gagattgtcc cagatcagtg gcatcaattt ccatacctgt gaccccagat 1260

tctgttccca cagagctctg ggtttgaact agagacacat cccttatgta tttgaaggta 1320

gtttgtgagg tgccggagaa gaacagagcc tggggctggt tggaatcata tcctgttctg 1380

tcctttgcta ctatggcctt gtgtaggatt tttttttttt tttttgttct ttttttcgga 1440

gctggggacc gaacccaggg ccttgcgctt cctaggcaag cgctttacca ctgagctaaa 1500

tccccaaccc ccttgtgtag gatttttaac ctttctctct cataatggca aggacagtct 1560

tgggcacctt acatcagttt tggccagagg aaacacatcg agtttgctaa ataaacctgg 1620

aaacccaggt gagtgtggca agttggtctt agtcctacct cttgtgggga gagcgtgcat 1680

cctttggctt tgatttggtt tgcgttggtg tgttcattcc cctttcctcc tgttcatcag 1740

ttactatgca ctggatggac tgttttcctc agaagtgctg tcttgtagcc gtgatgccat 1800

caataaatct ctgtgaggtc tcagtcctcc taggagacaa gtgggcagat gtgtgggaag 1860

gcatgaaggg ctccagcaca gccaggtgac tgcggagaac acccttggag agcaacaggg 1920

gtgggctcat taggattgct ggctgtctga tggccaggat ttgtcacacc tctgactgtg 1980

aatgcccctc cctatttggg gtgggggtcc tgagccattt acacccttct tgccagtgct 2040

gatttgtgtt tcagagtccc tcacgtttat tgaacgtttg ctaggaagga acttgtacaa 2100

atggtgcatc taattgttgt caacgcaagg ttgaaggatg catgggaagg tgaggaagct 2160

gcattttctg aggtttgtta acctggaatt tggtgttttc gagcagcgat ctcttagaac 2220

ttagaggctg attgtgagtg agttaacaac aggggcaggt aactgggccc agttcctact 2280

tagtccctgt ccgcctaatg gcaggatgtg ataactagca tttcacccag tctgggtctt 2340

ctgtcataag taagggaaga tagtcaaatc tacatggtga tcctgtgccg atgtgttcca 2400

aggatatcgg ctttcatggg agcagaccct cctcacatca tcctcacctg tgtcctagtg 2460

tctgactctc tggtcatgtc gttaaatccc caacagacag gagccgtttc taaaccttca 2520

catggcaaga ctgctgagaa aacgttctaa tccgttagga agttaattaa cctaggacgt 2580

taattaagaa agaaaactgc tctgctctca gggtgtagag agagggacca ctggagatgt 2640

gtgtagaggg ccagagggga taggcccagg agggctgttc tcgtgcttat ctaccaaccg 2700

ggtggctacg tcttcgtgtc ctaccatctg aaacttcaga aaaggcaaac aacccacatc 2760

agacacagaa taggaaaaac gcttcagaga gaaatgcacc tttgagagta gaagggaaag 2820

caatccgtag gtaattttag aaggacggct gggcgagcta cgtggagagc agacactgag 2880

ggaagcacag gattgcccgt ttaccaaatc tgcttgcttt gcttgccgat acccatgcca 2940

cgtcacgacg tcaccacggt ttctcctcgc tgacaagcct attcactggt gcttggattg 3000

tcttcattat ctgagcgctg actgtcagac atgataaacg cctcagactc agaggggatg 3060

ttgttactct aagactcctc agccaactac ctgttctctt caggacatgc tgtcttccat 3120

taagagcagc ctttatgttt cttctaactc atgatatgaa gtgaagtaga ggccctcagt 3180

cacgtgactt agaggcagat gtgtggaatg tgggttgagt atgaggctcc tctgttaatg 3240

cttttgctga agcgaagcct ccctgctgct gataaatctg tcagatgttg gcctaaccta 3300

ttgctaatag gatatacagt gcttgtttct gtagaacaaa ggtgtcaaag caattttcca 3360

aaactaccaa gggaccgaag gtagagagga gaaaactttg gatcttgggg catttaccat 3420

ccaaactgta ccattcatga gcctggaaat acagagatgg gtctgaaccc ttcagagccc 3480

ttctagagag gctcaagagc agaagtgctt ccagaagtgg atactccaga ggtcagcaga 3540

gcgcctctta gagatctgag aggcatcctg ataccaagga catggtaagg tcagctcaga 3600

ttcctgtgag ataaggctgc ctaggaagaa aagtcttttt gaatgcctgc actgtgttta 3660

caaagggccc aggctgctgc tgagaaagaa ttgtggggct gaagagccat cctaccactc 3720

agctagtgca cccaagaggg aagcaggaga gaggttggtc cagctctctt acacacacac 3780

acacacacac acacacacac acacacacac acagagtcac catacctctg gcttagcaga 3840

agactgaaga aatttttcag tgccccagga taagaaaatg aggtcatttg tgtgtgtgtg 3900

tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg ttttgagtat cataggtatc 3960

atcagaatgg gaatatgttc tggacctgtc agagtaatca tggccaaccc atgctggttt 4020

ttctatagct gtgaatcatt gaatagaaag tcactacaaa cttagtgtgt atcaggcact 4080

gttctagtaa tggagctgct ccagacaaat gtccctgtcc atcctctgct ggagaagata 4140

aacaatagac aacgtaagaa ggtgttttat ggtaggcggc aacacaagat aaagtggaga 4200

aagggggttg ggagtgggaa tgaggtaggg aatggtggta gtaggtcagt caggcataac 4260

ttcactgaag cagatgctag aaagaatagc ttgggagggt ggaggtgggg agtgggagag 4320

aaaggcaaga gacccatgcc tggcatgttc aggaaaagcc aggggaacac tagtctgctt 4380

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

aagccagggg aacactagtc 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gttaagttcc aatgccggcc 20

Claims (9)

1.一种采用测序技术、核酸杂交技术或核酸扩增技术检测样品circRNA的表达水平的制剂在检测缺氧缺血性脑损伤试剂中的应用，其特征在于，所述circRNA对应的DNA序列为SEQ ID NO.1。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，circRNA在缺氧缺血性脑损伤样品中高表达。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，采用二代测序技术、三代测序技术、探针杂交技术、基因芯片技术或荧光定量PCR技术检测样品中circRNA的表达水平。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，试剂含有与circRNA杂交的探针或扩增circRNA的特异性引物。

5.一种检测缺氧缺血性脑损伤的荧光定量PCR试剂盒，其特征在于，试剂盒采用特异的引物检测样品circRNA的表达水平，circRNA对应的DNA序列为SEQ ID NO.1。

6.根据权利要求5所述的荧光定量PCR试剂盒，其特征在于，引物序列为SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3。

7.根据权利要求5所述的荧光定量PCR试剂盒，其特征在于，试剂盒组分还包括内参引物、荧光定量PCR反应液。

8.一种circRNA，其特征在于，所述circRNA对应的DNA序列如SEQ ID NO.1所示。

9.权利要求5-7任意一项所述的荧光定量PCR试剂盒在制备缺氧缺血性脑损伤诊断制剂中的应用。

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