CN110734972B - miR-181c-3p作为肾纤维化标志物的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了肾纤维化标志物miR‑181c‑3p，所述标志物可用于制备诊断、预防和/或治疗肾纤维化的产品。本发明还提供了用于检测肾纤维化的诊断试剂盒，以及用于预防和/或治疗肾纤维化的药物组合物。本发明的药物组合物包含miR‑181c‑3p或其模拟物或激动剂作为活性成分。作为肾纤维化标志物的miR‑181c‑3p能够用于检测肾纤维化风险或疾病状态，也可应用于基因治疗、药物治疗等临床医学领域。

Description

miR-181c-3p作为肾纤维化标志物的应用
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及miR-181c-3p作为肾纤维化标志物的应用。
背景技术
慢性肾脏疾病是严重威胁人类健康的常见疾病。肾纤维化(renal fibrosis,RF)是慢性肾病的主要病理特征之一，它是肾脏的功能由健康到损伤，再到损坏，直至功能丧失的渐进过程。该过程涉及肾间质和肾实质的损伤，多种细胞因子和活性物质的产生，肌成纤维细胞活化、炎性细胞浸润、上皮细胞向间充质细胞转分化、细胞外基质过度沉积等多方面。肾脏由于受到创伤、感染、炎症、血循环障碍，以及免疫反应等多种致病因素刺激，其固有细胞受损，发展到后期出现大量胶原沉积和积聚，造成肾实质逐渐硬化，形成瘢痕，直至肾脏完全丧失脏器功能。
肾纤维化发生机制较为复杂，与多种因素有关，其中主要与细胞外基质细胞产生细胞的增殖和活化、血管活性物质、细胞因子以及细胞外基质转换失衡有关，肾间质纤维化几乎是所有原发或继发肾脏疾病进展到终末期肾衰竭的共同途径。肾纤维化的程度与患者预后密切相关。随着临床上肾功能的进行性下降，从病理上将肾纤维化分成炎症反应期、纤维化形成期和瘢痕形成期。其中，炎症反应期和纤维化形成期是可逆期，如能在可逆期尽早对肾功能受损的患者做出诊断和干预，这对于减缓和逆转慢性肾病的进程，改善肾脏功能，指导临床治疗，提高肾病患者的生活质量具有重要意义。
miRNA(microRNA)是一类长度为20～25个核苷酸的非编码小分子RNA，涉及多种生物学过程，包括对发育时机、凋亡、脂肪代谢和造血细胞分化等的调节，通过影响其靶基因的稳定性或抑制其翻译转录水平来调控细胞的分化、增殖和凋亡。miRNA广泛表达于人体各个组织和器官，在机体的病理生理过程中发挥着广泛的作用；同时，miRNA有显著的组织特异性，不同的组织器官中miRNA的表达强度是截然不同的。
研究表明，miRNA在细胞中表达失调会导致肾脏纤维化在内的多种疾病的发生，miRNA在各种原因所致肾间质纤维化进程中有明确的特异性表达，为肾纤维化机制的研究提供了良好的前景和平台，也为肾纤维化治疗的靶点提供新的思路。一些miRNA在肾纤维化患者肾脏和尿液中异常表达，提示miRNA与肾纤维化的发生、发展有关。因此，寻找与肾纤维化发生、发展有关的miRNA，可以为临床上诊断和治疗肾纤维化提供有效的手段。
发明内容
为了寻找与肾纤维化发生、发展有关的miRNA，本发明一个目的在于提供一种肾纤维化的标志物，所述标志物为miR-181c-3p并具有或SEQ IDNO:1(hsa-miR-181c-3p,AACCAUCGACCGUUGAGUGGAC)或SEQ IDNO:2(rno-miR-181c-3p,ACCAUCGACCGUUGAGUGGACC)所示的核苷酸序列，所述肾纤维化标志物可用于制备诊断、预防和/或治疗肾纤维化的产品。
本发明还一个目的还在于提供诊断、预防和/或治疗肾纤维化的产品。
本发明的发明人在对肾纤维化的相关研究中发现，miR-181c-3p在肾纤维化对象如人(Homo sapiens)或大鼠(Rattus norvegicus)的肾脏组织或肾细胞中含量显著降低，也即相对于未发生肾纤维化的对象来说肾纤维化对象肾脏组织或肾细胞中miR-181c-3p(如hsa-miR-181c-3p、或rno-miR-181c-3p、或mus-miR-181c-3p)的相对表达水平下调。
在本发明中，术语“对象”或“患者”指任意脊椎动物，包括但不限于人和其他灵长类(例如黑猩猩以及其他猿和猴类)、农场动物(例如牛、绵羊、猪、山羊和马)、家养哺乳动物(例如狗和猫)、实验室动物(例如家兔、啮齿动物如大鼠、大鼠和豚鼠)以及鸟(例如家禽或野生的鸟，如鸡、火鸡和其他鹑鸡类、鸭、鹅等)。在一些实施方式中，所述对象或患者是哺乳动物。在其他实施方式中，所述对象或患者是人。
在本发明中，术语“miR-181c-3p”是指包含SEQ ID NO:1(hsa-miR-181c-3p)或SEQID NO:2(rno-miR-181c-3p)所示序列或其同源序列的miRNA，例如本领域中已知各种来源如人、鼠、兔等的miR-181c-3p。
本发明的“miR-181c-3p”还包含上述天然存在的miR-181c-3p序列经取代、缺失或添加一个或几个核苷酸，或经过生物学化学修饰后仍具有miR-181c-3p生物活性的miR-181c-3p衍生物。
本发明的“miR-181c-3p”还包含人工合成的以及可以通过购买市售商品方式获得的具有miR-181c-3p生物学活性的miR-181c-3p模拟物或其激动剂，所述模拟物包括例如与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:1完全相同的核苷酸序列和具有所述miR-181c-3p生物活性的其各种变体形式。例如，本发明采用的rno-miR-181c-3p激动剂购自广州锐博生物技术有限公司。
此外，本发明所述的miR-181c-3p也可以为前体形式，miR-181c-3p前体是指在被施用对象的细胞内或体内可以被加工成为miR-181c-3p的前体。获得天然存在的miR-181c-3p前体的方法为本领域技术人员所公知。
本领域技术人员公知，miR-181c-3p的初始转录产物经过一系列的加工后，形成成熟的miR-181c-3p。miR-181c-3p前体只有在加工为成熟的miR-181c-3p后才具有相应的生物学功能。
本发明的一个方面提供了用于检测肾纤维化的诊断试剂盒，所述试剂盒包括特异性扩增肾纤维化相关的miR-181c-3p的引物和说明书。所述引物包括序列分别为SEQ IDNO:3(GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACGTCCAC)的hsa-miR-181c-3p反转录引物，以及SEQ ID NO:4(正向引物，AACCATCGACCGTTGA)和SEQ ID NO:5(反向引物，CAGTGCAGGGTCCGAGGTAT)的hsa-miR-181c-3p cDNA扩增引物对；或者序列分别为SEQ IDNO:6GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACGGTCCA)的rno-miR-181c-3p反转录引物，SEQ ID NO:7(正向引物，ACCATCGACCGTTGAG)和SEQ ID NO:8(反向引物，CAGTGCAGGGTCCGAGGTAT)的rno-miR-181c-3p cDNA扩增引物对。所述试剂盒还包括10×Buffer、dNTP、MgCl2、Taq酶和SYBR Green荧光染料。
本发明的另一个方面提供了miR-181c-3p或其模拟物或激动剂在制备预防和/或治疗肾纤维化的生物制剂中的应用。在本发明的一些实施方案中，所述应用包括将miR-181c-3p或其模拟物或激动剂与载体结合后与其他治疗肾纤维化的药物和/或药物可接受的辅料复配制成药物组合物。
进一步地，所述miR-181c-3p可以是天然的或人工合成的，所述miR-181c-3p模拟物包括与SEQ ID NO:1(hsa-miR-181c-3p)或SEQ ID NO:2(rno-miR-181c-3p)完全相同的核苷酸序列和具有所述miR-181c-3p生物活性的其各种变体形式，如含有一处或多处化学修饰的多核苷酸。
本发明还提供了用于预防和/或治疗肾纤维化的药物组合物，所述药物组合物含有有效量的miR-181c-3p或其模拟物或激动剂以及药物可接受的辅料。
本发明的miR-181c-3p或其模拟物或激动剂的有效剂量可以随给药的模式和待治疗的疾病的严重程度等进行相应的调整。优选的有效量的可以由本领域普通技术人员综合各因素来确定。所述因素包括但不限于：miR-181c-3p或其模拟物或激动剂的药代动力学参数、受治疗的患者的健康状况、体重、给药途径等。
进一步地，miR-181c-3p激动剂购自广州锐博生物技术有限公司。
在本发明的一些实施方案中，与miR-181c-3p结合的载体可以为本领域常用的适于miRNA在宿主细胞中表达的载体种类如脂质体、壳聚糖或慢病毒表达载体，所述药物可接受的辅料包括在药物使用中但不引起明显副作用的各种赋形剂、稀释剂和佐剂，包括但不限于：纯化水、生理盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、甘露醇、乙醇、表面活性剂和盐如氯化钠、EDTA钠等。
本发明的药物组合物可以包括经典的药物配制品。可以通过任意常规途径施用根据本发明的药物组合物，只要靶组织通过该途径可以获得即可。这包括口服、鼻(如吸入)、眼或口腔内。或者，可以通过静脉内、皮内、皮下、眼内、肌内注射或者直接注射进入肺或心脏组织施用。还可以通过用于向心脏递送治疗剂的导管系统或分离冠状动脉循环的系统施用包含miRNA模拟物或其激动剂的药物组合物。用于向心脏和冠状动脉脉管系统递送治疗剂的不同导管系统是本领域公知的。
在本发明的一些实施方案中，所述药物组合物的形式适合于：直接裸miRNA注射法、脂质体包裹RNA直接注射法、繁殖缺陷细菌携带质粒DNA法或复制缺陷腺病毒携带目的DNA法等。
在本发明的一些实施方案中，所述表达载体为慢病毒表达载体，优选地，所述慢病毒表达载体可以为pWPXL、pMD2.G或psPAX2慢病毒表达载体。
在本发明的一些实施方案中，所述药物组合物还任选地包含一种或多种其他对治疗肾纤维化有效的药物，这些药物是本领域技术人员所熟知的。
本发明中，所述药物组合物的给药途径为静脉内、动脉内灌注或局部注射等，也可以采用本领域技术人员所熟知的其他给药途径进行给药。本发明的药物组合物可以与其他治疗手段联合施用，用于肾纤维化的预防和/或治疗。
有益效果：
本发明提供的用于检测肾纤维化的诊断试剂盒，可用于诊断miR-181c-3p相关的肾纤维化，从而为有针对性地治疗该疾病提供依据。本发明提供一种预防和/或治疗肾纤维化的药物组合物，所述药物组合物含有有效量miR-181c-3p或其模拟物或激动剂作为活性剂，其中所述miR-181c-3p或其模拟物或激动剂能够显著缓解肾纤维化。本发明的肾纤维化标志物miR-181c-3p特异性强、灵敏度较高，能够用于早期检测肾纤维化风险或疾病状态，也可用于基因治疗、药物治疗等临床应用。
附图说明
图1所示为相比正常人肾小管上皮细胞系HK-2细胞(对照)，在由TGF(转化生长因子)-β诱导的EMT(上皮细胞间充质转化)细胞模型中，肾纤维化HK-2细胞的hsa-miR-181c-3p的相对表达量显著低于其在对照细胞中的相对表达量。
图2所示为相比对照大鼠，在肾纤维化模型大鼠组织中，rno-miR-181c-3p的相对表达量显著低于其在对照大鼠中的相对表达量。
图3所示为相比对照组大鼠，在肾纤维化模型组大鼠的肾脏组织中，细胞出现了明显的纤维化病变症状；而对模型大鼠施用rno-miR-181c-3p激动剂后(肾纤维化模型+rno-miR-181c-3p激动剂组)，大鼠肾脏组织中细胞纤维化病变症状明显减轻。
图4所示为相比对照组大鼠，在肾纤维化模型组大鼠肾脏组织中，蓝色间质纤维化面积明显出现；而对模型大鼠施用rno-miR-181c-3p激动剂后(肾纤维化模型+rno-miR-181c-3p激动剂组)，大鼠肾脏组织中肾间质纤维化面积明显减少。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例
实施例1：hsa-miR-181c-3p在肾纤维化HK-2细胞中表达下调
EMT是指上皮细胞间充质转化，是肾纤维化过程的一部分。我们通过诱导上皮-间质转化(EMT)细胞模型来检测hsa-miR-181c-3p在肾纤维化细胞中的相对表达量变化。采用人肾小管上皮细胞系HK-2细胞，在HK-2细胞培养液中加入TGF(转化生长因子)-β至终浓度为10ng/mL，培养48h后收取细胞，拍照观察并检测miR-181c-3p。具体操作如下：
1.miRNA提取
分别收集未发生肾纤维化的对照组细胞(HK-2)和由TGF-β诱导的EMT细胞模型的肾纤维化细胞(HK-2/TGF-β)。使用Tiangen公司的miRNA提取试剂盒，每50mg细胞样本中加入1ml裂解液，振荡器振荡混匀30秒。室温放置5min后，12,000rpm离心10min，取上清，加入200μl氯仿，剧烈振荡15秒，室温放置5min后，12,000rpm离心15min，样品会分成三层：黄色的有机相，中间层和无色的水相，RNA主要在水相中，把水相转移到新管中，缓慢加入转移液体积1/3体积的无水乙醇混匀，一起转入吸附柱，室温放置2min,12,000rpm离心30秒，保留流出液。缓慢加入流出液体积2/3体积的无水乙醇，混匀，一起转入吸附柱，室温放置2min后12,000rpm离心30秒，离心后保留吸附柱。向吸附柱中加入500μl去蛋白液，室温12,000rpm离心30sec，弃废液。500μl漂洗液，室温12,000rpm离心30秒。将吸附柱放入2ml收集管中，室温12,000rpm离心1min，去除残余液体。再将吸附柱转入一个新的1.5ml离心管中，加15-30μl无RNA酶的水，室温12,000rpm离心2min。
2.逆转录
将10pg-1μg的RNA模板与2μl 10倍缓冲液、2μl dATP(10mM)、0.5μl引物、0.5μl核糖核酸酶抑制剂和无核糖核酸酶水混合，体积最后为20μl，37℃孵育1h。然后反应管中加入1μl 0.5μg/μl特异性反转录引物(miR-181c-3p的反转录引物如SEQ ID NO:3所示)，70℃孵育5min后立刻冰上孵育至少2min，打断RNA和引物的二级结构。最后，将上述20μl反应混合物与4μl5倍缓冲液、1μl dNTP(10mM)，0.5μl M-MLV逆转录酶，0.5μl核糖核酸酶抑制剂，10μl polyA反应混合液和4μl无核糖核酸酶水混合，42℃孵育1h。
3.Q-PCR
采用25μl反应体系，每个样本设置3个平行管，所有扩增反应均重复三次以上以保证结果的可靠性。按照常规步骤操作，其中miR-181c-3p的cDNA扩增引物对序列分别如SEQID NO:4(正向引物)和SEQ ID NO:5(反向引物)所示。配制以下反应体系：SYBR Green聚合酶链式反应体系12.5μl，正向引物(5μM/l)1μl，反向引物(5μM/l)1μl，模板cDNA 2μl，无酶水8.5μl。各项操作均于冰上进行。扩增程序为：95℃10min,(95℃20s，60℃55s)40个循环。以SYBR Green作为荧光标记物，在荧光实时定量PCR仪上进行PCR反应。通过融解曲线分析和电泳确定目的条带，ΔΔCT法进行相对定量。
结果如图1所示，相比正常人肾小管上皮细胞系HK-2细胞(对照)，在由TGF-β诱导的EMT细胞模型中肾纤维化HK-2细胞的hsa-miR-181c-3p的相对表达量显著低于其在对照细胞中的相对表达量。hsa-miR-181c-3p在EMT(HK-2/TGF-β)细胞中的相对表达量为对照(HK-2)细胞中的约三分之一，这表明miR-181c-3p可作为肾纤维化发生过程的标记物。
实施例2：rno-miR-181c-3p在肾纤维化模型大鼠的组织中表达下调
我们通过对大鼠进行单侧输尿管结扎(UOO)建立肾纤维化动物模型。将大鼠单侧输尿管结扎20天后，通过HE(苏木精-伊红)染色和Masson染色验证成功构建了肾纤维化的大鼠动物模型。
分别收集未发生肾纤维化的对照组大鼠肾脏组织和经UOO处理大鼠单侧的肾脏组织，检测组织中miRNA的表达。参照实施例1中相关步骤分别提取miRNA并进行逆转录，用Q-PCR检测rno-miR-181c-3p的相对表达量(按照常规步骤操作，其中rno-miR-181c-3p的反转录引物如SEQ ID NO:6所示，cDNA扩增引物对分别为正向引物SEQ ID NO:7和反向引物SEQID NO:8)。
结果如图2所示，相比对照大鼠，在肾纤维化模型大鼠肾脏组织中rno-miR-181c-3p的相对表达量显著低于其在对照大鼠肾脏组织中的相对表达量。rno-miR-181c-3p在肾纤维化模型大鼠肾脏组织中的相对表达量为对照大鼠肾脏组织中的约四分之一，这表明miR-181c-3p可作为肾纤维化发生过程的标记物。
实施例3：使用rno-miR-181c-3p激动剂缓解肾纤维化
对上述实施例2中成功构建的肾纤维化大鼠动物模型的大鼠施用rno-miR-181c-3p激动剂(购自广州锐博生物技术有限公司)；每周注射两次，尾静脉注射。
一周后，分别收集未发生肾纤维化的(对照)大鼠、经单侧输尿管结扎(UOO)处理的(肾纤维化模型)大鼠，以及施用rno-miR-181c-3p激动剂的肾纤维化模型大鼠(肾纤维化模型+rno-miR-181c-3p激动剂)的肾脏组织，分别通过HE(苏木精-伊红)染色和Masson染色来比较三者肾脏组织细胞的形态差异。
HE染色观察结果如图3所示，对照组大鼠的肾脏组织细胞具有典型的鹅卵石样形态特征，胞间衔接紧密；肾纤维化模型组大鼠的肾脏组织细胞显示出梭形的形态，细胞间间隙明显，空泡变性明显，细胞较为瘦缩，类似成纤维细胞的形态；肾纤维化模型+rno-miR-181c-3p激动剂组大鼠的肾脏组织细胞显示肾脏病理改变明显减轻，细胞间衔接明显向紧密方向转化，空泡变性程度减弱，类似成纤维细胞的瘦缩形态消失，向鹅卵石形态恢复。上述结果表明，对肾纤维化模型大鼠施用rno-miR-181c-3p激动剂后，能够明显缓解肾纤维化的病理症状。
Masson染色观察结果如图4所示，对照组大鼠的肾脏组织细胞未见蓝色间质纤维化位置，无间质纤维化；肾纤维化模型组大鼠的肾脏组织细胞胶原纤维相比对照组明显增多，间质纤维化明显；肾纤维化模型+rno-miR-181c-3p激动剂组大鼠的肾脏组织细胞间质纤维化面积较肾纤维化模型组明显减小，肾纤维化程度明显减轻。上述结果表明，对肾纤维化模型大鼠施用rno-miR-181c-3p激动剂后，能够明显减轻肾间质纤维化程度。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 河北仁博科技有限公司
<120> miR-181c-3p作为肾纤维化标志物的应用
<130> P190358
<141> 2019-11-28
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 1
aaccaucgac cguugagugg ac 22
<210> 2
<211> 22
<212> RNA
<213> 大鼠(Rattus norvegicus)
<400> 2
accaucgacc guugagugga cc 22
<210> 3
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 3
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<210> 4
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 4
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<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
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cagtgcaggg tccgaggtat 20
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<213> 人工序列(Artificial sequence)
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gtcgtatcca gtgcagggtc cgaggtattc gcactggata cgacggtcca 50
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
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accatcgacc gttgag 16
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 8
cagtgcaggg tccgaggtat 20

Claims (4)

1.特异性扩增肾纤维化相关的miR-181c-3p的引物在用于制备检测肾纤维化的诊断试剂盒中的应用。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述引物包括序列分别为SEQ ID NO:3的hsa-miR-181c-3p反转录引物，以及SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5的hsa-miR-181c-3p cDNA扩增引物对；或者序列分别为SEQ ID NO:6的rno-miR-181c-3p反转录引物，SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8的rno-miR-181c-3p cDNA扩增引物对。
3.如权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述试剂盒还包括10×Buffer、dNTP、MgCl2、Taq酶和SYBR Green荧光染料。
4.miR-181c-3p的激动剂在制备治疗肾纤维化的生物制剂中的应用。
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Cortical Neuron-Derived Exosomal MicroRNA-181c-3p Inhibits Neuroinflammation by Downregulating CXCL1 in Astrocytes of a Rat Model with Ischemic Brain Injury;He Song等;《Neuroimmunomodulation》;20191030;第26卷(第5期);摘要 *

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