CN109234381B - miR-2682-5p作为肾纤维化标志物的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种肾纤维化标志物miR‑2682‑5p，其可用于制备诊断、预防和/或治疗肾纤维化的产品。本发明提供了用于检测肾纤维化的诊断试剂盒。本发明还提供了用于预防和/或治疗肾纤维化的药物组合物，所述药物组合物包含miR‑2682‑5p或其模拟物作为活性成分。本发明的肾纤维化标志物miR‑2682‑5p能够用于早期检测肾纤维化风险或疾病状态，并可用于基因治疗、药物治疗等临床应用。

Description

miR-2682-5p作为肾纤维化标志物的应用

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及miR-2682-5p作为肾纤维化标志物的应用。

背景技术

肾脏纤维化是一种病理生理改变，是肾脏的功能由健康到损伤，再到损坏，直至功能丧失的渐进过程。肾脏由于受到创伤、感染、炎症、血循环障碍，以及免疫反应等多种致病因素刺激，其固有细胞受损，发展到后期出现大量胶原沉积和积聚，造成肾实质逐渐硬化，形成瘢痕，直至肾脏完全丧失脏器功能。肾纤维化发生机制较为复杂，与多种因素有关，其中主要与细胞外基质细胞产生细胞的增殖和活化、血管活性物质、细胞因子以及细胞外基质转换失衡有关，肾间质纤维化几乎是所有原发或继发肾脏疾病进展到终末期肾衰竭的共同途径。

miRNA(microRNA)是一类长度为20～25个核苷酸的非编码小分子RNA，通过影响其靶基因的稳定性或抑制其翻译转录水平来调控细胞的分化、增殖和凋亡。miRNA在细胞中表达失调会导致肾脏纤维化在内的多种疾病的发生，研究表明，一些miRNA在肾纤维化患者肾脏和尿液中异常表达，提示miRNA与肾纤维化的发生、发展有。因此，寻找与肾纤维化发生、发展有关的miRNA，可以为临床上诊断和治疗肾纤维化提供有效的手段。

发明内容

为了寻找与肾纤维化发生、发展有关的miRNA，本发明一个目的在于提供一种肾纤维化的标志物，所述标志物为miR-2682-5p并具有SEQ ID NO:1(CAGGCAGUGACUGUUCAGACGUC)所示的核苷酸序列，所述肾纤维化标志物可用于制备诊断、预防和/或治疗肾纤维化的产品。

本发明还一个目的还在于提供诊断、预防和/或治疗肾纤维化的产品。

本发明的发明人在对肾纤维化的相关研究中发现，miR-2682-5p在肾纤维化对象的肾组织或肾细胞中含量显著降低，也即相对于未发生肾纤维化的对象来说肾纤维化对象肾组织或肾细胞中miR-2682-5p的相对表达水平下调。同时发现miR-2682-5p能够抑制靶基因twist的表达，使得受到twist抑制的E钙粘蛋白E-cadherin和紧密连接蛋白Claudin的表达量增加，从而抑制引起肾纤维化的EMT途径发生。twist基因是胚胎发育中起关键调控作用的转录因子，在诱导细胞移动及组织塑形中起重要作用，twist可抑制E钙粘蛋白E-cadherin和紧密连接蛋白Claudin表达而诱导上皮-间质转化(epithelial-mesenchymaltransition,EMT)，而EMT是肾小管间质纤维化(tubular interstitial fibrosis,TIF)的关键发病机制。因此，施用miR-2682或其模拟物可以促进E钙粘蛋白E-cadherin和紧密连接蛋白Claudin表达，进而有利于缓解和/或治疗肾纤维化对象或患者的肾纤维化。

在本发明中，术语“对象”或“患者”指任意脊椎动物，包括但不限于人和其他灵长类(例如黑猩猩以及其他猿和猴类)、农场动物(例如牛、绵羊、猪、山羊和马)、家养哺乳动物(例如狗和猫)、实验室动物(例如家兔、啮齿动物如小鼠、大鼠和豚鼠)以及鸟(例如家禽或野生的鸟，如鸡、火鸡和其他鹑鸡类、鸭、鹅等)。在一些实施方式中，所述对象或患者是哺乳动物。在其他实施方式中，所述对象或患者是人。

在本发明中，术语“miR-2682-5p”是指包含SEQ ID No.1所示序列或其同源序列的miRNA，例如本领域中已知各种来源如人、鼠、兔等的miR-2682-5p。

本发明的“miR-2682-5p”还包含上述天然存在的miR-2682-5p序列经取代、缺失或添加一个或几个核苷酸，或经过生物学化学修饰后仍具有miR-2682-5p生物活性的miR-2682-5p衍生物。

本发明的“miR-2682-5p”还包含人工合成的以及可以通过购买市售商品方式获得的具有miR-2682-5p生物学活性的miR-2682-5p模拟物，例如本发明采用的miR-2682-5p模拟物由苏州鸿讯生物科技有限公司合成。所述模拟物包括与SEQ ID NO:1完全相同的核苷酸序列和具有miR-2682-5p生物活性的其各种变体形式

此外，本发明所述的miR-2682-5p也可以为前体形式，miR-2682-5p前体是指在被施用对象的细胞内或体内可以被加工成为miR-2682-5p的前体。获得天然存在的miR-2682-5p前体的方法为本领域技术人员所公知。

本领域技术人员公知，miR-2682-5p的初始转录产物经过一系列的加工后，形成成熟的miR-2682-5p。miR-2682-5p前体只有在加工为成熟的miR-2682-5p后才具有相应的生物学功能。

本发明的一个方面提供了用于检测肾纤维化的诊断试剂盒，所述试剂盒包括特异性扩增肾纤维化相关的miR-2682-5p的引物和说明书。所述引物包括序列为SEQ ID NO:2(GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACGACGTC)的反转录引物，以及序列分别为SEQ ID NO:3(正向引物：CAGGCAGTGACTGTTCA)和SEQ ID NO:4(反向引物：CAGTGCAGGGTCCGAGGTAT)的cDNA扩增引物对。所述试剂盒还包括10×Buffer、dNTP、MgCl₂、Taq酶和SYBR Green荧光染料。

本发明的另一个方面提供了miR-2682-5p或其模拟物在制备预防和/或治疗肾纤维化的生物制剂中的应用。在本发明的一些实施方案中，所述应用包括将miR-2682-5p或其模拟物与载体结合后与其他治疗肾纤维化的药物和/或药物可接受的辅料复配制成药物组合物。

进一步地，所述miR-2682-5p可以是天然的或人工合成的，所述miR-2682-5p模拟物包括与SEQ ID NO:1完全相同的核苷酸序列和具有miR-2682-5p生物活性的其各种变体形式，如含有一处或多处化学修饰的多核苷酸。

本发明还提供了用于预防和/或治疗肾纤维化的药物组合物，所述药物组合物含有有效量的miR-2682-5p或其模拟物以及药物可接受的辅料。

本发明的miR-2682-5p或其模拟物的有效剂量可以随给药的模式和待治疗的疾病的严重程度等进行相应的调整。优选的有效量的可以由本领域普通技术人员综合各因素来确定。所述因素包括但不限于：miR-2682-5p或其模拟物的药代动力学参数、受治疗的患者的健康状况、体重、给药途径等。

进一步地，miR-2682-5p模拟物为由苏州鸿讯生物科技有限公司合成的产品或具有miR-2682-5p生物活性的其化学修饰物。

在本发明的一些实施方案中，与miR-2682-5p结合的载体可以为本领域常用的适于miRNA在宿主细胞中表达的载体种类如脂质体、壳聚糖或慢病毒表达载体，所述药物可接受的辅料包括在药物使用中但不引起明显副作用的各种赋形剂、稀释剂和佐剂，包括但不限于：纯化水、生理盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、甘露醇、乙醇、表面活性剂和盐如氯化钠、EDTA钠等。

本发明的药物组合物可以包括经典的药物配制品。可以通过任意常规途径施用根据本发明的药物组合物，只要靶组织通过该途径可以获得即可。这包括口服、鼻(如吸入)、眼或口腔内。或者，可以通过静脉内、皮内、皮下、眼内、肌内注射或者直接注射进入肺或心脏组织施用。还可以通过用于向心脏递送治疗剂的导管系统或分离冠状动脉循环的系统施用包含miRNA模拟物的药物组合物。用于向心脏和冠状动脉脉管系统递送治疗剂的不同导管系统是本领域公知的。

在本发明的一些实施方案中，所述药物组合物的形式适合于：直接裸miRNA注射法、脂质体包裹RNA直接注射法、繁殖缺陷细菌携带质粒DNA法或复制缺陷腺病毒携带目的DNA法等。

在本发明的一些实施方案中，所述表达载体为慢病毒表达载体，优选地，所述慢病毒表达载体可以为pWPXL、pMD2.G或psPAX2慢病毒表达载体。

在本发明的一些实施方案中，所述药物组合物还任选地包含一种或多种其他对治疗肾纤维化有效的药物，这些药物是本领域技术人员所熟知的。

本发明中，所述药物组合物的给药途径为静脉内、动脉内灌注或局部注射等，也可以采用本领域技术人员所熟知的其他给药途径进行给药。本发明的药物组合物可以与其他治疗手段联合施用，用于肾纤维化的预防和/或治疗。

有益效果：

本发明提供的用于检测肾纤维化的诊断试剂盒，可用于诊断miR-2682-5p相关的肾纤维化，从而为有针对性地治疗该疾病提供依据。本发明提供一种预防和/或治疗肾纤维化的药物组合物，所述药物组合物含有有效量miR-2682-5p或其模拟物作为活性剂，其中所述miR-2682-5p或其模拟物显著降低靶基因twist的表达，由于twist可抑制E钙粘蛋白E-cadherin和紧密连接蛋白Claudin进而诱导作为肾小管间质纤维化(TIF)关键发病因素的上皮-间质转化(EMT)，因此施用miR-2682-5p或其模拟物可以促进E钙粘蛋白E-cadherin和紧密连接蛋白Claudin表达，有利于缓解和/或治疗肾纤维化。本发明的肾纤维化标志物miR-2682-5p特异性强、灵敏度较高，能够用于早期检测肾纤维化风险或疾病状态，也可用于基因治疗、药物治疗等临床应用。

附图说明

图1所示为在发生肾纤维化(EMT)的细胞中，miR-2682-5p的相对表达量显著低于其在对照(Ctrl)细胞系中的相对表达量(*p<0.05)。

图2a所示为在施用miR-2682-5p mimic的HK-2细胞(人肾小管上皮细胞系)中twist蛋白表达相比对照(Ctrl)细胞明显降低，而微管蛋白tubulin的表达则没有发生明显变化。图2b和2c所示为，在施用miR-2682-5p mimic的HK-2细胞中，E钙粘蛋白E-cadherin和紧密连接蛋白Claudin的表达相比对照(Ctrl)细胞明显增加，而与肾纤维化不相关的微管蛋白tubulin的表达则没有发生明显变化。

图3a所示为通过HE和天狼星红染色观察到，未进行单侧输尿管结扎(UOO)的对照(Ctrl)组小鼠的肾组织细胞具有典型的鹅卵石样形态特征，胞间衔接紧密；经UOO处理小鼠单侧肾组织细胞显示出梭形的形态，细胞间间隙明显，细胞较为瘦缩，类似成纤维细胞的形态。如图3b所示，在发生肾纤维化的UOO处理小鼠单侧肾组织细胞(UOO)中，miR-2682-5p的相对表达量显著低于其在对照(Ctrl)组小鼠肾组织细胞中的相对表达量(*p<0.05)。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例

实施例1

本实施例证明，miR-2682-5p在EMT细胞模型的肾纤维化细胞系中相对表达水平下调。

诱导上皮-间质转化(EMT)细胞模型。EMT是指上皮细胞间充质转化，是肾纤维化过程的一部分。采用人肾小管上皮细胞系HK-2细胞，在HK-2细胞培养液中加入TGF(转化生长因子)-β至终浓度为10ng/mL，培养48h后收取细胞，拍照观察并检测miR-2682-5p。具体操作如下：

1.miRNA提取

分别收集未发生肾纤维化的对照(Ctrl)组HK-2细胞和诱导的EMT细胞模型的肾纤维化(EMT)细胞。使用Tiangen公司的miRNA提取试剂盒，每50mg细胞样本中加入1ml裂解液，振荡器振荡混匀30秒。室温放置5min后，12,000rpm离心10min，取上清，加入200μl氯仿，剧烈振荡15秒，室温放置5min后，12,000rpm离心15min，样品会分成三层：黄色的有机相，中间层和无色的水相，RNA主要在水相中，把水相转移到新管中，缓慢加入转移液体积1/3体积的无水乙醇混匀，一起转入吸附柱，室温放置2min,12,000rpm离心30秒，保留流出液。缓慢加入流出液体积2/3体积的无水乙醇，混匀，一起转入吸附柱，室温放置2min后12,000rpm离心30秒，离心后保留吸附柱。向吸附柱中加入500μl去蛋白液，室温12,000rpm离心30sec，弃废液。500μl漂洗液，室温12,000rpm离心30秒。将吸附柱放入2ml收集管中，室温12,000rpm离心1min，去除残余液体。再将吸附柱转入一个新的1.5ml离心管中，加15-30μl无RNA酶的水，室温12,000rpm离心2min。

2.逆转录

将10pg-1μg的RNA模板与2μl 10倍缓冲液、2μl dATP(10mM)、0.5μl引物、0.5μl核糖核酸酶抑制剂和无核糖核酸酶水混合，体积最后为20μl，37℃孵育1h。然后反应管中加入1μl 0.5μg/μl特异性反转录引物(miR-2682-5p的反转录引物如SEQ ID NO:2所示)，70℃孵育5min后立刻冰上孵育至少2min，打断RNA和引物的二级结构。最后，将上述20μl反应混合物与4μl5倍缓冲液、1μl dNTP(10mM)，0.5μl M-MLV逆转录酶，0.5μl核糖核酸酶抑制剂，10μl polyA反应混合液和4μl无核糖核酸酶水混合，42℃孵育1h。

3.Q-PCR

采用25μl反应体系，每个样本设置3个平行管，所有扩增反应均重复三次以上以保证结果的可靠性。按照常规步骤操作，其中miR-2682-5p的cDNA扩增引物对序列分别如SEQID NO:3(正向引物)和SEQ ID NO:4(反向引物)所示。配制以下反应体系：SYBR Green聚合酶链式反应体系12.5μl，正向引物(5μM/l)1μl，反向引物(5μM/l)1μl，模板cDNA 2μl，无酶水8.5μl。各项操作均于冰上进行。扩增程序为：95℃10min,(95℃20s，60℃55s)40个循环。以SYBR Green作为荧光标记物，在荧光实时定量PCR仪上进行PCR反应。通过融解曲线分析和电泳确定目的条带，ΔΔCT法进行相对定量。

结果如图1所示，在发生肾纤维化(EMT)的细胞中，miR-2682-5p的相对表达量显著低于其在对照(Ctrl)细胞系中的相对表达量(*p<0.05)，在EMT中的相对表达量约为对照中的25％。这表明miR-2682-5p可作为肾纤维化发生过程的标记物。

实施例2

本实施例证明，向HK-2细胞中转染miR-2682-5p模拟物(mimic)能够降低靶基因twist的表达，并增加E钙粘蛋白E-cadherin和紧密连接蛋白Claudin的表达。

用转染试剂lipofectamine 2000将miR-2682-5p模拟物(mimics)(由苏州鸿讯生物科技有限公司合成，主要作用是在细胞内模拟miR-2682-5p的功能，促使细胞内miR-2682-5p的浓度显著上升)转染人肾小管上皮细胞系HK-2细胞(源自上海酶研生物科技有限公司)，48小时后分别收集对照(Ctrl)组HK-2细胞和转染该模拟物后的HK-2细胞。参照实施例1分别提取miRNA并进行逆转录，用Q-PCR检测miR-2682-5p的相对表达量(按照常规步骤操作，其中miR-2682-5p的反转录引物如SEQ ID NO:2所示，cDNA扩增引物对分别如SEQ IDNO:3和SEQ ID NO:4所示)。结果用miR-2682-5p模拟物转染HK-2细胞后，所述细胞中miR-2682-5p的表达量显著性上升，证明该模拟物能够模拟miR-2682-5p的表达。

如图2a所示，进一步使用免疫印迹方法(按照常规步骤操作，Twist抗体的生产商：abcam公司，产品批号：ab50581；E-cadherin抗体的生产商：abcam公司，产品批号：ab15148；Claudin抗体的生产商：abcam公司，产品批号：ab15099；Tubulin抗体的生产商：abcam公司，产品批号：ab18207；二抗为羊抗兔或羊抗鼠，生产商：中山金桥公司)发现，在施用miR-2682-5p mimic的HK-2细胞中twist蛋白表达相比对照(Ctrl)细胞明显降低，而微管蛋白tubulin的表达则没有发生明显变化。这表明miR-2682-5p模拟物(mimic)能够降低靶基因twist的表达。另外，如图2b和2c所示，在施用miR-2682-5p mimic的HK-2细胞中，E钙粘蛋白E-cadherin和紧密连接蛋白Claudin的表达相比对照(Ctrl)细胞明显增加，而与肾纤维化不相关的微管蛋白tubulin的表达则没有发生明显变化。

由于(患者)肾小管上皮细胞发生EMT时将失去上皮细胞的标志物E钙粘蛋白E-cadherin，并且细胞连接相关蛋白如Claudin-1等表达量降低。以上结果表明，miR-2682-5p或其模拟物可以促进E钙粘蛋白E-cadherin和紧密连接蛋白Claudin表达，进而有利于缓解和/或治疗肾纤维化对象或患者的肾纤维化。

实施例3

本实施例证明，miR-2682-5p在单侧输尿管结扎(UOO)动物模型的肾纤维化细胞系中相对表达水平下调。

通过单侧输尿管结扎(UOO)构建肾纤维化动物模型，并通过HE(苏木精-伊红)染色和天狼星红染色来验证该肾纤维化模型。然后，检测miR-2682-5p的含量。

如图3a所示，通过HE和天狼星红染色观察到，未进行单侧输尿管结扎(UOO)的对照(Ctrl)组小鼠的肾组织细胞具有典型的鹅卵石样形态特征，胞间衔接紧密；经UOO处理小鼠的单侧肾组织细胞显示出梭形的形态，细胞间间隙明显，细胞较为瘦缩，类似成纤维细胞的形态。证明UOO处理成功构建了肾纤维化的动物模型。

分别收集未发生肾纤维化的对照(Ctrl)组小鼠肾组织细胞和经UOO处理小鼠单侧的肾组织细胞。参照实施例1分别提取miRNA并进行逆转录，用Q-PCR检测miR-2682-5p的相对表达量(按照常规步骤操作，其中miR-2682-5p的反转录引物如SEQ ID NO:2所示，cDNA扩增引物对分别如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示)。结果如图3b所示，在发生肾纤维化的UOO处理小鼠单侧肾组织细胞(UOO)中，miR-2682-5p的相对表达量显著低于其在未经处理的对照(Ctrl)组小鼠的肾组织细胞中的相对表达量(*p<0.05)，在UOO处理小鼠单侧肾组织细胞中miR-2682-5p的相对表达量约为对照组中的15％。这表明miR-2682-5p可作为肾纤维化发生过程的标记物。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 云南省玉溪市人民医院

<120> miR-2682-5p作为肾纤维化标志物的应用

<130> P18078

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 23

<212> RNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 1

caggcaguga cuguucagac guc 23

<210> 2

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 2

gtcgtatcca gtgcagggtc cgaggtattc gcactggata cgacgacgtc 50

<210> 3

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 3

caggcagtga ctgttca 17

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 4

cagtgcaggg tccgaggtat 20

Claims (5)

1.检测miR-2682-5p表达水平的试剂在制备检测肾纤维化的诊断试剂盒中的应用，其特征在于，所述试剂包括特异性扩增肾纤维化相关的miR-2682-5p的引物。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述引物包括序列为SEQ ID NO:2的反转录引物，以及序列分别为SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4的cDNA扩增引物对。

3.如权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述试剂还包括10×Buffer、dNTP、MgCl₂、Taq酶和SYBR Green荧光染料。

4.miR-2682-5p在制备治疗肾纤维化的生物制剂中的应用。

5.一种药物组合物在制备治疗肾纤维化的药物组合物中的应用，其特征在于，所述药物组合物包含miR-2682-5p以及药物可接受的辅料。

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