CN110724738B - lncXXYLT1-AS2的应用、诊断心血管疾病的试剂盒及治疗心血管疾病的药物 - Google Patents

lncXXYLT1-AS2的应用、诊断心血管疾病的试剂盒及治疗心血管疾病的药物 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种lncXXYLT1‑AS2的应用、诊断心血管疾病的试剂盒及治疗心血管疾病的药物，涉及生物技术领域，发明人通过实验发现经过厌氧处理人脐静脉内皮细胞，lncXXYLT1‑AS2有显著升高，且在临床动脉粥样硬化斑块样本中检测发现lncXXYLT1‑AS2的表达显著下调，通过对lncXXYLT1‑AS2进行特异性的检测能达到诊断心血管疾病的目的。过表达XXYLT1‑AS2能够抑制HUVEC的增殖和迁移，并且能够通过NF‑kB信号通路调节炎症反应。通过以上研究将为lncXXYLT1‑AS2对心血管疾病发生发展的调控机制提供新的理论基础，为心血管疾病的预防、治疗及诊断提供新的靶点和思路。

Description

lncXXYLT1-AS2的应用、诊断心血管疾病的试剂盒及治疗心血 管疾病的药物
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其是涉及一种lncXXYLT1-AS2的应用、诊断心血管疾病的试剂盒及治疗心血管疾病的药物。
背景技术
心血管疾病(Cardiovascular diseases，CVD)是当今世界上威胁人类最严重的疾病之一，其发病率和死亡率已超过肿瘤而跃居第一。中国城市和农村居民冠心病死亡率继续保持2012年以来的上升趋势，农村地区冠心病死亡率上升趋势明显。动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)是心血管疾病致残、致死的主要原因，目前，动脉粥样硬化的防治仍是亟待解决的医学难题，尤其是它的发病机理和分子机制依然尚未完全清楚。
血管内皮细胞(VEC)是介于血液与血管壁之间的屏障，并具有重要内分泌功能，调节平滑肌细胞的稳态和增殖，抑制血小板的聚集和黏附，调节着凝血、纤溶、白细胞黏附和迁移的过程。近30年的血管生物学研究发现，血管内皮系统的功能和分泌的多种因子是一系列心血管疾病发生、发展的重要调控机制，在高血压、氧化应激、动脉壁僵硬、血管新生及重建、抗炎抗栓等病理生理过程中发挥重要的调控作用，血管内皮细胞直接参与动脉粥样硬化的发生、发展。单核细胞(monocytes)是血液中最大的血细胞，也是体积最大的白细胞，是机体防御系统的一个重要组成部分。单核细胞参与免疫反应，在吞噬抗原后将所携带的抗原决定簇转交给淋巴细胞，诱导淋巴细胞的特异性免疫性反应。与其他血细胞比较，单核细胞内含有更多的非特异性脂酶，并且具有更强的吞噬作用。在动脉粥样硬化发生的过程中，单核细胞和内皮细胞之间相互作用在动脉粥样硬化的发病过程中发挥非常重要的作用。通过粘附因子之间的相互作用，单核细胞粘附于内皮细胞并进而进入动脉内膜，参与动脉粥样硬化的发生。
非编码RNA(ncRNA)占哺乳动物RNA的98％，不直接转录为蛋白质。既往认为非编码RNA不具备生物学功能，但近年研究发现，非编码RNA可从表观遗传学、转录调控及转录后调控等多个层面实现对基因表达的调控，其表达水平的变化与心血管疾病等多种疾病密切相关。长链非编码RNA(Long non-coding RNA,lncRNA)是长度大于200个核苷酸的非编码RNA。研究表明，lncRNA在剂量补偿效应、表观遗传调控、细胞周期调控和细胞分化调控等众多生命活动中发挥重要作用，成为遗传学研究热点。lncRNA在心血管疾病中的应用，仍处于研发阶段，需要不断的探索和研究。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的第一个目的在于提供lncXXYLT1-AS2在制备诊断和/或治疗心血管疾病的产品中的应用，以至少缓解了现有技术中存在的技术问题之一。
本发明的第二个目的在于提供一种诊断心血管疾病的试剂盒，以实现心血管疾病的有效诊断。
本发明的第三个目的在于提供一种治疗心血管疾病的药物，以实现心血管疾病的靶向治疗。
本发明提供了lncXXYLT1-AS2在制备诊断和/或治疗心血管疾病的产品中的应用，所述LncXXYLT1-AS2含有如SEQ ID NO.1所示的cDNA序列。
进一步地，所述心血管疾病包括由血管内皮细胞增殖和/或迁移引起的心血管疾病。
进一步地，所述心血管疾病包括动脉粥样硬化。
进一步地，所述产品包括试剂盒或药物。
本发明还提供了一种诊断心血管疾病的试剂盒，所述试剂盒包括识别LncXXYLT1-AS2的标记物；
所述LncXXYLT1-AS2含有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。
进一步地，所述识别LncXXYLT1-AS2的标记物包括如下a)或b)中的至少一种：
a)结合LncXXYLT1-AS2的引物；
b)结合LncXXYLT1-AS2的生物大分子，所述的生物大分子包括：抗体或抗体功能片段，或，RNA结合蛋白或其功能片段。
进一步地，所述结合LncXXYLT1-AS2的引物具有如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列。
另外，本发明还提供了一种治疗心血管疾病的药物，所述药物包括如下Ⅰ)-Ⅳ)中的一种或多种：
Ⅰ)LncXXYLT1-AS2；
Ⅱ)含有LncXXYLT1-AS2的编码基因的重组载体；
Ⅲ)含有LncXXYLT1-AS2的编码基因的重组病毒；
Ⅳ)含有LncXXYLT1-AS2的编码基因的重组病毒载体；
所述LncXXYLT1-AS2含有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。
进一步地，所述药物还包括药学上可接受的载剂；
优选地，所述载剂包括壳聚糖、胆固醇、脂质体和纳米颗粒中的一种或几种。
进一步地，所述药物的剂型包括口服制剂或注射制剂。
本发明提供的与心血管疾病相关的lncXXYLT1-AS2，其cDNA序列如SEQ ID NO.1所示。发明人通过实验发现经过厌氧处理人脐静脉内皮细胞(HUVEC)，lncXXYLT1-AS2有显著升高。同时，在临床动脉粥样硬化斑块样本中检测发现lncXXYLT1-AS2的表达显著下调，通过对lncXXYLT1-AS2进行特异性的检测能达到诊断心血管疾病的目的。后期实验发现，过表达XXYLT1-AS2能够抑制HUVEC的增殖和迁移，并且能够通过NF-kB信号通路调节炎症反应。此外，结合生物信息学分析发现，lncXXYLT1-AS2可以与下游靶基因FUS发挥结合作用，并通过lncXXYLT1-AS2/FUS/cyclin D1调控内皮细胞的增殖和迁移。通过以上研究将为lncXXYLT1-AS2对心血管疾病发生发展的调控机制提供新的理论基础，为心血管疾病的预防、治疗及诊断提供新的靶点和思路。针对该长非编码RNA可以开发出不同的产品，例如研发新的检测lncXXYLT1-AS2的试剂盒以诊断心血管疾病，或以lncXXYLT1-AS2为靶点的药物以治疗心血管疾病等等，对于心血管疾病的诊断和治疗具有重要的影响。
附图说明
图1A为本发明实施例提供的高通量测序分析RNA差异表达的结果图；
图1B为本发明实施例提供的NONCODE网站对lncXXYLT1-AS2保守性的分析的结果图；
图1C为本发明实施例提供的PCR对lncXXYLT1-AS2保守性的分析的结果图；
图1D为本发明实施例提供的XXYLT1-AS2在不同细胞系的相对表达量的结果图；
图1E为本发明实施例提供的XXYLT1-AS2在正常组和疾病组的表达量的结果图；
图1F为本发明实施例提供的XXYLT1-AS2在正常组和疾病组的分布的结果图；
图1G为本发明实施例提供的XXYLT1-AS2在颈动脉球囊损伤模型中的表达量的结果图；
图2A为本发明实施例提供的HUVEC中XXYLT1-AS2的相对表达水平的结果图；
图2B为本发明实施例提供的HUVEC中XXYLT1-AS2的相对表达水平的结果图；
图2C为本发明实施例提供的在HUVEC中CCK8检测XXYLT1-AS2对细胞增殖的影响的结果图；
图2D为本发明实施例提供的在HUVEC中划痕检测XXYLT1-AS2对细胞迁移的影响的显微结果图；
图2E为本发明实施例提供的在HUVEC中划痕检测XXYLT1-AS2对细胞迁移的影响的统计结果图；
图2F为本发明实施例提供的XXYLT1-AS2对HUVEC增殖的影响的统计结果图；
图3A为本发明实施例提供的TNF-α处理后HUVEC中XXYLT1-AS2的相对表达水平的结果图；
图3B为本发明实施例提供的TNF-α处理后THP-1中XXYLT1-AS2的相对表达水平的结果图；
图3C为本发明实施例提供的XXYLT1-AS2对单核细胞粘附作用的影响的荧光结果图；
图3D为本发明实施例提供的XXYLT1-AS2对单核细胞粘附作用的影响的统计结果图；
图3E为本发明实施例提供的XXYLT1-AS2对黏附因子VCAM-1表达的影响的结果图；
图3F为本发明实施例提供的XXYLT1-AS2对MCP-1表达的影响的结果图；
图3G为本发明实施例提供的在TNF-α处理的HUVEC中p-P65蛋白水平的相对表达量的结果图；
图4A为本发明实施例提供的HUVEC中XXYLT1-AS2表达的位置的结果图；
图4B为本发明实施例提供的XXYLT1-AS2与FUS结合预测图的结果图；
图4C为本发明实施例提供的XXYLT1-AS2与FUS在HUVEC中的共定位的结果图；
图4D为本发明实施例提供的RIP实验的结果图；
图4E为本发明实施例提供的Pull-down实验的结果图；
图5A为本发明实施例提供的XXYLT1-AS2正向调控FUS的表达的结果图；
图5B为本发明实施例提供的FUS在动脉粥样硬化组织的表达的结果图；
图5C为本发明实施例提供的FUS敲低效率的验证的结果图；
图5D为本发明实施例提供的在HUVEC中XXYLT1-AS2和FUS共同作用对细胞增殖的影响的统计结果图；
图5E为本发明实施例提供的在HUVEC中XXYLT1-AS2和FUS共同作用对细胞迁移的影响的结果图；
图5F为本发明实施例提供的在HUVEC中XXYLT1-AS2和FUS共同作用对细胞增殖的影响的结果图；
图6A为本发明实施例提供的ox-LDL处理后HUVEC中XXYLT1-AS2的相对表达水平的结果图；
图6B为本发明实施例提供的ox-LDL处理后HUVEC中FUS的相对表达水平的结果图；
图6C为本发明实施例提供的ox-LDL处理后XXYLT1-AS2对FUS的调控的结果图；
图6D为本发明实施例提供的ox-LDL处理后XXYLT1-AS2和FUS共同作用对细胞迁移的影响的结果图；
图6E为本发明实施例提供的ox-LDL处理后XXYLT1-AS2和FUS共同作用对细胞增殖影响的统计结果图；
图6F为本发明实施例提供的ox-LDL处理后XXYLT1-AS2和FUS共同作用对细胞增殖影响的结果图；
图6G为本发明实施例提供的ox-LDL处理后XXYLT1-AS2和FUS共同作用对cycin D1表达量的影响的结果图。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
除非本文另有定义，连同本发明使用的科学和技术术语应具有本领域普通技术人员通常理解的含义。术语的含义和范围应当清晰，然而，在任何潜在不明确性的情况下，本文提供的定义优先于任何字典或外来定义。在本申请中，除非另有说明，术语“包括”及其他形式的使用是非限制性的。
一般地，连同本文描述的细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学以及蛋白和核酸化学和杂交使用的命名法和其技术是本领域众所周知和通常使用的那些。除非另有说明，本发明的方法和技术一般根据本领域众所周知，且如各种一般和更具体的参考文献中所述的常规方法来进行，所述参考文献在本说明书自始至终引用和讨论。酶促反应和纯化技术根据制造商的说明书、如本领域通常实现的或如本文所述来进行。连同本文描述的分析化学、合成有机化学以及医学和药物化学使用的命名法、以及其实验室程序和技术是本领域众所周知和通常使用的那些。
根据本发明的一个方面，提供了lncXXYLT1-AS2在制备诊断和/或治疗心血管疾病的产品中的应用，所述LncXXYLT1-AS2含有如SEQ ID NO.1所示的cDNA序列。
本发明的发明人通过实验发现经过厌氧处理人脐静脉内皮细胞，lncXXYLT1-AS2有显著升高。同时，在临床动脉粥样硬化斑块样本中检测发现lncXXYLT1-AS2的表达显著下调，通过对lncXXYLT1-AS2进行特异性的检测能达到诊断心血管疾病的目的。后期实验发现，过表达XXYLT1-AS2能够抑制HUVEC的增殖和迁移，并且能够通过NF-kB信号通路调节炎症反应。此外，结合生物信息学分析发现，lncXXYLT1-AS2可以与下游靶基因FUS发挥结合作用，并通过lncXXYLT1-AS2/FUS/cyclin D1调控内皮细胞的增殖和迁移。通过以上研究将为lncXXYLT1-AS2对心血管疾病发生发展的调控机制提供新的理论基础，为心血管疾病的预防、治疗及诊断提供新的靶点和思路。
需要说明的是，在本发明中，lncXXYLT1-AS2含有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，指的是lncXXYLT1-AS2除去SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列外，还可以含有其他功能序列，如标签序列或连接序列等。
诊断和/或治疗心血管疾病，指的是本发明提供的lncXXYLT1-AS2可以用于诊断心血管疾病，或者用于治疗心血管疾病，或者同时用于诊断心血管疾病和治疗心血管疾病。
在一些优选的实施方式中，所述心血管疾病包括由血管内皮细胞增殖和/或迁移引起的心血管疾病。
心血管疾病例如动脉粥样硬化的发生是由于血管内皮细胞和平滑肌细胞受各种危险因子的损伤，而使血管局部产生的一种过度的慢性炎性增生反应。因此血管内皮细胞增殖和/或迁移在心血管疾病进程中起着重要的作用。在本实施方式中，典型的由血管内皮细胞增殖和/或迁移引起的心血管疾病包括动脉粥样硬化、中风、肺动脉高压、高血压等。
在一些优选的实施方式中，所述产品包括试剂盒或药物。
本发明还提供了一种诊断心血管疾病的试剂盒，所述试剂盒包括识别LncXXYLT1-AS2的标记物；
所述LncXXYLT1-AS2含有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。
lncXXYLT1-AS2在临床动脉粥样硬化斑块样本中检测发现其表达量显著下调，通常降低至50％。本发明提供的试剂盒以lncXXYLT1-AS2作为检测靶点，通过检测lncXXYLT1-AS2在细胞中的表达水平，可以在一定程度上实现对心血管疾病的诊断。
在一些优选的实施方式中，所述识别LncXXYLT1-AS2的标记物包括如下a)或b)中的至少一种：
a)结合LncXXYLT1-AS2的引物；
b)结合LncXXYLT1-AS2的生物大分子，所述的生物大分子包括：抗体或抗体功能片段，或，RNA结合蛋白或其功能片段。
其中，抗体或抗体功能片段优选为荧光标记的抗体或抗体功能片段；RNA结合蛋白或其功能片段优选为荧光标记的RNA结合蛋白或其功能片段。
利用上述标记物，可以对细胞中的LncXXYLT1-AS2的表达水平进行定量检测。
在一些优选的实施方式中，所述结合LncXXYLT1-AS2的引物具有如SEQ ID NO.2(5’-ACTGTGAAACAATGTGAAAAAAACT-3’)和SEQ ID NO.3(5’-ACTTGTCCCATAGTTACTTTACCTC-3’)所示的核苷酸序列。
另外，本发明还提供了一种治疗心血管疾病的药物，所述药物包括如下Ⅰ)-Ⅳ)中的一种或多种：
Ⅰ)LncXXYLT1-AS2；
Ⅱ)含有LncXXYLT1-AS2的编码基因的重组载体；
Ⅲ)含有LncXXYLT1-AS2的编码基因的重组病毒；
Ⅳ)含有LncXXYLT1-AS2的编码基因的重组病毒载体；
所述LncXXYLT1-AS2含有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。
需要说明的是，本发明提供的治疗心血管疾病的药物，可以包括LncXXYLT1-AS2、含有LncXXYLT1-AS2的编码基因的重组病毒、含有LncXXYLT1-AS2的编码基因的重组病毒或含有LncXXYLT1-AS2的编码基因的重组病毒载体中的一种或两种或以上，例如仅包括LncXXYLT1-AS2，或者仅包括含有LncXXYLT1-AS2的编码基因的重组载体，或者包括LncXXYLT1-AS2和含有LncXXYLT1-AS2的编码基因的重组病毒载体，或者包括含有LncXXYLT1-AS2的编码基因的重组载体、含有LncXXYLT1-AS2的编码基因的重组病毒和含有LncXXYLT1-AS2的编码基因的重组病毒载体，或者同时包括LncXXYLT1-AS2、含有LncXXYLT1-AS2的编码基因的重组病毒、含有LncXXYLT1-AS2的编码基因的重组病毒和含有LncXXYLT1-AS2的编码基因的重组病毒载体。
在一些优选的实施方式中，所述药物还包括药学上可接受的载剂；
优选地，所述载剂包括壳聚糖、胆固醇、脂质体和纳米颗粒中的一种或几种。
上述载剂均能够有效包裹LncXXYLT1-AS2、含有LncXXYLT1-AS2的编码基因的重组病毒、含有LncXXYLT1-AS2的编码基因的重组病毒或含有LncXXYLT1-AS2的编码基因的重组病毒载体中的一种或多种，并携上述活性成分进入体内并释放，以起到给药治疗的目的。优选地，通过对上述载体进行进一步修饰，如连接结合位点等，还能够进一步起到靶向给药的作用。
在一些优选的实施方式中，所述药物的剂型包括口服制剂或注射制剂。
当口服用药时，上述药物可制成任意口服可接受的制剂形式，例如可以为，但不限于片剂、胶囊剂、颗粒剂、丸剂、糖浆剂、口服溶液剂、口服混悬剂或口服乳剂。
其中，片剂使用的载体一般包括乳糖和玉米淀粉，另外也可加入润滑剂如硬脂酸镁。胶囊剂使用的稀释剂一般包括乳糖和干燥玉米淀粉。口服混悬剂则通常是将活性成分与适宜的乳化剂和悬浮剂混合使用。
任选地，以上口服制剂形式中还可加入一些甜味剂、芳香剂或着色剂。
当以注射的形式给药时，上述药物可制成任意注射可接受的制剂形式，例如可以为，但不限于注射液或粉针剂。
其中，可使用的载体和溶剂包括水、林格氏溶液和等渗氯化钠溶液。另外，灭菌的非挥发油也可用作溶剂或悬浮介质，如单甘油酯或二甘油酯。
下面通过具体的实施例进一步说明本发明，但是，应当理解为，这些实施例仅仅是用于更详细地说明之用，而不应理解为用于以任何形式限制本发明。
实施例1高通量测序发现lncRNA XXYLT1-AS2在动脉粥样硬化病变中下调
通过生物信息学分析高通量测序结果，发现在未研究的有变化差异的lncRNA中，差异最明显的lncXXYLT1-AS2，结果如图1A，其中高通量测序结果来自GEO数据库(GSE76743)。厌氧(O2＝1％)处理HUVEC 24小时后，高通量测序对表达有差异的lncRNA。
用NONCODE网站对lncXXYLT1-AS2保守性的分析，结果如图1B所示；分别取人脐静脉内皮细胞、小鼠和大鼠的主动脉组织提取总RNA，反转为cDNA，用XXYLT1-AS2的全长引物进行PCR扩增，产物用2％琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图1C所示。上述结果表明，保守性和RT-PCR检验表明lncXXYLT1-AS2在大鼠中有保守性。
取各细胞系RNA，QRT-PCR检测人的各种细胞系中XXYLT1-AS2的表达量，(P<0.05)。QRT-PCR检测lncXXYLT1-AS2在各个细胞系中的表达量，发现人脐静脉内皮(HUVEC)表达最为丰富，所以选择HUVEC细胞系作为研究对象(图1D，其中VSMC：人的血管平滑肌细胞系；HUVEC：人的内皮细胞系；THP-1：人的单核细胞系)。
分别取健康人和患有动脉粥样硬化病人的主动脉，提取总RNA，QRT-PCR检测XXYLT1-AS2的表达量，(n＝3，P<0.05)，结果如图1E所示(Normal：健康人的主动脉；Athero:患有动脉粥样硬化病人的主动脉)。分别取健康人和患有动脉粥样硬化病人的主动脉，做石蜡切片后FISH染色。红色：探针标记的XXYLT1-AS2；蓝色：DAPI标记的细胞核，结果如图1G所示(NC：健康人的主动脉；AS:患有动脉粥样硬化病人的主动脉)。QRT-PCR和FISH表明与健康组相比患有动脉粥样硬化病人主动脉中的lncXXYLT1-AS2表达量明显下降，两者有显著差异(P＜0.05)。
构建大鼠颈动脉球囊损伤模型，分别在第3、7和21天处死雄性SD大鼠(300-350g)，收集颈动脉，提取总RNA，QRT-PCR检测XXYLT1-AS2的表达量，(n＝3，P<0.05)，QRT-PCR表明在大鼠球囊损伤模型中，lncXXYLT1-AS2表达下降。
实施例2XXYLT1-AS2抑制HUVEC的增殖和迁移
HUVEC转染24h之后，提取RNA。QRT-PCR检测XXYLT1-AS2在各组细胞中的表达量(P＜0.05)，结果如图2A所示(NC组：转染无关序列(Negative control，NC)；si-XXYLT1-AS2组：转染si-XXYLT1-AS2)。HUVEC转染24h之后，提取RNA。QRT-PCR检测XXYLT1-AS2在各组细胞中的表达量，(n＝3，P<0.05)，结果如图2B所示(Vector组：转染空载为阴性对照；XXYLT1-AS2组：转染XXYLT1-AS2过表达)。通过QRT-PCR检测转染效率结果表明，与阴性对照相比组中si-XXYLT1-AS2表达量明显下降，有显著性差异(P＜0.05)。XXYLT1-AS2过表达组XXYLT1-AS2表达量明显升高，有显著性差异(P＜0.05)。
HUVEC转染之后，分别在转染0，12，24，36，48h时加入CCK8试剂，孵育1h后检测OD450，(n＝3，P<0.05)，结果如图2C所示(NC组：转染无关序列；si-XXYLT1-AS2组：转染si-XXYLT1-AS2；Vector组：转染空载；XXYLT1-AS2组：转染XXYLT1-AS2)。CCK8实验结果表明，si-XXYLT1-AS2组细胞增殖率明显低于NC组，有显著性差异(P＜0.05)；而XXYLT1-AS2过表达组细胞增殖率明显下降，有显著性差异(P＜0.05)。
HUVEC转染12h之后，对细胞进行划痕。分别在划痕后0，12，24，36，48h时拍摄同一位置的图像，结果如图2D所示(NC组：转染无关序列；si-XXYLT1-AS2组：转染si-XXYLT1-AS2；Vector组：转染空载；XXYLT1-AS2组：转染XXYLT1-AS2)。12/24/36/48h划痕愈合比率(％)＝(0h划痕面积-12/24/36/48h划痕面积)/0h划痕面积，结果如图2E所示(NC组：转染无关序列；si-XXYLT1-AS2组：转染si-XXYLT1-AS2；Vector组：转染空载；XXYLT1-AS2组：转染XXYLT1-AS2)。划痕实验结果表明，si-XXYLT1-AS2组细胞迁移率明显高于NC组，有显著性差异(P＜0.05)；XXYLT1-AS2过表达组细胞迁移率明显下降，有显著性差异(P＜0.05)。
HUVEC转染24h之后，使用EdU试剂盒进行EdU染色，拍摄图片。绿色：EdU标记的增殖细胞；蓝色：Hoechst标记的细胞核，EdU比率(％)＝绿色细胞数/蓝色细胞数，(n＝3，P<0.05)。EdU检测表明，si-XXYLT1-AS2组细胞增殖率明显高于NC组，有显著性差异(P＜0.05)；XXYLT1-AS2过表达组细胞增殖率明显下降，有显著性差异(P＜0.05)。以上实验结果表明XXYLT1-AS2抑制HUVEC的增殖和迁移。
实施例3XXYLT1-AS2抑制炎症基因的表达和NF-kB通路
HUVEC分别在浓度为10ng/ml的TNF-α处理12/24/36/48h之后，提取RNA。QRT-PCR检测XXYLT1-AS2在各个时间点的表达量，(n＝3，P<0.05)，结果如图3A所示。THP-1细胞分别在浓度为10ng/ml的TNF-α处理12/24/36/48h之后，提取RNA。QRT-PCR检测XXYLT1-AS2在各个时间点的表达量，(n＝3，P<0.05)，结果如图3B所示。通过QRT-PCR检测发现，在TNF-α处理的HUVEC和THP-1细胞系中，XXYLT1-AS2的表达量下降(P＜0.05)。
HUVEC转染24h之后，与活细胞染料CFSE(1μM)标记的THP-1共孵育6h，HUVEC黏附数量＝随机三个视野绿色细胞数，(n＝3，P<0.05)，结果如图3D所示(NC组：转染无关序列；si-XXYLT1-AS2组：转染si-XXYLT1-AS2；Vector组：转染空载；XXYLT1-AS2组：转染XXYLT1-AS2)。单核细胞黏附实验表明，si-XXYLT1-AS2组单核细胞黏附数量明显高于NC组，有显著性差异(P＜0.05)；而XXYLT1-AS2过表达组单核细胞黏附数量明显下降，有显著性差异(P＜0.05)。
HUVEC转染24h之后，换为无血清培养基，TNF-α(10ng/ml)处理12h后，提取RNA，QRT-PCR检测黏附因子VCAM-1的表达，结果如图3E所示(NC组：转染无关序列；si-XXYLT1-AS2组：转染si-XXYLT1-AS2；Vector组：转染空载；XXYLT1-AS2组：转染XXYLT1-AS2；TNF-α：人肿瘤坏死因子α；VCAM-1：血管细胞粘附分子-1；MCP-1：人单核细胞趋化蛋白-1)。HUVEC转染24h之后，换为无血清培养基，TNF-α(10ng/ml)处理12h后，提取RNA。QRT-PCR检测MCP-1的表达，结果如图3F所示(NC组：转染无关序列；si-XXYLT1-AS2组：转染si-XXYLT1-AS2；Vector组：转染空载；XXYLT1-AS2组：转染XXYLT1-AS2；TNF-α：人肿瘤坏死因子α；VCAM-1：血管细胞粘附分子-1；MCP-1：人单核细胞趋化蛋白-1)。QRT-PCR检测发现，经过TNF-α处理的内皮细胞，si-XXYLT1-AS2组炎症基因VCAM-1、MCP-1表达量明显增加，有显著差异(P＜0.05)；而XXYLT1-AS2过表达组炎症基因VCAM-1、MCP-1表达量明显减少，有显著性差异(P＜0.05)。
HUVEC转染24h之后，TNF-α处理12h后收取蛋白，蛋白免疫印迹检测p-P65的表达量，(n＝3，P<0.05)，结果如图3G所示(NC组：转染无关序列；si-XXYLT1-AS2组：转染si-XXYLT1-AS2；Vector组：转染空载；XXYLT1-AS2组：转染XXYLT1-AS2；TNF-α：人肿瘤坏死因子α)。蛋白免疫印迹检测发现，si-XXYLT1-AS2组NF-kB的磷酸化明显增强；而XXYLT1-AS2过表达组NF-kB的磷酸化明显减弱。
实施例4XXYLT1-AS2抑制炎症基因的表达和NF-kB通路
HUVEC正常生长，无转染处理，使用FISH探针孵育过夜，共聚焦拍摄图片。红色：红色荧光标签标记的XXYLT1-AS2；蓝色：DAPI标记的细胞核。FISH实验可以定位HUVEC中的XXYLT1-AS2，结果如图4A所示，XXYLT1-AS2主要在细胞核中表达。由结果推测XXYLT1-AS2是通过顺式/反式作用发挥生物学功能。
用CatRAPID软件预测XXYLT1-AS2与FUS结合的可能性，Discriminative Power(DP)代表结合的可能性，当DP大于50％时，可能发生结合。XXYLT1-AS2与FUS的DP值为96％，两者结合的可能性极大。CatRAPID软件预测表明了XXYLT1-AS2与RNA/DNA结合蛋白FUS结合的可能性(图4B)。
HUVEC正常生长，无转染处理，使用FISH探针孵育过夜，第二天细胞免疫荧光标记FUS，拍摄图片。红色：红色荧光标签标记的XXYLT1-AS2；绿色：绿色荧光标记的FUS；蓝色：DAPI标记的细胞核。XXYLT1-AS2和FUS共定位发现，两者均位于细胞核中(图4C)。
HUVEC正常生长，无转染处理，提取蛋白裂解液加琼脂糖磁珠4度摇晃孵育过夜，第二天分别加入IgG、CDK1和FUS抗体继续孵育4h后，离心提取RNA，反转为cDNA，分别用XXYLT1-AS2、ABHD11-AS1的引物进行PCR扩增，产物用2％琼脂糖凝胶电泳检测。RIP实验表明，XXYLT1-AS2与FUS结合(图4D)。
HUVEC正常生长，无转染处理，提取蛋白裂解液加生物素标记的XXYLT1-AS2的探针，然后加入孵育好的链霉素亲和磁珠，提取蛋白，蛋白免疫印迹检测FUS的表达。RNAPull-down实验也证实了XXYLT1-AS2可以与FUS结合(图4E)。
实施例5FUS抑制HUVEC的增殖和迁移
HUVEC转染24h之后，收取蛋白，蛋白免疫印迹检测FUS表达量。蛋白免疫印迹检测表明，XXYLT1-AS2正调节FUS的表达(图5A，其中NC组：转染无关序列；si-XXYLT1-AS2组：转染si-XXYLT1-AS2；Vector组：转染空载；XXYLT1-AS2组：转染XXYLT1-AS2)。
分别取健康人和患有动脉粥样硬化病人的主动脉，提取总蛋白，蛋白免疫印记检测FUS的表达量，(P<0.05)。免疫组化实验表明，与健康动脉相比，患有动脉粥样硬化的动脉中，FUS的表达量下降(图5B，其中Normal：健康人的主动脉；Athero:患有动脉粥样硬化病人的主动脉)。
分别取健康人和患有动脉粥样硬化病人的主动脉，提取总蛋白，蛋白免疫印记检测FUS的表达量，(P<0.05)。蛋白免疫印迹检测FUS敲低效率表明，转染si-FUS组FUS蛋白水平明显减少(图5C，其中NC：转染无关序列NC；si-FUS：转染si-FUS)。
HUVEC转染24h之后，使用EdU试剂盒进行EdU染色，拍摄图片。绿色：EdU标记的增殖细胞；蓝色：DAPI标记的细胞核，EdU比率(％)＝绿色细胞数/蓝色细胞数，(n＝3，P<0.05)，结果如图5D所示(XXYLT1-AS2组：转染XXYLT1-AS2；NC组：转染无关序列NC；si-FUS组：转染si-FUS；XXYLT1-AS2+si-FUS：共转染si-FUS和XXYLT1-AS2)。EdU检测表明，XXYLT1-AS2过表达组细胞增殖率明显下降，有显著性差异(P＜0.05)；si-FUS组细胞增殖率明显高于NC组，有显著性差异(P＜0.05)。
HUVEC转染12h之后，对细胞进行划痕。分别在划痕后0、12、24、36、48h时拍摄同一位置的图像。划痕实验结果表明，XXYLT1-AS2过表达组细胞迁移率明显下降，有显著性差异(P＜0.05)；si-FUS组细胞迁移率明显高于NC组，有显著性差异(P＜0.05)(图5E，其中XXYLT1-AS2组：转染XXYLT1-AS2；NC组：转染无关序列NC；si-FUS组：转染si-FUS；XXYLT1-AS2+si-FUS：共转染si-FUS和XXYLT1-AS2)。
UVEC转染之后，分别在转染0、12、24、36、48h时加入CCK8试剂，37℃孵育1h后检测OD450，(n＝3，P<0.05)。CCK8检测表明，XXYLT1-AS2过表达组细胞增殖率明显下降，有显著性差异(P＜0.05)；si-FUS组细胞增殖率明显高于NC组，有显著性差异(P＜0.05)(图5F，其中，XXYLT1-AS2组：转染XXYLT1-AS2；NC组：转染无关序列NC；si-FUS组：转染si-FUS；XXYLT1-AS2+si-FUS：共转染si-FUS和XXYLT1-AS2)。
实施例6ox-LDL处理下XXYLT1-AS2通过FUS调控细胞的增殖和迁移
QRT-PCR表明，ox-LDL处理后XXYLT1-AS2在mRNA水平上时间依赖性下降，有显著性差异(P＜0.05)(图6A)；HUVEC分别在浓度为50μM的ox-LDL处理12/24/36/48h之后，提取RNA。QRT-PCR检测FUS在各个时间点的表达量(n＝3，P<0.05)，QRT-PCR表明，ox-LDL处理后FUS在mRNA水平上时间依赖性下降，有显著性差异(P＜0.05)(图6B)；HUVEC转染24h之后，收取蛋白，蛋白免疫印迹检测FUS表达量。蛋白免疫印迹实验表明，ox-LDL处理HUVEC后，XXYLT1-AS2过表达组FUS蛋白水平表达量明显高于转染空载对照组，有显著性差异(P＜0.05)(图6C，其中Vector组：转染空载；XXYLT1-AS2组：转染XXYLT1-AS2；ox-LDL：氧化低密度脂蛋白)。
HUVEC转染12h，ox-LDL处理12h，对细胞进行划痕。分别在划痕后0、12、24、36、48h时拍摄同一位置的图像。划痕实验结果表明，ox-LDL处理HUVEC后，XXYLT1-AS2过表达组细胞迁移率明显下降，有显著性差异(P＜0.05)；si-FUS组细胞迁移率明显高于NC组，有显著性差异(P＜0.05)(图6D，con：正常生长的细胞；ox-LDL：ox-LDL处理的细胞；XXYLT1-AS2+ox-LDL：转染XXYLT1-AS2和ox-LDL处理；XXYLT1-AS2+NC+ox-LDL：转染XXYLT1-AS2、NC和ox-LDL处理；XXYLT1-AS2+si-FUS+ox-LDL：转染XXYLT1-AS2、si-FUS和ox-LDL处理)。
HUVEC转染12h用ox-LDL处理12h之后，使用EdU试剂盒进行EdU染色，拍摄图片。绿色：EdU标记的增殖细胞；蓝色：DAPI标记的细胞核，EdU比率(％)＝绿色细胞数/蓝色细胞数(n＝3，P<0.05)，结果如图6E所示(con:正常生长的细胞；ox-LDL：ox-LDL处理的细胞；XXYLT1-AS2+ox-LDL：转染XXYLT1-AS2和ox-LDL处理；XXYLT1-AS2+NC+ox-LDL：转染XXYLT1-AS2、NC和ox-LDL处理；XXYLT1-AS2+si-FUS+ox-LDL：转染XXYLT1-AS2、si-FUS和ox-LDL处理)。EdU检测表明，ox-LDL处理HUVEC后，XXYLT1-AS2过表达组细胞增殖率明显下降，有显著性差异(P＜0.05)；si-FUS组细胞增殖率明显高于NC组，有显著性差异(P＜0.05)。
HUVEC转染12h用ox-LDL处理12h之后，分别在转染0、12、24、36、48h时加入CCK8试剂，37℃孵育1h后检测OD450(n＝3，P<0.05)。CCK8检测表明，ox-LDL处理HUVEC后，XXYLT1-AS2过表达组细胞增殖率明显下降，有显著性差异(P＜0.05)；si-FUS组细胞增殖率明显高于NC组，有显著性差异(P＜0.05)(图6F，con：正常生长的细胞；ox-LDL：ox-LDL处理的细胞；XXYLT1-AS2+ox-LDL：转染XXYLT1-AS2和ox-LDL处理；XXYLT1-AS2+NC+ox-LDL：转染XXYLT1-AS2、NC和ox-LDL处理；XXYLT1-AS2+si-FUS+ox-LDL：转染XXYLT1-AS2、si-FUS和ox-LDL处理)。
HUVEC转染12h，用ox-LDL处理12h之后，收取蛋白，蛋白免疫印迹检测cycin D1表达量。蛋白免疫印迹实验表明，ox-LDL处理HUVEC后，XXYLT1-AS2过表达组cyclin D1蛋白水平表达量下降，有显著性差异(P＜0.05)；si-FUS组cyclin D1蛋白水平表达量升高，有显著性差异(P＜0.05)(图6G，ox-LDL组：ox-LDL处理的细胞；XXYLT1-AS2组：转染XXYLT1-AS2；NC组：转染NC；si-FUS组：转染si-FUS)。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (1)

1.一种结合LncXXYLT1-AS2的引物在制备诊断动脉粥样硬化试剂盒中的应用，其中，所述结合LncXXYLT1-AS2的引物序列为：5’-ACTGTGAAACAATGTGAAAAAAACT-3’和5’-ACTTGTCCCATAGTTACTTTACCTC-3’。
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