CN111118143A - 检测及靶向rp11-754b17.1的试剂及其在关节炎中的应用 - Google Patents

检测及靶向rp11-754b17.1的试剂及其在关节炎中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了检测及靶向RP11‑754B17.1的试剂及其在关节炎中的应用，本发明发现，RP11‑754B17.1能够有效的区分骨关节炎患者以及正常人；同时降低RP11‑754B17.1的表达水平可以促进细胞的增殖以及降低细胞的凋亡，从而为骨关节炎的诊断和治疗提供了新的分子手段。

Description

检测及靶向RP11-754B17.1的试剂及其在关节炎中的应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，涉及检测及靶向生物标志物RP11-754B17.1的试剂及其在关节炎中的应用。
背景技术
骨关节炎(osteoarthritis，OA)是一种异质性的慢性病，致病因素极其复杂，给社会带来了巨大的经济负担。OA具有极高的致残率，严重降低了患者的生活质量(Hunter DJ,Schofield D,Callander E.The individual and socioeconomic impact ofosteoarthritis[J].Nat Rev Rheumatol,2014,10(7):437-441.)，但是目前尚缺乏有效的治疗手段。OA发生时，关节组织发生一系列病理变化：包括软骨降解，滑膜炎症，骨赘形成和软骨下骨硬化等(Moon PM,Beier F.Novel Insights into Osteoarthritis JointPathology from Studies in Mice[J].Curr Rheumatol Rep,2015,17(8):50)。软骨侵蚀是OA发生的标志，由细胞外基质降解酶表达升高和软骨细胞外基质组分表达降低而共同引起。骨关节炎目前无法根治，发病后无有效的治疗手段，对患者及其家庭和社会都造成严重的影响。近年来，如何对骨关节炎进行有效的预防和治疗成为亟待解决的问题。
长链非编码RNA(long non-coding RNAs,1ncRNAs)是一类长度大于200个核苷酸、不编码蛋白的内源性RNA。它们通常位于相邻基因间或编码蛋白的序列重叠区，并由RNA聚合酶II转录(Quinn JJ,Chang HY.Unique features of long non-coding RNAbiogenesis and function[J].Nat Rev Genet,2016,17(1):47-62)。LncRNAs可以折叠形成独特的二级结构，包括DNA结合结构域、RNA结合结构域以及蛋白质结合结构域，从而广泛调节DNA,RNA和蛋白质的功能(Mercer TR,Mattick JS.Structure and function of longnoncoding RNAs in epigenetic regulation[J].Nat Struct Mol Biol,2013,20(3):300-307.)。大量研究表明，1ncRNAs可以在转录水平或转录后水平以多种机制调控蛋白编码基因的表达，如参与染色质重塑、作为ceRNAs抑制miRNA的功能或影响mRNA的稳定性等(Huynh NP,Anderson BA,Guilak F,McAlinden A.Emerging roles for long noncodingRNAs in skeletal biology and disease[J].Connect Tissue Res,2017,58(1):116-141.)。近年来，越来越多的证据表明，1ncRNAs参与调控细胞的增殖、凋亡、分化以及肿瘤的发生发展等正常生理以及病理过程(Shin VY,Chen J,Cheuk IW,Siu MT,Ho CW,Wang X,Jin H,Kwong A.Long non-coding RNA NEAT1 confers oncogenic role in triple-negativebreast cancer through modulating chemoresistance and cancer sternness[J].Cell Death Dis,2019,10(4):270.)。
随着lncRNA研究的进展，寻找与骨关节炎相关的lncRNA，为骨关节新型诊断和治疗策略的开发提供了机会。
发明内容
为了弥补现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种与骨关节炎发生发展相关的生物标志物及其在诊断和治疗骨关节炎中的应用。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明提供了用于测定来自骨关节炎病相关基因的试剂在制备诊断骨关节炎的产品中的应用，相关基因包括生物标志物RP11-754B17.1。
进一步，相比于生物标志物RP11-754B17.1正常对照表达水平，骨关节炎患者中生物标志物RP11-754B17.1的表达水平升高。
进一步，在转录水平上测定生物标志物RP11-754B17.1的表达水平。
进一步，通过检测探针与所述生物标志物RP11-754B17.1的基因转录产物杂交或通过扩增所述生物标志物RP11-754B17.1的基因转录物来测定生物标志物RP11-754B17.1的表达水平。
进一步，杂交步骤在核酸微阵列芯片或微流体测定板中进行。
进一步，扩增反应包括聚合酶链式反应(PCR)。
进一步，聚合酶链式反应包括实时定量聚合酶链式反应。
进一步，实时定量聚合酶链式反应的引物序列如SEQ ID NO.1～2所示。
进一步，在选自血液、血清和血浆的生物样本中检测所述表达水平。
本发明提供了一种诊断骨关节炎的产品，所述产品包括检测生物标志物RP11-754B17.1的试剂。
本发明提供了RP11-754B17.1作为分子靶标在制备治疗骨关节炎的药物组合物中的应用。
进一步，所述药物组合物包括生物标志物RP11-754B17.1的抑制剂。
进一步，所述抑制剂降低RP11-754B17.1的表达。
进一步，所述抑制剂为siRNA。
进一步，所述siRNA的序列如SEQ ID NO.5～6所示。
本发明提供了一种治疗骨关节炎的药物组合物，所述药物组合物包括生物标志物RP11-754B17.1的抑制剂。
进一步，所述抑制剂为siRNA。
进一步，所述siRNA的序列如SEQ ID NO.5～6所示。
进一步，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体。
本发明提供了RP11-754B17.1在筛选治疗骨关节炎的候选药物中的应用，包括以下步骤：
1)使测试物质与表达RP11-754B17.1基因的细胞接触；并
2)选择与在该测试物质不存在时检测到的表达水平相比降低RP11-754B17.1基因的表达水平的测试物质。
本发明的优点和有益效果：
本发明首次发现了RP11-754B17.1基因表达与骨关节炎病相关，通过检测受试者样品中RP11-754B17.1的表达水平，可以有效的区分骨关节炎患者与健康对照。
本发明基于RP11-754B17.1在骨关节炎患者中表达上调，设计针对RP11-754B17.1的siRNA进行细胞实验，发现改变细胞中RP11-754B17.1的表达水平可以改变骨关节炎细胞的增殖活性和凋亡率，提示RP11-754B17.1作为分子靶标具有较好的应用前景。
附图说明
图1是RP11-754B17.1基因在样本中的表达情况图；其中，A是血液样本，B是组织样本；
图2是RP11-754B17.1基因在细胞中的表达情况图；
图3是RP11-754B17.1基因对细胞增殖的影响图；
图4是RP11-754B17.1基因对细胞凋亡的影响图。
具体的实施方式
术语或“标志物”或“生物标志物”一般指其在组织或细胞中/上表达或分泌的可以通过已知的方法(或本文所披露的方法)来检测且是预测性的或以用于预测(或帮助预测)患者患病风险的分子，包括基因、mRNA、蛋白质、碳水化合物结构或糖脂。本文中特别感兴趣的生物标志物是RP11-754B17.1。
在本发明中，RP11-754B17.1包括野生型、突变型或其片段。对于本发明的目的，“RP11-754B17.1”指RP11-754B17.1的DNA或mRNA，包括其中任意一种样品中RP11-754B17.1检测的片段或部分。一种代表性的RP11-754B17.1基因具有ENST00000527799.1所示的序列。
“样品”或“样本”指从骨关节炎患者获得的相似细胞的集合。组织或细胞样品的来源可以是实体组织，像来自新鲜的、冷冻的和/或保存的器官或组织样品或活检样品或穿刺样品；血液或任何血液组分；体液，诸如脑脊液、分泌物、腹膜液(腹水)或间隙液；来自受试者任何时间的细胞。组织样品可能包含在自然界中天然不与组织混杂的化合物，诸如防腐剂、抗凝剂、缓冲剂、固定剂、营养物、抗生素等等。本文中患者样品的例子包括但不限于，血清或血浆、外周血单个核细胞(PBMC)、循环中的血浆蛋白质、腹水、患者原代细胞培养物或细胞系、以及保存的组织样品，诸如福尔马林固定的、石蜡包埋的组织样品或冷冻的组织样品。在优选的实施方案中，所述样品为血液。
与骨关节炎患者临床受益有关的生物标志物的“量”或“水平”是生物学样品中可检测的水平。这些可以通过本领域中技术人员已知的的方法来测量。
术语“表达的水平”或“表达水平”通常可互换使用，且一般指生物学样品中多核苷酸、mRNA或氨基酸产物或蛋白质的量。“表达”一般指基因所编码的信息转换成细胞中存在的和运行的结构的过程。因此，依照本发明，基因的“表达”可以指转录成多核苷酸、翻译成蛋白质、或甚至蛋白质的翻译后修饰。转录得到的多核苷酸的、翻译得到的蛋白质的、或翻译后修饰得到的蛋白质的片段也应视为表达的，无论它们是源自通过可变剪接生成的转录物或经过降解的转录物，或者是源自蛋白质的翻译后加工(例如通过蛋白水解)。“表达的基因”包括转录成多核苷酸(如mRNA)、然后翻译成蛋白质的基因，还有转录成RNA但不翻译成蛋白质的基因(例如miRNA，lncRNA)。
生物标志物的“升高”或“较高”的量或水平指所述量等于或大于健康对照群体中生物标志物表达水平，生物标志物相对于对照表达水平过表达至少1.5倍，例如至少1.6倍、1.7倍、1.8倍、1.9倍、2.0倍、2.1倍、2.2倍、2.3倍、2.4倍、2.5倍、2.6倍、2.7倍、2.8倍、2.9倍、3.0倍、3.1倍、3.2倍、3.3倍、3.4倍或3.5倍或更多倍。
生物标志物的“降低”或“较低”的量或水平指所述量小于健康对照群体中生物标志物的中值量，生物标志物相对于对照表达水平低表达至少1.5倍，例如至少1.6倍、1.7倍、1.8倍、1.9倍、2.0倍、2.1倍、2.2倍、2.3倍、2.4倍、2.5倍、2.6倍、2.7倍、2.8倍、2.9倍、3.0倍、3.1倍、3.2倍、3.3倍、3.4倍或3.5倍或更多倍。
术语“核酸”和“多核苷酸”在本文可交换使用，指单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸及它们的聚合物。该术语包括含有已知核苷酸类似物或修饰的主链残基或连接的核酸，所述核酸是合成的、天然存在的和非天然存在的，与参照核酸具有相似的结合特性，以及与参照核酸以相似的方式代谢。这类类似物的实例包括但不限于，硫代磷酸、磷酰胺、甲基磷酸、手性甲基磷酸、2-O-甲基核苷酸、肽核酸(PNA)。
除非另外指出，具体的核酸序列还包括其保守型修饰的变体(例如，简并密码子取代)和互补序列，以及明确指明的序列。具体来说，简并密码子取代可以通过产生下述序列来实现，该序列中一个或多个选择(或全部)的密码子的第三位用混合碱基和/或脱氧肌苷残基替代。术语核酸与基因、cDNA、mRNA、寡核苷酸和多核苷酸可交换使用。
本发明可以利用本领域内已知的任何方法测定基因表达。这些技术包括但不限于：核酸测序、核酸杂交、核酸扩增技术，本领域技术人员应当理解，测定基因表达的手段不是本发明的重要方面。
如本文所用的药物组合物，它含有有效量的所述的RP11-754B17.1的抑制剂，以及药学上可接受的载体，所述的药物组合物可用于治疗骨关节炎。
作为本发明的一种优选方式，所述的RP11-754B17.1的抑制剂是针对RP11-754B17.1的小干扰RNA。本文所用，所述的“小干扰RNA”是指一种短片段双链RNA分子，能够以同源互补序列的mRNA为靶目标降解特定的mRNA，这个过程就是RNA干扰(RNAinterference)过程。小干扰RNA可以制备成双链核酸的形式，它含有一个正义链和一个反义链，这两条链仅在杂交的条件下形成双链。一个双链RNA复合物可以由相互分离的正义链和反义链来制备。因此，举例来讲，互补的正义链和反义链是化学合成的，其后可通过退火杂交，产生合成的双链RNA复合物。
本发明所述药物可以是适合注射给药的剂型、适合口服摄取的剂型(如胶囊、片剂、囊片、酏剂)、适合局部给药的油膏、乳膏或洗剂形式、适合用作滴眼剂的递送剂型、适合通过吸入给药的气雾剂形式(如通过鼻内吸入或口吸入)、适合胃肠外给药的剂型，即皮下、肌肉内或静脉内注射。
本发明的药物组合物还可以与其他治疗骨关节炎的药物联用，其他治疗性化合物可以与主要的活性成分同时给药，甚至在同一组合物中同时给药。还可以以单独的药物或与主要的活性成分不同的剂量形式单独给予其它治疗性化合物。
下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。
以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1 QPCR测序验证RP11-754B17.1基因的表达情况
1、样品收集
选取进行膝关节置换手术的患者78例，其中OA患者48例，正常对照30例，收集患者的血液样本和组织样本，OA组和对照组的年龄、性别无统计学意义。
OA组：纳入标准：1)根据OA诊断标准，确诊骨关节炎患者，行膝关节置换手术；2)为初次置换。排除标准：1)合并其他炎症性关节炎或自身免疫性疾病，包括类风湿关节炎、痛风、系统性红斑狼疮等者；2)膝关节严重创伤史者；3)近3个月内有类固醇药物注射史或非类固醇类药物应用史者；4)合并严重肝肾功能疾病及心血管疾病者。
对照组：纳入标准：1)肢体毁损伤截肢术的患者；2)为初次置换。排除标准：1)所取关节术前有过明确外伤、疼痛；2)有骨关节炎、类风湿性关节炎、痛风病史；3)X线检查提示存在明显骨关节炎表现者。
2、Trizol法提取样本中的RNA
使用Trizol试剂从组织和血液样本中提取总RNA。向细胞中加入1ml预冷的TRizol，混匀直至透明状溶液。将裂解液转移至1.5m1离心管中，室温下放置5min，使得核酸蛋白复合物完全分离。加入氯仿，振荡，离心。吸取无色上清液移至另一离心管，向上清液中加入异丙醇，静置，离心，移去上清液，加入乙醇，离心，移去上清液，室温干燥RNA沉淀，加入适量的无酶水溶解沉淀
3、qRT-PCR检测
取总RNA500ng，应用GeneCopoeia逆转录试剂盒将其逆转录为cDNA，反应条件：42℃15min，95℃2min。以cDNA为模版，进行qRT-PCR，以GAPDH为内参照进行扩增，反应条件：95℃3min，(95℃15s，60℃15s，72℃40s)×40。引物由公司合成，相关引物序列如下：RP11-754B17.1(F：5’-CCAAGACTAAGGATGTGT-3’，SEQ ID NO.1；R：5’-TGAAGAGGATCAGTGTTG-3’，SEQ ID NO.2)；GAPDH(F：5’-CTCTGGTAAAGTGGATATTG-3’，SEQ ID NO.3；R：5’-GGTGGAATCATATTGGAACA-3’，SEQ ID NO.4)，通过qRT-PCR仪特定软件程序记录并分析检测数据结果，根据公式倍数＝2-ΔΔCt计算各检测目的基因的相对表达量。
4、统计学分析
实验采用3次重复实验，结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示，两者之间的差异采用t检验，认为当P<0.05时具有统计学意义，所有结果均采用GraphPad Software软件进行绘图。对变量RP11-754B17.1进行ROC曲线分析，判断基因的诊断效能、灵敏度和特异性。
5、结果
结果如图1所示，与健康对照相比，RP11-754B17.1基因在骨关节炎病患者血液和组织中的表达显著上调，上调约5.7倍和7.6倍，差异具有统计学意义(P<0.05)。
ROC曲线分析表明RP11-754B17.1可以作为生物标志物应用于骨关节炎的诊断，其曲线下面积为0.917(血液样本)和0.942(组织样本)，可以有效的区分骨关节炎患者与健康对照。
实施例2 RP11-754B17.1基因的沉默及对细胞的影响
1、细胞获取及培养
用含1％双抗PBS反复冲洗OA患者的软骨组织3次，无菌的眼科小剪刀将组织剪碎至1mm3大小的碎片，得到的软骨碎片放入l0cm培养皿中，加入l0ml新鲜的0.25％胰蛋白酶，37℃,5％CO2培养箱中消化30min，除去可能附着的成纤维细胞。吸出胰酶消化液，加入l0ml含10％FBS的DMEM培养液，吹打混匀终止消化，用10ml的含双抗的PBS清洗2遍。向培养皿中加入0.2％II型胶原酶l0ml，置于37℃,5％CO2培养箱中消化4h。将游离出的含有胶原酶溶液的软骨细胞悬液用吸管吸出，70μm 200目细胞筛过滤，所得滤液移入离心管中离心1000r/min，l0min，弃去上清液。用含10％FBS的DMEM培养基吹打混匀，25cm培养瓶中进行培养。
2、转染
由上海吉码制药技术有限公司设计并合成针对RP11-754B17.1的siRNA，具体序列为5’-UCAAACUCCAGACUUUCAGGU-3’，SEQ ID NO.5；反义链为5’-CUGAAAGUCUGGAGUUUGAAC-3’，SEQ ID NO.6，对照为通用的siRNA-NC。按照Lipofectamine 3000试剂说明书步骤，分别混匀脂质体和OPTI-MEM减血清培养基以及siRNA和OPTI-MEM培养基，室温放置5min，然后将脂质体、siRNA和OPTI-MEM培养基混合，室温放置20min。将混合溶液加入无血清的细胞培养基中，轻轻晃动混匀，孵育8h后换成含有10％胎牛血清的完全培养基继续培养。
3、qRT-PCR检测siRNA对RP11-754B17.1的沉默效果
使用Trizol法提取细胞总RNA，然后按照实施例1中的方法进行逆转录以及实时定量PCR检测。
4、CCK-8法检测细胞的增殖活性
取对数生长期的细胞，进行重悬计数，以5000个细胞/孔接种于96孔板，每组设置5个复孔；在72h加入CCK8试剂，100μL/孔，37℃避光孵育1h，用酶标仪在450nm波长下检测吸光值(OD)。
5、流式细胞检测细胞凋亡
使用Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒以及流式细胞仪检测细胞凋亡。试剂配制参照细胞凋亡检测试剂盒说明书。细胞转染培养48h后，收集细胞，用100μl的Bindingbuffer溶液重悬细胞，加入5μL AnnexinV-FITC和5μL PI Staining Solution，轻吹混匀，避光孵育15min。加入400μl 1×Binding buffer，使用流式细胞仪进行凋亡检测。
6、统计学分析
所有数据用采用均数±标准差表示。两组间比较采用双侧Student's t检验，三组及以上采用单因素方差分析。所有结果均采用GraphPad Software软件进行绘图。P<0.05定义为差异有统计学意义。
7、结果
干扰结果如图2所示，相比siRNA-NC组和空白对照组，转染siRNA-RP11-754B17.1实验组中的RP11-754B17.1基因表达水平显著下调，差异有统计学意义，而siRNA-NC组和空白对照组之间没有显著的差异。
CCK-8实验检测结果如图3所示，转染siRNA-RP11-754B17.1实验组的细胞增殖活性相比于对照组显著增加，说明RP11-754B17.1在软骨细胞增殖中起着重要的作用。
细胞凋亡实验结果如图4所示，转染siRNA-RP11-754B17.1实验组的软骨细胞凋亡率显著降低，说明RP11-754B17.1影响着软骨细胞的凋亡。
上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。
序列表
<110> 西安市红会医院
<120> 检测及靶向RP11-754B17.1的试剂及其在关节炎中的应用
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ccaagactaa ggatgtgt 18
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tgaagaggat cagtgttg 18
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ctctggtaaa gtggatattg 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ggtggaatca tattggaaca 20
<210> 5
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ucaaacucca gacuuucagg u 21
<210> 6
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
cugaaagucu ggaguuugaa c 21

Claims (10)

1.用于测定来自骨关节炎相关基因的试剂在制备诊断骨关节炎的产品中的应用，其特征在于，相关基因包括生物标志物RP11-754B17.1。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，相比于生物标志物RP11-754B17.1正常对照表达水平，骨关节炎患者中生物标志物RP11-754B17.1的表达水平升高。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，在转录水平上测定生物标志物RP11-754B17.1的表达水平。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，通过检测探针与所述生物标志物RP11-754B17.1的基因转录产物杂交或通过扩增所述生物标志物RP11-754B17.1的基因转录物来测定生物标志物RP11-754B17.1的表达水平。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，扩增反应包括实时定量聚合酶链式反应，优选的，实时定量聚合酶链式反应的引物序列如SEQ ID NO.1～2所示。
6.一种诊断骨关节炎的产品，其特征在于，所述产品包括检测生物标志物RP11-754B17.1的试剂。
7.RP11-754B17.1作为分子靶标在制备治疗骨关节炎的药物组合物中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述药物组合物包括生物标志物RP11-754B17.1的抑制剂，优选的，所述抑制剂降低RP11-754B17.1的表达，优选的，所述抑制剂为siRNA，优选的，所述siRNA的序列如SEQ ID NO.5～6所示。
9.一种治疗骨关节炎的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括生物标志物RP11-754B17.1的抑制剂，优选的，所述抑制剂为siRNA，优选的，所述siRNA的序列如SEQ IDNO.5～6所示，优选的，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体。
10.RP11-754B17.1在筛选治疗骨关节炎的候选药物中的应用，其特征在于，包括以下步骤：
1)使测试物质与表达RP11-754B17.1基因的细胞接触；并
2)选择与在该测试物质不存在时检测到的表达水平相比降低RP11-754B17.1基因的表达水平的测试物质。
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