JP2011217617A - miRNAを利用した慢性肝疾患の線維化の検査方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】患者の生物学的サンプルにおいて、線維化マーカーである配列番号1〜67の塩基配列、又は該塩基配列のそれぞれに1もしくは2個の変異を含む塩基配列、を有するmiRNAから選択される1又は複数のmiRNAの発現量を測定することを含む、慢性肝疾患の線維化又は線維化ステージの検査方法、ならびに該検査に使用するためのマイクロアレイ又はキット。
【選択図】なし
Description
本発明はまた、該検査のためのマイクロアレイ又はPCR用プライマーセットに関する。
(1) 患者の生物学的サンプルにおいて、線維化マーカーである配列番号1〜67の塩基配列、又は該塩基配列のそれぞれに1もしくは2個の変異を含む塩基配列、を有するmiRNAから選択される1又は複数のmiRNAの発現量(「発現レベル」とも称する)を測定することを含む、慢性肝疾患の線維化又は線維化ステージの検査方法。
(15) 検査の精度が少なくとも80%である、前記(14)に記載の方法。
(a) 配列番号1〜67に示される塩基配列を含むRNA
(b) 前記(a)の核酸の塩基配列において1もしくは2個の変異を有する塩基配列を含むRNA
(c) 前記(a)及び前記(b)のRNAの塩基配列においてu(ウラシル)がt(チミジン)である塩基配列からなるDNA
(d) 前記(a)及び前記(b)のRNAの塩基配列に相補的な塩基配列からなるRNA
(e) 前記(c)のDNAの塩基配列に相補的な塩基配列からなるDNA
(f) 前記(a)〜(e)のRNA及びDNAの誘導体
(a) 配列番号1〜67に示される塩基配列を含むRNA
(b) 前記(a)の核酸の塩基配列において1もしくは2個の変異を有する塩基配列を含むRNA
(c) 前記(a)及び前記(b)のRNAの塩基配列においてuがtである塩基配列からなるDNA
(d) 前記(a)及び前記(b)のRNAの塩基配列に相補的な塩基配列からなるRNA
(e) 前記(c)のDNAの塩基配列に相補的な塩基配列からなるDNA
(f) 前記(a)〜(e)のRNA及びDNAの誘導体
1. 定義
本明細書で使用する用語は以下の意味を包含する。また、その他の用語は、当業界で一般的に使用される意味を包含するものとする。
2.1 線維化マーカー
105人の慢性C型肝炎患者(表5)から得た肝組織検体について、F0〜F3でのmiRNAの相対的発現量を、市販のヒトmiRNAマイクロアレイ(Agilent Technologies)を用いて測定し、ステージ間の変化倍率を算出し(表2)、線維化の程度別にmiRNAの発現パターンを作成し、それに基づいて、分別可能な線維化ステージとmiRNAの種類を決定した。これらのmiRNAは、線維化が進むにつれて発現が増加するものと、逆に発現が減少するものとが存在したが、いずれの場合であっても、ステージ間で示差的発現が見られる限り、そのようなmiRNAは本発明の方法で使用可能である。
miRNAの選択に際しては、上に定義した線維化ステージF0、F1、F2及びF3に関して、F0とF1との分別(F0/F1)、F01-1とF2との分別(F0-1/F2)、F0-2とF3との分別(F0-2/F3)、F2とF3との分別(F2/F3)、F1とF2-3との分別(F1/F2-3)、及び/又は、F0とF1-3との分別(F0/F1-3)を可能にするmiRNAが選択される。好ましくは、F0/F1、F0-1/F2、F0-2/F3、F2/F3、F1/F2-3及びF0/F1-3の個々の線維化ステージの分別を可能にする、各分別あたり少なくとも1種類のmiRNAが使用される。上の表1には、分別可能なステージが、表示の遺伝子ごとに示されており、これに基づいて個々の線維化ステージの分別を可能にするmiRNAが選択される。
線維化ステージF0/F1の検査のためのmiRNAが、配列番号15、22、25、26、28、29、40、46、47、57及び62の塩基配列を有するmiRNAから選択される。このうち、配列番号15、22、28、40、46、47、57又は62の塩基配列を有するmiRNAは、F0とF1との分別を80%を超える精度で行うことができる。
患者から得た生物学的サンプルでの線維化マーカーの測定は、例えばハイブリダイゼーション又はポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を利用して行うことができる。この測定のために核酸プローブ又はPCRプライマーが使用されうる。
(a) 配列番号1〜67に示される塩基配列を含むRNA
(b) 前記(a)の核酸の塩基配列において1もしくは2個の変異を有する塩基配列を含むRNA
(c) 前記(a)及び前記(b)のRNAの塩基配列においてuがtである塩基配列からなるDNA
(d) 前記(a)及び前記(b)のRNAの塩基配列に相補的な塩基配列からなるRNA
(e) 前記(c)のDNAの塩基配列に相補的な塩基配列からなるDNA
(f) 前記(a)〜(e)のRNA及びDNAの誘導体
ノーザンハイブリダイゼーションの例は、ノーザンブロッティングである。ノーザンブロッティングは、RNAの分析に使用され、公知の一般的方法で行うことが可能である。例えば、サンプルRNAのPAGE電気泳動後にポリマーメンブレンに転写し、これにラベルした核酸プローブを結合させる。
慢性肝臓障害モデルマウスの作製
成熟(8週齢)雌C57BL/6Jマウスに、最初の4週間では2週間に1回、次の4週間では週に1回、オリーブオイルに溶解させた10%CCL4溶液又は陰性対照としてオリーブオイルを腹腔内投与(マウスあたり0.2ml)した。4、6及び8週目に、マウスを屠殺した。肝臓の一部を固定し、パラフィン包埋し、組織分析用に処理された。肝臓の連続切片をヘマトキシリン−エオシンとAzanで染色した(図1A及び1B参照)。肝臓障害の解析に関する動物手法のすべてを、京都大学、動物研究委員会の指針に従って行い、これらの手法は京都大学医学部倫理委員会によって承認された。
四塩化炭素を投与したマウスは、致死性ではなく温和な性質をもち、図1Bから明らかなように、8週で、慢性肝障害が起きて、中心静脈と門脈に架橋する線維の進展が見られた。
慢性肝臓障害モデルマウスにおけるmiRNA発現パターンの解析
実施例1で作製した慢性肝臓障害モデルマウスの肝臓組織から、全RNAを、mirVana miRNA抽出キット(Ambion)を用いて製造者の説明書に準じて調製した。Transcriptor High Fiderity cDNA synthesis Kit (Roche)によってcDNAを合成した。ヌクレアーゼを含まない水10.4μlを、50μMランダムヘキサマー1μlに添加した。変性反応を、65℃で10分間行った。変性したRNA混合物を5×逆転写酵素バッファー4μl、10mM dNTP 2μl、40U/μl RNase阻害剤0.5μl、及び逆転写酵素(FastStart Universal SYBR Green Master (Roche)1.1μlを含む総量20μl中に添加した。反応を50℃で30分間(cDNA合成)、及び85℃で5分間(酵素の変性)行った。mRNA発現の検出のために、Chromo 4検出器(Bio-rad)を使用した。アッセイを3回行い、標的核酸の発現レベルを、β-アクチン遺伝子の発現に対して正規化し、このとき内部対照を用い、かつリアルタイム定量PCRを用いて定量した。
図1Cに、4〜8週の間、一貫して対照群に比べ高レベルで発現する19種類のmiRNAを示した。
慢性C型肝炎患者におけるmiRNA発現パターンの解析
105名の慢性C型肝炎患者(遺伝子型1b)からの105種類の肝組織を、細い針を使用する生検によって得た(表5参照)。METAVIR線維症ステージは、7名の患者でF0、57名の患者でF1、24名の患者でF2、17名の患者でF3であった。自己免疫肝炎又はアルコール性肝障害をもつ患者は除外された。また、B型肝炎ウイルス関連抗原/抗体又は抗ヒト免疫不全ウイルス抗体に対して陽性の患者も除外した。インターフェロン療法も免疫調節療法を受けた患者を解析対象から除外した。本発明者らはまた、京都大学の移植外科から正常な肝臓組織を入手した。本発明者は解析対象患者または患者の親権者から本解析に参加する許諾のインフォームドコンセントを得た。京都大学大学院医学研究医の倫理委員会は、ヘルシンキ宣言に準拠した本研究のすべての態様を承認した。
図3A-Dから明らかなように、非学習網羅的クラスターリングは、肝線維症の程度(METAVIR線維症ステージのF0、F1、F2及びF3)に準じて著しく異なる分離を示した。2つの恣意的グループの平均発現値の倍率変化が1.5よりも大きいmiRNA(p<0.05)を抽出したところ、興味深いことに、数種類のmiRNAの発現が、異なるステージの線維症と比べて劇的に変化した(図2A-D)。
肝線維症に関連するmiRNAの同定
実施例2及び実施例3のmiRNAマイクロアレイ解析の結果に基づき、肝線維症に関連するmiRNAとして、ヒトとマウスにおいて同じ発現パターンを示し、かつヒトとマウスで共通の配列を有する3種類のmiRNA(miR-199a*、miR-200a及びmiR-200b)を抽出した。
その結果、表1に示す67種類のmiRNAを同定した。
miRNAの過剰発現による肝線維化の進行
実施例4で同定した3種類のmiRNAの過剰発現が肝線維化に与える影響をさらに調べるため、ヒト肝星細胞系LX-2細胞を用いて解析を行った。LX-2細胞はScott L. Friedman(Xu, 2005#1)から恵与された。LX-2細胞を10%ウシ胎児血清を含有するDMEM培地(Invitrogen)に保持し、60mm直径の培養ディッシュに入れ、70%コンフルエントになるまで培養した。次に、0.2%BSAを含むDMEM無血清培地で48時間培養したのち、TGF-β1(Sigma-Aldrich)で処理した(2.5ng/mlで20時間)。対照細胞をDMEM無血清培地で培養した。
図4Aから明らかなように、TGF-β1で処理したLX-2細胞では、TGF-β1で処理しないLX-2細胞と比較して、4種類の線維症関連遺伝子の発現レベルが有意に高かった(p<0.05)。
miRNA発現パターンを用いたヒト肝線維化ステージの分別解析
実施例4に記載した手法で同定された67種類のmiRNAについて、上記105種類のF0〜F3のいずれかに該当する検体について相対的発現量を調べ、各ステージ間の変動率を算出した。その結果を表2、表3、表4及び図5に示した。
図5及び表3から明らかなように、miRNAの発現パターンを指標とすると、80%以上の正答率(精度)でヒト肝線維化ステージの分別が可能である。また、表4から明らかなように、実施例4で同定されたヒトとマウスで共通して肝線維症に関連する3種類のmiRNAを含む5種類のmiRNAを用いても、60%以上の正答率でヒト肝線維化ステージの分別が可能である。
肝線維症の決定的な機序は不明であるが、これらのmiRNAは肝線維化進展に関連している可能性がある。なぜなら、それらは、データベース解析によりマイクロRNAの標的遺伝子が線維化進展に関連している可能性があることによる(表7)。miR−199a*の発現レベルは、線維芽細胞のみで発現が変化している(Kim, S. et al., J. Biol. Chem. 283:18158-18166 (2008))。興味深いことに、肝線維化に関係しているmiR-199a*及びmiR-200aの発現レベルは、正常肝組織に比べ肝細胞癌にて有意に発現が低下していた(Murakami, Y. et al., Oncogene 25:2537-2545 (2006))。miR-199a*は、HCV複製の制御因子の1つである(Murakami, Y. et al., J. Hepatol. 50:453-460 (2009))。Peg-IFN及びribavirin併用療法の投与前の肝臓組織でのmiR-199a*、miR-200a及びmiR-200bの発現レベルは、この併用療法に対する反応なし(NR)と関連していた。これらのことから、上記のmiRNAは協調して肝臓疾患の進行と密接に関連している可能性が示された。
本明細書で使用した表2〜表7は以下のとおりである。
Claims (18)
- 患者の生物学的サンプルにおいて、線維化マーカーである配列番号1〜67の塩基配列、又は該塩基配列のそれぞれに1もしくは2個の変異を含む塩基配列、を有するmiRNAから選択される1又は複数のmiRNAの発現量を測定することを含む、慢性肝疾患の線維化又は線維化ステージの検査方法。
- 測定する線維化マーカーが、配列番号1〜67の塩基配列を有するmiRNAから選択される少なくとも5種類のmiRNAである、請求項1に記載の方法。
- 測定する線維化マーカーが、配列番号1〜67の塩基配列を有する67種類のmiRNAである、請求項1に記載の方法。
- 測定する線維化マーカーが、配列番号25、26、28、29及び67の塩基配列を有する5種類のmiRNAである、請求項1に記載の方法。
- 検査可能な線維化ステージが、F0/F1、F0-1/F2、F0-2/F3、F2/F3、F1/F2-3及びF0/F1-3からなる群から選択される、請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
- 線維化ステージF0/F1の検査のためのmiRNAが、配列番号15、22、25、26、28、29、40、46、47、57及び62の塩基配列を有するmiRNAから選択される、請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法。
- 線維化ステージF0-1/F2の検査のためのmiRNAが、配列番号6、9、10、12、13、16、23、24、25、26、28、29、43、59、64及び67の塩基配列を有するmiRNAから選択される、請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法。
- 線維化ステージF0-2/F3の検査のためのmiRNAが、配列番号25、26、28、29及び67の塩基配列を有するmiRNAから選択される、請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法。
- 線維化ステージF2/F3の検査のためのmiRNAが、配列番号18、24、25、26、28、29、33、35、49、53及び67の塩基配列を有するmiRNAから選択される、請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法。
- 線維化ステージF1/F2-3の検査のためのmiRNAが、配列番号1〜14、16、17、20、21、23〜31、34、36、38、39、41〜45、47、48、50〜52、54〜61及び63〜67の塩基配列を有するmiRNAから選択される、請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法。
- 線維化ステージF0/F1-3の検査のためのmiRNAが、配列番号15、19、22、25、26、28、29、32、37、39、40、46、47及び62の塩基配列を有するmiRNAから選択される、請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法。
- 生物学的サンプルが肝臓由来の組織である、請求項1〜11のいずれか1項に記載の方法。
- 線維化マーカーの測定を、マイクロアレイ、PCR又はノーザンハイブリダイゼーションによって行う、請求項1〜12のいずれか1項に記載の方法。
- 検査の精度が少なくとも70%である、請求項1〜13のいずれか1項に記載の方法。
- 検査の精度が少なくとも80%である、請求項14に記載の方法。
- 下記の(a)〜(f)に示されるRNA、DNA及びその誘導体からなる群から選択される1又は複数の核酸プローブを含む、慢性肝疾患の線維化又は線維化ステージの検査のためのマイクロアレイ。
(a) 配列番号1〜67に示される塩基配列を含むRNA
(b) 前記(a)の核酸の塩基配列において1もしくは2個の変異を有する塩基配列を含むRNA
(c) 前記(a)及び前記(b)のRNAの塩基配列においてuがtである塩基配列からなるDNA
(d) 前記(a)及び前記(b)のRNAの塩基配列に相補的な塩基配列からなるRNA
(e) 前記(c)のDNAの塩基配列に相補的な塩基配列からなるDNA
(f) 前記(a)〜(e)のRNA及びDNAの誘導体 - 下記の(a)〜(f)に示されるRNA、DNA及びその誘導体からなる群から選択される1又は複数の核酸をプローブ又はPCRプライマーとして含む、慢性肝疾患の線維化又は線維化ステージの検査のためのキット。
(a) 配列番号1〜67に示される塩基配列を含むRNA
(b) 前記(a)の核酸の塩基配列において1もしくは2個の変異を有する塩基配列を含むRNA
(c) 前記(a)及び前記(b)のRNAの塩基配列においてuがtである塩基配列からなるDNA
(d) 前記(a)及び前記(b)のRNAの塩基配列に相補的な塩基配列からなるRNA
(e) 前記(c)のDNAの塩基配列に相補的な塩基配列からなるDNA
(f) 前記(a)〜(e)のRNA及びDNAの誘導体 - 前記検査を、請求項16に記載のマイクロアレイ又は請求項17に記載のキットを用いて行う、請求項1〜15のいずれか1項に記載の方法。
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