KR20160063082A - 노화 바이오마커 및 그의 용도 - Google Patents

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김용섭
강현태
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Abstract

노화를 진단하기 위한 바이오마커, 이를 검출하기 위한 노화 수준 진단용 조성물 및 키트, 이를 이용한 세포 또는 개체의 노화 수준 진단 방법, 및 노화 억제제를 스크리닝하는 방법을 제공한다. 이에 따르면, 노화의 수준을 높은 정확도로 정량적으로 측정할 수 있다. 또한, 노화 수준을 결정하고 노화 억제제를 스크리닝하는데 이용할 수 있다.

Description

노화 바이오마커 및 그의 용도{Biomarker for senescence and use thereof}
노화를 진단하기 위한 바이오마커 및 그의 용도에 관한 것이다.
노화(senesence 또는 aging)는 나이가 들면서 일어나는 쇠퇴적인 현상을 말한다. 사람의 경우 노화에 따라 생리활성이 저하되기도 하지만 일부 효소 활성이나 호르몬 분비 기능은 증가되기도 한다. 세포의 노화는 세포 분열(cellular division)의 영구적 정지(permanent halt)로서 정의될 수 있다. 복제 노화(replicative senescence) 또는 세포 노화(cellular senescence)는 세포 수준에서 에이징(aging)을 위한 모델로서 관찰되었다. 세포가 연속으로 배양되는 경우, 많은 회수의 분열을 하지만, 노화에 따라 세포는 더 이상 분열할 수 없다. 노화된 세포는 실제로 프로그램된 세포사(programmed cell death)에 저항성이고 일부 노화된 세포는 수년 동안 비증식 상태(nondividing state)로 유지되었다.
노화의 바이오마커로서 리포푸신(lipofuscin), 과산화지질 등이 알려져 있으나 여전히 정확도가 높은 바이오마커를 개발할 필요가 있다. 노화의 수준을 측정하는 방법으로서 노화된 세포에서 β-갈락코시다아제의 활성을 측정하는 방법이 알려져 있지만, 노화의 수준에 따라 구체적인 수치로 정량되지 않는 문제가 있다.
따라서, 노화의 바이오마커 및 이를 이용한 노화의 수준을 정량적으로 측정하는 방법이 요구되고 있다.
일 양상은 노화 수준 진단용 조성물을 제공한다.
다른 양상은 노화 수준 진단용 키트를 제공한다.
다른 양상은 세포 또는 개체의 노화 수준 진단 방법을 제공한다.
다른 양상은 노화 억제제를 스크리닝하는 방법을 제공한다.
일 양상은 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열의 핵산, 또는 그의 단편과 동일하거나 또는 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는 노화 수준 진단용 조성물을 제공한다.
상기 노화는 시간의 경과에 따라 나타나는 변화 현상을 의미한다. 세포의 노화(senescence of a cell)는 표준 세포(reference cell)에 비하여 세포의 증식능의 감소, 리포푸신 축적, β-갈락토시다아제 활성 증가, 미토콘드리아 활성 산소 종 증가, 미토콘드리아 막 전위 감소, 및 세포의 G0 및/또는 G1기의 기간의 감소 중 하나 이상을 포함하거나, 그를 야기하는 과정을 나타낸다. 젊은 세포(young cell)는 표준 세포(reference cell)에 비하여 세포의 증식능의 증가, 리포푸신 축적 감소, β-갈락토시다아제 활성 감소, 미토콘드리아 활성 산소 종 감소, 미토콘드리아 막 전위 증가, 및 세포의 G0 및/또는 G1기의 기간의 증가 중 하나 이상을 포함하는 것을 나타낸다. 예를 들어, 노화된 세포는 계대수 2의 분열 시간(doubling time)에 비해 분열 시간이 2 배 이상, 3배 이상, 4배 이상, 5배 이상, 6배 이상, 7배 이상, 9배 이상, 10배 이상, 50배 이상, 또는 100배 이상 증가한 경우 증가한 세포는 노화된 세포라고 할 수 있다. 인간의 경우 약 30세 이상, 약 40세 이상, 약 50세 이상, 약 60세 이상, 약 70세 이상, 약 80세 이상, 약 90세 이상, 약 100세 이상의 인간으로부터 수득된 세포는 노화된 세포라고 할 수 있다.
상기 노화 수준 진단은 노화 관련 질병의 진단 또는 노화 수준에 관한 정보의 제공일 수 있다. 노화 관련 질병에 관한 정보일 수 있다. 상기 노화 관련 질병은 예를 들어, 조로증, 인지 질환(알츠하이머병, 파킨슨씨병, 치매, 또는 이들의 조합을 포함함), 뇌졸중, 당뇨, 관절염, 동맥경화, 심장병, 탈모, 주름, 및 골다공증일 수 있다. 상기 노화 수준에 관한 정보는 생물학적 연령에 관한 정보일 수 있다. 용어 "생물학적 연령(biological age)"은 생체 나이라고도 하고, 성장, 성숙, 또는 노화를 기술할 때의 시간적 척도를 의미한다. 연령은 연, 월, 일과 같은 달력의 척도, 즉 생활 연령(chronological age)으로 나타낼 수 있지만, 성장, 성숙, 또는 노화 현상은 모든 개체가 동일하게 진행되지 않기 때문에 생활 연령 이외의 생물학적 연령의 개념이 제기되었다.
상기 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열의 핵산은 비암호화 리보핵산(noncoding rebonucleic acid; ncRNA)일 수 있다. 비암호화 RNA는 단백질로 번역되지 않는 기능적 RNA 분자이다. 상기 비암호화 RNA는 작은 인 RNA(small nucleolar RNA; snoRNA), 마이크로RNA, 작은 간섭 RNA(small interfering RNA; 작은 인 RNA), 작은 핵 RNA(small nuclear RNA; snRNA), 세포외 RNA(extracellular RNA; exRNA), piRNA(Piwi-interacting RNA), 또는 긴 비암호화 RNA(long ncRNA; lncRNA)일 수 있다. 상기 lncRNA는 단백질로 번역되지 않거나 낮은 단백질-암호화 가능성(low protein-coding potential)을 갖는 전사물(transcript)로서 길이가 약 50 뉴클레오티드 이상, 약 100 뉴클레오티드 이상, 약 200 뉴클레오티드 이상, 또는 약 500 뉴클레오티드 이상인 RNA일 수 있다. 상기 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열의 핵산은 인간의 16번 염색체의 p 암(arm)에 위치하는 핵산으로부터 전사된 핵산일 수 있다. 상기 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열의 핵산은 인간의 16번 염색체의 ERI2(ERI1 Exoribonuclease Family Member 2) 유전자와 DCUN1D3(DCN1, Defective In Cullin Neddylation 1, Domain Containing 3) 유전자의 사이에 존재하는 핵산으로부터 전사된 핵산일 수 있다. 상기 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열의 핵산은 GenBank Accession No. AK027199의 서열일 수 있다.
상기 단편은 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열의 핵산 중 2 뉴클레오티드 이상 연속된 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드를 말한다. 상기 단편의 길이는 예를 들면 2 뉴클레오티드(이하, 'nt'라고 함) 내지 2000 nt, 3 nt 내지 1500 nt, 4 nt 내지 1000 nt, 5 nt 내지 500 nt, 6 nt 내지 200 nt, 7 nt 내지 100 nt, 8 nt 내지 50 nt, 9 nt 내지 40 nt, 또는 10 nt 내지 30 nt일 수 있다.
상기 폴리뉴클레오티드는 프라이머 또는 프로브일 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드의 길이는 예를 들면 2 nt 내지 100 nt, 3 nt 내지 90 nt, 4 nt 내지 80 nt, 5 nt 내지 70 nt, 6 nt 내지 60 nt, 7 nt 내지 50 nt, 8 nt 내지 40 nt, 9 nt 내지 30 nt, 또는 10 nt 내지 30 nt일 수 있다. 상기 프라이머는 DNA 합성을 위한 개시점으로 작용하는 핵산 가닥을 말한다. 상기 프라이머는 정방향 프라이머 또는 역방향 프라이머일 수 있다. 상기 프로브는 특정 뉴클레오티드 서열에 혼성화될 수 있는 DNA 및/또는 RNA를 포함하는 올리고머를 말한다. 상기 프로브는 검출가능한 표지가 접합된 것일 수 있다. 검출가능한 표지는 예를 들어 형광 표지일 수 있다.
상기 조성물은 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열의 핵산, 또는 그의 단편을 검출하기 위해 필요한 물질을 더 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 조성물은 중합 효소, 완충액, dNTP, 검출용 시약, 또는 이들의 조합을 더 포함할 수 있다.
다른 양상은 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열의 핵산, 또는 그의 단편과 동일하거나 또는 상보적인 폴리뉴클레오티드, 및 검출 시약을 포함하는 노화 수준 진단용 키트를 제공한다.
상기 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열의 핵산, 단편, 폴리뉴클레오티드, 노화, 및 노화 수준 진단은 전술한 바와 같다.
검출 시약은 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열의 핵산, 또는 그의 단편을 검출하기 위해 필요한 물질일 수 있다. 검출 시약은 예를 들면, 효소 또는 완충액일 수 있다.
다른 양상은 생물학적 시료로부터 핵산을 분리하는 단계; 및 분리된 핵산에 함유된 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열의 핵산, 또는 그의 단편과 동일하거나 또는 상보적인 폴리뉴클레오티드의 양을 측정하는 단계를 포함하는, 세포 또는 개체의 노화 수준 진단 방법을 제공한다.
상기 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열의 핵산, 단편, 폴리뉴클레오티드, 노화, 및 노화 수준 진단은 전술한 바와 같다.
상기 방법은 생물학적 시료로부터 핵산을 분리하는 단계를 포함한다.
상기 생물학적 시료는 노화 관련 질병에 걸리거나 노화 관련 질병에 걸릴 위험이 있는 개체로부터 분리된 시료, 또는 배양된 세포일 수 있다. 상기 생물학적 시료는 혈액, 혈장, 혈청, 조직, 소변, 점액, 타액, 눈물, 객담, 척수액, 흉수, 유두 흡인물, 림프액, 기도액, 장액, 비뇨생식관액, 모유, 림프계 체액, 정액, 뇌척수액, 기관계내 체액, 복수, 낭성 종양 체액, 양수액, 조직, 또는 이들의 조합일 수 있다.
상기 개체는 포유동물일 수 있다. 상기 포유동물은 예를 들어 인간, 개, 고양이, 염소, 돼지, 마우스, 래빗, 햄스터, 랫트, 또는 기니아 피그일 수 있다.
상기 세포는 개체로부터 분리된 세포 또는 배양된 세포일 수 있다. 상기 세포는 예를 들어, 신경 세포, 면역 세포, 상피 세포, 생식 세포, 근육세포, 또는 암세포일 수 있다. 상기 세포는 세포주이거나 1차 배양된 세포일 수 있다.
상기 핵산은 리보핵산(ribo nucleic acid; RNA)일 수 있다. 상기 RNA는 게놈으로부터 전사된 전사물(transcript)일 수 있다.
상기 생물학적 시료로부터 핵산을 분리하는 방법은 당업자에게 알려진 것일 수 있다.
상기 방법은 분리된 핵산에 함유된 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열의 핵산, 또는 그의 단편과 동일하거나 또는 상보적인 폴리뉴클레오티드의 양을 측정하는 단계를 포함한다.
상기 폴리뉴클레오티드의 양을 측정하는 방법은 당업자에게 알려진 방법으로 수행될 수 있다. 예를 들어, 상기 방법은 역전사-중합효소 연쇄 반응(reverse transcription-polymerase chain reaction; RT-PCR), 마이크로어레이, SAGE(serial analysis of gene expression), 노던 블로팅, 또는 이들의 조합으로 수행될 수 있다.
상기 방법은 대조군에 비해 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열의 핵산, 또는 그의 단편과 동일하거나 또는 상보적인 폴리뉴클레오티드의 양이 약 1.5배 내지 약 10배, 약 1.5배 내지 약 8배, 약 1.5배 내지 약 6배, 또는 약 1.5배 내지 약 4배 증가된 경우 상기 생물학적 시료는 노화 수준이 증가된 시료인 것으로 결정하는 단계를 더 포함할 수 있다. 상기 방법은 대조군에 비해 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열의 핵산, 또는 그의 단편과 동일하거나 또는 상보적인 폴리뉴클레오티드의 양이 약 0.1배 내지 약 0.9배, 약 0.2배 내지 약 0.8배, 약 0.3배 내지 약 0.7배, 또는 약 0.4배 내지 약 0.6배 감소된 경우 상기 생물학적 시료는 노화 수준이 감소된 시료인 것으로 결정하는 단계를 더 포함할 수 있다. 상기 대조군은 노화 관련 질병에 걸리지 않거나 노화 관련 질병에 걸릴 위험이 없는 개체 또는 세포로부터 분리된 시료일 수 있다.
다른 양상은 세포와 피검 화합물을 인큐베이션하는 단계; 상기 세포로부터 핵산을 분리하는 단계; 분리된 핵산에 함유된 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열의 핵산, 또는 그의 단편과 동일하거나 또는 상보적인 폴리뉴클레오티드의 양을 측정하는 단계; 및 대조군에 비해 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열의 핵산, 또는 그의 단편과 동일하거나 또는 상보적인 폴리뉴클레오티드의 양이 감소한 경우 상기 피검 화합물을 노화 억제제로 결정하는 단계를 포함하는 노화 억제제를 스크리닝하는 방법을 제공한다.
상기 세포, 핵산의 분리, 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열의 핵산, 단편, 폴리뉴클레오티드, 폴리뉴클레오티드의 양을 측정, 및 노화는 전술한 바와 같다.
상기 노화 억제제는 노화의 수준을 감소시키는 물질일 수 있다.
상기 방법은 세포와 피검 화합물을 인큐베이션하는 단계를 포함한다.
상기 피검 화합물은 화학 물질, 단백질, 핵산, 지질, 또는 이들의 조합일 수 있다.
상기 인큐베이션은 인 비트로에서 수행될 수 있다.
상기 방법은 세포로부터 핵산을 분리하는 단계를 포함한다.
세포로부터 핵산을 분리하는 방법은 당업자에게 알려진 방법으로 수행될 수 있다.
상기 방법은 분리된 핵산에 함유된 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열의 핵산, 또는 그의 단편과 동일하거나 또는 상보적인 폴리뉴클레오티드의 양을 측정하는 단계를 포함한다.
상기 방법은 대조군에 비해 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열의 핵산, 또는 그의 단편과 동일하거나 또는 상보적인 폴리뉴클레오티드의 양이 감소한 경우 상기 피검 화합물을 노화 억제제로 결정하는 단계를 포함한다.
상기 대조군은 음성 대조군일 수 있다. 음성 대조군은 피검 화합물과 인큐베이션하지 않은 세포일 수 있다.
상기 노화 억제제는 예를 들어 조로증, 인지질환, 뇌졸중, 당뇨, 관절염, 동맥경화, 심장병, 탈모, 주름, 또는 골다공증의 치료제 또는 증상 완화제일 수 있다.
상기 대조군에 비해 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열의 핵산, 또는 그의 단편과 동일하거나 또는 상보적인 폴리뉴클레오티드의 양이 증가한 경우 상기 피검 화합물을 노화 촉진제로 결정할 수 있다. 상기 노화 촉진제는 항암제일 수 있다.
일 양상에 따른 노화를 진단하기 위한 바이오마커, 이를 검출하기 위한 노화 수준 진단용 조성물 및 키트, 이를 이용한 세포 또는 개체의 노화 수준 진단 방법, 및 노화 억제제를 스크리닝하는 방법에 따르면, 노화의 수준을 높은 정확도로 정량적으로 측정할 수 있다. 또한, 노화 수준을 결정하고 노화 억제제를 스크리닝하는데 이용할 수 있다.
도 1은 젊은 세포와 노화된 세포의 RNA를 마이크로어레이 분석하여 얻어진 이미지이다.
도 2a 및 도 2b는 각각 RT-qPCR 결과와 마이크로어레이 결과가 같은 패턴을 보이는 Linc_WARC1의 RT-qPCR 결과와 마이크로어레이 결과의 그래프이다(점선: 프라이머 세트 1, 점선: 프라이머 세트 2).
도 3a 내지 도 3f는 각각 HDF(M11), HDF(M4), 근아세포, HMEC, 근아세포(osteoblast), 및 IMR-90의 젊은 세포 및 노화된 세포에서 Linc_WARC1의 RT-qPCR 결과를 나타내는 그래프이다(Young: 젊은 세포, Old: 노화된 세포).
도 4a 내지 도 4d는 각각 HDF(M11), HDF(M4), 근아세포, 및 HMEC의 젊은 세포, 중간 세포, 및 노화된 세포에서 Linc_WARC1의 RT-qPCR 결과를 나타내는 그래프이다(Young: 젊은 세포, Middle: 중간 세포, Old: 노화된 세포).
도 5는 인간 염색체 16번 p 암(arm) 12.3 중 Linc_WARC1 위치를 나타내는 모식도이다.
도 6은 HGPS(Hutchinson-Gilford Progeria Syndrome) 환자 피부 섬유아세포의 젊은 세포 및 노화된 세포에서 Linc_WARC1의 RT-qPCR 결과를 나타내는 그래프이다(Young: 젊은 세포, Old: 노화된 세포).
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 노화 관련 바이오마커 Long non - coding RNA ( Lnc RNA )의 확인
(1) 노화 관련 Lnc RNA 의 스크리닝
노화 관련 바이오마커를 스크리닝하기 위해 11세 남아에서 수득된 HDF(human dermal fibroblast) M11 세포를 37℃ 및 5% CO2의 조건 하에서 고농도 글루코스, 글루타민, 및 피루베이트를 함유한 DMEM(이하, 'DMEM'이라고 함), 10%(v/v) FBS, 및 1x 페니실린/스트렙토마이신을 함유하는 배지에 배양하여 젊은 세포와 노화한 세포를 수득하였다. 젊은 세포로서 계대수 14이고 분열 시간이 약 1일인 HDF M11 세포를 이용하고, 노화한 세포로서 계대수 38이고 분열 기간이 약 14일 이상인 세포를 이용하였다.
한편, 노화된 세포를 젊은 세포로부터 유래한 세포외 기질(extracelluar matrix; ECM) 위에 배양하는 방법으로 노화된 세포를 젊은 세포로 회복시켰다. 젊은 세포의 세포외 기질은 Aging Cell(2011), vol.10:pp.148-157에 기재된 방법으로 수득하였다. 젊은 세포로부터 유래한 ECM 위에 노화된 세포를 접종하고, 2일, 8일, 16일, 또는 24일 동안 37℃ 및 5% CO2의 조건 하에서 배양하였다. 노화된 세포에 젊은 세포의 ECM을 첨가하고 2일, 8일, 16일, 또는 24일 동안 배양한 세포를 각각 R2d, R8d, R16d, 및 R24d로 표시하였다.
수득된 세포로부터 RNA를 수득하기 위해, TRIzol®(Life technologies)을 첨가하여 세포를 용해시키고, 클로로포름을 첨가하고 균질화시켰다. 원심분리하여 상층액의 RNA를 분리하였다. 분리된 상층액에 동량의 이소프로판올을 첨가하고, 원심분리하여 침전된 RNA를 수득하였다.
수득된 1 ㎍의 RNA를 아미노-알릴 cDNA 표지 키트(Ambion)를 이용하여 형광 표지된 cDNA를 제조하였다. 젊은 세포로부터 수득된 RNA를 Cy3로 표지하고, 노화된 세포로부터 수득된 RNA를 Cy5로 표지하였다. 표지된 RNA를 인간 게놈 8x60k 어레이(Agilent Technologies)에 가하고, 약 55℃에서 약 16 시간 인큐베이션하여 RNA를 혼성화시켰다. 인간 게놈 8x60k 어레이는 7,419개의 lincRNA(large intergenic non-coding RNA)와 2,644개의 ncRNA(non-coding RNA)가 집적된 마이크로어레이이다. 이미지 분석을 위해 ImaGene 4.2(Biodiscovery)와 MAAS(Gaiagene)을 이용하였고, SAM을 이용하여 발현 양상에 있어서 통계적으로 유의한 변화를 보이는 유전자를 1차 선별하였다. 그리고, Cluster 프로그램을 이용하여 발현 패턴 별로 A 내지 F로 분류하였다. 마이크로어레이 분석에 의해 얻어진 이미지(Heatmap)를 도 1에 나타내었다.
마이크로어레이 분석 결과, 젊은 세포와 노화한 세포 간에 1.5 배 이상의 발현 차이가 있고 p<0.01인 35 종의 LincRNA 및 37 종의 noncoding RNA를 1차 선별하였다. 1차 선별된 RNA 중, 노화된 세포로부터 젊은 세포로 회복된 R24d 세포에서 발현이 감소된 15 종의 LincRNA 및 10 종의 noncoding RNA를 2차 선별하였다. 2차 선별된 RNA의 유형은 A형 8 종, B형 6종, C형 3종, D형 4종, E형 3종, 및 F형 1종이었다. A형 및 B형은 노화된 세포의 전사물의 양이 젊은 세포의 전사물의 양 보다 작아서 하향 조절된(down-regulated) 전사물이고, C형 내지 F형은 노화된 세포의 전사물의 양이 젊은 세포의 전사물의 양 보다 커서 상향 조절된(up-regulated) 전사물이었다.
(2) RT - qPCR 을 통한 검증
실시예 1(1)에서 선별된 전사물을 검증하기 위해 역전사-정량적 중합효소 연쇄 반응(reverse transcription-quantitative polymerase chain reaction; RT-qPCR)을 수행하였다.
실시예 1(1)에서 수득된 1 ㎍의 RNA에 25 ㎕의 역전사 반응 완충액(50 mM Tris-HCl(pH 8.3), 75 mM KCl, 3 mM MgCl2, 0.1 M DTT, 10 mM dNTP, 40 유닛/㎕ RNase 저해제), 0.5 ㎍/㎕의 올리고-dT16의 프라이머, 및 200 유닛의 SuperScript® II 역전사 중합효소(GiboBRL)를 첨가하고, 혼합물을 42℃에서 1 시간 동안 인큐베이션시켰다. 2.5 ㎕의 반응물을 50 ㎕의 PCR 반응 완충액(0.04 유닛의 AmpliTaq® DNA 중합효소(Life Technologies), 50 mM Tris-HCl(pH 8.3), 0.25 ㎎/㎖ 우태아혈청 알부민, 3 mM MgCl2, 0.25 mM dNTPs, SYBR® Green I의 1/50,000 희석액(Life Technologies)에 첨가하고, 실시예 1(1)에서 선별된 전사물에 대한 각각 10 μM의 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머를 첨가하여 반응물을 만들었다. 반응물을 94℃에서 30 초, 53℃에서 30 초, 72℃에서 1 분을 1 사이클로 하여 30 사이클을 수행하였다. 상대적인 mRNA 레벨은 아이사이클러(ICycler) 소프트웨어를 이용하여 SYBR 그린 I 형광 변화를 측정하였다.
정량된 전사물의 양을 GAPDH의 양을 기준으로 표준화하고, 노화된 세포의 전사물에 대한 변화 배수(fold-change/old)를 산출하였다. 산출된 RT-qPCR과 실시예 1(1)에서 수득된 마이크로어레이 결과가 유사한 패턴을 보이는 전사물을 선별하고, Linc_WARC1(서열번호 1)로 명명하였다. Linc_WARC1의 길이는 2,118 뉴클레오티드였다. Linc_WARC1의 증폭을 위한 프라이머 세트는 하기에 기재된 바와 같다.
프라이머 세트 1:
정방향 프라이머: 5'-TTAAGCACAGACGGAGCTGG-3' (서열번호 2) 및
역방향 프라이머: 5'-TGGGCATCATGTCCTCCCTA-3' (서열번호 3)
프라이머 세트 2:
정방향 프라이머: 5'-CACAAAGGTGGAGGGTCACA-3' (서열번호 4) 및
역방향 프라이머: 5'-TGGGGTTTTTCATCCCCCTG-3' (서열번호 5)
상기 RT-qPCR 결과 및 실시예 1(1)의 마이크로어레이 결과를 각각 도 2a 및 도 2b에 나타내었다(Y: 젊은 세포, O: 노화된 세포, R2d, R8d, R16d, 및 R24d; 각각 노화된 세포에 젊은 세포의 ECM을 첨가하고 2일, 8일, 16일, 또는 24일 동안 배양한 세포, 점선: 프라이머 세트 1, 점선: 프라이머 세트 2). 도 2a 및 도 2b에서 점선 및 실선은 각각 2개의 프로브에 의한 결과를 나타내지만, 그 프로브들은 동일한 전사물을 표적으로 한다.
(3) 여러 세포에서 Linc _ WARC1 의 발현 확인
선별된 Linc_WARC1가 노화된 세포에서 범용적인 마커인지 확인하기 위해, 여러 종류의 세포에서 젊은 세포와 노화된 세포들 간에 Linc_WARC1의 발현량에 차이가 있는지 여부를 확인하였다.
11세 남아로부터 수득된 HDF 세포('HDF(M11)'), 4세 남아로부터 수득된 HDF 세포('HDF(M4)'), 근아세포(myoblast; Lonza, Cat. No. cc-2580), HMEC(human mammary epithelial cell), 골아세포(osteoblast; ScienCell™, Cat. No. 4610), 및 IMR-90(인간 폐 섬유아세포; ATCC®, CCL-186™)을 준비하였다. 실시예 1(1)에 기재된 바와 같이, 37℃ 및 5% CO2의 조건 하에서, HDF 및 IMR-90 세포는 10%(v/v) FBS를 포함한 DMEM(Hyclone™)에서 배양하고, 근아세포는 SkGM™-2(Lonza)에서 배양하고, HMEC은 MEGM™(Lonza)에서 배양하고, 골아세포는 ObM(ScienCell™)에서 배양하여 젊은 세포와 노화된 세포를 준비하였다.
준비된 세포의 계대수 및 분열 시간(doubling time)을 하기 표 1에 나타내었다.
세포 젊은 세포 노화된 세포
계대수 분열 시간 계대수 분열 시간
HDF(M11) 14 1일 38 >14일
HDF(M4) 8 1일 30 14일
근아세포 2 2일 10 7일
HMEC 4 2일 13 14일
골아세포 1 2일 10 1개월
IMR-90 3 2일 15 약 14일
각 배양된 세포로부터 실시예 1(1)에 기재된 방법으로 RNA를 수득하고, 실시예 1(2)에 기재된 방법으로 RT-qPCR을 수행하였다. 정량된 전사물의 양을 GAPDH의 양을 기준으로 표준화하고, 노화된 세포의 전사물에 대한 변화 배수(fold-change/old)를 산출하고, 그 결과를 도 3a 내지 도 3f에 나타내었다(Young: 젊은 세포, Old: 노화된 세포).
도 3a 내지 도 3f에 나타난 바와 같이, HDF(M11), HDF(M4), 근아세포, 골아세포, 및 IMR-90의 세포에서 젊은 세포에 비해 노화된 세포에서 Linc_WARC1의 발현량이 증가하였다. 따라서, Linc_WARC1는 범용적인 노화 마커임을 확인하였다.
(4) Linc _ WARC1 의 시간 경과에 따른 분석
Linc_WARC1의 발현량이 노화되는 시간의 경과에 따라 달라지는지 확인하였다.
실시예 1(3)에서 준비된 HDF(M11), HDF(M4), 근아세포, 및 HMEC의 세포를 배양하여 젊은 세포, 중간 세포, 및 노화된 세포로 나누었다. 젊은 세포, 중간 세포, 및 노화된 세포의 계대수 및 분열 시간을 하기 표 2에 나타내었다.
세포 젊은 세포 중간 세포 노화된 세포
계대수 분열 시간 계대수 분열 시간 계대수 분열 시간
HDF(M11) 14 1일 28 약 7일 38 >14일
HDF(M4) 8 1일 21 약 6일 30 14일
근아세포 2 2일 6 6일 10 7일
HMEC 4 2일 7 5일 13 14일
각 배양된 세포로부터 실시예 1(1)에 기재된 방법으로 RNA를 수득하고, 실시예 1(2)에 기재된 방법으로 RT-qPCR을 수행하였다. 정량된 전사물의 양을 GAPDH의 양을 기준으로 표준화하고, 노화된 세포의 전사물에 대한 변화 배수(fold-change/old)를 산출하고, 그 결과를 도 4a 내지 도 4d에 나타내었다(Young: 젊은 세포, Middle: 중간 세포, Old: 노화된 세포).
도 4a 내지 도 4d에 나타난 바와 같이, HDF(M11), HDF(M4), 근아세포, 및 HMEC의 세포에서 배양 시간이 증가함에 따라 Linc_WARC1의 발현량이 증가하였다. 따라서, Linc_WARC1는 범용적인 노화 마커라는 것을 검증하였다.
(5) Linc _ WARC1 의 확인
Linc_WARC1가 인간 게놈에서 어느 위치에 해당하는지 확인하기 위해, UCSC Genome Bioinformatics 웹사이트(genome.ucsc.edu/) 또는 NCBI 웹사이트(www.ncbi.nlm.nih.gov)에서 해당 유전자의 마이크로어레이 프로브 서열을 입력하여 염색체 중 Linc_WARC1의 위치를 확인하였다.
Linc_WARC1는 GenBank Accession No. AK027199의 핵산이고, 인간 염색체 16번 p 암(arm) 12.3에 위치하고(Chr16: 20773748-20775847), ERI2 유전자와 DCUN1D3 유전자 사이에 위치하는 유전자간(intergenic) Linc(long non-coding) RNA이다. Linc_WARC1 위치를 도 5에 표시하였다.
(6) 조로증 세포에서 Linc _ WARC1 의 확인
조로증을 갖는 세포에서도 Linc_WARC1가 발현량이 증가하는지 확인하였다.
HGPS(Hutchinson-Gilford Progeria Syndrome) 환자 피부 섬유아세포(ATCC®, AG03198B)의 조로증 세포를 실시예 1(1)에 기재된 바와 같이 37℃ 및 5% CO2의 조건 하에서 10 내지 15%(v/v) FBS를 함유하는 DMEM 배지에 배양하여 젊은 세포와 노화한 세포를 준비하였다. 젊은 세포로서 계대수 11이고 분열 기간이 약 5일인 세포를 이용하고, 노화된 세포로서 계대수 17이고 분열 기간이 약 14일인 세포를 이용하였다.
배양된 세포로부터 실시예 1(1)에 기재된 방법으로 RNA를 수득하고, 실시예 1(2)에 기재된 방법으로 RT-qPCR을 수행하였다. 정량된 전사물의 양을 GAPDH의 양을 기준으로 표준화하고, 노화된 세포의 전사물에 대한 변화 배수(fold-change/old)를 산출하고, 그 결과를 도 6에 나타내었다(Young: 젊은 세포, Old: 노화된 세포).
도 6에 나타난 바와 같이, 조로증을 갖는 세포에서 배양 시간이 증가함에 따라Linc_WARC1의 발현량이 증가하였다. 따라서, Linc_WARC1는 조로증의 진단용 마커로 이용할 수 있음을 확인하였다.
<110> Samsung Electronics Co., Ltd. <120> Biomarker for senescence and use thereof <130> PN107374 <160> 5 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 2118 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human Linc_WARC1 <400> 1 cttaatgagt gagcagtaag tctgtgtaag aggctgaatg catgcccctc agataagcca 60 gtacactcct tgcttagcaa cagaacatca gggtgatgtg gagaggggca ggatgtggac 120 gccacattgg aaatcggcaa catctgaggg caacaacaaa caagtgtgtt gggaaataag 180 aaataactca gttttgacaa ctggctttgt cagcttttgt gatgtttctt tagcagttta 240 ttggaaagat ggtatgagat gacgtgctgc ttcattgaat tgctctttcc cccatctttg 300 ccaaatctca atgtatcgtt cttaacccca cctcctgtaa ggggctttgc tatgcttcag 360 ctggttgtct cagcagctga agtgctgccc acctgtgtga gttgggtcca ggaaaccatg 420 tctgcccttc tgataaggga agatgaatct agagctgggt gaagatctaa attttaacca 480 aacccctggg cccaggaaaa taacaattga aaatgtacaa ggcagtgttt tcaatattaa 540 acttccccaa ggaaagcaca aactagtctt tttggaaagg gagaaaggat taagccacac 600 agtattagtc tttgaagcag tactggtctc taggggctgg tgccaaaatg gagtcccata 660 gtagttacac tcgatggcct catgtactat atactgtgcc gaattgtatt aaacagtggt 720 ggggagttac tgggataaga acttgtctaa aagtttacaa accaaaacag atctgttagg 780 ttggtgcaaa agtaagtttt tgccatactt aatgtattgc cattaagtat ggcaaaaacc 840 acaattactt ttacaccaac ctatgtattt aagaatgttt ggtttgccag attccaaatg 900 aggtcttcag tgcagcaaag cccaaaaggt gtagactcag ttatgcaatt ataaggttaa 960 ggcgtagaag aaagctgctg ctaggttttt gttgcatttt acttgactgc tctgctgttt 1020 ttcttgtctc tcatgtttgg ttagctatga cttgagcatc ttggtaactg acaaaggtct 1080 tccttggggg acttgaacat cttggtaaat gacaggtctt cttggaggac tccagcagta 1140 tcttgtttaa acgactgaaa ggactattaa ggttgttgaa ttgtgttaat tggaactcat 1200 tgaggaaatg cgacattgat cctcctctta ttccacagtg tgttttctga tcatataaag 1260 aaggttccga accatccatc cccctcagag tttattcccc tggtaagctg taattgcata 1320 tccagtttaa actggactgg gactgcatgt tggtgaggat cggcaggggt tttccccctt 1380 ttcgaaagat gaaatagatt cttgagcact ggttgcagaa gccaaaatag ttcaaatagc 1440 tttgcataac cattgggttc tgcttctgat tcaggtgctg ggcatcatgt cctccctatt 1500 cttctcttct tggaaaccca gcctatctca taaataccta cttccggcca cccatccaac 1560 ctccctgctc ctttcaacac aaatcttgga tattgccaaa ggaagccatt cagcagctgc 1620 tggggttttt catccccctg acatgcatac atttgctctg ggagaagtgt cttccctctg 1680 accctggtcc ccagctccgt ctgtgcttaa ttgctcttac ctgttgcact aatgaatatg 1740 actaggtttt aaagggggaa tgtgaagcaa taggcacatg gggcttggat gaattggtcc 1800 cacagatata ccctgcctta agccgctgag gtgatgagtc cactgctcat gtgaccctcc 1860 acctttgtgg atccctcttg gtttgtgacc agtgtgtctg tttgttgagg ttgtacaaac 1920 ttgacaaaag ttaatacttt tgtttgtatt ttctgcactg ttgcactctc caaatggccc 1980 cttgagtatt tttattgact tgttacacac atttttgtct ttgatgtcta cattttttcc 2040 tttaatgttt tttatttgga aggttacctg ctgttggatt taataaattt gtttacttga 2100 aaaaaaaaaa aaaaaaaa 2118 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for human Linc_WARC1 <400> 2 ttaagcacag acggagctgg 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Backward primer for human Linc_WARC1 <400> 3 tgggcatcat gtcctcccta 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for human Linc_WARC1 <400> 4 cacaaaggtg gagggtcaca 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Backward primer for human Linc_WARC1 <400> 5 tggggttttt catccccctg 20

Claims (17)

  1. 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열의 핵산, 또는 그의 단편과 동일하거나 또는 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는 노화 수준 진단용 조성물.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 노화 수준 진단은 노화 관련 질병의 진단 또는 노화 수준에 관한 정보의 제공인 것인 조성물.
  3. 청구항 2에 있어서, 상기 노화 수준에 관한 정보는 생물학적 연령(biological age)인 것인 조성물.
  4. 청구항 1에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 프라이머 또는 프로브인 것인 조성물.
  5. 청구항 1에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드의 길이는 2 뉴클레오티드 내지 100 뉴클레오티드인 것인 조성물.
  6. 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열의 핵산, 또는 그의 단편과 동일하거나 또는 상보적인 폴리뉴클레오티드, 및 검출 시약을 포함하는 노화 수준 진단용 키트.
  7. 생물학적 시료로부터 핵산을 분리하는 단계; 및
    분리된 핵산에 함유된 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열의 핵산, 또는 그의 단편과 동일하거나 또는 상보적인 폴리뉴클레오티드의 양을 측정하는 단계를 포함하는, 세포 또는 개체의 노화 수준 진단 방법.
  8. 청구항 7에 있어서, 상기 노화 수준 진단은 노화 관련 질병을 진단하거나 또는 노화 수준에 관한 정보를 제공하는 것인 방법.
  9. 청구항 8에 있어서, 상기 노화 관련 질병은 조로증, 인지 질환, 뇌졸중, 당뇨, 관절염, 동맥경화, 심장병, 탈모, 주름, 및 골다공증으로 이루어진 군으로부터 선택된 질병인 것인 방법.
  10. 청구항 9에 있어서, 상기 인지 질환은 알츠하이머병, 파킨슨씨병, 치매, 또는 이들의 조합인 것인 방법.
  11. 청구항 8에 있어서, 상기 노화 수준에 관한 정보는 생물학적 연령인 것인 방법.
  12. 청구항 7에 있어서, 상기 생물학적 시료는 노화 관련 질병에 걸리거나 노화 관련 질병에 걸릴 위험이 있는 개체로부터 분리된 시료, 또는 배양된 세포인 것인 방법.
  13. 청구항 7에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드의 양을 측정하는 단계는 역전사-중합효소 연쇄 반응(reverse transcription-polymerase chain reaction; RT-PCR), 마이크로어레이, SAGE(serial analysis of gene expression), 노던 블로팅, 또는 이들의 조합으로 수행되는 것인 방법.
  14. 청구항 7에 있어서, 상기 방법은 대조군에 비해 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열의 핵산, 또는 그의 단편과 동일하거나 또는 상보적인 폴리뉴클레오티드의 양이 1.5배 내지 10배 증가된 경우 상기 생물학적 시료는 노화 수준이 증가된 시료인 것으로 결정하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
  15. 청구항 7에 있어서, 상기 방법은 대조군에 비해 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열의 핵산, 또는 그의 단편과 동일하거나 또는 상보적인 폴리뉴클레오티드의 양이 0.1배 내지 0.9배 감소된 경우 상기 생물학적 시료는 노화 수준이 감소된 시료인 것으로 결정하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
  16. 청구항 14 또는 15에 있어서, 상기 대조군은 노화 관련 질병에 걸리지 않거나 노화 관련 질병에 걸릴 위험이 없는 개체 또는 세포로부터 분리된 시료인 것인 방법.
  17. 세포와 피검 화합물을 인큐베이션하는 단계;
    상기 세포로부터 핵산을 분리하는 단계;
    분리된 핵산에 함유된 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열의 핵산, 또는 그의 단편과 동일하거나 또는 상보적인 폴리뉴클레오티드의 양을 측정하는 단계; 및
    대조군에 비해 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열의 핵산, 또는 그의 단편과 동일하거나 또는 상보적인 폴리뉴클레오티드의 양이 감소한 경우 상기 피검 화합물을 노화 억제제로 결정하는 단계를 포함하는 노화 억제제를 스크리닝하는 방법.
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