CN114622008B

CN114622008B - Mst4基因作为强直性脊柱炎诊断标志物中的应用

Info

Publication number: CN114622008B
Application number: CN202210100646.1A
Authority: CN
Inventors: 冷小敏; 倪文娟; 谢富华; 王润秀; 杨亚东; 杨影
Original assignee: Gannan Medical University
Current assignee: Gannan Medical University
Priority date: 2022-01-27
Filing date: 2022-01-27
Publication date: 2023-05-30
Anticipated expiration: 2042-01-27
Also published as: CN114622008A

Abstract

本发明公开了MST4基因作为强直性脊柱炎诊断标志物中的应用。发明人通过试验验证，首次发现了MST4基因作为强直性脊柱炎诊断标志物中在强直性脊柱炎早期诊断或预后诊断方面的应用。而且相比于目前已发现的作为强直性脊柱炎潜在诊断标志物的miR‑495和PDCD10具有更好诊断优势，有效检测可达70％，敏感度可达95％，避免了假阳性的发生，从而可以作为强直性脊柱炎血清早期预测指标，用于疾病的早期筛查和诊断，填补了强直性脊柱炎血液早期诊断的空白。

Description

MST4基因作为强直性脊柱炎诊断标志物中的应用

技术领域

本发明属于分子标志物领域，具体涉及MST4基因作为强直性脊柱炎诊断标志物中的应用。

背景技术

强直性脊柱炎(AS)是指以骶髂关节和脊柱附着点炎症为主要症状的疾病。该疾病是一类以脊柱为主要病变部位的慢性病，其累及骶髂关节，并会引起脊柱强直和纤维化，造成不同程度眼、肺、肌肉、骨骼病变，属于一种自身免疫性疾病。相关技术中，对于引发强直性脊柱炎(AS)的病因尚不明确，具有发病年龄早，难诊治等特点，对人体健康具有极大的威胁性。因此，开发一种能够有效监测强直性脊柱炎的发病情况，实现强直性脊柱炎的早期诊断对于病患的治疗和甄别具有极为重要的意义。

MST4基因是GCK III类激酶家族的成员，是Ste20-like激酶的亚类。其编码的蛋白质包含一个氨基末端激酶结构域和一个介导同源二聚化的羧基末端调节结构域。当人体内的蛋白激酶定位于高尔基体，并与高尔基基质蛋白GM130结合后会特异性激活MST4基因。而且其在在体外也可被caspase-3切割，并可能在凋亡途径中发挥作用。

相关技术中，仅发现脑海绵状畸形3(Cerebral Cavernous Malformations 3:CCM3)和海绵状畸形(Cavernous Malformations:CM)与MST4基因存在关联性。相关技术中发现MST4基因的主要功能为蛋白质同源二聚化活性和转移酶活性，其中转移酶活性主要是转移含磷基团。而研究人员猜测，MST4基因导致CCM3和CM的主要机制可能是CDK介导的磷酸化和抑制CDC6和LKB1信号通路。但对于MST4基因与强直性脊柱炎(AS)的关联性并未有任何公开。

发明内容

本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出MST4基因作为强直性脊柱炎诊断标志物中的应用。发明人通过试验验证，MST4基因对于强直性脊柱炎的特异性可达70％以上，敏感度可达95％，发现其相比于目前已发现的作为强直性脊柱炎潜在诊断标志物的miR-495和PDCD10具有更好诊断优势。

本发明的第一个方面，提供MST4基因在制备检测或辅助检测强直性脊柱炎的产品中的应用。

根据本发明的第一个方面，在本发明的一些实施方式中，所述MST4基因来自NCBI数据库，编号为Gene ID:51765(其mRNA分子的编号：NM_016542.4)。

在本发明实施例中，发明人通过大量的数据以及试验验证了MST4基因作为强直性脊柱炎早期预测及诊断标志物的有效性和准确性，AUC值为0.8013，最佳界限对应特异性为0.70％，灵敏度为0.95％，95％的置信期间为：[0.7047,0.8978]，P值小于0.0001。

根据本发明的第一个方面，在本发明的一些实施方式中，所述产品包括检测试纸或试纸条、检测试剂和检测试剂盒。

当然，本领域技术人员可以根据实际使用需求，将其制备为其他强直性脊柱炎早期预测及诊断产品，包括但不限于检测试纸或试纸条、检测芯片或试剂盒。

在本发明的一些优选实施方式中，所述检测试剂用于执行以下任一种方法：放射免疫法、间接免疫荧光法、斑点免疫金渗滤法、生物质谱法、免疫印记法和酶联免疫吸附法，聚合酶链反应、变性梯度凝胶电泳、核酸分型芯片检测、变性高效液相色谱法、原位杂交以及HRM法。

在本发明的一些更优选实施方式中，所述聚合酶链反应包括但不限于限制性片段长度多态性法、单链构象多态性法、Taqman探针法、qPCR、竞争性等位基因特异性PCR和等位基因特异性PCR。

在本发明实施例中，MST4水平的检测可以是与对照组(例如健康人)比较而得出结论。升高或者降低通常是显著性的，确定受试者和健康群体的初始状态相比，是否具有显著性的差异可用本领域公知的统计学方法进行，并使用置信区间和/或p值进行确认。在一些实施方案中，置信区间可以为90％、95％、97.5％、98％、99％、99.5％、99.9％或99.99％并且p值可以为0.1、0.05、0.025、0.02、0.01、0.005、0.001或0.0001。

本发明的第二个方面，提供MST4基因在制备检测或辅助检测强直性脊柱炎预后产品中的应用。

根据本发明的第二个方面，在本发明的一些实施方式中，所述MST4基因来自NCBI数据库，编号为Gene ID:51765(其mRNA分子的编号：NM_016542.4)。

根据本发明的第二个方面，在本发明的一些实施方式中，所述产品包括检测试纸或试纸条、检测试剂和检测试剂盒。

本发明的第三个方面，提供MST4基因在制备预测或辅助预测强直性脊柱炎钙化发展情况的产品中的应用。

根据本发明的第三个方面，在本发明的一些实施方式中，所述MST4基因来自NCBI数据库，编号为Gene ID:51765(其mRNA分子的编号：NM_016542.4)。

根据本发明的第三个方面，在本发明的一些实施方式中，所述产品包括检测试纸或试纸条、检测试剂和检测试剂盒。

本发明的第四个方面，提供定量检测MST4基因的物质在制备检测或辅助检测强直性脊柱炎的产品中的应用。

根据本发明的第四个方面，在本发明的一些实施方式中，所述MST4基因来自NCBI数据库，编号为Gene ID:51765(其mRNA分子的编号：NM_016542.4)。

根据本发明的第四个方面，在本发明的一些实施方式中，所述产品包括检测试纸或试纸条、检测试剂和检测试剂盒。

在本发明的一些优选实施方式中，所述物质在基因水平上定量检测MST4。

在本发明的一些优选实施方式中，所述物质为在基因水平上定量检测MST4的试剂和/或仪器。

在本发明的一些优选实施方式中，所述检测试剂包括引物试剂。

在本发明的一些更优选实施方式中，所述引物的核苷序列为：

上游引物MST-F:5’-TGAGGAAGCCGAAGATGAAATAGAA-3’；

下游引物MST-R:5’-TCATCAAATGGACCAGCTCGAA-3’。

本发明的第五个方面，提供定量检测MST4基因的物质在制备检测或辅助检测强直性脊柱炎预后产品中的应用。

根据本发明的第五个方面，在本发明的一些实施方式中，所述MST4基因来自NCBI数据库，编号为Gene ID:51765(其mRNA分子的编号：NM_016542.4)。

根据本发明的第五个方面，在本发明的一些实施方式中，所述产品包括检测试纸或试纸条、检测试剂和检测试剂盒。

上游引物MST-F:5’-TGAGGAAGCCGAAGATGAAATAGAA-3’；

下游引物MST-R:5’-TCATCAAATGGACCAGCTCGAA-3’。

本发明的第六个方面，提供定量检测MST4基因的物质在制备预测或辅助预测强直性脊柱炎钙化发展情况的产品中的应用。

根据本发明的第六个方面，在本发明的一些实施方式中，所述MST4基因来自NCBI数据库，编号为Gene ID:51765(其mRNA分子的编号：NM_016542.4)。

根据本发明的第六个方面，在本发明的一些实施方式中，所述产品包括检测试纸或试纸条、检测试剂和检测试剂盒。

上游引物MST-F:5’-TGAGGAAGCCGAAGATGAAATAGAA-3’；

下游引物MST-R:5’-TCATCAAATGGACCAGCTCGAA-3’。

本发明的第七个方面，提供一种靶向抑制MST4表达试剂。

根据本发明的第七个方面，在本发明的一些实施方式中，所述靶向抑制MST4表达试剂包括siRNA。

在本发明的一些优选实施方式中，所述siRNA的核苷酸序列为5’-GCCUGAUCCAAAGAAAGUA-3’。

在本发明的一些优选实施方式中，所述siRNA靶向的mRNA分子的核苷酸序列如SEQID NO:5所示。

本发明的有益效果是：

本发明中首次发现了MST4基因作为强直性脊柱炎诊断标志物中在强直性脊柱炎早期诊断或预后诊断方面的应用。且发明人通过试验验证，在同等条件下，相比于其相比于目前已发现的作为强直性脊柱炎潜在诊断标志物的miR-495和PDCD10具有更好诊断优势，有效检测可达70％，敏感度可达95％，避免了假阳性的发生，从而可以作为强直性脊柱炎血清早期预测指标，用于疾病的早期筛查和诊断，填补了强直性脊柱炎血液早期诊断的空白。

附图说明

图1为MST4、MST1、STK4、MST4-2、MST2/3、STK25和PDCD10在正常人和AS患者中的表达情况对比，其中HC表示健康人。

图2为MST4在正常人和AS患者中的表达情况，其中HC表示健康人。

图3为本发明实施例中的MST4基因过表达重组质粒(GV492)的质粒图谱。

图4为本发明实施例中的MST4基因敲低表达重组质粒(GV493)的质粒图谱。

图5为MST4的上调表达对HFLS细胞的钙化影响。

图6为抑制MST4表达对HFLS细胞的钙化影响。

图7为MST4的ROC曲线图。

具体实施方式

为了使本发明的发明目的、技术方案及其技术效果更加清晰，以下结合具体实施方式，对本发明进行进一步详细说明。应当理解的是，本说明书中描述的具体实施方式仅仅是为了解释本发明，并非为了限定本发明。

所使用的实验材料和试剂，若无特别说明，均为常规可从商业途径所获得的耗材和试剂。

在下述实施例中，所使用的MST4基因序列来自NCBI数据库，编号为Gene ID:51765(其mRNA分子的编号：NM_016542.4)。

在下述实施例中，作为对比使用的MST1、STK4、MST4-2、MST2/3、STK25和PDCD10的基因序列来源如表1所示。

表1基因来源披露表

基因	数据库	编号
			MST1	NCBI	NM_006282.5
STK4	NCBI	NM_016542.4
			MST4-2	NCBI	NM_001042452.2
MST2/3	NCBI	NM_006281
			STK25	NCBI	NM_001271977.2
PDCD10	NCBI	NM_007217.4

实施例1 MST4基因与强直性脊柱炎(AS)的相关性

在本实施例中，以现有技术中公认与强直性脊柱炎(AS)具有相关性的PDCD10为对比对象，分别检测MST4、MST1、STK4、MST4-2、MST2/3、STK25的表达与PDCD10的表达的相关性。

其中，检测方法为：

利用NCBI GEO数据库(数据信息编号GDS5231)分析MST4、MST1、STK4、MST4-2、MST2/3、STK25、PDCD10的表达。最后将PDCD10的表达与MST4、MST1、STK4、MST4-2、MST2/3、STK25的表达进行Pearson分析。

结果如表2所示。

表2基因相关性对比结果

可以发现，在检测MST4、MST1、STK4、MST4-2、MST2/3、STK25的表达与PDCD10的表达的相关性之后，MST4基因显示出了最高的正相关性，说明MST4基因也具有作为强直性脊柱炎(AS)的诊断标志物的潜力。

实施例2 MST4基因在HFLS细胞中的表达情况

为了进一步验证MST4基因与强直性脊柱炎(AS)之间的相关性，发明人以临床样本作为检测对象，检测MST4、MST1、STK4、MST4-2、MST2/3、STK25和阳性对照PDCD10的表达情况。

在本实施例中，临床样本为外周淋巴细胞，其中，40例为健康人样本，40例为已确诊的强直性脊柱炎患者样本。

具体检测步骤为：

(1)外周淋巴细胞的分离：使用Ficoll(TBDscience,Code No:LTS1077)分离获取外周血中的单核淋巴细胞，操作方法参考使用说明书。

(2)进行RNA的提取和qPCR检测：

使用RNAiso Plus(Takara,Code No:9108)提取上述单核淋巴细胞的总RNA用于后续RNA的定量检测。操作方法参考使用说明书。

将提取到的单核淋巴细胞总RNA利用PrimeScript^TM RT reagent Kit with gDNAEraser(Takara,Code No:RR047A)反转录为cDNA模板。操作方法参考使用说明书。

基于PrimeScript^TM RT reagent Kit with gDNA Eraser(TAKARA,RR047A)的反转录反应体系如表3和4所示。

表3

组分	使用量
		5×gDNA Eraser Buffer	2μL
gDNA Eraser	1μL
		总RNA	500ng
RNase-free H₂O	补至10μL

反应程序为：42℃下反应2min后，扩增产物4℃保存备用。

表4

组分	使用量
		表3体系中得到产物	10μL
PrimeScript RT Enzyme Mix I	1.0μL
		RT Primer	1.0μL
5×PrimeScript Buffer 2(for ReaL Time)	4.0μL
		RNase-free H₂O	4.0μL

其中，RT Primer为PrimeScript^TM RT reagent Kit with gDNA Eraser中的RTprimer mix(包含Oligo dT和Random 6mers)。

反应程序为：37℃，30min；85℃，5sec。扩增产物(cDNA)4℃保存。

基于上述步骤得到的cDNA为模板进行qPCR扩增。qPCR扩增使用SYBR(Takara,CodeNo:RR420A)，操作方法参考使用说明书。

扩增体系如表5所示。

表5

qPCR扩增反应程序为：95℃，30s；95℃，5s，60℃，30s，40个循环。测定溶解曲线。

其中，Forward Primer为MST-F:5’-TGAGGAAGCCGAAGATGAAATAGAA-3’(SEQ ID NO:1)；

Reverse Primer为MST-R:5’-TCATCAAATGGACCAGCTCGAA-3’(SEQ ID NO:2)。

结果如图1～2所示。

可以发现，除MST1外，MST4、STK4、MST4-2、MST2/3、STK25和阳性对照PDCD10基因均在健康人样本(HC)和强直性脊柱炎汉患者样本(AS)中存在显著差异性，说明MST4、STK4、MST4-2、MST2/3、STK25均有作为AS诊断标志物的可能性。但是，根据检测结果可以发现，仅MST4与PDCD10在实际检测中出现相似的显著上调情况，而STK4、MST4-2、MST2/3、STK25则均表现为显著下调，因此，暂不考虑STK4、MST4-2、MST2/3、STK25作为AS诊断标志物的可能性。

为了能够进一步验证MST4在AS中的潜在功能是否与PDCD10类似，发明人选择本领域中常规作为AS研究细胞模型的HFLS细胞作为试验对象，检测MST4在AS患者HFLS细胞中的功能性。

具体检测步骤为：

(1)HFLS细胞的获得：以AS患者来源的滑膜，通过原代细胞的培养，获得HFLS细胞。

(2)基因功能性验证试验：

a.MST4基因过表达：

构建MST4基因过表达重组质粒(GV492)，其中，MST4基因过表达重组质粒GV492交由上海吉凯基因科技有限公司按照图3所示质粒图谱进行合成。MCS处插入MST4基因全长CDS序列(NCBI数据库序列编号NM_016542.4)。

将构建好的MST4基因过表达重组质粒GV492采用慢病毒包装的方法，使用293T细胞系进行包装，然后通过浓缩和纯化得到实验用的病毒。进行慢病毒转染的前一天，在96孔板每孔内接入5000细胞。然后第二天按照10MOI的滴度进行细胞的转染(转染至步骤(1)中获得的HFLS细胞中)。转染8小时候后进行换液，并加入G418(Geneticin,遗传霉素)进行筛选，使用浓度为4ng/mL。48小时后进行荧光检测和细胞换液。

b.MST4基因敲低表达：

构建MST4基因敲低表达重组质粒(GV493)，其中，MST4基因敲低表达重组质粒GV493交由生物公司按照图4所示质粒图谱进行合成。MCS处插入shRNA序列，其序列为5’-GCCTGATCCAAAGAAAGTATTCAAGAGATACTTTCTTTGGATCAGGCTTTTTT-3’(SEQ ID NO:3)。

该shRNA序列参考siRNA的序列设计得到，该siRNA的核苷酸序列为5’-GCCUGAUCCAAAGAAAGUA-3’(SEQ ID NO:4)。该siRNA靶向的mRNA的核苷酸序列为：

5’-ATCACTCGAGCCCAGGTCCCAGCCACCACCACTCACAGCGCTCGGCGTTCAGGAAGAGGAGCAGCAGCGGAGGCGGCTGCTTCAGCGGCGGGCGGGCGCCAGAAAGGCCCCGATCGAAAAGCCTGGGAGGGCCGCCGAACTACCCCCGGAGGGAGGAGCCAGTCCGAACCCAAGGCGCCACCGCCGCAGAAGCGGAGCGAGGCAGCATTCGCCTCCATGGCCCACTCGCCGGTGGCTGTCCAAGTGCCTGGGATGCAGAATAACATAGCTGATCCAGAAGAACTGTTCACAAAATTAGAGCGCATTGGGAAAGGCTCATTTGGGGAAGTTTTCAAAGGAATTGATAACCGTACCCAGCAAGTCGTTGCTATTAAAATCATAGACCTTGAGGAAGCCGAAGATGAAATAGAAGACATTCAGCAAGAAATAACTGTCTTGAGTCAATGTGACAGCTCATATGTAACAAAATACTATGGGTCATATTTAAAGGGGTCTAAATTATGGATAATAATGGAATACCTGGGCGGTGGTTCAGCACTGGATCTTCTTCGAGCTGGTCCATTTGATGAGTTCCAGATTGCTACCATGCTAAAGGAAATTTTAAAAGGTCTGGACTATCTGCATTCAGAAAAGAAAATTCACCGAGACATAAAAGCTGCCAATGTCTTGCTCTCAGAACAAGGAGATGTTAAACTTGCTGATTTTGGAGTTGCTGGTCAGCTGACAGATACACAGATTAAAAGAAATACCTTTGTGGGAACTCCATTTTGGATGGCTCCTGAAGTTATTCAACAGTCAGCTTATGACTCAAAAGCTGACATTTGGTCATTGGGAATTACTGCTATTGAACTAGCCAAGGGAGAGCCACCTAACTCCGATATGCATCCAATGAGAGTTCTGTTTCTTATTCCCAAAAACAATCCTCCAACTCTTGTTGGAGACTTTACTAAGTCTTTTAAGGAGTTTATTGATGCTTGCCTGAACAAAGATCCATCATTTCGTCCTACAGCAAAAGAACTTCTGAAACACAAATTCATTGTAAAAAATTCAAAGAAGACTTCTTATCTGACTGAACTGATAGATCGTTTTAAGAGATGGAAGGCAGAAGGACACAGTGATGATGAATCTGATTCCGAGGGCTCTGATTCGGAATCTACCAGCAGGGAAAACAATACTCATCCTGAATGGAGCTTTACCACCGTACGAAAGAAGCCTGATCCAAAGAAAGTACAGAATGGGGCAGAGCAAGATCTTGTGCAAACCCTGAGTTGTTTGTCTATGATAATCACACCTGCATTTGCTGAACTTAAACAGCAGGACGAGAATAACGCTAGCAGGAATCAGGCGATTGAAGAACTCGAGAAAAGTATTGCTGTGGCTGAAGCCGCCTGTCCCGGCATCACAGATAAAATGGTGAAGAAACTAATTGAAAAATTTCAAAAGTGTTCAGCAGACGAATCCCCCTAAGAAACTTATTATTGGCTTCTGTTTCATATGGACCCAGAGAGCCCCACCAAACCTACGTCAAGATTAACAATGCTTAACCCATGAGCTCCATGTGCCTTTTGGATCTTTGCAACACTGAAGATTTGGAAGAAGCTATTAAACTATTTTGTGATGGCGTTTATCATTTTATATTTTGAAAGGATTATTTTGTAAGGAATAACTTTTAATACTATAGTTTCACCTGTATTCTAGTAAATGTTGAGACACCGTTTTGCTTTTAAGTATCCCTATTTCTTAAGTTACGAGGATGAATACCTTTCACATTTTGATCTTTAGTTGACTCTACAGTCATGAAACATACAGGTCTTTCAAAGTCATTCTCAATATTCAGCTTTTGTAAATTATCAAGCTTCAAAAAGCTTTTTTTTTTAAAAAAAAACATGCATATTCTAAAAATGACTATTGGTGGGGAGGTGTAAATAAGTCATACCTTCTTAAAACAGAAAATTTAAGTAAAGTCTTTTAAATGAAACCTGTAAAAGTATTGACTCTTCTACCAAGTTGGTATGATATTCCAGGCAGCTCAATGATTATCACATTTGAGACCCTGTGTTTGAAGCATTTACAGGCAATGTACAGCAACAGAGGTACCTCTTGGTGTATAGTATTTACATTCTCTTTTAGGTAGAAGAGGCAATTTTACCCTTATTTCACATGGTTAGAAATTTAAAGCAAGATCATTTACCCAAGGATAGGTGTTTGGTAATGTTGAAGGAGTTAGTCTGGCTTCATGTTTTACATCTTCAACTAAAATCCCATACTATCTGCTTGGATTTGGAGAGCCAAAAAATAAAGCTGATTGTCATGTGATTAAATATCTGATCAACAGGTATGAATATAACTTAAATCAGCATATTTTTGCCATGGTAATAAATTGTCCTATAAACTATTTATATATTTTTGTTCTTCATAATTATCACTAATAAGCATCAGTTTGTTGTTTTTAAAAGGATATTTAAGTGAGCATTTTCTAGTTCATATGAAAATAACCATAGTACAGGATGATTTCTGTCCACACAAAGGTTAAATTAGATTGCACAGTTAATTTTCACTTATATTTATGGTACTATTATGTGGGTGATGCCTTTTTCTTTTAAGCCCAGTACATATATTATGCCTGCCTAAGTTCTGAACTGGGGCTGTATTTCAGTAGTTGTAGAATTATTGATATTTAGTTTTGATAGCTAATGTTTAATTGTTTGGATCTGCACAGTTTGGTTTTTGCACAAAAGTCATTTAAAAAAATCTGAGTAATTGTCAAATATTAAAAGAAAGATATTCTTCCTGTAAGGAATACAGTTTTTAGTCAAAGTGGCCATTACATCCTCTTTTTAATTTACATAATACAGATACTTGAGAAAGTTGTTGTGGTGTTGTATGCCAAGAAAATTCTTTTTATTGGTGCCTATATTGTAACAATTATTTTTAATGCATTGTATTTTGAAGTAACGGTTCAGTTAAATTTTTCACCTGCTGTGTAACTGAAACACAATTACAGTTTATAATCATCTGTAGAAGTCTGGAGATAATTTTGCAACTCATGTTATGGGTTAAATGAATATTTTTGTAAAAGTAAAAGCAACAAATTTATAAATTGATTATTTGAAACTTTACAACACAATTGCATCCCAAATACAAATTGTATTGCTTATTCATTATAGCTATTCGTCCTGTAATCTGTTTCTAGGTGAAGCATACTCCAGTGTTTTAGGGGTTTTGAAAATAAATATTTAAATTTCACAGTC-3’(SEQID NO:5)。

将构建好的MST4基因敲低表达重组质粒GV493采用慢病毒包装的方式，使用293T细胞进行包装。后续通过纯化和浓缩以及滴度测定后，将病毒用于后续的转染实验(转染至步骤(1)中获得的HFLS细胞中)。转染条件使用96孔板，细胞数量为5000细胞/每孔，病毒滴度为10MOI，筛选试剂为G418，使用浓度为4ng/mL，筛选结果使用荧光显微镜进行评估。

在本实施例中，HFLS细胞为经诱导钙化的HFLS细胞，所用的诱导钙化的试剂的组分如表6所示。

表6

成分	终浓度
		基础培养基(DMEM)	500mL
地塞米松	2mM/L
		维生素C	10mg/mL
甘油磷酸钠	2M/L
		胎牛血清(FBS)	10％
双抗(青/链霉素)	1‰

结果如图5～6所述。

通过以原代培养的AS来源HFLS细胞为对象，可以发现，抑制MST4基因的表达可以抑制细胞的成骨化，而过表达该基因则能促进细胞钙化，从而可以说明MST具有促进AS成骨表型的功能。

经过上述实施例中的验证，其结果说明MST4基因可以作为治疗强直性脊柱炎靶向标志物。

实施例3 MST4基因作为强直性脊柱炎诊断标志物的特异性和灵敏度

为了能够进一步体现MST4基因作为强直性脊柱炎诊断标志物的有效性，发明人对上述实施例中的数据进行进一步整理，构建ROC曲线。

结果如图7所示。

经计算，ROC曲线的AUC值为0.8013，最佳界限对应特异性为0.70％，灵敏度为0.95％，95％的置信期间为：[0.7047,0.8978]，P值小于0.0001。由此可见，MST4基因可以有效预测强直性脊柱炎，对强直性脊柱炎患者的筛选表现出很好的效果。

实施例4 MST4基因与其他潜在性强直性脊柱炎诊断标志物的对比

为了显示出本发明实施例中的MST4基因作为强直性脊柱炎诊断标志物的优势性，发明人分别选取了miR-495(具体序列为：5’-AAACAAACAUGGUGCACUUCUU-3’(SEQ ID NO:6))和PDCD10基因作为对比，分析MST4、miR-495和PDCD10对于强直性脊柱炎的检测特异性和灵敏度。

MST4和PDCD10的检测方法参考上述实施例。

PDCD10和miR-495的检测采用qPCR方式检测(检测程序和体系如上述实施例)，具体涉及的检测引物的核苷酸序列如表7：

表7

结果如表8所示。

表8强直性脊柱炎检测特异性和灵敏度

名称	约登指数	特异性	灵敏度
				miR-495	0.57	0.61	0.96
PDCD10	0.55	0.63	0.95
				MST4	0.62	0.70	0.95

通过对比三者可以发现，MST4的灵敏度虽然相对于miR-495和PDCD10没有产生显著性变化，但特异性却得到了显著的提高。miR-495的特异性仅为0.61，PDCD10也仅为0.63，而MST4的特异性却达到了0.70，相比miR-495和PDCD10能够更加专一性的识别强直性脊柱炎，避免了假阳性的发生。因而可以作为强直性脊柱炎血清早期预测指标，用于疾病的早期筛查和诊断，填补了强直性脊柱炎血液早期诊断的空白。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 赣南医学院

<120> MST4基因作为强直性脊柱炎诊断标志物中的应用

<130>

<160> 11

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

tgaggaagcc gaagatgaaa tagaa 25

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

tcatcaaatg gaccagctcg aa 22

<210> 3

<211> 53

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

gcctgatcca aagaaagtat tcaagagata ctttctttgg atcaggcttt ttt 53

<210> 4

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 4

gccugaucca aagaaagua 19

<210> 5

<211> 3251

<212> DNA

<213> MST4

<400> 5

atcactcgag cccaggtccc agccaccacc actcacagcg ctcggcgttc aggaagagga 60

gcagcagcgg aggcggctgc ttcagcggcg ggcgggcgcc agaaaggccc cgatcgaaaa 120

gcctgggagg gccgccgaac tacccccgga gggaggagcc agtccgaacc caaggcgcca 180

ccgccgcaga agcggagcga ggcagcattc gcctccatgg cccactcgcc ggtggctgtc 240

caagtgcctg ggatgcagaa taacatagct gatccagaag aactgttcac aaaattagag 300

cgcattggga aaggctcatt tggggaagtt ttcaaaggaa ttgataaccg tacccagcaa 360

gtcgttgcta ttaaaatcat agaccttgag gaagccgaag atgaaataga agacattcag 420

caagaaataa ctgtcttgag tcaatgtgac agctcatatg taacaaaata ctatgggtca 480

tatttaaagg ggtctaaatt atggataata atggaatacc tgggcggtgg ttcagcactg 540

gatcttcttc gagctggtcc atttgatgag ttccagattg ctaccatgct aaaggaaatt 600

ttaaaaggtc tggactatct gcattcagaa aagaaaattc accgagacat aaaagctgcc 660

aatgtcttgc tctcagaaca aggagatgtt aaacttgctg attttggagt tgctggtcag 720

ctgacagata cacagattaa aagaaatacc tttgtgggaa ctccattttg gatggctcct 780

gaagttattc aacagtcagc ttatgactca aaagctgaca tttggtcatt gggaattact 840

gctattgaac tagccaaggg agagccacct aactccgata tgcatccaat gagagttctg 900

tttcttattc ccaaaaacaa tcctccaact cttgttggag actttactaa gtcttttaag 960

gagtttattg atgcttgcct gaacaaagat ccatcatttc gtcctacagc aaaagaactt 1020

ctgaaacaca aattcattgt aaaaaattca aagaagactt cttatctgac tgaactgata 1080

gatcgtttta agagatggaa ggcagaagga cacagtgatg atgaatctga ttccgagggc 1140

tctgattcgg aatctaccag cagggaaaac aatactcatc ctgaatggag ctttaccacc 1200

gtacgaaaga agcctgatcc aaagaaagta cagaatgggg cagagcaaga tcttgtgcaa 1260

accctgagtt gtttgtctat gataatcaca cctgcatttg ctgaacttaa acagcaggac 1320

gagaataacg ctagcaggaa tcaggcgatt gaagaactcg agaaaagtat tgctgtggct 1380

gaagccgcct gtcccggcat cacagataaa atggtgaaga aactaattga aaaatttcaa 1440

aagtgttcag cagacgaatc cccctaagaa acttattatt ggcttctgtt tcatatggac 1500

ccagagagcc ccaccaaacc tacgtcaaga ttaacaatgc ttaacccatg agctccatgt 1560

gccttttgga tctttgcaac actgaagatt tggaagaagc tattaaacta ttttgtgatg 1620

gcgtttatca ttttatattt tgaaaggatt attttgtaag gaataacttt taatactata 1680

gtttcacctg tattctagta aatgttgaga caccgttttg cttttaagta tccctatttc 1740

ttaagttacg aggatgaata cctttcacat tttgatcttt agttgactct acagtcatga 1800

aacatacagg tctttcaaag tcattctcaa tattcagctt ttgtaaatta tcaagcttca 1860

aaaagctttt ttttttaaaa aaaaacatgc atattctaaa aatgactatt ggtggggagg 1920

tgtaaataag tcataccttc ttaaaacaga aaatttaagt aaagtctttt aaatgaaacc 1980

tgtaaaagta ttgactcttc taccaagttg gtatgatatt ccaggcagct caatgattat 2040

cacatttgag accctgtgtt tgaagcattt acaggcaatg tacagcaaca gaggtacctc 2100

ttggtgtata gtatttacat tctcttttag gtagaagagg caattttacc cttatttcac 2160

atggttagaa atttaaagca agatcattta cccaaggata ggtgtttggt aatgttgaag 2220

gagttagtct ggcttcatgt tttacatctt caactaaaat cccatactat ctgcttggat 2280

ttggagagcc aaaaaataaa gctgattgtc atgtgattaa atatctgatc aacaggtatg 2340

aatataactt aaatcagcat atttttgcca tggtaataaa ttgtcctata aactatttat 2400

atatttttgt tcttcataat tatcactaat aagcatcagt ttgttgtttt taaaaggata 2460

tttaagtgag cattttctag ttcatatgaa aataaccata gtacaggatg atttctgtcc 2520

acacaaaggt taaattagat tgcacagtta attttcactt atatttatgg tactattatg 2580

tgggtgatgc ctttttcttt taagcccagt acatatatta tgcctgccta agttctgaac 2640

tggggctgta tttcagtagt tgtagaatta ttgatattta gttttgatag ctaatgttta 2700

attgtttgga tctgcacagt ttggtttttg cacaaaagtc atttaaaaaa atctgagtaa 2760

ttgtcaaata ttaaaagaaa gatattcttc ctgtaaggaa tacagttttt agtcaaagtg 2820

gccattacat cctcttttta atttacataa tacagatact tgagaaagtt gttgtggtgt 2880

tgtatgccaa gaaaattctt tttattggtg cctatattgt aacaattatt tttaatgcat 2940

tgtattttga agtaacggtt cagttaaatt tttcacctgc tgtgtaactg aaacacaatt 3000

acagtttata atcatctgta gaagtctgga gataattttg caactcatgt tatgggttaa 3060

atgaatattt ttgtaaaagt aaaagcaaca aatttataaa ttgattattt gaaactttac 3120

aacacaattg catcccaaat acaaattgta ttgcttattc attatagcta ttcgtcctgt 3180

aatctgtttc taggtgaagc atactccagt gttttagggg ttttgaaaat aaatatttaa 3240

atttcacagt c 3251

<210> 6

<211> 22

<212> RNA

<213> miR-495

<400> 6

aaacaaacau ggugcacuuc uu 22

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

gcccctctat gcagtcatgt a 21

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

agccttgatg aaagcggctc 20

<210> 9

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

gtcgtatcca gtgcgtgtcg tggagtcgg 29

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

gggcaaacaa acatggtgca 20

<210> 11

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

cagtgcgtgt cgtggagt 18

Claims

1.特异性定量检测MST4基因的试剂在制备检测或辅助检测强直性脊柱炎的产品中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述试剂为在基因水平上特异性定量检测MST4的试剂。

3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述试剂包括引物试剂，所述引物的核苷序列为：

MST-F: 5’-TGAGGAAGCCGAAGATGAAATAGAA-3’；

MST-R: 5’-TCATCAAATGGACCAGCTCGAA-3’。