KR101758667B1 - 심부전 또는 심부전 위험성을 방지, 예방 및/또는 측정하기 위한 수단 및 방법 - Google Patents
심부전 또는 심부전 위험성을 방지, 예방 및/또는 측정하기 위한 수단 및 방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은, 개체로부터 수득한 체액 샘플내에서 miRNA인 하나 이상의 유전자 마커의 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 개체에서 심부전을 진단 및/또는 예측하는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은, 개체내에서 하나 이상의 miRNA의 발현, 양 및/또는 활성을 감소시키는 단계, 또는 개체내에서 하나 이상의 miRNA와 이의 mRNA 타겟과의 상호 작용을 낮추는 단계, 또는 개체내에서 하나 이상의 miRNA의 mRNA 타겟의 발현, 양 및/또는 활성을 증가시키는 단계를 포함하는, 개체에서 심부전을 치료 또는 예방하는 방법에 관한 것이다.
Description
본 발명은 생물학 및 의학 분야에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은 심부전의 진단 및 치료에 유용한 miRNA에 관한 것이다.
MicroRNA (miRNA)는 식물과 동물의 게놈에서 코딩되는 소형 RNA 분자이다. 이는 복수의 miRNA를 코딩하는 폴리시스트론 전사체, 및 개별 miRNA 유전자로 단백질-코딩 유전자의 인트론내에 존재하고 있다. 이는 대략 21 - 23개의 뉴클레오티드 길이인 고도로 보존된 RNA로서, 통상적으로 특정 mRNA의 3'-비번역부(3'UTR)에 결합함으로써, 유전자의 발현을 조절한다. 각 miRNA는 복수의 유전자들을 조절하는 것으로 생각되며, 수백개의 miRNA 유전자들이 고등 진핵생물에 존재하는 것으로 예측되기 때문에, miRNA에 의해 부여되는 잠재적인 조절 회로는 막대하다. 몇몇의 연구 그룹들에서, miRNA가 초기 발생, 세포 증식 및 세포 사멸, 세포자살 및 지방 대사, 및 세포 분화와 같이 다양한 과정의 주된 조절자로서 작용한다는 증거들을 제시하고 있다. 고등 진핵생물에서 유전자 발현 조절에서의 miRNA의 역할은 전사 인자들의 역할만큼 중요할 수 있다는 추측도 있다. 지금까지 540개 이상의 인간 miRNA가 확인되었지만, 컴퓨터 모델에 따르면 수천개 이상이 있을 수 있는 것으로 추정된다. 인간 유전자의 최소 30%가 miRNA에 의해 조절되는 것으로 생각된다.
miRNA를 코딩하는 유전자는 RNA 중합효소 II에 의해 DNA로부터 전사되지만 단백질로 번역되진 않는다. 통상적으로 수천 kb 길이를 갖는, 1차 전사체를, pri-miRNA라고 한다. pri-miRNA는 세포 핵내에서 더 짧은 70-100개의 뉴클레오티드로 구성된 스템-루프 구조체로 가공되는데, 이것을 pre-miRNA라고 한다. 이러한 과정은 RNase III 엔도뉴클레아제인 Drosha에 의해 동물에서 수행된다. pre-miRNA는 이후 세포질로 이동하여, 세포질에서 2번째 RNase III 엔도뉴클레아제인 DICER에 의해 21-23개의 뉴클레오티드 길이를 갖는 이중 가닥 miRNA로 가공된다. 이후, miRNA 듀플렉스 중 한가닥은 RNA-유도성 침묵 컴플렉스(RISC)로 통합된다. RISC의 일부로서, 타겟 유전자의 유전자 발현은, 번역 저해에 의해, 및/또는 mRNA 절단에 의해 간섭받는다. 성숙형 miRNA는 부분적으로 하나 이상의 mRNA 분자에 상보적이다. miRNA 및 mRNA가 동일 세포에서 발현되면, 이들은 서열-특이적인 방식으로 혼성화하여 mRNA의 단백질로의 번역을 방지할 수 있으며, 따라서 특정 단백질 수준을 현저하게 조절할 수 있다. 가능성있는 임상 플레이어로서의 miRNA에 대한 관심과 신뢰 수준은, 다양한 miRNA-기반의 생물공학 회사들이 최근 설립되고 있다는 점에서 확인할 수 있다.
수개의 miRNA가 암 및 심장 질환과 관련되어 있다. 발현 분석 연구를 통해, 정상 조직과 비교하여 종양에서의 교란된 miRNA 발현이 확인되었다. MicroRNA는 유방암, 폐암 및 대장암에서 조절 범위를 벗어나 있으며, 버킷 및 그외 인간 B-세포 림프종에서 상향 조절된다. 그 결과, 인간 miRNA는 특히 미래 암 진단제용 바이오마커로서 매우 유용한 것임에 틀림없으며, 질병 개입에 대한 매력적인 타겟으로서 급속하게 부상하고 있다. 이의 암과의 관련성 외에도, microRNA는, 미오사이트 생장, 심실벽의 온전성, 수축성, 유전자 발현 및 심장 리듬 유지 등의, 심장 기능과 부전의 다양한 측면들을 조절하는데 중요한 역할을 수행한다. miRNA의 잘못된 발현이 많은 유형의 심장 질환에 필요 충분 조건인 것으로 입증되고 있다.
최근, miRNA가 혈중에 존재하는 것으로 나타났다. 수개의 miRNA는, 혈청, 혈장, 혈소판, 적혈구 뿐만 아니라 유핵성 혈액 세포에서 비교적 높은 수준으로 검출할 수 있었다. 겸상 적혈구성 빈혈 환자나 전립선암의 혈중에서 miRNA의 비정상적인 발현 프로파일이 언급되고 있다.
유전 인자들이 심부전 발병 소인과 관련있다는 것은 확실함에도 불구하고, 이러한 유전자 인자들은 장애의 복합적인 성질을 고려하면 동정하기 어렵다.
심부전을 포함하여 급성 관상 증후군을 진단하는 방법들이 특히 WO/2002/083913, WO2002/089657 및 WO2006/120152에 기술되어 있다. 이러한 방법들 모두 예컨대 혈액 또는 뇨내 급성 관상 증후군의 마커로서 BNP(brain natriuretic peptide)의 수준을 이용한다. 그러나, 이 폴리펩타이드는 심근 세포의 과도한 스트레칭에 반응하여 심장의 심실에서 분비되므로, 이는 심장의 상태를 나타내는 생리학적 마커이다. 환자의 심부전 발병에 대한 유전적 소인을 보다 정확하게 반영하는 유전자 마커가 요구되고 있다. 또한, 이러한 마커들은 보다 초기 진단을 가능하게 해준다.
그래서, 심부전 발병을 예측하는 유전자 마커의 사용이 매우 바람직하다. 현재에는 이러한 마커가 존재하지 않는다.
현재, miRNA 혈액 프로파일이 심장 질환에서 변형된 것으로 확인되고 있다. 임의의 이론으로 결부시키고자 하는 것은 아니나, 심근 세포를 포함한 세포가 엑소좀을 통해 이들 miRNA를 혈액으로 배출시키는데, 질병 상태에서는 이러한 배출 양상이 바뀌는 것으로 생각되고 있다. 따라서, 본 발명자들은, 혈중 miRNA 프로파일링을 심부전에서의 진단적 또는 바이오마커 접근법에 대한 새로운 도구로서 사용할 수 있음을, 입증하였다.
본 발명의 목적은, 심부전 (의 위험성)을 치료, 예방 또는 측정하기 위한 수단과 방법을 제공한다. 즉, 본 발명은, 일 측면에서,
- 하나 이상의 miRNA의 발현, 양 및/또는 활성을 개체내에서 감소시키는 단계;
- 하나 이상의 miRNA와 이의 mRNA 타겟과의 상호작용을 개체내에서 감소시키는 단계; 또는
- 하나 이상의 miRNA의 mRNA 타겟의 발현, 양 및/또는 활성을 개체내에서 증가시키는 단계를 포함하며,
상기 하나 이상의 miRNA가 miR-423-5p, miR-191*, miR-15b, miR-1228*, miR-181a, miR-18a*, miR-107, miR-299-3p, miR-342-3p, miR-652, miR-675, miR-129-5p, miR18b*, miR-1254, miR-622, HS_202.1, miR-302d 및 solexa-3927-221로 이루어진 군으로부터 선택되는, 개체에서 심부전을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다.
다른 측면에서, 본 발명은,
- 개체내에서 하나 이상의 miRNA의 발현, 양 및/또는 활성을 증가시키는 단계;
- 개체내에서 하나 이상의 miRNA와 이의 mRNA 타겟과의 상호작용을 증가시키는 단계; 또는
- 개체내에서, 하나 이상의 miRNA의 mRNA 타겟의 발현, 양 및/또는 활성을 낮추는 단계를 포함하며,
상기 하나 이상의 miRNA가 miR-191, miR-30e, miR-744, miR-142-3p 및 solexa-2952-306으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 개체에서 심부전을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다.
상기 측면에 대한 바람직한 구현예에서, miRNA의 발현, 양 및/또는 활성 또는 상호작용을 증가시키는 단계는, 상기 개체에게, 기능성 miRNA로서, 전구체 microRNA (pre-miRNA)로서, 또는 microRNA 1차 전사체 (프리-miRNA)로서의, 상기 miRNA의 투여를 포함한다.
다른 측면에서, 본 발명은, 약제로서, 바람직하게는 심부전의 치료 또는 예방용으로서의, miR-191, miR-30e, miR-744, miR-142-3p 및 solexa-2952-306으로 이루어진 군으로부터 선택되는 miRNA, 또는 이의 전구체 microRNA (pre-miRNA) 또는 microRNA 1차 전사체를 제공한다.
또다른 측면에서, 본 발명은, 약제로서, 바람직하게는 심부전의 치료 또는 예방용으로서의, miR-423-5p, miR-191*, miR-15b, miR-1228*, miR-181a, miR-18a*, miR-107, miR-299-3p, miR-342-3p, miR-652, miR-675, miR-129-5p, miR-18b*, miR-1254, miR-622, HS_202.1, miR-302d 및 solexa-3927-221, 및 이의 전구체 microRNA (pre-miRNA) 또는 microRNA 1차 전사체로 이루어진 군으로부터 선택되는, 하나 이상의 miRNA에 결합하여, 이의 활성 및/또는 기능을 저해할 수 있는, 화합물, 바람직하게는 핵산을 제공한다. 용어 "기능"은 특히 본원에서 타겟 mRNA의 번역을 저해하는 상기 miRNA의 능력을 지칭한다. 따라서, 핵산은, 바람직하게는, miRNA 및 이의 mRNA 타겟 간의 혼성화를 서열-특이적인 방식으로 저해할 수 있다. 본원에서 핵산과 관련하여 "에 특이적으로 결합"이라는 용어는 특히 상기 miRNA에 엄격한 조건 하에 혼성화할 수 있는 핵산을 지칭한다. 바람직한 구현에에서, 상기 핵산은 도 3에 제시된 miRNA의 서열의 상보체인 서열을 가진다.
다른 측면에서, 본 발명은, miR-423-5p, miR-191*, miR-15b, miR-1228*, miR-181a, miR-18a*, miR-107, miR-299-3p, miR-342-3p, miR-652, miR-675, miR-129-5p, miR-18b*, miR-1254, miR-622, HS_202.1, miR-302d 및 solexa-3927-221, 및 이의 전구체 microRNA (pre-miRNA) 또는 microRNA 1차 전사체로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 miRNA, 또는 miR-191, miR-30e, miR-744, miR-142-3p 및 solexa-2952-306, 및 이의 전구체 microRNA (pre-miRNA) 및 microRNA 1차 전사체로 이루어진 군으로부터 선택되는 miRNA에 특이적으로 결합하여, 이의 활성 및/또는 기능을 저해할 수 있는, 핵산을 코딩하는 핵산 서열을 포함하며, 상기 핵산 또는 (pre 또는 pri) miRNA를 발현할 수 있는, 약제용, 바람직하게는 심부전 치료 또는 예방용 벡터를 제공한다.
또다른 측면에서, 본 발명은 약제용, 바람직하게는 심부전의 치료 또는 예방용으로서의, 전술한 본 발명에 따른 벡터를 포함하는 세포를 제공한다.
또다른 측면에서, 본 발명은,
- 전술한 본 발명에 따른 유전자 또는 이의 발현 산물, 전술한 본 발명에 따른 (pre- 또는 pri-) miRNA, 전술한 본 발명에 따른 벡터, 또는 전술한 본 발명에 따른 세포, 및
- 약학적으로 허용가능한 담체, 희석제 또는 부형제를 포함하는, 심부전 치료 또는 예방용 약학 조성물을 제공한다.
또다른 측면에서, 본 발명은,
a) 개체에서 수득되는 샘플에서, miR-191*, miR-15b, miR-1228*, miR-181a, miR-18a*, miR-107, miR-299-3p, miR-342-3p, miR-652, miR-675, miR-191, miR-302d, miR-30e, miR-744, miR-142-3p, solexa-2952-306, 및 solexa-3927-221, 및 이의 전구체 microRNA (pre-miRNA) 또는 microRNA 1차 전사체로 이루어진 군으로부터 선택되는 miRNA인, 유전자 마커의 수준을 측정하는 단계;
b) 상기 개체가 심부전을 앓고 있는지 또는 심부전 발병 위험성이 있는지를, 단계 a)에서 측정된 유전자 마커의 수준을 기초로 진단하는 단계
를 포함하는, 심부전을 앓고 있는 개체나 또는 심부전 발병 위험이 있는 개체의 진단 방법을 제공한다.
추가적인 구현예에서, 본 발명은, a) 개체에서 수득되는 샘플에서, miR-423-5p, miR-191*, miR-15b, miR-1228*, miR-181a, miR-18a*, miK-107, miR-299-3p, miR-342-3p, miR-652, miR-675, miR-129-5p, miR-18b*, miR-1254, miR-622, HS_202.1, miR-191, miR-302d, miR-30e, miR-744, miR-142-3p, solexa-2952-306, 및 solexa-3927-221, 및 이의 전구체 microRNA (pre-miRNA) 또는 microRNA 1차 전사체로 이루어진 군으로부터 선택되는 miRNA인, 하나 이상의 유전자 마커의 수준을 측정하는 단계; 및 b) 상기 개체가 심부전을 앓고 있는지 또는 심부전 발병 위험성이 있는지를, 단계 a)에서 측정된 하나 이상의 유전자 마커의 수준을 기초로 진단하는 단계를 포함하는, 심부전을 앓고 있는 개체나 심부전 발병 위험이 있는 개체를 진단하는 방법을 제공한다. 바람직한 구현예에서, 상기 하나 이상의 유전자 마커는, miR-423-5p, miR-191*, miR-15b, miR-1228*, miR-181a, miR-18a*, miR-107, miR-299-3p, miR-342-3p, miR-652, miR-675, miR-129-5p, miR-18b*, miR-1254, miR-622, HS_202.1, miR-191, miR-302d, miR-30e, miR-744, miR-142-3p, solexa-2952-306, 및 solexa-3927-221 및 이의 전구체 microRNA (pre-miRNA) 또는 microRNA 1차 전사체로 이루어진 군으로부터 선택되는 miRNA로부터 선택되는, 2종 이상의 miRNA, 더 바람직하게는 3종 이상의 miRNA를 포함한다. 추가적인 바람직한 구현예에서, 상기 2종 이상의 miRNA는, miR-423-5p 및 miR-191*, miR-423-5p 및 miR-15b, miR-423-5p 및 miR-1228*, miR-423-5p 및 miR-181a, miR-423-5p 및 miR-18a*, miR-423-5p 및 miR-107, miR-423-5p 및 miR-299-3p, miR-423-5p 및 miR-342-3p, miR-423-5p 및 miR-652, miR-423-5p 및 miR-675, miR-423-5p 및 miR-129-5p, miR-423-5p 및 miR-18b*, miR-423-5p 및 miR-1254, miR-423-5p 및 miR-622, miR-423-5p and HS_202.1, miR-423-5p 및 miR-191, miR-423-5p 및 miR-302d, miR-423-5p 및 miR-30e, miR-423-5p 및 miR-744, miR-423-5p 및 miR-142-3p, miR-423-5p 및 solexa-2952-306, 또는 miR-423-5p 및 solexa-3927-221로 이루어진 군으로부터 선택된다.
또다른 측면에서, 본 발명은, a) 개체에서 수득되는 샘플에서, miR-423-5p, miR-191*, miR-15b, miR-1228*, miR-181a, miR-18a*, miR-107, miR-299-3p, miR-342-3p, miR-652, miR-675, miR-129-5p, miR-18b*, miR-1254, miR-622, HS_202.1, miR-191, miR-302d, miR-30e, miR-744, miR-142-3p, solexa-2952-306, 및 solexa-3927-221, 및 이의 전구체 microRNA (pre-miRNA) 또는 microRNA 1차 전사체로 이루어진 군으로부터 선택되는 miRNA인, 유전자 마커의 수준을 측정하는 단계; b) 상기 개체가 심부전을 앓고 있는지 또는 심부전 발병 위험성이 있는지를, 단계 a)에서 측정된 하나 이상의 유전자 마커의 수준을 기초로 진단하는 단계를 포함하는, 심부전을 앓고 있는 개체 또는 심부전 발병 위험이 있는 개체를 진단하는 방법을 제공한다.
상기 방법의 바람직한 구현예에서, 상기 단계 b)에서는,
- miR-423-5p, miR-191*, miR-15b, miR-1228*, miR-181a, miR-18a*, miR-107, miR-299-3p, miR-342-3p, miR-652, miR-675, miR-129-5p, miR-18b*, miR-1254, miR-622, HS_202.1, miR-302d 및/또는 solexa-3927-221, 또는 이의 전구체 microRNA (pre-miRNA) 또는 microRNA 1차 전사체의 발현, 양 및/또는 활성이, 심부전을 앓고 있지 않거나 심부전 발병 위험이 없는 대조 개체와 비교하여 상향 조절되거나; 및/또는
- miR-191, miR-30e, miR-744, miR-142-3p, 및/또는 solexa-2952-306, 또는 이의 전구체 microRNA (pre-miRNA) 또는 microRNA 1차 전사체의 발현, 양 및/또는 활성이, 심부전을 앓고 있지 않거나 심부전 발병 위험이 없는 대조 개체와 비교하여, 하향 조절되었을때,
개체가 심부전을 앓고 있거나 또는 심부전 발병 위험성이 있는 것으로 고려한다.
본 발명은, 개체가 심부전을 앓고 있는지 또는 심부전 발병 위험성이 있는지를, 본 발명에 따른 하나 이상의 유전자 마커의 수준을 기초로 진단하는 단계, 및 개체가 심부전을 앓고 있거나 심부전 발병 위험성이 있을 경우에 이 개체를 치료하는 단계를 포함하는, 개체에서 심부전의 치료 또는 예방 방법을 추가로 제공한다.
다른 측면에서, 본 발명은,
- miR-423-5p, miR-191*, miR-15b, miR-1228*, miR-181a, miR-18a*, miR-107, miR-299-3p, miR-342-3p, miR-652, miR-675, miR-129-5p, miR-18b*, miR-1254, miR-622, HS_202.1, miR-191, miR-302d, miR-30e, miR-744, miR-142-3p, solexa-2952-306, 및 solexa-3927-221, 및 이의 전구체 microRNA (pre-miRNA) 또는 microRNA 1차 전사체로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 miRNA에 특이적으로 결합할 수 있는, 1종 이상의 화합물; 및
- 본 발명의 방법에 따라 심부전을 앓고 있는 개체 또는 심부전 발병 위험이 있는 개체를 진단하기 위한, 상기 화합물의 사용 설명서를 포함하는,
심부전을 앓고 있는 개체 또는 심부전 발병 위험이 있는 개체를 진단하기 위한 부품 키트(kit of parts)를 제공한다.
다른 측면에서, 본 발명은,
- 후보 화합물을 인간 조직 세포, 바람직하게는 심장 조직 세포와 접촉시키는 단계;
- 상기 후보 화합물이, 상기 조직 세포에서, miR-423-5p, miR-191*, miR-15b, miR-1228*, miR-181a, miR-18a*, miR-107, miR-299-3p, miR-342-3p, miR-652, miR-191, miR-302d, miR-30e, miR-744, miR-675, miR-129-5p, miR-18b*, miR-1254, miR-622, HS_202.1, miR-142-3p, solexa-2952-306, 및 solexa-3927-221 중 임의의 것의 발현, 양 및/또는 활성을 조절할 수 있는지를 확인하는 단계를 포함하는,
후보 화합물이 인간 개체에서 심부전을 치료 또는 예방할 수 있는지를 확인하는 방법을 제공한다. 바람직하게는, 상기 화합물은 모든 miRNA의 발현을 심부전 (의 위험)과 더 이상 관련없는 방향으로 향하게 작용한다.
후보 화합물이 인간 개체에서 심부전을 치료 또는 예방할 수 있는지를 확인하는 바람직한 방법에서, 이 방법은,
- 상기 후보 화합물을 조직 세포, 바람직하게는 인간 조직 세포, 더 바람직하게는 심장 조직 세포와 접촉시키는 단계, 및
- 상기 후보 화합물이, 상기 조직 세포에서, miR-423-5p, miR-191*, miR-15b, miR-1228*, miR-181a, miR-18a*, miR-107, miR-299-3p, miR-342-3p, miR-652, miR-675, miR-129-5p, miR-18b*, miR-1254, miR-622, HS_202.1, miR-302d solexa-3927-221의 발현, 양 및/또는 활성을 감소시킬 수 있는지, 및/또는 miR-191, miR-30e, miR-744, miR-142-3p, or solexa-2952-306의 발현을 높일 수 있는지를 결정하는 단계를 포함한다.
또한, 모든 측면과 구현예들에서, 건강한 대조군의 혈장과 비교하였을 때, HF 환자의 혈장에서 차별적으로 발현되는 것으로 확인된, miRNAs miR-654-3p, miR-346, miR-1301, miR-24-2 및 HS_239는 본 발명의 일부이다.
또한, 후보 치료 화합물의 스크리닝과 관련된 본 발명의 측면은, 본원에 기재된 바와 같이 심부전 (의 발병 위험 증가)과 관련있는 특이적인 miRNA 발현 패턴을 나타내는, 모델 시스템, 예컨대 동물 모델에서 수행할 수 있다. 따라서, 본 발명의 다른 측면은, 본원에 기술된 바와 같이, 심부전(의 발현 위험 증가)과 관련있는 miRNA 발현 프로파일을 보이는, 모델 시스템(인간을 포함한 동물)이다. 이러한 모델 시스템은, 모델 시스템(의 세포)을 후보 화합물에 노출시키거나 후보 화합물을 모델 시스템에 투여하는 단계, 및 상기 후보 화합물이 심부전(의 위험 증가)과 더이상 관련없는 변화를 miRNA 발현 프로파일에서 유도할 수 있는지, 특히 상기 모델 시스템(의 세포)에서 miR-191, miR-30e, miR-744, miR-142-3p or solexa-2952-306의 발현, 양 및/또는 활성을 증가시키는지, 및/또는 상기 모델 시스템(의 세포)에서 miR-423-5p, miR-191*, miR-15b, miR-1228*, miR-181a, miR-18a*, miR-107, miR-299-3p, miR-342-3p, miR-652, miR-675, miR-129-5p, miR-18b*, miR-1254, miR-622, HS_202.1, miR-302d or solexa-3927-221의 발현, 양 및/또는 활성을 낮출 수 있는지를, 결정하는 단계를 포함하는, 후보 치료 물질의 스크리닝 방법에 사용할 수 있다.
도 1은 심부전(HF) 환자의 혈장내 농화된 miRNA를 보여준다. 혈장 샘플들. 1) 건강한 개체 1; 2) 건강한 개체 2; 4) HF 환자 1; 5) HF 환자 2; 6) HF 환자 3.
도 2는 심부전 환자의 혈장내에 하향-조절된 miRNA를 보여준다. 혈장 샘플: 1) 건강한 개체 1; 2) 건강한 개체 2; 4) HF 환자 1; 5) HF 환자 2; 6) HF 환자 3.
도 3은 본원에서 논의된 miRNA의 서열(5'-3')이다.
도 4는 DNA 칩 어레이 상에서 측정된 본원에서 논의한 miRNA의 발현을 나타낸 것으로, miRNA에 대한 24개의 측정 결과를 보여준다. 처음 12개는 환자 샘플의 결과이고, 다음 12개(번호 13-24)는 대조군이다. FC = 배수 변호(fold change); p = p 값; 및 padJUsted는 다중 검사로 보정된 p값이다. 결과는 QPCR로 검증하였다.
도 5는 HF 환자와 대조군 개체의 혈장의 16가지의 후보 miRNA의 발현 프로파일을 나타낸 것이다. 각 패널의 좌측 2개의 막대는 12명의 건강한 대조군과 12명의 HF 환자에서 miRNA 어레이로 결정된 miRNA 수준을 나타낸다. 우측 2개의 막대는 개별 개체들에서(30명의 HF 사례와 39명의 건강한 대조군) 실시간 PCR에 의해 지금 검증한 동일 miRNA의 수준을 나타낸다. 데이타는 평균 ± SEM으로 나타낸다. * 건강한 대조군 대비 P<0.05.
도 6은 miRNA의 진단 정확도를 나타낸 것이다. A, D 및 G는 건강한 대조군, 비-HF 사례 및 HF 사례에서의 miRNA 수준을 나타낸다. 데이타는 평균 ± SEM으로 나타낸다. * 건강한 대조군 대비 P<0.05; $: 비-HF 사례 대비 P<0.05. B, E 및 H는 HF를 비-HF 사례와 구분하는 진단력에 대한 ROC 곡선과 AUC이다. C, F 및 I는 proBNP와 miRNA 간의 스피어만 상관 관계를 나타낸 것으로, miR-423-5p (P=O.002)에 대해서는 유의하고, miR-18b* (P=O.049)에 대해서는 경계치 유의성을 보인다. 단일 이상치의 누락은 miR423-5p의 상관관계에 영향을 미치지 않았지만, miR-18b*의 상관관계는 약화시켰다.
도 7은 비-심장 요인으로 사망한 개체(대조군)과 비교하여 확장성 심근병증(DCM)으로 사망한 개체로부터 수득한 사후 심근 조직에서의 miRNA 발현을 나타낸 것이다. miR-423-5p에 대한 실시간 PCR을 U6의 발현을 기준으로 표준화하였다. *는 대조군 대비 p<0.05임을 표시한다.
도 8은 심부전의 죽상경화성 형태 대 비-죽상경화성 형태를 가진 환자들에서의 순환성 miRNA의 수준을 나타낸다. 기본적인 요인인 심부전에 따른 순환성 miRNA의 수준을 비교하기 위해, HF의 죽상경화성 형태와 HF의 비-죽상경화성 형태를 구분하였다. 본 실험에서, 본 발명자들은, 심근 허혈증의 급성 신호를 나타낸 환자들은 제외시켜, 활성형 허혈증이 HF의 요인으로서 제외되었다는 것을 강조하는 것이 중요하다. 환자 30명중 12명은 HF로 유도되는 만성적인 광범위한 관상 죽상경화성 질환 병력이 있었다. 이들 죽상경화성 질환을 가진 개체들에서는, 비-죽상경화성 HF 환자(n=18)와 비교하여, miR-423-5p 및 miR-675이 현저하게 높은 순환성 수준을 나타내었지만, miR-18b*는 그렇지 않았다. *: 비-죽상경화성 형태 대비 p<0.05.
도 2는 심부전 환자의 혈장내에 하향-조절된 miRNA를 보여준다. 혈장 샘플: 1) 건강한 개체 1; 2) 건강한 개체 2; 4) HF 환자 1; 5) HF 환자 2; 6) HF 환자 3.
도 3은 본원에서 논의된 miRNA의 서열(5'-3')이다.
도 4는 DNA 칩 어레이 상에서 측정된 본원에서 논의한 miRNA의 발현을 나타낸 것으로, miRNA에 대한 24개의 측정 결과를 보여준다. 처음 12개는 환자 샘플의 결과이고, 다음 12개(번호 13-24)는 대조군이다. FC = 배수 변호(fold change); p = p 값; 및 padJUsted는 다중 검사로 보정된 p값이다. 결과는 QPCR로 검증하였다.
도 5는 HF 환자와 대조군 개체의 혈장의 16가지의 후보 miRNA의 발현 프로파일을 나타낸 것이다. 각 패널의 좌측 2개의 막대는 12명의 건강한 대조군과 12명의 HF 환자에서 miRNA 어레이로 결정된 miRNA 수준을 나타낸다. 우측 2개의 막대는 개별 개체들에서(30명의 HF 사례와 39명의 건강한 대조군) 실시간 PCR에 의해 지금 검증한 동일 miRNA의 수준을 나타낸다. 데이타는 평균 ± SEM으로 나타낸다. * 건강한 대조군 대비 P<0.05.
도 6은 miRNA의 진단 정확도를 나타낸 것이다. A, D 및 G는 건강한 대조군, 비-HF 사례 및 HF 사례에서의 miRNA 수준을 나타낸다. 데이타는 평균 ± SEM으로 나타낸다. * 건강한 대조군 대비 P<0.05; $: 비-HF 사례 대비 P<0.05. B, E 및 H는 HF를 비-HF 사례와 구분하는 진단력에 대한 ROC 곡선과 AUC이다. C, F 및 I는 proBNP와 miRNA 간의 스피어만 상관 관계를 나타낸 것으로, miR-423-5p (P=O.002)에 대해서는 유의하고, miR-18b* (P=O.049)에 대해서는 경계치 유의성을 보인다. 단일 이상치의 누락은 miR423-5p의 상관관계에 영향을 미치지 않았지만, miR-18b*의 상관관계는 약화시켰다.
도 7은 비-심장 요인으로 사망한 개체(대조군)과 비교하여 확장성 심근병증(DCM)으로 사망한 개체로부터 수득한 사후 심근 조직에서의 miRNA 발현을 나타낸 것이다. miR-423-5p에 대한 실시간 PCR을 U6의 발현을 기준으로 표준화하였다. *는 대조군 대비 p<0.05임을 표시한다.
도 8은 심부전의 죽상경화성 형태 대 비-죽상경화성 형태를 가진 환자들에서의 순환성 miRNA의 수준을 나타낸다. 기본적인 요인인 심부전에 따른 순환성 miRNA의 수준을 비교하기 위해, HF의 죽상경화성 형태와 HF의 비-죽상경화성 형태를 구분하였다. 본 실험에서, 본 발명자들은, 심근 허혈증의 급성 신호를 나타낸 환자들은 제외시켜, 활성형 허혈증이 HF의 요인으로서 제외되었다는 것을 강조하는 것이 중요하다. 환자 30명중 12명은 HF로 유도되는 만성적인 광범위한 관상 죽상경화성 질환 병력이 있었다. 이들 죽상경화성 질환을 가진 개체들에서는, 비-죽상경화성 HF 환자(n=18)와 비교하여, miR-423-5p 및 miR-675이 현저하게 높은 순환성 수준을 나타내었지만, miR-18b*는 그렇지 않았다. *: 비-죽상경화성 형태 대비 p<0.05.
용어 "심부전" 또는 "심장 부전"은, 심장 기능의 (검출가능한 또는 그렇지 않은) 비정상성으로 인해, 심장이, 대사성 조직의 요건에 상응하는 속도로 혈액을 펌프하지 못하거나, 및/또는 비정상적으로 상승된 심장 이완성 충만압으로인해 단순히 펌프하지 못하는, 병리생리학적 상태를 지칭한다. 심부전은 심근 부전에 의해서 유발될 수도 있지만, 또한 높은 요구 조건에서 거의 정상적인 심장 기능일 때에도 발생할 수 있다. 심부전은 늘 순환 부전을 야기하지만, 다양한 비-심장 증상들(예, 혈액량 감소성 쇼크, 패혈성 쇼크)이 정상이나 약간 손상되거나 또는 심지어 정상을 초과한 심장 기능일 때에도 순환 부전이 발생될 수 있기 때문에, 사례에서 그 반대가 반드시 성립되는 것은 아니다. 용어 "심부전"은 따라서 심부전의 요인과는 상관없이, 그리고 심부전 및/또는 심부전의 요인과 관련있는 유전적 요소가 있던지 없던지의 여부와는 상관없이, 수축성 및 이완성 심부전, 급성 심부전 및 만성 심부전을 포함한다.
본원에서, "핵산"은 단일 가닥 형태나 또는 이중 가닥 형태의 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드 폴리머에 대한 언급을 포함하며, 그렇지 않게 제한된 경우가 아니라면, 천연적으로 형성되는 뉴클레오티드(예, 펩타이드 핵산)와 비슷한 방식으로 단일 가닥의 핵산에 혼성하는, 천연 뉴클레오티드의 본질적인 속성을 가지고 있는, 공지된 유사체를 망라한다. "분리된 세포"에서와 같이 용어 "분리된"은, 천연적으로 형성되는 환경에서 발견되는 것과 같이 정상적으로 이를 수반하거나 상호작용하는 구성 요소들이 실질적으로 또는 본질적으로 없는, 세포와 같은 물질을 지칭한다. 분리된 세포는, 이것이 정상적으로 귀속된 조직으로부터 분리되고 이것이 유래된 유기체의 조직에 더 이상 통합되어 있지 않은, 세포를 배양하여 수득되는 세포 배양물일 수 있다.
"뉴클레오티드"는 다음과 같은 IUPAC 명명에 따라 일반적으로 허용되는 단문자로 나타낸다: A (아데닌), C (시토신), T (티민), G (구아닌), U (우라실), W (A 또는 T), R (A 또는 G), K (G 또는 T), Y (C 또는 T), S (C 또는 G), M (A 또는 C), B (C, G 또는 T), H (A, C, 또는 T), D (A, G, 또는 T), V (A, C, 또는 G), N (A, C, G, 또는 T).
"코딩" 또는 "인코딩" 서열은 단백질의 아미노산 서열, 또는 tRNA 또는 rRNA와 같은 기능성 RNA를 코딩하는, 유전자의 일부분이다. 용어 "유전자"는 본원에서 DNA 서열을 지칭하며, 비제한적인 예로서, 폴리펩타이드 체인으로 번역될 수 있는 mRNA로 전사될 수 있는 DNA 서열, rRNA 또는 tRNA로 번역될 수 있는 DNA 서열, 또는 DNA 복제, 전사 및 조절에 참여하는 효소 및 그외 단백질에 대한 인지 부위로서 제공될 수 있는 DNA 서열이 포함된다. 이 용어는, 프로모터 영역, 5' 비번역 영역(5' UTR), 코딩 영역(단백질을 코딩하거나 코딩하지 않을 수 있음) 및 폴리아데닐화 부위를 포함하는 3' 비번역 영역(3' UTR) 등의, 작동가능하게 연결된 DNA 단편 수개를 포함하는, 임의의 DNA 서열을 지칭한다. 전형적으로, 5' UTR, 코딩 영역 및 3' UTR은, 단백질을 코딩하는 유전자의 경우, 코딩 영역이 단백질로 번역되는, RNA로 전사된다. 유전자는 통상적으로 인트론과 엑손을 포함한다. 유전자는 예컨대 인트론과 같은 추가적인 DNA 단편을 포함할 수 있다.
"샘플"은 광의의 의미로는 핵산을 함유하는 것으로 사용된다. 샘플은 혈액 또는 뇨 등의 채액; 세포 조제물(cell preparation)의 가용성 분획 또는 세포를 배양한 배지의 분획; 염색체, 세포 기관 또는 세포로부터 분리되거나 추출된 막; 용액 중 또는 기질에 결합된, 게놈 DNA, RNA, 또는 cDNA; 세포; 조직; 조직 프린트; 핑거프린트, 볼 세포, 피부 또는 모발; 등을 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 miRNA의 검출에 바람직한 샘플은 혈액 및 뇨로부터 선택되는 체액이다. 가장 바람직한 샘플인 혈액 샘플이다. 혈액 샘플은 전 혈액 샘플 또는 당해 기술 분야의 당업자에게 공지된 바와 같이, 예컨대 혈장, 혈청, 혈소판, 적혈구 세포, 백혈구 세포와 같이, 원심분리 및/또는 여과에 의해 수득되는 샘플을 포함할 수 있다. 혈액 샘플은 예컨대 손가락을 찔러 혈액을 수득(finger prick)하는 것과 같이, 정맥 천자, 동맥 천자 및/또는 모세관 천자에 의해 수득할 수 있다. 샘플, 바람직하게는 혈액 샘플은 당업자에게 공지된 바와 같이 헤파린 튜브 또는 EDTA-튜브와 같은 항응고제가 든 튜브에 수집할 수 있다.
본 발명은 hsa-miR-423-5p, hsa-miR-191*, hsa-miR-15b, hsa-miR-1228*, hsa-miR-181a, hsa-miR-18a*, hsa-miR-107, hsa-miR-299-3p, hsa-miR-342-3p, hsa-miR-652, hsa-miR-675, hsa-miR-129-5p, hsa-miR-18b*, hsa-miR-1254, hsa-miR-622, HS_202.1, hsa-miR-191, hsa-miR-302d, hsa-miR-30e, hsa-miR-744, hsa-miR-142-3p, solexa-2952-306, solexa-3927-221와 같이, 본원에 기술된 miRNA의 진단, 예후 및 치료학적 용도에 관한 것이다. 이들 miRNA의 뉴클레오티드 서열은 도 3에 나타나있다.
miRNA는, 단백질성 유전자 산물을 코딩하는 유전자에 의해 코딩되는 mRNA에 어닐링시킴으로써 특이적인 유전자 산물의 발현을 방지한다. 따라서, miRNA는 번역에서 타겟 mRNA를 억제하여 타겟 mRNA를 기능적으로 조절하는 능력을 가지고 있다.
따라서, 세포에서 이들 mRNA에 의해 코딩되는 유전자 산물의 발현은, 상기 세포내에서, hsa-miR-423-5p, hsa-miR-191*, hsa-miR-15b, hsa-miR-1228*, hsa-miR-181a, hsa-miR-18a*, hsa-miR-107, hsa-miR-299-3p, hsa-miR-342-3p, hsa-miR-652, hsa-miR-675, hsa-miR-129-5p, hsa-miR-18b*, hsa-miR-1254, hsa-miR-622, HS_202.1, hsa-miR-191, hsa-miR-302d, hsa-miR-30e, hsa-miR-744, hsa-miR-142-3p, solexa-2952-306, solexa-3927-221로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 miRNA, 또는 이의 기능성 부분이나 유도체의 발현, 양 및/또는 활성에 영향을 주거나, 및/또는 상기 세포내에서, 타겟 mRNA과, hsa-miR-423-5p, hsa-miR-191*, hsa-miR-15b, hsa-miR-1228*, hsa-miR-181a, hsa-miR-18a*, hsa-miR-107, hsa-miR-299-3p, hsa-miR-342-3p, hsa-miR-652, hsa-miR-675, hsa-miR-129-5p, hsa-miR-18b*, hsa-miR-1254, hsa-miR-622, HS_202.1, hsa-miR-191, hsa-miR-302d, hsa-miR-30e, hsa-miR-744, hsa-miR-142-3p, solexa-2952-306, solexa-3927-221로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 miRNA, 또는 이의 기능성 부분 또는 유도체와의 상호작용에 작용함으므로써, 영향을 미친다.
또한, 세포에서 miRNA의 타겟 mRNA에 의해 코딩되는 특이적인 유전자 산물의 발현에 영향을 미치기 위한, hsa-miR-423-5p, hsa-miR-191*, hsa-miR-15b, hsa-miR-1228*, hsa-miR-181a, hsa-miR-18a*, hsa-miR-107, hsa-miR-299-3p, hsa-miR-342-3p, hsa-miR-652, hsa-miR-675, hsa-miR-129-5p, hsa-miR-18b*, hsa-miR-1254, hsa-miR-622, HS_202.1, hsa-miR-191, hsa-miR-302d, hsa-miR-30e, hsa-miR-744, hsa-miR-142-3p, solexa-2952-306, solexa-3927-221로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 miRNA 또는 이의 기능성 부분이나 유도체의 용도, 또는 세포에서, hsa-miR-423-5p, hsa-miR-191*, hsa-miR-15b, hsa-miR-1228*, hsa-miR-181a, hsa-miR-18a*, hsa-miR-107, hsa-miR-299-3p, hsa-miR-342-3p, hsa-miR-652, hsa-miR-675, hsa-miR-129-5p, hsa-miR-18b*, hsa-miR-1254, hsa-miR-622, HS_202.1, hsa-miR-191, hsa-miR-302d, hsa-miR-30e, hsa-miR-744, hsa-miR-142-3p, solexa-2952-306, solexa-3927-221로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 miRNA의 발현, 양 및/또는 활성에 영향을 미칠 수 있는 화합물의 용도, 또는 타겟 mRNA와, hsa-miR-423-5p, hsa-miR-191*, hsa-miR-15b, hsa-miR-1228*, hsa-miR-181a, hsa-miR-18a*, hsa-miR-107, hsa-miR-299-3p, hsa-miR-342-3p, hsa-miR-652, hsa-miR-675, hsa-miR-129-5p, hsa-miR-18b*, hsa-miR-1254, hsa-miR-622, HS_202.1, hsa-miR-191, hsa-miR-302d, hsa-miR-30e, hsa-miR-744, hsa-miR-142-3p, solexa-2952-306, solexa-3927-221로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 miRNA와의 상호작용에 영향을 미칠 수 있는 화합물의 용도를 제공한다. 일 구현예에서, 특이적인 유전자 산물의 발현은 시험관내에서, 예컨대 세포 배양물내에서 영향을 받는다.
miRNA는 당업자에게 공지된 바와 같이 표준 명명 체계를 따른다. 소문자 "mir-"은 pre-miRNA를 지칭하고, 대문자 "miR-"은 성숙형을 지칭한다. 거의 동일한 서열을 가진 miRNA들에는 추가적인 소문자를 단다. 예컨대, miR-123a는 miR-123b와 거의 비슷하다. 100% 동일하지만 게놈에서는 다른 위치에서 인코딩되는 miRNA는 추가적인 -번호 접미사로 표시하며, miR-123-1과 miR-123-2는 동일하지만 다른 pre-miRNA로부터 만들어진다. 기원 종들은 3문자 접두사로 명시되며, 예컨대 hsa-miR-123은 인간(호모 사이엔스) 유래 miRNA이고, oar-miR-123은 양(오비스 아리에스(Ovis aries)) 유래 miRNA이다. 상대적인 발현 수준이 공지된 경우, 이름 다음에 오는 *은 헤어핀의 반대쪽 암에 있는 miRNA에 비해 낮은 수준으로 발현되는 miRNA를 표시한다. 예컨대, miR-123와 miR-123*는, pre-miRNA 헤어핀을 공유하지만, 상대적으로 miR-123이 세포에서 더 많이 발견된다. 접미사 5p와 3p는 pre-miRNA의 5'암 또는 3'암 각각으로부터 miRNA가 유래된 경우를 표시한다. 이러한 접미사들은, miRNA가 동일한 수준으로 발현될 때 사용된다. 예를 들어, miR423-5p 및 miR423-3p는 pre-miRNA 헤어핀을 공유할 것이다.
본 발명에서, miRNA는 본원에서 특이적인 유전자 산물의 발현을 방지할 수 있다. 본원에서, 용어 "miRNA"는 상기 miRNA의 임의의 이소형을 포괄하며, 상기 miRNA 패밀리의 모든 구성원들은 상기 특이적인 유전자 산물의 발현을 방지할 수 있다. 따라서, 용어 "miRNA"는 pri-miRNA 및 pre-miRNA와 같은 전구체, miR-123 및 miR-123*와 같은 *-서열, miR-17 및 miR-18 등의 패밀리 구성원; 및 miR-92a, miR-92a-2* 및 miR-363 등의 클러스터 구성원을 포함한다.
따라서, 용어 miR-423-5p는, 이소형들 pre-mir423 및 miR423-3p을 포함하며; 용어 miR-129-5p는 이소형들 pre-mir129-1, pre-mir129-2, miR-129* 및 miR-129-3p를 포함하며; 용어 miR-18b*는 이소형들 pre-mir18b, miR-18b, pre-mir17, miR-17, miR-17*, pre-mir18a, miR-18a, miR-18a*, pre-mir20a, miR-20a, pre-mir20b, miR-20b, miR-20b*, pre-mir93, miR-93, miR-93*, pre-mirlO6a, miR-106a, miR-106a*, pre-mirlO6b, miR-106b, miR-106b*, pre-mirl9b-2, miR-19b, miR-19b-2*, pre-mir92a-2, miR-92a, miR-92a-2*, pre-mir363, miR-363, 및 miR-363*를 포함하며; 용어 miR-1254는 이소형 pre-mir1254를 포함하며; 용어 miR-622는 이소형 pre-mir622을 포함하며; 용어 HS_202.1은 이소형들 pre-mir221, miR-221 및 miR-221*을 포함한다.
그래서, 본원에서, 용어 "miRNA"는 모든 miRNA 구성원을 포함한다. hsa-miR-423-5p, hsa-miR-191*, has-miR-15b, hsa-miR-1228*, hsa-miR-181a, hsa-miR-18a*, hsa-miR-107, hsa-miR-299-3p, hsa-miR-342-3p, hsa-miR-652, hsa-miR-675, hsa-miR-129-5p, hsa-miR-18b*, hsa-miR-1254, hsa-miR-622, HS_202.1, hsa-miR-191, has-miR-302d, hsa-miR-30e, hsa-miR-744, hsa-miR-142-3p, solexa-2952-306, 및 solexa-3927-221이 당해 기술 분야에 공지되어 있더라도, 이의 심부전과의 관련성 및 이의 심부전에 대한 효과는 본 발명 이전에는 알려지지 않았다.
이제, 본 발명은, 전술한 miRNA가 심부전과 관련되어 있으며, 심부전의 진단, 예방 및 치료가 가능하게 되었다는 인식을 제공한다. 본원에 기술된 miRNA와 심부전 간의 관련성은 발현이 miRNA에 의해 예방 또는 조절되는 특이적인 유전자 산물을 통해서이다. 이러한 특이적인 유전자 산물들 중 임의의 것의 발현 방지는, 이들 특이적인 유전자 산물이 보다 소량으로 생성되게 할 것이며, 이로써 심부전의 개시, 진행 및/또는 효과는 줄어들게 될 것이다. 이는 특히 심부전 동안에 상향 조절되는 miRNA에 의해 발현이 조절되는 유전자 산물에 해당된다. 또한, 이들 특이적인 유전자 산물의 임의의 것의 발현 자극, 예컨대 miRNA의 발현 예방은 이들 특이적인 유전자 산물의 다른 것이 더 많은 양으로 생성될 수 있으며, 또한 심부전의 개시, 진행 및/또는 효과가 줄어들 수 있다. 여기에는 심부전 동안에 하향 조절되는 miRNA에 의해 발현이 조절되는 유전자 산물에 해당된다. 따라서, 이들 특이적인 유전자 산물은 아직 기전은 공지되지 않았지만 심부전의 중요한 매개체로서 지칭된다. 본 발명에서, hsa-miR-423-5p, hsa-miR-191*, hsa-miR-15b, hsa-miR-1228*, hsa-miR-181a, hsa-miR-18a*, hsa-miR-107, hsa-miR-299-3p, hsa-miR-342-3p, hsa-miR-652, hsa-miR-675, hsa-miR-129-5p, hsa-miR-18b*, hsa-miR-1254, hsa-miR-622, HS_202.1, hsa-miR-191, hsa-miR-302d, hsa-miR-30e, hsa-miR-744, hsa-miR-142-3p, solexa-2952-306, solexa-3927-221 중에서 선택되는 수개의 miRNA는 특이적인 유전자 산물의 발현 방지에 의해 심부전을 방지할 수 있다.
따라서, 일 구현예는,
- 개체내에서, hsa-miR-191, hsa-miR-30e, hsa-miR-744, hsa-miR-142-3p, solexa-2952-306으로 이루어진 군으로부터 선택되는 miRNA, 또는 이의 기능성 부분 또는 유도체의 발현, 양 및/또는 활성을 증가시키는 단계, 및/또는
- 특이적인 타겟 mRNA와, hsa-miR-191, hsa-miR-30e, hsa-miR-744, hsa-miR-142-3p, solexa-2952-306으로 이루어진 군으로부터 선택되는 miRNA, 또는 이의 기능성 부분 또는 유도체와의 상호작용을 증가시키는 단계로서, 상기에서 언급된 바와 같이, 상기 miRNA는 상기 miRNA 패밀리에 속하는 임의의 구성원을 포함하는 단계, 및/또는
- hsa-miR-423-5p, hsa-miR-191*, hsa-miR-15b, hsa-miR-1228*, hsa-miR-181a, hsa-miR-18a*, hsa-miR-107, hsa-miR-299-3p, hsa-miR-342-3p, hsa-miR-652, has-mir-675, hsa-miR-129-5p, hsa-miR-18b*, hsa-miR-1254, hsa-miR-622, HS_202.1, miR-302d 및/또는 solexa-3927-221로 이루어진 군으로부터 선택되는 miRNA, 또는 이의 기능성 부분 또는 유도체의 발현, 양 및/또는 활성을, 개체에서 감소시키는 단계, 및/또는
- 특이적인 타겟 mRNA와, hsa-miR-423-5p, hsa-miR-191*, hsa-miR-15b, hsa-miR-1228*, hsa-miR-181a, hsa-miR-18a*, hsa-miR-107, hsa-miR-299-3p, hsa-miR-342-3p, hsa-miR-652, hsa-miR-675, hsa-miR-129-5p, hsa-miR-18b*, hsa-miR-1254, hsa-miR-622, HS_202.1, 및/또는 solexa-3927-221로 이루어진 군으로부터 선택되는 miRNA, 또는 이의 기능성 부분 또는 유도체와의 상호작용을, 개체에서 감소시키는 단계로서, 상기에 기술된 바와 같이, 상기 miRNA는 상기 miRNA 패밀리에 속하는 임의의 구성원을 포함하는 단계를 포함하는,
개체에서 심부전을 방지, 치료, 감소, 지연 및/또는 예방하는 방법을 제공한다.
일 구현예에서, 상기 개체는 심부전으로 진단받은 개체이다. 그러나, 다른 구현예에서, 상기 개체는, 예컨대 상기 개체가 이미 손상되거나 질병을 앓고 있어, 심부전 위험이 높은 개체이다. 다른 구현예에서, 본 발명에 따른 방법은 일반적으로 병에 걸리지 않은 개체에서 심부전을 예방하기 위해 수행된다.
심부전 진단 방법은 당해 기술 분야에 공지되어 있다. 개체는 예컨대 기계적 견고성이 증가되는지, 예컨대 심장의 전기적 성질 등의 정상적인 기능이 감소되는, ECM 단백질이 과도하게 축적되는지, 및/또는 특이적인 유전자 산물의 수준이 임의의 역치 수준 보다 높은지를 측정함으로써, 심부전에 대해 진단한다. 심부전 위험성 증가는 개체에 손상 또는 장애가 있을 때 대개 개체에 존재한다.
본 발명의 방법은 심부전의 진단적 및 치료적 용도에 적합하다. 바람직한 구현예에서, 본 발명의 방법은 심부전을 방지, 치료, 감소, 지연 및/또는 예방하기 위해 사용된다. 따라서, 본 발명은, 치료 및/또는 예방이 필요한 개체내에서,
- 본원에서 동정된 바와 같이 심부전에서 하향 조절되는 miRNA의 발현, 양 및/또는 활성을 증가시키는 단계, 및/또는 본원에서 동정된 바와 같이 심부전에서 상향 조절되는 miRNA의 발현, 양 및/또는 활성을 줄이는 단계를 포함하는, 개체에서의 심부전 치료 및/또는 예방 방법을 제공한다. 이는, miRNA를 각각 하향 및 상향 조절하기 위해, 예컨대 이들 miRNA의 타겟 mRNA와의 상호작용을 높이거나, 및/또는 이들 miRNA의 타겟 mRNA와의 상호작용을 낮춤으로써, 달성될 수 있다.
바람직한 일 구현예에서, 상기 개체는 심부전으로 진단받거나 심부전 위험성이 있는 것으로 진단받은 개체이다. 다른 구현예에서, 상기 방법은 질병에 걸리지 않은 개체에서 일반적으로 심부전을 예방하기 위해 수행된다. 예컨대, miRNA의 발현 및/또는 활성을 증가시킬 수 있는 활성 화합물을 투여함으로써, 직접적으로 본원에 기술된 심부전에서 하향 조절되는 miRNA의 발현, 양 및/또는 활성을 증가시킬 수 있다. 또한, 예컨대 miRNA의 발현, 양 및/또는 활성을 감소시킴으로써, 간접적으로, miRNA의 발현, 양 및/또는 활성을 증가시킬 수 있다. 반대는 본원에 기술된 심부전에서 상향 조절되는 miRNA의 발현, 양 및/또는 활성 감소에 적용된다.
바람직한 구현예에서, miRNA의 양은, 상기 개체에게, pri- miRNA 및/또는 pre- miRNA 및/또는 miRNA, 또는 이의 기능성 부분 또는 유도체를 투여함으로써, 증가된다. 이들 화합물들 중 임의의 화합물, 또는 이들 화합물의 임의 조합의 투여시, 타겟 mRNA가 (증가) 방지되며, 따라서, 심부전이 방지 및/또는 예방된다. pri-miRNA는 수 kb 길이의 miRNA의 1차 전사체이며, 이 전사체는 RNA 중합효소 II에 의한 게놈 miRNA 서열의 전사 후 수득된다. pre-miRNA는 더 짧은 길이로 70-100개의 뉴클레오티드로 구성된 스템-루프 구조로서, pri-miRNA의 리보뉴클레아제 Drosha를 이용한 가공 후 수득된다. 본원에 언급되는 miRNA의 서열은 도 3에 나타낸다.
pri-miRNA 또는 pre-miRNA 또는 miRNA의 기능성 부분은, 본원에서, pri-miRNA 또는 pre-miRNA 또는 (성숙형) miRNA 각각 보다 더 짧은, 적어도 7개의 뉴클레오티드 길이를 가지며, 타겟 mRNA 유전자(miRNA가 결합하는 mRNA를 코딩하는 유전자) 및/또는 타겟 mRNA에 결합할 수 있으며/있거나 타겟 mRNA 또는 유전자로부터의 단백질 발현을 방지할 수 있는, 핵산 서열로서 정의된다. 상기 기능성 부분은, 바람직하게는, miRNA에 의해 결합될 수 있는, 타겟 mRNA의 동일한 3'UTR 영역에 결합할 수 있다. 상기 기능성 부분은 바람직하게는 miRNA의 시드(seed) 영역의 서열을 포함한다. miRNA의 시드 영역은 천연적으로 형성되는 miRNA의 5' 영역에 존재한다. 상기 시드 영역은 특히 타겟 인지에 참여한다. miRNA의 시드 영역의 서열은, miRNA 및 mRNA 간의 결합 실험을 수행함으로써, 어려움 없이 또는 독창적인 기술 없이 당업자가 발견할 수 있다. 따라서, pri-miRNA 또는 pre-miRNA 또는 miRNA의 기능성 부분은, 바람직하게는 시드 영역 서열을 포함하는 7개 이상의 뉴클레오티드 길이를 가진 핵산 서열이다. 그러나, 타겟 mRNA 유전자 또는 타겟 mRNA 결합력을 유지하는 한, 상기 시드 영역의 일부 변형도 허용된다. 따라서, pri-miRNA 또는 pre-miRNA 또는 miRNA의 기능성 부분은, 본원에 언급된 바와 같이 miRNA의 시드 영역의 서열에 대해 72% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 보다 바람직하게는 86% 이상, 가장 바람직하게는 90% 이상의 서열 동일성을 가진 서열을 포함하는, 7개 이상의 뉴클레오티드 길이의 핵산 서열을 포함한다.
pri-miRNA 또는 pre-miRNA 또는 miRNA의 기능적 유도체는, 본원에서, pri-miRNA 또는 pre-miRNA 또는 miRNA에 대해 70% 이상 - 100% 미만의 서열 동일성을 가진 서열을 포함하며, 정량적인 고려와 관계없이 공통적으로 한가지 이상의 동일한 특성을 가지는, 분자로서 정의된다. 상기 기능적 등가체는, 반드시 pri-miRNA 또는 pre-miRNA 또는 miRNA와 동일한 수준은 아니더라도, 상기 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 발현을 방지하고 타겟 mRNA 유전자 및/또는 타겟 mRNA에 결합할 수 있다. 이러한 기능성 등가체로는, 예를 들어, 하기를 포함한다:
- pri-miRNA 또는 pre-miRNA 또는 miRNA의 천연 서열에 한개 이상의 뉴클레오티드가 부가된 폴리뉴클레오티드;
- 뉴클레오티드들 중 1-40%가 하나 이상의 다른 뉴클레오티드로 치환되나, 시드 영역의 서열이 도 3에 나타낸 miRNA 서열과 72% 이상의 서열 동일성을 유지하는, pri-miRNA 또는 pre-miRNA 또는 miRNA; 및/또는
- 하나 이상의 뉴클레오티드가 변형되어, 제조되는 산물이 천연적으로 형성되는 뉴클레오티드가 아닌 것을 포함하는, pri-miRNA 또는 pre-miRNA 또는 miRNA.
바람직하게는, pri-miRNA 또는 pre-miRNA 또는 miRNA의 기능적 등가체는, pri-miRNA 또는 pre-miRNA 또는 miRNA와 약 75% 이상, 바람직하게는 약 80% 이상, 더 바람직하게는 약 85% 이상, 더 바람직하게는 약 90% 이상, 가장 바람직하게는 약 95% 이상의 서열 동일성을 보이는 뉴클레오티드 서열을 가진다. 서열 동일성이 높을수록, 상기 기능적 등가체는 pri-miRNA 또는 pre-miRNA 또는 miRNA과 더 비슷해진다.
pri-miRNA 또는 pre-miRNA 또는 miRNA의 기능적 등가체에 대한 바람직한 예는, 적어도 miRNA의 시드 영역을 포함하는 벡터, 또는 상기 시드 영역의 서열과 72% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더 바람직하게는 86% 이상, 가장 바람직하게는 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 벡터이다.
용어 "서열 동일성%"는 본원에서 필요에 따라 최대 서열 동일성%를 달성하도록 서열을 정렬하여 선택적으로 갭을 도입하였을 때, 대상 핵산 서열의 뉴클레오티드와 동일한 핵산 서열 서열내 뉴클레오티드의 비율로서 정의된다. 정렬 방법과 정렬하기 위한 컴퓨터 프로그램들은 당해 기술 분야에 잘 알려져 있다. 본원에서, 용어 "핵산 서열" 및 "뉴클레오티드"는 또한 예컨대 인공적으로 변형된 핵산 서열, 펩타이드 핵산 등의 핵산 서열, 뿐만 아니라 예컨대 이노신과 같은 하나 이상의 변형된 뉴클레오티드 및/또는 비-천연 뉴클레오티드를 포함하는 핵산 서열을 기본으로 하거나, 및/또는 이로부터 유래된, 비천연 분자도 포함한다.
세포에 폴리뉴클레오티드를 도입하는 방법은 당해 기술 분야에 공지되어 있다. 핵산의 도입 방법은, 예컨대, 칼슘 포스페이트 형질감염, DEAE-덱스트란, 전기천공 또는 리포좀-매개의 형질감염을 포함한다. 다른 예로, 폴리뉴클레오티드의 직접 주입도 사용된다. 그러나, 바람직하게는, 핵산 서열은 벡터에 의해, 바람직하게는 바이러스 벡터에 의해 세포로 도입된다. 이러한 벡터는, 바람직하게는, 레트로바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 아데노-부족 바이러스(AAV) 벡터 또는 렌티바이러스 벡터를 포함한다. 일 구현예에서, AAV9 벡터가 사용된다.
당해 기술 분야에서는, 핵산을 세포에 벡터에 의해 도입하는 것을 지칭하는 다양한 용어들이 알려져 있다. 이러한 용어의 예로는 "형질전이", "형질감염" 및 "형질전환"이 있다. 핵산 서열을 가진 벡터의 제조 기법과 상기 벡터의 세포로의 도입 기법들은 당해 기술 분야에 공지되어 있다.
바람직하게는, 생체내에서 포유류 세포에 도입될 수 있는, pri-miRNA 또는 pre-miRNA 또는 miRNA, 또는 이의 기능성 부분 또는 유도체를 사용한다. 본 발명에 따른 방법의 예로는, 상기 핵산 서열과 세포-투과성 펩타이드, 마이크로캐리어 또는 나노캐리어와의 커플링, 또는 상기 핵산 서열을 함유하는 리포좀의 사용이 있으나, 이들로 한정되지 않는다. 바람직하게는, 상기 저해제는 예컨대 상기 저해제에 결합된 인공적인 HDL-유사 입자를 이용하여 심근으로의 전달을 강화함으로써 심근 세포로 타겟화된다.
본 발명에서, 심부전은 특히 상기 개체에서 상향 또는 하향 조절되는 pri-miRNA 또는 pre-miRNA 또는 miRNA, 또는 이의 기능성 부분 또는 유도체를, 심부전을 앓고 있거나 앓을 위험성이 있는 개체에게 투여함으로써, 충분히 방지하거나 및/또는 예방한다. 또한, 심부전은, 상기 개체에서 하향 조절되거나 과소 발현되는 miRNA의 발현, 양 및/또는 활성을 증가 또는 회복시킬 수 있는 화합물을 투여함으로써, 또는 상기 개체에서 하향 조절되거나 과소 발현되는 miRNA와 타겟 mRNA와의 상호작용을 높일 수 있는 화합물을 투여함으로써, 방지 및/또는 예방한다. 따라서, 본 발명은, 심부전의 방지, 치료, 감소, 지연 및/또는 예방에 사용하기 위한, 상기 개체에서 하향 조절되거나 과소 발현되는 pri-miRNA 및/또는 pre-miRNA 및/또는 miRNA, 또는 이의 기능성 부분 또는 유도체, 또는 세포에서 본원에 언급된 바와 같이 심부전시 하향 조절되거나 과소 발현되는 miRNA의 발현, 양 및/또는 활성을 증가 또는 회복시킬 수 있는 화합물, 또는 본원에 언급된 바와 같이 심부전시 하향 조절되거나 과소 발현되는 miRNA와 타겟 mRNA와의 상호작용을 높일 수 있는 화합물을 추가로 제공한다. 본원에서 언급된 바와 같이 심부전시 상향 조절되거나 과다발현되는 miRNA의 경우 그 반대가 적용된다.
따라서, 전술한 화합물 또는 이의 임의 조합은, 심부전용 약제 또는 예방제의 제조에 특히 적합하다. 따라서, 본 발명은, 심부전용 약제 또는 예방제를 제조하기 위한, 본원에 언급된 pri-miRNA 및/또는 pre-miRNA 및/또는 miRNA, 또는 이의 기능성 부분 또는 유도체의 용도, 또는 세포에서 miRNA의 발현, 양 및/또는 활성을 증가 또는 회복시킬 수 있는 화합물의 용도, 또는 상기 miRNA와 타겟 mRNA 간의 상호작용을 높일 수 있는 화합물을 용도를 추가로 제공한다. 상기한 예방제는 특히 심부전 위험성이 증가된 개체 뿐만 아니라 심부전을 이미 앓고 있는 개체에게 적합하다. 그러나, 상기 예방제는 또한 질병에 걸리지 않은 개체에서 일반적으로 심부전을 예방하는데도 적합하다.
또한, 상기한 본 발명은, 본원에서 동정된 miRNA의 타겟 mRNA에 의해 코딩되는 단백질 산물의 양 또는 활성을 증가 또는 감소시킴으로써, 달성될 수 있다. 전술한 화합물들 중 임의의 것, 또는 이의 임의 조합의 개체 투여는, 특히 상기 개체에서 심부전을 방지 및/또는 예방하는데 적합하다. 일 구현예에서, 전술한 화합물들 중 임의의 화합물, 또는 이의 임의 조합은, 심부전으로 진단된 개체에게 투여된다. 다른 구현예에서, 전술한 화합물들 중 임의의 화합물 또는 이의 임의 조합은 심부전 위험성이 높은 개체, 예컨대 이미 손상이 있거나 질병을 앓고 있는 개체에게 투여된다. 그러나, 상기 화합물, 또는 이의 임의 조합은 또한 질병에 걸리지 않은 개체에서 통상적으로 심부전을 예방하는데에도 적합하다.
이미 설명한 바와 같이, 심부전의 존재 또는 위험성을 확정(establishing)하는 방법은, 심장 기능성 검사를 포함한다. 현재, 본원에서 동정된 타겟 mRNA에 의해 코딩되는 단백질의 축적 수준 또는 (pri/pre) miRNA의 축적 수준 측정을 포함하는 방법이 제공가능한 것으로 확인되었다. 그러나, 본 발명에서는, miRNA 그룹과 심부전 간의 관련성을 기술하여, 추가적인 방법들을 이용할 수 있게 되었다. 본 발명에 따라, 심부전의 존재 또는 위험성은, 개체의 샘플에서, 본원에서 동정된, 심부전과 관련있는 pri-miRNA 및/또는 pre-miRNA 및/또는 miRNA의 양이, 특정 기준값 보다 높거나 낮은지를 측정함으로써, 확정된다. 일 구현예에서, 상기 기준값은 건강한 개체나 건강한 집단내에서 miR-191, miR-30e, miR-744, miR-142-3p 및 solexa-2952-306으로 이루어진 군으로부터 선택되는 pri-miRNA 및/또는 pre-miRNA 및/또는 miRNA의 양이다. 개체 샘플내 상기 pri-miRNA 및/또는 pre-miRNA 및/또는 miRNA의 양이 기준값 보다 현저하게 낮다면, 타겟 mRNA 발현은 충분히 방지되지 않는다. 그 결과, 타겟 mRNA에 의해 코딩되는 단백질이 너무 많이 발현되게 될 것이고, 개체는 심부전을 앓거나 심부전을 앓을 위험성이 높아지게 된다. 이럴 경우, 본 발명에 따른 치료법이 권고된다.
반면, 개체의 샘플에서, miR-423-5p, miK-191*, miR-15b, miR-1228*, miR-181a, miR-18a*, miR-107, miR-299-3p, miR-342-3p, miR-652, miR-675, miR-129-5p, miR-18b*, miR-1254, miR-622, HS_202.1, miR-302d 및/또는 solexa-3927-221로 이루어진 군으로부터 선택되는 pri-miRNA 및/또는 pre-miRNA 및/또는 miRNA의 양이, 기준값 보다 현저하게 높다면, 타겟 mRNA 발현 (또는 타겟 mRNA의 단백질로의 번역)은 상당히 방지된다. 이 경우, 개체는 심부전을 앓고 있거나 또는 앓을 위험성이 있는 것으로 진단된다.
심부전과 관련된, pri-miRNA 및/또는 pre-miRNA 및/또는 miRNA의 양은, 샘플, 바람직하게는 혈액 샘플 또는 뇨 샘플로부터 RNA를 분리한 후에 결정할 수 있다. RNA의 분리는 바람직하게는 RNase가 존재하는 경우 불활성화시키기 위해, GITC, LiCl, SDS 및/또는 페놀과 같은 강력한 디터전트의 존재 하에 수행된다. RNA의 분리 방법은 당해 기술 분야에 공지되어 있으며, 예를 들어 mirVana PARIS 키트(Ambion) en Trizol LS (Invitrogen)와 같은 시판되는 RNA 분리 키트의 사용이 포함된다. 그러나, 샘플은 RNA의 사전 분리 없이, 예컨대 샘플로부터 미세소낭 등의 소낭을 분리함으로써 miRNA 서열을 검출하기 위해 가공할 수 있다.
샘플에서 miRNA를 검출하는 방법은 당해 기술 분야의 당업자들에게 공지되어 있으며, 노던 블롯팅, 마이크로-엔 마크로어레이, 인 시츄 혼성화, 액상의 단일 분자 검출, 대규모 대응체 서열분석 및 정량적인 중합효소 연쇄 반응(Q-PCR)을 포함한다. 샘플내 RNA는 miNRA 서열을 검출하기 전에 증폭시키는 것이 바람직하다. RNA 서열의 증폭 방법은 당해 기술 분야에 공지되어 있으며, 역전사효소 중합효소 연쇄 반응 (RT-PCR) 및 핵산 서열 기반의 증폭 (NASBA)이 있다. 바람직한 증폭 방법은, 예컨대 SYBR GREEN (Roche, Basel, Switzerland) 또는 형광 표지된 Taqman 프로브 (Applied Biosystems, Foster City, USA)를 이용한 RNA 서열의 정량적인 증폭을 포함한다.
역전사효소-매개의 cDNA 합성용 프라이머는, 예컨대 폴리(A)-꼬리와 같이, 모든 miRNA 서열들에서 공유되는 서열을 라이게이션에 의해 또는 말단 트랜스퍼라제의 작용을 통해 부가한 다음 어댑터-올리고(dT) 프라이머를 어닐링시킴으로써, 제공될 수 있다. 추가적인 방법은 스템-루프 프라이머의 사용 및/또는 miRNA-특이적인 프라이머의 사용을 포함한다. RNA 서열의, 바람직하게는 실시간 PCR에 의한 정량적 증폭은 바람직하게는 유니버셜 프라이머 및 miRNA-특이적인 프라이머를 포함한다.
검출, cDNA 합성 및/또는 증폭용 프라이머는 바람직하게는 RNA 뉴클레오티드, DNA 뉴클레오티드 또는 LNA(Locked Nucleic Acid) 뉴클레오티드, PNA() 뉴클레오티드 및/또는 2'-O-알킬 변형체2'-플루오로 변형제, 4'-티오 변형체, 포스포로티오에이트 연걸, 모르폴리노 연결, 포스포노카르복실레이트 연결 등의 변형된 뉴클레오티드를 포함한다. 바람직한 구현예에서, 프라이머의 길이, 바람직하게는 miRNA-특이적인 프라이머의 길이는 특이적이 miRNA의 길이와 동일하다. 추가적인 바람직한 구현예에서, miRNA-특이적인 프라이머의 길이는 miRNA 길이 보다 짧으며, 예컨대 특이적인 miRNA의 길이에 따라 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 20개, 20개, 21개, 22개 또는 23개 뉴클레오티드 짧다. 프라이머, 바람직하게는 miRNA-특이적인 프라이머의 서열은 바람직하게는 miRNA의 서열과 비교하여 1 또는 2개의 미스매치, 또는 miRNA에 부가된 어댑터 서열을 포함하며, 더 바람직하게는 miRNA의 서열과 동일하다.
샘플에서 하나 이상의 miRNA를 검출하는 방법 및 수단은 바람직하게는 키트로서 제공된다. 이 키트는 바람직하게는, 프라이머 세트, 바람직하게는 하나 이상의 특이적인 프라이머 세트, RNA-의존성 DNA 중합효소 및/또는 DNA-의존성 DNA 중합효소와 같은 효소, 및 반응 또는 반응들을 수행하기 위한 1종 이상의 완충액을 포함한다. 상기 키트는 예컨대 동결건조 후 건조된 물질로서 또는 액체로서 제공될 수 있다.
개체의 샘플에서, pri-miRNA 및/또는 pre-miRNA 및/또는 miRNA의 양이 기준치와 본질적으로 동일하다면, 타겟 mRNA 발현은 충분히 방지되고 있는 것이다. 이 경우, 개체는 심부전을 앓고 있거나 앓을 위험성이 있다고 진단되지 않는다.
물론, 건강한 개체의 다른 종류의 기준치를 사용할 수 있다. 예를 들어, 심부전을 앓고 있는 개체나 집단에서, pri-miRNA 및/또는 pre-miRNA 및/또는 miRNA의 양을 나타내는 기준치를 사용할 수 있다. 이 경우, pri-miRNA 및/또는 pre-miRNA 및/또는 miRNA의 양이 본질적으로 상기 기준치와 동일한 샘플은 심부전(의 위험)을 의미한다. 이 수치가 훨씬 낮거나 높은 샘플은 건강함을 의미한다.
따라서, 본 발명은,
- 개체로부터 샘플을 수득하는 단계;
- 상기 샘플에서, 심부전과 관련있는 것으로 본원에서 언급된 pri-miRNA 및/또는 pre-miRNA 및/또는 miRNA의 양을 결정하는 단계;
- 상기 양을 기준치와 비교하는 단계; 및
- 상기 비교를 통해, 상기 개체가 심부전을 앓고 있는지의 유무 또는 상기 개체가 심부전 발병 위험성이 높은지의 유무를 결정하는 단계를 포함하는,
개체가 심부전을 앓고 있는지, 개체가 심부전 발병 위험성이 높은지를 확인하는 방법을 제공한다.
개체 샘플내 pri-miRNA 및/또는 pre-miRNA 및/또는 miRNA의 양은 바람직하게는 결합성 화합물을 이용하여 확립된다. 샘플의 적어도 일부분을, 바람직하게는, 상기한 결합성 화합물과 (선택적으로는 샘플을 사전 가공 후) 접촉시키며, 이때 결합되지 않은 성분들은 바람직하게는 헹구어 제거하고, 결합된 화합물들은 바람직하게는 가시화하고 정량한다. 따라서, 일 구현예는, 개체가 심부전을 앓고 있는지 또는 개체가 심부전 발병 위험성이 높은지를 결정하기 위한 본 발명에 따른 방법을 제공하며, 상기 방법은, 상기 샘플에서 적어도 일부분을 pri-miRNA 및/또는 pre-miRNA 및/또는 miRNA에 특이적으로 결합할 수 있는 1종 이상의 화합물과 접촉시키는 단계를 추가로 포함한다. 물론, 샘플의 일부만 사용한다면, 적정 검사가 수행될 수 있는 microRNA가 함유된 일부를 사용한다.
샘플은, 바람직하게는 혈액, 혈장 또는 뇨 샘플이다.
본 발명은, 아울러, 본 발명에 따른 방법을 수행하기 위한 부품 키트를 제공한다. 따라서,
- 본원에서 심부전과 관련있다고 언급되는, pri-miRNA 및/또는 pre-miRNA 및/또는 miRNA에 특이적으로 결합할 수 있는, 1종 이상의 화합물; 및
- 개체가 심부전을 앓고 있는지를 확인하기 위한 상기 화합물의 사용 설명서를 포함하는, 부품 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 치료법을 수행하기 위한 부품 키트를 제공한다. 이러한 부품 키트를 이용하여, 타겟 mRNA 발현을 전형적으로 miRNA를 통해 방지한다. 본 발명에 따른 부품 키트는,
- 본원에서 심부전시 하향 발현되거나 또는 과소 발현되는 것으로 언급되는, pri-miRNA 및/또는 pre-miRNA 및/또는 miRNA, 또는 이의 기능성 부분 또는 유도체, 및/또는
- 본원에서 심부전시 세포에서 하향 발현되거나 과소 발현되는 것으로 언급되는, pri-miRNA 및/또는 pre-miRNA 및/또는 miRNA의 발현, 양 및/또는 활성을, 증가 또는 회복시킬 수 있는 화합물, 및/또는
- 심부전시 세포에서 하향 발현되거나 과소 발현되는 것으로 본원에 언급된 pri-miRNA 및/또는 pre-miRNA 및/또는 miRNA와 타겟 mRNA의 상호작용을 높일 수 있는 화합물, 및
- 필요한 개체에서, 심부전을 방지, 치료, 감소, 지연 및/또는 예방하기 위한 상기 화합물(들)의 사용 설명서를 포함한다. 상기 본원에서 심부전시 하향 또는 과소 발현되는 것으로 언급된 pri-miRNA 및/또는 pre-miRNA 및/또는 miRNA, 또는 이의 기능성 부분 또는 유도체는, 바람직하게는 벡터내에 존재한다. 또한, 전술한 화합물들 중 임의의 것을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 벡터도 사용할 수 있다. 상기 벡터는, 바람직하게는, 바이러스 벡터, 가장 바람직하게는, 레트로바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 아데노-부속 바이러스 벡터 또는 렌티바이러스 벡터를 포함한다. 일 구현예에서, AAV9 벡터를 사용한다.
이에, 본 발명은,
- 본원에서 심부전시 하향 또는 과소 발현되는 것으로 언급된 pri-miRNA 및/또는 pre-miRNA 및/또는 miRNA, 또는 이의 기능성 부분 또는 유도체, 및/또는
- 심부전시 세포에서 하향 또는 과소 발현되는 것으로 본원에서 언급된 miRNA의 발현, 양 및/또는 활성을 증가 또는 회복시킬 수 있는 화합물을 코딩하는 핵산 서열, 및/또는
- 심부전시 하향 또는 과소 발현되는 것으로 본원에서 언급된 miRNA와 타겟 mRNA와의 상호작용을 높일 수 있는, 화합물을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 벡터를 추가로 제공한다.
바람직한 일 구현예에서, 상기 벡터는
- miR-191, miR-30e, miR-744, miR-142-3p 및 solexa-2952-306 중 하나 이상, 또는 이의 pre- 또는 pri-miRNA, 또는 이의 기능성 부분 또는 유도체, 및/또는
- 세포에서, miR-191, miR-30e, miR-744, miR-142-3p 및 solexa-2952-306 중 하나 이상의 발현, 양 및/또는 활성을 증가 또는 회복시킬 수 있는 화합물을 코딩하는 핵산 서열, 및/또는
- miR-191, miR-3Oe, miR-744, miR-142-3p 및 solexa-2952-306 중 하나 이상의 것의 타겟 mRNA와, miR-191, miR-30e, miR-744, miR-142 및 solexa-2952-306과의 상호작용을 높일 수 있는 화합물을 코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 이러한 벡터는 심부전 방지에 특히 적합하다.
본 발명에 따른 벡터는 바람직하게는 레트로바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 아데노-부속 바이러스 벡터 또는 렌티 바이러스 벡터를 포함한다. 일 구현예에서, 상기 벡터는 AAV9 벡터를 포함한다.
본 발명에 따른 벡터의 전술한 핵산 서열들 중 임의의 서열은, 형질감염 후 상기 핵산이 발현되도록, 바람직하게는 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 상기 프로모터는, 바람직하게는 포유류 세포에서의 발현에 적합한다. 특히 바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 벡터는, 심부전(의 위험)을 방지하도록, 심장 세포에서의 발현에 적합하다. 이럴 경우, 상기 벡터는 바람직하게는 심장 세포에서의 발현에 저갑한 프로모터를 포함한다. 그러나, 다른 구현예에서, 본 발명에 따른 벡터는 통상적인(ubiquitous) 프로모터를 포함한다. 본 발명에 따른 벡터의 (하나 이상의) 핵산의 발현이 뜻대로 조절되도록 유도성 프로모터를 사용하는 것이 유익하다. 유도성 프로모터에 대한 비제한적인 예로는 심근세포 특이적인 프로모터인, 심장 트로포닌과 알파 미오신 중쇄가 있다. 일 구현예에서, 심장 섬유모세포 특이적인 프로모터를 사용할 수 있다.
본 발명에 따른 벡터는, 특히 치료에 적합하다. 이에, 본 발명은, 심부전의 방지, 치료, 감소, 지연 및/또는 예방용 약제 및/또는 예방제의 제조에 있어서의, 전술한 벡터의 용도를 제공한다.
또한, 본 발명에 따른 벡터를 치료학적 함량으로 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 개체에서 심부전을 방지, 치료, 감소, 지연 및/또는 예방하는 방법을 제공한다. 상기에서 언급한 바와 같이, 상기 벡터는 바람직하게는 레트로바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 아데노-부속 바이러스 벡터 또는 렌티 바이러스 벡터를 포함한다. 일 구현예에서, AAV9 벡터가 사용된다. 본 발명에 따른 벡터를 포함하는, 분리된 또는 재조합 세포도 본원에서 함께 제공한다.
시험관내에서 pri-miRNA 및/또는 pre-miRNA 및/또는 miRNA를 가진 세포도 제공할 수 있다. 이러한 세포는 특히 검색 목적에 적합하다. 또한, 이러한 세포는 치료법에 적합하다. 예컨대, miR-191, miR-30e, miR-744, miR-142-3p 및 solexa-2952-306 중 1종 이상을 과다 발현하는 세포는, 심부전 위험을 낮추기 위해 개체에 투여될 수 있다. 따라서, 심부전 방지, 치료, 감소, 지연 및/또는 예방하기 위한 약제 및/또는 예방제의 제조에 있어서의, miR-191, miR-3Oe, miR-744, miR-142-3p 및 solexa-2952-306, 또는 이의 기능성 부분 또는 유도체 중 하나 이상을 과다 발현할 수 있는 분리된 화합물의 용도를 제공한다. 다른 구현예에서, 본원에서 심부전을 앓고 있는 개체에서 과다 발현되는 것으로 언급된, miRNA의 타겟 mRNA에 의해 코딩되는 1종 이상의 단백질을 과다 발현할 수 있으며, 바람직하게는 배출할 수 있는 분리된 세포의 용도도 고려한다.
본원에 언급된 화합물들 중 하나 또는 화합물들의 조합을 약학적으로 허용가능한 담체, 희석제 또는 부형제와 함께 포함하는, 심부전 예방 및/또는 치료가 가능한 약학 조성물도 본 발명에서 제공한다.
본 발명에 따른 약학 조성물은, 본원에서 언급된 바와 같이 하향 또는 과소 발현이 심부전과 관련있는, miRNA의 pri-miRNA 및/또는 pre-miRNA 및/또는 miRNA, 또는 이의 기능성 부분 또는 유도체, 및/또는
- 세포에서 상기 miRNA의 발현, 양 및/또는 활성을 증가 또는 회복시킬 수 있는 화합물, 및/또는
- 상기 miRNA와 타겟 mRNA의 상호작용을 높일 수 있는 화합물, 및/또는
- 세포에서 상기 miRNA를 과다 발현할 수 있는, 본 발명에 따른 벡터, 및/또는
- 상기 miRNA, 또는 이의 기능성 부분 또는 유도체를 발현시킬 수 있는 세포, 및/또는
- 이의 상향 조절 또는 과다 발현이 심부전과 관련있는 miRNA의 타겟 mRNA에 의해 코딩되는 단백질, 또는 상기 단백질을 발현할 수 있는 벡터나 세포를,
약학적으로 허용가능한 담체, 희석제 또는 부형제와 함께 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은, 본 발명에 따른 약학 조성물을 치료량으로 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 개체에서 심부전을 방지, 치료, 감소, 지연 및/또는 예방하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은
- 이의 상향 조절 또는 하향 조절이 본원에서 언급된 바와 같이 심부전과 관련있는, pri-miRNA 및/또는 pre-miRNA 및/또는 miRNA, 또는 이의 기능성 부분 또는 유도체 중 하나 이상을 포함하는, 외인성 핵산 서열, 및/또는
- 이의 상향 조절 또는 하향 조절이 본원에서 언급된 바와 같이 심부전과 관련있는 miRNA, 또는 이의 기능성 부분 또는 유도체의 발현, 양 및/또는 활성을, 세포에서, 증가 또는 저해시킬 수 있는, 화합물을 코딩하는, 외인성 핵산 서열, 및/또는
- 이의 상향 조절 또는 하향 조절이 본원에서 언급된 바와 같이 심부전과 관련있는 miRNA과, 타겟 mRNA의 상호작용을 높일 수 있는 화합물을 코딩하는, 외인성 핵산 서열을 포함하는, 인간을 제외한 동물을 제공한다.
상기 인간을 제외한 동물은 바람직하게는 포유류를 포함한다. 바람직한 일 구현예에서, 상기 인간을 제외한 동물은, 토끼, 염소, 소, 양 또는 원숭이 등의 실험 동물을 포함한다. 본 발명에 따른, 벡터, 분리된 세포 및/또는 약학 조성물을 갖춘, 인간을 제외한 동물도 제공한다. 본 발명에 따른 인간을 제외한 동물은, 특히 본원에서 언급된 바와 같이 심부전시에 상향조절되는 miRNA의 발현, 양 및/또는 활성을 저해 또는 낮출 수 있는, 후보 화합물의 탐색, 검출 및/또는 동정에 유용하다. 또한, 이러한 인간을 제외한 실험 동물은 특히 타겟 mRNA와 대응되는 miRNA 간의 상호작용을 낮출 수 있는 후보 화합물의 탐색, 검출 및/또는 동정에 유용하다. 그래서, 본 발명에 따른 인간을 제외한 실험 동물은, 특히 심부전을 유발 또는 증대시킬 수 있는 후보 화합물의 탐색, 검출 및/또는 동정에 유용하다. 만일 후보 화합물이 이러한 특성을 가지는 것으로 나타나면, 인간 개체에 대한 투여는 금하는 것으로 권고한다.
본 발명에 따른 치료 방법에서, 개체는 바람직하게는 포유류, 가장 바람직하게는 인간이며, 본원에서 언급되는 miRNA는 바람직한 구현예에서 호모 사피엔스(hsa) miRNA를 지칭한다.
또다른 구현예에서, 본 발명은 심부전을 방지, 치료, 감소, 지연 및/또는 예방할 수 있는 후보 화합물의 탐색, 검출 및/또는 동정 방법을 제공한다. 이러한 구현예에서, 후보 화합물들은, 통상적으로, 하향 조절이 심부전과 관련있는 miRNA의 발현, 양 및/또는 활성을 증가시키는 잠재력, 상향 조절이 심부전과 관련있는 miRNA의 발현, 양 및/또는 활성을 낮추는 잠재력, 또는 본원에 언급된 바와 같이 비정상적인 miRNA와 관련된 비정상적인 단백질 발현의 작용을 상쇄시키는 능력에 대해 스크리닝된다. 후보 화합물이 이러한 특성을 가지고 있는 것으로 나타난다면, 이 화합물은 심부전을 상쇄 또는 예방할 수 있다. 이에, 본 발명은,
- 상기 후보 화합물을 세포, 바람직하게는 심장 세포에 접촉하는 단계; 및
- 상기 후보 화합물이 본원에서 언급된 바와 같이 비정상적인 miRNA 발현과 관련있는 비정상적인 단백질 발현의 작용을 상기 세포에서 방지할 수 있는지를 확인하는 단계를 포함하는, 후보 화합물이 심부전을 방지, 치료, 감소, 지연 및/또는 예방하는지를 확인하는 방법을 제공한다.
바람직한 일 구현예에서, 후보 화합물은 본 발명에 따른 세포와 접촉되며, 이때, miRNA 발현 또는 활성시 후보 화합물의 효과가 보다 명확하게 가시화 되도록, miRNA(바람직하게는, 심부전에서 하향 조절되는)의 발현은 감소된다. 그러나, 또한, 본 발명에 따른 스크리닝 방법에서 당해 기술 분야에서 현재 공지된 임의의 세포 또는 인간을 제외한 동물을 사용하는 것도 가능하다. 일 구현예에서, 본 발명에 따른 인간을 제외한 동물을 사용한다.
다른 구현예에서, 후보 화합물은 본원에 언급된 바와 같이 타겟 mRNA와 miRNA, 또는 이의 기능성 부분 또는 유도체의 상호작용을 높이는 능력에 대해 탐색한다. 후보 화합물은 하향 조절이 심부전과 관련있는 miRNA와 관련하여 이러한 특성을 가지는 것으로 나타나는 경우, 이 화합물은 심부전을 상쇄 또는 예방할 수 있다. 따라서, 본 발명은,
- 후보 화합물을 세포, 바람직하게는 심장 세포에 접촉시키는 단계, 및
- 상기 후보 화합물이 mRNA와 miR-191, miR-3Oe, miR-744, miR-142-3p 및 solexa-2952-306, 또는 이의 기능성 부분 또는 유도체 중 하나 이상과의 상호작용을 상기 세포내에서 증가시킬 수 있는지를 확인하는 단계를 포함하는, 후보 화합물이 심부전을 방지, 치료, 감소, 지연 및/또는 예방할 수 있는지를 확인하는 방법을 제공한다.
바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 심부전을 앓고 있는 개체 또는 심부전 발병 위험이 있는 개체의 진단 방법은, (a) miR-423-5p, miR-191*, miR-15b, miR-1228*, miR-181a, miR-18a*, miR-107, miR-299-3p, miR-342-3p, miR-652, miR-675, miR-129-5p, miR-18b*, miR-1254, miR-622, HS_202.1, solexa-3927-221, miR-191, miR-302d, miR-30e, miR-744, miR-142-3p 및/또는 solexa-2952-306 중에서 선택되는 하나 이상의 miRNA, 또는 이의 전구체 microRNA (pre-miRNA) 또는 microRNA 1차 전사체의 수준을 결정하는 단계, 및 (b) 단계 (a)에서 결정된, 상기 하나 이상의 유전자 마커의 수준을 기초로, 개체가 심부전을 앓고 있는지 또는 심부전 발병 위험성이 있는지를, 진단하는 단계를 포함한다. 바람직한 miRNA는 miR-423-5p이다.
추가적인 바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 방법은, miR-423-5p, miR-191*, miR-15b, miR-1228*, miR-181a, miR-18a*, miR-107, miR-299-3p, miR-342-3p, miR-652, miR-675, miR-129-5p, miR-18b*, miR-1254, miR-622, HS_202.1, solexa-3927-221, miR-191, miR-302d, miR-30e, miR-744, miR-142-3p 및/또는 solexa-2952-306, 또는 이의 전구체 microRNA (pre-miRNA) 또는 microRNA 1차 전사체로부터 선택되는 2종 이상의 miRNA, 예컨대, 2종, 3종, 4종, 5종, 6종, 7종, 8종, 9종, 10종, 15종, 20종의 miRNA, miR-423-5p, miR-191*, miR-15b, miR-1228*, miR-181a, miR-18a*, miR-107, miR-299-3p, miR-342-3p, miR-652, miR-675, miR-129-5p, miR-18b*, miR-1254, miR-622, HS_202.1, solexa-3927-221, miR-191, miR-302d, miR-30e, miR-744, miR-142-3p 및/또는 solexa-2952-306로부터 선택되는 모든 miRNA, 또는 이의 전구체 microRNA (pre-miRNA) 또는 microRNA 1차 전사체의 수준을 결정하는 단계를 포함한다.
바람직한 구현예에서, 상기 2종 이상의 miRNA는 miR-423-5p 및 miR-191*, miR-423-5p 및 miR-15b, miR-423-5p 및 miR-1228*, miR-423-5p 및 miR-181a, miR-423-5p 및 miR-18a*, miR-423-5p 및 miR-107, miR-423-5p 및 miR-299-3p, miR-423-5p 및 miR-342-3p, miR-423-5p 및 miR-652, miR-423-5p 및 miR-675, miR-423-5p 및 miR-129-5p, miR-423-5p 및 miR-18b*, miR-423-5p 및 miR-1254, miR-423-5p 및 miR-622, miR-423-5p and HS_202.1, miR-423-5p 및 miR-191, miR-423-5p 및 miR-302d, miR-423-5p 및 miR-30e, miR-423-5p 및 miR-744, miR-423-5p 및 miR-142-3p, miR-423-5p 및 solexa-2952-306, 또는 miR-423-5p 및 solexa-3927-221로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명에 따른 바람직한 진단 및/또는 예후 예측법은, 심부전 진단 및/또는 예후 예측에 사용될 수 있는, 하나 이상의 바이오마커의 검출을 추가로 포함한다. 이들 바이오마커는, 바람직하게는, C-반응성 단백질 등의 염증 마커 및 인터루킨-6 및 종양 괴사 인자(TNF) 등의 염증 사이토카인; 혈장 및 뇨내, 저밀도 지단백질, 말론디알데하이드 및 마이엘로페록시다제 및 이소프로스탄 수준 등의 산화적 스트레스의 표시자; 프로펩타이드 프로콜라겐 I형 및/또는 프로펩타이드 프로콜라겐 III 형 등의, 심실의 세포외 매트릭스의 리모델링에 대한 마커; 노르에피네프린 및 엔도텔린-1의 혈장 수준 등의 신경호르몬; 심장 트로포닌 T 및 I 등의 심근 세포 손상에 대한 마커; 갈렉틴-3 등의 심장 리모델링 및 섬유증의 마커, 및 나트륨뇨 펩타이드 BNP 및 N-말단 프로-뇌 나트륨뇨 펩타이드(NT-pro-BNP), 아드레노메둘린 및 ST2, 인터루킨-1 수용체 패밀리에 속하는 구성원 등의, 심근 세포 스트레스 마커를 포함한다. 또한, 본 발명에 따른 보다 바람직한 진단 및/또는 예후 예측 방법은, 예컨대 심전도, 심장초음파, 및/또는 심장 자기 공명 이미지(CMR) 등의 통상적인 방법을 포함한다.
추가적인 바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 진단 및/또는 예후 예측 방법의 결과는, 심부전을 앓고 있거나 또는 심부전 발병 위험이 있는 개체의 치료 방법을 적어도 부분적으로 확정한다. 가능한 치료는, 나트륨 섭취 감소, 비만 개체의 체중 감소, 및/또는 금연 등의 식이적 조처(dietary measure); 안지오텐신 변환 효소 저해제 및/또는 베타-아드레노셉터 길항제 등의 약물의 처방; 및/또는 혈관 재생 시술, 승모판 수술, 심실 재건 및 심장 이식 등의 침습적인 시술을 포함한다. 치료의 선택은, 적어도 부분적으로, 개체로부터 수득한 샘플에서 결정되는, miR-423-5p, miR-191*, miR-15b, miR-1228*, miR-181a, miR-18a*, miK-107, miR-299-3p, miR-342-3p, miR-652, miR-675, miR-129-5p, miR-18b*, miR-1254, miR-622, HS_202.1, miR-191, miR-302d, miR-30e, miR-744, miR-142-3p, solexa-2952-306, 및 solexa-3927-221, 및 이의 전구체 microRNA (pre-miRNA) 또는 microRNA 1차 전사체로 이루어진 군으로부터 선택되는, 하나 이상의 유전자 마커의 실체 및/또는 발현 수준에 따라 결정될 수 있다.
약학 조성물 및 치료학적 용도
약학 조성물은 청구하는 발명의 폴리펩타이드, 폴리뉴클레오티드 또는 소형 분자를 포함할 수 있으며, 이들은 총체적으로 본원에서 약학 화합물로 지칭된다. 약학 조성물은, 본원에 기술된, 바이오마커 단백질, 폴리뉴클레오티드 또는 소형 분자 중 어느 하나의 치료학적 유효량을 포함할 것이다.
용어 "치료학적 유효량"은 본원에서 원하는 질환 또는 증상을 치료, 완화 또는 예방하기 위한, 또는 검출가능한 치료 또는 예방적 효능을 발휘하기 위한, 치료제의 양을 지칭한다. 이러한 효능은, 예컨대 화학 마커 또는 항원 수준에 의해 검출할 수 있다. 또한, 치료 효능은 신체 증상 감소를 포함한다. 개체에 정확한 유효량은 개체의 체격과 건강, 증상의 특성과 정도, 및 투여용으로 선택된 치료제들 또는 치료제의 조합에 따라 결정될 것이다. 따라서, 미리 정확한 유효량을 명시하는 것은 쓸모없다. 그러나, 해당 상황에서의 유효량은 임상학자의 판단내에서 이루어지며 통상적인 실험으로 정할 수 있다.
본 발명의 목적에 따라, 유효량은 투여되는 개체내 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩타이드 조성물 약 0.01 mg/kg - 50 mg/kg 또는 0.05 mg/kg - 약 10 mg/kg일 것이다.
또한, 약학 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체를 포함할 수 있다. 용어 "약학적으로 허용가능한 담체"는 폴리펩타이드, 폴리뉴클레오티드 및 그외 치료제 등의, 치료제의 투여를 위한 담체를 지칭한다. 이 용어는 조성물을 복용하는 개체에게 유해한 항체의 생산을 그 자체로는 유도하지 않으며, 과도한 독성없이 투여할 수 있는, 임의의 약학 담체를 지칭한다. 적합한 담체는 단백질, 다당류, 폴리락트산, 폴리글리콜산, 폴리머성 아미노산, 아미노산 코폴리머 및 비활성의 바이러스 입자 등의 크고 느리게 대사되는 거대 분자일 수 있다. 이러한 담체는 당해 기술 분야의 당업자에게 잘 공지되어 있다.
약학적으로 허용가능한 염, 예컨대 하이드로클로라이드, 하이드로브로마이드, 포스페이트, 설페이트 등의 미네랄 산 염; 및 아세테이트, 프로피오네이트, 말로네이트, 벤조에이트 등의 유기산의 염이 조성물에 사용될 수 있다. 약학적으로 허용가능한 부형제에 대한 철저한 검토는 Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Pub. Co., N.J. 1991)를 이용하여 수행할 수 있다.
치료 조성물내 약학적으로 허용가능한 담체는 물, 염수, 글리세롤 및 에탄올 등의 액체를 포함할 수 있다. 부가적으로, 습윤제 또는 유화제, pH 완충성 물질 등의 보조 물질은 이러한 비히클에 존재할 수도 있다. 전형적으로, 치료 조성물은, 액제 용액 또는 현탁액과 같은 주사용 제품으로서 제조되며; 주사하기 전에 액체 비히클 중의 용액 또는 현탁액으로 준비하기 적합한 고체 형태로도 제조될 수 있다. 약학적으로 허용가능한 담체의 정의에 리포좀도 포함된다.
전달 방법
일단 제형화되면, 본 발명의 약학 조성물은 (1) 개체에게 직접 투여하거나, (2) 생체외로 개체 유래의 세포에 전달하거나, 또는 (3) 재조합 단백질의 발현을 위해 시험관내로 전달할 수 있다.
조성물의 직접 전달은, 통상적으로, 피하, 복막내, 정맥내 또는 근육내 주입에 의해, 또는 조직의 간질 공간(interstitial space)에 전달함으로써, 달성할 것이다. 또한, 조성물은 신경계로 투여할 수 있다. 그외 투여 모드로는, 국소, 경구, 좌제 및 경피 적용, 니들, 및 입자 건 또는 하이포스프레이를 포함한다. 용량 처리는 단일 투약 계획 또는 다중 투약 계획일 수 있다.
생체외 전달 및 개체에 형질전환된 세포의 재-이식 방법은 당해 기술 분야에 공지되어 있으며, 예로 국제 특허 공개번호 WO 93/14778에 기술되어 있다. 생체외 이용에 유용한 세포의 예로는, 줄기 세포, 특히 조혈 줄기 세포, 림프 세포, 대식세포, 수지상 세포 또는 종양 세포가 있다.
일반적으로, 생체외 이용 및 생체내 이용 둘다에서의 핵산의 전달은, 예컨대 덱스트란-매개 형질감염, 칼슘 포스페이트 침강, 폴리브렌 매개 형질감염, 프로토플라스트 융합, 전기천공, 리포좀내 폴리뉴클레오티드(들)의 캡슐화 및 DNA의 핵내로의 직접 미세주입에 의해 달성할 수 있으며, 이들은 모두 당해 기술 분야에 잘 알려져 있다.
신체의 특정 부위에 직접 치료 조성물을 투여하는데 다양한 방법들이 이용된다. 안티센스 폴리뉴클레오티드, 서브게놈 폴리뉴클레오티드 또는 항체를 포함하는 치료 조성물을 특정 조직에 수용체-매개 타겟화된 전달도 이용된다. 수용체-매개 DNA 전달 기법은, 예컨대 Findeis et al., Trends in Biotechnol. (1993) 11:202-205; Wu et al., J. Biol. Chem. (1994) 269:542-46에 기술되어 있다.
폴리뉴클레오티드를 포함하는 약학 조성물은 유전자 치료 프로토콜에서 국소 투여를 위한 약 100 ng 내지 약 200 mg의 폴리뉴클레오티드 범위로 투여하는 것이 바람직하다. 폴리뉴클레오티드는 약 500 ng - 약 50 mg, 약 1 ㎍ - 약 2 mg, 약 5 ㎍ - 약 500 ㎍, 및 약 20 ㎍ - 약 100 ㎍의 농도 범위로 유전자 치료 프로토콜을 수행하는 동안에 사용할 수 있다. 폴리뉴클레오티드의 최종적인 효능에 필요한 용량에 영향을 미치는, 작용 방법 및 형질전환과 발현의 효능 등의 인자들도 고려한다. 넓은 면적의 조직에서 원하는 발현 수준이 높을 수록, 긍정적인 치료 결과를 위해, 예컨대 신경 말단 또는 시냅스의 다른 인접하거나 또는 가까운 조직 부위에, 연속적인 투여 프로토콜 또는 수회의 투여로 재-투여되는, 폴리뉴클레오티드의 양은 더 많거나 동량으로 요구될 수 있다. 모든 경우들에서, 임상 실험에서의 일반적인 실험으로 최적의 치료 효과에 대한 구체적인 범위를 결정할 수 있을 것이다. 유전자 치료 벡터, 특히 레트로바이러스 벡터에 대한 보다 충분한 설명은 WO 98/00542에 기술되어 있으며, 이는 원용에 의해 본 발명에 자명하게 포함된다.
본 발명은 이하 비제한적인 실시예들을 들어 설명한다.
실시예
실시예 1. 심부전 검출을 위한 순환성 바이오마커로서의 miRNA의 용도
2명의 건강한 개체와 3명의 심부전 환자로부터 혈액을 채혈하였다. 이를 15분간 1550 x g로 원심분리하여, 혈장을 수집하였다. RNA 분리를 위한 PARIS 키트(Applied Biosystems)를 제조사의 프로토콜에 따라 사용하여, 소형 RNA를 분리하였다. Illumina human miRNA Expression Profiling Panel (User card for bead chip cat#MI-501-1001, part#11297760 RevA)을 이용하여 miRNA 발현 프로파일을 수행하였다. 이는 파일롯-어레이다. 표준화(normalization)는 Genespring 소프트웨어를 이용하여 수행하였다.
총 9개의 miRNA가 심부전 환자들의 혈액에서 현저하게 상향 조절된 것으로 확인되었고, 6개의 miRNA는 하향 조절 되었다(표 1, 도 1 및 도 2 참조). 이렇게 차별적으로 조절된 miRNA는 심부전 검출용 바이오마커로서 이용할 수 있다.
표 1. 심부전 환자의 혈장내에서 차별적으로 발현되는 miRNA들
HF에서 상향 조절됨
p-value 배수 변화
HF에서 하향 조절됨
p-value 배수 변화
실시예 2. 심부전 검출을 위한 순환성 바이오마커로서의 miRNA의 용도. 한정 어레이
상기 실시예를, 이러한 새로운 스크리닝에서 특이적으로 나타난, 새로운 어레이 상에서의 miRNA의 중복 세트에 대해 반복 수행하였다. 건강한 개체 12명과 심부전 환자 12명으로부터 채혈하였다. 이를 15분간 1550 x g로 원심분리하여, 혈장을 수집하였다. RNA 분리를 위한 PARIS 키트(Applied Biosystems)를 제조사의 프로토콜에 따라 사용하여, 소형 RNA를 분리하였다. Illumina human miRNA Expression Profiling Panel을 이용하여 miRNA 발현 프로파일을 수행하였다. 표준화는 Genespring 소프트웨어를 이용하여 수행하였다.
도 4에 나타낸 어레이의 결과들은 QPCR에 의해 검증하였다. 본 실험에서 하나의 miRNA (solexa-3927-221)가 상향 조절되지만, 도 1의 파일롯 어레이 실험에서는 하향 조절되는 것으로 나타났다. QPCR 결과는, MiRNA가 심부전 환자에서 실제 상향 조절됨을 검증하였다. 나머지 miRNA들도 검증되었다.
이러한 차별적으로 조절되는 miRNA는 심부전을 검출하기 위한 바이오마커로서 이용할 수 있다.
실시예 3: 심부전을 검출하기 위한 순환성 바이오마커로서의 miRNA의 용도. 비의존성의 임상 실험을 통한 검증
방법
인간 물질의 적절한 이차 사용을 위한 의학 센터 학회 심사 위원회(Academic Medical Center institutional review board)의 포괄적인 권리 포기 하에 설명된 내용에 동의한 사람으로부터 혈장 샘플을 수득하였다. 호흡장애 관련해서는, 네덜란드에 있는 3곳의 센터가 참여하는 여러 센터들의 실험의 일부로서 혈장 샘플을 입수하였다. 기술된 실험들은 의학 학회 센터에서 입수한 샘플에 대해 수행하였다.
개체는 진단에 대한 프레이밍햄 기준을 충족시키고 순환성 NT-proBNP가 1000 ng/L 보다 높은 경우 HF 사례로 분류하였다. 임상 진단에서 HF가 배제되고, 순환성 NT-proBNP가 Januzzi et al. (Januzzi et al. 2006. Eur Heart J 27:330)에 공개된 연령-관련 컷오프 포인트 미만인 경우에는, 개체를 비-HF 사례로 분류하였다. 호흡장애에 대해 스크리닝한 환자 77명 중 총 50명이 기준을 충족시켰다.
건강한 대조군 39명과 호흡장애 개체 50명을 조사하였다. 환자 50명 중, 20명은 HF로 진단되지 않았고, 30명은 HF인 것으로 진단되었다. 사례들과 대조군 간의 miRNA 발현 수준을 스튜던트 t-검사 또는 Mann-Whitney-U-검사를 이용하여 비교하였다. 분석은 로지스틱 회귀 분석으로 수행하였다. HF 사례군을 비-HF 사례 또는 건강한 대조군과 구별하는데 있어 로지스틱 회귀 모델의 예측 확률의 다양한 컷-오프 수준에 대해 ROC(receiver-operator-characteristic) 곡선을 작성하였다. ROC 곡선 하 면적(AUC)을 추산하여, miRNA의 진단 정확성을 산정하였다. 모든 분석들은 SPSS를 이용하여 수행하였고, 모든 통계 테스트는 중복 진행하였다. 모든 분석들에서, p 값 < 0.05는 통계적으로 유의한 것으로 간주하였다.
심근 조직
특발성 DCM으로 사망한 개체로부터 사후 심근 샘플을 수득하고, 심장 요인이 아닌 요인으로 사망한 개체로부터 심근 샘플을 수득하였다. 이를 Trizol (Invitrogen)을 사용하여 전체 RNA를 추출하였다. RNA 품질을 확인한 다음, 실시간 PCR에 사용하여 miR-423-5p의 발현 수준을 평가하였다. 이 결과는 U6의 발현에 대해 표준화하여, 심근의 상대적인 miR-423-5p 발현을 평가하였다.
혈액 처리
모든 개체의 혈액은 직접적인 정맥 천자를 통해 2.7ml 소듬 사이트레이트가 든 시험관(BD Biosciences 363048)으로 채혈하였다. 개체들로부터 miRNA 어레이용으로 10.8 ml, 실시간 PCR 용으로 5.4 ml을 채혈하였다. 모든 혈액은 채혈한지 4시간 이내에 혈장 분리하기 위한 처리를 실시하였다. 혈액은 실온에서 10분간 1550 x g로 회전시켜, 처리하였다. 혈장을 조심스럽게 새로운 RNAse/DNAse 비함유 시험관으로 옮켜, -80℃에 보관하였다.
RNA 분리
miRNA 어레이용으로, 혈장 4.4 ml에서, 실시간 PCR 용으로 500 ㎕ 혈장으로부터 RNA를 분리하였다. 혈장을 얼음 위에 두어 녹인 후, mirVana PARIS 키트 (Ambion)를 제조사의 액체 샘플에 대한 프로토콜에 따라 사용하여 RNA를 분리하였다. 프로토콜을 변형시켜, 샘플을 동일 부피의 산 페놀 클로로포름으로 2번 추출하고, 컬럼은 마지막 세정 단계 후, 그리고 용출 전에 3분간 건조시켰다.
miRNA 어레이
miRNA 어레이용으로, 용출된 샘플 50 ㎕를 12 ㎕로 농축하고, 각 샘플 5 ㎕를 분석에 사용하였다. 이들 샘플에 대해 Illumina human v2 miRNA 발현 프로파일링을 수행하였다. Illumina miRNA 비드칩은 1146종의 miRNA들과 miRNA로 예측되는 기타 소형 RNA로 탐침하였다. 1,2 원 데이타를 사전-가공하고, 종합하여, 로그 변환한 후 통계 소프트웨어 패키지 R(버전 2.9.0)의 비드어레이 패키지(버전 1.12.1)를 사용하여 변위치를 표준화하였다. 차별적인 발현은 limma package (버전 2.18.3)를 이용한 중도 t-테스트를 이용하여 평가하였다. MicroRNA는, P 값이 0.05 미만인 경우, 현저하게 차별적으로 발현되는 것으로 간주하였다.
실시간 PCR
혈장 샘플의 경우, RNA 분리로부터의 용출액 중 고정된 부피 8 ㎕, 심근 조직 샘플의 경우, 투입 RNA 1 ㎍을, 역전사 반응에서 투입체로서 사용하였다. 투입 RNA를 miScript 역전사 키트 (Qiagen)를 제조사의 프로토콜에 따라 사용하여 역전사하였다. 고해상도 멜팅 마스터 (Roche)를 이용하여 실시간 PCR을 수행하였다. MgC12는 최종 농도 2.5 mmol/L로 사용하였고, 8회 희석한 cDNA 2 ㎕를 총 부피 10 ㎕로 사용하였다. 정방향 프라이머는 성숙형 miRNA 서열과 동일한 서열을 가지며 U는 모두 T로 바뀌었으며, 역방향 프라이머의 서열은 GAATCGAGCACCAGTTACGC로, 이는 miRNA의 cDNA 제조에 사용되는 RT프라이머(miScript 역전사 키트의 일부)의 어댑터 서열과 상보적이다. 실시간 PCR 반응은 다음과 같은 프로그램을 이용하여 LightCycler480 system II (Roche)로 수행하였다: 예비-인큐베이션, 10분 및 95℃ -> 40회 사이클로서, 45초간 95℃에서 변성 -> 45초간 55℃에서 어닐링 -> 45초간 72℃에서 연장. 데이타는 LinRegPCR 정량 PCR 데이타 분석 소프트웨어, 버전 11.3.3을 이용하여 분석하였다. 이 소프트웨어를 통해 추산된 miRNA의 출발 농도는, 우리의 miRNA 어레이에서 안정적으로 발현되는 내인성 miRNA인, miR-1249의 추정되는 개시 농도를 기준으로 보정하였다.
결과
HF 환자의 혈장에서의 MiRNA의 발현 프로파일
MiRNA 어레이 (Illumina 비드칩, 인간 v2 miRNA 패널)는 12명의 HF 환자와 12명의 건강한 대조군으로부터 유래된 RNA에 대해 수행하였다. 총 108종의 miRNA가 HF 환자와 대조군 간에 유의하게 차별적으로 발현되었다. 이로부터, 본 발명자들은 이후의 검증을 위해 이의 배수 변화와 가능성 수치를 기초로 16종의 miRNA를 선택하였다.
비의존성 집단에서의 후보 MiRNA의 검증(validation)
본 발명자들은, 새로운 3그룹의 개체들에서 16종의 miRNA의 발현을 검증하였다. 제1 그룹은 HF로 진단받은 호흡장애로 등록된 개체(HF 사례, n=30)로 구성되며, 제2 그룹의 개체는 호흡장애로 등록되어 있지만 임상적인 진단시 HF가 아닌 것으로 확인된 개체들이고(비-HF 사례, n=20), 제3 그룹은 건강한 대조군으로 구성된다(n=39). HF 군에서, 개체 30명 중 19명은 45% 미만의 박출 계수(EF: ejection fraction)를 보인 반면, 비-HF 군에서는, 개체 20명 중 3명이 45% 미만의 EF를 보였다. 이들 3명의 개체는 심실 기능 부전이었지만, HF로 진단하기에는 임상적 및 NTproBNP 기준에 미달되었다. miRNA의 발현 수준은 실시간 PCR로 분석하고, 어레이 분석에서 변화가 없는 것으로 확인된 miRNA인 miR-1249의 발현 수준에 대해 표준화하였다. 건강한 대조군 대비 HF 군의 miRNA 변화 배수는 도 5에 나타낸다.
후보 MiRNA의 진단 정확성
하나의 miRNA, miR-423-5p는, 성별 및 연령을 포함한 다변수 로지스틱 회귀 모델에서 HF 진단의 중요한 예측인자인 것으로 확인되었다. 도 6는, miR-423-5p가 건강한 대조군과 호흡 장애 비-HF 군 둘다와 비교하였을 때 HF 군에서 특이적으로 증가됨을 보여준다. miR-423-5p는 건강한 대조군으로부터 HF를 구분하였으며, AUC는 0.91(신뢰 구간 95%, 0.84 - 0.98)이다. miR-423-5p의 예측력은, HF 군 및 비-HF 군을 비교하였을 때, 호흡장애 등록군내에서도 높았다 (AUC, 0.83; 95% 신뢰 구간, 0.71 - 0.94). 순환성 miR-423-5p는 NT-proBNP 및 EF와 상관 관계가 있었다(각각 스피어만 상관 계수: 0.43, 확률 값: 0.002; 스피어만 상관 계수: 0.34, 확률 값: 0.023). miR-423-5p의 발현은 정상 인간 심장과 비교하여 결함이 있는 인간 심근에서 3배 증가하였다(도 7).
miR-423-5p 외에도, 그외 6종의 miRNA들 (miR-18b*, miR-129-5p, miR-1254, miR-675, HS_202.1 및 miR-622)이 HF 군에서 증가되는 것으로 확인되었으며, miR-18b*와 miR-675는 도 6에 도시한다. 그러나, 호흡장애 집단내에서, miR-18b*는 비-HF 군에서 약간 증가하지만, miR-675는 비-HF 군에서 HF 군과 동일한 수준으로 한층 더 상향 조절된다. 이러한 결과는, HF 군을 건강한 대조군과 비교하여 먼저 동정된 일부 miRNA들이 실제 호흡 장애가 HF에 의해 야기되지 않았을 때 증가되는 것으로 나타나며, 따라서 HF에 덜 특이적임을 설명한다. 그러나, NT-proBNP 역시 우심실 과부하에 기인한 폐 질환과 더불어 약간 증가될 수 있어, miR-18b*와 같은 miRNA도 여전히 HF의 유용한 바이오마커일 수 있음을 알 수 있다.
후보 miRNA가 질병 중증도 또는 병인과 관련있는지를 조사하기 위해, HF 환자를 EF, NYHA 클래스 또는 기저 병인에 따라 분류하였다. EF가 < 45%인 개체가, EF > 45%인 개체에 비해, 순환성 miR-423-5p 및 miR-18b*의 수준이 더 높았지만, 통계적 유의성에는 이르지 않았다. miR-423-5p와 또한 miR-18b*와 같은 다른 miRNA들의 순환성 수분은 NYHA 클래스 증가에 따라 증가하였다. 마지막으로, 일부 후보 miRNA (miR-423-5p 및 miR-675가 포함됨, miR-18b*는 아님)들은 HF의 비-죽상경화성 형태들과 비교하여, HF의 죽상경화성 형태에서 더 많았다(도 8).
Claims (13)
- a) 개체에서 수득되는 체액에서, miR-423-5p, 및 이의 전구체 microRNA (pre-miRNA) 또는 microRNA 1차 전사체로 이루어진 군으로부터 선택되는 miRNA인, 하나 이상의 유전자 마커의 수준을 측정하는 단계;
b) 단계 a)에서 측정된 하나 이상의 유전자 마커의 수준을 기초로, 상기 개체가 심부전을 앓고 있는지 또는 심부전 발병 위험성이 있는지에 대한 진단에 필요한 정보를 제공하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는,
심부전을 앓고 있는 개체 또는 심부전 발병 위험이 있는 개체의 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법. - 제1항에 있어서, 상기 개체에서,
miR-423-5p, 또는 이의 전구체 microRNA (pre-miRNA) 또는 microRNA 1차 전사체의 발현, 양 또는 활성이, 심부전을 앓고 있지 않거나 심부전 발병 위험이 없는 대조 개체에 비해, 상향 조절된 경우에,
상기 개체를 심부전을 앓고 있는 것으로 진단하거나, 또는 심부전 발병 위험이 있는 것으로 예측하는 것을 특징으로 하는, 방법. - 제2항에 있어서, 상기 방법은,
개체에서 수득되는 체액에서, miR-191, miR-30e, miR-744, miR-142-3p 및 solexa-2952-306으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 miRNA, 또는 이의 전구체 microRNA (pre-miRNA) 또는 microRNA 1차 전사체의 수준을 측정하는 단계를 더욱 포함하며,
상기 개체에서,
miR-191, miR-30e, miR-744, miR-142-3p 또는 solexa-2952-306, 또는 이의 전구체 microRNA (pre-miRNA) 또는 microRNA 1차 전사체의 발현, 양 또는 활성이, 심부전을 앓고 있지 않거나 심부전 발병 위험이 없는 대조 개체에 비해, 하향 조절된 경우에,
상기 개체를 심부전을 앓고 있는 것으로 진단하거나, 또는 심부전 발병 위험이 있는 것으로 예측하는 것을 특징으로 하는, 방법. - 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 개체에서 수득되는 체액이 혈액 샘플인 방법.
- 심부전을 앓고 있는 개체 또는 심부전 발병 위험이 있는 개체를 진단하기 위한 부품 키트(kit of parts)로서
- miR-423-5p, 및 이의 전구체 microRNA (pre-miRNA) 또는 microRNA 1차 전사체로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 miRNA에 특이적으로 결합할 수 있는, 하나 이상의 화합물; 및
- 제1항 또는 제2항에 따라 심부전을 앓고 있는 개체 또는 심부전 발병 위험이 있는 개체를 진단하기 위한, 상기 화합물의 사용 설명서
를 포함하는 것을 특징으로 하는, 심부전을 앓고 있는 개체 또는 심부전 발병 위험이 있는 개체를 진단하기 위한 부품 키트. - 삭제
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