KR101501562B1 - 췌장암 진단 마커를 검출하는 방법 - Google Patents

췌장암 진단 마커를 검출하는 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 췌장암 암줄기세포 및 췌장암에 대한 신규한 분자 마커를 이용하여 췌장암 치료제의 스크리닝 방법을 제공한다. 본 발명의 췌장암 치료제 타겟은 췌장암 암 줄기세포에 특이적으로 작용하는 치료제 후보물질을 스크리닝 하는데 매우 유용하다. 본 발명은 췌장암 치료용 약제학적 조성물은 제공하며, 본 발명의 췌장암 치료용 약제학적 조성물은 췌장암 암줄기세포의 억제 또는 사멸을 효과적으로 유도하므로 췌장암의 전이를 예방하고 항암치료 내성을 극복하여 췌장암을 근본적으로 치료할 수 있는 장점이 있다. 또한, 본 발명의 췌장암 치료용 약제학적 조성물은 mRNA를 직접적인 타겟으로 하는 것이 아니라, mRNA 레벨을 조절할 수 있는 miRNA 조절을 통해 질병을 치료하므로 안전하다.

Description

췌장암 진단 마커를 검출하는 방법{Method for Detecting Diagnostic Marker of Pancreatic Cancer}
본 발명은 췌장암 진단 마커를 검출하는 방법에 관한 것이다.
오랫동안 통설로 여겨져 온 암발생 모델은 클론진화설(clonal evolution)로서, “종양은 정상세포가 돌연변이를 거쳐 비정상적인 딸세포를 낳고, 이 딸세포들 역시 돌연변이를 일으켜 유전적으로 다양한 암세포의 덩어리를 형성한다”는 것이다. 그러나 최근 이 모델을 반박하는 암줄기세포(cancer stem cell 또는 tumor initiating cell)설이 주목을 받고 있다. 암줄기세포설의 요체는 인체를 구성하는 장기에는 각기 고유한 성체 줄기세포가 있어서, 장기가 손상을 받을 때 장기를 재생하고 유지하는 역할을 하듯이, 암 조직에도 일반 장기처럼 암 조직을 유지하는 구실을 하는 암줄기세포가 존재하며, 이것이 암의 최초 시작에 관여할 것으로 추측되고 있을 뿐 아니라, 암 치료 후 줄어든 암세포를 재생하는 데 관여함으로써 암의 재발이나 전이 및 항암치료 내성 유발에 깊은 영향을 미친다는 것이다. 따라서 암을 근본적으로 치료하기 위해서는, 기존의 암 치료와 같이 암조직의 대부분을 차지하는 일반 암세포만을 표적으로 삼는 것도 중요하지만, 암 조직의 극히 일부만 차지하면서도 암의 발병과 유지, 재발에 핵심 구실을 하는 암줄기세포에 초점을 맞춰야 한다. 최근에, 실제로 유방암, 뇌종양, 전립선암, 간암 및 췌장암 등의 몇몇 악성 종양 내에 암줄기세포의 존재가 보고 및 확인되었다. 췌장관 선암종은 실질적으로 치료-저항성이 있는 대단히 공격적인 악성종양으로 알려져 있다. 따라서, 암줄기세포에 대한 더 많은 이해는 조기 진단을 위한 진단용 마커 개발뿐만 아니라, 화학-방사선 저항성 췌장암을 치료하는 데에도 도움이 될 것이다.
마이크로 RNA(micro RNA 또는 miRNA)는 발생, 분화, 증식, 보존 및 아폽토시스 등 다양한 생물학적 과정을 조절한다. 마이크로 RNA는 일반적으로 타겟 mRNA를 불안정하게 하거나, 번역을 방해함으로써 타겟 mRNA를 코딩하는 유전자의 발현을 조절한다. 최근 들어, miRNA와 암줄기세포의 관련성에 관한 증거가 보고되었다. let-7, mir-200 및 mir-181을 포함하는 몇몇 miRNA는 다양한 기관의 암줄기세포 내에서 조절기능을 갖는다. 그러나, 췌장암을 포함하는 다른 암 내 miRNA는 아직 보고된 바 없다.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
본 발명자들은 췌장암 암 줄기세포 특성에 기초한 췌장암의 치료용 타겟 및 췌장암 암 줄기세포에 대한 신규 바이오마커를 발굴하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 본 발명자들은 췌장암 암 줄기세포에서 특이적으로 발현되는 마이크로 RNA들이 췌장암 진단 마커가 될 수 있음을 발견하였다. 더불어, 본 발명자들은 발굴된 바이오 마커들이 췌장암 암 줄기세포 생물학적 특성에 근거하여 췌장암을 진단, 특히 조기 진단할 수 있고, 예후를 판정할 수 있는 마커 및 향후 치료표적에 사용할 수 있는 표지자임을 규명함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 목적은 암줄기세포를 가지는 췌장암 진단 마커를 검출하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 췌장암 치료제의 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 췌장암줄기세포에서 특이적으로 다르게 발현하는 췌장암 치료용 마이크로 RNA를 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 마이크로 RNA를 이용한 췌장암 치료용 약제학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명 및 청구범위에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명의 일 다른 양태에 따르면, 본 발명은 암줄기세포를 가지는 췌장암 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여 인간의 췌장 세포 시료에 있는 서열목록 제1서열 내지 제3서열로 구성된 군으로부터 선택되는 뉴클레오타이드의 발현 수준을 측정하는 방법을 통해 암줄기세포로를 가지는 췌장암 진단 마커를 검출하는 방법을 제공한다.
본 발명자들은 췌장암 암 줄기세포 특성에 기초한 췌장암의 치료용 타겟 및 췌장암 암 줄기세포에 대한 신규 바이오마커를 발굴하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 본 발명자들은 췌장암 암 줄기세포에서 특이적으로 발현되는 마이크로 RNA들이 췌장암 진단 마커가 될 수 있음을 발견하였다. 더불어, 본 발명자들은 발굴된 바이오 마커들이 췌장암 암 줄기세포 생물학적 특성에 근거하여 췌장암을 진단, 특히 조기 진단할 수 있고, 예후를 판정할 수 있는 마커 및 향후 치료표적에 사용할 수 있는 표지자임을 규명하였다.
본 발명의 서열목록 제1서열은 마이크로 RNA인 hsa-miR-202, 제2서열은 hsa-miR-194, 제3서열은 hsa-miR-23b의 뉴클레오타이드 서열이다.
암줄기세포를 가지는 췌장암 진단 마커를 검출하는 본 발명의 방법은 인간의 췌장 세포 시료로부터 서열목록 제1서열 내지 제3서열로 구성된 군으로부터 선택되는 뉴클레오타이드의 발현 수준을 측정하고, 상기 측정된 발현 수준을 정상 대조군 시료의 뉴클레오타이드 발현 수준과 비교하는 방법으로 수행된다.
상기 인간의 췌장 세포 시료는 바람직하게는 췌장암 세포 시료일 수 있다. 본 발명의 암줄기세포를 가지는 췌장암 진단 마커를 검출하는 방법을 췌장암 환자의 세포 시료를 가지고 수행하는 경우, 시료를 채취한 환자의 췌장암 예후를 판단할 수 있게 된다.
상기 정상 대조군 시료란, 암에 걸리지 않은 인간으로부터 채취한 췌장 세포, 암이 없는 정상 췌장 세포, 암줄기세포를 포함하지 않는 것으로 이미 확인된 시료로서, 예컨대 비 점착성 배양 조건 하에서 구를 형성하지 않는 등 암줄기세포를 포함하지 않는 것으로 확인된 췌장암 세포주 시료, 또는 악성이 아닌 것으로 확인된 췌장암 환자의 암 세포 시료 등을 포함하며, 반드시 이에 제한되는 것은 아니다. 바람직하게는 암줄기세포를 포함하지 않는 것으로 확인된 췌장암 세포주 시료 또는 악성이 아닌 것으로 확인된 췌장암 환자의 암 세포 시료일 수 있다. 상기 정상 대조군 시료 내 서열목록 제1서열 내지 제3서열로 구성된 군으로부터 선택되는 뉴클레오타이드의 발현 수준도 상술한 바와 동일한 방법을 사용하여 측정할 수 있다.
상기 서열목록 제1서열 내지 제3서열로 구성된 군으로부터 선택되는 뉴클레오타이드의 발현 수준을 측정하기 위한 분석 방법으로는 당업계에 공지된 방법을 사용할 수 있으며, 예컨대 RT-PCR, 경쟁적 RT-PCR, 실시간 RT-PCR, RNase 보호 분석법(RNase protection assay), 노던블롯팅(Nothern blotting), DNA 칩 등이 있으나 반드시 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 발현수준 측정은 상기 뉴클레오타이드에 특이적인 프라이머를 이용하는 역전사효소 중합효소반응법을 이용하여 수행된다. 상기의 역전사효소 중합효소반응은 반응 후 전기영동하여 밴드 패턴과 밴드의 두께를 확인함으로써 상기 뉴클레오타이드의 발현 여부와 정도를 확인 가능하고 이를 대조군과 비교함으로써, 췌장암줄기세포를 간편하게 검출할 수 있다.
본 발명의 다른 구현예에서, 상기 발현수준 측정은 DNA 칩을 이용하여 수행된다. 상기 DNA 칩은 상기 제1서열 내지 제3서열로 구성된 군으로부터 선택되는 뉴클레오타이드 또는 그 단편에 해당하는 핵산이 유리 같은 기판에 고밀도로 부착되어 있는 DNA 칩을 이용하는 것으로서, 시료에서 총 RNA를 분리하고, 그 말단 또는 내부를 형광 물질로 표지된 cDNA 프로브를 조제하여, DNA 칩에 혼성화시킨 다음 췌장암줄기세포 포함여부를 간단하게 판독할 수 있다.
상기 검출 방법들을 통하여, 정상 대조군에서의 miRNA 발현량과 암줄기세포 검출 대상인 췌장암 환자에서의 miRNA 발현량을 비교할 수 있으며, 상기 발현량의 유의한 변화 여부를 판단하여 췌장암 환자 시료 내 암줄기세포 포함여부를 진단할 수 있다.
구체적으로 서열목록 제1서열의 경우, 환자 시료의 상기 뉴클레오타이드 발현 수준이 정상 대조군 시료의 뉴클레오타이드 발현 수준의 70% 미만인 경우 췌장암 암줄기세포를 포함하는 것으로 판단한다. 반면, 서열목록 제2서열 및 제3서열의 경우는, 환자 시료의 상기 뉴클레오타이드 발현 수준이 정상 대조군 시료의 뉴클레오타이드 발현 수준의 150% 이상인 경우 췌장암 암줄기세포를 포함하는 것으로 판단한다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 서열목록 제1서열의 뉴클레오타이드를 발현하는 세포에 시험물질을 접촉시키는 단계; 및 (b) 상기 시험물질이 상기 뉴클레오타이드의 발현에 미치는 영향을 분석하는 단계를 포함하며, 상기 시험물질이 상기 뉴클레오타이드의 발현을 증가시키면 암 치료제로 판정하는 췌장암 치료제의 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 서열목록 제2서열 및 제3서열로 구성된 군으로부터 선택되는 뉴클레오타이드를 발현하는 세포에 시험물질을 접촉시키는 단계; 및 (b) 상기 시험물질이 상기 뉴클레오타이드의 발현에 미치는 영향을 분석하는 단계를 포함하며, 상기 시험물질이 상기 뉴클레오타이드의 발현을 감소시키면 암 치료제로 판정하는 췌장암 치료제의 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명자들은 상기 서열목록 제1서열의 뉴클레오타이드의 경우, 일반 췌장 세포와 달리 췌장암 암줄기세포 내에서 그 발현이 현저히 감소한다는 사실을 발견하였다. 마이크로 RNA인 상기 뉴클레오타이드 발현의 현저한 감소는 타겟 RNA 발현의 현저한 증가로 이어지게 된다. 일반 췌장세포와는 달리 췌장암 암줄기세포 내에서만 타겟 RNA 발현이 특이적으로 현저하게 증가한다는 것은 그것이 코딩하고 있는 단백질이 암줄기세포의 생존에 있어 필수적인 요소임을 지시하며, 이의 발현을 차단하는 물질은 암줄기세포의 성장 억제 및 사멸을 유도함으로써 췌장암의 근본적 치료에 도움이 되는 물질, 즉 췌장암 치료제로 판정된다.
반면, 상기 서열목록 제2서열 및 제3서열로 구성된 군으로부터 선택되는 뉴클레오타이드는, 일반 췌장세포와 달리 췌장암 암줄기세포 내에서만 그 발현이 특이적으로 현저히 증가하는 뉴클레오타이드로서, 동일한 원리에 의하여 시험물질이 상기 뉴클레오타이드의 발현을 감소시키면 암 치료제로 판정된다.
상기 본 발명의 스크리닝 방법에 의해 동정되는 췌장암 치료제는 암 조직의 대부분을 차지하는 일반 암세포만를 타겟으로 하는 것이 아니라, 암 조직의 극히 일부만 차지하면서도 암의 발병과 유지, 재발에 핵심 구실을 하는 췌장암 암줄기세포를 그 타겟으로 하므로, 췌장암의 근본적인 치료를 가능하게 한다. 특히 어떤 특정 암줄기세포 유전자를 차단하여도 암을 실질적으로 성장 억제를 하기가 쉽지 않은 현실에서, 마이크로 RNA가 여러 분자들을 조절한다는 점을 고려한다면, 췌장암 암줄기세포에서 특이적으로 발현하는 상기 마이크로 RNA를 조절하는 것은 암줄기세포를 공략하기 위한 매우 현실적인 방법이라 할 것이다. 또한, 상기 방법은 항암제 내성 또는 방사선 치료 내성 극복을 위해 사용될 수 있다는 점에서도 그 가치가 크다고 할 것이다.
본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 서열목록 제1서열의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 마이크로 RNA 또는 그의 단편의 약제학적 유효량; 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 췌장암 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.
상기 서열목록 제1서열에 해당하는 마이크로 RNA는 췌장암줄기세포 내에서 특이적으로 발현이 감소하는 특성을 나타내며, 이들 마이크로 RNA를 췌장암줄기세포에 주입하는 경우 췌장암줄기세포의 억제 및 사멸을 유도한다. 즉 본 발명의 췌장암 치료용 조성물은 췌장암줄기세포의 성장억제, 분화억제 또는 사멸을 유도하는 것을 특징으로 한다. 또한, 본 발명의 췌장암 치료용 조성물은 췌장암 줄기세포를 그 타겟으로 하여 췌장암의 근본적 치료를 가능하게 하므로 화학항암요법 내성 극복 또는 방사선 치료 내성극복을 위해 효과적으로 사용될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 본 발명의 조성물은 상기 마이크로 RNA 자체를 포함할 수도 있으나 그의 단편을 포함할 수도 있으며, 상기 마이크로 RNA의 단편은 상기 마이크로 RNA의 종자서열(seed sequence)을 포함하는 폴리뉴클레오타이드인 것을 특징으로한다.
본 명세서에 사용되는 용어 “종자서열(seed sequence)”은 마이크로 RNA가 타겟을 인식할 때 완전한 상보성을 가지고 결합하는 miRNA 내 일부 영역의 뉴클레오타이드 서열을 의미하며, 이는 miRNA가 타겟에 결합하기 위해 필수적으로 요구되는 부분이다.
용어, “약제학적 유효량”은 췌장암줄기세포의 성장억제, 분화억제 또는 사멸을 적절히 유도하여 상기 췌장암 치료제의 약리학적 효과를 나타내는 데 필요한 양을 의미한다.
본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있고, 비경구 투여인 경우에는 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 경피 투여 등으로 투여할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 한편, 본 발명의 약제학적 조성물의 투여량은 바람직하게는 1일 당 0.001 ㎍/kg-100 mg/kg(체중)이다.
본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 서열목록 제2서열 및 제3서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 마이크로 RNA에 상보적인 올리고뉴클레오타이드 또는 그의 단편의 약제학적 유효량; 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 췌장암 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 서열목록 제2서열 및 제3서열의 miRNA와 관련있는 췌장암 치료용 약제학적 조성물은 역시 서열목록 제1서열의 miRNA와 관련되는 췌장암 치료용 약제학적 조성물과 마찬가지로, 췌장암 암줄기세포에서 특이적으로 다르게 발현하는 miRNA를 조절하여 췌장암 암줄기세포를 억제 또는 사멸시키는 것을 목적으로 하는 것이므로, 이 둘 사이에 공통된 내용은 반복 기재에 따른 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.
상기 서열목록 제2서열 및 제3서열에 해당하는 마이크로 RNA는 췌장암 암줄기세포 내에서 특이적으로 발현이 증가하는 특성을 나타낸다. 이들 miRNA를 억제할 수 있는 물질 예컨대 상기 miRNA에 상보적인 올리고뉴클레오타이드로서 상기 miRNA에 특이적으로 혼성화되는 프라이머, 프로브 또는 안타고미어(antagomir)를 췌장암 암줄기세포에 주입하는 경우 췌장암 암줄기세포의 억제 및 사멸을 유도한다. 즉 본 발명의 췌장암 치료용 조성물은 췌장암 암줄기세포의 성장억제, 분화억제 또는 사멸을 유도하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에서 상기 miRNA에 상보적인 올리고뉴클레오타이드, 즉 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 다양한 분자를 포함한다. 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 DNA 또는 RNA 분자이며, 보다 바람직하게는 RNA 분자이다. 선택적으로 , 본 발명에서 이용되는 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 리보뉴클레오타이드(RNA), 디옥시리보뉴클레오타이드(DNA), 2‘-O-변형 올리고뉴클레오타이드, 포스포로티오에이트-백본 디옥시리보뉴클레오타이드, PNA(peptide nucleic acid) 또는 LNA(locked nucleic acid)이다. 2‘-O-변형 올리고뉴클레오타이드는 바람직하게는 2’-O-알킬 올리고뉴클레오타이드이고, 보다 바람직하게는 2’-O-C1-3 알킬 올리고뉴클레오타이드이며, 가장 바람직하게는 2’-O-C1-3 메틸 올리고뉴클레오타이드이다.
상술한 바와 같이, 본 발명에서 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 서열목록 제2서열 및 제3서열에 해당하는 마이크로 RNA에 상보적인 서열을 가지는 핵산-기반 억제제를 포함하는 포괄적인 의미를 갖는다. 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오타이드에 포함되는 것은, 예를 들어 좁은 의미의 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 안타고미어 및 억제 RNA 분자를 포함한다.
용어 “안타고미어는 내성적 miRNA를 사일런싱하기 위해 디자인된 올리고뉴클레오타이드를 의미하며, 분해를 방지하기 위하여 변형된 형태로서 사용될 수 있다. 안타고미어는 단일-가닥 화학적-변형 리보뉴클레오타이드로서 서열목록 제23서열 내지 제36서열에 해당하는 마이크로 RNA에 적어도 부분적으로 바람직하게는 완전하게 상보적인 서열을 갖는다. 안타고미어는 하나 또는 그 이상의 변형 뉴클레오타이드(예컨대, 2'-O-메틸-당 변형)를 포함한다. 어떤 구현예에 따르면, 안타고미어는 변형 뉴클레오타이드만을 포함한다. 안타고미어는 하나 또는 그 이상의 포스포로티오에이트 결합을 포함하며 이에 부분적으로 또는 완전히 포스포로티오에이트 백본을 갖게 된다. 인 비보 운반 및 안정성을 개선하기 위하여, 안타고미어는 그의 3‘-말단에 콜레스테롤 또는 다른 부위를 결합시킬 수 있다.
서열목록 제2서열 및 제3서열에 해당하는 마이크로 RNA 기능의 억제는 전형적인 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 투여하여 달성될 수 있다. 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 리보뉴클레오타이드 또는 디옥시리보뉴클레오타이드이다. 바람직하게는, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 적어도 하나의 화학적 변형을 포함한다. 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 하나 또는 그 이상의 LNAs(Locked nucleic acids)를 포함할 수 있다. LNA는 변형 리보뉴클레오타이드로서 리보오스 당 부위의 2‘ 내지 4’ 탄소 사이에 추가적인 브리지를 포함하여 잠금(locked) 형태를 가지게 되며 이에 LNA가 있는 올리고뉴클레오타이드는 개선된 열 안정성을 가지게 된다. 택일적으로, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 PNAs(peptide nucleic acids)를 포함할 수 있으며, 이는 당-포스페이트 백본 대신에 펩타이드-기반 백본을 포함한다. 안티센스 올리고뉴클레오타이드가 포함할 수 있는 다른 화학적 변형은, 2'-O-알킬(예컨대, 2'-O-메틸, 2'-O-메톡시에틸), 2'-플루오로 및 4'-티오 변형과 같은 당 변형; 포스포로티오에이트, 모포리노 또는 포스포노카복실레이트 결합과 같은 백본 변형(예컨대, 미국 특허 제6,693,187호 및 제7,067,641호)을 포함한다.
서열목록 제2서열 및 제3서열에 해당하는 마이크로 RNA의 기능을 억제하는 다른 접근 방식은 억제 RNA 분자를 투여하는 것이며, 상기 억제 RNA 분자는 서열목록 제2서열 및 제3서열에 해당하는 마이크로 RNA의 성숙 서열에 상보적인 서열을 포함한다. 이러한 억제 RNA 분자는 이중가닥 siRNA(small interfering RNA), shRNA(short hairpin RNA) 및 라이보자임을 포함한다.
본 발명의 일 구현예에서, 본 발명의 조성물은 상기 마이크로 RNA에 상보적인 폴리뉴클레오타이드 자체를 포함할 수도 있으나 그의 단편을 포함할 수도 있으며, 상기 단편은 특히 miRNA의 종자서열(seed sequence)을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 영역에 결합할 수 있는 것이 바람직하다.
본 발명에서 규명한 상기 3가지의 miRNA는 췌장암 암줄기세포에서 특이적으로 발현이 감소하거나 또는 증가하는 것으로서, 췌장암 암줄기세포의 특성을 규정짓는 하나의 특징이라 할 것이다. 상기 3가지의 miRNA는 췌장암 암줄기세포 존재를 확인하는 것뿐만 아니라, 췌장암의 암줄기세포의 진단 및 췌장암의 예후 판단을 위해서도 사용될 수 있다.
또한, 췌장암 암줄기세포에서 다르게 발현하는 상기 3가지의 miRNA의 조절은 위에서 상세히 설명한 바와 같이 췌장암 치료에 이용될 수 있다. 특히 어떤 특정 암줄기세포 유전자를 차단하여도 암을 실질적으로 성장 억제를 하기가 쉽지 않은 현실에서, 마이크로 RNA가 여러 분자들을 조절한다는 점을 고려한다면, 췌장암 암줄기세포에서 특이적으로 발현하는 상기 마이크로 RNA를 조절하는 것은 암줄기세포를 공략하기 위한 매우 현실적인 방법일 수 있다. 그 뿐만 아니라, 상기 방법은 항암제 내성 또는 방사선 치료 내성 극복을 위해 사용될 수 있다는 점에서도 그 가치가 크다고 할 것이다.
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
(ⅰ) 본 발명은 췌장암 암 줄기세포 및 췌장암에 대한 신규한 분자 마커를 이용하여 췌장암 치료제의 스크리닝 방법을 제공한다.
(ⅱ) 본 발명의 췌장암 치료제 타겟은 췌장암 암 줄기세포에 특이적으로 작용하는 치료제 후보물질을 스크리닝 하는데 매우 유용하다.
(ⅲ) 또한, 본 발명을 이용하면 췌장암의 진단 및 예후를 정확하게 분석할 수 있다.
(ⅳ) 본 발명은 췌장암 치료용 약제학적 조성물은 제공하며, 본 발명의 췌장암 치료용 약제학적 조성물은 췌장암 암줄기세포의 억제 또는 사멸을 효과적으로 유도하므로 췌장암의 전이를 예방하고 항암치료 내성을 극복하여 췌장암을 근본적으로 치료할 수 있는 장점이 있다.
(Ⅴ) 또한, 본 발명의 췌장암 치료용 약제학적 조성물은 mRNA를 직접적인 타겟으로 하는 것이 아니라, mRNA 레벨을 조절할 수 있는 miRNA 조절을 통해 질병을 치료하므로 안전하다.
도 1은 췌장암줄기세포에서 특이적으로 발현되는 mRNA 및 miRNA의 관계를 피어슨 상관관계 계수로 분석한 결과이다(p값<0.05).
도 2는 췌장암줄기세포에서 특이적으로 발현되는 mRNA 및 miRNA의 관계를 피어슨 상관관계 계수로 분석한 결과이다(p값<0.01).
도 3은 암줄기세포에서 miRNA 및 유전자 간의 상관관계에 대한 분석 방법을 나타낸 그림이다.
도 4-30은 miRNA와 개별 유전자 간의 상관관계를 예측한 분석결과이다.
도 4: has-miR-100 miRNA, 도 5: has-miR-125-3p miRNA, 도 6: has-miR-192 miRNA, 도 7: has-miR-26a miRNA, 도 8: has-miR-572 miRNA, 도 9: has-miR-629* miRNA, 도 10: has-miR-106a miRNA, 도 11: has-miR-500 miRNA, 도 12: has-miR-574-5p miRNA, 도 13: has-miR-503 miRNA, 도 14: has-miR-1224-5p miRNA, 도 15: has-miR-134 miRNA, 도 16:has-miR-148 miRNA, 도 17: has-miR-194 miRNA, 도 18:has-miR-886-5p miRNA, 도 19:has-miR-99b* miRNA, 도 20: has-miR-206 miRNA, 도 21: has-miR-99a miRNA, 도 22: has-miR-150* miRNA, 도 23: has-miR-181a miRNA, 도 24:has-miR-371-5p miRNA, 도 25: has-miR-450a miRNA, 도 26: has-miR-202 miRNA, 도 27: has-miR-23b miRNA, 도 28: has-miR-135a* miRNA, 도 29: hcmv-miR-UL70-3p miRNA, 도 30: has-miR-877 miRNA.
△: 암, ○: 정상, 적색 제목: 암에서 증가, 청색 제목: 암에서 감소, (+): 양의 상관관계, (-): 음의 상관관계
도 31은 인간 정상 췌장세포 및 췌장암 세포에서 miRNA(mir-194, mir-202, mir-23b, mir-503, mir-886-5p)의 발현 변화를 측정한 결과이다.
도 32는 인간 정상 췌장세포 및 췌장암 세포에서 miRNA에 의해 직간접적으로 발현 변화를 나타낼 것으로 예상되는 유전자의 발현 변화를 측정한 결과이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예
실험방법
세포배양
인간 췌장암 세포주 Capan-1은 ATCC(American Type Culture Collection; Manassas, VA)로부터 구입하고, 성장 배지로 우태아혈청(FBS; Hyclone, Logan, UT)를 포함하는 IMDM(Invitrogen Gibco)에서 배양하였다. SV40-T 항원으로 형질전환한 인간 정상 췌장 세포주 hYGIC6(unpublished)는 10% FBS를 포함한 Waymouth MB 752/1(Sigma, St. Louis, MO)에서 배양하였다.
구(sphere) 형성
세포를 트립신 처리하고 단일 세포 현탁액을 현미경을 사용하여 확인하였다. 그 다음 PBS로 세척하고 EGF(10 ng/ml, R&D Systems Inc., 미국), bFGF(10 ng/ml, R&D Systems Inc., 미국), LIF(10 ng/ml, Chemicon, 미국), 1ITS(insulin transferring selenium, Gibco, 미국) 및 0.5% FBS을 보충한 혈청 프리 D/F12 배지에 103 세포/ml의 비율로 재현탁시켰다. 상기 세포 현탁액을 37℃, 5 % CO2 대기 환경 하에서 6-웰 울트라 로우 클러스터 플레이트(Corning Inc., 미국)에 7일 동안 배양하고 수집하였다. 대조군으로는 상기 구 형성 배지와 동일한 배지를 포함하는 배양 접시(Nalgene Nunc Int., 미국)에 부착시킨 부착성 배양 세포를 사용하였다.
cDNA 마이크로어레이
RNaesy 미니 키트(Qiagen, 미국)를 사용하여 제조사 지시에 따라 총 RNA를 추출하였다. 총 RNA를 ND-1000 나노드롭 분광기(NanoDrop Technologies, Inc., DE)를 사용하여 정량 분석하고, Agilent 2100 생분석기(Agilent Technologies, Santa Clare, CA)에 의해 RNA 6000 나노 칩(Agilent Technologies)을 사용하여 정성 분석하였다. 마이크로어레이 실험 절차는 제조사 프로토콜에 따라 수행하였다. cDNA 마이크로어레이 분석은 디지털 제노믹스(한국)를 사용하여 수행하였다. 간략히 정리하면, 각각의 총 RNA 6 ㎍을 사용하여 이중사 cDNA를 준비하고, 비오틴-표지(IVT 라벨링 키트; Affymetrix)를 하여 증폭하였다. 상기 표지된 cDNA를 조각내어 Affymetrix GeneChip 인간 지놈 U133 플러스 2.0 고농도 올리고뉴클레오타이드 어레이(Affymatrix, 미국)에 혼성화시켰다. 그 다음 마이크로어레이를 Genechip Fluidics 스테이션 450(Affymetrix)으로 세척하고 Genechip 어레이 스캐너 3000 7G(Affymetrix)를 사용하여 스캔하였다. raw .cel 파일 내 발현 강도 데이터는 로그2 값으로 변환 후 Robust Multichip Average(RMA) 알고리즘으로 표준화하여 잡음을 감소시켰다. 얻어진 발현 값은 R/Bioconducter 에서 limma 패키지를 이용한 empirical Bayes 선형모델을 통해 통계적으로 분석되었다. 유의한 발현 변화를 나타내는 유전자의 값은 False Discovery Rate(FDR)(p 값< 0.05)에 의해 선별되었다.
miRNA 칩 분석
제조사 지시에 따라 mirVana miRNA 분리 키트(Ambion, Austin, TX)를 사용하여 총 RNA를 추출하였다. 총 RNA를 ND-1000 나노드롭(NanoDrop Technologies, Inc., DE)을 사용하여 정량 분석하고, 아질런트 2100 생분석기(Agilent Technologies) 및 RNA 6000 나노 칩(Agilent Technologies)을 사용하여 정성 분석하였다. miRNA 마이크로어레이 실험은 제조사 프로토콜에 따라 수행하였고, 디지털 지노믹스(Seoul)를 사용하여 miRNA 마이크로어레이 결과를 분석하였다. 즉, 37℃에서 30분 동안 각각의 총 RNA 샘플 100 ng 분량을 송아지 장 포스파타제(GE Healthcare, 미국)로 처리하고, 100℃에서 5분간 열 블록 하에 100% DMSO(Sigma)로 변성시키고, 그 다음 RNA가 재 어닐링 되는 것을 방지하기 위하여 얼음 수조 내로 이전시켰다. 그 다음 T4 RNA 리가아제(GE Healthcare)를 사용하여 16℃에서 2시간 동안 반응시켜 RNA 샘플을 pCp-Cy3로 표지하였다. 상기 표지된 샘플을 Agilent 인간 miRNA Version 2 마이크로어레이(Agilent Technologies)에 혼성화시켰다. 혼성화는 SureHyb 챔버(Agilent Technologies) 내 55℃에서 24시간 동안 수행하였다. 그 다음 마이크로어레이를 세척하고 Agilent 마이크로어레이 스캐너(G2505B; Agilent Technologies)를 사용하여 스캔하였다. raw .cel 파일 내 발현 강도 데이터는 로그2 값으로 변환 후 Robust Multichip Average(RMA) 알고리즘으로 표준화하여 잡음을 감소시켰다. 얻어진 발현 값은 R/Bioconducter 에서 limma 패키지를 이용한 empirical Bayes 선형모델을 통해 통계적으로 분석되었다. 유의한 발현 변화를 나타내는 유전자의 값은 False Discovery Rate(FDR)(p 값< 0.05)에 의해 선별되었다. 독립적인 총 RNA 샘플에 대하여 모든 개별적 칩 분석을 2회 반복 수행하였다.
정량적 RT-PCR
TaqMan 역전사 키트(Applied Biosystems, 미국), TaqMan miRNA 분석기(Applied Biosystems) 및 TaqMan 유전자 발현 마스터 믹스를 사용하여 제조사 프로토콜에 따라 역전사 및 정량적 역전사 PCR(qRT-PCR)를 수행하였다. qRT-PCR는 ABI 프리즘 7300 시퀀스 탐지 시스템(Applied Biosystems)을 사용하여 수행하였고, 성숙한 miRNA 및 U6 snRNA는 Ambion로부터 구입하였다. PCR 증폭 프로그램은 95℃ 10분간의 개시단계와 95℃ 30초, 56℃ 30초 및 72℃ 15초로 이루어지는 PCR 40 사이클 단계로 구성되었다. 표준 곡선을 구하고 타겟 유전자 miRNA의 상대적인 양을 U6 snRNA에 대하여 평준화하였다. 샘플 내 상대적인 miRNA의 양은 비교 Ct 방법(△Ct구-△Ct부착배양세포=△△Ct; 상대량=2-△△Ct)을 사용하여 계산하였고, 배수변화값(fold change)으로 전환시켰다. 모든 qRT-PCR은 독립적인 총 RNA 샘플에 대하여 3회 반복 수행하였다.
miRNA 및 mRNA의 상관관계
피어슨(Pearson) 상관관계 계수 분석을 통해 얻어진 모든 유의적으로 변화하는 췌장암줄기세포 특이적 유전자와 miRNA 사이의 상관관계를 분석하였다. 유전자와 miRNA의 암줄기세포와 암세포 사이에서의 발현 값의 차이를 적용하여 피어슨 상관관계 계수를 도출하였고 유의한 변화를 나타내는 p값이 0.01이하인 유전자-miRNA 쌍을 선정하여 선형회귀분석을 수행하였다. 계층적(hierarchical) 클러스터 분석은 유클리딘 디스턴스 메트릭스(Euclidean distance metric)와 최장연결법(complete linkage method)으로 피어슨 상관관계 계수를 이용해 분석하였다.
실험결과
췌장암 세포주 내 구(sphere) 형성
인간의 정상 췌장 세포주인 hYGIC6와 Capan-1으로 구형 형성 실험을 수행하여, 상기 세포주들의 구 형성 능력을 평가하였다. 그 결과, 인 비트로(in vitro)에서 재생 가능한 구를 형성하였다.
전체적인 mRNA 발현 프로파일
Capan-1과 hYGIC6 세포의 스피어세포 및 부착배양세포에서 다르게 발현되는 유전자를 분석하기 위하여 칩 분석법을 수행하였다. 유전자 발현 프로파일을 분석하기 위하여, 본 발명자들은 Affymetrix GeneChip HG U133을 사용하였다. 상기 스피어세포를 부착배양세포와 비교한 결과 Capan-1 및 hYGIC6에서 111개 유전자가 각각 다르게 발현됨을 확인하였고(p<0.01) 유전자 프로브는 단일 유전자 ID로 변환시켰다.
전체적인 miRNA 발현 프로파일
miRNA 발현 프로파일을 분석하기 위하여, 본 발명자들은 Agilent 멀티플렉스 마이크로어레이-베이스 플랫폼을 사용하였다. 칩 상의 723개 인간 miRNA와 76개 바이러스 miRNA중에서, 통계적 유의한 (p값<0.01) 총 52 개의 miRNA를 남겼고 약 4만 7천여 개의 전사물(transcript)을 포함하고 있는 유전자 칩에서 통계적 유의한 (p 값<0.05) 총 146 프로브에 해당하는 111개의 유전자를 남겼다. 상기 스피어세포 내에서 다르게 발현된 총 52개의 miRNA를 하기 표 1에, 유전자를 하기 표 2에 각각 정리하였다.
PROBE GENE M A t pval adj.pval fdr.pval
A_25_P00014886 hsa-miR-513a-5p 4.869 4.388 17.736 0.000 0.000 0.000
A_25_P00012271 hsa-miR-155 2.513 4.649 6.856 0.001 0.006 0.006
A_25_P00010474 hsa-miR-100 2.222 8.009 6.371 0.001 0.007 0.007
A_25_P00012077 hsa-miR-7 1.915 6.048 11.931 0.000 0.001 0.001
A_25_P00013254 hsa-miR-29b-1* 1.824 3.662 6.244 0.001 0.008 0.008
A_25_P00012126 hsa-miR-222 1.758 7.007 5.780 0.001 0.010 0.010
A_25_P00013578 hsa-miR-431* 1.675 3.273 7.941 0.000 0.005 0.005
A_25_P00014859 hsa-miR-18b 1.658 3.983 8.644 0.000 0.003 0.003
A_25_P00011994 hsa-miR-18a 1.620 5.576 5.869 0.001 0.009 0.009
A_25_P00010657 hsa-miR-503 1.567 3.212 7.842 0.000 0.005 0.005
A_25_P00010471 hsa-miR-99a 1.430 4.432 5.897 0.001 0.009 0.009
A_25_P00014825 hsa-miR-106a 1.332 5.464 7.105 0.000 0.005 0.005
A_25_P00014968 hsa-miR-513b 1.316 3.054 7.133 0.000 0.005 0.005
A_25_P00010053 hsa-miR-29b 1.248 11.105 6.272 0.001 0.008 0.008
A_25_P00011097 hsa-miR-572 1.245 4.441 6.582 0.001 0.007 0.007
A_25_P00010690 hsa-miR-221 1.205 8.344 6.064 0.001 0.008 0.008
A_25_P00010615 hsa-miR-20b 1.171 6.772 5.706 0.002 0.010 0.010
A_25_P00012437 hsa-miR-450a 1.163 3.194 6.701 0.001 0.006 0.006
A_25_P00013151 hsa-miR-17* 1.063 5.635 5.688 0.002 0.010 0.010
A_25_P00012262 hsa-miR-320 1.011 6.103 6.418 0.001 0.007 0.007
A_25_P00010131 hsa-miR-148a -0.880 5.629 -5.777 0.001 0.010 0.010
A_25_P00012631 hsa-miR-500 -0.899 2.744 -6.575 0.001 0.007 0.007
A_25_P00011999 hsa-miR-26a -1.033 8.402 -7.588 0.000 0.005 0.005
A_25_P00010285 hsa-miR-181a -1.082 6.723 -7.221 0.000 0.005 0.005
A_25_P00013090 hsa-miR-940 -1.163 5.846 -6.067 0.001 0.008 0.008
A_25_P00013766 ebv-miR-BART16 -1.178 2.845 -6.381 0.001 0.007 0.007
A_25_P00011668 ebv-miR-BART10 -1.312 2.706 -7.447 0.000 0.005 0.005
A_25_P00010881 hsa-miR-23b -1.370 7.591 -7.359 0.000 0.005 0.005
A_25_P00013496 hsa-miR-99b* -1.441 2.761 -10.257 0.000 0.002 0.002
A_25_P00012860 hsa-miR-671-5p -1.455 3.903 -6.609 0.001 0.007 0.007
A_25_P00010831 hsa-miR-629* -1.506 3.440 -7.302 0.000 0.005 0.005
A_25_P00010868 hsa-miR-192 -1.534 5.549 -7.214 0.000 0.005 0.005
A_25_P00011799 hsv1-miR-H1 -1.672 3.200 -9.354 0.000 0.002 0.002
A_25_P00013941 hsa-miR-125a-3p -1.675 5.277 -5.733 0.001 0.010 0.010
A_25_P00014895 hsa-miR-574-3p -1.718 4.379 -6.990 0.001 0.005 0.005
A_25_P00014863 hsa-miR-202 -1.820 4.322 -7.374 0.000 0.005 0.005
A_25_P00011006 hsa-miR-194 -1.839 4.877 -9.555 0.000 0.002 0.002
A_25_P00012919 hsa-miR-874 -1.917 5.176 -7.368 0.000 0.005 0.005
A_25_P00011725 hcmv-miR-UL70-3p -1.974 8.905 -7.177 0.000 0.005 0.005
A_25_P00010528 hsa-miR-206 -2.141 2.954 -15.472 0.000 0.000 0.000
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qRT-PCR
mir-194, mir-202, mir-23b를 포함하는 선별된 miRNA에 대한 qRT-PCR 분석을 수행하여 발현의 차이 여부를 확인하였다. qRT-PCR에 사용한 각각의 miRNA 프로브를 하기 표 3에 정리하였다.
유전자 타겟 서열
U6 snRNA CGCAAGGAUGACACGCAAAUUCGUGAAGCGUUCCAUAUUUUU
hsa-miR-194 UGUAACAGCAACUCCAUGUGGA
hsa-miR-202 AGAGGUAUAGGGCAUGGGAAAA
hsa-miR-23b AUCACAUUGCCAGGGAUUACC
교차-상관관계
췌장암줄기세포 특이적으로 발현된 mRNA와 miRNA의 관계를 알아보기기 위하여, 111개의 mRNA 및 52개의 miRNA를 대상으로 피어슨(Pearson) 상관관계 계수 분석을 통해 얻어진 모든 유의적으로 변화하는 췌장암줄기세포 특이적 유전자와 miRNA 사이의 교차-상관관계를 분석하였다. hYGIC6 부착배양세포의 2중 데이터의 평균값을 분석하고 각각에 대하여 Log2(샘플/점착성 hYGIC6 평균) 값을 분석하기 위하여, hYGIC6을 대조군으로 설정하였다. 상관관계를 계산한 miRNA 및 mRNA 각각의 로그 발현 동태와 선형 모델이 일치하는 결과, 본 발명자들은 피어슨 상관관계 계수로 색을 입힌 교차 상관관계 히트 맵을 p 값이 0.05 이하일 때와 0.01 이하일 때 각각 작성하였다(도 1-2).
높은 교차-상관관계를 나타내는 개별적 miRNA와 유전자사이의 상관관계 분석
암줄기세포에서의 발현값에서 hYGIC6에서의 강도(intensity) 값을 뺀 차이 값을 도 3의 범례에 따라 개별적 miRNA와 유전자 사이의 상관관계를 그래프상으로 표현하였다(도 4-30).
개별적 높은 상관관계를 나타내는 miRNA와 mRNA의 관계 분석 확인을 위한 개별적 miRNA 및 유전자의 발현 검증
기존에 검증했던 miRNA의 발현 변화와 더불어 추가적 miRNA의 발현 변화 mir-194, mir-202, mir-23b의 발현을 검증하였고 각 miRNA에 의해 직접적 및 간접적으로 발현 변화를 나타낼 것으로 예상되는 유전자 CCL2, FCGBP, FOXO1, HNF4G, PEMPA1, POU2F3, SRD5A3, SYT17, THBD, TNS4, TRPM8 및 VNN2의 발현을 확인하였다(도 31-32).
본 실험을 통해 추가적으로 췌장암줄기세포에서 특이적으로 발현하는 miRNA mir-194, mir-202, mir-23b를 발굴하였고 췌장암세포에서 특이적으로 발현하는 miRNA에 의해 조절받는 유전자 CCL2, FCGBP, FOXO1, HNF4G, PEMPA1, POU2F3, SRD5A3, SYT17, THBD, TNS4, TRPM8 및 VNN2의 발현 변화를 통해 췌장암줄기세포 특이적 유전자를 규명하였다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> Industry-Academic Cooperation Foundation Yonsei University <120> Pharmaceutical Compositions for Treating Pancreatic Cancer and Screening Method for Pancreatic Cancer Therapeutic Agen <130> PN130200 <160> 3 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens, hsa-miR-202 <400> 1 agagguauag ggcaugggaa aa 22 <210> 2 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens, hsa-miR-194 <400> 2 uguaacagca acuccaugug ga 22 <210> 3 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens, hsa-miR-23b <400> 3 aucacauugc cagggauuac c 21

Claims (13)

  1. 암줄기세포를 가지는 췌장암 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여 인간의 췌장 세포 시료에 있는 서열목록 제1서열 내지 제3서열로 구성된 군으로부터 선택되는 뉴클레오타이드의 발현 수준을 측정하는 방법을 통해 암줄기세포를 가지는 췌장암 진단 마커를 검출하는 방법.
  2. 다음 단계를 포함하는 췌장암 치료제의 스크리닝 방법:
    (a) 서열목록 제1서열의 뉴클레오타이드를 발현하는 세포에 시험물질을 접촉시키는 단계; 및
    (b) 상기 시험물질이 상기 뉴클레오타이드의 발현에 미치는 영향을 분석하는 단계로서, 상기 시험물질이 상기 뉴클레오타이드의 발현을 증가시키면 췌장암 치료제로 판정된다.
  3. 다음 단계를 포함하는 췌장암 치료제의 스크리닝 방법:
    (a) 서열목록 제2서열 및 제3서열로 구성된 군으로부터 선택되는 뉴클레오타이드를 발현하는 세포에 시험물질을 접촉시키는 단계; 및
    (b) 상기 시험물질이 상기 뉴클레오타이드의 발현에 미치는 영향을 분석하는 단계로서, 상기 시험물질이 상기 뉴클레오타이드의 발현을 감소시키면 췌장암 치료제로 판정된다.
  4. 제 2 항 또는 제 3 항에 있어서, 상기 췌장암 치료제는 췌장 암줄기세포의 성장억제, 분화억제 또는 사멸을 유도하는 것을 특징으로 하는 췌장암 치료제의 스크리닝 방법.
  5. 제 2 항 또는 제 3 항에 있어서, 상기 췌장암 치료제는 항암약물치료 내성 극복 또는 방사선 치료 내성극복을 위해 사용되는 것을 특징으로 하는 췌장암 치료제의 스크리닝 방법.
  6. 삭제
  7. 삭제
  8. 삭제
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  11. 삭제
  12. 서열목록 제1서열 내지 제3서열로 구성된 군으로부터 선택되는 뉴클레오타이드에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브를 포함하는 췌장암 줄기세포 검출용 키트.
  13. 서열목록 제1서열 내지 제3서열로 구성된 군으로부터 선택되는 뉴클레오타이드에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브를 포함하는 췌장암 진단 또는 예후 분석용 키트.
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JP2012231801A (ja) * 2006-03-02 2012-11-29 Ohio State Univ 膵臓癌に関連するマイクロｒｎａ発現プロファイル

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