KR20100012557A - ｍｉｃｒｏＲＮＡ의 고형암 치료 또는 진단에 있어서의용도 - Google Patents

ｍｉｃｒｏＲＮＡ의 고형암 치료 또는 진단에 있어서의용도 Download PDF

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Abstract

고형암, 바람직하게는 자궁경부암에서 특이적으로 생성이 증가되는 특정 microRNA, 및 상기 microRNA를 이용하여 고형암, 바람직하게는 자궁경부암을 치료, 예방, 또는 진단하는 기술이 제공된다.

Description

ｍｉｃｒｏＲＮＡ의 고형암 치료 또는 진단에 있어서의 용도{Use of microRNA in treating or preventing solid cancers}
본 발명은 고형암, 구체적으로는 자궁경부암에서 특이적으로 생성이 증가되는 특정 microRNA, 및 상기 microRNA를 이용하여 고형암, 바람직하게는 자궁경부암을 치료, 예방, 또는 진단하는 기술에 관한 것이다.
자궁경부암(Cervical cancer)은 정상 자궁경부 상피가 침습 발암전 자궁경부 상피내 종양으로 전이되고, 이어서 침습 자궁경부암으로 전이되는 것을 수반하는 복잡한 과정으로 발생된다. 자궁경부암은 고위험도 인유두종바이러스와 관련되어 있지만, 인유두종바이러스 감염만으로는 악성 전이를 유발하기에 충분하지 않다. 따라서, 밝혀지지 않은 다른 유전적 변이가 수반될 것으로 보인다. 이러한 유전적 변이를 동정하는 것은 자궁경부암을 검사하고 치료하는데 매우 중요할 것이다.
MicroRNAs (miRNA)는 최근에 밝혀진 유전자 발현을 조절하는 small noncoding RNAs 종류이다. 성숙한 miRNAs는 18 내지 25개의 뉴클레오타이드를 가지며 헤어핀 구조 전사체에 의하여 생성된다. microRNA는 표적 mRNA에 상보적으로 결합하여 전사 후 유전자 억제자로서 작용하며, mRNA 번역을 억제하여 유전자 발현을 억제하거나 mRNA 절단을 촉매하여 불안정화를 유도하는 것으로 알려져 있다. 이러한 miRNAs 의 특별한 역할은 세포 증식 및 대사 조절, 발생 시기, 세포 사멸, 조혈, 신경세포 발생, 인간 종양발생, DNA 메틸레이션, 및 염색질 변형을 포함한다.
miRNA 유전자 발현이 인간 암발생 및 진행에 관여한다는 증거가 많아지고 있다. 특징적인 miRNA 발현 양상이 폐암, 유방암, 교모세포종, 간세포 암종, 갑상선 유두상 암종, 및 최근에는, 직장암에서도 보고되고 있다. 더욱이, miRNA 발현 signature가 특정 질병의 임상적 결과와 관련 있다는 보고도 있다. 이러한 데이터는 miRNAs 가 다양한 인간 암에서 중요한 역할을 한다는 것을 제안하는 것이다.
그러나, miRNA-매개 유전자 조절의 분자적 기초는 아직 완전히 알려지지 않았으며, 이들의 종양발생에 있어서의 역할 역시 거의 알려지지 않았다.
본 발명은 세포 증식 변화를 유도할 수 있는 특정 마이크로 RNA (microRNA)를 발굴하여 이를 암 치료 또는 진단에 사용하는 기술을 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 구체적인 예는 고형암, 바람직하게는 자궁경부암에서 특이적으로 생성이 증가되는 것으로 동정된 특정 microRNA를 제공한다.
본 발명의 다른 구체적 예는 상기 동정된 microRNA의 억제제를 포함하는 고형암, 바람직하게는 자궁경부암 치료용 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 구체적 예는 상기 동정된 microRNA의 생성을 억제하는 물질을 선별하는 단계를 포함하는 고형암, 바람직하게는 자궁경부암 치료제 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 구체적 예는 시료의 상기 동정된 microRNA의 발현을 측정하여 고형암, 바람직하게는 자궁경부암을 진단하는 방법을 제공한다.
본 발명은 마이크로 RNA (microRNA)를 이용한 인간 암세포 증식 억제 기술에 관한 것으로, 구체적으로, 본 발명자들은 암세포에서 특정 microRNA의 생성이 증가하고, 상기 microRNA의 pri-microRNA (primary microRNA)에 상보적으로 결합하는 항-microRNA 올리고뉴클레오타이드 (anti-miRNA)가 암세포내로 도입되어 상기 microRNA의 생성을 감소시켰을 때 암세포 증식이 억제됨을 발견하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 자궁경부암 초기 단계 침습편평세포암종(invasive squamous cell carcinoma, ISCC)과 정상 자궁경부 상피조직에서 반응 감도 및 효율이 우수한 실시간 정량 PCR 방법을 이용하여 두 조직간 현저한 차등 발현 양상을 보이는 miRNA를 확인하였다. 특히 miR-199a이 자궁경부암 ISCC 에서 특이적으로 생성이 증가되는 것으로 확인하여, miR-199a이 자궁경부암 치료의 타겟이 될 수 있음을 제안하는 것이다.
우선, 본 발명의 구체예는 miR-199a의 억제 물질을 유효성분으로 포함하는 자궁경부암 치료 및/또는 예방용 조성물을 제공한다.
상기 miR-199a는 포유류 유래, 바람직하게는 인간 유래의 것이며, 서열번호 1 (5'-CCCAGUGUUCAGACUACCUGUUC-3')의 뉴클레오타이드 서열을 갖는 것일 수 있다. 본 발명에 있어서의 miR-199a의 억제는 miRNA-199a와 결합하여 그 활성을 억제하는 항 miRNA-199a일 수 있다. 예컨대, 본 발명에 따른 miR-199a의 억제 물질은 상기 서열번호 1의 뉴클레오타이드 서열 중 연속하는 10개 이상, 바람직하게는 15개 이상의 뉴클레오타이드와 상보적인 서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 서열번호 2 (5'-GAACAGGUAGUCUGAACACUGGG-3')의 뉴클레오타이드 서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드일 수 있다.
본 발명에 기술된 항-microRNA 분자는 통상적인 DNA 합성기에 의해 합성되어 직접 이용되거나, 발현 벡터 내로 클로닝된 것일 수 있다. 발현 벡터는 포유류 세 포 또는 그 밖의 표적 세포 유형에 복제 및 발현에 이용되는, 플라스미드, 렌티바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터 등으로 이루어진 군으로부터 선택하여 사용할 수 있다. 통상의 방법으로 본 발명에 기술된 항-microRNA서열을 암호화하는 유전자를 합성하여 발현 벡터에 삽입할 수 있다.
본 발명에 따른 조성물은 상기한 바와 같이 합성되거나 발현 벡터에 클로닝된 항-microRNA 분자를 유효성분으로 함유하는 것일 수 있다. 본 발명에 따른 조성물은 상기 항-microRNA 분자를 단독으로, 또는 약제학적으로 허용되는 담체와 함께 포함할 수 있다. 약학적으로 허용되는 담체로는 약제학적 투여에 적합한 용매, 분산 매질, 고팅, 항세균제 및 항균제, 등장제 및 흡수 지연제 등을 포함하며, 보강 활성 화합물이 추가적으로 포함될 수 있다. 항-microRNA는 투여하고자 하는 경로에 적합하게 제형화 할 수 있다. 예컨대, 본 발명에 따른 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 경피제, 좌제, 또는 주사제 등의 형태의 비경구 제형 등으로 제형화하여 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 조성물의 투여 경로는 특별한 제한이 없으며, 예컨대, 정맥내, 혈액내, 복강내, 근육, 피하, 흡입, 경피 (국부), 점막 및 직장 같은 비경구 투여 또는 경구 투여 경로로 투여할 수 있다. 투여 방법은 현재 통상적으로 사용되고 있는, 안정성 및 효율이 검증된 의,약학적 방법에 준한다. 본 발명에 따른 조성물의 투여는 통상적으로 사용되는 모든 투여방식에 의할 수 있으며, 예컨대, 경구, 직장, 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 주사에 의하여 투여될 수 있다.
본 발명에 따른 조성물의 독성 및 치료 효능은 LD50 (시험군의 50%가 치사 되는 용량) 및 ED50 (시험 군의 50%에 치료효과를 나타내는 용량)을 측정함으로써 세포 배양물 또는 실험 동물의 표준 약제학적 절차에 의해 측정될 수 있다. 독성 및 치료 효과 간의 용량비가 치료 지수로 적용 및 표현될 수 있으며 LD50/ED50의 비로 표현될 수 있다. 높은 치료 지수를 나타내는 질환 치료제가 바람직하며, 비감염된 세포에 대한 손상을 가능한 한 최소로 하여 부작용을 감소시키기 위하여, 치료제에 의해 영향 받는 조직의 부위에 표적화하는 전달 시스템을 설계해야 한다.
본 발명의 항-microRNA를 포함하는 조성물의 적합한 용량은 조절되어야 하는 분자(pri-microRNA)의 발현 또는 활성에 의존한다. 항-microRNA가 환자에게 투여되는 경우, 의사, 수의자, 또는 연구자는 먼저 낮은 용량을 처방한 후, 적합한 반응이 얻어질 때까지 용량을 증가시킬 수 있다. 또한 특정 대상에 대한 특정 용량 수준은 사용되는 항암제를 포함한 특정 화합물의 활성, 환자의 연령, 체중, 일반적인 건강 상태, 성병 및 식습관, 투여시간, 투여 경로, 배설율, 배합되는 약물, 및 조절되어야 하는 발현 또는 활성 정도를 포함하는 여러 가지 인자에 의존한다.
본 발명에 따른 조성물은 포유류, 바람직하게는 인간을 대상으로 투여할 수 있고, 투여량은 환자의 연령, 병의 경중 등에 따라서 적절히 조절 가능하며, 예컨대, 유효성분 중량을 기준으로, 0.001 내지 500 mg/kg, 바람직하게는, 0.01 내지 100 mg/kg일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명에 따른 조성물의 투여는 통상적으로 사용되는 모든 투여방식에 의할 수 있으며, 예컨대, 경구, 직장, 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 주사에 의하여 투여될 수 있다.
본 발명의 다른 구체적인 예는 miR-199a 생성 정도를 측정하여 그 생성이 증가된 경우 자궁경부암으로 판단하는 것을 특징으로 하는 자궁경부암 판단 (진단) 방법을 제공한다. 보다 구체적으로, 상기 자궁경부암 판단 방법은
환자로부터 얻은 시료의 miR-199a 생성 정도를 측정하는 단계;
상기 얻어진 환자의 miR-199a 생성 정도를 정상 시료의 miR-199a 생성 정도와 비교하는 단계; 및
환자의 miR-199a 생성 정도가 정상인의 miR-199a 생성 정도보다 높은 경우 자궁경부암으로 판단하는 단계
를 포함할 수 있다.
상기 환자는 포유류, 바람직하게는 인간일 수 있으나 이에 제한되지는 않는다. 상기 시료는 상기 환자로부터 분리한 세포, 조직, 바람직하게는 자궁경부 상피 조직 또는 세포일 수 있다. 또한, 상기 정상시료는 자궁경부암이 발병되지 않고 관련된 병력이 전혀 없는 여성의 정상 자궁경부 상피 조직 또는 세포를 의미한다. 본 발명의 한 구체예에서는 자궁경부암 또는 이와 관련된 병력이 전혀 없고, 양성 산부인과 질환 (주로 자궁근종 질환)으로 자궁절제술을 받은 여성의 자궁 경부 상피 조직 또는 세포를 사용할 수 있다.
miR-199a 생성 정도는 이 발명이 속하는 기술분야에 통상적으로 알려진 모든 RNA 정량 방법에 의하여 측정할 수 있으며, 예컨대, 실시간 정량 PCR (Real-time quantitative PCR), 노던 블러팅, 마이크로어레이 등의 방법으로 측정할 수 있다.
본 발명의 또 다른 구체예는 miR-199a를 타겟으로 하는 자궁경부암 치료제 스크리닝 방법을 제공한다. 상기 스크리닝 방법은
후보 화합물을 시료와 접촉시키는 단계;
상기 후보 화합물과 접촉한 시료의 miR-199a 생성 정도를 상기 화합물을 처리하지 않은 경우의 miR-199a 생성 정도와 비교하는 단계; 및
후보 화합물과 접촉한 시료의 miR-199a 생성 정도가 화합물을 처리하지 않은 경우의 miR-199a 생성 정도보다 감소한 경우 상기 후보 화합물을 자궁경부암 치료제로 선별하는 단계
를 포함할 수 있다.
상기 후보 화합물은 15 내지 30 bp, 바람직하게는 18 내지 25 bp 길이의 올리고뉴클레오타이드일 수 있다. 상기 miR-199a 생성 정도는 이 발명이 속하는 기술분야에 통상적으로 알려진 모든 RNA 정량 방법에 의하여 측정할 수 있으며, 예컨대, 실시간 정량 PCR (Real-time quantitative PCR), 노던 블러팅, 마이크로어레이 등의 방법으로 측정할 수 있다.
miRNA 발현의 조직 특이적 패턴은 최근 보고된 바 있는데, 이들은 발생학적 진화(embryologic development)를 반영하는 것으로 생각된다. 몇 몇 보고들은 특정 miRNAs의 과발현 또는 저발현이 특정 종양 유형에 따라서 상이하게 나타남이 보고되어 있다. 본 발명에서는 정상 자궁경부 상피 조직과 비교하여 ISCC에서는 특정 miRNA의 과발현이 저발현보다 우세하게 나타남을 확인하였으며, 기존에 자궁경부암에서 과발현되는 miRNA에 대하여 보고된 바 없다. 본 발명에서 얻어진 결과는, 다양한 조직유형의 종양을 이용한 대규모 프로파일링 연구에서 보여지는 바와 같이, miRNA 발현이 조직 특이적이라는 것에 의하여 설명 가능하다.
대부분의 인간 miRNAs는 단백질 코딩 유전자 사이에서 발현되고, 약 1/3은 annotated mRNA의 인트론들 내에 위치한다. 이들 인트론 miRNAs는 일반적으로 pre-mRNA와 동일한 방향을 갖기 때문에, 본래 mRNA 전사체를 조절하는 프로모터의 조절하에서 조절 가능하다. 지금까지 생물정보학적 접근에 의하여 90개 이상의 인트론 miRNAs가 동정되었지만, 이들 분자들의 대부분은 기능이 밝혀지지 않고 있다. 인트론 miRNAs는 일반적으로 그들의 숙주 유전자의 mRNA와 대등하게 발현한다. 본 발명에서는 생물 정보학적 분석에 의하여 DNM2 인트론 16이 miR-199a의 숙주 유전자임과, DNM2의 mRNA가 인트론 miRNA와 함께 발현함을 확인하였다 (도 1 참조).
암세포에서의 과발현된 miRNA의 녹다운 (knock-down) 또는 침묵(silent) miRNA의 발현은 종양세포사멸을 유도할 수 있다. 최근, 'antagomirs'라고 불리는 화학적으로 합성된 올리고뉴클레오타이드의 신규한 종류는 내재 miRNA를 생체내에서(in vivo) 효과적으로 침묵시킬 수 있다는 것이 보고되어 있다. 본 발명에서는 항-miR-199a가 자궁경부암 세포 (SiHa 및 ME-180) 성장을 감소시키고, 시스플라틴-유도 세포독성을 증가시키는 것으로 나타났다 (도 2 참조). 시스플라틴에 의하여 유발되는 DNA 손상은 항-miR-199a의 성장 억제를 증가시킬 수 있다.
요약하면, 본 발명에서는, 항-miR-199a는 세포 성장을 억제하고 항암치료 (chemotherapeutic) 반응을 강화 (in vitro)시키는 것을 확인하였으며, 이는 miR-199a이 자궁경부암 치료를 위한 잠재적 치료 타겟이 될 수 있음을 결론 제안하는 것이라 할 수 있다.
이와 같은 microRNA는 암치료에 사용될 수 있으며, 더 나아가 각종 고형암 세포 내의 microRNA 발현 정도를 측정함으로써 암세포 증식에 대한 판단 기준으로 응용할 수 있다.
이하, 본 발명을 하기의 실시예에 의하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐이며, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의하여 제한되는 것은 아니다.
실시예 1: 시료 채취
원발 ISCC (primary ISCC) 환자 (International Federation of Gynecology and Obstetrics stage of IB to IIA)로부터 신선한 동결된 종양 생검 표본 (n = 10)을 외과수술시에 얻었다. 골반 림프종 (pelvic lymph node) 절제를 포함하는 근치 자궁절제술 (radical hysterectomy)는 2002년 1월에서 2003년 10월 사이에 Department of Obstetrics and Gynecology, Samsung Medical Center에 의해서 수행되었다. 종양 표본을 -80℃에서 즉시 snap-frozen하였다. H&E 염색으로 단독 gynecologic pathologist에 의하여 시험하여, >90% 종양 세포를 90% 이상 포함하는 표본만을 분석에 사용하였다. 환자 특성을 정리하여 아래의 표 1에 나타내었다.
[표 1] 자궁 경부(uterine cervix)에 ISCC가 발병한 10명의 환자의 임상적 배경
No. 나이 세포유형 International Federation of Gynecology and Obstetrics stage Tumor size (cm) 인유두종 바이러스 LN* PM+ RM‡ Recur
1 54 ISCC IB1 1.5 x 1.7 + - - - -
2 69 ISCC IB1 2.4 x 2.6 + + - - -
3 46 ISCC IB1 2.5 x 1.9 + - - - -
4 39 ISCC IB2 4.5 x 3.7 + + - - -
5 38 ISCC IB1 3.8 x 3.2 + + - - -
6 38 ISCC IIA 5.7 x 5.0 - + - - -
7 40 ISCC IB1 4.0 x 3.2 + + - - -
8 74 ISCC IB1 3.9 x 2.7 + - - - -
9 40 ISCC IB1 4.5 x 3.2 + - - - -
10 52 ISCC IB1 2.3 x 1.6 + + - - -
* 림프절 전이
+ 자궁주위 침습 (Parametrial invasion)
‡ 절제면 수반 (Resection margin involvement)
대조군으로서, 양성 산부인과 질환으로 자궁절제술을 받은 환자로부터 정상 자궁경부 조직 (n = 10)을 얻었다. 신선한 자궁경부 생검을 외과적 시술 전에 수득하였다. 디스파제 II (2.4 units/mL; Roche)를 사용하여 간질 (stroma)을 포함하는 전체 자궁경부 조직으로부터 정상 상피 조직을 얻었다 (39). 이들 생검 표본을 멸 균 PBS로 수 분간 세척하고 37℃에서 디스파제 II와 함께 1 시간 동안 배양하여 간질 부분을 침전시켰다. 얻어진 상피 박편을 간질층으로부터 조심스럽게 제거시키고, 멸균 PBS로 2회 세척한 후 전 RNA 추출하였다.
실시예 2: RNA 추출 및 역전사
easy-spin (genomic DNA-free) Total RNA Extraction Kit (iNtRON Biotechnology)를 사용하여 전 RNA를 ISCC 및 정상 상피 조직으로부터 추출하였다. NanoDrop ND-1000 Spectrophotometer (Nano-Drop Technologies)를 사용하여 농도를 정량화하였다. TaqMan MicroRNA 에세이 프로토콜 (PE Applied Biosystems; ref. 38)에 따라서 스템-루프 (stem-loop) 역전사 프라이머쌍 (ABI사 제공)을 이용하여 전 RNA로부터 cDNA를 합성하였다.
실시예 3: TaqMan MicroRNA 에세이를 이용한 miRNA 발현 프로파일링
miRNA 발현 프로파일링을 위하여, 7900HT Sequence Detection system (Applied Biosystems)을 사용하여 실시간 PCR을 수행하였다. 157 개의 인간 성숙 miRNAs의 발현 수준을 Human Panel Early Access Kit (PN 4365381; Applied Biosystems)를 사용하여 측정하였다. 제조자 설명서에 따라서, 내부 대조군으로서 let-7a, 양성 대조군으로서 hsa-miR-16, 음성 대조군으로서 cel-lin-4, ath-miR159a, 및 cel-miR-2을 사용하여 데이터를 정상화하였다:
mature miRNA hsa-let-7a (UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUU, 서열번호 3)
mature miRNA hsa-miR-16 (UAGCAGCACGUAAAUAUUGGCG, 서열번호 4)
mature miRNA cel-lin-4 (UCCCUGAGACCUCAAGUGUGA, 서열번호 5)
mature miRNA ath-miR159a (UUUGGAUUGAAGGGAGCUCUA, 서열번호 6)
mature miRNA cel-miR-2 (UAUCACAGCCAGCUUUGAUGUGC, 서열번호 7)
2-DDCT 법 (Livak KJ, SchmittgenTD. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-컴C(T)) method.Methods 2001;25:402-8)을 이용하여 miRNA의 상대적 양을 계산하였다. 데이터를 단순하여 표현하기 위하여 상대적 발현치에 106을 곱하였다.
실시예 4: DNM2 mRNA 발현에 대한 실시간 정량적 역전사 - PCR 분석
miR-199의 중복하는 전사물로서 DNM2 및 내부 대조군으로서 글리세랄데하이드-3-포스페이트 디하이드로지네이즈 (GAPDH)를 동일한 PCR 반응에 사용하여 실시간 정량적 역전사-PCR을 수행하였다. 게놈 DNA의 증폭을 피하기 위하여, DNM2 및 GAPDH 증폭을 위한 프라이머와 프로브는 다음과 같은 두 개의 엑손 간의 접합부 (junction)에 혼성화 가능한 것으로 선택되었다:
DNM2 (Hs00191900, Applied Biosystems; NM_001005362, exon boundary 13-14, probe 5'-CATCCCCAATCAGGTGATCCGCAGG-3', 서열번호 8), 및
GAPDH (4310884E, Applied Biosystems).
[PCR 조건]
Figure 112008054653544-PAT00001
각 샘플로부터 얻어진 DNM2의 유전자 발현 DCt 값을 GAPDH로 정상화하여 계산하였고, 상대적 정량치를 플로팅하였다 (XiY, Shalgi R, FodstadO, PilpelY, JuJ. Differentially regulatedm icro-RNAs and actively translated messenger RNA transcripts by tumor suppressor p53 in colon cancer. Clin Cancer Res 2006;12:2014-24).
실시예 5: 항- miR -199a의 세포주 및 트랜스펙션
모든 세포 배양에 필요한 시약은 Invitrogen Life Technologies社로부터 구입하였다. 인간 자궁경부암 세포주인, SiHa와 ME-180를 American Type Culture Collection으로부터 입수하였다. SiHa 세포는 10% 우태아혈청, 페니실린 (100 units/mL), 및 스트렙토마이신 (100 Ag/mL)이 보충된 MEM 배지에서 5% CO2 조건하의 37℃에서 배양하였다. ME-180 세포는 McCoy's 5A 및 RPMI 1640에 두었다.
상기 세포들을 anti-miR-199a (Ambion) 100 nmol/L 또는 or negative control using siPort Neo-FX (Ambion)를 사용하는 음성 대조군으로 트랜스펙션시켰다. 3일 후, 상기 세포로부터 얻은 전체 RNA를 분리하여 RNA-spin total extraction Kit (Intron Biotech)를 사용하여 miR-199a의 발현 수준을 조사하였다.
실시예 6: [3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5- 디페닐 - 테트라졸륨브로마이드 ] 에세이에 의한 세포 생존률 측정
자궁경부암 세포 (SiHa 및 ME-180)를 4,000 cells/well으로 96-웰에 플레이팅하고, 3일동안 배양한 후, MTT [3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐-테트라졸륨브로마이드] 에세이를 수행하였다. 상기 MTT 에세이를 위하여, MTT 용액 (PBS에 용해된 10 mg/mL의 MTT 1 mL이 무혈청 배지 9 mL에 첨가됨) 1 mg/mL을 각각의 웰에 첨가하였다. 그리고 나서, 상기 세포들을 암조건하에서 3시간동안 배양하였다. formazan grain를 DMSO (Sigma)에 녹이고, ELISA plate reader (Bio-Rad)를 이용하여 570 nm에서 흡광도를 측정하였다. 세포 증식에 대한 항-miR-199a의 효과를 추가로 조사하기 위하여, 상기 트랜스펙션된 세포를 시스플라틴 1.5 및 3 Ag/mL로 2일간 처리하였다.
<데이터 분석>
SPSS 소프트웨어 (version 10.0, SPSS Inc.)를 사용하여 통계 분석을 수행하였다. Mann-Whitney U 테스트를 사용하여 종양 조직 샘플과 비악성 조직 샘플 간의 유전자 발현 중요성을 측정하였다. 또한, 상기 얻어진 real time PCR 데이터는 시료당 3회 반복수행하여 얻은 각 miRNA 유전자의 발현값에 대하여　중간값을 얻어　log값으로 치환하였고, 피어슨 상관매트릭스를 고려하여 GeneSpring GX software (version 7.3.1, Agilent Technologies) 프로그램을 이용하여　Hierarchical average-linkage clustering 하였다.
실험예 1: ISCC 및 정상 자궁경부 상피 조직에서의 miRNA 발현 비교
ISCC 및 정상 자궁경부 상피 조직을 대상으로 총157개의 miRNA 발현 양상을 비교하였다. 그 결과 70개의 miRNA에서 두 조직간 차등 발현 양상을 보였다(유의수준 p<0.05). 68개의 mRNA는 ISCC 조직에서 발현 상승되었으며, 2개의 miRNA는 발현 감소되었다. 이들 중에서, ISCC조직에서 약 100배 이상 (P < 0.0001)의 현저한 과발현 양상을 보인 10개의 miRNAs는 다음과 같다: miR-199-s, miR-9, miR-199a*, miR-199a, miR-199b, miR-145, miR-133a, miR-133b, miR-214, 및 miR-127. 이와 대조적으로, 두 개의 miRNAs, 즉 miR-149 (2.974-fold change) 및 miR-203 (3.704-fold change)에서는 ISCC에서 현저하게 발현이 감소됨을 관찰하였다.
또한 unsupervised hierarchical clustering를 수행하여 ISCC시료의 임상적 기준에 대한 별도의 사전 정보 없이 상기 샘플들을 분류하였다(도 1 참조). 도 1은 miR-199a의 숙주 유전자인 DNM2 인트론 16의 mRNA 수준의 실시간 정량 PCR 분석 결과를 보여주는 것으로, X 축의 번호는 대상시료의 불특정 일련번호를 의미한다. 원발 ISCC (primary ISCC) 환자 (International Federation of Gynecology and Obstetrics stage of IB to IIA)로부터 신선한 동결된 종양 생검 표본 (Columns, n = 10) (표1 참조)과, 대조군으로서, 양성 산부인과 질환으로 자궁절제술을 받은 환자로부터 추출한 정상 자궁경부 조직 (Normal squamous Epithlium) (Columns, n = 10)에서 순수 분리한 mRNA의 발현 수준을 분석하였으며, ISCCs에서 DMM2 인트론 16이 현저하게 높게 나타남을 보여준다 (p < 0.0001). 이와 같은 과정 분석 수행 결과 ISCC시료간 miRNA 발현 양상은 임상적 유사성에 기초하여 2개의 큰 부류로 분류됨을 확인하였는데, 흥미롭게도 상기 두 클러스터 간 림프절전이에 있어서 차이점이 관찰되었다 (p = 0.052 using Pearson m2 test).
실험예 2: miR -199a의 숙주 유전자 조사
본 시험 예에서는 miR-199a는 숙주 유전자인 DNM2 유전자의 인트론 16에 위치하는 intronic miRNA임을 확인하였다. ISCC에서 과발현된 70개의 miRNA와 중복되는 염기서열을 갖는 중복 전사물 유전자의 염기서열을 Sanger miRNA registry (http://microrna.sanger.ac.uk)를 사용하여 조사하였다. 상기 조사에서 중복되는 전사물의 염색체 위치는 40 개 인트론, 22 개 유전자간 부위, 6 개의 3'-비번역 부위, 2개의 엑손으로 나누어진다. 상위 10개의 miRNAs와 중복되는 전사물의 유전자 목록은 DNM, C1orf61, C20orf166, RP11-771D21.2, 및 RTL1이다.
조사 결과 miR-199-s, miR-199a*, 및 miR-199a의 중복 전사물은 DNM2 mRNA로 동정 확인되었고, DNM2 인트론 16에서의 뉴클레오타이드 서열이 miR-199a* 및 miR-199a의 서열과 상보적임을 발견하였다 (표 2 참조). Intronic miRNA는 이들의 숙주 유전자의 mRNA와 대등하게 발현하기 때문에, 실시간 정량 PCR을 사용하여 동일한 조직을 대상으로 DNM2의 mRNA 발현 수준을 측정하였다. ISCC에서의 mRNA 수준이 정상 자궁 상피 조직과 비교하여 현저하게 발현 증가된 것을 확인하였다 (p < 0.0001; 도 1). 따라서, 이러한 결과들은 miR-199a*와 miR-199a이 숙주 mRNA, DNM2 인트론 16로부터 유래하는 인트론 miRNAs임을 제안하는 것이다.
[표 2] Mature hsa-mir-199 서열
Accession No. ID 서열
MIMAT0000231 hsa-mir-199a 6 - cccaguguuCagacuaCcuguuc - 28
MIMAT0000232 hsa-mir-199a* 46 - uacaguagucugcacauugguu - 67
MIMAT0000263 hsa-mir-199b 26 - cccaguguuUagacuaUcuguuc - 48
Dead miRNA entry hsa-mir-199-s cccaguguuCagacuaCcuguu_
실험예 3: 항- miR -199a에 의한 자궁경부암 세포의 억제 시험
자궁경부암 형성에 있어서 특정 miRNA의 역할을 조사하기 위하여, ISCC에서 가장 발현이 증가하는 miR-199a를 선별하였다 (도 2의 A). TaqMan 실시간 PCR에 의하여 항-miR-199a이 자궁경부암 세포에서의 miR-199a 발현을 현저하게 감소시킴을 확인하였으며, 이는 항-miR-199a가 상기 세포에 효과적으로 도입되어 miR-199a을 넉다운시키는 작용을 한다는 것을 제안하는 것이다 (도 2의 B). 또한, 상기 억제제가 세포 증식도 감소시킴이 확인되었다 (도 2의 C). 또한, 항-miR-199a-매개 세포 증식 억제 효과는 시스플라틴 용량 의존적으로 증가하는 것으로 나타났다 (도 2의 D 및 E).
도 1은 miR-199a의 숙주 유전자인 DNM2 인트론 16의 mRNA 수준의 실시간 정량 PCR 분석 결과를 보여주는 것으로, mRNA 수준이 ISCC 에서 현저하게 높게 나타남을 보여준다 (P < 0.0001).
도 2는 항-miR-199a 올리고뉴크레오타이드에 의한 자궁경부편평세포암종 세포 성장의 억제를 보여주는 것으로, A는 TaqMan real-time PCR (p < 0.0001)로 측정된 자궁경부 침습편평세포암종 조직 및 정상 자궁경부 편평 상피 세포에서의 miR-199a의 상대적 발현, B는 자궁경부 편평세포 (ME-180 및 SiHa)에서의 항-miR-199a에 의한 miR-199a 발현 억제, C는 항-miR-199a에 의한 세포 성장 억제, 및 D와 E는 항-miR-199a와 항암제인 시스플라틴의 복합투여시 시스플라틴 용량 증가에 따라 세포 성장 억제가 증가됨을 보여준다 (Columns, 3번의 독립적 실험의 평균값; bars, SE (*, p < 0.05; **, p < 0.01)).
<110> Samsung Life Public Welfare Foundation Samsung Medical Center <120> Use of microRNA in treating or preventing solid cancers <130> DPP20082131KR <160> 8 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR-199a <400> 1 cccaguguuc agacuaccug uuc 23 <210> 2 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-miRNA-199a <400> 2 gaacagguag ucugaacacu ggg 23 <210> 3 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mature miRNA hsa-let-7a <400> 3 ugagguagua gguuguauag uu 22 <210> 4 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mature miRNA hsa-miR-16 <400> 4 uagcagcacg uaaauauugg cg 22 <210> 5 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mature miRNA cel-lin-4 <400> 5 ucccugagac cucaagugug a 21 <210> 6 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mature miRNA ath-miR159a <400> 6 uuuggauuga agggagcucu a 21 <210> 7 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mature miRNA cel-miR-2 <400> 7 uaucacagcc agcuuugaug ugc 23 <210> 8 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe of DNM2 <400> 8 catccccaat caggtgatcc gcagg 25

Claims (6)

  1. 서열번호 1의 뉴클레오타이드 서열을 갖는 miR-199의 연속하는 15개 이상의 뉴클레오타이드 서열과 상보적 서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드를 유효성분으로 포함하는 자궁경부암 치료 또는 예방용 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오타이드는 서열번호 2의 뉴클레오타이드 서열을 갖는 것인 자궁경부암 치료 또는 예방용 조성물.
  3. 환자로부터 얻은 시료의 miR-199a 생성 정도를 측정하는 단계;
    상기 얻어진 환자의 miR-199a 생성 정도를 정상 시료의 miR-199a 생성 정도와 비교하는 단계; 및
    환자의 miR-199a 생성 정도가 정상 시료의 miR-199a 생성 정도보다 높은 경우 자궁경부암으로 판단하는 단계
    를 포함하는, 자궁경부암 판단 방법.
  4. 제3항에 있어서, 상기 환자는 포유류이고, 상기 시료는 자궁경부 상피 조직 또는 세포인, 방법.
  5. 후보 화합물을 시료와 접촉시키는 단계;
    상기 후보 화합물과 접촉한 시료의 miR-199a 생성 정도를 상기 화합물을 처리하지 않은 경우의 miR-199a 생성 정도와 비교하는 단계; 및
    후보 화합물과 접촉한 시료의 miR-199a 생성 정도가 화합물을 처리하지 않은 경우의 miR-199a 생성 정도보다 감소한 경우 상기 후보 화합물을 자궁경부암 치료제로 선별하는 단계
    를 포함하는, 자궁경부암 치료제 스크리닝 방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 후보 화합물은 15 내지 30 bp 길이의 올리고뉴클레오타이드인, 방법.
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