CN111518913B

CN111518913B - 用于胃癌诊治的非编码rna-linc01819

Info

Publication number: CN111518913B
Application number: CN202010499577.7A
Authority: CN
Inventors: 汪丽燕; 李滨
Original assignee: Affiliated Hospital of Guilin Medical University
Current assignee: Affiliated Hospital of Guilin Medical University
Priority date: 2020-06-04
Filing date: 2020-06-04
Publication date: 2021-02-12
Anticipated expiration: 2040-06-04
Also published as: CN111518913A

Abstract

本发明提供用于胃癌诊治的非编码RNA‑LINC01819。本发明的研究表明LINC01819在胃癌组织和在癌旁组织中的表达存在显著差异，据此认为LINC01819可以作为诊断胃癌的分子标志物。根据上述研究成果开发了可用于早期诊断肝癌的产品。另外，本发明利用体外细胞实验证明抑制LINC01819表达可抑制胃癌细胞增殖和迁移，故可据此开发治疗胃癌的药物。

Description

用于胃癌诊治的非编码RNA-LINC01819

技术领域

本发明属于生物医学领域，涉及用于胃癌诊治的非编码RNA-LINC01819。

背景技术

胃癌(gastric cancer，GC)是危害人类生命健康的消化系统恶性肿瘤之一，同时肿瘤相关死亡率在全世界排在第三位。在中国胃癌的发病率和死亡率均为消化系统肿瘤前列，每年新发病例数约40多万。胃癌不仅给患者健康带来严重损害，同时也让社会家庭背负沉重的精神及经济负担。大多数胃癌患者确诊时己错失最佳诊断和治疗时机，丧失治愈机会，导致疾病进展、肿瘤转移，甚至步入终末期。在早期诊断、综合治疗及病情监测中缺之有效的分子标记物，是限制胃癌预后改善的重要障碍之一。对胃癌发生发展过程中分子机制的进一步研究，努力寻求重要调节分子，可为胃癌诊断、预后判断甚至靶向治疗提供新的方向。目前已有诸多研究探讨胃癌的生物学特性，但在胃癌的临床疗效改善上发挥的作用却微乎其微。缺乏早期诊断的生物标志物、预后指标以及有效的治疗靶点使得胃癌治疗始终存在瓶颈。因此，加强胃癌早期诊断研究，建立新的早期胃癌或转移性胃癌的诊断标准，进而探索新的干预措施，防止胃癌的进一步复发及转移，提髙胃癌术前术后的治疗效果，増加患者的存活率和生活质量对疾病的治疗和预防具有重大的意义。

非编码RNA是指不编码蛋白质的RNA，其中包括rRNA，tRNA，sRNA，snoRNA，microRNA及长链非编码RNA(long non-coding RNA，lncRNA)等，其中miRNA及lncRNA是近期研究的热点。他们在肿瘤的发生中起着重要的调节作用。lncRNA参与人类多种疾病的发生和发展，尤其与恶性肿瘤的发生、发展关系密切。近年来的研究发现，lncRNA可通过多种机制进行调控：(1)编码基因上游转录调控下游基因；(2)与编码基因序列互补干扰mRNA加工；(3)抑制RNA聚合酶II或染色质重构影响基因表达；(4)与蛋白结合形成核酸-蛋白复合体调节蛋白活性；(5)改变蛋白细胞定位；(6)与基因序列形成互补链在DICER作用下生成源性siRNA；(7)作为小分子RNA前体转录。这些作用使lncRNA靶基因形成调控网络，共同参与生命。

随着科技的进步，如生物芯片技术、新一代高通量测序技术及生物信息学的发展，越来越多的研究提示lncRNA是肿瘤发生发展分子调控网络中不可或缺的一部分。随着对lncRNA在细胞生物学中的功能不断深入研究，lncRNA与疾病的关系得到越来越多的关注。尽管目前对lncRNA的致病机理还了解不多，但大量由临床观察和基础实验得来的证据显示，lncRNA的异常表达是疾病发生的重要原因之一。随着肿瘤基因表达谱的完善，越来越多的证据揭示了lncRNA的功能，并发现了大量肿瘤相关lncRNA分子。同时，已经在多种肿瘤中发现lncRNA的异常表达，如：ENSG00000271781、ENSG00000259153在胃癌患者组织中异常高表达(CN201710404209.8、CN201710522240.1)，LOC105371720在肺腺癌组织中表达下调(CN201710128322.8)，并且异常表达的lncRNA和肿瘤的复发、转移及预后有关。lncRNA作为非编码RNA家族的一员，日渐成为肿瘤分子生物学研宄领域的热点。lncRNA的优势在于大多数的lncRNA在组织分化发育过程中具有明显的时空表达特异性。此外，lncRNA在肿瘤等疾病中有特征性的表达方式，并且序列上保守性较低，只有约12％的lncRNA可在人类之外的其它生物中找到。

本发明目的在于寻找在胃癌中异常表达的lncRNA，进一步阐明胃癌发生过程中可能的分子机制，为胃癌早期诊断、治疗提供理论依据。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明的目的之一在于提供一种用于诊断胃癌的长链非编码RNA标志物。本发明证明LINC01819在胃癌组织中的表达水平明显高于在癌旁组织中的水平，因此可以将LINC01819作为诊断胃癌的分子标志物。

本发明的目的之二在于提供一种用于治疗胃癌的药物靶标。本发明证明LINC01819表达可调控胃癌细胞增殖，因此可以将LINC01819作为治疗胃癌的药物靶标。

为了实验上述目的，本发明采用了如下技术方案：

本发明提供了检测长链非编码RNA表达的试剂在制备胃癌辅助诊断的产品中的应用；所述长链非编码RNA的编码基因Gene ID：102723854。

本发明的长链非编码RNA在NCBI中的命名为LINC01819。属于基因ID：102723854编码产物的LINC01819转录本包括：NR_110585.1(2156bp，对应的DNA序列是SEQ ID NO.1)。

进一步，所述试剂包括利用SYBR Green、TaqMan探针、分子信标、双杂交探针、或复合探针检测LINC01819表达量时使用的PCR扩增引物。

在本发明的具体实施方案中，所述引物序列如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示。

本发明提供了一种用于胃癌辅助诊断的产品，所述产品包括检测LINC01819表达水平的试剂。

进一步，所述试剂包括SYBR Green、TaqMan探针、分子信标、双杂交探针、或复合探针检测LINC01819表达量时使用的PCR扩增引物。

进一步，前面所述的产品包括但不限于芯片、试剂盒、试纸、或高通量测序平台；高通量测序平台是一种特殊的诊断胃癌的工具，随着高通量测序技术的发展，对一个人的RNA表达谱的构建将成为十分便捷的工作。通过对比疾病患者和正常人群的RNA表达谱，容易分析出哪个RNA的异常与疾病相关。因此，在高通量测序中获知LINC01819表达异常与胃癌相关也属于LINC01819的用途，同样在本发明的保护范围之内。

所述试剂盒包括检测LINC01819表达量的试剂，所述试剂包括与LINC01819或其DNA序列结合的核酸，所述核酸包括SYBR Green、TaqMan探针、分子信标、双杂交探针、或复合探针检测LINC01819表达量时使用的PCR扩增引物。

所述芯片包括检测LINC01819表达量的试剂，所述试剂包括与LINC01819或其DNA序列结合的核酸，所述核酸包括能够检测LINC01819表达量的探针。

所述试纸包括检测LINC01819表达量的试剂，所述试剂包括与LINC01819或其DNA序列结合的核酸，所述核酸包括能够检测LINC01819表达量的探针。

本发明提供了一种用于治疗胃癌的药物组合物，所述药物组合物包括抑制LINC01819的试剂。

进一步，所述试剂不受限制，只要是可以抑制LINC01819表达水平或抑制LINC01819功能活性即可。

所述试剂包括siRNA、shRNA、抑制型miRNA、或抑制型靶向小分子化合物。

本发明的药物组合物可以作为医药单独施用或与其它药物一起施用。可以与本发明的药物组合物一起施用的其它药物不受限制，只要它不损害本发明的治疗性或预防性药物组合物的效果即可，优选的是，用于治疗或预防肿瘤的药物可以包括例如烷化剂，诸如异环磷酰胺、环磷酰胺、达卡巴嗪、替莫唑胺、尼莫司汀、白消安、丙卡巴肼、美法仑、和雷莫司汀；抗代谢物，诸如依诺他滨、卡培他滨、卡莫氟、克拉屈滨、吉西他滨、阿糖胞苷、阿糖胞苷十八烷基磷酸盐(cytarabine ocfosfate)、替加氟、替加氟-尿嘧啶、替加氟吉美嘧啶奥替拉西钾、去氧氟尿苷、羟基脲、氟尿嘧啶、氟达拉滨、培美曲塞、喷司他丁、巯嘌呤、和甲氨蝶呤；植物生物碱，诸如伊立替康、依托泊苷、索布佐生、多西他赛、nogitecan、帕利他赛、长春瑞滨、长春地辛、和长春碱；抗癌抗生素，诸如放线菌素D、阿柔比星、氨柔比星、伊达比星、表柔比星、净司他丁stimalamer、柔红霉素、多柔比星、吡柔比星、博来霉素、培洛霉素、丝裂霉素C、和米托蒽醌；基于铂的药物，诸如奥沙利铂、卡铂、顺铂、和奈达铂；激素药物，诸如阿那曲唑、依西美坦、雌莫司汀、炔雌醇、氯地孕酮、戈舍瑞林、他莫昔芬、地塞米松、托瑞米芬、比卡鲁胺、氟他胺、泼尼松龙、磷雌酚、米托坦、甲睾酮、甲羟孕酮、美雄烷、亮丙瑞林、和来曲唑；生物反应修饰剂，诸如干扰素α、干扰素β、干扰素γ、白介素、乌苯美司、干BCG、和香菇多糖；和分子靶向药物，诸如伊马替尼(imatinib)、吉非替尼(gefitinib)、吉姆单抗、奥佐米星、他米巴罗汀、曲妥单抗、维A酸、硼替佐米(bortezomib)、和利妥昔单抗等。

本发明的药物组合物可根据需要制备成各种剂型。包括但不限于，经皮、粘膜、鼻、口颊、舌下或经口使用的片剂、溶液剂、颗粒剂、贴剂、膏剂、胶囊剂、气雾剂或栓剂。

本发明的药物组合物的施用途径不受限制，只要它能发挥期望的治疗效果或预防效果即可，包括但不限于静脉内，腹膜内，眼内，动脉内，肺内，口服，小泡内，肌肉内，气管内，皮下的，通过皮肤，通过胸膜，局部的，吸入，通过粘膜，皮肤，肠胃，关节内，心室内，直肠，阴道，颅骨内，尿道内，肝内，瘤内。在某些情况下，可以系统地给药。在某些情况下是局部地给药。

本发明的药物组合物的剂量不受限制，只要获得期望的治疗效果或者预防效果即可，可以依据症状、性别、年龄等来恰当的确定。本发明的治疗药物组合物或预防药物组合物的剂量可以使用例如对疾病的治疗效果或者预防效果作为指标来确定。

本发明还提供了前面所述的长链非编码RNA在制备治疗胃癌的药物中的应用。

本发明还提供了前面所述的抑制LINC01819的试剂在制备治疗胃癌的药物中的应用。

本发明还提供了一种诊断胃癌的方法，所述方法包括如下步骤：

(1)获取受试者的样品；

(2)检测受试者样品中LINC01819的表达水平；

(3)将测得的LINC01819的表达水平与受试者的患病与否关联起来。

(4)与正常对照相比，LINC01819的表达水平显著升高，则该受试者被判断患有胃癌、或判断该受试者患有胃癌的风险高。

本发明还提供了一种胃癌的治疗方法，所述方法包括抑制LINC01819表达量或者抑制LINC01819的调节活性。

本发明还提供了一种肿瘤药物的筛选方法，可以通过在对癌细胞添加测试药物后或在对肿瘤模型动物施用测试药物后的某个时期测量LINC01819的表达水平来测定肿瘤药物改善肿瘤的效果。更具体地说，当LINC01819的表达水平在添加或施用测试药物后降低时或者恢复正常水平时，可选择该药物作为改善肿瘤的治疗药物。

在本发明的上下文中，“诊断胃癌”包括判断受试者是否已经患有胃癌、判断受试者是否存在患有胃癌的风险、判断胃癌患者是否已经复发与转移、判断胃癌患者对药物治疗的反应性、或者判断胃癌患者的预后情况。

本文所用的“治疗”涵盖患有相关疾病或病症的哺乳动物例如人类中治疗相关的疾病或疾病状态，并且包括：

(1)预防疾病或疾病状态在哺乳动物中发生，尤其是当该哺乳动物易感于所述疾病状态，但尚未被诊断出患有这种疾病状态时；

(2)抑制疾病或疾病状态，即阻止其发生；或者

(3)缓解疾病或疾病状态，即使疾病或疾病状态消退。

术语“治疗”通常涉及治疗人类或动物(例如，被兽医所应用)，其中可达到某些预期的治疗效果，例如，抑制病症的发展(包括降低发展速度、使发展停止)、改善病症和治愈病症。还包括作为预防措施(例如预防)的治疗。对还没有发展为病症但有发展为该病症危险的患者的用途，也包括在术语“治疗”中。

本发明的优点和有益效果：

本发明的发现了一种诊治胃癌的分子标志物，使用该分子标志物可以在胃癌发生的早期即可作为判断，提供了患者的生存率。另外，利用本发明的研究成果可开发用于治疗胃癌的药物。

附图说明

图1显示利用QPCR检测LINC01819的差异表达情况的统计图；

图2显示利用CCK-8检测LINC01819表达对胃癌细胞增殖影响的生长曲线图。

具体的实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1 非长链编码RNA的差异表达

1、组织样本来源

对胃癌患者进行外科手术治疗，切除病变组织。在胃癌病灶和远离病灶部位5cm处分别切取黄豆样大小组织一块(作为癌组织以癌旁对照组织)，用手术刀切成厚度不超过0.5cm的组织小块，浸泡入ImL RNA fixer非液氮型样品RNA保存液(北京百泰克)中，放入-80℃超低温冰箱中备用。

2、QPCR检测

用TRIzol试剂(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)分离总RNA，并采用GoScript反转录系统(Qiagen GmbH,Germany)反转录。使用SYBR-Green PCR Master Mix试剂盒(Takara，中国大连)在ABI 7900检测系统(Applied Biosystems,Foster City,CA,USA)上实施了qRT-PCR。以GAPDH为内参基因通过2^-ΔΔCt方法将基因相对表达量标准化。

QPCR扩增引物序列如下：

LINC01819引物序列：

F：5’-ACCTAATCTCAGTGTCCTT-3’(SEQ ID NO.2)，

R：5’-GATTCCTTCATCGTGTCA-3’(SEQ ID NO.3)；

GAPDH引物序列：

F：5’-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3’(SEQ ID NO.4)，

R：5’-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3’(SEQ ID NO.5)。

3、结果

QPCR结果显示，相比对照组织(相对表达量为1)，胃癌组织中LINC01819平均表达水平更高，差异具有统计学意义(P<0.05)(图1)。

实施例2 LINC01819对胃癌细胞功能的影响

1、细胞培养

人胃癌细胞SGC-7901购自美国典型培养物保藏中心(ATCC；Manassas，VA，USA)。上述细胞接种于添加了1％青霉素/链霉素(Solarbio，北京，中国)、10％FBS(Gibco，Rockville，MD，USA)的RPMI-1640(GE Healthcare Life Sciences，Logan，UT，USA)培养基中放置在37℃、5％CO₂条件下的潮湿培养箱中培养。

针对LINC01819的siRNA(siLINC01819)、通用阴性对照siRNA(siNC)由Genechem(中国上海)构建。通过Lipotransfectamine 3000(Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA，USA)将siRNA转染至细胞中。具体操作参见产品说明书。

针对LINC01819的siRNA序列如下：

正义链：5’-UCUUAUCACCCAGAUGUUGCU-3’(SEQ ID NO.6)；

反义链：5’-CAACAUCUGGGUGAUAAGAGA-3’(SEQ ID NO.7)；

2、QPCR

步骤同实施例1。

结果显示针对LINC01819的siRNA干扰效率高于70％，可进行下一步实验。

3、细胞增殖实验

将经过转染的两组待测细胞(1×10⁵/mL)接种于96孔板中，置于含5％CO₂、37℃培养箱中培养0h、24、48、72h后，分别向每孔加入10μL CCK-8溶液)，锡箔纸包好避光，置于37℃培养箱中孵育2h后，用酶标仪测定450nm处的吸光度，重复3次。结果如图2所示，siLINC01819组细胞增殖速度相比siNC组明显变慢，表明抑制LINC01819表达可显著抑制胃癌细胞增殖。

4、Transwell实验检测细胞迁移

实验前12h将两组待测细胞的培养基更换为无血清培养基培养，加入200μL无血清培养基稀释的各组细胞悬液(2×10⁵/mL)于Transwell小室上室表面，小室下层孔板中加入含10％血清的完全培养液800μL，分别置于含5％CO₂、37℃细胞培养箱内培养48h，棉签轻轻擦拭上层小室内的液体，PBS轻柔洗2次，甲醇固定20min后行结晶紫染色20min，移去结晶紫，PBS柔洗2次晾干后，倒置显微镜下随机选取膜上5个不同视野，计算穿过小室的细胞个数，取平均值计数并统计分析。结果如表1所示，siLINC01819组迁移细胞数相比siNC组明显变少，表明抑制LINC01819表达可显著抑制胃癌细胞迁移。

表1胃癌细胞迁移数量

siNC	siLINC01819	P
			241.4±31.10	86.6±8.56	0.000311

上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

序列表

<110> 桂林医学院附属医院

<120> 用于胃癌诊治的非编码RNA-LINC01819

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2156

<212> DNA

<213> 人工序列(Homo sapiens)

<400> 1

gggtggcttt gtgaggatgg ctttgtgtgg ctgcacattg cccttggcca agccccgctg 60

ccaggagagg cagctcggct gccaaacctc ctgaacccaa gttacctgag caagcagccc 120

tatcccctcg cctgcttctc actgcctcgc ctgccttggg cctgcccgac ccagggggtc 180

acatgccttg ttccccatca gtggagacca gggacaagaa gacagttctg tgggaagagc 240

caggaggacc atttgggaaa atacaggttc caggtgtgtc tccagacctt gagagttggt 300

gtctcctggg aagaggccct gatgagatct ggggagattc ggatctgatg agattcagga 360

agccctggcc tctccgtact tgaggagacg ggacacacag gacaagctgc aggctggtga 420

gcaggttcac cttctatttt gaagacccgc ttcttcctca ggtacctgat cttgaaaacg 480

acctcccctt tcaggccggc gtgcagcagg gcaatcgtgg ttcactgcaa cctcgacctc 540

ccagggtcaa gtgatcctcc agcctcagcc ccacaagtag ctgggaccac agacggttga 600

gcccatagaa caggagtgag aagatggaag ggcgaggggg ctgggatgat gaaaacttgc 660

gcctgcagcc accattcatt acagagcgcc gggggccagc tgcagaactg tagactcctc 720

atacatcatc gtgttgagtc ttcaaaacaa acctatgagg ctggagtgca gcagcgcgat 780

ctcggctcac tgcaacttcc acctcctggt ttcaagcaat tctcccgcct cagcctcccg 840

agtagctggg attacaagca cccgccacca tgcccggcta atttttatat ttttagcaga 900

ggcgggattt ctccatgtag cccaggccgg tctcgaactc ctgacctcaa gtgatccacc 960

cacctcagcc tcccaaagtg ctgggattac aggtgtgagc caccatgccc cgccagccat 1020

cagagtttta tagcaagaat ttttaccttt gtccttagtg caatgggaaa tccttgaaac 1080

gctattattg ccttcctctg caaggaaagg ttattttggt gagcagtgga tagaggaaat 1140

gcagagggag ccactaaagg gttctggtga gatctggagc cctgctggga taatctgacc 1200

agagaaagca aagattccag agagctaggc acacttgccc tacctccagc tgcacacagc 1260

tggttccagc tttgtcctga ccttcagtct ggcatacagg gtagacccac tggtacctgg 1320

tacctcactc tgggggtgag gtggccaccc acctaggtct gggtcctgta gcagtttggc 1380

agcaacatct gggtgataag agaaggcgat ttgacctact cccagggaca agaagctttg 1440

actcttcaag atcataaagt cttccctcct ggccttgggt cctcctgttg cgggagaggt 1500

gaggtggggt gagggtcctc cgggagggca ggcttggcag agcccagcac catctcagca 1560

gacactgctc ttctcctact ctcagcacct ccaaggcagt gagtggcttt ctcttgtcta 1620

gaggacaaaa tccgttcctc acctggacac aatgaacctg tctgtgggat ttagggagca 1680

tcaaggaggg aatttagttt ccgcagactt caaggaagac tttctggagg aggtgatgcc 1740

tgagagctat ccaggagaga agagtgaaaa aatgttaagc agtggaaaaa catgaaccaa 1800

actgtggctg catcttccca tagggcaaca gggacttagc gcgtgcaatc aaggatctcc 1860

agatggggat aacccaggtg tgcccaacct aatctcagtg tccttggaag agggatgcag 1920

aaggagtcag aatcagagaa gaaggtgaca cgatgaagga atccgaaatt agagtgatgc 1980

tctttgaaga tggaggaagg gaccacaagc tgagaaatag aggtggccac tagacactga 2040

aaaaggcaag gaagtggatt ctcccctgga gcctccagaa ggaaccagct ctgccgacac 2100

cttgacatta gcccattgag actgatttaa gggctgctgg cctccagaat tgtaag 2156

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

acctaatctc agtgtcctt 19

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gattccttca tcgtgtca 18

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ggagcgagat ccctccaaaa t 21

<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ggctgttgtc atacttctca tgg 23

<210> 6

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ucuuaucacc cagauguugc u 21

<210> 7

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

caacaucugg gugauaagag a 21

Claims

1.抑制LINC01819表达的试剂在制备治疗胃癌的药物中的应用，其特征在于，所述试剂是针对LINC01819的干扰RNA，所述干扰RNA序列如SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7所示。