CN111088355A - 用于胃癌诊断的分子标记物及试剂盒 - Google Patents

用于胃癌诊断的分子标记物及试剂盒 Download PDF

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CN111088355A CN201911401340.4A CN201911401340A CN111088355A CN 111088355 A CN111088355 A CN 111088355A CN 201911401340 A CN201911401340 A CN 201911401340A CN 111088355 A CN111088355 A CN 111088355A
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    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/178—Oligonucleotides characterized by their use miRNA, siRNA or ncRNA

Abstract

本发明公开了用于胃癌诊断的分子标记物及试剂盒；所述分子标记物是LINC01176。本发明还公开了用于胃癌诊断的试剂，所述诊断试剂通过检测被试者胃组织中LINC01176的含量，进而诊断胃癌。本发明还公开了LINC01176与胃癌细胞增殖的关系，有利于指导临床治疗。

Description

用于胃癌诊断的分子标记物及试剂盒
技术领域
本发明属于生物医学领域，涉及用于胃癌诊断的分子标记物及试剂盒。
背景技术
胃癌(GC)的是导致死亡的全球第二大癌症。病情的快速发展和转移导致其预后较差。为了提高GC的早期诊断和靶向治疗，迫切需要了解其潜在的分子机制并确定新的、有效的新的生物标记物和治疗靶点。
长链非编码RNA(lncRNAs)是一类转录本长度超过200nt的RNA分子，有别于其他小分子非编码RNA，其可以顺式(in cis)或反式(in trans)作用的方式调节RNA代谢、蛋白质功能活性、组蛋白修饰及染色质重塑，在表观遗传学、转录以及转录后水平广泛参与细胞生物学过程。非编码RNA(ncRNA)是无法被翻译成蛋白质的RNA。分为两大类：小RNA(＜200NT)和lncRNAs。小ncRNA包括小分子RNA，siRNA和DNA，已经被证明在胃癌发生中起着重要的作用。近年来，许多研究表明lncRNAs参与多种疾病的发生，在广泛的生物过程具有多种功能，特别是与人类癌证发病相关。研究显示：除这些已被广泛研究的编码基因外,长非编码RNA(long noncoding RNAs，lncRNAs)的异常表达也参与肿瘤恶性进展。越来越多的研究证实，lncRNAs不仅在维持机体的正常生理功能及发育过程中发挥重要的调控作用,其异常表达与疾病的发生发展尤其是肿瘤的恶性进展有着密切的联系。一个众所周知的致癌lncRNA参与肿瘤的发病机理为HOTAIR(HOX转录反义基因RNA)，它一直被上调，确定为病人的结果强烈的预后标志物，如影响多种人类肿瘤患者的生存率。
近来，有很多研究显示，lncRNA在胃癌组织中高表达。因此急需寻找新的lncRNAs，并探讨其对胃癌的生物学效应，以获得用于诊断和胃癌基因治疗的潜在治疗靶点。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于诊治胃癌的长链非编码RNA标志物。本发明利用实验证明LINC01176在胃癌组织中的表达水平明显高于在癌旁组织中的水平，因此可以将LINC01176作为诊治胃癌的分子标志物。
为了实验上述目的，本发明采用了如下技术方案：
本发明提供了检测长链非编码RNA表达的试剂在制备胃癌诊断产品中的应用。
本发明的长链非编码RNA在NCBI中的命名为LINC01176，其基因ID：100506516，LINC01176的转录本序列为Genbank登录号NR_108081.1(具有728bp的长度，相应的DNA序列如SEQ ID NO.1所示)。
进一步，所述试剂包括利用SYBR Green、TaqMan探针、分子信标、双杂交探针、或复合探针检测LINC01176表达量时使用的PCR扩增引物。
在本发明的具体实施方案中，所述引物序列如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示。
本发明提供了一种用于胃癌诊断的产品，所述产品包括检测LINC01176表达水平的试剂。
进一步，所述试剂包括SYBR Green、TaqMan探针、分子信标、双杂交探针、或复合探针检测LINC01176表达量时使用的PCR扩增引物。
在本发明的具体实施方案中，所述引物序列如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示。
进一步，前面所述的产品包括但不限于芯片、试剂盒、试纸、或高通量测序平台；高通量测序平台是一种特殊的诊断胃癌的工具，随着高通量测序技术的发展，对一个人的RNA表达谱的构建将成为十分便捷的工作。通过对比疾病患者和正常人群的RNA表达谱，容易分析出哪个RNA的异常与疾病相关。因此，在高通量测序中获知非LINC01176的异常与胃癌相关也属于LINC01176的用途，同样在本发明的保护范围之内。
所述试剂盒包括检测LINC01176表达量的试剂，所述试剂包括与LINC01176或其DNA序列结合的核酸，所述核酸包括SYBR Green、TaqMan探针、分子信标、双杂交探针、或复合探针检测LINC01176表达量时使用的PCR扩增引物。
所述芯片包括检测LINC01176表达量的试剂，所述试剂包括与LINC01176或其DNA序列结合的核酸，所述核酸包括能够检测LINC01176表达量的探针。
所述试纸包括检测LINC01176表达量的试剂，所述试剂包括与LINC01176或其DNA序列结合的核酸，所述核酸包括能够检测LINC01176表达量的探针。
本发明提供了一种用于治疗胃癌的药物组合物，所述药物组合物包括抑制LINC01176的试剂。
进一步，所述试剂不受限制，只要是可以抑制LINC01176表达水平或抑制LINC01176功能活性即可。
所述试剂包括LINC01176的siRNA或shRNA。在本发明的具体实施方案中，所述LINC01176的siRNA序列如SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7所示。
本发明的药物组合物可以作为医药单独施用或与其它药物一起施用。可以与本发明的药物组合物一起施用的其它药物不受限制，只要它不损害本发明的治疗性或预防性药物组合物的效果即可。
本发明的药物组合物可根据需要制备成各种剂型。包括但不限于，经皮、粘膜、鼻、口颊、舌下或经口使用的片剂、溶液剂、颗粒剂、贴剂、膏剂、胶囊剂、气雾剂或栓剂。
本发明的药物组合物的施用途径不受限制，只要它能发挥期望的治疗效果或预防效果即可，包括但不限于静脉内，腹膜内，眼内，动脉内，肺内，口服，小泡内，肌肉内，气管内，皮下的，通过皮肤，通过胸膜，局部的，吸入，通过粘膜，皮肤，肠胃，关节内，心室内，直肠，阴道，颅骨内，尿道内，肝内。在某些情况下，可以系统地给药。在某些情况下是局部地给药。
本发明的药物组合物的剂量不受限制，只要获得期望的治疗效果或者预防效果即可，可以依据症状、性别、年龄等来恰当的确定。本发明的治疗药物组合物或预防药物组合物的剂量可以使用例如对疾病的治疗效果或者预防效果作为指标来确定。
本发明还提供了前面所述的长链非编码RNA在制备治疗胃癌的药物中的应用。
本发明还提供了抑制前面所述的长链非编码RNA的试剂在制备治疗胃癌的药物中的应用。
进一步，所述试剂的限定同前。
本发明还提供了一种诊断胃癌的方法，所述方法包括如下步骤：
(1)获取受试者的样品；
(2)检测受试者样品中LINC01176的表达水平；
(3)将测得的LINC01176的表达水平与受试者的患病与否关联起来。
(4)与对照相比，LINC01176的表达水平升高，则该受试者被判断患有胃癌、或者该受试者患有胃癌的风险高、或者胃癌患者被判断为预后不良。
本发明还提供了一种胃癌的治疗方法，所述方法包括降低LINC01176表达量或者抑制LINC01176的功能活性。
本发明还提供了一种胃癌药物的筛选方法，可以通过在对胃癌细胞添加测试药物后或在对胃癌模型动物施用测试药物后的某个时期测量LINC01176的表达水平来测定肿瘤药物改善肿瘤预后的效果。更具体地说，当LINC01176的表达水平在添加或施用测试药物后降低时或者恢复正常水平时，可选择该药物作为改善肿瘤预后的治疗药物。
在本发明的上下文中，“诊断胃癌”包括判断受试者是否已经患有胃癌、判断受试者是否存在患有胃癌的风险、判断胃癌患者对药物治疗的反应性、或者判断胃癌患者的预后情况。
本文所用的“治疗”涵盖患有相关疾病或病症的哺乳动物例如人类中治疗相关的疾病或疾病状态，并且包括：
(1)预防疾病或疾病状态在哺乳动物中发生，尤其是当该哺乳动物易感于所述疾病状态，但尚未被诊断出患有这种疾病状态时；
(2)抑制疾病或疾病状态，即阻止其发生；或者
(3)缓解疾病或疾病状态，即使疾病或疾病状态消退。
术语“治疗”通常涉及治疗人类或动物(例如，被兽医所应用)，其中可达到某些预期的治疗效果，例如，抑制病症的发展(包括降低发展速度、使发展停止)、改善病症和治愈病症。还包括作为预防措施(例如预防)的治疗。对还没有发展为病症但有发展为该病症危险的患者的用途，也包括在术语“治疗”中。
本发明的优点和有益效果：
本发明的发现了一种诊断胃癌的分子标志物，使用该分子标志物可以在胃癌发生的早期即可作为判断，提供了患者的生存率。
本发明的包括抑制LINC01176的试剂的治疗药物可用作新的胃癌的治疗药物。
附图说明
图1显示利用QPCR检测LINC01176表达抑制情况的统计图。
具体的实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1差异表达LncRNA研究
1、研究对象
收集医院肿瘤外科经胃癌根治术的50例原发性胃癌患者的手术标本(胃癌组织以及对应的癌旁正常组织)。50例病人中男30例，女20例；年龄38～79岁，平均61岁，病人术前均未曾接受过辅助治疗。组织标本RNA提取后立即置于-80℃保存。
入组标准：a.术前诊断为原发性胃癌，且没有接受肿瘤的治疗；b.没有合并其他恶性肿瘤；c.无其他并发症，如胃穿孔、消化道大出血、消化道梗阻等并发症，患者术前一般情况良好；d.无其他慢性疾病，如高血压、糖尿病等。
2、在转录水平上进行检测
采用RNAisoPlus(TaKaRa，Shiga，Japan)分别提取实验组(胃癌组织)以及对照组(相邻正常胃组织)中的总RNA，采用分光光度计检测RNA的浓度以及纯度。利用PrimeScript逆转录酶(TaKaRa，Shiga，Japan)将其逆转录成互补DNA(cDNA)。以cDNA为模板，按照SYBRGREEN EX TaqTM(TaKaRa，Shiga，Japan)说明书要求的反应体系和反应时间在LightCycler480上进行QPCR，所有实验结果重复3次，结果以2－△△CT计算并进行统计分析。实验以GAPDH作为内参基因。LINC01176上游引物:5’-CCAAGAGAACAAGGCAGAA-3’(SEQ IDNO.2),下游引物:5’-GGATGGTGGAAGTGACTC-3’(SEQ ID NO.3)；GAPDH上游引物：5’-TCATGGGTGTGAACCATGAGAA-3’(SEQ ID NO.4),下游引物:5’-GGCATGGACTGTGGTCATGAG-3’(SEQ ID NO.5)。
3、结果
统计结果如图1显示，与癌旁组织相比，胃癌组织中LINC01176表达水平显著升高，约7.9倍，差异具有统计学意义(P<0.05)。利用GEO数据库进行电子验证，ROC曲线分析显示，LINC01176在区分胃癌患者和正常人时，其AUC值是0.8381。
实施例2抑制LINC01176表达
1、细胞培养与转染
细胞培养：胃癌细胞株BGC-823用含10％FBS的DMEM，并放置在5％CO2、饱和湿度，37℃二氧化碳培养箱培养。培养液每隔两天更换一次，细胞传代时用0.25％胰蛋白酶消化细胞。
siRNA转染：转染的前一天，将细胞消化接种到培养皿或培养板中，细胞接种的数量应保证第二天转染时能达到30-50％的密度。siRNA转染时严格按照LipofectaminTM2000说明书进行，4-6h后更换含10％FBS新鲜培养液，继续培养48h。
2、siRNA设计
siRNA(small interfering RNA)的设计：通过BLAST检索，在LINC01176的特异性序列区域设计siRNA序列：
siRNA-LINC01176
正义链：5’-AAGUGUUUGUGGUAUCAGCAA-3’(SEQ ID NO.6)；
反义链：5’-GCUGAUACCACAAACACUUGU-3’(SEQ ID NO.7)。
上述siRNA由上海吉玛制药技术有限公司合成，同时该公司提供阴性对照siRNA(siRNA-NC)。
3、利用QPCR实验检测siRNA的干扰情况
步骤同实施例1。
4、结果
siRNA转染胃癌细胞株BGC823后，应用QPCR检测LncRNA转录水平的改变。结果显示，实验组细胞(siRNA-LncRNA，相对表达量21.56±3.03％)较对照组细胞(siRNA-NC，相对表达量100％)中LncRNA表达水平明显降低，差异具有统计学意义(P<0.05)，表明本发明的siRNA-LncRNA可显著抑制细胞内LINC01176表达。
实施例3抑制LINC01176表达对胃癌细胞增殖能力的测定
1、步骤：
取对数生长期的BGC-823细胞，接种于96孔培养板上，细胞培养12h后，分别转染siRNA-LncRNA和siRNA-NC，4-6h后，更换含10％FBS的DMEM继续培养72h；每板每孔加10μLCCK8，培养箱中孵育2h后用酶标仪检测波长450nm的吸光度值。实验重复3次,绘制细胞生长曲线。
2、统计学分析
实验数据均采用均数士标准差表示，采用SPSS15.0统计学软件，进行单因素方差分析(ANOVA)或t检验。P<0.05为差异有统计学意义。
3、结果
结果显示，转染后72h，siRNA-LncRNA组(0.757±0.054)的细胞生长速度相比siRNA-NC(1.546±0.052)明显下降(P<0.05)。结果表明，抑制LINC01176表达对胃癌细胞株BGC823的增殖能力有抑制作用。
上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。
序列表
<110> 北京泱深生物信息技术有限公司
<120> 用于胃癌诊断的分子标记物及试剂盒
<160> 7
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 728
<212> DNA
<213> 人源(Homo sapiens)
<400> 1
ctgagacagc agttgctgat accacaaaca cttgtctgct gtttctgtgg cctggctgag 60
ccaagaaaac atgttaaagc acagagccca cgcaagacag tgtgcttgca ggagacccta 120
ccaacaggaa tcggataaca aggagctaaa gagcctaatg ggaggtgact ggatcatggg 180
agcagagttc tcttggatgg tttagcatta tccccttggc gctgtctttg cggtacttct 240
agcaagatct ggctgtttaa agtattggct ggagttggcg atgactcagc agatcaaggc 300
tggaagactc attctcgtca ggtggttgac gttggctgtc agttggaacc tcacctgggg 360
ctgtttgcca gaacacctac acatggcatg tccatggagc tatttgactt cctcactgca 420
atggctgggt tccaagagca gttatcccaa gagaacaagg cagaagtgca tgacttttag 480
aatcttgtct cacaagtcac acagagtcac ttccaccatc ccctgttggt caaggaggac 540
atgaaggtct tcctaggagc acggggagaa gacagacttc taccacctgt tggaaggagt 600
gtcagtgtta catagcaaga gaagcacatg gaatgggatg tattgtgatg cccatctttg 660
gaacagacaa tttggcatat ctgtgaaaat taaaagtctg atttggatat aacaaaaaaa 720
aaaaaaaa 728
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ccaagagaac aaggcagaa 19
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ggatggtgga agtgactc 18
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tcatgggtgt gaaccatgag aa 22
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ggcatggact gtggtcatga g 21
<210> 6
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
aaguguuugu gguaucagca a 21
<210> 7
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
gcugauacca caaacacuug u 21

Claims (10)

1.检测长链非编码RNA表达的试剂在制备胃癌诊断产品中的应用；所述长链非编码RNA是LINC01176。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述试剂包括利用SYBR Green、TaqMan探针、分子信标、双杂交探针、或复合探针检测所述长链非编码RNA表达量时使用的PCR扩增引物。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述引物序列如SEQ ID NO.2和SEQ IDNO.3所示。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的应用，其特征在于，所述产品包括试剂盒、芯片、或试纸。
5.一种用于胃癌诊断的产品，其特征在于，所述产品包括检测权利要求1-4中任一项所述的长链非编码RNA表达的试剂。
6.根据权利要求5所述的产品，其特征在于，所述试剂包括SYBR Green、TaqMan探针、分子信标、双杂交探针、或复合探针检测所述长链非编码RNA表达量时使用的PCR扩增引物。
7.根据权利要求6所述的产品，其特征在于，所述引物序列如SEQ ID NO.2和SEQ IDNO.3所示。
8.一种用于治疗胃癌的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括抑制权利要求1-4中任一项所述的长链非编码RNA的试剂。
9.根据权利要求8所述的药物组合物，其特征在于，所述试剂包括抑制长链非编码RNA水平的试剂，或抑制所述长链非编码RNA功能活性的试剂。
10.权利要求1-4中任一项所述的长链非编码RNA在制备治疗胃癌的药物中的应用。
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