CN103571839B - 具有转录和转录后双水平基因沉默功能的microRNA的筛选方法 - Google Patents

具有转录和转录后双水平基因沉默功能的microRNA的筛选方法 Download PDF

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Abstract

本发明是提供了一种具有转录和转录后双水平基因沉默功能的microRNA的筛选方法。通过上述方法筛选得到的microRNA既能够通过结合于5’侧翼区特异位点从而下调目的基因mRNA表达（具有转录抑制能力），又能够通过结合于3’非翻译区特异位点从而下调目的基因蛋白表达的作用（具有转录后/翻译抑制能力）。

Description

具有转录和转录后双水平基因沉默功能的microRNA的筛选 方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，更具体而言，涉及一种具有转录和转录后双水平基因沉默功能的microRNA的筛选方法，由本发明的方法筛选得到的microRNA具有同时在转录与转录后水平调控基因表达的机制(双重调控)。
背景技术
基因沉默是一个广义的概念，是基因表达的表观遗传调控过程，通常是指生物体中特定基因不表达或表达低于正常水平的现象，但并不是由于遗传物质本身的改变所引起。这一现象广泛存在于生物界，是生物体内源存在的基因表达调控机制，同时也是生物学研究中抑制基因表达的重要技术之一。降低某基因的表达水平，进而观察所引起的现象是研究此基因功能非常有效的手段。以核酸为药物靶点，已开发了对特定基因沉默的多种药物。目前已有多种形式的寡核苷酸被应用于临床试验，如反义寡核苷酸、小干扰RNA(Smallinterfering RNA,siRNA)、核酸适体(aptamers)、镜像异构微小RNA(spiegelmersmicroRNA)等。
基因沉默可通过多种方式实现，可以发生在转录或转录后水平。转录水平的基因沉默包括组蛋白修饰、基因组印迹、副突变、转座子沉默、转基因沉默、位置效应、RNA介导的DNA甲基化等。转录后基因沉默可通过RNA干扰、无义链介导的RNA衰变等方式实现。RNA干扰(RNA interference,RNAi)是目前最常用的转录后基因沉默技术，将与内源mRNA同源的小片段外源双链RNA(dsRNA)或小发夹RNA(small hairpin RNA,shRNA)导入细胞内可以诱导该mRNA降解，从而阻断相应基因表达。无论dsRNA或shRNA最后都要被Dicer加工成21个碱基长度的功能性双链小RNA(siRNA)。
目前，siRNA介导的基因沉默技术已被广泛应用于基因功能的科学研究，是目前研究中最常用的基因沉默技术，同时siRNA在多种疾病(如病毒感染、肿瘤等)的治疗与药物研发中均具有重要的意义，但RNAi技术有其局限性：(1)在哺乳动物细胞中，RNAi并不能完全阻断基因的表达，特别是表达高的基因；(2)RNAi并不适用于所有的基因，如dsRNA对一些在神经细胞中发挥功能的基因抑制作用不明显；(3)RNAi的脱靶效应(off-target)明显；(4)SiRNA会激活体内的干扰素反应基因，引起副作用。
微小RNA(microRNA,miRNA)是近年新发现的细胞内源产生的调节基因表达的小分子非编码RNA，其调节的效应通常是抑制基因表达。到目前的研究发现，至少60％以上基因的表达受microRNA调控，它们参与了细胞增殖、分化、凋亡和代谢等几乎所有生命过程，在心血管疾病、神经系统疾病、造血系统疾病、糖尿病及各种肿瘤的病理过程中也发挥了重要作用。作为一种内源的、具有良好的适应性与特异性、抑制效果显著的小RNA分子，microRNA作为基因沉默药物的开发受到了极大的关注。目前已有多个microRNA及其修饰序列作为药物处于临床开发阶段。
microRNA作用机制
目前已知的microRNA基因沉默机制一般为转录后调控机制。miRNA的靶位点大多位于mRNA的3’非翻译区域(3’-untranslated region,3’-UTR)，功能性的单链成熟miRNA被整合到RNA诱导沉默复合体(RNA-induced silencing complex,RISC)中，与靶mRNA结合，通过mRNA剪切、mRNA去腺苷或抑制翻译等方式在转录后水平抑制基因表达。microRNA的这种调节方式依赖于miRNA种子区(Seed region)序列(第2～7位碱基)与目的mRNA 3’非翻译区序列的互补配对。
近年来，也有报道表明miRNA以互补配对的方式结合到基因的启动子区，通过影响RNA聚合酶的结合，引起组蛋白甲基转移酶或DNA甲基转移酶在该区域的富集导致组蛋白或DNA的甲基化，从而在转录水平上抑制基因转录，这种调节方式并不依赖于miRNA种子区的序列匹配，能够在较低剂量、较长时间来抑制基因表达。因此，miRNA可以通过转录或转录后抑制的方式引起目的基因沉默。
发明内容
本发明人经过大量的实验与验证，筛选得到的miRNA可以同时通过两种方式(转录抑制和转录后的翻译抑制)作用于目的基因，这种外源给予的miRNA可以通过同时抑制目的基因的转录和翻译从而有效抑制目的基因表达的方式说明miRNA对靶基因的这种“转录和转录后双管齐下”的调节方式可以成为基因沉默的有效手段。
因此，本发明的一个目的是提供一种具有转录和转录后双水平基因沉默功能的microRNA的筛选方法。
本发明的另一个目的是提供一种由上述方法筛选得到的microRNA。
本发明的再一个目的是提供一种由上述方法筛选得到的microRNA的用途。
本发明的又一个目的是提供一种基因沉默的方法。
在本发明的一个方面中，提供了一种具有转录和转录后双水平基因沉默功能的microRNA的筛选方法，所述方法包括：
步骤1)：使用miRBase数据库对目的基因的转录起始位点前1-2kb的5’侧翼区(5’-flanking region,5’-FR)(启动子可能存在的位置)进行microRNA结合位点预测，得到能够结合于目的基因启动子区域的microRNA；
步骤2)：使用TargetScan数据库对目的基因的3’非翻译区进行microRNA结合位点预测，得到能够结合于目的基因3’非翻译区的microRNA；
步骤3)：化学合成上述步骤1)和步骤2)中得到的microRNA，并检测microRNA对目的基因蛋白表达的影响，由此筛选得到能够下调目的基因蛋白表达的microRNA；
步骤4)：检测步骤3)中得到的能够下调目的基因蛋白表达的microRNA对目的基因mRNA表达的影响，由此筛选得到能够同时下调目的基因mRNA和蛋白水平的microRNA；
步骤5)：使用基因定点突变与萤光素酶报告基因的方法验证microRNA转录与转录后双重基因沉默能力，从而筛选得到具有转录和转录后双水平基因沉默功能的microRNA。
本发明方法中，步骤1)中，所述miRBase数据库为http://www.mirbase.org/ search.shtml。
本发明方法中，步骤2)中，所述TargetScan数据库为http:// www.targetscan.org/。
上述数据库是目前应用最广泛，在科研领域、药物开发领域认可程度最高的数据库。本发明使用上述数据库可以保证预测的准确性与可靠性。
本发明方法中，步骤3)中，检测microRNA对目的基因蛋白表达的影响的方法包括脂质体转染与蛋白免疫印迹等。
本发明方法中，步骤4)中，检测步骤3)中得到的能够下调目的基因蛋白表达的microRNA对目的基因mRNA表达的影响的方法包括总RNA抽提，cDNA反转录以及实时荧光定量PCR。
本发明方法中，步骤5)包括以下步骤：
a)使用miRbase数据库预测，结合人工比对，确认筛选得到的microRNA与目的基因5’侧翼区的结合位点，使用基因定点突变技术，将5’侧翼区上的结合位点突变，然后将野生型与突变型的5’侧翼区分别插入携带renilla(海肾)萤光素酶的载体(PGL4.10,Promega)，用携带firefly(萤火虫)萤光素酶的载体PGL4.73作为内参，将PGL4.10与PGL4.73这两个载体同时转入细胞中，加入步骤4)中得到的microRNA模拟物，检测5’侧翼区microRNA结合位点突变对renilla萤光素酶活性的影响，确认microRNA与目的基因5’侧翼区的结合位点，最终确定该microRNA是否具有转录水平的调控能力，由此筛选得到具有转录水平的调控能力的microRNA。
b)使用TargetScan数据库预测，结合人工比对，确认筛选得到的microRNA与目的基因3’非翻译区的结合位点，使用基因定点突变技术，将3’非翻译区上的结合位点突变，然后将野生型与突变型的3’非翻译区分别插入firefly萤光素酶载体psiCHECK2，以载体自身携带的renilla萤光素酶为内参，将分别携带野生型与突变型的psiCHECK2载体分别转入细胞中，加入microRNA模拟物，检测3’非翻译区microRNA结合位点突变对firefly萤光素酶活性的影响，确认步骤a)中得到的具有转录水平的调控能力的microRNA与目的基因3’非翻译区的结合位点，最终确定该microRNA是否具有转录后(翻译)水平的调控能力，由此筛选得到具有转录和转录后双水平基因沉默功能的microRNA。
本发明中，所述人工比对，是指在上述数据库(miRbase，TargetScan)预测的基础上，使用Vector NTI软件(Invitrogen)，RNAhybrid在线软件(http:// bibiserv.techfak.uni-bielefeld.de/rnahybrid/)以及核酸序列片段的手工查找(Excel,Microsoft)，考察microRNA与目的基因的结合能力与配对序列。
其中，所述细胞可为PLC/PRF/5肝脏细胞，也可以为293细胞，也可以为786-O肾脏细胞系。
因此，通过上述方法筛选得到的microRNA既能够通过结合于5’侧翼区特异位点从而下调目的基因mRNA表达(具有转录抑制能力)，又能够通过结合于3’非翻译区特异位点从而下调目的基因蛋白表达的作用(具有转录后/翻译抑制能力)。
在步骤4)中，我们筛选得到了可以同时下调目的基因mRNA与蛋白水平的microRNA，mRNA水平下调可能与microRNA的转录水平(结合于启动子或5’侧翼区)调控机制相关，蛋白水平下调可能与microRNA的转录后调控机制相关，因此，基于下列原因，我们应用基因定点突变与萤光素酶报告基因的方法验证microRNA的作用机制。
①使用miRbase与TargetScan数据库预测microRNA与目的基因的结合位点时有一定的局限性。例如TargetScan数据库会使用microRNA种子区域与目的基因3’非翻译区碱基配对数量(一般要求配对数量大于6)来筛选预测结果，但由于RNA二级结构的复杂性，配对碱基数量少于6，或存在U-G配对时，microRNA也可能与目的基因3’非翻译区进行有效结合，从而起到下调目的基因表达的作用。因此，在这种情况下，使用一定程度的人工比对的方式可以对数据进行更好的筛选。
②使用miRbase数据库预测，结合人工比对，确认筛选得到的microRNA与目的基因5’侧翼区的结合位点，使用基因定点突变技术，将5’侧翼区上的结合位点突变，然后将野生型与突变型的5’侧翼区分别插入萤光素酶载体，并将载体转入细胞中，加入microRNA模拟物，检测5’侧翼区microRNA结合位点突变对萤光素酶活性的影响，确认microRNA与目的基因5’侧翼区的结合位点，最终确定该microRNA是否具有转录水平的调控能力。
③使用TargetScan数据库预测，结合人工比对，确认筛选得到的microRNA与目的基因3’非翻译区的结合位点，使用基因定点突变技术，将3’非翻译区上的结合位点突变，然后将野生型与突变型的3’非翻译区分别插入萤光素酶载体，将分别携带野生型与突变型的载体分别转入细胞中，加入microRNA模拟物，检测3’非翻译区microRNA结合位点突变对萤光素酶活性的影响，确认microRNA与目的基因3’非翻译区的结合位点，最终确定该microRNA是否具有转录后(翻译)水平的调控能力。
综合①-③的实验结果，即可得到可以同时在转录与转录后(翻译)水平调控目的基因表达的microRNA。
本发明中，所述目的基因可为任何基因而不受限制，优选地，所述目的基因为细胞色素P450酶亚型2E1(Cytochrome P450 2E1,CYP2E1)基因或I型血红素氧化酶(Haemoxygenase 1,HMOX1)基因。
在本发明的另一个方面中，提供了由上述方法筛选得到的microRNA。
优选地，本发明中，例如，以细胞色素P450酶亚型2E1基因为目的基因，通过上述方法，筛选得到具有转录和转录后双水平基因沉默功能的microRNA 552(miR-552)。或者，例如，以I型血红素氧化酶基因为目的基因，通过上述方法，筛选得到具有转录和转录后双水平基因沉默功能的microRNA 1254(miR-1254)。
在本发明的另一个方面中，提供了由上述方法筛选得到的microRNA的用于使基因沉默的用途。因此，本发明的microRNA具有在开发与筛选用于治疗各种疾病的药物中的用途。
在本发明的另一个方面中，提供了基因沉默的方法，所述方法包括使用由上述方法筛选得到的microRNA进行基因沉默。
与siRNA相比，microRNA是一种内源的、具有良好的适应性与特异性、抑制效果显著的小RNA分子。本发明筛选得到microRNA与前人报道的针对同一目的基因的microRNA相比，应用本发明的方法筛选得到的microRNA具有更好的基因沉默效果(图9)；本发明提供了一种新的有效的microRNA筛选方法，可以得到良好的基因沉默效果；本发明为科学研究中常用的基因沉默技术提供了新的设计思路；本发明也为针对疾病的microRNA药物开发设计提供了新的思路。
附图说明
下面结合附图与实施例对本发明做进一步的详细说明，其仅仅是对本发明的描述而不是限定。
图1为示意性显示本发明的具有转录和转录后双水平基因沉默功能的microRNAs的筛选方法的流程图。
图2为显示使用miRBase数据库预测CYP2E1 5’侧翼区所得的microRNA及其在5’侧翼区上的结合位点的图。其中，5’FR即指5’侧翼区。
图3为显示使用TargetScan数据库预测CYP2E1 3’非翻译区所得的microRNA及其在3’非翻译区上的结合位点的图。其中，3’UTR即指3’非翻译区。
图4为显示预测所得的microRNA对CYP2E1蛋白表达的影响的图。其中：
A.PLC/PRF/5细胞中转染各miRNA后检测CYP2E1表达的蛋白印迹图。GAPDH作为上样量对照。图中数字为microRNA的名字，nc是指阴性对照(negative control)。
B.图4A对应的统计学结果。其中，使用ImageQuant Solutions软件对CYP2E1与内参基因GAPDH的条带进行灰度检测，然后依据GAPDH的灰度值，以nc为1，对CYP2E1的蛋白表达水平进行归一化处理，从而得到归一化CYP2E1蛋白表达水平。
图5为显示miR-552对CYP2E1mRNA表达水平的抑制作用的图。CYP2E1蛋白表达随miR-552类似物剂量依赖性下调，而mRNA水平的下调无此特点。使用Rotor Gene荧光实时定量PCR仪，使用Takara的荧光定量PCR试剂，检测CYP2E1的mRNA表达水平，同时检测内参基因GAPDH的mRNA水平。归一化CYP2E1的mRNA表达水平是指依据GAPDH的表达水平，以nc为1，对CYP2E1的mRNA表达水平进行归一化处理，从而得到归一化CYP2E1的mRNA表达水平。*表示p<0.05vs nc(相对于nc)，**表示p<0.01vs nc(相对于nc)。
图6为显示CYP2E1 5’侧翼区miR-552结合位点突变对miR-552转录抑制能力的影响的图。其中：
A.miR-552第9-21位核苷酸能够与CYP2E1启动子区转录起始位点前第313-326位核苷酸序列互补配对，其中小写字母为CYP2E1启动子区对应miR-552结合位点突变后的核苷酸序列。
B.荧光素酶报告基因实验显示miR-552抑制野生型CYP2E1启动子活性，而对于将miR-552可能的结合位点突变了的CYP2E1启动子，则不能抑制其活性。归一化萤光素酶活性指依据内参firefly萤光素酶活性，以nc为1，对renilla萤光素酶活性进行归一化处理，从而得到归一化萤光素酶活性。*表示p<0.05vs nc(相对于nc)。
图7为显示CYP2E1 3’非翻译区miR-552结合位点突变对miR-552转录后抑制能力的影响的图。其中：
A.CYP2E1mRNA 3’-UTR区与miR-552种子序列区部分互补配对，其中，小写字母代表CYP2E1mRNA 3’-UTR区中miR-552可能的结合位点突变后的核苷酸序列。
B.荧光素酶报告基因实验显示miR-552抑制CYP2E1 3’-UTR活性，而对miR-552可能的结合位点突变了的3’-UTR不能发挥抑制作用。归一化萤光素酶活性指依据内参renilla萤光素酶活性，以nc为1，对firefly萤光素酶活性进行归一化处理，从而得到归一化萤光素酶活性。**表示p<0.01vs nc(相对于nc)。
图8为显示miR-1254对HMOX1mRNA与蛋白表达的抑制作用的图。其中：
A.293细胞中转染miR-1254类似物后检测HMOX1表达的蛋白印迹图。Beta-actin作为上样量对照。nc是指阴性对照。
B.HMOX1蛋白与mRNA表达随miR-1254类似物剂量依赖性下调。使用Rotor Gene荧光实时定量PCR仪，使用Takara的荧光定量PCR试剂，检测HMOX1的mRNA表达水平，同时检测内参基因GAPDH的mRNA水平。归一化HMOX1的mRNA表达水平是指依据GAPDH的表达水平，以nc为1，对CYP2E1的mRNA表达水平进行归一化处理，从而得到归一化HMOX1的mRNA表达水平。**表示p<0.01vs nc(相对于nc)，***表示p<0.001vs nc(相对于nc)。
C.图8A对应的统计学结果。其中，使用ImageQuant Solutions软件对HMOX1与内参基因beta-actin的条带进行灰度检测，然后依据actin的灰度值，以nc为1，对HMOX1的蛋白表达水平进行归一化处理，从而得到归一化HMOX1蛋白表达水平。
图9为显示筛选所得miR-552比前人报道的miR-378具有更好的CYP2E1沉默效果的图。其中：
A.PLC/PRF/5细胞中转染miR-552与miR-378模拟物后检测CYP2E1表达的蛋白印迹图。GAPDH作为上样量对照。图中数字为microRNA的名字，nc是指阴性对照(negativecontrol)
B.图9A对应的统计学结果。其中，使用ImageQuant Solutions软件对CYP2E1与内参基因GAPDH的条带进行灰度检测，然后依据GAPDH的灰度值，以nc为1，对CYP2E1的蛋白表达水平进行归一化处理，从而得到归一化CYP2E1蛋白表达水平。**表示p<0.01vs nc(相对于nc)。
具体实施方式
实施例中所使用的试剂、仪器来源：
人肝癌细胞PLC/PRF/5细胞，293细胞：中科院上海生命科学院生化与细胞研究所细胞库；
所用质粒(PGL4.10，PGL4.73与psiCHECK2)均购自Promega；
萤光素酶活性检测试剂盒：购于Promega；
转染试剂：lipofectamine 2000购于Invitrogen；
细胞培养液：购于Invitrogen；
蛋白免疫印迹仪器：购于BioRad；
基因定点突变试剂盒：购于Merck；
实时定量PCR仪：QIAGEN；
实时定量PCR试剂：上海皓嘉；
CYP2E1蛋白印迹检测用抗体：购于Millipore；
HMOX1蛋白印迹检测用抗体：购于Santa Cruz。
除特别指定外，本发明中所使用的方法均为本领域中的常规方法。
制备实施例
制备实施例1microRNA 552(miR-552)的制备
以细胞色素P450酶亚型2E1(Cytochrome P450 2E1,CYP2E1)为目的基因，通过下述步骤筛选得到具有双重抑制能力的microRNA 552(miR-552)。
步骤1)：使用miRBase数据库对CYP2E1转录起始位点前1kb的5’侧翼区(启动子可能存在的位置)进行microRNA结合位点预测，得到一系列可能结合于目的基因启动子区域的microRNA(见图2)；
步骤2)：使用TargetScan数据库对CYP2E1的3’非翻译区进行microRNA结合位点预测，得到一系列可能结合于CYP2E1 3’非翻译区的microRNA(见图3)；
步骤3)：使用化学合成的microRNA模拟物(mimics)检测步骤1)与步骤2)所得microRNA对目的基因蛋白表达的影响，筛选得到可以显著下调目的基因蛋白表达的microRNA 552(见图4)；
步骤4)：使用化学合成的miR-552模拟物(mimics)检测miR-552对CYP2E1mRNA表达的影响，发现miR-552可以下调CYP2E1mRNA水平(见图5)；
步骤5)：使用miRbase与TargetScan数据库预测，结合人工比对，找到miR-552在CYP2E1的5’侧翼区和3’非翻译区的结合位点(见图2，图7A)。使用基因定点突变技术，将CYP2E1的5’侧翼区和3’非翻译区与miR-552的结合位点突变(见图6A，图7A)。野生型5’侧翼区与3’非翻译区位置与序列：
野生型5’侧翼区位于人类基因组，CYP2E1基因转录起始点上游1000个碱基，10号染色体，位置：1352354624-1352355623；
野生型3’非翻译区序列位于CYP2E1成熟mRNA末端，1755-1912，共计158个碱基。
将野生型与突变型5’侧翼区与3’非翻译区分别插入萤光素酶报告基因中(5’侧翼区插入位置：PGL4.10质粒多克隆位点；3’非翻译区插入位置：psiCHECK2质粒多克隆位点)，实验证明(1)miR-552是通过结合于5’侧翼区特异位点，起到下调目的基因mRNA表达的作用，证明miR-552具有转录抑制能力(见图6B)；(2)miR-552是通过结合于3’非翻译区特异位点，起到下调目的基因蛋白表达的作用，证明miR-552具有翻译抑制能力(见图7B)；
步骤6)：结合步骤3)、4)和5)的数据，筛选得到可以同时显著下调CYP2E1mRNA与蛋白水平，具有转录与转录后双重抑制能力的miR-552。
制备实施例2microRNA 1254(miR-1254)的制备
按照前述的方法，我们选择目的基因I型血红素氧化酶(Haemoxygenase1,HMOX1)，使用同样的计算机预测与实验手段得到同时具有转录和转录后双重基因沉默能力的microRNA 1254(miR-1254)(见图8)，这一数据说明本发明方法的有效性。
实验实施例
实施例1在人肝癌细胞PLC/PRF/5细胞中检测miR-552对CYP2E1mRNA和蛋白表达水平的抑制作用。
在人肝癌细胞PLC/PRF/5细胞中分别转染25nM、50nM、100nM、200nM的miR-552，用蛋白印迹实验检测细胞内CYP2E1的蛋白表达变化，用逆转录-实时定量PCR的方法检测CYP2E1mRNA表达变化。如图4和5所示，miR-552可剂量依赖地引起CYP2E1蛋白水平表达下降(图5)，CYP2E1mRNA水平轻微下降，无剂量相关性(图5)。
实施例2miR-552通过非种子序列区作用于CYP2E1基因启动子区抑制其转录活性。
将人CYP2E1基因启动子区(5’侧翼区)野生型(wt)和miR-552结合位点突变型(mt)(见图6A)克隆入PGL3荧光素酶报告系统，检测共转染miR-552及其各种突变体对荧光素酶活性的影响。如图6所示，MiR-552可以明显抑制CYP2E1启动子活性，而不降低突变的启动子活性(见图6B)。
实施例3miR-552通过种子序列区作用CYP2E1mRNA 3’-非翻译区而对其表达进行转录后抑制。
将人CYP2E1 3’非翻译区野生型(wt)和miR-552结合位点突变型(mt)克隆入双荧光素酶报告基因检测系统，检测共转染miR-552对荧光素酶活性的影响。如图7所示，miR-552可以明显抑制CYP2E1 3’非翻译区荧光素酶活性，而对突变型3’非翻译区荧光素酶活性抑制程度较小(见图7B)。
实施例4在人肾脏293细胞中检测miR-1254对HMOX1mRNA和蛋白表达水平的抑制作用。
在人肾脏293细胞中分别转染50nM、100nM的miR-1254，用蛋白印迹实验检测细胞内HMOX1的蛋白表达变化，用逆转录-实时定量PCR的方法检测HMOX1mRNA表达变化。如图8所示，miR-1254可剂量依赖地引起HMOX1蛋白水平表达显著下降(图8A,C)，HMOX1mRNA水平显著下降(图8B)。

Claims (5)

1.一种具有转录和转录后双水平基因沉默功能的microRNA的筛选方法，所述方法包括：
步骤1)：使用miRBase数据库对目的基因的转录起始位点前1-2kb的5’侧翼区进行microRNA结合位点预测，得到能够结合于目的基因启动子区域的microRNA；
步骤2)：使用TargetScan数据库对目的基因的3’非翻译区进行microRNA结合位点预测，得到能够结合于目的基因3’非翻译区的microRNA；
步骤3)：化学合成上述步骤1)和步骤2)中得到的microRNA，并检测microRNA对目的基因蛋白表达的影响，由此筛选得到能够下调目的基因蛋白表达的microRNA；
步骤4)：检测步骤3)中得到的能够下调目的基因蛋白表达的microRNA对目的基因mRNA表达的影响，由此筛选得到能够同时下调目的基因mRNA和蛋白水平的microRNA；
步骤5)：包括以下步骤：
a)使用miRbase数据库预测，结合人工比对，确认筛选得到的microRNA与目的基因5’侧翼区的结合位点，使用基因定点突变技术，将5’侧翼区上的结合位点突变，然后将野生型与突变型的5’侧翼区分别插入携带海肾萤光素酶的载体，使用携带萤火虫萤光素酶的载体作为内参，分别将携带野生型5’侧翼区的海肾萤光素酶载体或突变型5’侧翼区的海肾萤光素酶载体与萤火虫萤光素酶载体共同转入细胞中，加入步骤4)中得到的microRNA，检测5’侧翼区microRNA结合位点突变对海肾萤光素酶活性的影响，确认microRNA与目的基因5’侧翼区的结合位点，最终确定该microRNA是否具有转录水平的调控能力，由此筛选得到具有转录水平的调控能力的microRNA；
b)使用TargetScan数据库预测，结合人工比对，确认筛选得到的microRNA与目的基因3’非翻译区的结合位点，使用基因定点突变技术，将3’非翻译区上的结合位点突变，然后将野生型与突变型的3’非翻译区分别插入萤火虫萤光素酶载体，以载体自身携带的海肾萤光素酶为内参，将携带野生型3’非翻译区的萤火虫萤光素酶载体与突变型3’非翻译区的萤火虫萤光素酶载体载体分别转入细胞中，加入microRNA模拟物，检测3’非翻译区microRNA结合位点突变对萤火虫萤光素酶活性的影响，确认步骤a)中得到的具有转录水平的调控能力的microRNA与目的基因3’非翻译区的结合位点，最终确定该microRNA是否具有转录后水平的调控能力，由此筛选得到具有转录和转录后双水平基因沉默功能的microRNA。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤3)中，检测microRNA对目的基因蛋白表达的影响的方法包括脂质体转染与蛋白免疫印迹。
3.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤4)中，检测步骤3)中得到的能够下调目的基因蛋白表达的microRNA对目的基因mRNA表达的影响的方法包括总RNA抽提，cDNA反转录以及实时荧光定量PCR。
4.根据权利要求1所述的方法，其中，所述细胞为PLC/PRF/5肝脏细胞、293细胞或786-O肾脏细胞系。
5.根据权利要求1所述的方法，其中，所述目的基因为细胞色素P450酶亚型2E1基因或I型血红素氧化酶基因。
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