JP2023538496A

JP2023538496A - 心不全治療のためのｍｉＲＮＡのコンビナトリアル阻害

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Publication number: JP2023538496A
Application number: JP2023504532A
Authority: JP
Inventors: クリシュナン，ジャヤ; ユアン，ティング; ディメラー，ステファニー
Original assignee: ヨハンヴォルフガングゲーテ－ウニヴェルズィテートフランクフルト
Priority date: 2020-07-23
Filing date: 2021-07-23
Publication date: 2023-09-08
Also published as: US20230265426A1; CN116438305A; WO2022018269A1; EP4185694A1

Abstract

本発明は、心不全の治療のためのｍｉＲＮＡの組み合わせを標的とする阻害性核酸剤の組み合わせに関するものである。阻害されるｍｉＲＮＡの組み合わせは、ｍｉＲ－１ａ及びｍｉＲ－１５ｂ、又はｍｉＲ－１ａ、ｍｉＲ－１５ｂ及びｍｉＲ－２７ｂ、又はｍｉＲ－１ａ、ｍｉＲ－２７ｂ及びｍｉＲ－３４ａから選択される群のうちの１つを含む。これらのｍｉＲＮＡのコンビナトリアル阻害（ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ）は、心筋細胞の増殖を増加することが示されている。【選択図】なし

Description

本発明は、心不全の治療のためのｍｉＲＮＡの組み合わせを対象とする（標的とする）阻害性核酸剤の組み合わせに関するものである。阻害されるｍｉＲＮＡの組み合わせは、ｍｉＲ－１ａ及びｍｉＲ－１５ｂ、又はｍｉＲ－１ａ、ｍｉＲ－１５ｂ及びｍｉＲ－２７ｂ、又はｍｉＲ－１ａ、ｍｉＲ－２７ｂ及びｍｉＲ－３４ａから選択される群のうちの１つを含む。これらのｍｉＲＮＡのコンビナトリアル阻害（ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ）は、心筋細胞の増殖を増大することが示されている。

心血管疾患は、世界の主要な死因となっている。特に心不全は、心血管疾患の罹患率及び死亡率の主な要因となる。心不全は、心筋梗塞、慢性高血圧、心筋線維化、及び炎症によって引き起こされる心臓の不適応なリモデリングに起因する。心筋細胞の喪失は心不全の主な特徴である。しかしながら、成人の心臓や不全のヒト心臓では、心筋細胞の増殖能に限界がある。したがって、心臓の収縮能力を回復させるためには、失われた心筋細胞を補充するような再生アプローチが必要である。このように、心筋細胞の増殖を目的とすることは、心筋の再生及び修復のための可能な新たな治療戦略の１つである。

調節性低分子マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は、約２２ヌクレオチドの小さな非コードＲＮＡであり、遺伝子発現を抑制し、標的タンパク質をコードするｍＲＮＡの分解又は崩壊を促進する。ｍｉＲＮＡは、標的ｍＲＮＡの３’－非翻訳領域に結合することにより転写後レベルで遺伝子発現を調節する。心筋症では多くのｍｉＲＮＡが制御されていることが示されており、単一のｍｉＲＮＡの過剰発現又は阻害は、炎症、代謝、及び心機能に関わる重要な遺伝子を標的することにより心不全の発症を干渉する可能性があることがわかっている。ｍｉＲＮＡは、健康状態及び病気の状態における遺伝子発現の調節に中心的な役割を果たすことから、様々な病気の可能な治療ターゲットとして浮上している。

上述の技術水準に基づいて、本発明の目的は、心不全を治療するための手段及び方法を提供することである。

この目的は、本明細書の独立請求項の主題によって達成される。

図１は、ＥｄＵスクリーニングによるｍｉＲＮＡＬＮＡの候補の絞り込みについて示す。本発明者らは、心筋細胞の増殖を負に制御する因子の候補として、１７種のｍｉＲＮＡを選択した。これらのｍｉＲＮＡをラット心筋細胞でノックダウンするために、Ｅｘｉｑｏｎ社製のロック核酸（ＬＮＡ）を使用して調査した。ラット新生児心筋細胞は、１７種のＬＮＡのプールから個々の因子を除去したもので治療し、一方では、対照として１７種のＬＮＡを共に用いて治療した。２日間治療後、ＤＮＡ合成（ＥｄＵ）をＥｄＵ（緑）とα－アクチニン（赤）との二重染色で解析した（Ａ、Ｂ、Ｃ）。（Ｄ）ｍｉＲＮＡ発現量をｑＲＴ－ＰＣＲで解析した。データは平均値±ＳＥＭで示す。^＊Ｐ＜０．０５、^＊＊Ｐ＜０．０１。統計解析は両側スチューデントのｔ検定で行った。図２はラット心筋細胞におけるｉｎｖｉｔｒｏでの細胞増殖について示す。本発明者らは、ＥｄＵスクリーニングに基づき、ＤＮＡ合成に必要な５種のＬＮＡ（ＬＮＡ－１ａ、ＬＮＡ－１５ａ、ＬＮＡ－１５ｂ、ＬＮＡ－２７ｂ、ＬＮＡ－３４ｃ）を選択した。最適な組み合わせを同定するために、すべてのコンビナトリアルなＬＮＡで新生児ラット心筋細胞を治療し、オーロラＢ（緑）、α－アクチニン（赤）、及びＤＡＰＩ（青）の三重染色で心筋細胞の増殖を解析した（Ａ、Ｂ）。オーロラＢスクリーニングに基づき、本発明者らは心筋細胞の増殖を増大させることができる２つの組み合わせを選択した。心筋細胞の増殖はオーロラＢで解析し（Ｂ、Ｃ、Ｅ）、ｍｉＲＮＡの発現量はｑＲＴ－ＰＣＲで解析した（Ｄ、Ｆ）。^＊Ｐ＜０．０５、^＊＊Ｐ＜０．０１。図３は７日齢のラット心筋細胞におけるｉｎｖｉｔｒｏでの細胞増殖について示す。本発明者らは、ＬＮＡ－１ａ、ＬＮＡ－１５ａ、ＬＮＡ－１５ｂ、及びＬＮＡ－２７ｂを選択し、７日齢のラット心筋細胞ですべての組み合わせの効果を試験した。ラット心筋細胞をすべてのコンビナトリアルなＬＮＡで２日間治療し、心筋細胞増殖をオーロラＢ（緑）、α－アクチニン（赤）、及びＤＡＰＩ（青）の三重染色で解析した（Ａ、Ｂ）。ｍｉＲＮＡ発現量をｑＲＴ－ＰＣＲで解析した（Ｃ）。^＊Ｐ＜０．０５、^＊＊Ｐ＜０．０１。図４はｉｎｖｉｖｏにおけるｍｉＲＮＡの発現量を示す。１２週齢のマウスに、個別のＬＮＡ－１ａ、ＬＮＡ－１５ｂ、又はＬＮＡ－１ａとＬＮＡ－１５ｂとの組み合わせ、又はＬＮＡ－対照を注入した。７日間注入後、左心室を採取し、ｑＲＴ－ＰＣＲによりｍｉＲＮＡ遺伝子発現を解析した（Ａ、Ｂ、Ｃ、及びＤ）。心筋細胞の増殖は、ｐＨＨ３（緑）、α－アクチニン（赤）、及びＤＡＰＩ（青）の三重染色で解析した（Ｅ及びＦ）。データは平均値±ＳＥＭで示す。^＊Ｐ＜０．０５、^＊＊Ｐ＜０．０１。図５は、１２週齢のマウスに心筋梗塞を起こし、次いでＬＮＡ－１ａとＬＮＡ－１５ｂとの組み合わせ、又はＬＮＡ－対照を注入した。心エコーは０、７、１４、２１、２８日目に実施した（Ａ）。（Ｂ）２８日間注入後、マウスから心臓全体を採取した。（Ｃ、Ｄ）遠隔部、境界部、及び梗塞部におけるＬＮＡ－対照又はＬＮＡ－１ａ／１５ｂを注入したＭＩ後のｍｉＲ－１ａ及びｍｉＲ－１５ｂの発現を解析した。（Ｅ）心臓の％駆出率（％ＥＦ：Ｅｊｅｃｔｉｏｎｆｒａｃｔｉｏｎ）の縦断的モニタリングを示す。（Ｆ、Ｇ、Ｈ）病態リモデリングマーカー遺伝子（ＮＰＰＡ、ｍｙ７７、及びＭｙｈ７／ｍｙｈ６比率）をＬＮＡ注入及びＭＩ損傷後に遠隔部、境界部、及び梗塞部においてｑＲＴ－ＰＣＲで定量した。（Ｉ、Ｊ、Ｋ）ＬＮＡ注入とＭＩ損傷後の遠隔部、境界部、梗塞部における線維性リモデリングマーカー遺伝子（ＴＧＦβ２、Ｃｏｌ３ａ１、及びＴｈｂｓ１）をｑＲＴ－ＰＣＲで定量した。ＭＩ：心筋梗塞（ＭｙｏｃａｒｄｉａｌＩｎｆａｒｃｔｉｏｎ）、ＮＰＰＡ：ナトリウム利尿ペプチド、ｍｉｈ７：β－ミオシン重鎖、ｍｉｈ６：β－ミオシン重鎖（Ｍｙｈ７）ｎ＝５（偽薬）、ｎ＝７（心筋梗塞）。データは平均値±ＳＥＭで示す。^＊Ｐ＜０．０５、^＊＊Ｐ＜０．０１。すべて一元配置分散分析を行い、その後いずれかはＤｕｎｎｅｔｔの多重比較後検定を行った。図６は、ｍｉＲ－１ａ及びｍｉＲ－１５ｂの阻害は、ｉｎｖｉｖｏでの心筋梗塞後の心筋細胞増殖を増大させることについて示す。（Ａ）心筋梗塞（ＭＩ）損傷後２８日目にＬＮＡ－１ａ／１５ｂ又は対照を注入した成人心臓の心臓切片におけるＫｉ６７の代表的な免疫蛍光画像を示す。Ｋｉ６７は増殖細胞（緑）を標識する；心筋細胞特異的なα－アクチニン（赤）及びＤＡＰＩ（青）。（Ｂ）はＫｉ６７^＋心筋細胞の割合の定量を示す。（Ｃ）心筋梗塞（ＭＩ）損傷後２８日目にＬＮＡ－１ａ／１５ｂ又は対照のＬＮＡ－対照を注入した成人心臓の心臓切片におけるｐＨＨ３の代表的免疫蛍光画像を示す。ｐＨＨ３は増殖細胞（緑）を標識する；心筋細胞特異的α－アクチニン（赤）とＤＡＰＩ（青）。（Ｄ）はｐＨＨ３^＋心筋細胞の割合の定量を示す。（Ｅ）成人心臓の心臓切片におけるオーロラＢの代表的な免疫蛍光画像を示す。オーロラＢは増殖細胞（緑）を標識する；心筋細胞特異的なα－アクチニン（赤）、ＤＡＰＩ（青）。（Ｆ）はオーロラＢ^＋心筋細胞の割合の定量を示す。データは平均値±ＳＥＭで示す。^＊Ｐ＜０．０５、^＊＊Ｐ＜０．０１。すべて一元配置分散分析を行い、その後いずれかはＤｕｎｎｅｔｔの多重比較後検定を行った。図７は、ヒトｉＰＳ－ＣＭのｉｎｖｉｔｒｏでの細胞増殖について示す。ヒトｉＰＳＣ－ＣＭをＬＮＡ－１ａとＬＮＡ－１５ｂとの組み合わせ、又はＬＮＡ－対照のいずれかで治療し、酸素正常状態（２０％Ｏ_２）又は低酸素状態（３％Ｏ_２）に２日間曝露した。心筋細胞の増殖はオーロラＢで解析した（Ａ、Ｂ）。ｍｉＲＮＡ発現量をｑＲＴ－ＰＣＲで解析した（Ｃ、Ｄ）。データは平均値±ＳＥＭで示す。^＊Ｐ＜０．０５、^＊＊Ｐ＜０．０１。図８は、ヒト模倣組織におけるＬＮＡ－１ａとＬＮＡ－１５ｂとの組み合わせによる心筋細胞増殖と心機能への効果について示す。ヒト心臓オルガノイド（Ａ）は、ＬＮＡ－１ａ／１５ｂ又はＬＮＡ－対照のいずれかで治療した後、３日間、酸素正常状態と低酸素状態とで培養した。（Ｂ、Ｃ）ｍｉＲ－１ａ及びｍｉＲ－１５ｂの発現量は、ｑＲＴ－ＰＣＲで解析した。（Ｄ）ＬＮＡ－１ａ／１５ｂ又は対照のＬＮＡ－対照で治療したヒト心筋オルガノイドの切片におけるＥｄＵの代表的な免疫蛍光画像を示す。小麦胚芽凝集素（Ｗｈｅａｔ－Ｇｅｒｍ－Ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）（ＷＧＡ）は細胞表面（緑）を、ＥｄＵは増殖細胞（マゼンタ）を標識する；心筋細胞特異的α－アクチニン（赤）及びＤＡＰＩ（青）。（Ｅ）ＥｄＵ^＋心筋細胞の割合の定量を示す。（Ｆ）正常酸素状態と低酸素状態との両方でＬＮＡ－１ａ／１５ｂ又はＬＮＡ－対照で治療した単培養心筋オルガノイドの切片におけるｐＨＨ３の代表的免疫蛍光画像を示す。ｐＨＨ３は増殖細胞（緑）を標識する；心筋細胞特異的α－アクチニン（赤）とＤＡＰＩ（青）。（Ｇ）はｐＨＨ３^＋心筋細胞の割合の定量を示す。（Ｈ）ヒト単培養心筋オルガノイドをＬＮＡ－１ａ／１５ｂ又はＬＮＡ－対照で３日間、正常酸素状態と低酸素状態の両方で処理した後、単培養心筋オルガノイドの収縮の振幅ピークを測定することにより収縮力アッセイを実施した。データは平均値±ＳＥＭで示す。^＊Ｐ＜０．０５、^＊＊Ｐ＜０．０１。すべて一元配置分散分析を行った後、いずれかはＤｕｎｎｅｔｔの多重比較後検定を行った。ｈｉＰＳＣ－ＣＭ：ヒト人工多能性幹細胞由来心筋細胞。図９は、ＬＮＡ－１ａ、ＬＮＡ－２７ｂ及びＬＮＡ－３４ａの組み合わせによるｉｎｖｉｔｒｏ及びｉｎｖｉｖｏの心筋細胞増殖の効果について示す。ラット新生児心筋細胞をＬＮＡ－１ａ、ＬＮＡ－２７ｂ、及びＬＮＡ－３４ａの組み合わせ、又はＬＮＡ－対照のいずれかで２日間治療した。心筋細胞の増殖は、オーロラＢ（緑）、α－アクチニン（赤）、及びＤＡＰＩ（青）の三重染色で解析した（Ａ及びＢ）。１２週齢のマウスに、ＬＮＡ－１ａ、ＬＮＡ－２７ｂ、及びＬＮＡ－３４ａの組み合わせ、又はＬＮＡ－対照のいずれかを１週間注入した。心筋細胞の増殖は、Ｋｉ６７（緑）、αーアクチニン（赤）、及びＤＡＰＩ（青）の三重染色で解析した（Ａ及びＢ）。データは平均値±ＳＥＭで示す。^＊Ｐ＜０．０５、^＊＊Ｐ＜０．０１。図１０Ａ：ｍｉＲ１ａ－ＬＮＡ又はｍｉＲ－１５ａ－ＬＮＡ単独、あるいは組み合わせ（ｍｉＲ１ａ／１５ｂ－ＬＮＡ）で治療した成人心筋細胞について、ディープＲＮＡシーケンス（ＲＮＡｓｅｑ）を実施した。ベン図（Ａ）は、それぞれの条件下で固有な遺伝子と共通する遺伝子とを明らかにするものである。図１０Ｂ：生物学的プロセス（ＢＰ）経路に対応する差次的発現遺伝子のジーンオントロジー（ＧＯ）解析により、ｍｉＲ１ａ－ＬＮＡ、ｍｉＲ－１５ａ－ＬＮＡ、及びｍｉＲ１ａ／１５ｂ－ＬＮＡ治療に共通の経路（共有）と比較して、ｍｉＲ１ａ／１５ｂで治療した心筋細胞では固有な経路（固有）が出現し、かつ活性化することが示された（Ｂ）。図１０Ｃ及びＤ：それぞれのＬＮＡ治療時に存在する細胞成分（ＣＣ）のＧＯ解析は、ｍｉＲ１ａ－ＬＮＡ、ｍｉＲ－１５ａ－ＬＮＡ、及びｍｉＲ１ａ／１５ｂ－ＬＮＡ治療に共通の経路（共有）と比較して、ｍｉＲ１ａ／１５ｂで治療した心筋細胞で固有の経路（固有）が出現しかつ活性化することを示す（Ｃ）。ｍｉＲ１ａ／１５ｂ－ＬＮＡ治療に固有の遺伝子と、それらの特異的な細胞成分（ＣＣ）経路への接続性（ｃｏｎｎｅｃｔｉｖｉｔｙ）を（Ｄ）に描く。

発明の概要
本発明の第１の態様は、心臓病の治療又は予防における使用のための核酸剤の組み合わせに関するものである。各核酸剤は、標的マイクロＲＮＡを標的とし、かつそれを特異的に阻害及び／又は分解することが可能である。核酸薬剤の組み合わせは、細胞内のマイクロＲＮＡの組み合わせを阻害及び／又は分解することが可能である。阻害される、あるいは分解されるマイクロＲＮＡの組み合わせは、
ａ．ｍｉＲ－１ａ、及び
ｂ．ｍｉＲ－１５ｂ、又は
ｍｉＲ－１５ｂ及びｍｉＲ－２７ｂ、又は
ｍｉＲ－２７ｂ及びｍｉＲ－３４ａ、
である。

本発明の第２の態様は、ヒト心筋細胞において作動可能なプロモーターの制御下で、心臓病の治療又は予防における使用のための核酸剤の組み合わせをコードする、発現コンストラクト、又は複数の発現コンストラクトに関する。各核酸剤は、標的マイクロＲＮＡを標的とし、かつそれを特異的に阻害及び／又は分解することができ、それによりマイクロＲＮＡの組み合わせを阻害及び／又は分解することができる。マイクロＲＮＡの組み合わせは、
ａ．ｍｉＲ－１ａ、及び
ｂ．ｍｉＲ－１５ｂ、又は
ｍｉＲ－１５ｂ及びｍｉＲ－２７ｂ、又は
ｍｉＲ－２７ｂ及びｍｉＲ－３４ａ、
である。

本発明の第３の態様は、第１の態様による核酸剤の組み合わせ、又は第２の態様による複数の発現コンストラクトを含む、心臓病の治療又は予防における使用のための医薬組成物に関するものである。

別の実施形態では、本発明は、本発明の化合物の少なくとも１つ又はその薬学的に許容される塩と、少なくとも１つの薬学的に許容される担体、希釈剤、又は賦形剤とを含む医薬組成物に関するものである。

発明の詳細な説明
用語と定義
本明細書を解釈する目的で、以下の定義が適用され、適切な場合、単数形で使用される用語は複数形も含み、その逆も同様である。以下に記載されているいずれの定義が、参照により本明細書に組み込まれている文書と矛盾する場合は、この記載されている定義が優先されるものとする。

本明細書で使用される用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、及び他の同様の形態、並びにそれらの文法的に同等な用語は、意味において同等であること、及びこれらの単語のいずれか１つに続く１つ又は複数の項目が、係る１つ又は複数の項目を網羅的にリストするものではない、又はリストした１つ又は複数の項目のみに限定するものではないことにおいてオープンエンドとすることを意図している。例えば、成分Ａ、Ｂ及びＣを「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」品目は、成分Ａ、Ｂ及びＣからなる（すなわち、成分Ａ、Ｂ及びＣのみを含有する）こともでき、又は成分Ａ、Ｂ及びＣのみならず、１つ又は複数の他の成分を含むこともできる。そのため、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」及びその同様の形態、並びにその文法的に同等な用語には、「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙｏｆ）」又は「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇｏｆ）」の実施形態の開示が含まれることが意図及び理解されている。

値の範囲が与えられている場合、文脈上明確に別段の指示がない限り、その範囲の上限と下限の間の下限の単位の１０分の１までの介在値、及びその記載の範囲内のいずれの他の記載値又は介在値のそれぞれは、記載の範囲内で具体的に除外される限界に従って、本開示内に包含されると理解される。記載された範囲が限界値の一方又は両方を含む場合、それらの含まれる限界値の一方又は両方を除いた範囲もまた開示に含まれる。

本明細書において、ある値又はパラメータに関する「約」の言及は、その値又はパラメータそれ自体を対象とする変化形を含む（及び記述する）。例えば、「約Ｘ」に言及する記述は、「Ｘ」の記述を含む。

添付の特許請求の範囲を含み、本明細書で使用されるとおり、単数形の「ａ」、「又は（ｏｒ）」及び「ｔｈｅ」は、文脈によって明らかに指示されない限り、複数の参照を含む。

他に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術的及び科学的用語は、当業者（例えば、細胞培養、分子遺伝学、核酸化学、ハイブリダイゼーション技術及び生化学）により一般的に理解されるものと同じ意味を有する。分子、遺伝、生化学的手法（一般に、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，第４編．（２０１２）ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．及びＡｕｓｕｂｅｌら，ＳｈｏｒｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ（２００２）第５編，ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．）及び化学的手法には、標準的な技術を使用する。

本明細書の文脈における「ハイブリッド又はハイブリダイズ配列を形成することができる」という用語は、哺乳類細胞のサイトゾル内に存在する条件の下で、標的配列に選択的に結合することができる配列に関するものである。このようなハイブリダイズ配列は、標的配列と連続的に逆相補的であってもよいし、又はギャップ、ミスマッチ、又はさらにノンマッチングのヌクレオチドを含んでいてもよい。ハイブリッドを形成可能な配列の最小長は、骨格化学及びその組成に依存し、Ｃ又はＧのヌクレオチドはＡ又はＴ／Ｕのヌクレオチドよりも多く結合エネルギーに寄与する。

本明細書の文脈における「ヌクレオチド」という用語は、核酸又は核酸アナログの構成単位に関するもので、それらのオリゴマーは、塩基対形成に基づいてＲＮＡオリゴマー又はＤＮＡオリゴマーと選択的ハイブリッドを形成することが可能である。この文脈での「ヌクレオチド」という用語は、古典的なリボヌクレオチドの構成単位であるアデノシン、グアノシン、ウリジン（及びリボシルチミン）、シチジン、古典的なデオキシリボヌクレオチドであるデオキシアデノシン、デオキシグアノシン、チミジン、デオキシウリジン、及びデオキシシチジンが含まれる。さらに、ホスホチオエート（ｐｈｏｓｐｈｏｔｉｏａｔｅ）、２’Ｏ－メチルホスホチオエート、ペプチド核酸（ＰＮＡ；Ｎ－（２－アミノエチル）－グリシン単位をペプチド結合でつなぎ、グリシンのα炭素に核酸塩基が結合したもの）又はロック核酸（ＬＮＡ；２’Ｏ，４’Ｃメチレン架橋ＲＮＡ構成単位）などの核酸のアナログが含まれる。本明細書において、「ハイブリダイズ配列」に言及する場合、係るハイブリダイズ配列は、上記のヌクレオチドのいずれか、又はそれらの混合物から構成することができる。

本明細書の文脈における「ｍｉＲＮＡ（マイクロＲＮＡ（ｍｉｃｒｏＲＮＡ））」という用語は、ＲＮＡサイレンシング及び遺伝子発現の転写後調節で機能する低分子非コードＲＮＡ（約２２ヌクレオチド含有）に関するものである。

本明細書の文脈における「アンチセンスオリゴヌクレオチド」という用語は、ＲＮＡと実質的に相補的で、かつＲＮＡとハイブリダイズすることができる配列を有するオリゴヌクレオチドに関するものである。このようなＲＮＡに対するアンチセンス作用により、ＲＮＡの生物学的作用が調節され、特に阻害又は抑制されることになる。このＲＮＡがｍＲＮＡである場合、得られる遺伝子産物の発現が阻害又は抑制される。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ヌクレオチドアナログ及び／又はそれらの混合物からなることが可能である。当業者は、所与の標的に対する理論的に最適なアンチセンス配列を計算処理するための様々な商業的及び非商業的な供給元を知っている。最適化は、核酸塩基配列と骨格（リボ、デオキシリボ、アナログ）組成との両方の観点から行うことができる。実際の物理的なオリゴヌクレオチドを送達する供給元は多数存在し、これらは一般的には固体合成によって合成される。本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドの例としては、ＤＮＡからできるアンチセンスオリゴマー、骨格にホスホロチオエート修飾結合を有するＤＮＡ、リボヌクレオチドオリゴマー、架橋ヌクレオチド又はロックヌクレオチドを含むＲＮＡ（特に、リボース環が２’－Ｏ原子と４’－Ｃ原子との間のメチレン架橋によって連結されるもの）、骨格にホスホロチオエート修飾結合を有するＲＮＡ、又はオリゴマーとしてのデオキシリボヌクレオチド塩基とリボヌクレオチド塩基との任意の混合物が挙げられる。

特定の実施形態では、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ホスホチオエート、２’Ｏ－メチルホスホチオエート、ペプチド核酸（ＰＮＡ；Ｎ－（２－アミノエチル）－グリシン単位がペプチド結合によって連結され、核酸塩基がグリシンのα炭素に結合しているもの）又はロック核酸（ＬＮＡ；２’Ｏ，４’Ｃメチレン架橋ＲＮＡ構成単位）などの核酸のアナログを含む。アンチセンス配列は、上記の核酸アナログのいずれかで部分的に構成され、残りのヌクレオチドは自然界に存在する「天然」リボヌクレオチドであってもよいし、又は異なるアナログの混合物であってもよいし、又は１種類のアナログで完全に構成されてもよい。

本明細書の文脈における「核酸発現ベクター」という用語は、プラスミド又はウイルスゲノムに関し、プラスミド又はウイルスゲノムは目的の特定の遺伝子を標的細胞に導入（トランスフェクト）（プラスミドの場合）又は形質導入（ウイルスゲノムの場合）するために使用される。目的の遺伝子はプロモーター配列の制御下にあり、プロモーター配列は標的細胞内で作動可能なため、目的の遺伝子は構成的に、あるいは刺激に応答して、あるいは細胞の状態に依存してのいずれかで転写される。特定の実施形態では、ウイルスゲノムはカプシドに封入され、ウイルスベクターとなり、標的細胞に形質導入することができる。

本明細書に開示される配列と類似又は相同（例えば、少なくとも約７０％の配列同一性）の配列もまた、本発明の一部である。核酸レベルでは、配列同一性は約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上とすることができる。あるいは、核酸セグメントが選択的なハイブリダイゼーション条件（例えば、非常に高いストリンジェンシーなハイブリダイゼーション条件）下で、鎖の相補体にハイブリダイズする場合には、実質的な同一性が存在する。核酸は、全細胞、細胞溶解物、又は部分的に精製された若しくは実質的に純粋な形態で存在することができる。

本明細書の文脈において、「配列同一性」及び「配列同一性の割合（パーセンテージ）」という用語は、整列した２つの配列を位置ごとに比較して決定される配列比較の結果を表す１つの定量的パラメータを意味する。比較用の配列アラインメント方法は、当該技術分野でよく知られている。比較用の配列アラインメントは、Ｓｍｉｔｈ及びＷａｔｅｒｍａｎのローカルホモロジーアルゴリズム，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈのグローバルアライメントアルゴリズム、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）、Ｐｅａｒｓｏｎ及びＬｉｐｍａｎの類似性検索法、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８５：２４４４（１９８８）、又はこれらのアルゴリズムのコンピュータ化された実装によって実行され、ＣＬＵＳＴＡＬ、ＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ及びＴＦＡＳＴＡを含むが、これらに限定されない。ＢＬＡＳＴ分析を行うためのソフトウェアは、例えば、アメリカ国立生物工学情報センター（ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）を通じて公的に入手可能である。

核酸配列の比較についての一例としては、ＢＬＡＳＴＮアルゴリズムがあり、デフォルト設定を使用する：Ｅｘｐｅｃｔｔｈｒｅｓｈｏｌｄ１０；Ｗｏｒｄｓｉｚｅ：２８；Ｍａｘｍａｔｃｈｅｓｉｎａｑｕｅｒｙｒａｎｇｅ：０；Ｍａｔｃｈ／ＭｉｓｍａｔｃｈＳｃｏｒｅｓ：１．－２；Ｇａｐｃｏｓｔｓ：Ｌｉｎｅａｒ。他に記載がない限り、本明細書で提供される配列同一性の値は、ＢＬＡＳＴ一連のプログラム（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－４１０（１９９０））を用いて、それぞれタンパク質及び核酸の比較のために上記で特定されるデフォルトパラメータを使用して得られた値を指す。

パーセンテージの値の指定なしに同一配列に言及する場合、１００％同一の配列（つまり、同じ配列）を意味する。

本明細書の文脈において、「ハイブリダイズ配列」という用語は、ＲＮＡ（リボヌクレオチド）、ＤＮＡ（デオキシリボヌクレオチド）、ホスホチオエート（ｐｈｏｓｐｈｏｔｉｏａｔｅ）デオキシリボヌクレオチド、２’－Ｏ－メチル修飾ホスホチオエートリボヌクレオチド、ＬＮＡ及び／又はＰＮＡヌクレオチドアナログを含むか、又はそれから本質的になるポリヌクレオチド配列を包含する。

本明細書で使用されるとおり、「医薬組成物」という用語は、少なくとも１つの薬学的に許容される担体を伴う、本発明の化合物又はその薬学的に許容される塩を指す。特定の実施形態では、本発明による医薬組成物は、局所、非経口又は注入投与に適した形態で提供される。

本明細書で使用されるとおり、「薬学的に許容される担体」という用語には、当業者に知られているとおり、任意の溶媒、分散媒質、コーティング、界面活性剤、抗酸化剤、保存剤（例えば、抗菌剤、抗真菌剤）、等張剤、吸収遅延剤、塩、保存剤、薬物、薬物安定剤、結合剤、賦形剤、崩壊剤、潤滑剤、甘味剤、香味剤、染料など、並びにそれらの組み合わせが含まれる（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：ｔｈｅＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＰｒａｃｔｉｃｅｏｆＰｈａｒｍａｃｙ、ＩＳＢＮ０８５７１１０６２４を参照）。

本明細書で使用されるとおり、任意の疾患又は障害（例えば、がん）を「治療する」又はその「治療」という用語は、一実施形態では、疾患又は障害を改善すること（例えば、疾患又はその臨床症状の少なくとも１つの発生を遅らせること、停止させること、又は低減させること）を指す。別の実施形態では、「治療する」又は「治療」は、患者が識別できない可能性のあるものを含む少なくとも１つの身体的パラメータを緩和すること又は改善することを指す。さらに別の実施形態では、「治療する」又は「治療」は、身体的に（例えば、識別可能な症状の安定化）、生理学的に（例えば、身体的パラメータの安定化）、又はその両方のいずれかで、疾患又は障害を調節することを指す。疾患の治療及び／又は予防を評価する方法は、以下に特に記載しない限り、当該技術分野において一般的に知られているものである。

本発明の第１の態様は、心臓病の治療又は予防における使用のための核酸剤の組み合わせに関するものである。各核酸剤は、標的マイクロＲＮＡを標的とし、かつそれを特異的に阻害及び／又は分解することが可能である。核酸薬剤の組み合わせは、細胞内のマイクロＲＮＡの組み合わせを阻害及び／又は分解することが可能である。阻害される、あるいは分解されるマイクロＲＮＡの組み合わせは、
ａ．ｍｉＲ－１ａ、及び
ｂ．ｍｉＲ－１５ｂ、又は
ｍｉＲ－１５ｂ及びｍｉＲ－２７ｂ、又は
ｍｉＲ－２７ｂ及びｍｉＲ－３４ａ、
である。

特定の実施形態では、マイクロＲＮＡの組み合わせは、ｍｉＲ－１ａ及びｍｉＲ－１５ｂを含む。

核酸剤の組み合わせは、細胞分裂が停止したＰ７ラットの心筋細胞で試験した（図３）。この状況は、心不全の治療状況に最も似ており、なぜなら、心不全の治療状況でも、心筋細胞の細胞分裂が停止しているからである。本発明者らは、ｍｉＲ－１ａとｍｉＲ－１５ｂとの組み合わせが、分裂終期の心筋細胞のパーセンテージとして測定される最も高い細胞分裂率を誘導することを発見した（図３）。

特定の実施形態では、本核酸薬剤はアンチセンスヌクレオチドである。

特定の実施形態では、各核酸剤は、ヌクレオチドのハイブリダイズ配列を含む。特定の実施形態では、各核酸剤は、ヌクレオチドのハイブリダイズ配列から本質的になる。ヌクレオチドのハイブリダイズ配列は、それぞれの標的マイクロＲＮＡとハイブリッドを形成することが可能である。

特定の実施形態では、各核酸剤は、配列番号００１～００４の配列から選択される（異なる）配列を含む。特定の実施形態では、各核酸剤は、配列番号００１～００４の配列から選択される（異なる）配列から本質的になる。

特定の実施形態では、各核酸剤は、配列番号００１～００２の配列から選択される（異なる）配列を含む。特定の実施形態では、各核酸剤は、配列番号００１～００２の配列から選択される（異なる）配列から本質的になる。

特定の実施形態では、前記核酸剤のうちの１つは、１つ又は複数のロック核酸（ＬＮＡ）部分及び／又はペプチド核酸（ＰＮＡ）部分を含むか、又はそれから本質的になる。特定の実施形態では、前記核酸剤のうちのすべては、１つ又は複数のロック核酸（ＬＮＡ）部分及び／又はペプチド核酸（ＰＮＡ）部分を含むか、又はそれから本質的になる。特定の実施形態では、核酸剤は、ロック核酸（ＬＮＡ）部分から本質的になる。

特定の実施形態では、核酸剤のうちの１つは、隣接する（デオキシ）リボヌクレオシド部分又は隣接するリボヌクレオチドアナログ部分を接続する１つ又は複数のチオリン酸結合を含む。特定の実施形態では、核酸剤のいくつか又はすべては、隣接する（デオキシ）リボヌクレオシド部分又はリボヌクレオチドアナログ部分を接続する１つ又は複数のチオリン酸結合を含む。

特定の実施形態では、核酸剤のうちの１つは、チオリン酸結合によって隣接するリボヌクレオシド部分又は隣接するリボヌクレオチドアナログ部分に接続されるＬＮＡ部分を含む。特定の実施形態では、核酸剤のうちの１つは、核酸剤のいずれかの末端にチオリン酸結合で接続された２、３又は４個のＬＮＡ部分を含む。

特定の実施形態では、前記核酸剤のうちの１つは、ヒト心筋細胞において作動可能なプロモーターの制御下でヌクレオチドのハイブリダイズ配列をコードする配列を含む外来性（導入遺伝子）発現コンストラクトから細胞内で発現する。

特定の実施形態では、前記核酸剤のいくつか又はすべては、ヒト心筋細胞において作動可能なプロモーターの制御下でヌクレオチドのハイブリダイズ配列をコードする配列を含む外来性（導入遺伝子）発現コンストラクトから細胞内で発現する。

特定の実施形態では、発現コンストラクトの各々及びすべては、単一の核酸分子内に含まれる。

特定の実施形態では、すべての発現コンストラクトを含む単一の核酸分子は多シストロン性コンストラクトであり、これは本発明の核酸剤の組み合わせのそれぞれ１つずつに、複数のオープンリーディングフレームを有するものである。

特定の実施形態では、核酸剤又は発現コンストラクトは、ナノ粒子に結合しているか、又はウイルス及びリポソームから選択される粒子構造体によってカプセル化されている。

リポソームは、少なくとも１つの脂質二重層を持つ球状の小胞である。リポソームは、生体膜を破壊すること（超音波処理など）により調製することができる。リポソームの主な種類には、多層膜小胞（ＭＬＶ（ｍｕｌｔｉｌａｍｅｌｌａｒｖｅｓｉｃｌｅ）、複数のラメラ相脂質二重層を含む）、小型単層リポソーム小胞（ＳＵＶ（ｓｍａｌｌｕｎｉｌａｍｅｌｌａｒｌｉｐｏｓｏｍｅｖｅｓｉｃｌｅ）、１層の脂質二重層を含む）、大型単層小胞（ＬＵＶ（ｌａｒｇｅｕｎｉｌａｍｅｌｌａｒｖｅｓｉｃｌｅ））、及び渦巻状小胞がある。

ナノ粒子は、直径１～１００ナノメートル（ｎｍ）の間の粒子状物質である。特定の実施形態では、ナノ粒子は、銀、金、ヒドロキシアパタイト、クレイ、二酸化チタン、二酸化ケイ素、二酸化ジルコニウム、炭素、ダイヤモンド、酸化アルミニウム、及び三フッ化イッテルビウム（ｙｔｔｅｒｂｉｕｍｔｒｉｆｌｕｏｒｉｄｅ）から選択される材料から構成されている。

特定の実施形態では、ウイルスは、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、及びアデノ随伴ウイルス、又は前述のもののハイブリッドから選択される。特定の実施形態では、ウイルスは、心筋細胞を選択的に形質導入する。

特定の実施形態では、ナノ粒子、又は粒子構造体は、心筋細胞へのナノ粒子又は粒子構造体の送達又は進入を促進するリガンドを含む。特定の実施形態では、リガンドは、抗ＣＤ７１Ｆａｂ断片及び抗ｃＴｎＩＦａｂ断片から選択される。これらのリガンドは、標的送達を行うために、心筋細胞に特異的な細胞表面受容体を標的することによって機能する。

特定の実施形態では、プロモーターは、前記核酸剤の心臓特異的な発現を可能にする。特定の実施形態では、プロモーターは、心臓組織特異的ＲＮＡポリメラーゼ２プロモーターである。特定の実施形態では、プロモーターは、ミオシン軽鎖２ｖ（ＭｙｏｓｉｎＬｉｇｈｔＣｈａｉｎ２ｖ）（ＭＬＣ２ｖ）プロモーター、心臓トロポニンＴ（ｃａｒｄｉａｃＴｒｏｐｏｎｉｎＴ）（ｃＴｎＴ）プロモーター、ミオシン重鎖α（ＭｙｏｓｉｎＨｅａｖｙＣｈａｉｎａｌｐｈａ）（ＭＨＣａ）プロモーター、及びタイチン（Ｔｉｔｉｎ）（Ｔｔｎ）プロモーターから選択される。

特定の実施形態では、心臓病は、心筋細胞の損失によって特徴付けられる。特定の実施形態では、心臓病は、心筋細胞の損失によって特徴付けられる心不全である。特定の実施形態では、心不全は、心筋の梗塞、狭窄、先天性疾患、炎症及び／又は敗血症の結果である。

特定の実施形態では、心臓病は、心筋細胞の低酸素状態（低酸素症）によって特徴付けられる。

心不全（ＨＦ：Ｈｅａｒｔｆａｉｌｕｒｅ）は、心臓が身体の必要量を満たす血流を維持するのに十分なポンプ機能を果たせない場合に発生し、治療しなければ死に至る。心不全（ＨＦ）は、冠動脈疾患、虚血性心疾患、大動脈弁狭窄症、高血圧症、及び代謝性疾患などの症状における疾患進行の結末にある。心不全は、心筋細胞の損失によって引き起こされ得る。心筋細胞は、酸素の供給不足（低酸素症（状態））により失われることが多い。本発明の核酸剤の組み合わせを使用することで、残った心筋細胞が分裂し、失われた心筋細胞の置き換えが引き起こされる。

特定の実施形態では、医薬組成物は、心臓へ投与される。

医療、剤形、及び塩
同様に、本発明の範囲内には、上記の核酸配列を患者に投与することを含む、それを必要とする患者の心臓病を治療すること、又はその方法が含まれる。

同様に、本発明の上記いずれかの態様又は実施形態によるアンチセンス分子を含む、心臓病の予防又は治療のための剤形が提供される。

当業者は、いずれの具体的に言及された薬物が、該薬物の薬学的に許容される塩として存在し得ることを認識している。薬学的に許容される塩には、イオン化された薬物及び逆荷電の対イオンが含まれる。薬学的に許容されるアニオン性塩形態の非限定的な例としては、酢酸塩、安息香酸塩、ベシル酸塩、酒石酸水素塩（ｂｉｔａｔｒａｔｅ）、臭化物、炭酸塩、塩化物、クエン酸塩、エデト酸塩、エジシル酸塩、エンボン酸塩、エストール酸塩、フマル酸塩、グルセプト酸塩、グルコン酸塩、臭化水素酸塩、塩酸塩、ヨウ化物、乳酸塩、ラクトビオン酸塩、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、マンデル酸塩、メシル酸塩、臭化メチル、硫酸メチル、ムチン酸塩、ナプシル酸塩、硝酸塩、パモ酸塩、リン酸塩、二リン酸塩、サリチル酸塩、ジサリチル酸塩、ステアリン酸塩、コハク酸塩、硫酸塩、酒石酸塩、トシル酸塩、トリエチオジド、及び吉草酸塩が挙げられる。薬学的に許容されるカチオン塩形態の非限定的な例としては、アルミニウム、ベンザチン、カルシウム、エチレンジアミン、リジン、マグネシウム、メグルミン、カリウム、プロカイン、ナトリウム、トロメタミン、及び亜鉛が挙げられる。

剤形は、鼻腔、口腔、直腸、経皮、若しくは経口投与などの経腸投与用、又は吸入剤若しくは坐剤とすることができる。あるいは、皮下、静脈内、肝内、若しくは筋肉内の注入形態などの非経口投与が用いられてもよい。任意に、薬学的に許容される担体及び／又は賦形剤が存在してもよい。

局所投与もまた、本発明の有利な使用の範囲内である。当業者は、以下の内容によって例示されるとおり局所製剤を提供するための可能な広い範囲の処方について理解している：Ｂｅｎｓｏｎ及びＷａｔｋｉｎｓｏｎ（編），ＴｏｐｉｃａｌａｎｄＴｒａｎｓｄｅｒｍａｌＤｒｕｇＤｅｌｉｖｅｒｙ：ＰｒｉｎｃｉｐｌｅｓａｎｄＰｒａｃｔｉｃｅ（第１編，Ｗｉｌｅｙ２０１１，ＩＳＢＮ－１３：９７８－０４７０４５０２９１）；及びＧｕｙ及びＨａｎｄｃｒａｆｔ：ＴｒａｎｓｄｅｒｍａｌＤｒｕｇＤｅｌｉｖｅｒｙＳｙｓｔｅｍｓ：ＲｅｖｉｓｅｄａｎｄＥｘｐａｎｄｅｄ（第２編，ＣＲＣＰｒｅｓｓ２００２，ＩＳＢＮ－１３：９７８－０８２４７０８６１０）；Ｏｓｂｏｒｎｅ及びＡｍａｎｎ（編）：ＴｏｐｉｃａｌＤｒｕｇＤｅｌｉｖｅｒｙＦｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ（第１編，ＣＲＣＰｒｅｓｓ１９８９；ＩＳＢＮ－１３：９７８－０８２４７８１８３５）。

医薬組成物及び投与
本発明の別の態様は、本発明の化合物、又はその薬学的に許容される塩、及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物に関する。さらなる実施形態では、該組成物は、本明細書に記載されるものなどの少なくとも２つの薬学的に許容される担体を含む。

本発明の特定の実施形態では、本発明の化合物は、典型的には、薬物の容易に制御可能な投与量を提供し、かつ患者に簡潔かつ容易に取り扱い可能な製品を付与するような薬学的剤形に製剤化される。

本発明の化合物の局所的使用に関する本発明の実施形態では、医薬組成物は、水溶液、懸濁液、軟膏、クリーム、ゲル又は噴霧可能な製剤、例えばエアゾール等による送達用のものなど、局所投与に適した方法で製剤化され、活性成分を当業者に知られている１つ又は複数の可溶化剤、安定剤、等張化増強剤、緩衝液及び防腐剤と共に含んでいる。

医薬組成物は、経口投与、非経口投与、又は直腸投与用に製剤化することができる。さらに、本発明の医薬組成物は、固体形態（限定されないが、カプセル、錠剤、丸薬、顆粒、粉末又は坐剤を含む）、又は液体形態（限定されないが、溶液、懸濁液又は乳濁液を含む）において構成することができる。

本発明の化合物の投与レジメンは、特定の薬剤の薬力学的特性及びその投与の様式及び経路などの既知の要因：レシピエントの種、年齢、性別、健康状態、病状、及び体重；症状の性質と程度；同時治療の種類；治療の頻度；投与経路、患者の腎機能及び肝機能、並びに所望の効果、に応じて変化するであろう。特定の実施形態では、本発明の化合物は、１日１回の用量で投与されてもよいし、又は１日の総用量が、１日２回、３回、又は４回に分割した用量で投与されてもよい。

特定の実施形態では、本発明の医薬組成物又は組み合わせは、約５０～７０ｋｇの対象に対して約１～１０００ｍｇの活性成分（複数可）の単位用量であり得る。化合物、医薬組成物、又はそれらの組み合わせの治療上有効な投与量は、対象の種、体重、年齢及び個人の状態、治療される障害又は疾患又はその重篤度に依存する。通常の技術を有する医師、臨床医又は獣医師であれば、障害又は疾患の予防、治療又は進行抑制に必要な各有効成分の有効量を容易に決定することができる。

本発明の医薬組成物は、滅菌などの従来の医薬操作にかけることができ、及び／又は従来の不活性希釈剤、潤滑剤、又は緩衝剤、並びに保存剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤及び緩衝剤などのアジュバントを含有することができる。これらは、標準的なプロセス、例えば、従来の混合、造粒、溶解又は凍結乾燥プロセスによって製造することができる。医薬組成物を調製するための多くのそのような手順及び方法は、当技術分野で知られており、例えば、Ｌ．Ｌａｃｈｍａｎら、ＴｈｅＴｈｅｏｒｙａｎｄＰｒａｃｔｉｃｅｏｆＩｎｄｕｓｔｒｉａｌＰｈａｒｍａｃｙ，第４編，２０１３（ＩＳＢＮ８１２３９２２８９２）を参照されたい。

本発明は、さらに以下の項目を包含する。
項目
項目１．心臓病の治療又は予防における使用のための核酸剤の組み合わせであって、前記核酸剤の各々は、標的マイクロＲＮＡを標的とし、かつそれを特異的に阻害及び／又は分解することができ、それによって前記核酸剤の組み合わせは、細胞内のマイクロＲＮＡの組み合わせを阻害及び／又は分解することができ、前記マイクロＲＮＡの組み合わせは、
ａ．ｍｉＲ－１ａ、及び
ｂ．ｍｉＲ－１５ｂ、又は
ｍｉＲ－１５ｂ及びｍｉＲ－２７ｂ、又は
ｍｉＲ－２７ｂ及びｍｉＲ－３４ａ、
である、前記核酸剤の組み合わせ。
項目２．前記マイクロＲＮＡの組み合わせは、ｍｉＲ－１ａ及びｍｉＲ－１５ｂを含む、項目１に記載の心臓病の治療又は予防における使用のための核酸剤の組み合わせ。
項目３．各核酸剤は、ヌクレオチドのハイブリダイズ配列を含むか、又はそれから本質的になり、前記ヌクレオチドのハイブリダイズ配列は、標的マイクロＲＮＡとハイブリッドを形成することができる、項目１又は２に記載の心臓病の治療又は予防における使用のための核酸剤の組み合わせ。
項目４．各核酸剤は、配列番号００１～００４の配列から選択される配列を含むか、又はそれから本質的になる、項目１～３のいずれか一項に記載の心臓病の治療又は予防における使用のための核酸剤の組み合わせ。
項目５．前記核酸剤のうちの１つは、
１つ又は複数のロック核酸（ＬＮＡ）部分及び／又はペプチド核酸（ＰＮＡ）部分、
を含むか、又はそれから本質的になり、
特に、前記核酸剤のすべては、
１つ又は複数のロック核酸（ＬＮＡ）部分及び／又はペプチド核酸（ＰＮＡ）部分、
を含むか、又はそれから本質的になり、
特に、前記核酸剤は、ロック核酸（ＬＮＡ）部分から本質的になる、
項目１～４のいずれか一項に記載の心臓病の治療又は予防における使用のための核酸剤の組み合わせ。
項目６．前記核酸剤のうちの１つは、
１つ又は複数のチオリン酸結合を含み、
特に、前記核酸剤のすべては、
１つ又は複数のチオリン酸結合を含む、
項目１～５のいずれか一項に記載の心臓病の治療又は予防における使用のための核酸剤の組み合わせ。
項目７．前記核酸剤のうちの１つは、チオリン酸結合により隣接物に接続されたＬＮＡ部分を含み、
特に、前記核酸剤のうちの１つは、前記核酸剤のいずれかの末端でチオリン酸結合により接続された２、３又は４個のＬＮＡ部分を含む、
項目５又は６に記載の心臓病の治療又は予防における使用のための核酸剤の組み合わせ。
項目８．前記核酸剤のうちの１つは、
ヒト心筋細胞において作動可能なプロモーターの制御下でヌクレオチドのハイブリダイズ配列をコードする配列を含む外来性（導入遺伝子）発現コンストラクトにより細胞内で発現し、
特に、前記核酸剤のすべては、
ヒト心筋細胞において作動可能なプロモーターの制御下でヌクレオチドのハイブリダイズ配列をコードする配列を含む外来性（導入遺伝子）発現コンストラクトにより細胞内で発現する、
項目１～７のいずれか一項に記載の心臓病の治療又は予防における使用のための核酸剤の組み合わせ。
項目９．ヒト心筋細胞において作動可能なプロモーターの制御下で、核酸剤の組み合わせをコードする、心臓病の治療又は予防における使用のための、発現コンストラクト、又は複数の発現コンストラクトであって、前記核酸剤の各々は、標的マイクロＲＮＡを標的とし、かつそれを特異的に阻害及び／又は分解することができ、それによってマイクロＲＮＡの組み合わせを阻害及び／又は分解することができ、前記マイクロＲＮＡの組み合わせは、
ａ．ｍｉＲ－１ａ、及び
ｂ．ｍｉＲ－１５ｂ、又は
ｍｉＲ－１５ｂ及びｍｉＲ－２７ｂ、又は
ｍｉＲ－２７ｂ及びｍｉＲ－３４ａ、
を含み、特に、前記マイクロＲＮＡの組み合わせは、ｍｉＲ－１ａ及びｍｉＲ－１５ｂを含む、前記発現コンストラクト、又は前記複数の発現コンストラクト。
項目１０．前記発現コンストラクトの各々及びすべては、単一の核酸分子内に含まれる、項目９に記載の心臓病の治療又は予防における使用のための複数の発現コンストラクト。
項目１１．前記核酸剤又は前記発現コンストラクトは、ナノ粒子に結合しているか、又はウイルス及びリポソームから選択される粒子構造体によってカプセル化されている、項目１～１０のいずれか一項に記載の心臓病の治療又は予防における使用のための、核酸剤の組み合わせ、又は発現コンストラクト。
項目１２．前記ナノ粒子、又は前記粒子構造体は、心筋細胞への前記ナノ粒子又は前記粒子構造体の送達又は侵入を促進するリガンドを含む、項目１１に記載の心臓病の治療又は予防における使用のための、核酸剤の組み合わせ、又は発現コンストラクト。
項目１３．前記プロモーターは、前記核酸剤の心臓特異的発現を可能にし、特に前記プロモーターは、心臓組織特異的ＲＮＡポリメラーゼ２プロモーターであり、特にミオシン軽鎖２ｖ（ＭＬＣ２ｖ）プロモーター、心臓トロポニンＴ（ｃＴｎＴ）プロモーター、ミオシン重鎖α（ＭＨＣａ）プロモーター、及びタイチン（Ｔｔｎ）プロモーターから選択されるプロモーターである、項目９～１２のいずれか１項に記載の心臓病の治療又は予防における使用のための、発現コンストラクト、又は複数の発現コンストラクト。
項目１４．前記心臓病は、心筋細胞の損失によって特徴付けられ、特に前記心臓病は、心筋細胞の損失によって特徴付けられる心不全であり、より特に前記心不全は、心筋の梗塞、狭窄、先天性疾患、炎症及び／又は敗血症の結果である、項目１～１３のいずれか一項に記載の心臓病の治療又は予防における使用のための、核酸剤の組み合わせ、又は複数の発現コンストラクト。
項目１５．前記心臓病は、心筋細胞の低酸素状態によって特徴付けられる、項目１～１４のいずれか一項に記載の心臓病の治療又は予防における使用のための、核酸剤の組み合わせ、又は複数の発現コンストラクト。
項目１６．項目１～１５のいずれか一項に記載の前記核酸剤の組み合わせ、又は前記複数の発現コンストラクトを含む、心臓病の治療又は予防における使用のための医薬組成物。
項目１７．前記医薬組成物は、心臓へ投与される、項目１６に記載の心臓病の治療又は予防における使用のための医薬組成物。

本発明は、以下の実施例及び図によってさらに説明され、そこからさらなる実施形態及び利点を引き出すことができる。これらの実施例は、本発明を説明するためのものであり、その範囲を限定するものではない。

実施例１：心筋細胞増殖を促進するｍｉＲＮＡの阻害剤のスクリーニング
本発明者らは、心筋細胞の増殖を誘導する候補として１７種のｍｉＲＮＡを選択した。これら１７の候補ｍｉＲＮＡを評価するために、これらをｉｎｖｉｔｒｏにてラット心筋細胞において、ロック核酸（ＬＮＡ）ベースのａｎｔｉｍｉＲ（ＬＮＡ－ｍｉＲＮＡ）で阻害した。本発明者らは、心筋細胞における増殖を検出するためのコンビナトリアルなアプローチを開発した。本発明者らは、１７種の候補ＬＮＡのうちのどれが重要であるかを決定するために、新生児ラット心筋細胞（ＮＲＣ：ｎｅｏｎａｔａｌｒａｔｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅ、Ｐ１）をすべての１７種のＬＮＡを対照として一緒に用いて治療し、１７種のＬＮＡのプールから個々のＬＮＡを取り除いた場合の心筋細胞の増殖を、ＥｄＵ（５－エチニル－２’－デオキシウリジン（５－Ｅｔｈｙｎｙｌ－２’－ｄｅｏｘｙｕｒｉｄｉｎｅ））取り込み法により調査した（図１Ａ、１Ｂ及び１Ｃ）。ＥｄＵの初期評価はＬＮＡ治療後４８時間以内に行い、ラット心筋細胞はサルコメアα－アクチニンで標識した。ｍｉＲ－１ａ、ｍｉＲ－１５ａ、ｍｉＲ－１５ｂ、ｍｉＲ－２７ｂ、又はｍｉＲ－３４ｃを標的とする個々のＬＮＡを除去することは、図１Ｂ及び１Ｃに示すとおり、Ｓ期の心筋細胞数の減少をもたらした。残りのＬＮＡを除去しても、心筋細胞の増殖に有意な影響を与えなかった。ｍｉＲＮＡの発現量を、定量的リアルタイムＰＣＲによって検出した（図１Ｄ）。これらの結果は、ｍｉＲ－１ａ、ｍｉＲ－１５ａ、ｍｉＲ－１５ｂ、ｍｉＲ－２７ｂ、及びｍｉＲ－３４ｃがラット心筋細胞におけるＤＮＡ合成に重要な役割を担っていることを示唆している。

実施例２：ｍｉＲ－１ａ及びｍｉＲ－１５ｂの組み合わせの阻害は心筋細胞増殖を誘導する
ＥｄＵは、Ｓ期におけるｄｅｎｏｖｏＤＮＡ合成及び取り込みの重要なマーカーとしての役割を果たす一方で、細胞周期の完了及び娘細胞の形成の判定は除外される。このｍｉＲＮＡが細胞質分裂及び細胞周期の完了を駆動することを確認するために、本発明者らはオーロラＢをマーカーとして利用した。オーロラＢは、有糸分裂期において、内側セントロメアタンパク質及びサバイビンと物理的に会合する。有糸分裂の初期にセントロメアヘテロクロマチンと会合し、中心紡錘体に移行し、最終的に収縮環と中心体に局在する。このように、収縮環と中心体とでのオーロラＢの染色及び局在は、細胞質分裂及び細胞周期完了のマーカーとして機能している。

どの組み合わせが細胞質分裂を増強できるかを調べるため、ｍｉＲ－１ａ、ｍｉＲ－１５ａ、ｍｉＲ－１５ｂ、ｍｉＲ－２７ｂ、及びｍｉＲ－３４ｃを標的とする５種の候補ＬＮＡの組み合わせに相当する３１条件を１日齢のラット心筋細胞で試験した。心筋細胞の増殖は、収縮環と中心体のオーロラＢ染色とサルコメアα－アクチニンの共局在化により、細胞質分裂中の細胞を標識して評価した（図２Ａ及び２Ｂ）。これらの結果から、２つの組み合わせ（ＬＮＡ－１ａ及びＬＮＡ－１５ｂ；ＬＮＡ－１ａ、ＬＮＡ－１５ｂ、及びＬＮＡ－２７ｂ）は、他の組み合わせに比べて、分裂終期の心筋細胞数が多いことがわかった（図２Ｂ、２Ｃ、及び２Ｅ）。ｍｉＲＮＡの発現量を図２Ｄ及び図２Ｆに示した。

さらに、ｍｉＲ－１ａ、ｍｉＲ－１５ａ、ｍｉＲ－１５ｂ、及びｍｉＲ－２７ｂを標的とするＬＮＡによるすべての組み合わせを、細胞分裂が停止した７日齢のラット心筋細胞（Ｐ７）でスクリーニングした。４８時間後、心筋細胞の増殖をオーロラＢ染色で評価した。ＬＮＡ－１ａとＬＮＡ－１５ｂとの組み合わせは、７日齢のラット心筋細胞の分裂終期におけるオーロラＢをさらに増強させる結果となった（図３Ａ及び３Ｂ）。ｍｉＲ－１ａ及びｍｉＲ－１５ｂの発現量を図２Ｄ及び図２Ｆに示した。これらのデータから、ｍｉＲ－１ａとｍｉＲ－１５ｂとの組み合わせ阻害は、ｉｎｖｉｔｒｏのＰ１及びＰ７の両方のラット心筋細胞において、心筋細胞の増殖を効果的かつ効能的に増強することが示唆された。

実施例３：ｍｉＲ－１ａ及びｍｉＲ－１５ｂの阻害は、ｉｎｖｉｖｏでの心筋梗塞後の心機能を向上させる
ｉｎｖｉｖｏでｍｉＲ－１ａ及びｍｉＲ－１５ｂをノックダウンするために、ＬＮＡベースのａｎｔｉｍｉＲ（ＬＮＡ－１ａ、ＬＮＡ－１５ｂ）を腹腔内注入により投与した（図４Ａ）。１２週齢のマウスにおいて単一及びコンビナトリアルなＬＮＡを試験し、注入後７日目に心臓を採取した。定量的リアルタイムＰＣＲにより、ＬＮＡ対照と比較して、いずれか一方又は両方のＬＮＡの送達が成功したことが確認された（図４Ｂ、４Ｃ及び４Ｄ）。心筋細胞増殖に対するＬＮＡのいずれか一方又は両方の効果を調べるために、本発明者らはｐＨＨ３の発現を調べ、ＬＮＡ－１ａ／１５ｂ注入後のマウス心臓でＬＮＡ－対照と比較してｐＨＨ３シグナルが増加していることを見出した（図４Ｅ及び図４Ｆ）。

傷害後の心筋細胞増殖及び心機能に対するｍｉＲ－１ａ及びｍｉＲ－１５ｂ阻害の効果を調べるため、１２週齢のマウスに心筋梗塞（ＭＩ）後４時間の腹腔内注入によりｍｉＲ－１ａ及びｍｉＲ－１５ｂを阻害し（図５Ａ）、２８日目に心臓を摘出した（図５Ｂ）。心エコー検査を０、７、１４、２１、及び２８日目に実施した。２８日後、心臓を摘出し、３つの部分に分けた：遠隔部、境界部、梗塞部。ＬＮＡ－１ａ／１５ｂ治療マウスでは、遠隔部、境界部、及び梗塞部においてｍｉＲ－１ａ及びｍｉＲ－１５ｂのｍｉＲＮＡ量が対照群に比べ有意に減少した（図５Ｃ及び５Ｄ）。

心機能を心エコー法で測定したところ、ＬＮＡ－１ａ／ＬＮＡ－１５ｂを注入したマウスは、心収縮機能の指標である駆出率（ＥＦ）が対照と比較して劇的な増加を示すことが本発明者らによって見出された（図５Ｅ）。本発明者らは、さらに病的肥大の分子マーカーの発現を調べたところ、脳性ナトリウム利尿ペプチド（ＮＰＰＡ：ｂｒａｉｎｎａｔｒｉｕｒｅｔｉｃｐｅｐｔｉｄｅ）とβミオシン重鎖（Ｍｙｈ７）とが、対照のＬＮＡ注入と比較して、境界部と梗塞部の両方でＬＮＡ－１ａ／１５ｂ注入後に減少することを発見した（図５Ｆ及び図５Ｇ）。ＭＩによって誘導されるＭｙｈ７：Ｍｙｈ６比率を、ｍｉＲ－１ａとｍｉＲ－１５ｂとをコンビナトリアル阻害することによって有意に減少させた（図５Ｈ）。さらに、線維化関連遺伝子（ＴＧＦβ２、Ｃｏｌ３ａ１、及びＴｈｂｓ１）の発現量を、ＭＩ後の境界部と梗塞部との両方でＬＮＡ－１ａ／１５ｂ注入により抑制した（図５Ｉ、５Ｊ、及び５Ｋ）。これらの結果は、ＬＮＡ－１ａ／１５ｂのコンビナトリアル治療により、ＭＩにおいて有意に優れた保護効果がもたらされることを示している。

実施例４：ｍｉＲ－１ａ及びｍｉＲ－１５ｂの阻害は、ｉｎｖｉｖｏでの心筋梗塞後の心筋細胞増殖を増加させる
本発明者らは、ｍｉＲ－１ａ及びｍｉＲ－１５ｂのコンビナトリアル阻害が、Ｐ１及びＰ７のラット心筋細胞において心筋細胞増殖を駆動することを実証した。したがって、本発明者らは、ｍｉＲ－１ａ及びｍｉＲ－１５ｂの阻害が、ＭＩ応答での心筋細胞増殖を同様に増大し得るかどうかを調査した。本発明者らは、成体マウス心臓においてＬＮＡ－１ａ及びＬＮＡ－１５ｂが心筋細胞の増殖を増強することができるかどうかを調べるために、ＬＮＡ－１ａ及びＬＮＡ－１５ｂ又は対照ＬＮＡの注入及びＭＩ後のマウス心臓の心筋細胞におけるＫｉ６７を調査した。対照マウスとＭＩマウスの両方において、ＬＮＡ－１ａ及びＬＮＡ－１５ｂ注入後に、対照ＬＮＡと比較して心筋細胞でＫｉ６７シグナルの増加を検出した（図６Ａ及び図６Ｂ）。さらに、本発明者らは、ｐＨＨ３の発現を調べたところ、ＬＮＡ－１ａ／１５ｂ注入後及びＭＩ後のマウス心臓において、ｐＨＨ３シグナルが同様に増加することを見出した（図６Ｃ及び図６Ｄ）。さらに、本発明者らは、細胞質分裂マーカーであるオーロラＢを調べたところ、ＬＮＡ－１ａ／１５ｂは、対照及びＭＩにおけるマウス心筋細胞でオーロラＢの発現を誘導することを見出した（図６Ｅ及び図６Ｆ）。これらのデータは、ＬＮＡ－１ａ／１５ｂがｉｎｖｉｖｏでのマウスのＭＩに応答して心筋細胞の増殖を誘導できたことを示すものである。

実施例５：ｍｉＲ－１ａ及びｍｉＲ－１５ｂの阻害は、ｈｉＰＳＣ－ＣＭの心筋細胞増殖を増強する
ヒト心筋細胞での組み合わせを試験するために、本発明者らは、組み合わせＬＮＡ（ＬＮＡ－１ａ、ＬＮＡ－１５ｂ）又は陰性対照ＬＮＡ（ＬＮＡ－対照）のいずれかで、有糸分裂後４０日齢のヒト人工多能性幹細胞由来心筋細胞（ｈｉＰＳＣ－ＣＭｓ）を治療した。本発明者らは、ＬＮＡ－１ａ及びＬＮＡ－１５ｂが、酸素正常状態及び低酸素状態の両方の条件下で心筋細胞の増殖を増大させることを観察した（図７Ａ及び図７Ｂ）。ｍｉＲＮＡの発現量は、定量的リアルタイムＰＣＲで検出した（図７Ｃ及び図７Ｄ）。

実施例６：ｍｉＲ－１ａとｍｉＲ－１５ｂとの組み合わせ阻害は、ヒト模倣組織において心筋細胞増殖を増強し、心機能を改善する
次に、本発明者らは、ｍｉＲ－１ａとｍｉＲ－１５ｂとの組み合わせが、ヒト単培養心筋オルガノイドにおける心筋細胞の増殖及び心筋収縮力に影響を与えるかどうかを調査した（図８Ａ）。本発明者らは、ヒト心筋オルガノイドにおいて、ＬＮＡ－１ａとＬＮＡ－１５ｂとの組み合わせ、又はＬＮＡ－対照で治療し、酸素正常状態と低酸素状態で３日間培養した。定量的リアルタイムＰＣＲにより、単培養心筋オルガノイドでのＬＮＡ治療によりｍｉＲ－１及びｍｉＲ－１５ｂの発現量が有意にダウンレギュレートされることが示された（図８Ｂ及び図８Ｃ）。心筋細胞の増殖は、ＥｄＵ取り込み及びｐＨＨ３によって決定した。図８Ｄ及び図８Ｅに示すとおり、本発明者らは、組み合わせＬＮＡ（ｍｉＲ－１ａ、ｍｉＲ－１５ｂ）が、ＥｄＵ取り込み量の増加に基づき、低酸素状態における心筋細胞の増殖を増大させることを見出した。さらに、ｐＨＨ３は、ＬＮＡ－１ａ／１５ｂの組み合わせ治療が低酸素条件下で心筋細胞の増殖を増強することを示したが、酸素正常条件下では認められなかった（図８Ｆ及び図８Ｇ）。さらに、低酸素による収縮力の低下は、ｍｉＲ－１ａ及びｍｉＲ－１５ｂの阻害によって回復した（図８Ｈ）。これらのデータを総合すると、ｍｉＲ－１ａとｍｉＲ－１５ｂとの組み合わせ阻害は、ヒト心筋模型において心筋細胞の増殖を増大させ、収縮力を高めることができたことが示された。

実施例７：ｍｉＲ－１ａ、ｍｉＲ－２７ｂ、及びｍｉＲ－３４ａの組み合わせ阻害は、心筋細胞増殖を誘導する
さらに、Ｄｉｍｍｅｌｅｒは、ｍｉＲ－３４ａの阻害が心筋細胞の増殖を誘導することができ、心機能を改善することを示してきた。本発明者らのデータは、ｍｉＲ－１ａとｍｉＲ－２７ｂとが心筋細胞における細胞分裂に重要であることを示した。それ故、本発明者らは、ｍｉＲ－１ａ、ｍｉＲ－２７ｂ及びｍｉＲ－３４ａの組み合わせ阻害が、ｉｎｖｉｔｒｏ、及びｉｎｖｉｖｏで心筋細胞の増殖を駆動することができるかどうかを検出することを試みた。最初に、単離した新生児ラット心筋細胞をＬＮＡ－１ａ、ＬＮＡ－２７ｂ、及びＬＮＡ－３４ａの組み合わせ、又はＬＮＡ－対照で２日間治療し、この細胞をオーロラＢ、αアクチニン、及びＤＡＰＩで染色した。ＬＮＡ－１ａ、ＬＮＡ－２７ｂ及びＬＮＡ－３４ａの組み合わせ治療は、新生児ラット心筋細胞において、分裂終期のオーロラＢ陽性心筋細胞を有意に増加させて心筋細胞の増殖を著しく増大させた（図９Ａ及び図９Ｂ）。次いで本発明者らは、ｍｉＲ－１ａ、ｍｉＲ－２７ｂ及びｍｉＲ－３４ａを組み合わせ阻害によってもまた心筋細胞の増殖を促進できるのではないかと考え、１２週齢のマウスにＬＮＡ－１ａ、ＬＮＡ－２７ｂ及びＬＮＡ－３４ａの組み合わせ又はＬＮＡ－対照のいずれかを１週間注入した。図９Ｃ及び図９Ｄに示すとおり、ＬＮＡ－１ａ、ＬＮＡ－２７ｂ及びＬＮＡ－３４ａの組み合わせは、Ｋｉ６７陽性心筋細胞の増加により心筋細胞の増殖を増大させた。ＬＮＡ－１ａ、ＬＮＡ－２７ｂ、及びＬＮＡ－３４ａの組み合わせは、ｉｎｖｉｔｒｏ及びｉｎｖｉｖｏで心筋細胞の増殖を駆動することができることが示された。

材料と方法
動物
すべての動物はＪａｎｖｉｅｒ社（ル・ジュネスト＝サン＝ティスル、フランス）から入手した。この実験に使用したすべての動物は、ＮＩＨ動物飼育ガイドライン、§８ドイツ動物保護法、ドイツ動物福祉法、実験動物学会（ＧＶ－ＳＯＬＡＳ）及び欧州実験動物学会連合（ＦＥＬＡＳＡ）のガイドラインのとおり、１２時間明暗サイクルの温度制御された部屋に収容し、餌及び水を自由に摂取できるようにした。

心筋梗塞（ＭＩ）
心筋梗塞（ＭＩ）は１２週齢の雄Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスにて実施し、左冠動脈前下降枝（ｌｅｆｔａｎｔｅｒｉｏｒｄｅｓｃｅｎｄｉｎｇｃｏｒｏｎａｒｙａｒｔｅｒｙ）（ＬＡＤ）の永久結紮によりこれを誘発させた。術後２８日までマウスをモニターし、０、７、１４、２１、及び２８日目に心エコーで心臓の寸法及び心機能を測定した。ＭＩから４時間後、ｉｎｖｉｖｏｍｉＲＣＵＲＹＬＮＡＰｏｗｅｒＩｎｈｉｂｉｔｏｒを１０ｍｇ／ｋｇの用量でマウスに腹腔内（ｉ．ｐ．：ｉｎｔｒａｐｅｒｉｔｏｎｅａｌｌｙ）に注入した。以下のｉｎｖｉｖｏｍｉＲＣＵＲＹＬＮＡＰｏｗｅｒＩｎｈｉｂｉｔｏｒはＱＩＡＧＥＮ社から購入した：ｍｉＲ－１ａ－３ｐ（３３９２０３ＹＣＩ０２００６５９－ＦＺＡ）、ｍｉＲ－１５ｂ－５ｐ（３３９２０３ＹＣＩ０２００６４１－ＦＺＡ）。陰性対照：ＬＮＡ（３３９２０３ＹＣＩ０２００５７８－ＦＺＡ）。

新生児ラット初代心筋細胞の単離と維持
ＳｐｒａｇｕｅＤａｗｌｅｙの雌の交配ラットはＪａｎｖｉｅｒ社（ル・ジュネスト＝サン＝ティスル、フランス）から入手した。製造元の指示に従って、新生児心臓解離キット（ＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃ）及びｇｅｎｔｌｅＭＡＣＳ解離装置を使用して、初代新生児ラット心筋細胞（ＮＲＣ：Ｐｒｉｍａｒｙｎｅｏｎａｔａｌｒａｔｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅ）をＰ１及びＰ７の仔ラットから分離した。単離した細胞を、以前の記載のとおり線維芽細胞を除くために加湿雰囲気で３７℃及び５％ＣＯ_２で１０ｃｍの細胞培養ディッシュ（Ｎｕｎｃ）において１．５時間、プレーティング培地（ＤＭＥＭ高グルコース、Ｍ１９９ＥＢＳ（ＢｉｏＣｏｎｃｅｐｔ）、１０％ウマ血清、５％ウシ胎児血清、２％Ｌ－グルタミン及び１％ペニシリン／ストレプトマイシン）に事前にプレーティングした。ＮＲＣを、プレーティング培地中のディッシュ、又はＩ型ウシコラーゲンコーティング（ＡｄｖａｎｃｅｄＢｉｏｍａｔｒｉｘ）プレートにプレーティングした。ＮＲＣの分離後２４時間にて、プレーティング培地を維持培地（ＤＭＥＭ高グルコース、Ｍ１９９ＥＢＳ、１％ウマ血清、２％Ｌ－グルタミン、及び１％ペニシリン／ストレプトマイシン）に変更した。

ロック核酸（ＬＮＡ）のｉｎｖｉｔｒｏ投与
ｍｉＲＣＵＲＹＬＮＡＰｏｗｅｒＩｎｈｉｂｉｔｏｒを、最終濃度５０ｎＭで細胞培養液に直接添加した。すべてのｍｉＲＣＵＲＹＬＮＡＰｏｗｅｒＩｎｈｉｂｉｔｏｒと陰性対照ＬＮＡはＱＩＡＧＥＮ社から購入した。ｍｉＲ－１ａ－３ｐ（１９９９９９０－８０１）、ｍｉＲ－１５ａ－５ｐ（３３９１４６ＹＣＩ０２００６４０－ＦＤＡ）、ｍｉＲ－１５ｂ－５ｐ（３３９１４６ＹＣＩ０２００６４１－ＦＤＡ）、ｍｉＲ－１６（３３９１４６ＹＣＩ０２００６４７－ＦＤＡ）、ｍｉＲ－２７ｂ－５ｐ（３３９１４６ＹＣＩ０２００６４８－ＦＤＡ）、ｍｉＲ－２９ａ－３ｐ（３３９１４６ＹＣＩ０２００６４４－ＦＤＡ）、ｍｉＲ－３４ａ－５ｐ（３３９１４６（ＹＣＩ０２００６４９－ＦＤＡ）、ｍｉＲ－３４ｂ－５ｐ（３３９１４６ＹＣＩ０２００６４５－ＦＤＡ）、ｍｉＲ－３４ｃ－５ｐ（３３９１４６ＹＣＩ０２００６５０－ＦＤＡ）、ｍｉＲ－９２ａ－３ｐ（３３９１４６ＹＣＩ０２００６４６－ＦＤＡ）、ｍｉＲ－１３２－３ｐ（１９９９９９０－８０１）、ｍｉＲ－１３３ａ－３ｐ（１９９９９９０－８０１）、ｍｉＲ－１５５－３ｐ（１９９９９９０－８０１）、ｍｉＲ－１９５ａ－５ｐ（３３９１４６ＹＣＩ０２００６４２－ＦＤＡ）、ｍｉＲ－２０８ａ－３ｐ（１９９９９９０－８０１）、ｍｉＲ－４９７ａ－５ｐ（３３９１４６ＹＣＩ０２００６４３－ＦＤＡ）、ｍＲ－８７３ａ－５ｐ（１９９９９９０－８０１）、及び陰性対照ＬＮＡＣＥＬ－ＣＯＮＴＲＯＬ－ＩＮＨ（３３９１４７ＹＣＩ０１９９０６６－ＦＦＡ）。

ＲＮＡの単離、逆転写及びｑＲＴ－ＰＣＲ
試料はＱＩＡｚｏｌＬｙｓｉｓ試薬（ＱＩＡＧＥＮ）で採取し、ｍｉＲＮＡｍｉｎｉキット（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて製造元のプロトコルに従って総ｍｉＲＮＡ及び総ｍＲＮＡを単離した。２００ｎｇの総ＲＮＡをＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ逆転写キット（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて、製造元のプロトコルに従ってｃＤＮＡに逆転写した。ＦａｓｔＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎマスターミックス（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用したＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社のＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓリアルタイムＰＣＲシステム（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カリフォルニア州、米国）を分析に使用した。以下を対象とするＴａｑＭａｎＴＭＡｄｖａｎｃｅｄｍｉＲＮＡアッセイ：ｍｍｕ－ｍｉＲ－１ａ－３ｐ（ＩＤ：ｍｍｕ４８２９１４＿ｍｉｒ）、ｈａｓ－ｍｉＲ－１－３ｐ（ＩＤ：ｍｍｕ４８２９１４＿ｍｉｒ）、ｒｎｏ－ｍｉＲ－１５ａ－５ｐ（ＩＤ：ｒｎｏ４８３０２２＿ｍｉｒ）、ｍｍｕ－ｍｉＲ－１５ｂ－５ｐ（ＩＤ：ｍｍｕ４８２９５７＿ｍｉｒ）、ｒｎｏ－ｍｉＲ－１６－５ｐ（ＩＤ：ｒｎｏ４８１３１２＿ｍｉｒ）、ｒｎｏ－ｍｉＲ－２７ｂ－５ｐ（ＩＤ：ｒｎｏ４８１０１６＿ｍｉｒ）、ｈｓａ－ｍｉＲ－２７ｂ－ｓｐ（ＩＤ：４７８７８９＿ｍｉｒ）、ｈｓａ－ｍｉＲ－２９ａ－３ｐ（ＩＤ：４７８５８７＿ｍｉｒ）、ｈｓａ－ｍｉＲ－３４ａ－５ｐ（ＩＤ：ｒｎｏ４８１３０４＿ｍｉｒ）、ｈｓａ－ｍｉＲ＿３４ｃ－５ｐ（ＩＤ：４７８０５２＿ｍｉｒ）、ｒｎｏ－ｍｉＲ－１３２－３ｐ（ＩＤ：ｒｎｏ４８０９１９＿ｍｉｒ）、ｒｎｏ－ｍｉＲ－１３３ａ－３ｐ（ＩＤ：ｒｎｏ４８１４９１＿ｍｉｒ）、ｍｍｕ－ｍｉＲ－１５５－３ｐ（ＩＤ：ｍｍｕ４８１３２８＿ｍｉｒ）、ｍｍｕ－ｍｉＲ－１９５ａ－５ｐ（ＩＤ：ｍｍｕ４８２９５３＿ｍｉｒ）、ｍｍｕ－ｍｉＲ－４９７ａ－５ｐ（ＩＤ：ｍｍｕ４８２６０７＿ｍｉｒ）、ｍｉＲ－８７３ａ－５ｐ（ＩＤ：ｒｎｏ４８１４２５＿ｍｉｒ）、及びｈｓａ－ｍｉＲ－２６ａ－５ｐ（ＩＤ：４７７９９５＿ｍｉｒ）。

ヒトｉＰＳＣ－ＣＭの調製と維持
ヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）はＣｅｌｌｕｌａｒＤｙｎａｍｉｃｓＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社（ＣＭＣ－１００－０１０－００１）から購入し、製造元の推奨の方法で培養した。ヒトｉＰＳＣ由来心筋細胞（ｈｉＰＳＣ－ＣＭ）を、ＳＴＥＭｄｉｆｆ（商標）心筋細胞分化キット（ＳＴＥＭＣＥＬＬＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて、製造元のプロトコルに従って再プログラム化した。簡潔には、５ｕＭＲＯＣＫ阻害剤（Ｙ－２７６３２、ＳＴＥＭＣＥＬＬＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）添加のｍＴｅＳＲ（商標）培地を用いて、ヒトｉＰＳ細胞をマトリゲルコーティングした１２ウェルプレートに３．５×１０^５細胞／ウェルの細胞密度で２４時間プレートした。１日後（－１）、この培地を新しいＴｅＳＲ（商標）培地に交換した。心筋分化を誘導するため、ＴｅＳＲ（商標）培地を０日目に培地Ａ（サプリメントＡを含有するＳＴＥＭｄｉｆｆ（商標）心筋細胞分化基礎培地）、２日目に培地Ｂ（サプリメントＢを含有するＳＴＥＭｄｉｆｆ（商標）心筋細胞分化基礎培地）、４日目及び６日目に培地Ｃ（サプリメントＣを含有するＳＴＥＭｄｉｆｆ（商標）心筋細胞分化基礎培地）に交換した。８日目に培地をＳＴＥＭｄｉｆｆ（商標）心筋細胞維持培地に切り替え、２日ごとに培地を全量交換し、成熟心筋細胞への分化をさらに促進させた。すべての実験は、４０日目のｈｉＰＳＣ－ＣＭにおいて実施した。低酸素チャンバーを用いて低酸素状態を作り出し、ｈｉＰＳＣ－ＣＭを３％Ｏ_２下で２日間培養した。

単培養心筋オルガノイド形成手法
トリカルチャーのオルガノイドをｈｉＰＳＣ－ＣＭによって作成した。Ａｇｇｒｅｗｅｌｌ（商標）８００マイクロウェル培養プレートを用いて、ＳＴＥＭｄｉｆｆ（商標）心筋細胞支持培地（ＳＴＥＭＣＥＬＬＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中で単培養心筋オルガノイドを作製した。２ｍｌの細胞懸濁液で約９００，０００ウェルを各ウェルにピペッティングした。２日間の培養後、培地をＳＴＥＭｄｉｆｆ（商標）心筋細胞維持培地に切り替え、長期培養を行った。

収縮力測定
単培養した心臓オルガノイドを１つずつ９６ウェルプレートに移し、ＬＮＡ－１ａ、及びＬＮＡ－１５ｂ、又はＬＮＡ－ＮＣのいずれかで治療した。低酸素チャンバーを用いて低酸素状態を作り出し、１％のＯ_２で３日間培養した後、ＩｏｎＯｐｔｉｘシステムで収縮力を解析した。単位／画素は、マイクロメータを用いてシステムを校正することで決定した。

免疫蛍光染色
ＮＲＣを４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）／ＰＢＳで固定し、細胞を透過処理し、サルコメアα－アクチニン（ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ）、オーロラＢ（Ａｂｃａｍ）、又はＫｉ６７（Ａｂｃａｍ）に対する一次抗体を２％（ｖ／ｖ）ＨＳ／ＰＢＳで希釈したもので、４℃で一晩インキュベートした。５分間ＰＢＳで３回洗浄後、細胞を４’，６－ジアミノ－２－フェニルインドール（ＤＡＰＩ；ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５５５抗マウス（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）及びＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８抗ウサギ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）二次抗体と室温にて１時間インキュベートした。ディッシュをＰｒｏＬｏｎｇ褪色防止剤（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を滴下し、スライドグラス（ＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に取り付けた。蛍光画像はＳＰ５共焦点顕微鏡（Ｌｅｉｃａ）を用い、４０倍の倍率で取得した。

統計解析
データは平均値で表し、エラーバーは平均値の標準誤差（ＳＥＭ）を示す。両側の対応のないスチューデントのｔ検定（Ｅｘｃｅｌ）又は一元配置分散分析に続いてＤｕｎｎｅｔｔの多重比較後検定（単一対照との多重比較）又はＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉ補正（異なる群間の多重比較）のいずれかを、それぞれの図の凡例に示されるとおり使用した。ｎ．ｓ．＝有意ではない；^＊ｐ＜０．０５；^＊＊ｐ＜０．０１。

Claims

心臓病の治療又は予防における使用のための核酸薬剤の組み合わせであって、前記核酸薬剤の各々は、標的マイクロＲＮＡを標的とし、かつそれを特異的に阻害及び／又は分解することができ、それによって前記核酸薬剤の組み合わせは、細胞内のマイクロＲＮＡの組み合わせを阻害及び／又は分解することができ、前記マイクロＲＮＡの組み合わせは、
ｃ．ｍｉＲ－１ａ、及び
ｄ．ｍｉＲ－１５ｂ、又は
ｍｉＲ－１５ｂ及びｍｉＲ－２７ｂ、
である、前記核酸剤の組み合わせ。
前記マイクロＲＮＡの組み合わせは、ｍｉＲ－１ａ及びｍｉＲ－１５ｂを含む、請求項１に記載の心臓病の治療又は予防における使用のための核酸剤の組み合わせ。
前記各核酸剤は、ヌクレオチドのハイブリダイズ配列を含むか、又はそれから本質的になり、前記ヌクレオチドのハイブリダイズ配列は、標的マイクロＲＮＡとハイブリッドを形成することができる、請求項１又は２に記載の心臓病の治療又は予防における使用のための核酸剤の組み合わせ。
前記各核酸剤は、配列番号００１～００４の配列から選択される配列を含むか、又はそれから本質的になる、請求項１～３のいずれか一項に記載の心臓病の治療又は予防における使用のための核酸剤の組み合わせ。
前記核酸剤のうちの１つは、
１つ又は複数のロック核酸（ＬＮＡ）部分及び／又はペプチド核酸（ＰＮＡ）部分、
を含むか、又はそれから本質的になり、
特に、前記核酸剤のすべては、
１つ又は複数のロック核酸（ＬＮＡ）部分及び／又はペプチド核酸（ＰＮＡ）部分、
を含むか、又はそれから本質的になり、
特に、前記核酸剤は、ロック核酸（ＬＮＡ）部分から本質的になる、
請求項１～４のいずれか一項に記載の心臓病の治療又は予防における使用のための核酸剤の組み合わせ。
前記核酸剤のうちの１つは、
１つ又は複数のチオリン酸結合を含み、
特に、前記核酸剤のすべては、
１つ又は複数のチオリン酸結合を含む、
請求項１～５のいずれか一項に記載の心臓病の治療又は予防における使用のための核酸剤の組み合わせ。
前記核酸剤のうちの１つは、チオリン酸結合により隣接物に接続されたＬＮＡ部分を含み、
特に、前記核酸剤のうちの１つは、前記核酸剤のいずれかの末端でチオリン酸結合により接続された２、３又は４個のＬＮＡ部分を含む、
請求項５又は６に記載の心臓病の治療又は予防における使用のための核酸剤の組み合わせ。
前記核酸剤のうちの１つは、
ヒト心筋細胞において作動可能なプロモーターの制御下でヌクレオチドのハイブリダイズ配列をコードする配列を含む外来性（導入遺伝子）発現コンストラクトにより細胞内で発現し、
特に、前記核酸剤のすべては、
ヒト心筋細胞において作動可能なプロモーターの制御下でヌクレオチドのハイブリダイズ配列をコードする配列を含む外来性（導入遺伝子）発現コンストラクトにより細胞内で発現する、
請求項１～７のいずれか一項に記載の心臓病の治療又は予防における使用のための核酸剤の組み合わせ。
ヒト心筋細胞において作動可能なプロモーターの制御下で、核酸剤の組み合わせをコードする、心臓病の治療又は予防における使用のための、発現コンストラクト、又は複数の発現コンストラクトであって、前記核酸剤の各々は、標的マイクロＲＮＡを標的とし、かつそれを特異的に阻害及び／又は分解することができ、それによってマイクロＲＮＡの組み合わせを阻害及び／又は分解することができ、前記マイクロＲＮＡの組み合わせは、
ｃ．ｍｉＲ－１ａ、及び
ｄ．ｍｉＲ－１５ｂ、又は
ｍｉＲ－１５ｂ及びｍｉＲ－２７ｂ、
を含み、特に、前記マイクロＲＮＡの組み合わせは、ｍｉＲ－１ａ及びｍｉＲ－１５ｂを含む、前記発現コンストラクト、又は前記複数の発現コンストラクト。
前記発現コンストラクトの各々及びすべては、単一の核酸分子内に含まれる、請求項９に記載の心臓病の治療又は予防における使用のための複数の発現コンストラクト。
前記核酸剤又は前記発現コンストラクトは、ナノ粒子に結合しているか、又はウイルス及びリポソームから選択される粒子構造体によってカプセル化されている、請求項１～１０のいずれか一項に記載の心臓病の治療又は予防における使用のための、核酸剤の組み合わせ、又は発現コンストラクト。
前記ナノ粒子、又は前記粒子構造体は、心筋細胞への前記ナノ粒子又は前記粒子構造体の送達又は侵入を促進するリガンドを含む、請求項１１に記載の心臓病の治療又は予防における使用のための、核酸剤の組み合わせ、又は発現コンストラクト。
前記プロモーターは、前記核酸剤の心臓特異的発現を可能にし、特に前記プロモーターは、心臓組織特異的ＲＮＡポリメラーゼ２プロモーターであり、特にミオシン軽鎖２ｖ（ＭＬＣ２ｖ）プロモーター、心臓トロポニンＴ（ｃＴｎＴ）プロモーター、ミオシン重鎖α（ＭＨＣａ）プロモーター、及びタイチン（Ｔｔｎ）プロモーターから選択されるプロモーターである、請求項９～１２のいずれか一項に記載の心臓病の治療又は予防における使用のための、発現コンストラクト、又は複数の発現コンストラクト。
前記心臓病は、心筋細胞の損失によって特徴付けられ、特に前記心臓病は、心筋細胞の損失によって特徴付けられる心不全であり、より特に前記心不全は、心筋の梗塞、狭窄、先天性疾患、炎症及び／又は敗血症の結果である、請求項１～１３のいずれか一項に記載の心臓病の治療又は予防における使用のための、核酸剤の組み合わせ、又は複数の発現コンストラクト。
前記心臓病は、心筋細胞の低酸素状態（低酸素症）によって特徴付けられる、請求項１～１４のいずれか一項に記載の心臓病の治療又は予防における使用のための、核酸剤の組み合わせ、又は複数の発現コンストラクト。
請求項１～１５のいずれか一項に記載の前記核酸剤の組み合わせ、又は前記複数の発現コンストラクトを含む、心臓病の治療又は予防における使用のための医薬組成物。
前記医薬組成物は、心臓へ投与される、請求項１６に記載の心臓病の治療又は予防における使用のための医薬組成物。