JP2023538495A - 心不全治療のための転写因子のコンビナトリアル阻害 - Google Patents

Abstract

本発明は、心不全の治療のための転写因子の組み合わせを標的とする阻害性核酸剤の組み合わせに関する。阻害される転写因子の組み合わせは、ＲＡＲａ、ＴＣＦ７Ｌ２、Ｅ２Ｆ６及びＬＥＦ１、又はＲＡＲａ、ＴＣＦ７Ｌ２、Ｅ２Ｆ７及びＮＦＹｂから選択される群のうちの１つを含む。これらの転写因子のコンビナトリアル阻害（ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ）は、心筋細胞の増殖を増大させることが示されている。【選択図】なし

Description

本発明は、心不全の治療のための転写因子の組み合わせを対象とする（標的とする）阻害性核酸剤の組み合わせに関するものである。阻害する転写因子の組み合わせは、ＲＡＲａ、ＴＣＦ７Ｌ２、Ｅ２Ｆ６及びＬＥＦ１、又はＲＡＲａ、ＴＣＦ７Ｌ２、Ｅ２Ｆ７及びＮＦＹｂから選択される群のうちの１つを含む。これらの転写因子のコンビナトリアル阻害（ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ）により、心筋細胞の増殖が増大することが示されている。

心血管疾患は現在、世界の主要な死因となっている。特に心不全は、世界中で６，４００万人が罹患しており、心血管疾患の罹患率と死亡率の主な要因となっている。急性心筋梗塞（ＡＭＩ：ａｃｕｔｅ ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ）の間に、大量の心筋細胞死が発生し、残りの心筋細胞は、損傷した組織を回復するための再生能力が非常に限られているため、心臓線維症及び心不全をもたらす。したがって、心臓再生療法は、心不全、虚血再灌流、及び心筋梗塞などの心臓の病状を治癒するための次善の策となり得る。したがって、心不全の新規の治療法を確立するためには、心筋細胞増殖を誘導するメカニズムを理解することが不可欠である。

上述の技術水準に基づいて、本発明の目的は、心不全を治療するための手段及び方法を提供することである。

この目的は、本明細書の独立請求項の主題によって達成される。

図１は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの新生児ラット心筋細胞の増殖について示す。新生児ラット心筋細胞をグルコース（０ｍＭ、２ｍＭ、３ｍＭ、５．５ｍＭ）で２日間処理し、その後心筋細胞増殖を５－エチニル－２’－デオキシウリジン（５－ｅｔｈｙｎｙｌ－２’－ｄｅｏｘｙｕｒｉｄｉｎｅ）（ＥｄＵ）取り込み及びＡｕｒｏｒａ Ｂ染色によって解析した。（Ａ）は心筋細胞のＥｄＵの代表的な免疫蛍光画像である。ＥｄＵは増殖細胞（緑）を標識する；心筋細胞特異的α－アクチニン（赤）及びＤＡＰＩ（青）。（Ｂ）はＥｄＵ^＋心筋細胞の割合の定量化を示す。（Ｃ）は心筋細胞のＡｕｒｏｒａ Ｂの代表的な免疫蛍光画像を示す。Ａｕｒｏｒａ Ｂは増殖細胞（緑）を標識する；心筋細胞特異的α－アクチニン（赤）、ＤＡＰＩ（青）。（Ｄ）はＡｕｒｏｒａ Ｂ^＋心筋細胞の割合の定量を示す。データは平均値±ＳＥＭで示す。^＊Ｐ＜０．０５、^＊＊Ｐ＜０．０１。統計解析は両側スチューデントのｔ検定で行った。 図２はシグナルレポーターアッセイについて示す。新生児ラット心筋細胞に、転写因子応答性ホタルルシフェラーゼレポーター及び構成的に発現するウミシイタケ（Ｒｅｎｉｌｌａ）コンストラクトの混合物をトランスフェクトし、次いで翌日、この細胞をグルコース（０ｍＭ、２ｍＭ、３ｍＭ）で２日間処理した。ルシフェラーゼ活性は、Ｄｕａｌ－Ｇｌｏルシフェラーゼアッセイシステムを用いて評価した。ヒートマップは、レポーター活性によって示されるとおり、１８のシグナル伝達経路がダウンレギュレートされていることを示す。 １８のシグナル伝達経路の中から、本発明者らは以下の実験について３４の転写因子を候補として選択した。 図３は、ＥｄＵスクリーニングによる候補の転写因子の絞り込みについて示す。本発明者らは、心筋細胞増殖を増大させる因子の候補として３４遺伝子を選択し、この選択した転写因子をＯＮ－ＴＡＲＧＥＴｐｌｕｓ ＳＭＡＲＴｐｏｏｌ ｓｉＲＮＡでノックダウンした。新生児ラット心筋細胞に、この３４のｓｉＲＮＡのプールから個々の因子を除いたものをトランスフェクトし、一方で対照（Ａ）として細胞に３４のｓｉＲＮＡを共にトランスフェクトした。３日間トランスフェクション後、ＤＮＡ合成（ＥｄＵ）をＥｄＵ（緑）とα－アクチニン（赤）の二重染色で解析した（Ｂ、Ｃ）。（Ｄ）遺伝子発現量をｑＲＴ－ＰＣＲで解析した。データは平均値±ＳＥＭで示す。^＊Ｐ＜０．０５、^＊＊Ｐ＜０．０１。統計解析は両側スチューデントのｔ検定で行った。 図３は、ＥｄＵスクリーニングによる候補の転写因子の絞り込みについて示す。本発明者らは、心筋細胞増殖を増大させる因子の候補として３４遺伝子を選択し、この選択した転写因子をＯＮ－ＴＡＲＧＥＴｐｌｕｓ ＳＭＡＲＴｐｏｏｌ ｓｉＲＮＡでノックダウンした。新生児ラット心筋細胞に、この３４のｓｉＲＮＡのプールから個々の因子を除いたものをトランスフェクトし、一方で対照（Ａ）として細胞に３４のｓｉＲＮＡを共にトランスフェクトした。３日間トランスフェクション後、ＤＮＡ合成（ＥｄＵ）をＥｄＵ（緑）とα－アクチニン（赤）の二重染色で解析した（Ｂ、Ｃ）。（Ｄ）遺伝子発現量をｑＲＴ－ＰＣＲで解析した。データは平均値±ＳＥＭで示す。^＊Ｐ＜０．０５、^＊＊Ｐ＜０．０１。統計解析は両側スチューデントのｔ検定で行った。 図４は、Ａｕｒｏｒａ Ｂによる候補の転写因子の絞り込みについて示す。ＥｄＵスクリーニングに基づき、発明者らは、ＤＮＡ合成に必要な１２遺伝子を選択した後、細胞質分裂の別の読み出しとしてＡｕｒｏｒａ Ｂを使用した。新生児ラット心筋細胞に、この１２のｓｉＲＮＡのプールから個々の因子を除いたものをトランスフェクトし、一方で対照として細胞に１２のｓｉＲＮＡを共にトランスフェクトした。３日間トランスフェクション後、心筋細胞の増殖をＡｕｒｏｒａ Ｂ（緑）、α－アクチニン（赤）、ＤＡＰＩ（青）の三重染色で解析した（Ａ、Ｂ）。（Ｃ）遺伝子発現量は、ｑＲＴ－ＰＣＲで解析した。データは平均値±ＳＥＭで示す。^＊Ｐ＜０．０５、^＊＊Ｐ＜０．０１。統計解析は両側スチューデントのｔ検定で行った。 図５はｉｎ ｖｉｔｒｏでのラット心筋細胞の細胞増殖について示す。ＥｄＵ及びＡｕｒｏｒａ Ｂのスクリーニングに基づき、発明者らはＤＮＡ合成と細胞質分裂とに必要な６遺伝子を選択した。最適なコンビナトリアル因子を同定するため、すべてのコンビナトリアルｓｉＲＮＡを１日齢（Ａ、Ｂ）及び７日齢（Ｃ、Ｄ）のラット心筋細胞にトランスフェクトし、その後、Ａｕｒｏｒａ Ｂ（緑）、α－アクチニン（赤）及びＤＡＰＩ（青）の三重染色により心筋細胞の増殖を解析した。その結果、本発明者らは、心筋細胞の増殖を増大するのに最も適した２つの組み合わせを選択した。 図５はｉｎ ｖｉｔｒｏでのラット心筋細胞の細胞増殖について示す。ＥｄＵ及びＡｕｒｏｒａ Ｂのスクリーニングに基づき、発明者らはＤＮＡ合成と細胞質分裂とに必要な６遺伝子を選択した。最適なコンビナトリアル因子を同定するため、すべてのコンビナトリアルｓｉＲＮＡを１日齢（Ａ、Ｂ）及び７日齢（Ｃ、Ｄ）のラット心筋細胞にトランスフェクトし、その後、Ａｕｒｏｒａ Ｂ（緑）、α－アクチニン（赤）及びＤＡＰＩ（青）の三重染色により心筋細胞の増殖を解析した。その結果、本発明者らは、心筋細胞の増殖を増大するのに最も適した２つの組み合わせを選択した。 図６はＥ２Ｆ６／ＲＡＲａ／ＴＣＦ７Ｌ２／ＬＥＦ１若しくはＥ２Ｆ７／ＮＦＹｂ／ＲＡＲａ／ＴＣＦ７Ｌ２のノックダウン時のラット心筋細胞の増殖について示す。ラット心筋細胞（Ｐ１）にｓｉＥ２Ｆ６、ｓｉＲＡＲａ、ｓｉＴＣＦ７Ｌ２、及びｓｉＬＥＦ１；ｓｉＥ２Ｆ７、ｓｉＮＦＹｂ、ｓｉＲＡＲａ及びｓｉＴＣＦ７Ｌ２、又は対照のスクランブルｓｉＲＮＡ（ｓｉＳｃｒ）を３日間トランスフェクションし、心筋細胞の増殖をＡｕｒｏｒａ Ｂ（緑）、ａ－アクチニン（赤）及びＤＡＰＩ（青）の三重染色により分析及び定量した（Ａ、Ｂ）。（Ｃ、Ｄ）それぞれの遺伝子発現量をｑＲＴ－ＰＣＲで解析した。 （Ｅ、Ｆ）Ｐ７ラット心筋細胞にｓｉＥ２Ｆ６、ｓｉＲＡＲａ、ｓｉＴＣＦ７Ｌ２及びｓｉＬＥＦ１；ｓｉＥ２Ｆ７、ｓｉＮＦＹｂ、ｓｉＲＡＲａ及びｓｉＴＣＦ７Ｌ２、又は対照のスクランブルｓｉＲＮＡ（ｓｉＳｃｒ）を３日間トランスフェクションし、その後心筋細胞の増殖をＥｄＵ（緑）、α－アクチニン（赤）及びＤＡＰＩ（青）の三重染色により解析及び定量した。（Ｇ、Ｈ）Ｐ７ラット心筋細胞にｓｉＥ２Ｆ６、ｓｉＲＡＲａ、ｓｉＴＣＦ７Ｌ２及びｓｉＬＥＦ１；ｓｉＥ２Ｆ７、ｓｉＮＦＹｂ、ｓｉＲＡＲａ、及びｓｉＴＣＦ７Ｌ２、又は対照のスクランブルｓｉＲＮＡ（ｓｉＳｃｒ）を３日間トランスフェクションし、その後、心筋細胞の増殖をＡｕｒｏｒａ Ｂ（緑）、α－アクチニン（赤）、及びＤＡＰＩ（青）の三重染色により解析及び定量した。データは平均値±ＳＥＭで示す。^＊Ｐ＜０．０５、^＊＊Ｐ＜０．０１。統計解析は両側スチューデントのｔ検定で行った。 図７はＥ２Ｆ６／ＲＡＲａ／ＴＣＦ７Ｌ２／ＬＥＦ１、又はＥ２Ｆ７／ＮＦＹｂ／ＲＡＲａ／ＴＣＦ７Ｌ２のノックダウン時のヒトｉＰＳＣ細胞由来心筋細胞（ｉＰＳＣ－ＣＭ：ｉＰＳＣ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅｓ）増殖について示す。ヒトｉＰＳＣ－ＣＭにｓｉＥ２Ｆ６、ｓｉＲＡＲａ、ｓｉＴＣＦ７Ｌ２及びｓｉＬＥＦ１；ｓｉＥ２Ｆ７、ｓｉＮＦＹｂ、ｓｉＲＡＲａ及びｓｉＴＣＦ７Ｌ２、又は対照のスクランブルｓｉＲＮＡ（ｓｉＳｃｒ）をトランスフェクトし、その後、酸素正常状態（２０％ Ｏ_２）又は心筋梗塞（ＭＩ）のｉｎ ｖｉｔｒｏモデルとして低酸素状態（３％ Ｏ_２）に２日間暴露した。心筋細胞の増殖は、Ａｕｒｏｒａ Ｂ（緑）、α－アクチニン（赤）、及びＤＡＰＩ（青）の三重染色で解析及び定量した（Ａ、Ｂ）。（Ｃ、Ｄ）それぞれの遺伝子発現量をｑＲＴ－ＰＣＲで解析した。データは平均値±ＳＥＭで示す。^＊Ｐ＜０．０５、^＊＊Ｐ＜０．０１。統計解析は両側スチューデントのｔ検定で行った。 図８はＥ２Ｆ６／ＲＡＲａ／ＴＣＦ７Ｌ２／ＬＥＦ１のノックダウン時のマウス心筋細胞の増殖について示す。マウスＨＬ１細胞を、Ｅ２Ｆ６、ＲＡＲＡ、ＴＣＦ７Ｌ２、及びＬＥＦ１を標的とするＧａｐｍｅＲ、又は対照のＧａｐｍｅＲ－ｃｏｎｔｒｏｌのいずれかで処理した後、細胞を酸素正常状態（２０％ Ｏ_２）又は低酸素状態に（３％ Ｏ_２）に２日間曝露した。（Ａ）ＲＮＡの発現量をｑＲＴ－ＰＣＲで解析した。（Ｂ）ＥｄＵ^＋心筋細胞の割合の定量を示す。（Ｃ）Ｋｉ６７^＋心筋細胞の割合の定量を示す。（Ｄ）Ａｕｒｏｒａ Ｂ^＋心筋細胞の割合の定量を示す。データは平均±ＳＥＭで示す。^＊ｐ＜０．０５、^＊＊ｐ＜０．０１。

発明の概要
本発明の第１の態様は、心臓病の治療又は予防における使用のための核酸剤の組み合わせに関するものである。前記核酸剤のそれぞれは、標的タンパク質の発現を特異的に阻害することが可能である。核酸剤の組み合わせは、細胞内の標的タンパク質（転写因子）の組み合わせの発現を阻害することが可能である。
標的タンパク質の組み合わせは、
ａ． ＲＡＲａ、及び
ｂ． ＴＣＦ７Ｌ２、及び
ｃ． Ｅ２Ｆ６及びＬＥＦ１、又は
Ｅ２Ｆ７及びＮＦＹｂ
である。

本発明の第２の態様は、ヒト心筋細胞において作動可能なプロモーターの制御下で、心臓病の治療又は予防における使用のための核酸剤の組み合わせをコードする、発現コンストラクト、又は複数の発現コンストラクトに関するものである。各核酸剤は、標的タンパク質の発現を特異的に阻害することが可能であり、それにより、標的タンパク質（転写因子）の組み合わせの発現を阻害することが可能である。標的タンパク質の組み合わせは、
ａ． ＲＡＲａ、及び
ｂ． ＴＣＦ７Ｌ２、及び
ｃ． Ｅ２Ｆ６及びＬＥＦ１、又は
Ｅ２Ｆ７及びＮＦＹｂ
である。

本発明の第３の態様は、第１の態様による核酸剤の組み合わせ、又は第２の態様による複数の発現コンストラクトを含む、心臓病の治療又は予防における使用のための医薬組成物に関するものである。

別の実施形態では、本発明は、少なくとも１つの本発明の化合物又はその薬学的に許容される塩と、少なくとも１つの薬学的に許容される担体、希釈剤、又は賦形剤とを含む医薬組成物に関するものである。

発明の詳細な説明
用語と定義
本明細書を解釈する目的で、以下の定義が適用され、適切な場合、単数形で使用される用語は複数形も含み、その逆も同様である。以下に記載されているいずれの定義が、参照により本明細書に組み込まれている文書と矛盾する場合は、この記載されている定義が優先されるものとする。

本明細書で使用される用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、及び他の同様の形態、並びにそれらの文法的に同等な用語は、意味において同等であること、及びこれらの単語のいずれか１つに続く１つ又は複数の項目が、係る１つ又は複数の項目を網羅的にリストするものではない、又はリストした１つ又は複数の項目のみに限定するものではないことにおいてオープンエンドとすることを意図している。例えば、成分Ａ、Ｂ及びＣを「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」品目は、成分Ａ、Ｂ及びＣからなる（すなわち、成分Ａ、Ｂ及びＣのみを含有する）こともでき、又は成分Ａ、Ｂ及びＣのみならず、１つ又は複数の他の成分を含むこともできる。そのため、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」及びその同様の形態、並びにその文法的に同等な用語には、「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」又は「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」の実施形態の開示が含まれることが意図及び理解されている。

値の範囲が与えられている場合、文脈上明確に別段の指示がない限り、その範囲の上限と下限の間の下限の単位の１０分の１までの介在値、及びその記載の範囲内のいずれの他の記載値又は介在値のそれぞれは、記載の範囲内で具体的に除外される限界に従って、本開示内に包含されると理解される。記載された範囲が限界値の一方又は両方を含む場合、それらの含まれる限界値の一方又は両方を除いた範囲もまた開示に含まれる。

本明細書において、ある値又はパラメータに関する「約」の言及は、その値又はパラメータそれ自体を対象とする変化形を含む（及び記述する）。例えば、「約Ｘ」に言及する記述は、「Ｘ」の記述を含む。

添付の特許請求の範囲を含み、本明細書で使用されるとおり、単数形の「ａ」、「ｏｒ（又は）」及び「ｔｈｅ」は、文脈によって明らかに指示されない限り、複数の指示対象を含む。

他に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術的及び科学的用語は、当業者（例えば、細胞培養、分子遺伝学、核酸化学、ハイブリダイゼーション技術、及び生化学における当業者）により一般的に理解されるものと同じ意味を有する。分子、遺伝、生化学的手法（一般に、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第４編（２０１２）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．及びＡｕｓｕｂｅｌら，Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（２００２）第５編，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．）及び化学的手法には、標準的な技術を使用する。

本明細書の文脈における「ハイブリッド又はハイブリダイズ配列を形成することができる」という用語は、哺乳類細胞のサイトゾル内に存在する条件下で、標的配列に選択的に結合できる配列に関するものである。このようなハイブリダイズ配列は、標的配列と連続的に逆相補的であってもよいし、又はギャップ、ミスマッチ、又はさらにノンマッチングのヌクレオチドを含んでいてもよい。ハイブリッドを形成可能な配列の最小長は、骨格化学及びその組成に依存し、Ｃ又はＧのヌクレオチドはＡ又はＴ／Ｕのヌクレオチドよりも多く結合エネルギーに寄与する。

本明細書の文脈における「ヌクレオチド」という用語は、核酸又は核酸アナログの構成単位に関するもので、それらのオリゴマーは、塩基対形成に基づいてＲＮＡオリゴマー又はＤＮＡオリゴマーと選択的ハイブリッドを形成することが可能である。この文脈での「ヌクレオチド」という用語は、古典的なリボヌクレオチドの構成単位であるアデノシン、グアノシン、ウリジン（及びリボシルチミン）、シチジン、古典的なデオキシリボヌクレオチドであるデオキシアデノシン、デオキシグアノシン、チミジン、デオキシウリジン、及びデオキシシチジンが含まれる。さらに、ホスホチオエート、２’Ｏ－メチルホスホチオエート、ペプチド核酸（ＰＮＡ；Ｎ－（２－アミノエチル）－グリシン単位をペプチド結合でつなぎ、グリシンのα炭素に核酸塩基が結合したもの）又はロック核酸（ＬＮＡ；２’Ｏ，４’Ｃメチレン架橋ＲＮＡ構成単位）などの核酸のアナログが含まれる。本明細書において、「ハイブリダイズ配列」に言及する場合、係るハイブリダイズ配列は、上記のヌクレオチドのいずれか、又はそれらの混合物から構成することができる。

本明細書の文脈における「ｓｉＲＮＡ（低分子／短鎖干渉ＲＮＡ）」という用語は、ＲＮＡ干渉と呼ばれるプロセスにおいて、ｓｉＲＮＡの配列に相補的又はハイブリダイズする核酸配列を含む遺伝子の発現を干渉すること（言い換えれば、発現を抑制又は阻止すること）ができるＲＮＡ分子に関する。「ｓｉＲＮＡ」という用語は、一本鎖ｓｉＲＮＡと二本鎖ｓｉＲＮＡとの両方を包含することを意味する。ｓｉＲＮＡは通常、１７～２４ヌクレオチド長を特徴とする。二本鎖ｓｉＲＮＡは、より長い二本鎖ＲＮＡ分子（ｄｓＲＮＡ：ｄｏｕｂｌｅ ｓｔｒａｎｄｅｄ ＲＮＡ）から誘導することができる。有力な説によれば、この長い方の二本鎖ＲＮＡは、エンド・リボヌクレアーゼ（Ｄｉｃｅｒと呼ばれる）によって切断され二本鎖ｓｉＲＮＡを形成するとされる。核タンパク質複合体（ＲＩＳＣと呼ばれる）において、二本鎖ｓｉＲＮＡが巻き戻され一本鎖ｓｉＲＮＡが形成される。ＲＮＡ干渉は、相補的な配列を持つｍＲＮＡ分子にｓｉＲＮＡ分子が結合し、ｍＲＮＡの分解をもたらすことで機能することが多い。ＲＮＡ干渉は、細胞の核内にあるプレｍＲＮＡ（未熟な、スプライシングされていないｍＲＮＡ）のイントロン配列にｓｉＲＮＡ分子が結合し、プレｍＲＮＡの分解を引き起こすことによっても可能である。

本明細書の文脈における「ｓｈＲＮＡ（ｓｍａｌｌ ｈａｉｒｐｉｎ ＲＮＡ）」という用語は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ：ＲＮＡ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ）を介して標的遺伝子の発現をサイレンシングするために用いることができるタイトなヘアピンターン持つ人工ＲＮＡ分子に関するものである。

本明細書の文脈における「ｓｇＲＮＡ（ｓｉｎｇｌｅ ｇｕｉｄｅ ＲＮＡ）」という用語は、ＣＲＩＳＰＲ（ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ ｒｅｇｕｌａｒｌｙ ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ ｓｈｏｒｔ ｐａｌｉｎｄｒｏｍ ｒｅｐｅａｔ：クラスター化した規則的な配置の短い回文配列リピート）機構を介して遺伝子発現を配列特異的に抑制することができるＲＮＡ分子に関する。

本明細書の文脈における「ｍｉＲＮＡ（ｍｉｃｒｏＲＮＡ）」という用語は、ＲＮＡサイレンシング及び遺伝子発現の転写後調節において機能する低分子非コードＲＮＡ（約２２ヌクレオチド含有）に関するものである。

本明細書の文脈における「アンチセンスオリゴヌクレオチド」という用語は、ＲＮＡと実質的に相補的で、かつＲＮＡとハイブリダイズすることができる配列を有するオリゴヌクレオチドに関するものである。このようなＲＮＡに対するアンチセンス作用により、ＲＮＡの生物学的作用が調節され、特に阻害又は抑制されることになる。このＲＮＡがｍＲＮＡである場合、得られる遺伝子産物の発現が阻害又は抑制される。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ヌクレオチドアナログ及び／又はそれらの混合物からなることが可能である。当業者は、所与の標的に対する理論的に最適なアンチセンス配列を計算処理するための様々な商業的及び非商業的な供給元を知っている。最適化は、核酸塩基配列と骨格（リボ、デオキシリボ、アナログ）組成との両方の観点から行うことができる。実際の物理的なオリゴヌクレオチドを送達する供給元は多数存在し、これらは一般的には固体合成によって合成される。本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドの例としては、ＤＮＡからできるアンチセンスオリゴマー、骨格にホスホロチオエート修飾結合を有するＤＮＡ、リボヌクレオチドオリゴマー、架橋ヌクレオチド又はロックヌクレオチドを含むＲＮＡ（特に、リボース環が２’－Ｏ原子と４’－Ｃ原子との間のメチレン架橋によって連結されるもの）、骨格にホスホロチオエート修飾結合を有するＲＮＡ、又はオリゴマーとしてのデオキシリボヌクレオチド塩基とリボヌクレオチド塩基との任意の混合物が挙げられる。

特定の実施形態では、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ホスホチオエート、２’Ｏ－メチルホスホチオエート、ペプチド核酸（ＰＮＡ；Ｎ－（２－アミノエチル）－グリシン単位がペプチド結合によって連結され、核酸塩基がグリシンのα炭素に結合しているもの）又はロック核酸（ＬＮＡ；２’Ｏ，４’Ｃメチレン架橋ＲＮＡ構成単位）などの核酸のアナログを含む。アンチセンス配列は、上記の核酸アナログのいずれかで部分的に構成され、残りのヌクレオチドは自然界に存在する「天然」リボヌクレオチドであってもよいし、又は異なるアナログの混合物であってもよいし、又は１種類のアナログで完全に構成されてもよい。

本明細書の文脈における「核酸発現ベクター」という用語は、プラスミド又はウイルスゲノムに関し、プラスミド又はウイルスゲノムは目的の特定の遺伝子を標的細胞に導入（トランスフェクト）（プラスミドの場合）又は形質導入（ウイルスゲノムの場合）するために使用される。目的の遺伝子はプロモーター配列の制御下にあり、プロモーター配列は標的細胞内で作動可能なため、目的の遺伝子は構成的に、あるいは刺激に応答して、あるいは細胞の状態に依存してのいずれかで転写される。特定の実施形態では、ウイルスゲノムはカプシドに封入され、ウイルスベクターとなり、標的細胞に形質導入することができる。

本明細書に開示される配列と類似又は相同（例えば、少なくとも約７０％の配列同一性）の配列もまた、本発明の一部である。核酸レベルにて、配列同一性は約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上とすることができる。あるいは、核酸セグメントが選択的なハイブリダイゼーション条件（例えば、非常に高いストリンジェントなハイブリダイゼーション条件）下で、鎖の相補体にハイブリダイズする場合に実質的な同一性が存在する。核酸は、全細胞、細胞溶解物、又は部分的に精製された若しくは実質的に純粋な形態で存在することができる。

本明細書の文脈において、「配列同一性」及び「配列同一性の割合（パーセンテージ）」という用語は、整列させる２つの配列を位置ごとに比較することで決定される配列の比較結果を表す単一の定量的パラメータを意味する。比較用の配列のアライメント方法は、当技術分野でよく知られている。比較の配列アラインメントは、Ｓｍｉｔｈ及びＷａｔｅｒｍａｎのローカルホモロジーアルゴリズム，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈのグローバルアライメントアルゴリズム,Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）、Ｐｅａｒｓｏｎ及びＬｉｐｍａｎの類似性検索法,Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８５：２４４４（１９８８）、又はこれらのアルゴリズムのコンピュータ化された実装によって実行され、ＣＬＵＳＴＡＬ、ＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ及びＴＦＡＳＴＡを含むがこれらに限定されない。ＢＬＡＳＴ分析を行うためのソフトウェアは、例えば、アメリカ国立生物工学情報センター（ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）を通じて公的に入手可能である。

核酸配列の比較についての一例としては、ＢＬＡＳＴＮアルゴリズムがあり、デフォルト設定を使用する：Ｅｘｐｅｃｔ ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ：１０；Ｗｏｒｄ ｓｉｚｅ：２８；Ｍａｘ ｍａｔｃｈｅｓ ｉｎ ａ ｑｕｅｒｙ ｒａｎｇｅ：０；Ｍａｔｃｈ／Ｍｉｓｍａｔｃｈ Ｓｃｏｒｅｓ：１．－２；Ｇａｐ ｃｏｓｔｓ：Ｌｉｎｅａｒ。他に記載がない限り、本明細書で提供される配列同一性の値は、ＢＬＡＳＴ一連のプログラム（Ａｌｔｓｃｈｕｌら,Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－４１０（１９９０））を用いて、それぞれタンパク質及び核酸の比較のために上記で特定されるデフォルトパラメータを使用して得られた値を指す。

パーセンテージの値の指定なしに同一配列に言及する場合、１００％同一の配列（つまり、同じ配列）を意味する。

本明細書の文脈において、「ハイブリダイズ配列（ｈｙｂｒｉｄｉｚｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」という用語は、ＲＮＡ（リボヌクレオチド）、ＤＮＡ（デオキシリボヌクレオチド）、ホスホチオエートデオキシリボヌクレオチド、２’－Ｏ－メチル修飾ホスホチオエートリボヌクレオチド、ＬＮＡ及び／又はＰＮＡヌクレオチドアナログを含むか、又はそれから本質的になるポリヌクレオチド配列を包含する。

本明細書で使用されるとおり、「医薬組成物」という用語は、少なくとも１つの薬学的に許容される担体を伴う本発明の化合物又はその薬学的に許容される塩を指す。特定の実施形態では、本発明による医薬組成物は、局所、非経口、又は注入投与に適した形態で提供される。

本明細書で使用されるとおり、「薬学的に許容される担体」という用語には、当業者に知られているとおり、任意の溶媒、分散媒質、コーティング、界面活性剤、抗酸化剤、保存剤（例えば、抗菌剤、抗真菌剤）、等張剤、吸収遅延剤、塩、保存剤、薬物、薬物安定剤、結合剤、賦形剤、崩壊剤、潤滑剤、甘味剤、香味剤、染料など、並びにそれらの組み合わせを含む（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ、ＩＳＢＮ ０８５７１１０６２４を参照）。

本明細書で使用されるとおり、任意の疾患又は障害（例えば、がん）を「治療する」又はその「治療」という用語は、一実施形態では、疾患又は障害を改善すること（例えば、疾患又はその臨床症状の少なくとも１つの発生を遅らせること、停止させること、又は低減させること）を指す。別の実施形態では、「治療する」又は「治療」は、患者が識別できない可能性のあるものを含む少なくとも１つの身体的パラメータを緩和すること又は改善することを指す。さらに別の実施形態では、「治療する」又は「治療」は、身体的に（例えば、識別可能な症状の安定化）、生理学的に（例えば、身体的パラメータの安定化）、又はその両方のいずれかで、疾患又は障害を調節することを指す。疾患の治療及び／又は予防を評価する方法は、以下に特に記載しない限り、当該技術分野において一般的に知られているものである。

本明細書の文脈における「ＲＡＲａ」という用語は、レチノイン酸受容体αに関するものである。

ホモ・サピエンスＲＡＲａ：遺伝子ＩＤ：５９１４；ドブネズミ（Ｒａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ）ＲＡＲａ：遺伝子ＩＤ：２４７０５；ハツカネズミ（Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ）ＲＡＲａ：遺伝子ＩＤ：１９４０１。

本明細書の文脈における「ＴＣＦ７Ｌ２」は、転写因子７様２に関するものである。

ホモ・サピエンスＴＣＦ７Ｌ２：遺伝子ＩＤ：６９３４；ドブネズミＴＣＦ７Ｌ２：遺伝子ＩＤ：６７９８６９；ハツカネズミＴＣＦ７Ｌ２：遺伝子ＩＤ：２１４１６。

本明細書の文脈における「Ｅ２Ｆ６」という用語は、Ｅ２Ｆ転写因子６に関するものである。

ホモ・サピエンスＥ２Ｆ６：遺伝子ＩＤ：１８７６；ドブネズミＥ２Ｆ６：遺伝子ＩＤ：３１３９７８；ハツカネズミＥ２Ｆ６：遺伝子ＩＤ：５０４９６。

本明細書の文脈における「ＬＥＦ１」という用語は、リンパ系エンハンサー結合因子１に関するものである。

ホモ・サピエンスＬＥＦ１：遺伝子ＩＤ：５１１７６；ドブネズミＬＥＦ１：遺伝子ＩＤ：１６８４２；ハツカネズミＬＥＦ１：遺伝子ＩＤ：１６１４５２。

本明細書の文脈における「Ｅ２Ｆ７」という用語は、Ｅ２Ｆ転写因子７に関するものである。

ホモ・サピエンスＥ２Ｆ７：遺伝子ＩＤ：１４４４５５；ドブネズミＥ２Ｆ７：遺伝子ＩＤ：５２６７９；ハツカネズミＥ２Ｆ７：遺伝子ＩＤ：３１４８１８。

本明細書の文脈における「ＮＦＹｂ」という用語は、核転写因子Ｙサブユニットβに関するものである。

ホモ・サピエンスＮＦＹｂ：遺伝子ＩＤ：４８０１；ドブネズミＮＦＹｂ：遺伝子ＩＤ：１８０４５；ハツカネズミＮＦＹｂ：遺伝子ＩＤ：２５３３６。

本発明の第１の態様は、心臓病の治療又は予防における使用のための核酸剤の組み合わせに関するものである。前記核酸剤のそれぞれは、標的タンパク質の発現を特異的に阻害することが可能である。核酸剤の組み合わせは、細胞内の標的タンパク質（転写因子）の組み合わせの発現を阻害することが可能である。

標的タンパク質の組み合わせは、
ａ． ＲＡＲａ、及び
ｂ． ＴＣＦ７Ｌ２、及び
ｃ． Ｅ２Ｆ６及びＬＥＦ１、又は
Ｅ２Ｆ７及びＮＦＹｂ
である。

特定の実施形態では、標的タンパク質の組み合わせは、
ａ． ＲＡＲａ、及び
ｂ． ＴＣＦ７Ｌ２、及び
ｃ． Ｅ２Ｆ６、及び
ｄ． ＬＥＦ１
である。

核酸剤の組み合わせは、細胞分裂が停止したＰ７ラットの心筋細胞で試験した（図５）。この状況は、心不全の治療の状態に最も似ており、なぜなら心不全の治療の状態でも心筋細胞の細胞分裂が停止しているからである。本発明者らは、ＲＡＲａ、ＴＣＦ７Ｌ２、Ｅ２Ｆ６、及びＬＥＦ１の組み合わせが、分裂終期の心筋細胞のパーセンテージとして測定される細胞分裂率を最も高く誘導することを見出した（図５）。

特定の実施形態では、各核酸剤はヌクレオチドのハイブリダイズ配列を含み、このヌクレオチドのハイブリダイズ配列は、標的タンパク質をコードするそれぞれのｍＲＮＡとハイブリッドを形成することが可能である。特定の実施形態では、各核酸剤は、ヌクレオチドのハイブリダイズ配列から本質的になり、前記ヌクレオチドのハイブリダイズ配列は、標的タンパク質をコードするそれぞれのｍＲＮＡとハイブリッドを形成することが可能である。

特定の実施形態では、各核酸剤は、独立して、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｓｇＲＮＡ、及びｍｉＲＮＡから選択される。特定の実施形態では、各核酸剤は、ｓｉＲＮＡである。

特定の実施形態では、センス鎖は、ＲＩＳＣとの相互作用を妨げ、かつアンチセンス鎖の取り込みを有利にするように改変されている。特定の実施形態では、アンチセンス鎖のシード領域は、オフターゲット活性を不安定化し、かつ標的特異性を高めるように改変されている。

特定の実施形態では、前記核酸剤の１つ又は２つ、又は各核酸剤は、ヌクレオシドアナログを含むか、又はヌクレオシドアナログからなる。

特定の実施形態では、各核酸剤は、配列番号１６５～１８８の配列から選択される（異なる）配列を含む。特定の実施形態では、各核酸剤は、配列番号１６５～１８８の配列から選択される（異なる）配列から本質的になる。

特定の実施形態では、前記核酸剤のうちの１つは、１つ又は複数のロック核酸（ＬＮＡ）部分及び／又はペプチド核酸（ＰＮＡ）部分を含む。特定の実施形態では、前記核酸剤のうちの１つは、１つ又は複数のロック核酸（ＬＮＡ）部分及び／又はペプチド核酸（ＰＮＡ）部分から本質的になる。

特定の実施形態では、複数又はすべての前記核酸剤は、１つ又は複数のロック核酸（ＬＮＡ）部分及び／又はペプチド核酸（ＰＮＡ）部分を含む。特定の実施形態では、複数又はすべての前記核酸剤は、１つ又は複数のロック核酸（ＬＮＡ）部分及び／又はペプチド核酸（ＰＮＡ）部分から本質的になる。

特定の実施形態では、核酸剤は、ロック核酸（ＬＮＡ）部分から本質的になる。

特定の実施形態では、核酸剤のうちの１つは、隣接する（デオキシ）リボヌクレオシド部分又はリボヌクレオチドアナログ部分を接続する１つ又は複数のチオリン酸結合を含む。特定の実施形態では、複数又はすべての核酸剤は、隣接する（デオキシ）リボヌクレオシド部分又はリボヌクレオチドアナログ部分を接続する１つ又は複数のチオリン酸結合を含む。

特定の実施形態では、前記核酸剤のうちの１つは、チオリン酸結合によって隣接するリボヌクレオシド部分又はリボヌクレオチドアナログ部分に接続されるＬＮＡ部分を含む。特定の実施形態では、前記核酸剤のうちの１つは、その核酸剤のいずれかの末端にチオリン酸結合で接続された２、３又は４個のＬＮＡ部分を含む。

特定の実施形態では、複数又はすべての核酸剤は、チオリン酸結合によって隣接するリボヌクレオシド部分又はリボヌクレオチドアナログ部分に接続されたＬＮＡ部分を含む。特定の実施形態では、複数又はすべての核酸剤は、その核酸剤のいずれかの末端にチオリン酸結合で接続された２、３又は４個のＬＮＡ部分を含む。

特定の実施形態では、前記核酸剤のうちの１つは、ヒト心筋細胞において作動可能なプロモーターの制御下でヌクレオチドのハイブリダイズ配列をコードする配列を含む外来性（導入遺伝子）発現コンストラクトにより細胞内で発現される。

特定の実施形態では、前記複数又はすべての核酸剤は、ヒト心筋細胞において作動可能なプロモーターの制御下でヌクレオチドのハイブリダイズ配列をコードする配列を含む外来性（導入遺伝子）発現コンストラクトにより細胞内で発現される。

本発明の第２の態様は、ヒト心筋細胞において作動可能なプロモーターの制御下で、心臓病の治療又は予防における使用のための核酸剤の組み合わせをコードする、発現コンストラクト、又は複数の発現コンストラクトに関する。各核酸剤は、標的タンパク質の発現を特異的に阻害することが可能であり、それにより、標的タンパク質（転写因子）の組み合わせの発現を阻害することが可能である。標的タンパク質の組み合わせは、
ａ． ＲＡＲａ、及び
ｂ． ＴＣＦ７Ｌ２、及び
ｃ． Ｅ２Ｆ６及びＬＥＦ１、又は
Ｅ２Ｆ７及びＮＦＹｂ
である。

特定の実施形態では、標的タンパク質の組み合わせは、
ａ． ＲＡＲａ、及び
ｂ． ＴＣＦ７Ｌ２、及び
ｃ． Ｅ２Ｆ６、及び
ｄ． ＬＥＦ１
である。

特定の実施形態では、前記発現コンストラクトの各々及びすべては、単一の核酸分子内に含まれる。

特定の実施形態では、すべての発現コンストラクトを含む単一の核酸分子は、本発明の核酸剤の組み合わせについてそれぞれ１つずつの、複数のオープンリーディングフレームを有する多シストロン性コンストラクトである。

特定の実施形態では、前記核酸剤又は前記発現コンストラクトは、ナノ粒子に結合しているか、又はウイルス及びリポソームから選択される粒子構造体によってカプセル化されている。

リポソームは、少なくとも１つの脂質二重層を持つ球状の小胞である。リポソームは、生体膜を破壊する（超音波処理など）ことにより調製することができる。リポソームの主な種類には、多層膜小胞（ＭＬＶ（ｍｕｌｔｉｌａｍｅｌｌａｒ ｖｅｓｉｃｌｅ）、複数のラメラ相脂質二重層を含む）、小型単層リポソーム小胞（ＳＵＶ（ｓｍａｌｌ ｕｎｉｌａｍｅｌｌａｒ ｌｉｐｏｓｏｍｅ ｖｅｓｉｃｌｅ）、１層の脂質二重層を含む）、大型単層小胞（ＬＵＶ（ｌａｒｇｅ ｕｎｉｌａｍｅｌｌａｒ ｖｅｓｉｃｌｅ））、及び渦巻状小胞がある。

ナノ粒子は、直径１～１００ナノメートル（ｎｍ）の間の粒子状物質である。特定の実施形態では、ナノ粒子は、銀、金、ヒドロキシアパタイト、クレイ、二酸化チタン、二酸化ケイ素、二酸化ジルコニウム、炭素、ダイヤモンド、酸化アルミニウム、及び三フッ化イッテルビウム（ｙｔｔｅｒｂｉｕｍ ｔｒｉｆｌｕｏｒｉｄｅ）から選択される材料から構成されている。

特定の実施形態では、ウイルスは、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、及びアデノ随伴ウイルス、又は前述のもののハイブリッドから選択される。特定の実施形態では、ウイルスは、心筋細胞を選択的に形質導入する。

特定の実施形態では、ナノ粒子、又は粒子構造体は、心筋細胞へのナノ粒子又は粒子構造体の送達又は進入を促進するリガンドを含む。特定の実施形態では、リガンドは、抗ＣＤ７１ Ｆａｂ断片及び抗ｃＴｎＩ Ｆａｂ断片から選択される。これらのリガンドは、標的送達を行うために、心筋細胞に特異的な細胞表面受容体を標的することによって機能する。

特定の実施形態では、プロモーターは、前記核酸剤の心臓特異的な発現を可能にする。特定の実施形態では、プロモーターは、心臓組織特異的ＲＮＡポリメラーゼ２プロモーターである。特定の実施形態では、プロモーターは、ミオシン軽鎖２ｖ（Ｍｙｏｓｉｎ Ｌｉｇｈｔ Ｃｈａｉｎ ２ｖ）（ＭＬＣ２ｖ）プロモーター、心臓トロポニンＴ（ｃａｒｄｉａｃ Ｔｒｏｐｏｎｉｎ Ｔ）（ｃＴｎＴ）プロモーター、ミオシン重鎖α（Ｍｙｏｓｉｎ Ｈｅａｖｙ Ｃｈａｉｎ ａｌｐｈａ）（ＭＨＣａ）プロモーター、及びタイチン（Ｔｉｔｉｎ）（Ｔｔｎ）プロモーターから選択される。

特定の実施形態では、心臓病は、心筋細胞の損失によって特徴付けられる。特定の実施形態では、心臓病は、心筋細胞の損失によって特徴付けられる心不全である。特定の実施形態では、心不全は、心筋の梗塞、狭窄、先天性疾患、炎症及び／又は敗血症の結果である。

特定の実施形態では、心臓病は、心筋細胞の低酸素状態（低酸素症）によって特徴付けられる。

心不全（ＨＦ：Ｈｅａｒｔ ｆａｉｌｕｒｅ）は、心臓が身体の必要量を満たす血流を維持するのに十分なポンプ機能を果たせない場合に発生し、治療しなければ死に至る。心不全（ＨＦ）は、冠動脈疾患、虚血性心疾患、大動脈弁狭窄症、高血圧症、及び代謝性疾患などの症状における疾患進行の結末にある。心不全は、心筋細胞の損失によって引き起こされ得る。心筋細胞は、酸素の供給不足（低酸素症（状態））により失われることが多い。本発明の核酸剤の組み合わせを使用することで、残った心筋細胞が分裂し、失われた心筋細胞を置き換えることがもたらされる。

本発明の第３の態様は、第１の態様による核酸剤の組み合わせ、又は第２の態様による複数の発現コンストラクトを含む、心臓病の治療又は予防における使用のための医薬組成物に関するものである。

特定の実施形態では、本医薬組成物は、心臓に投与される。

医療、剤形、及び塩類
同様に、本発明の範囲内には、上記の核酸配列を患者に投与することを含む、それを必要とする患者の心臓病を治療すること、又はその方法が含まれる。

同様に、本発明の上記いずれかの態様又は実施形態によるアンチセンス分子を含む、心臓病の予防又は治療のための剤形が提供される。

当業者は、いずれの具体的に言及された薬物が、該薬物の薬学的に許容される塩として存在し得ることを認識している。薬学的に許容される塩には、イオン化された薬物及び逆荷電の対イオンが含まれる。薬学的に許容されるアニオン性塩形態の非限定的な例としては、酢酸塩、安息香酸塩、ベシル酸塩、酒石酸水素塩（ｂｉｔａｔｒａｔｅ）、臭化物、炭酸塩、塩化物、クエン酸塩、エデト酸塩、エジシル酸塩、エンボン酸塩、エストール酸塩、フマル酸塩、グルセプト酸塩、グルコン酸塩、臭化水素酸塩、塩酸塩、ヨウ化物、乳酸塩、ラクトビオン酸塩、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、マンデル酸塩、メシル酸塩、臭化メチル、硫酸メチル、ムチン酸塩、ナプシル酸塩、硝酸塩、パモ酸塩、リン酸塩、二リン酸塩、サリチル酸塩、ジサリチル酸塩、ステアリン酸塩、コハク酸塩、硫酸塩、酒石酸塩、トシル酸塩、トリエチオジド、及び吉草酸塩が挙げられる。薬学的に許容されるカチオン塩形態の非限定的な例としては、アルミニウム、ベンザチン、カルシウム、エチレンジアミン、リジン、マグネシウム、メグルミン、カリウム、プロカイン、ナトリウム、トロメタミン、及び亜鉛が挙げられる。

剤形は、鼻腔、口腔、直腸、経皮、若しくは経口投与などの経腸投与用、又は吸入剤若しくは坐剤とすることができる。あるいは、皮下、静脈内、肝内、若しくは筋肉内の注入形態などの非経口投与が用いられてもよい。任意に、薬学的に許容される担体及び／又は賦形剤が存在してもよい。

局所投与もまた、本発明の有利な使用の範囲内である。当業者は、以下の内容によって例示されるとおり局所製剤を提供するための可能な広い範囲の処方について理解している：Ｂｅｎｓｏｎ及びＷａｔｋｉｎｓｏｎ（編），Ｔｏｐｉｃａｌ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ（第１編，Ｗｉｌｅｙ ２０１１，ＩＳＢＮ－１３：９７８－０４７０４５０２９１）；及びＧｕｙ及びＨａｎｄｃｒａｆｔ：Ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ：Ｒｅｖｉｓｅｄ ａｎｄ Ｅｘｐａｎｄｅｄ（第２編，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ ２００２，ＩＳＢＮ－１３：９７８－０８２４７０８６１０）；Ｏｓｂｏｒｎｅ及びＡｍａｎｎ（編）：Ｔｏｐｉｃａｌ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ（第１編，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ １９８９；ＩＳＢＮ－１３：９７８－０８２４７８１８３５）。

医薬組成物及び投与
本発明の別の態様は、本発明の化合物、又はその薬学的に許容される塩、及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物に関する。さらなる実施形態では、該組成物は、本明細書に記載されるものなどの少なくとも２つの薬学的に許容される担体を含む。

本発明の特定の実施形態では、本発明の化合物は、典型的には、薬物の容易に制御可能な投与量を提供し、かつ患者に簡潔かつ容易に取り扱い可能な製品を付与するような薬学的剤形に製剤化される。

本発明の化合物の局所的使用に関する本発明の実施形態では、医薬組成物は、水溶液、懸濁液、軟膏、クリーム、ゲル又は噴霧可能な製剤、例えばエアゾール等による送達用のものなど、局所投与に適した方法で製剤化され、活性成分を当業者に知られている１つ又は複数の可溶化剤、安定剤、等張化増強剤、緩衝液及び防腐剤と共に含んでいる。

医薬組成物は、経口投与、非経口投与、又は直腸投与用に製剤化することができる。さらに、本発明の医薬組成物は、固体形態（限定されないが、カプセル、錠剤、丸薬、顆粒、粉末又は坐剤を含む）、又は液体形態（限定されないが、溶液、懸濁液、又は乳濁液を含む）において構成することができる。

本発明の化合物の投与レジメンは、特定の薬剤の薬力学的特性及びその投与様式及び投与経路などの既知の要因：レシピエントの種、年齢、性別、健康状態、病状、及び体重；症状の性質と程度；同時治療の種類；治療の頻度；投与経路、患者の腎機能及び肝機能、並びに所望の効果、に応じて変化するであろう。特定の実施形態では、本発明の化合物は、１日１回の用量で投与されてもよいし、又は１日の総用量が、１日２回、３回、又は４回に分割した用量で投与されてもよい。

特定の実施形態では、本発明の医薬組成物又は組み合わせは、約５０～７０ｋｇの対象に対して約１～１０００ｍｇの活性成分（複数可）の単位用量であり得る。化合物、医薬組成物、又はそれらの組み合わせの治療上有効な投与量は、対象の種、体重、年齢及び個人の症状、治療される障害又は疾患又はその重篤度に依存する。通常の技術を有する医師、臨床医、又は獣医師であれば、障害又は疾患の予防、治療、又は進行抑制に必要な各有効成分の有効量を容易に決定することができる。

本発明の医薬組成物は、滅菌などの従来の医薬操作にかけることができ、及び／又は従来の不活性な希釈剤、潤滑剤、又は緩衝剤、並びに保存剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤及び緩衝剤などのアジュバントを含有することができる。これらは、標準的なプロセス、例えば、従来の混合、造粒、溶解、又は凍結乾燥プロセスによって製造することができる。医薬組成物を調製するための多くのそのような手順及び方法は、当技術分野で知られており、例えば、Ｌ．Ｌａｃｈｍａｎら,Ｔｈｅ Ｔｈｅｏｒｙ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｐｈａｒｍａｃｙ，第４編，２０１３（ＩＳＢＮ ８１２３９２２８９２）を参照されたい。

本発明は、以下の実施例及び図によってさらに説明され、そこからさらなる実施形態及び利点を引き出すことができる。これらの実施例は、本発明を説明するためのものであり、その範囲を限定するものではない。

実施例１：ｉｎ ｖｉｔｒｏでの新生児ラット心筋細胞の増殖
心筋細胞の増殖を制御する転写因子（ＴＦ：ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ）を同定するため、本発明者らは最初に新生児ラット心筋細胞をグルコース（Ｇｌｃ）濃度を変化させたもので培養し（図１Ａ～１Ｄ）、心筋細胞増殖の誘導におけるＧｌｃレベルの変化の効果を測定した。その際、本発明者らは、Ｇｌｃ濃度が０ｍＭと２ｍＭ以上とでは、顕著な差があることを観察した（図１Ａ～１Ｄ）。本発明者らは、０ｍＭ Ｇｌｃと２ｍＭ Ｇｌｃ（及びそれ以上）との間のＴＦ活性の差が、心筋細胞の増殖を誘導する上で重要であると証明できるであろうと考えた。シグナル転写因子レポーターアッセイ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、本発明者らは、０ｍＭ Ｇｌｃと２ｍＭ及び３ｍＭ Ｇｌｃとの間で別個に活性化される多数のＴＦ経路を同定した（図２）。

実施例２：心筋細胞の増殖を促進するＴＦ阻害のスクリーニング
それぞれのＴＦ経路は、多数の個々のＴＦ及びＴＦアイソフォームを包含している。心筋細胞に関連かつ活性な特異的ＴＦを同定するために、本発明者らは、同定したＴＦ経路内に含まれる個々のＴＦを、公的データベース及びリポジトリ（ＮＣＢＩ ＧＥＯ、ＵＣＳＣ Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｒｏｗｓｅｒなどを含む）のゲノムワイドなＲＮＡ配列及び単一細胞ＲＮＡ配列のデータセットと相互参照した。そのようにして本発明者らは、図３Ａ及び図３Ｂに示すとおり心臓関連ＴＦを同定した。ラット心筋細胞におけるこれらのＴＦをノックダウンするために、ＯＮ－ＴＡＲＧＥＴ ＳＭＡＲＴプール ｓｉＲＮＡをこの調査に使用した。

これまでの研究では、特異的ＴＦによるダウンレギュレーション又はアップレギュレーションを介して心筋細胞の細胞周期の再突入を誘導することが試みられてきた。しかしながら、このようなアプローチでは、心筋細胞の増殖に穏やかな変化しかもたらさないことがほとんどであった。これは、心筋細胞が細胞質分裂と娘細胞の形成とを完了するために（主に心筋細胞の有糸分裂後状態及び末期分化状態に関わる）多くの物理的、形態的、及び構造的な障壁を乗り越える必要があることに大きく起因する。これらの障壁を克服するためには、多くの異なるシグナル伝達経路の協調的かつ共同的な作用が必要であることから、本発明者らは、多能性誘導ＴＦの同定にＹａｍａｎａｋａらが採用したアプローチを採用した（Ｔａｋａｈａｓｈｉら，Ｃｅｌｌ，ｖｏｌ．１３１（５），Ｐ８６１－８７２，２００７）。Ｔａｋａｈａｓｈｉらは、成体細胞の多能性誘導には、複数のシグナル伝達経路のコンビナトリアルかつ協調的な作用が同様に必要であることから、コンビナトリアルＴＦの機能の同定のためのスクリーニング方法を確立した。

本発明者らは、同様の戦略で、３４のＴＦ候補のうちどのＴＦが心筋細胞の増殖に重要であるかを同定した。新生児ラット心筋細胞（ｎｅｏｎａｔａｌ ｒａｔ ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅ）（ＮＲＣ、Ｐ１）に、対照として、それぞれのＴＦを標的とする３４のｓｉＲＮＡをすべて共にトランスフェクトし、３４のｓｉＲＮＡのプールから１つずつのｓｉＲＮＡを引き出した場合の心筋細胞の増殖をＥｄＵ（５－エチニル－２’－デオキシウリジン）取り込み法により調査した（図３Ａ、３Ｂ、及び３Ｃ）。ＥｄＵの初期評価はトランスフェクション後３日以内に行い、ラット心筋細胞はサルコメアα－アクチニンで標識した。ＬＥＦ１、ＴＣＦ７Ｌ２、ＲＡＲｂ、ＲＡＲａ、Ｍｙｃ、ＩＲＦ１、Ｇｌｉ１、ＨＳＦ１、ＮＦＹＢ、Ｅ２Ｆ７、Ｅ２Ｆ６、又はＥ２Ｆ５を標的とする個々のｓｉＲＮＡを除去すると、図３Ｂ及び３Ｃに示すとおり、Ｓ期の心筋細胞数の減少がもたらされた。ＲＮＡの発現量を定量的リアルタイムＰＣＲにより検出した（図３Ｄ）。これらの結果は、ＬＥＦ１、ＴＣＦ７Ｌ２、ＲＡＲｂ、ＲＡＲａ、Ｍｙｃ、ＩＲＦ１、Ｇｌｉ１、ＨＳＦ１、ＮＦＹＢ、Ｅ２Ｆ７、Ｅ２Ｆ６、及びＥ２Ｆ５がラット心筋細胞におけるＤＮＡ合成に重要な役割を担っていることを示している。

１２種のＴＦのうちどのＴＦが心筋細胞の細胞質分裂に重要であるかを調べるために、本発明者らはＡｕｒｏｒａ Ｂをマーカーとして使用した。単離した新生児ラット心筋細胞（ＮＲＣ）に、対照としてそれぞれのＴＦを標的とする１２種のｓｉＲＮＡをすべて一緒にトランスフェクトし、１２種のｓｉＲＮＡのプールからそれぞれｓｉＲＮＡを抜いた際の心筋細胞の増殖をＡｕｒｏｒａ Ｂを用いて調査した（図４Ａ及び図４Ｂ）。図４Ａ及び図４Ｂに示すとおり、ＬＥＦ１、ＴＣＦ７Ｌ２、ＲＡＲａ、ＮＦＹＢ、Ｅ２Ｆ７、Ｅ２Ｆ６を標的とする個々のｓｉＲＮＡを除去した結果、心筋細胞の細胞質分裂の数が減少した。ＲＮＡの発現量を定量的リアルタイムＰＣＲにより検出した（図４Ｃ）。これらの結果は、ＬＥＦ１、ＴＣＦ７Ｌ２、ＲＡＲａ、ＮＦＹＢ、Ｅ２Ｆ７、及びＥ２Ｆ６がラット心筋細胞の細胞質分裂に重要な役割を担っていることを示している。

実施例３：Ｅ２Ｆ６／ＲＡＲａ／ＴＣＦ７Ｌ２／ＬＥＦ１、又はＥ２Ｆ７／ＮＦＹｂ／ＲＡＲａ／ＴＣＦ７Ｌ２の組み合わせのノックダウンがラット心筋細胞における心筋細胞増殖を誘導する。
どの組み合わせが細胞質分裂を増強するか調査するために、ＬＥＦ１、ＴＣＦ７Ｌ２、ＲＡＲａ、ＮＦＹＢ、Ｅ２Ｆ７、及びＥ２Ｆ６を標的とする６種のｓｉＲＮＡの候補の組み合わせに相当する６３通りの条件を１日齢（Ｐ１）と７日齢（Ｐ７）のラット心筋細胞において試験した。心筋細胞増殖を、Ｐ１ラット心筋細胞（図５Ａ及び図５Ｂ）及びＰ７ラット心筋細胞（図５Ｃ及び図５Ｄ）の細胞質分裂中の細胞を標識するために、サルコメアα－アクチニンとの収縮環及び中心体のＡｕｒｏｒａ Ｂ染色による共局在化によって評価した。これらの結果から、３種の組み合わせ（ｓｉＥ２Ｆ６、ｓｉＲＡＲａ、ｓｉＴＣＦ７Ｌ２及びｓｉＬＥＦ１；ｓｉＥ２Ｆ７、ｓｉＮＦＹｂ、ｓｉＲＡＲａ及びｓｉＴＣＦ７Ｌ２；ｓｉＥ２Ｆ６、ｓｉＥ２Ｆ７、ｓｉＲＡＲａ、ｓｉＴＣＦ７Ｌ２及びｓｉＬＥＦ１）は、分裂終期の心筋細胞数が他の組み合わせよりも多くなることが示された。本発明者らは、ｓｉＥ２Ｆ６、ｓｉＲＡＲａ、ｓｉＴＣＦ７Ｌ２及びｓｉＬＥＦ１；並びにｓｉＥ２Ｆ７、ｓｉＮＦＹｂ、ｓｉＲＡＲａ及びｓｉＴＣＦ７Ｌ２の特定の組み合わせを選択した。図６Ａ及び図６Ｂに示すとおり、Ｅ２Ｆ６／ＲＡＲａ／ＴＣＦ７Ｌ２／ＬＥＦ１、又はＥ２Ｆ７／ＮＦＹｂ／ＲＡＲａ／ＴＣＦ７Ｌ２のノックダウンは、分裂終期のＡｕｒｏｒａ Ｂ陽性心筋細胞が有意に増加することによって心筋細胞の増殖を顕著に増加させた。その遺伝子発現量を図６Ｃ及び図６Ｄに示した。さらに、図６Ｅ及び図６Ｆに示すとおり、ｓｉＥ２Ｆ６、ｓｉＲＡＲａ、ｓｉＴＣＦ７Ｌ２及びｓｉＬＥＦ１；又はｓｉＥ２Ｆ７、ｓｉＮＦＹｂ、ｓｉＲＡＲａ及びｓｉＴＣＦ７Ｌ２の組み合わせにより、Ｐ７ラット心筋細胞の分裂終期のＡｕｒｏｒａ Ｂ^＋心筋細胞が増加した。その遺伝子発現量を図６Ｇ及び図６Ｈに示した。

実施例４：Ｅ２Ｆ６／ＲＡＲａ／ＴＣＦ７Ｌ２／ＬＥＦ１又はＥ２Ｆ７／ＮＦＹｂ／ＲＡＲａ／ＴＣＦ７Ｌ２の組み合わせのノックダウンがｈｉＰＳＣ－ＣＭの心筋細胞増殖を誘導する。
ヒト心筋細胞における組み合わせを試験するために、本発明者らは、Ｅ２Ｆ６／ＲＡＲａ／ＴＣＦ７Ｌ２／ＬＥＦ１若しくはＥ２Ｆ７／ＮＦＹｂ／ＲＡＲａ／ＴＣＦ７Ｌ２を標的とするｓｉＲＮＡ、又は対照のスクランブルｓｉＲＮＡ（ｓｉＳｃｒ）を、分裂後４０日齢のヒト人工多能性幹細胞由来心筋細胞（ｈｉＰＳＣ－ＣＭ：ｈｕｍａｎ ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅ）にトランスフェクトし、その後、ｈｉＰＳＣ－ＣＭを正常酸素状態（２０％ Ｏ_２）又は低酸素状態（３％ Ｏ_２）に２日間暴露した。さらに、図７Ａ及び図７Ｂに示すとおり、ｓｉＥ２Ｆ６、ｓｉＲＡＲａ、ｓｉＴＣＦ７Ｌ２及びｓｉＬＥＦ１；又はｓｉＥ２Ｆ７、ｓｉＮＦＹｂ、ｓｉＲＡＲａ及びｓｉＴＣＦ７Ｌ２の組み合わせは、ｈｉＰＳＣ－ＣＭの分裂終期におけるＡｕｒｏｒａ Ｂ^＋心筋細胞を増加させた。その遺伝子発現量をｑＲＴ－ＰＣＲで検出した（図７Ｃ及び図７Ｄ）。これらの結果は、Ｅ２Ｆ６／ＲＡＲａ／ＴＣＦ７Ｌ２／ＬＥＦ１、又はＥ２Ｆ７／ＮＦＹｂ／ＲＡＲａ／ＴＣＦ７Ｌ２の組み合わせのノックダウンがｈｉＰＳＣ－ＣＭの心筋細胞の増殖を誘導することを示している。

実施例５：Ｅ２Ｆ６／ＲＡＲａ／ＴＣＦ７Ｌ２／ＬＥＦ１の組み合わせのノックダウンがＨＬ－１細胞の心筋細胞の増殖を誘導する
次に、本発明者らは、ＨＬ－１細胞において、Ｅ２Ｆ６／ＲＡＲａ／ＴＣＦ７Ｌ２／ＬＥＦ１の組み合わせのノックダウンがマウス心筋細胞の増殖を誘導するか否かを調査した。ＨＬ－１細胞をＥ２Ｆ６／ＲＡＲａ／ＴＣＦ７Ｌ２／ＬＥＦ１を標的とするＧａｐｍｅＲ又は対照のＧａｐｍｅＲ－ｃｏｎｔｒｏｌのいずれかで治療し、次いでこの細胞を酸素正常状態（２０％ Ｏ_２）又は低酸素状態（３％ Ｏ_２）に２日間曝露した。その遺伝子発現量をｑＲＴ－ＰＣＲで検出した（図８Ａ）。図８Ｂ、図８Ｃ、及び図８Ｄに示すとおり、Ｅ２Ｆ６／ＲＡＲａ／ＴＣＦ７Ｌ２／ＬＥＦ１の組み合わせのノックダウンにより、ＥｄＵ^＋、Ｋｉ６７^＋、及びＡｕｒｏｒａ Ｂ^＋心筋細胞の増加によって決定されるように心筋細胞の増殖が増大した。これらのデータは、Ｅ２Ｆ６／ＲＡＲａ／ＴＣＦ７Ｌ２／ＬＥＦ１の組み合わせのノックダウンが、ＨＬ－１細胞のマウス心筋細胞の増殖を増大させることを示すものである。

材料と方法
ｓｉＲＮＡ
すべてのｓｉＲＮＡはＤｈａｒｍａｃｏｎ社から購入した。ＯＮ－ＴＡＲＧＥＴｐｌｕｓ ＳＭＡＲＴプールｓｉＲＮＡの混合物は以下の配列を標的とする：ラットＥ２Ｆ６（３１３９７８）配列 ＵＧＡＣＡＡＡＧＡＡＡＡＣＧＡＡＡＧＡ（配列番号００９）、ＣＣＧＧＡＡＧＡＧＧＣＧＵＧＵＧＵＡＵ（配列番号０１０）、ＧＧＡＵＡＧＧＡＵＣＵＧＡＣＣＵＧＡＡ（配列番号０１１）、ＧＡＣＧＡＧＵＵＧＡＵＵＡＡＡＧＡＵＵ（配列番号０１２）；ラットＥ２Ｆ７（３１４８１８）配列 ＧＣＡＵＣＵＡＵＧＡＣＡＵＣＧＵＡＡＡ（配列番号０１７）、ＡＧＡＡＧＡＧＣＧＡＧＧＣＣＧＣＡＡＡ（配列番号０１８）、ＣＡＡＣＧＧＡＧＡＣＡＵＣＧＧＧＡＧＡ（配列番号０１９）、ＧＧＡＵＡＡＡＵＧＵＡＵＡＵＡＣＧＵＧ（配列番号０２０）；ラットＮＦＹｂ（２５３３３６）配列 ＡＡＵＡＡＧＵＡＧＣＵＧＵＡＡＣＧＵＡ（配列番号０２１）、ＧＣＡＵＧＧＵＡＡＣＵＵＡＧＣＣＧＡＡ（配列番号０２２）、ＡＡＵＣＵＵＧＵＧＵＡＣＡＵＣＧＵＡＡ（配列番号０２３）、ＣＡＵＣＧＧＡＧＧＡＡＧＵＣＡＵＵＡＵ（配列番号０２４）；ラットＲＡＲａ（２４７０５）配列 ＧＣＡＡＧＵＡＣＡＣＵＡＣＧＡＡＣＡＡ（配列番号００１）、ＣＧＡＡＵＣＵＧＣＡＣＧＣＧＧＵＡＣＡ（配列番号００２）、ＡＡＧＡＣＡＡＧＵＣＡＵＣＣＧＧＣＵＡ（配列番号００３）、ＧＣＵＣＡＡＡＣＣＡＣＵＣＣＡＵＣＧＡ（配列番号００４）；ラットＴＣＦ７Ｌ２（６７９８６９）配列 ＧＣＡＣＵＵＡＣＣＡＧＣＵＧＡＣＧＵＡ（配列番号００５）、ＧＧＡＧＡＧＧＧＡＵＵＵＡＧＣＣＧＡＵ（配列番号００６）、ＧＣＡＣＡＣＡＵＣＧＵＵＵＣＧＡＡＣＡ（配列番号００７）、ＣＡＡＡＡＣＡＧＣＵＣＣＵＣＣＧＡＵＵ（配列番号００８）；ラットＬＥＦ１（１６１４５２）配列 ＧＧＧＣＧＡＡＵＧＵＣＧＵＡＧＣＣＧＡ（配列番号０１３）、ＣＧＵＣＡＣＡＣＡＵＣＣＣＧＵＣＡＧＡ（配列番号０１４）、ＣＧＡＡＧＡＧＧＡＧＧＧＣＧＡＣＵＵＡ（配列番号０１５）、ＣＡＡＵＡＵＧＡＡＵＡＧＣＧＡＣＣＣＡ（配列番号０１６）；
ヒトＥ２Ｆ６（１８７６）配列 ＣＡＡＣＧＧＡＣＣＵＡＵＣＧＡＵＧＵＣ（配列番号１６５）、ＵＡＧＣＡＵＡＵＧＵＧＡＣＣＵＡＵＣＡ（配列番号１６６）、ＧＵＡＡＧＣＡＡＣＵＧＡＵＧＧＣＡＵＵ（配列番号１６７）、ＧＡＡＣＡＧＡＵＣＧＵＣＡＵＵＧＣＡＧ（配列番号１６８）；ヒトＥ２Ｆ７（１４４４５５）配列 ＧＣＡＣＡＣＡＵＣＧＵＧＡＧＡＣＧＵＵ（配列番号１６９）、ＵＧＡＣＵＡＡＣＣＵＧＣＣＧＣＵＵＵＧ（配列番号１７０）、ＣＡＡＧＧＡＣＧＡＵＧＣＡＵＵＵＡＣＡ（配列番号１７１）、ＧＧＡＣＵＡＵＵＣＣＧＡＣＣＣＡＵＵＧ（配列番号１７２）；ヒトＮＦＹｂ（４８０１）配列 ＧＡＵＡＵＵＣＵＣＵＵＵＧＣＵＡＵＧＣ（配列番号１７３）、ＧＵＡＡＧＵＧＡＧＵＵＣＡＵＣＡＧＵＵ（配列番号１７４）、ＧＡＡＵＧＵＧＵＣＡＧＧＵＧＣＡＵＡＡ（配列番号１７５）、ＵＡＵＧＣＡＡＧＣＵＣＣＡＵＧＵＵＡ（配列番号１７６）；ヒトＲＡＲａ（５９１４）配列 ＧＣＡＡＡＵＡＣＡＣＵＡＣＧＡＡＣＡＡ（配列番号１７７）、ＣＣＡＡＧＧＡＧＵＣＵＧＵＧＡＧＡＡＡ（配列番号１７８）、ＧＡＧＣＡＧＣＡＧＵＵＣＵＧＡＡＧＡＧ（配列番号１７９）、ＧＡＡＣＡＡＣＧＵＧＵＣＵＣＵＣＵＧＣ（配列番号１８０）；ヒトＴＣＦ７Ｌ２（６９３４）配列 ＣＡＧＣＧＡＡＵＧＵＵＵＣＣＵＡＡＡＵ（配列番号１８１）、ＣＧＡＧＡＣＡＡＡＵＣＣＣＧＧＧＡＡＡ（配列番号１８２）；ＡＣＡＣＵＵＡＣＣＡＧＣＣＧＡＣＧＵＡ（配列番号１８３）、ＧＡＵＧＵＣＧＧＣＵＣＡＣＵＣＣＡＵＡ（配列番号１８４）；ヒトＬＥＦ１（５１１７６）配列 ＧＣＡＡＧＡＧＡＣＡＡＵＵＡＵＧＧＵＡ（配列番号１８５）、ＵＧＣＣＡＡＡＵＡＵＧＡＡＵＡＡＣＧＡ（配列番号１８６）、ＣＧＡＵＵＵＡＧＣＵＧＡＣＡＵＣＡＡＧ（配列番号１８７）、ＣＧＵＣＡＣＡＣＡＵＣＣＣＡＵＣＡＧＡ（配列番号１８８）；Ｄｈａｒｍａｃｏｎ社製のＯＮ－ＴＡＲＧＥＴｐｌｕｓ非標的ｓｉＲＮＡプールは対照として機能する。

新生児ラット初代心筋細胞の単離と維持
Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙの雌の交配ラットはＪａｎｖｉｅｒ社（ル・ジュネスト＝サン＝ティスル、フランス）から入手した。製造元の指示に従って、新生児心臓解離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）及びｇｅｎｔｌｅＭＡＣＳ解離装置を使用して、初代新生児ラット心筋細胞（ＮＲＣ：Ｐｒｉｍａｒｙ ｎｅｏｎａｔａｌ ｒａｔ ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅ）をＰ１及びＰ７の仔ラットから単離した。単離した細胞を、以前の記載のとおり線維芽細胞を除くために加湿雰囲気で３７℃及び５％ ＣＯ_２で１０ｃｍの細胞培養ディッシュ（Ｎｕｎｃ）において１．５時間、プレーティング培地（ＤＭＥＭ 高グルコース、Ｍ１９９ ＥＢＳ（ＢｉｏＣｏｎｃｅｐｔ）、１０％ ウマ血清、５％ ウシ胎児血清、２％ Ｌ－グルタミン及び１％ ペニシリン／ストレプトマイシン）に事前プレーティングした。ＮＲＣを、プレーティング培地中のディッシュ、又はＩ型ウシコラーゲンコーティング（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｂｉｏｍａｔｒｉｘ）プレートにプレーティングした。ＮＲＣの単離の２４時間後、プレーティング培地を維持培地（ＤＭＥＭ 高グルコース、Ｍ１９９ ＥＢＳ、１％ ウマ血清、２％ Ｌ－グルタミン、及び１％ ペニシリン／ストレプトマイシン）に変更した。

ヒトｉＰＳＣ－ＣＭの調製と維持
ヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）はＣｅｌｌｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社（ＣＭＣ－１００－０１０－００１）から購入し、製造元の推奨の方法で培養した。ヒトｉＰＳＣ由来心筋細胞（ｈｉＰＳＣ－ＣＭ）を、ＳＴＥＭｄｉｆｆ（商標）心筋細胞分化キット（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて、製造元のプロトコルに従って再プログラム化した。簡潔には、５ｕＭ ＲＯＣＫ阻害剤（Ｙ－２７６３２、ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を添加したｍＴｅＳＲ（商標）培地を用いて、ヒトｉＰＳ細胞を、マトリゲルをコーティングした１２ウェルプレートに３．５×１０^５細胞／ウェルの細胞密度で２４時間プレーティングした。１日後（－１）、この培地を新しいＴｅＳＲ（商標）培地に交換した。心筋分化を誘導するため、ＴｅＳＲ（商標）培地を０日目に培地Ａ（サプリメントＡを含有するＳＴＥＭｄｉｆｆ（商標）心筋細胞分化基礎培地）、２日目に培地Ｂ（サプリメントＢを含有するＳＴＥＭｄｉｆｆ（商標）心筋細胞分化基礎培地）、４日目及び６日目に培地Ｃ（サプリメントＣを含有するＳＴＥＭｄｉｆｆ（商標）心筋細胞分化基礎培地）に交換した。８日目に培地をＳＴＥＭｄｉｆｆ（商標）心筋細胞維持培地に切り替え、２日ごとに培地を全量交換し、成熟心筋細胞への分化をさらに促進させた。すべての実験は、４０日目のｈｉＰＳＣ－ＣＭで行った。低酸素チャンバーを用いて低酸素状態を作り出し、ｈｉＰＳＣ－ＣＭを３％ Ｏ_２下で２日間培養した。

ＲＮＡの単離、逆転写及びｑＲＴ－ＰＣＲ
試料はＱＩＡｚｏｌ Ｌｙｓｉｓ試薬（ＱＩＡＧＥＮ）で採取し、ｍｉＲＮＡ ｍｉｎｉキット（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて製造元のプロトコルに従って総ｍｉＲＮＡ及び総ｍＲＮＡを単離した。２００ｎｇの総ＲＮＡをＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ逆転写キット（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて、製造元のプロトコルに従ってｃＤＮＡに逆転写した。Ｆａｓｔ ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎマスターミックス（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いてＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社のＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓリアルタイムＰＣＲシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カリフォルニア州、米国）を分析に使用した。遺伝子発現量を、ハウスキーピング遺伝子ＨＰＲＴ１に対して正規化した。以下のｑＲＴ－ＰＣＲ用プライマーを使用した：ラット：Ｅ２Ｆ６：５’ ＧＴＧＧＡＧＡＡＣＣＴＡＣＴＧＣＣＡＴＣＡ ３’（配列番号１３７）、及び５’ ＧＴＧＧＣＡＡＣＣＴＴＧＴＴＴＡＧＧＴＣＡ’（配列番号１３８）；Ｅ２Ｆ７：５’ ＴＣＧＣＴＡＴＣＣＡＡＧＣＴＡＣＣＣＣＴ ３’（配列番号１３９）、及び５’ ＣＣＧＡＣＣＡＴＧＣＣＡＡＣＣＡＴＡＣＴ ３’（配列番号１４０）；ＲＡＲａ：５’ ＴＧＧＣＴＣＡＡＡＣＣＡＣＴＣＣＡＴＣＧ ３’（配列番号１４１）、及び５’ ＣＧＴＣＧＧＡＡＧＡＡＧＣＣＣＴＴＡＣＡ ３’（配列番号１４２）；ＮＦＹｂ：５’ ＣＴＣＴＣＧＧＣＴＴＣＧＡＣＡＧＣＴＡＣ ３’（配列番号１４３）、及び５’ ＴＣＣＡＴＣＴＧＴＡＧＣＡＧＡＣＡＣＧＧ ３’（配列番号１４４）；ＴＣＦ７Ｌ２：５’ ＣＧＣＡＣＴＴＡＣＣＡＧＣＴＧＡＣＧＴＡ ３’（配列番号１４５）、及び５’ ＧＴＡＣＡＣＡＧＧＣＴＧＡＣＣＴＴＧＣＴ ３’（配列番号１４６）；ＬＥＦ１：５’ ＧＧＧＡＣＡＣＴＴＣＣＡＴＧＴＣＣＡＧＧ ３’（配列番号１４７）、及び５’ ＴＴＣＡＣＧＴＧＣＡＴＴＡＧＧＴＣＧＣＴ ３’（配列番号１４８）；ＨＰＲＴ：５’ ＣＣＴＣＣＴＣＣＧＣＣＡＧＣＴＴ ３’（配列番号１４９）、及び５’ ＧＴＣＡＴＡＡＣＣＴＧＧＴＴＣＡＴＣＡＴＣＡＣＴ（配列番号１５０）３’；ヒト：Ｅ２Ｆ６：５’ ＧＧＡＧＣＡＣＣＡＡＣＧＧＡＣＣＴＡＴＣ ３’（配列番号１５１）、及び５’ ＣＡＧＧＧＣＣＴＴＣＴＧＧＡＴＧＡＧＴＧ ３’（配列番号１５２）；Ｅ２Ｆ７：５’ ＣＡＧＧＣＡＧＣＣＣＡＧＡＣＴＡＧＡＴＴ ３’（配列番号１５３）、及び５’ ＴＡＴＴＧＧＡＧＴＣＴＴＣＧＧＧＧＣＣＡ ３’（配列番号１５４）；ＲＡＲａ：５’ ＣＣＴＡＴＧＣＴＧＧＧＴＧＧＡＣＴＣＴＣ ３’ （配列番号１５５）、及び５’ ＡＧＣＡＡＧＧＣＴＴＧＴＡＧＡＴＧＣＧＧ ３’（配列番号１５６）；ＮＦＹｂ：５’ ＡＴＧＣＣＡＴＡＣＣＴＣＡＡＡＣＧＧＧＡ ３’（配列番号１５７）、及び５’ ＣＣＧＴＴＴＣＴＣＴＴＧＡＴＧＧＣＡＣＣＴ ３’（配列番号１５８）；ＴＣＦ７Ｌ２：５’ ＧＧＣＡＡＧＡＴＧＧＡＧＧＧＣＴＣＴＴＴ ３’（配列番号１５９）、及び５’ ＣＧＣＡＧＡＧＴＡＡＴＧＴＧＴＧＣＴＧＣ ３’（配列番号１６０）；ＬＥＦ１：５’ ＴＡＴＣＣＡＧＧＣＴＧＧＴＣＴＧＣＡＡＧ ３’（配列番号１６１）、及び５’ ＧＣＡＧＣＴＧＴＣＡＴＴＣＴＴＧＧＡＣＣ ３’（配列番号１６２）；ＨＰＲＴ５’ ＣＣＴＧＧＣＧＴＣＧＴＧＡＴＴＡＧＴＧＡＴ ３’（配列番号１６３）、及び５’ ＡＧＡＣＧＴＴＣＡＧＴＣＣＴＧＴＣＣＡＴＡＡ ３’（配列番号１６４）。

免疫蛍光染色
ＮＲＣを４％ パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）／ＰＢＳで固定化し、細胞を透過処理し、２％（ｖ／ｖ）ＨＳ／ＰＢＳで希釈したＡｕｒｏｒａ Ｂ（Ａｂｃａｍ）、サルコメアα－アクチニンに対する一次抗体（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）と４℃で一晩インキュベートした。５分間ＰＢＳで３回洗浄した後、細胞を４’，６－ジアミノ－２－フェニルインドール（ＤＡＰＩ；Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ ５５５抗マウス（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）及びＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ ４８８抗ウサギ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）二次抗体と室温にて１時間インキュベートした。ディッシュをＰｒｏＬｏｎｇ褪色防止剤（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を滴下してスライドグラス（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に取り付けた。蛍光画像はＳＰ８共焦点顕微鏡（Ｌｅｉｃａ）を用い、４０倍の倍率で取得した。

統計解析
データは平均値で表し、エラーバーは平均値の標準誤差（ＳＥＭ）を示す。両側の対応のないスチューデントのｔ検定（Ｅｘｃｅｌ）又は一元配置分散分析に続いてＤｕｎｎｅｔｔの多重比較後検定（単一対照との多重比較）又はＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉ補正（異なる群間の多重比較）を、それぞれの図の凡例に示されるとおり使用した。ｎ．ｓ．＝有意ではない；^＊ｐ＜０．０５；^＊＊ｐ＜０．０１。

Claims (19)

1. 心臓病の治療又は予防における使用のための核酸剤の組み合わせであって、
   前記核酸剤の各々が標的タンパク質の発現を特異的に阻害することができ、それによって、前記核酸剤の組み合わせが細胞内の標的タンパク質の組み合わせの発現を阻害することができ、
   前記標的タンパク質の組み合わせは、
   ａ． ＲＡＲａ、及び
   ｂ． ＴＣＦ７Ｌ２、及び
   ｃ． Ｅ２Ｆ６及びＬＥＦ１、又は
   Ｅ２Ｆ７及びＮＦＹｂ
   である、
   前記核酸剤の組み合わせ。
2. 前記標的タンパク質の組み合わせは、
   ａ． ＲＡＲａ、及び
   ｂ． ＴＣＦ７Ｌ２、及び
   ｃ． Ｅ２Ｆ６、及び
   ｄ． ＬＥＦ１
   である、
   請求項１に記載の心臓病の治療又は予防における使用のための核酸剤の組み合わせ。
3. 各核酸剤は、ヌクレオチドのハイブリダイズ配列を含むか、又はそれから本質的になり、前記ヌクレオチドのハイブリダイズ配列は、前記標的タンパク質をコードするｍＲＮＡとハイブリッドを形成することができる、請求項１又は２に記載の心臓病の治療又は予防における使用のための核酸剤の組み合わせ。
4. 各核酸剤は、独立して、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｓｇＲＮＡ、及びｍｉＲＮＡから選択され、特に各核酸剤は、ｓｉＲＮＡである、請求項１～３のいずれか一項に記載の心臓病の治療又は予防における使用のための核酸剤の組み合わせ。
5. 前記核酸剤の１つ若しくは２つ、又は各核酸剤は、ヌクレオシドアナログを含むか、又はそれからなる、請求項１～４のいずれか一項に記載の心臓病の治療又は予防における使用のための核酸剤の組み合わせ。
6. 各核酸剤は、配列番号１６５～１８８の配列から選択される配列を含むか、又はそれから本質的になる、請求項１～５のいずれか一項に記載の心臓病の治療又は予防における使用のための核酸剤の組み合わせ。
7. 前記核酸剤のうちの１つは、
   １つ又は複数のロック核酸（ＬＮＡ）部分及び／又はペプチド核酸（ＰＮＡ）部分、
   を含むか、又はそれから本質的になり、
   特に、前記核酸剤のすべては、
   １つ又は複数のロック核酸（ＬＮＡ）部分及び／又はペプチド核酸（ＰＮＡ）部分、
   を含むか、又はそれから本質的になり、
   特に、前記核酸剤は、ロック核酸（ＬＮＡ）部分から本質的になる、
   請求項１～６のいずれか一項に記載の心臓病の治療又は予防における使用のための核酸剤の組み合わせ。
8. 前記核酸剤のうちの１つは、
   １つ又は複数のチオリン酸結合を含み、
   特に、前記核酸剤のすべては、
   １つ又は複数のチオリン酸結合を含む、
   請求項１～７のいずれか一項に記載の心臓病の治療又は予防における使用のための核酸剤の組み合わせ。
9. 前記核酸剤のうちの１つは、チオリン酸結合により隣接物に接続されたＬＮＡ部分を含み、
   特に、前記核酸剤のうちの１つは、前記核酸剤のいずれかの末端でチオリン酸結合により接続された２、３又は４個のＬＮＡ部分を含む、請求項５又は６に記載の心臓病の治療又は予防における使用のための核酸剤の組み合わせ。
10. 前記核酸剤のうちの１つが、
    ヒト心筋細胞において作動可能なプロモーターの制御下でヌクレオチドのハイブリダイズ配列をコードする配列を含む外来性（導入遺伝子）発現コンストラクトにより細胞内で発現し、
    特に、前記核酸剤のすべてが、
    ヒト心筋細胞において作動可能なプロモーターの制御下でヌクレオチドのハイブリダイズ配列をコードする配列を含む外来性（導入遺伝子）発現コンストラクトにより細胞内で発現する、
    請求項１～９のいずれか一項に記載の心臓病の治療又は予防における使用のための核酸剤の組み合わせ。
11. ヒト心筋細胞において作動可能なプロモーターの制御下で、核酸剤の組み合わせをコードする、心臓病の治療又は予防における使用のための、発現コンストラクト、又は複数の発現コンストラクトであって、
    前記核酸剤の各々は、標的タンパク質の発現を特異的に阻害することができ、それによって標的タンパク質の組み合わせの発現を阻害することができ、
    前記標的タンパク質の組み合わせは、
    ａ． ＲＡＲａ、及び
    ｂ． ＴＣＦ７Ｌ２、及び
    ｃ． Ｅ２Ｆ６及びＬＥＦ１、又は
    Ｅ２Ｆ７及びＮＦＹｂ
    である、
    前記発現コンストラクト、又は前記複数の発現コンストラクト。
12. 前記発現コンストラクトの各々及びすべては、単一の核酸分子内に含まれる、請求項１１に記載の心臓病の治療又は予防における使用のための複数の発現コンストラクト。
13. 前記核酸剤又は前記発現コンストラクトは、ナノ粒子に結合しているか、又はウイルス及びリポソームから選択される粒子構造体によってカプセル化されている、請求項１～１２のいずれか一項に記載の心臓病の治療又は予防における使用のための、核酸剤の組み合わせ、又は複数の発現コンストラクト。
14. 前記ナノ粒子、又は前記粒子構造体は、心筋細胞への前記ナノ粒子又は前記粒子構造体の送達又は侵入を促進するリガンドを含む、請求項１３に記載の心臓病の治療又は予防における使用のための、核酸剤の組み合わせ、又は複数の発現コンストラクト。
15. 前記プロモーターは、心臓組織特異的ＲＮＡポリメラーゼ２プロモーターであり、特にミオシン軽鎖２ｖ（ＭＬＣ２ｖ）プロモーター、心臓トロポニンＴ（ｃＴｎＴ）プロモーター、ミオシン重鎖α（ＭＨＣａ）プロモーター、及びタイチン（Ｔｔｎ）プロモーターから選択されるプロモーターである、請求項１１～１４のいずれか一項に記載の心臓病の治療又は予防における使用のための、発現コンストラクト、又は複数の発現コンストラクト。
16. 前記心臓病は、心筋細胞の損失によって特徴付けられ、特に前記心臓病は、心筋細胞の損失によって特徴付けられる心不全であり、より特に前記心不全は、心筋の梗塞、狭窄、先天性疾患、炎症及び／又は敗血症の結果である、請求項１～１５のいずれか一項に記載の心臓病の治療又は予防における使用のための、核酸剤の組み合わせ、又は複数の発現コンストラクト。
17. 前記心臓病は、心筋細胞の低酸素状態（低酸素症）によって特徴付けられる、請求項１～１６のいずれか一項に記載の心臓病の治療又は予防における使用のための、核酸剤の組み合わせ、又は複数の発現コンストラクト。
18. 請求項１～１７のいずれか一項に記載の、前記核酸剤の組み合わせ、又は前記複数の発現コンストラクトを含む、心臓病の治療又は予防における使用のための医薬組成物。
19. 前記医薬組成物は、心臓へ投与される、請求項１８に記載の心臓病の治療又は予防における使用のための医薬組成物。