WO2011111824A1 - マイクロrnaを用いた心筋細胞の増殖方法 - Google Patents

マイクロrnaを用いた心筋細胞の増殖方法 Download PDF

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佳代子 河島
右一 小清水
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    • C12N2320/11—Applications; Uses in screening processes for the determination of target sites, i.e. of active nucleic acids

Definitions

  • the present invention relates to a method for growing cardiomyocytes using microRNA, a vector for treating heart disease, and a pharmaceutical composition for treating heart disease.
  • cardiomyocytes in adults have lost their cell division ability, they are not replenished once they are necrotic or lost by exposure to various stresses such as ischemia and myocarditis. As a result, the remaining cardiomyocytes try to maintain cardiac function by compensatory hypertrophy, but if that state persists and exceeds the permissible range of myocardial tissue, further myocardial cell fatigue and death occurs. Occurs and eventually exhibits decreased myocardial function, i.e. heart failure.
  • Heart diseases such as heart failure are the second leading cause of death in Japan.
  • the prognosis of patients with heart disease is extremely poor, and the 5-year survival rate is only about 50%. Therefore, the development of an effective heart failure treatment method is considered to be extremely beneficial from the viewpoint of medical welfare and medical economy.
  • cardiotonic agents such as digitalis and xanthine preparations that increase myocardial contractility have been used as therapeutic agents for heart failure.
  • long-term administration of these drugs may worsen the disease state.
  • treatments with drugs that relieve excessive cardiac load due to enhancement of the sympathetic nervous system and renin-angiotensin system, such as ⁇ -blockers and ACE inhibitors, have become mainstream. However, it does not restore the damaged heart tissue itself.
  • heart transplantation is a fundamental treatment for severe heart failure, but this method is a general treatment because of problems such as lack of organ donors, medical ethics, and the physical or economic burden on patients. Is difficult to use.
  • Micro RNA (hereinafter referred to as “miRNA”) is a non-coding RNA having a length of 21 to 25 bases present in cells. It has been widely conserved from nematodes to mammals, and has recently attracted attention as a molecule that plays an important role in regulating the expression of various genes in vivo.
  • MiRNA is first transcribed as a miRNA primary transcript (pri-miRNA) of about several hundred to several thousand bases from the miRNA gene present on the genomic DNA. Next, it is processed by a RNase III enzyme called Drosha in the nucleus to become a precursor miRNA (pre-miRNA) having a hairpin structure of about 70 bases. It is then transported from the nucleus to the cytoplasm by Exportin-5 and processed by the RNase III enzyme called Dicer to form a double-stranded mature miRNA (mature miRNA) of 21-25 bases.
  • pri-miRNA miRNA primary transcript
  • Drosha a RNase III enzyme having a hairpin structure of about 70 bases. It is then transported from the nucleus to the cytoplasm by Exportin-5 and processed by the RNase III enzyme called Dicer to form a double-stranded mature miRNA (mature miRNA) of 21-25 bases.
  • RISC RNA-induced repression complex
  • Non-Patent Document 3 it is estimated that there are about 1000 miRNAs per species, each of which is said to regulate the expression of multiple target genes and control about 1/3 of the entire protein-encoding gene.
  • miRNAs are involved in development, differentiation, biological reactions during viral infection, and the like, and it is suggested that they are associated with human diseases.
  • cancer and miRNA there are many miRNAs with different expression patterns in normal and cancer tissues, which strongly suggests the involvement of miRNA in the carcinogenesis process, miRNAs that promote carcinogenesis, and tumor suppression The presence of both miRNAs has been reported (Non-Patent Documents 4, 5, and 6).
  • miRNA expression profile analysis in normal and pathological heart has been reported by many research groups. Some of them have also been analyzed for specific functions.For example, miR-195 expression is increased in cardiac hypertrophy, and in the transgenic mice in which the miRNA is forcibly expressed, the heart is enlarged and dilated myocardium. MiR-1, a miRNA whose expression is decreased due to cardiac hypertrophy, suppresses cardiomyocyte proliferation (Patent Document 2, Non-patent Document) Reference 8) has been reported.
  • An object of the present invention is to identify a miRNA that promotes the proliferation of cardiomyocytes, and to provide a method for growing cardiomyocytes using the miRNA, a heart disease treatment vector, a heart disease treatment pharmaceutical composition, and the like.
  • the present inventors have conducted research focusing on microRNA (hereinafter referred to as “miRNA”) as a factor that regulates the proliferation of cardiomyocytes, and analyzed the miRNA that regulates the proliferation of cardiomyocytes. Went. As a result of intensive studies, the present inventors have succeeded in identifying a plurality of miRNAs that regulate the proliferation of cardiomyocytes, and have completed the present invention.
  • miRNA microRNA
  • the present inventors provide miRNA having a cardiomyocyte proliferation promoting action. More specifically, the miRNA of the present invention includes the following embodiments: (1-1) miRNA having a cardiomyocyte proliferation promoting action.
  • the miRNA is a substance selected from the group consisting of a mature miRNA, a precursor of the miRNA, a mutant thereof, and a similar substance.
  • the miRNA is a substance comprising a seed sequence consisting of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2.
  • Substances containing a seed sequence consisting of SEQ ID NO: 1 are miR-148a (SEQ ID NO: 3), miR-148b (SEQ ID NO: 5), miR-152 (SEQ ID NO: 7 ) And their precursors, and their variants and similar substances, the miRNA according to (1-3) above.
  • a substance comprising a seed sequence consisting of SEQ ID NO: 2 is a substance selected from the group consisting of miR-373 (SEQ ID NO: 9) and precursors thereof, and variants and similar substances thereof The miRNA according to (1-3) above.
  • the present inventors have (a) a pharmaceutical composition for treating heart disease using a nucleic acid defining miRNA having the above-mentioned cardiomyocyte proliferation promoting action, ( b) a method of treating heart disease, characterized by introducing a nucleic acid defining miRNA having a cardiomyocyte proliferation promoting action into a damaged part of an individual's heart to proliferate the cardiomyocyte in the part, (c ) Use of a nucleic acid defining miRNA having a cardiomyocyte growth promoting action for the manufacture of a medicament for the treatment of heart disease, or (d) Cardiomyocyte growth promoting action for use in the treatment of heart disease Provided is an invention about a medicinal use of miRNA having a cardiomyocyte proliferation-promoting action, which can be described as a nucleic acid that defines miRNA.
  • nucleic acid defining miRNA when referring to “nucleic acid defining miRNA”, (i) mature miRNA and precursor of the miRNA, and variants and similar substances thereof, or (ii) mature miRNA and precursor of the miRNA, and An expression vector for expressing these mutants and similar substances in vivo or in cells.
  • such a pharmaceutical composition includes the following embodiments: (2-a-1) A pharmaceutical composition for treating heart disease, comprising a nucleic acid that defines miRNA having a cardiomyocyte proliferation promoting action. (2-a-2) The miRNA described in (2-a-1) above, wherein the miRNA is a substance selected from the group consisting of a mature miRNA and a precursor of the miRNA, and variants and similar substances thereof Pharmaceutical composition. (2-a-3) The miRNA is a substance comprising a seed sequence consisting of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2, according to (2-a-1) or (2-a-2) above Pharmaceutical composition.
  • Substances containing a seed sequence consisting of SEQ ID NO: 1 are miR-148a (SEQ ID NO: 3), miR-148b (SEQ ID NO: 5), miR-152 (SEQ ID NO :
  • the pharmaceutical composition according to (2-a-3) above which is a substance selected from the group consisting of 7) and their precursors, and mutants and similar substances thereof.
  • a substance containing a seed sequence consisting of SEQ ID NO: 2 is selected from the group consisting of miR-373 (SEQ ID NO: 9) and its precursor, and its variants and similar substances
  • (2-a-6) The above (2-a-1) to (2-), comprising a nucleic acid defining miRNA having a cardiomyocyte proliferation promoting action as an expression vector or liposome for introduction and expression in cardiomyocytes.
  • (2-a-7) The pharmaceutical composition according to (2-a-6) above, wherein the vector is a viral vector or a non-viral expression vector.
  • (2-a-8) virus vectors are adenovirus vectors, adeno-associated virus (AAV) vectors, retrovirus vectors, Japanese hemagglutinating virus (HVJ; aka Sendai virus) vectors, lentivirus vectors, vaccinia virus vectors,
  • AAV adeno-associated virus
  • HVJ Japanese hemagglutinating virus
  • lentivirus vectors vaccinia virus vectors
  • the pharmaceutical composition according to (2-a-7) above which is selected from chicken poxvirus vectors and papovavirus vectors.
  • (2-a-9) The above (2-a-1), wherein the miRNA is a miRNA derivative comprising at least one modified internucleoside linkage, at least one modified sugar moiety, at least one modified base, or a combination thereof.
  • such a treatment method includes the following aspects: (2-b-1) A cardiovascular disease characterized by proliferating cardiomyocytes at an affected site of an individual's heart by introducing a nucleic acid defining miRNA having a cardiomyocyte proliferation promoting action into the damaged site of the individual's heart Method of treatment. (2-b-2) The miRNA according to (2-b-1) above, wherein the miRNA is a substance selected from the group consisting of a mature miRNA and a precursor of the miRNA, and variants and similar substances thereof Method of treatment.
  • a substance comprising a seed sequence consisting of SEQ ID NO: 2 is selected from the group consisting of miR-373 (SEQ ID NO: 9) and its precursor, and its variants and similar substances
  • (2-b-6) The above-mentioned (2-b-1) to (2), wherein a nucleic acid defining miRNA having an effect of promoting proliferation of cardiomyocytes is introduced into an impaired site of an individual heart by an expression vector or a liposome.
  • (2-b-7) The method according to (2-b-6) above, wherein the vector is a viral vector or a non-viral expression vector.
  • (2-b-8) virus vectors include adenovirus vectors, adeno-associated virus (AAV) vectors, retrovirus vectors, Japanese hemagglutinating virus (HVJ; aka Sendai virus) vectors, lentivirus vectors, vaccinia virus vectors, The treatment method according to (2-b-7) above, which is selected from a chicken poxvirus vector and a papovavirus vector.
  • (2-b-9) The above (2-b-1), wherein the miRNA is a miRNA derivative comprising at least one modified internucleoside linkage, at least one modified sugar moiety, at least one modified base, or a combination thereof.
  • (c) Use of a nucleic acid defining miRNA having a cardiomyocyte proliferation promoting action for the manufacture of a pharmaceutical composition for treating heart disease.
  • (2-c-2) The miRNA according to (2-c-1) above, wherein the miRNA is a substance selected from the group consisting of a mature miRNA and a precursor of the miRNA, and variants and similar substances thereof use.
  • (2-c-3) The miRNA is a substance comprising a seed sequence consisting of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2, according to (2-c-1) or (2-c-2) above use.
  • Substances containing a seed sequence consisting of SEQ ID NO: 1 are miR-148a (SEQ ID NO: 3), miR-148b (SEQ ID NO: 5), miR-152 (SEQ ID NO : Use according to (2-c-3) above, which is a substance selected from the group consisting of 7) and their precursors, and mutants and similar substances thereof.
  • (2-c-5) The substance containing the seed sequence consisting of SEQ ID NO: 2 is selected from the group consisting of miR-373 (SEQ ID NO: 9) and its precursor, and its variants and similar substances The use according to (2-c-3) above, which is a substance.
  • (2-c-6) The above (2-c-1) to (2-), comprising a nucleic acid defining miRNA having a cardiomyocyte proliferation promoting action as an expression vector or liposome for introduction and expression in cardiomyocytes Use of any one of c-5).
  • (2-c-7) The use according to (2-c-6) above, wherein the vector is a viral vector or a non-viral expression vector.
  • (2-c-8) virus vectors include adenovirus vectors, adeno-associated virus (AAV) vectors, retrovirus vectors, Japanese hemagglutinating virus (HVJ; aka Sendai virus) vectors, lentivirus vectors, vaccinia virus vectors, The use according to (2-c-7) above, which is selected from a chicken poxvirus vector and a papovavirus vector.
  • (2-c-9) The above (2-c-1), wherein the miRNA is a miRNA derivative comprising at least one modified internucleoside linkage, at least one modified sugar moiety, at least one modified base, or a combination thereof. ) To (2-c-8).
  • (2-c-10) The above (2-c-1) to (2-c-1), wherein the heart disease is myocardial infarction, ischemic heart disease, congestive heart failure, hypertrophic cardiomyopathy, dilated cardiomyopathy, myocarditis or chronic heart failure Use of any one of (2-c-9).
  • nucleic acids include the following embodiments: (2-d-1) A nucleic acid that defines miRNA having a cardiomyocyte proliferation promoting action for use in the treatment of heart disease.
  • (2-d-3) The miRNA is a substance comprising a seed sequence consisting of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2, according to (2-d-1) or (2-d-2) above Nucleic acid.
  • Substances containing a seed sequence consisting of SEQ ID NO: 1 are miR-148a (SEQ ID NO: 3), miR-148b (SEQ ID NO: 5), miR-152 (SEQ ID NO :
  • a substance comprising a seed sequence consisting of SEQ ID NO: 2 is selected from the group consisting of miR-373 (SEQ ID NO: 9) and its precursor, and its variants and similar substances
  • the nucleic acid according to (2-d-3 which is a substance.
  • (2-d-6) The above (2-d-1) to (2-), comprising a nucleic acid defining miRNA having a cardiomyocyte proliferation promoting action as an expression vector or liposome for introduction and expression into cardiomyocytes.
  • (2-d-7) The nucleic acid according to (2-d-6) above, wherein the vector is a viral vector or a non-viral expression vector.
  • (2-d-8) virus vectors are adenovirus vectors, adeno-associated virus (AAV) vectors, retrovirus vectors, Japanese hemagglutinating virus (HVJ; aka Sendai virus) vectors, lentivirus vectors, vaccinia virus vectors,
  • AAV adeno-associated virus
  • HVJ Japanese hemagglutinating virus
  • lentivirus vectors vaccinia virus vectors
  • (2-d-9) The above (2-d-1), wherein the miRNA is a miRNA derivative comprising at least one modified internucleoside linkage, at least one modified sugar moiety, at least one modified base, or a combination thereof.
  • the present inventors provide a method for proliferating cardiomyocytes using the above-described nucleic acid that defines miRNA having a cardiomyocyte proliferation promoting action. More specifically, such cardiomyocyte proliferation methods include the following aspects: (3-1) A method for proliferating cardiomyocytes, characterized by introducing a nucleic acid defining miRNA having a cardiomyocyte proliferation-promoting action into cardiomyocytes for expression. (3-2) The method according to (3-1) above, wherein the miRNA is a substance selected from the group consisting of a mature miRNA, a precursor of the miRNA, a mutant thereof, and a similar substance.
  • a substance comprising a seed sequence consisting of SEQ ID NO: 2 is a substance selected from the group consisting of miR-373 (SEQ ID NO: 9) and its precursors, and variants and similar substances thereof
  • Adenovirus vector adeno-associated virus (AAV) vector, retrovirus vector, Japanese hemagglutinating virus (HVJ; aka Sendai virus) vector, lentivirus vector, vaccinia virus vector, chicken pox
  • AAV adeno-associated virus
  • retrovirus vector retrovirus vector
  • Japanese hemagglutinating virus (HVJ; aka Sendai virus) vector lentivirus vector
  • vaccinia virus vector chicken pox
  • 3-9) The above (3-1) to (3), wherein the miRNA is a miRNA derivative comprising at least one modified internucleoside bond, at least one modified sugar moiety, at least one modified base, or a combination thereof. -8) The method according to any one of the above.
  • the miRNA according to the present invention By using the miRNA according to the present invention, it is possible to provide a method for proliferating cardiomyocytes, a vector for treating heart disease, and a pharmaceutical composition for treating heart disease.
  • the cardiomyocyte proliferation method according to the present invention can induce cardiomyocyte division and proliferate cells more efficiently than conventional methods.
  • Cardiomyocytes prepared by the method can be used for various drugs. It can be used as a cell for screening and transplantation therapy.
  • this method to gene therapy, the possibility of regenerative medical treatment of heart disease caused by necrosis or deletion of cardiomyocytes was obtained. It has been revealed that the miRNA according to the present invention exhibits proliferative activity remarkably against cardiomyocytes.
  • FIG. 1 shows in primary cultured cardiomyocytes transfected with miR-148a (SEQ ID NO: 3), miR-152 (SEQ ID NO: 7), miR-373 (SEQ ID NO: 9) in Example 2. It is a figure which shows a Ki67 positive cardiomyocyte rate. Ki67 is a cell nuclear protein and is a protein used as a marker for detecting proliferating cells.
  • FIG. 2 shows infection of recombinant adenovirus expressing miR-148a (SEQ ID NO: 3), miR-152 (SEQ ID NO: 7), miR-373 (SEQ ID NO: 9) in Example 3. It is a figure which shows the Ki67 positive cardiomyocyte rate in the made primary cultured cardiomyocytes. None indicates unprocessed.
  • Figure 3-1 shows primary cultured myocardium transfected with miR-148a (SEQ ID NO: 3), miR-152 (SEQ ID NO: 7), miR-373 (SEQ ID NO: 9) in Example 4. It is a figure which shows the phosphorylated histone H3 (H3P) positive cardiomyocyte rate in a cell.
  • FIG. 3-2 shows a recombinant adenovirus expressing miR-148a (SEQ ID NO: 3), miR-152 (SEQ ID NO: 7), miR-373 (SEQ ID NO: 9) in Example 4. It is a figure which shows the H3P positive cardiomyocyte rate in the primary culture cardiomyocytes which infected A. None indicates unprocessed.
  • FIG. 3 shows primary cultured myocardium transfected with miR-148a (SEQ ID NO: 3), miR-152 (SEQ ID NO: 7), miR-373 (SEQ ID NO: 9) in Example 4. It is a figure which shows the H3P positive cardio
  • FIG. 4 shows the production of recombinant adenovirus expressing miR-148a (SEQ ID NO: 3), miR-152 (SEQ ID NO: 7), miR-373 (SEQ ID NO: 9) in Example 5. It is a figure which shows the Ki67 positive cardiomyocyte rate in the heart tissue section which infected the rat heart in the body.
  • the present invention provides, as a first aspect, miRNA having a cardiomyocyte proliferation promoting action.
  • the present invention provides, as a second aspect, a pharmaceutical composition for treating a heart disease using the above-described nucleic acid that defines miRNA having a cardiomyocyte proliferation promoting action; miRNA having a cardiomyocyte proliferation promoting action
  • a method for treating a heart disease comprising introducing a nucleic acid that defines the above into a damaged site of a heart of an individual to proliferate cardiomyocytes at the site; myocardium for producing a pharmaceutical composition for treating a heart disease
  • a nucleic acid defining a miRNA having a cell growth promoting effect and a nucleic acid defining a miRNA having a cardiomyocyte growth promoting effect for use in the treatment of heart disease.
  • a method for proliferating cardiomyocytes using a nucleic acid that defines miRNA having the above-mentioned cardiomyocyte proliferation promoting action is provided.
  • Cardiomyocytes to be propagated using the method according to the present invention may generally include adult cardiomyocytes, juvenile cardiomyocytes, and cardiomyocytes at all stages of development of fetal cardiomyocytes. And in the present invention, cardiomyocytes present in the heart tissue of mammals can be directly targeted, but in the first and third aspects of the present invention, cultured cardiomyocytes in vitro Etc. can also be used.
  • any cardiomyocytes derived from any source can be used as cultured cardiomyocytes in vitro.
  • cardiomyocytes isolated from living heart tissue by various methods such as enzyme treatment Alternatively, primary cultured cells obtained by culturing them for about 1 to 5 days under suitable culture conditions can also be used.
  • the cultured cardiomyocytes are not limited to the above examples, but also include cardiomyocytes obtained by inducing differentiation from various stem cells.
  • the stem cell used in the practice of the present invention means a cell having a property capable of differentiating into a cell having a cardiomyocyte-like character under in vitro culture. Specifically, it is already widely used as a cultured cell. Examples include embryonic stem cells (ES cells) derived from mammals such as mice, monkeys and humans, pluripotent stem cells such as artificial pluripotent stem cells (iPS cells) and embryonic germ cells (EG cells).
  • ES cells embryonic stem cells
  • iPS cells artificial pluripotent stem cells
  • EG cells embryonic germ cells
  • ES cell-like traits include the presence of ES cell-specific surface (antigen) markers, the expression of ES cell-specific genes, and the ability to form teratoma and chimeric mice. It can be defined with cell biology specific to ES cells.
  • cells that do not have traits similar to ES cells or cells that are not pluripotent stem cells should be capable of differentiating into cells having cardiomyocyte-like traits at least in vitro culture.
  • the method described in the present invention can be used.
  • examples of such cells include bone marrow mesenchymal stem cells derived from bone marrow cells (Bruder et al., USP 5,736,396; Pittenger et al., Science, 284: 143-147, (1999)) and CMG cells (Makino et al., The.Journal of Clinical Investigation, 103: 697-705, (1999); WO01 / 048151), Spoc cells derived from muscle tissue (WO03 / 035382), and the like.
  • any culture method can be used as a culture method for producing cardiomyocytes from stem cells as long as the method is suitable for inducing differentiation of cardiomyocytes.
  • specific differentiation induction methods a plurality of methods have already been established.
  • reference books such as Embryonic Stem Cells (Turksen edition, Humana Press, 2002) and multiple references (Klug et al., The Journal of Clinical Investigation, 98: 216-224, (1996); Wobus et al., Journal of Molecular and Cellular Cardiology, 29: 1525-1539, (1997); Kehat et al., The Journal of Clinical Investigation, 108: 407-414, (2001); Xu et al., Circulation Research, 91: 501-508, (2002); Takahashi et al., Circulation, 107: 1912-1916, (2003); Field et al., USP ⁇ ⁇ 6,015,671; Xu et al.
  • the present invention provides a microRNA (miRNA) having a cardiomyocyte proliferation promoting action.
  • the miRNA according to the present invention may be any miRNA that promotes the proliferation of cardiomyocytes, and can be used for growing the cardiomyocytes.
  • miRNA is a small RNA that does not encode a protein that is highly expressed in eukaryotes including mammals, and is considered to be involved in various life phenomena such as development, differentiation, and proliferation. ing.
  • the miRNA that can be used in the present invention includes mature miRNA and precursors of the miRNA, and mutants and similar substances thereof.
  • the miRNA according to the present invention may be single-stranded or double-stranded.
  • the mature miRNA is a completely processed miRNA, which is 15 to 30 nucleotides long (mostly 21 to 25 nucleotides long).
  • Mature miRNAs share at least 6 consecutive nucleotides from 1 to 12 nucleotides 5 ′ of the mature miRNA molecule (the nucleotide portion is also referred to as the “seed region” (Brennecke et al., PLoS Biology, 3: e85, (2005)), can constitute a miRNA family consisting of a group of miRNAs, so the 5 'region of mature miRNA is identical to the miRNA family, but the 3' side is Multiple mature miRNAs are included, and if they belong to the same miRNA family, they may have the same function even if the nucleic acid sequence of the 3 'region is different.
  • the 8-mer seed region sequence (seed sequence) has been reported (Brennecke et al., PLoS Biology, 3: e85,2005 (2005)).
  • the sequence complementary to the sequence to which the mer seed region sequence binds is 5
  • the precursor of miRNA is a precursor RNA of mature miRNA.
  • miRNA is first transcribed into miRNA primary transcript (pri-miRNA) of several hundred to several thousand bases from miRNA gene present on genomic DNA, It is processed in the nucleus by an RNase III enzyme called Drosha, and becomes a precursor miRNA (pre-miRNA) having a hairpin structure of about 70 bases. Therefore, in the present invention, miRNA precursor includes miRNA primary transcript (pri-miRNA) and precursor miRNA (pre-miRNA).
  • the miRNA mutant is a miRNA in which one or several nucleotides are deleted, substituted, inserted or added as compared with a mature miRNA or a precursor of a mature miRNA originally possessed by a living body.
  • the term “several” means, for example, 7 to 6, preferably 5 to 4, and more preferably 3 to 1.
  • the miRNA mutant is preferably an miRNA in which nucleotides are deleted, substituted, inserted or added in a portion other than the seed region of the mature miRNA.
  • the miRNA-like substance is an miRNA synthesized so as to mimic an endogenous mature miRNA or a precursor of mature miRNA.
  • miRNA eg, from Ambion
  • Such materials are commercially available (eg, from Ambion) and are readily available.
  • nucleic acid derivatives can be appropriately selected from known ones. Specifically, for example, methylphosphonate, phosphorothioate, phosphorodithioate, phosphoramidate, phosphotriester, sulfone, siloxane, Carbonate, carboxymethylester, acetamidate, carbamate, thioether, bridged phosphoramidate, bridged methylenephosphonate, bridged Bridged phosphorothioate, dimethylene-sulfide, dimethylene-sulfoxide, dimethylene-sulfone, 2'-O-alkyl, and 2'-deoxy-2'-full Examples include nucleic acids containing internucleoside linkages of 2'-deoxy-2'-fluoro phosphorothioate (Uhlmann & Peyman,
  • miRNA derivatives such as Locked Nucleic Acid (Koshkin et al., Journal of the American Chemical Society, 120: 13252-13253 (1998)) and ENA (US7335765) are also included.
  • a nucleic acid derivative and / or miRNA having a modified internucleoside bond is referred to as a miRNA derivative in the present invention.
  • the miRNA derivatives include mature miRNA derivatives, miRNA precursor derivatives, miRNA variant derivatives, and miRNA analog derivatives.
  • the miRNA that can be used in the present invention is obtained, for example, by isolating it from a natural product, chemically synthesizing it, or by producing it by a gene recombination technique using a known technique. It can also be obtained as a commercial product.
  • mature miRNAs are registered in Sanger miRbase, and all of the registered miRNAs can be obtained from Ambion, Qiagen, Sigma, Thermo Scientific and the like.
  • any of gene delivery means commonly used in the art such as expression vectors or liposomes should be used.
  • Any of gene delivery means commonly used in the art such as expression vectors or liposomes should be used.
  • the above mature miRNA or miRNA precursor can be used in the form of oligonucleic acid or derivative, but from the viewpoint of its expression efficiency and duration of effect, it should be used in the form incorporated into an expression vector. Is preferred.
  • any expression vector may be used so long as it has a promoter capable of expressing miRNA, and a viral expression vector or a non-viral expression vector may be used. it can.
  • Viral expression vectors include adenovirus, adeno-associated virus (AAV), retrovirus, Japanese hemagglutinating virus (HVJ; also known as Sendai virus), lentivirus, vaccinia virus, chicken poxvirus, and papovaviruses such as SV40 Vectors derived from the above are exemplified, but preferably, by using an adenovirus vector, AAV vector, HVJ vector, or lentivirus vector, efficient gene transfer and high-level expression of the introduced gene are performed. Can do.
  • Gene transfer with these viral vectors is one of the most powerful methods of introducing genes into mammalian cells and is used to introduce into virtually all types of human cells and many non-human cells it can.
  • genes can be expressed in various primary culture cell lines and transformed cell lines.
  • genes can be efficiently introduced into cells that do not undergo DNA synthesis or cell division, such as cardiomyocytes. Since many cells receive multiple copies of recombinant DNA (or RNA) after infection, the introduced gene is temporarily expressed at a high level.
  • DNA / RNA usually remains in the cytoplasm and is not taken up by the nucleus. Therefore, when these viral vectors are used, there is also an advantage that almost no mutagenic error that randomly occurs when a foreign gene is integrated into the host cell genome.
  • the adenovirus vector used as one of the preferred embodiments of the present invention is a method using homologous recombination using human fetal kidney 293 cells or E. coli as a host (Miyake et al., EdProceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 93: 1320-1324, (1996)) or a simple in vitro ligation method (Mizuguchi & Kay, Human Gene Therapy, 9: 2577-2583, (1998)).
  • Adenovirus is one of DNA viruses having double-stranded DNA genome, and human adenovirus type 5 and type 2 are the best studied. By deleting most of the E1 and E3 genes of these wild-type adenoviruses, it is possible to create viral vectors that are not capable of replication and have several kb of foreign sites without adversely affecting virus particle formation. It becomes possible to insert DNA.
  • the recombinant adenovirus lacks the E1 gene, which is a transcriptional regulator, but is inserted by the inserted gene-specific transcription unit without depending on the growth of target cells or the presence or absence of other viral genes. Only the target gene can be expressed.
  • Adeno-associated virus is a single-stranded DNA virus of about 4.7 kb belonging to the Parvoviridae family, and serotypes AAV of type 1 to 12 are known.
  • AAV vector is made by replacing Rep (involved in replication and integration) and Cap (capsid) sandwiched between ITRs (Inverted terminal repeat) at both ends with the target gene.
  • This vector is introduced into 293 cells together with plasmids expressing Rep and Cap, and further adenovirus is infected as a helper virus to prepare a recombinant adeno-associated virus vector accumulated in the nucleus.
  • a method has been developed that does not require a helper virus by introducing E2A, E4, and VA-expressing plasmids into 293 cells that express E1A and E1B.
  • Sendai virus is a rodent virus belonging to the genus Paramyxovirus, also known as Hemagglutinating Virus (of Japan) (HVJ).
  • the SeV genome consists of negative single-stranded RNA (complementary to mRNA), nucleoprotein (NP), nucleoprotein kinase (P), virus surface-lined protein (M), hemagglutinating protein (HN), membrane fusion It encodes 6 genes: protein (F) and RNA synthase (L).
  • SeV binds to the sialic acid of the host cell by HN (hemaglutination-neuraminidase) protein and binds to it, and the genome is injected into the cytoplasm.
  • HN hemaglutination-neuraminidase
  • SeV vectors can be created as non-transmissible vectors by deleting one or more F, HN, and M genes other than the N, P, and L genes required for autonomous replication of the vector in the introduced cell.
  • F gene deletion type vector is a plasmid in which recombinant vector cDNA is inserted downstream of T7 promoter recognized by bacteriophage T7 derived RNA polymerase, N, P, F, L expression plasmid under T7 promoter control, and T7 RNA It is produced by introducing a recombinant vaccinia virus expressing polymerase into monkey kidney-derived LLC-MK2 cells.
  • plasmids a plasmid with a recombinant vector cDNA inserted downstream of the T7 promoter and a CAG promoter
  • a simple method of preparation by only transfection of N, P, L, F, and T7 RNA polymerase gene expression plasmids under control is also possible.
  • kits for producing adenovirus vectors are also commercially available (from Invitrogen's ViraPower TM adenovirus expression system (# K4930), Takara Bio's Adenovirus Expression Vector Kit (# 6170), etc.) and are readily available. Can be used to implement the present invention.
  • Kits for preparing AAV vectors and SeV vectors are also commercially available (AAV Helper-Free system (Stratagene; # 240071), recombinant Sendai virus mini vector preparation kit (MBL; DV-0001), etc.) are readily available and can be used to implement the present invention.
  • non-viral expression vectors include promoters derived from viruses such as SV (Simian virus) virus promoter, cytomegarovirus (CMV) promoter, Rous sarcoma virus promoter, ⁇ -actin CAG promoter (Niwa et al.), A hybrid promoter in which the CMV enhancer and the poly A addition signal sequence of the rabbit ⁇ -globin gene are incorporated into the avian ⁇ -actin promoter, such as promoter, EF (elongation factor) 1 ⁇ promoter , Gene, 108: 193-199, (1991)), and vectors having U6 or H1 promoter, which is a Pol.III promoter, are not limited thereto. Expression vectors that can use these promoters are commercially available (from Ambion, Invitrogen, TAKARA BIO, etc.) and can be easily obtained.
  • SV Seimian virus
  • CMV cytomegarovirus
  • Rous sarcoma virus promoter Rous sarcoma virus
  • the above gene or gene vector As a method for introducing the above gene or gene vector, all known methods can be used. For example, a transfection method using calcium phosphate or an electric pulse, a cell after encapsulating a target gene in a liposome or the like. And a method in which a gene of interest is incorporated into a virus vector such as a retrovirus or an adenovirus, and a cell is infected with the recombinant virus.
  • the viral vector is a construct that can incorporate and express a target gene in a nucleic acid sequence in which the entire length or part of viral DNA or RNA is deleted or mutated.
  • liposomes include lipid preparations containing N- [2,3- (dioleoyloxy) propyl] -N, N, N-trimethylammonium chloride (DOTMA) and dioleoylphosphatidylethanolamine (DOPE). Can be used.
  • DOTMA dioleoyloxypropyl
  • DOPE dioleoylphosphatidylethanolamine
  • the present inventors searched a library of mature miRNAs based on whether or not they exhibited a remarkable BrdU uptake ability when introduced into cardiomyocytes.
  • miR-148a SEQ ID NO: 3
  • miR-148b SEQ ID NO: 5
  • miR-152 SEQ ID NO: 7
  • miR-373 SEQ ID NO: 9
  • Preferred miRNAs that can be used in the present invention also include precursors of these mature miRNAs.
  • miRNA primary transcript pri-miRNA
  • pre-miRNA precursor miRNA
  • Specific examples thereof include, for example, the following primary transcripts (pri-miRNAs) of genes encoding the specific mature miRNAs described above, and preferred miRNAs that can be used in the present invention.
  • Mir-148a (precursor of miR-148a, SEQ ID NO: 4), mir-148b (precursor of miR-148b, SEQ ID NO: 6), mir-152 (precursor of miR-152, SEQ ID) NO: 8), and mir-373 (precursor of miR-373, SEQ ID NO: 10).
  • miRNA examples include mutants and similar substances of mature miRNA and precursor miRNA shown in Table 1 above, or precursors of miRNA other than the precursor of miRNA shown in Table 1 above.
  • the body eg, miRNA primary transcript (pri-miRNA) and the like
  • variants and similar substances thereof are also included.
  • miR-148a SEQ ID NO: 3
  • miR-148b SEQ ID NO: 5
  • miR-152 SEQ ID NO: 7
  • the miR-148 family consists of a common seed sequence, ucagugca (SEQ ID NO: 1), on the 5 ′ side of the miRNA.
  • the sequences of miRNAs belonging to the miR-148 family are listed below. Underline the stored seed sequence.
  • miR-148a ucagugca cuacagaacuuugu (SEQ ID NO: 3)
  • miR-148b ucagugca ucacagaacuuugu (SEQ ID NO: 5)
  • miR-152 ucagugca ugacagaacuugg (SEQ ID NO: 7).
  • one of the miRNAs of the present invention includes mature miRNA containing a seed sequence consisting of ucagugca (SEQ ID NO: 1) at the 5 ′ end, a precursor of the miRNA, or a variant or similar substance thereof.
  • miRNAs include miR-148a (SEQ ID NO: 3), miR-148b (SEQ ID NO: 5), miR-152 (SEQ ID NO: ⁇ ⁇ 7) and precursors of the miRNA, and variants thereof And miRNA selected from the group consisting of similar substances.
  • the precursors of mature miRNAs miR-148a include the pri of each miRNA.
  • -miRNA, pre-miRNA and the like include, for example, precursors represented by the following SEQ ID NOs: NO 4, 4, and 8, respectively.
  • Human mir-148a gaggcaaagu ucugagacac uccgacucug aguaugauag aagucagugc acuacagaac uuugucuc (SEQ ID NO: 4)
  • Human mir-148b caagcacgau uagcauuuga ggugaaguuc uguuauacac ucaggcugug gcucucugaa agucagugca ucacagaacu uugucucgaa agcuuucua (SEQ ID NO: 6)
  • Human mir-152 uguccccccc ggcccagguu cugugauaca cuccgacucg ggcucuggag cagucagugc augacagaac uugggcccgg aggacc (SEQ ID NO: 8).
  • miR-373 which is another mature miRNA that can be used in the present invention, has a common seed sequence, gaagugcu (SEQ ID NO: 2), on the 5 ′ side of the miRNA, and miR-373 Make up a family. The sequence of miRNA belonging to the miR-373 family is shown. The seed array is underlined.
  • miR-373 gaagugcu ucgauuuuggggugu (SEQ ID NO: 9).
  • one of the miRNAs of the present invention includes mature miRNA containing a seed sequence consisting of gaagugcu (SEQ ID NO: 2) at the 5 'end, a precursor of the miRNA, or a variant or similar substance thereof.
  • miRNAs include miR-373 (SEQ ID NO: 9) and precursors of the miRNA, as well as miRNAs selected from the group consisting of variants and analogs thereof.
  • examples of the precursor of miR-373 (SEQ ID NO: 9) that is a mature miRNA include pri-miRNA and pre-miRNA of the miRNA. Specific examples thereof include a precursor represented by the following SEQ ID NO: 10.
  • Human miR-373 gggauacuca aaaugggggc gcuuuccuuuu uugucuguac ugggaagugc uucgauuuug ggguguccc (SEQ ID NO: 10).
  • the miRNA according to the present invention obtained in this way has a proliferative activity remarkably against cardiomyocytes.
  • the miRNA according to the present invention includes MRC-5 (human fetal lung-derived) cells, WI-38 (human fetal lung-derived) cells, MC3T3-E1 (mouse calvarial-derived) cells and the like, which are normal cell lines. Did not show significant growth-promoting activity.
  • an expression vector such as a viral vector or a non-viral vector, which is used in the practice of the present invention, includes a nucleic acid that defines miRNA having a cardiomyocyte proliferation promoting action
  • a pharmaceutical composition for gene therapy comprising a vector (hereinafter simply referred to as “gene expression vector”), preferably a viral vector, more preferably an adenoviral vector or HVJ vector, AAV vector, lentiviral vector and the like.
  • the nucleic acid that defines the miRNA contained in the gene expression vector may be any nucleic acid that defines the miRNA described in the section “Acquisition of specific miRNA” described above.
  • this pharmaceutical composition for gene therapy contains a nucleic acid that defines miRNA having a cardiomyocyte proliferation promoting action, it can be used as a myocardial regenerative drug or a cardiac disease therapeutic drug by the action of miRNA.
  • the heart disease to be treated is not particularly limited as long as it is accompanied by weakness, cessation or death of cardiomyocytes. Specific examples include myocardial infarction, ischemic heart disease, congestive heart failure, hypertrophy Cardiomyopathy, dilated cardiomyopathy, myocarditis, chronic heart failure and the like.
  • the dosage form of the pharmaceutical composition is not particularly limited, and can be formulated by a conventional method.
  • it may be in the form of an injectable preparation containing the gene expression vector of the present invention in a pharmaceutically acceptable drug carrier or diluent such as sterile water or buffered saline.
  • the drug carrier can also include other suitable stabilizers (eg, nuclease inhibitors, etc.), chelating agents (eg, EDTA, etc.), and / or other auxiliaries.
  • the pharmaceutical composition containing the above components can be sterilized by a method such as filtration as necessary and filled in a container such as a sterile ampoule.
  • the dosage of the pharmaceutical composition of the present invention should be appropriately increased or decreased depending on conditions such as the patient's age, sex, body weight, symptoms, and administration route. It can be set as appropriate.
  • the amount of active ingredient DNA per adult is in the range of about 1.0 ⁇ g / kg to 1.0 g / kg, preferably in the range of about 10 ⁇ g / kg to 100 mg / kg.
  • the final titer of the virus is preferably 10 7 to 10 13 pfu / mL, more preferably 10 9 to 10 12 pfu / mL.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be supplied as a complex with a liposome, particularly when the gene expression vector is based on a non-viral vector. With such a configuration, there is a possibility that high transfection efficiency can be realized particularly in cardiomyocytes.
  • liposomes include many new ones including N- [2,3- (dioleoyloxy) propyl] -N, N, N-trimethylammonium chloride (DOTMA) and dioleoylphosphatidylethanolamine (DOPE).
  • Lipid formulations have been developed and tested for transfection using various cell lines (Banerjee, Journal of Biomaterials Applications, 16: 3-21, (2001); Maurer et al., Expert Opinion on Biological Therapy, 1: 923-947, Sakai (2001)). Also, a method using a fusion-forming virus liposome having a fusion-forming envelope derived from HVJ, the so-called HVJ-liposome method (Yonemitsu et al., International Journal Oncology, 12: 1277-1285, (1998); Kaneda et al ., Molecular Medicine Today, 5: 298-303, (1999)) is also effective. Liposomes for the introduction of these nucleic acids are commercially available. Especially for miRNA introduction, Lipofectamine RNAi MAX (Invitrogen), Oligofectamine (Invitrogen), siLentFect (BIO-RAD), HiPerFect (Qiagen) can be used.
  • the above gene expression vector or a pharmaceutical composition containing the gene expression vector may be introduced into the entire heart of a heart disease patient, but it is preferable to introduce the gene expression vector in a limited area.
  • the site of injury refers to a site where a cardiomyocyte in an individual (human or non-human animal: the same applies hereinafter) is weakened, ceases to function or has died, and its nearby region, or is weakened in the individual, progression of functional death or death. Means the expected site.
  • a method of introducing a gene expression vector or a pharmaceutical composition containing the same into an injured site it is possible to continuously transport the preparation to the injured site using an osmotic pump, an osmotic tube, etc. Examples include a method of injecting directly into the heart using a syringe after opening the chest, a method of injecting transvascularly (indirectly) using a catheter under fluoroscopy, and the like.
  • the transvascular method is preferable because gene transfer can be confined to the heart.
  • the gene expression vector or a pharmaceutical composition containing the gene can be injected into the blood vessel and transported to the cardiomyocytes via the bloodstream. It can also be injected directly into the myocardium and contacted with cardiomyocytes.
  • Surgical techniques using such catheters are well known in the art, and as reference books, for example, Gene Transfer in Cardiovascular System: Expertimental Approaches & Therapeutic Implications (March, Kluwer Academic Publishers, 1997), Examples include Vascular Surgery 5th edition (Rutherford, WB Saunders, 2000), Textbook of Interventional Cardiology 4th edition (Topol, WB Saunders, 2002).
  • the catheters used for carrying out the above method are commercially available (from Boston ⁇ ⁇ Scientific, EdwardsELifesciences Corporation, etc.) and can be easily obtained.
  • Cardiomyocytes proliferated by the method of the present invention can be efficiently converted to highly purified cardiomyocytes by using cell recovery, separation and purification methods by known methods. And can be obtained in large amounts.
  • the cardiomyocytes thus obtained are hereinafter referred to as cardiomyocytes prepared according to the present invention.
  • Any known cell separation and purification method can be used for the purification of cardiomyocytes. Specific examples thereof include antigen-antibody reactions such as flow cytometers, magnetic beads, and panning methods. An equivalent method and a cell fractionation method by density gradient centrifugation using a carrier such as sucrose or percoll can be exemplified.
  • cardiomyocyte sorting method a modification such as artificially imparting drug resistance or ectopic protein expression ability to the gene of stem cells such as animal cells or ES cells to be a cardiomyocyte source in advance
  • a method of selectively collecting cardiomyocytes based on these indices is mentioned.
  • Field and co-workers have introduced a gene cassette capable of expressing a neomycin (G418) resistance gene under the control of an ⁇ -type myosin heavy chain promoter into mouse ES cells so that the ES cells become cardiomyocytes.
  • cardiomyocytes prepared according to the present invention are useful for pharmacological evaluation and activity evaluation of various physiologically active substances (for example, drugs) and novel gene products whose functions are unknown.
  • physiologically active substances for example, drugs
  • it can be used for screening for substances and drugs related to cardiomyocyte function regulation, or substances and drugs that are toxic or toxic to cardiomyocytes.
  • an evaluation kit comprising cardiomyocytes prepared according to the present invention is useful for the screening.
  • the test substance to be used for screening may be any kind as long as it can be added to the culture system, for example, low molecular weight compounds, high molecular weight compounds, organic compounds, inorganic compounds, proteins, peptides, genes, viruses, cells, cell cultures. Liquid, microbial culture solution, and the like.
  • Examples of a method for efficiently introducing a gene into a culture system include a method for adding to a culture system using a viral vector such as a retrovirus or adenovirus, or a method for encapsulating in a liposome or the like and adding to a culture system. .
  • the test substance can be evaluated by measuring qualitative or quantitative changes in cardiomyocyte function. Taking cardiomyocyte viability as an example, cardiomyocytes prepared according to the present invention are seeded on a culture plate to an appropriate cell density, and cultured in a serum-free medium to induce cell death (apoptosis). In this case, an appropriate amount of the test substance may be added to the medium, and the survival rate or mortality of the cardiomyocytes may be measured.
  • a method for measuring the survival rate or mortality of cardiomyocytes it may be based on macroscopic observation using dye uptake such as trypan blue, or a method using dehydrogenase activity (reduction activity) as an index, Furthermore, a method using caspase activity specific to apoptotic cells or annexin V expression as an index may be used. Kits using this mechanism are commercially available (from Sigma, Clonetech, Promega, etc.) and can be easily obtained.
  • Substances and drugs obtained by the above screening methods have cardiomyocyte differentiation-inducing action and function-regulating action.
  • myocardial infarction ischemic heart disease, congestive heart failure, hypertrophic cardiomyopathy, dilated cardiomyopathy, cardiomyopathy It can be used as a preventive or therapeutic agent for heart diseases such as inflammation and chronic heart failure.
  • These compounds may be novel compounds or known compounds.
  • the cardiomyocytes prepared according to the present invention can also be used as transplanted cells for myocardial regeneration or heart disease treatment.
  • the heart disease include myocardial infarction, ischemic heart disease, congestive heart failure, hypertrophic cardiomyopathy, dilated cardiomyopathy, myocarditis, chronic heart failure and the like.
  • the cells for transplantation if the cardiomyocytes prepared according to the present invention are contained in high purity, the cells are suspended in an aqueous carrier such as a medium, and the cells are encapsulated in a solid phase carrier such as a biodegradable substrate. It can be used in any shape, such as embedded or processed into a single-layer or multilayer cardiomyocyte sheet (Shimizu et al., Circulation Research, 90: e40-e48, (2002)).
  • Methods for transplanting the above-mentioned cardiomyocytes for transplantation into the injured site include a method in which the chest is opened and injected directly into the heart using a syringe, a method in which a part of the heart is surgically incised, and a catheter. Transplantation by the transvascular method used (Murry et al., Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology, 67: 519-526, (2002); Menasche, The Annals of Thoracic Surgery, 75: S20-S28, ( 2003); Dowell et al., Cardiovascular Research, 58: 336-350, (2003)), but is not particularly limited.
  • Example 1 miRNA library screening using BrdU incorporation as an index using primary cultured cardiomyocytes
  • Hearts were excised from rats 2 to 4 days after birth (Wistar strain, obtained from Shimizu Experimental Materials Co., Ltd.) and treated with collagenase Percoll concentration gradient centrifugation from the obtained cell group (percol solution with a density of 1.082 g / mL in which cells were suspended was layered on a percoll solution with a density of 1.050 g / mL and 1.060 g / mL, and 4 ° C, 3000 rpm (2000 G) The cardiomyocyte fraction was collected by centrifugation for 25 minutes.
  • the cardiomyocytes obtained in this way were suspended in Eagle's minimum medium (Nacalai Tesque) supplemented with 5% calf serum (FCS; SAFC Bioscience), and then seeded in a culture dish. In a carbon dioxide incubator, Cultured at 37 ° C.
  • Pre-miR TM miRNA Precursor Library-HumanV2 (Ambion: miRBase Sequence Database Version 8.0) 328 human mature miRNAs were prepared from cardiomyocytes prepared in this way (15,000 cells / well per 96-well plate).
  • Example 2 Analysis of cell cycle progression marker by forced miRNA expression in primary cultured cardiomyocytes
  • candidate miRNAs obtained in Example 1, miR-148a, miR -148b, miR-152 and miR-373 human mature miRNAs designed to mimic Pre-miR TM miRNA Precursor Molecule and negative control Negative control # 1 (all Ambion) 1 pmol Lipofectamine TM RNAiMAX (Invitrogen ) And cells were fixed with 4% paraformaldehyde 2-4 days after transfection.
  • ThermoSCIENTIFIC anti-Ki67 antibody
  • anti-TroponinT antibody anti-TroponinT antibody
  • Alexa Fluor TM labeled antibodies Alexa-488 and Alexa-568; Molecular Probes
  • the cell nuclei were stained with a 4 ', 6-diamidine-2'-phenylindole dihydrochloride (DAPI) solution (1 ⁇ g / mL).
  • DAPI 6-diamidine-2'-phenylindole dihydrochloride
  • the Ki67 positive rate in cardiomyocytes was measured using In-Cell Analyzer 1000 (GE-Healthcare). Because Ki67 nucleoprotein is expressed in proliferating cells in every cycle of the cell cycle (Scholzen & Gerdes, Journal of Cellular Physiology, 182: 311-22, 2000), cells with advanced cell cycle are detected Used to do.
  • miR-148a, miR-148b, miR-152, and miR-373 were identified as miRNAs having a proliferative promoting effect on cardiomyocytes in comparison with the case where Negative control # 1 was used.
  • Example 3 Analysis of cell cycle progression marker by forced expression of adenovirus-expressed miRNA in primary cultured cardiomyocytes
  • adenovirus vector for expressing miR-148a, miR-152, miR-373, ViraPower TM Adenoviral Expression System (Invitrogen For example). That is, a human genomic DNA fragment containing the precursor sequence of each miRNA and several hundred adjacent nucleotides was amplified by PCR using the human genomic DNA as a template and the primers shown below.
  • hsa-miR-148a-F 5'-caccgaacacacctgcaggaagaaact-3 '(SEQ ID NO: 11)
  • hsa-miR-148a-R 5'-gttcccatttacagggtttaaccca-3 '(SEQ ID NO: 12)
  • hsa-miR-152-F 5'-caccgtcccagactcggctcccatca-3 '(SEQ ID NO: 13)
  • hsa-miR-373-F 5'-caccgtgaccaaggggctgtatgca-3 '(SEQ ID NO: 15)
  • hsa-miR-373-R 5'-ctgcccaccccagaatatgcca-3
  • these vectors were cleaved with the restriction enzyme PacI, and transfected into human kidney-derived 293A cells using Lipofectamine 2000 (Invitrogen), so that recombinant adenovirus Ad-miR-148a, Ad-miR-152, And Ad-miR-373 were prepared.
  • the recombinant adenovirus produced by the above method is constructed so that the precursor of each inserted miRNA is expressed under the control of the CMV promoter and can be highly expressed in mammalian cells.
  • a precursor of miRNA expressed in a mammal becomes a functional mature miRNA by a group of enzymes in the mammalian cell.
  • Ad-LacZ (Takara Bio Inc.) was used.
  • a high titer virus solution was prepared for each recombinant virus, and the titer of the prepared virus solution was determined by plaque assay using 293A cells, all within the range of 10 9 to 10 10 pfu / mL. Met.
  • miRNeasy mini kit Qiagen.
  • cDNA was synthesized using reverse transcription primers specific to each miRNA attached to TaqMan MicroRNA reverse reverse transcription kit (Applied Biosystems) and TaqMan MicroRNA Assay (Applied Biosystems) Subsequently, using the forward and reverse primers specific for each miRNA and TaqMan probe attached to TaqMan MicroRNA Assay (Applied Biosystems), perform real-time PCR on Applied Biosystems 7900HT Fast Real Realtime PCR PCR system, and mature type The expression level as miRNA was quantified.
  • RNU6B was used as an endogenous control, and the expression level was standardized. As a result, it was confirmed that mature miRNA was expressed in a dose-dependent manner.
  • ThermoSCIENTIFIC anti-Ki67 antibody
  • anti-TroponinT antibody anti-TroponinT antibody
  • Alexa Fluor TM labeled antibodies Alexa-488 and Alexa-568; Molecular Probes
  • Cell nuclei were stained with DAPI solution (1 ⁇ g / mL).
  • the Ki67 positive rate in cardiomyocytes was measured using In-Cell Analyzer 1000.
  • Ki67 which is a cell cycle progression marker becomes positive and the cell cycle of cardiomyocytes is increased. It was confirmed that it has an effect of promoting proliferation of cardiomyocytes.
  • Example 4 Analysis of cell division marker by miRNA forced expression or adenovirus-expressed miRNA forced expression in primary cultured cardiomyocytes
  • miR-148a, miR-148b, miR-152, miR-373 and negative As a control Negative control # 1 was transfected into cardiomyocytes.
  • Ad-miR-148a, Ad-miR-152, Ad-miR-373 and negative control Ad-LacZ were added to cardiomyocytes in the same manner as in Example 3. Cells were fixed with 4% paraformaldehyde, 2-3 days after each addition.
  • H3P histone H3
  • MILLIPORE anti-phosphorylated histone H3
  • anti-TroponinT antibody ThermoSCIENTIFIC
  • Alexa Fluor TM labeled antibody Alexa-488, And Alexa-568; Molecular Probes
  • Cell nuclei were stained with DAPI solution (1 ⁇ g / mL).
  • the H3P positive rate in cardiomyocytes was measured using In-Cell Analyzer 1000. Since histone H3 Ser-10 phosphorylation is closely related to chromatin aggregation observed during cell mitosis (Adamas, R, The Journal of Cell Biology, 153: p. 865-880, 2001) ), Used as a marker of cell division.
  • Fig. 3-1 The results are shown in Fig. 3-1 and Fig. 3-2. In this figure, None indicates unprocessed. Further, a micrograph of the cells subjected to the above immunostaining is shown in Fig. 3-3.
  • Example 5 Examination of the possibility of proliferation of cardiomyocytes in vivo Example 3 was performed to confirm whether the expression of miR-148a, miR-152, miR-373 causes proliferation of cardiomyocytes in vivo.
  • Recombinant viruses Ad-miR-148a, Ad-miR-152 and Ad-miR-373 (1 ⁇ 10 9 pfu / mL each) prepared in 1 above were opened, and Wistar rats (250 to 300 g) were opened and visually observed. A total of 200 ⁇ L was injected into a total of four apical regions using a 30G needle.
  • miR-141 As a negative control, miR-141 was used, and the target sequence was expressed as follows according to the method of Example 3, using human genomic DNA as a template: hsa-miR-141-F: 5'-caccgcagggatcctgggcctga-3 '(SEQ ID NO: 17) hsa-miR-141-R: 5'-cgggaagacaatggaggtgcct-3 '(SEQ ID NO: 18)
  • the PCR product was used as described in Example 3 to prepare Ad-miR-141, and Ad-miR-141 (1 ⁇ 10 9 pfu / mL) was used as a Wistar rat. (250-300 g) was opened, and a total amount of 200 ⁇ L was injected into a total of four apical regions using a 30 G needle.
  • ThermoSCIENTIFIC anti-Ki67 antibody
  • ThermoSCIENTIFIC anti-TroponinT antibody
  • Cell nuclei were stained and visualized in blue using DAPI.
  • DAPI and Troponin T co-positive cells are cardiomyocytes
  • Ki67 and Troponin T co-positive cells are cardiomyocytes with an advanced cell cycle, and the cell cycle progresses.
  • the percentage of cardiomyocytes in the blood was measured.
  • the number of cells measured in each individual was 300 or more.
  • FIG. 4 it was found that the proportion of Ki67 positive cardiomyocytes was clearly increased in the heart infected with miR-148a, miR-152 or miR-373 adenovirus. On the other hand, Ki67 positive cardiomyocytes were hardly observed in the heart infected with the negative control miR-141 adenovirus.
  • SEQ ID NO: 1 Seed sequence common to the 5 ′ side of the miR-148 family
  • SEQ ID NO: 2 Seed sequence common to the 5 ′ side of the miR-373 family
  • SEQ ID NO: 11 forward primer for amplifying the coding region of the miR-148a gene, hsa-miR-148a-F
  • SEQ ID NO: 12 reverse primer for amplifying the coding region of the miR-148a gene, hsa-miR-148a-R
  • SEQ ID NO: 13 forward primer for amplifying the coding region of the miR-152 gene, hsa-miR-152-F
  • SEQ ID NO: 14 reverse primer for amplifying the coding region of the miR-152 gene, hsa-miR-152-R
  • SEQ ID NO: 15 forward primer for amplifying the coding region of the miR-373 gene, hsa-miR-373-F
  • SEQ ID NO: 16 reverse primer for amplifying the

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Abstract

　本発明は、心筋細胞の増殖を促進するmiRNAを用いた心筋細胞の増殖方法、心臓疾患治療用ベクター及び心臓疾患治療用医薬組成物等を提供することを課題とする。　心筋細胞の増殖促進作用を有するmiRNAを用いた心筋細胞の増殖方法、当該miRNAを含有する心臓疾患治療用ベクター及び当該ベクターを含有する心臓疾患治療用医薬組成物等を提供する。miRNAとしては、特に成熟型miRNAであるmiR-148a、miR-148b、miR-152及びmiR-373並びに当該miRNAの前駆体、並びにこれらの変異体及び類似物質からなる群から選択されるmiRNAが望ましい。

Description

マイクロRNAを用いた心筋細胞の増殖方法
　本発明は、マイクロRNAを用いた心筋細胞の増殖方法、心臓疾患治療用ベクター及び心臓疾患治療用医薬組成物に関する。
　成体における心筋細胞は、細胞分裂能を失っているため、虚血や心筋炎等の各種ストレスに曝されることにより一旦壊死又は喪失すると、補充されることがない。その結果、残存する心筋細胞は代償性に肥大することにより、心機能を保とうとするが、その状態が持続し、心筋組織の許容範囲を超えてしまうと、更なる心筋細胞の疲弊や死滅が起こり、最終的には心筋機能の低下、即ち心不全を呈するようになる。
　心不全をはじめとする心臓疾患は、日本国の死亡原因の第2位となっている。また、心臓疾患患者の予後は極めて悪く、5年生存率は50％程度に過ぎない。そのため、有効な心不全治療法の開発は、医療福祉並びに医療経済の観点から、極めて有益であるものと考えられる。
　これまで心不全治療薬としては、心筋の収縮力を増加させるジギタリス製剤やキサンチン製剤等の強心剤が使用されてきたが、これらの薬剤を長期投与すると、むしろ病態を悪化させる場合もあることが知られている。また、最近では、β遮断薬やACE阻害薬等、交感神経系やレニン－アンジオテンシン系の亢進による過剰な心臓負荷を軽減する薬剤による治療が主流になってきているが、これらは対症的治療法に過ぎず、傷害を受けた心組織そのものを回復させるものではない。
　一方、心臓移植は重症心不全に対する根本的な治療法であるが、臓器提供者の不足や医療倫理、患者の肉体的又は経済的負担の重さ等の問題から、一般的な治療法として本法を用いることは難しい。
　マイクロRNA（以下「miRNA」という）は、細胞内に存在する長さ21～25塩基の非コードRNAである。線虫から哺乳類まで幅広く保存されており、生体内の様々な遺伝子の発現調節において重要な役割を担っている分子として近年注目されている。
　miRNAは、ゲノムDNA上に存在するmiRNA遺伝子から、まず数百～数千塩基程度のmiRNA一次転写産物（pri-miRNA）として転写される。次いで、核内でDroshaと呼ばれるRNase III酵素によってプロセシングされ、約70塩基程度のヘアピン構造を有する前駆体miRNA（pre-miRNA）となる。その後Exportin-5によって核から細胞質に輸送され、Dicerと呼ばれるRNase III酵素によってプロセシングを受けて、21～25塩基の二本鎖の成熟型miRNA（mature miRNA）となる。成熟型miRNAは、そのうちの一本鎖がRNA誘導性抑制複合体（RISC）と呼ばれるタンパク質と複合体を形成し、相補的配列を持つ標的遺伝子のmRNAに結合し、標的遺伝子の発現を抑制することが知られている（非特許文献1、2）。
　miRNAは1つの生物種あたり1000種類程度存在していると推測され、それぞれが複数の標的遺伝子の発現を調節し、タンパク質をコードする遺伝子全体の約1/3を制御していると言われている（非特許文献3）。また、miRNAは発生、分化、ウイルス感染の際の生体反応等に関与することが明らかになってきており、ヒトの疾患との関連も示唆されている。特に癌とmiRNAの関係に関しては、正常組織と癌組織で発現様式が異なるmiRNAが多く存在することから、発癌過程へのmiRNAの関与が強く示唆されており、発癌を促進するmiRNA、腫瘍を抑制するmiRNAの両方の存在が報告されている（非特許文献4、5、6）。
　また、心臓疾患関連としては、正常心臓と病態心臓におけるmiRNAの発現プロファイル解析が多くの研究グループによって報告されている。その一部は具体的な機能も解析されており、例えば、心肥大ではmiR-195の発現が増加しており、当該miRNAを強制発現させたトランスジェニックマウスでは、心臓が肥大し、拡張型心筋症や心不全を引き起こすこと（特許文献1、非特許文献7）、また、心肥大で発現が減少しているmiRNAであるmiR-1は心筋細胞の増殖を抑制すること（特許文献2、非特許文献8）等が報告されている。
WO2009/062169 WO2006/107826
He & Hannon, Nature Reviews Genetics, 5: 522-531, (2004) Bartel, Cell, 116:281-297, (2004) Berezikov et al., Cell, 120:21-24, (2005) Esquela-Kerscher & Slack, Nature Reviews Cancer, 6:259-269, (2006) Kent & Mendell, Oncogene, 25:6188-6196, (2006) Zhang et al., Developmental Biology, 302:1-12, (2007) van Rooij et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 103:18255-18260, (2006) Zhao et al., Cell, 129: 303-317, (2007)
　本発明は、心筋細胞の増殖を促進するmiRNAを同定し、当該miRNAを用いた心筋細胞の増殖方法、心臓疾患治療用ベクター及び心臓疾患治療用医薬組成物等を提供することを課題とする。
　上記課題を解決するために、本発明者らは、心筋細胞の増殖を調節する因子としてマイクロRNA（以下「miRNA」という）に着目して研究を行い、心筋細胞の増殖を調節するmiRNAに関する解析を行った。そして、鋭意研究の結果、本発明者らは、心筋細胞の増殖を調節する複数のmiRNAを特定することに成功し、本発明を完成するに到った。
　本発明の第1の態様として、本発明者らは、心筋細胞の増殖促進作用を有するmiRNAを提供する。より具体的には、本発明のmiRNAには、以下の態様が含まれる：
（1-1）心筋細胞の増殖促進作用を有するmiRNA。
（1-2）miRNAが、成熟型miRNA及び当該miRNAの前駆体、並びにそれらの変異体及び類似物質からなる群から選択される物質である、上記（1-1）に記載のmiRNA。
（1-3）miRNAが、SEQ ID NO: 1又はSEQ ID NO: 2からなるシード配列を含む物質である、上記（1-1）又は（1-2）に記載のmiRNA。
（1-4）SEQ ID NO: 1からなるシード配列を含む物質が、miR-148a（SEQ ID NO: 3）、miR-148b（SEQ ID NO: 5）、miR-152（SEQ ID NO: 7）及びそれらの前駆体、並びにそれらの変異体及び類似物質からなる群から選択される物質である、上記（1-3）に記載のmiRNA。
（1-5）SEQ ID NO: 2からなるシード配列を含む物質が、miR-373（SEQ ID NO: 9）及びその前駆体、並びにその変異体及び類似物質からなる群から選択される物質である、上記（1-3）に記載のmiRNA。
　本発明の第2の態様として、本発明者らは、（a）上述した心筋細胞の増殖促進作用を有するmiRNAを規定する核酸を使用して、心臓疾患を治療するための医薬組成物、（b）心筋細胞の増殖促進作用を有するmiRNAを規定する核酸を、個体の心臓の障害部位に導入することにより、当該部位において心筋細胞を増殖させることを特徴とする心臓疾患の治療方法、（c）心臓疾患の治療のための医薬の製造のための心筋細胞の増殖促進作用を有するmiRNAを規定する核酸の使用、又は（d）心臓疾患の治療において使用するための心筋細胞の増殖促進作用を有するmiRNAを規定する核酸、として記載することができる、心筋細胞の増殖促進作用を有するmiRNAの医薬用途についての発明を提供する。本発明において「miRNAを規定する核酸」という場合、（i）成熟型miRNA及び当該miRNAの前駆体、並びにそれらの変異体及び類似物質、又は（ii）成熟型miRNA及び当該miRNAの前駆体、並びにそれらの変異体及び類似物質を生体内又は細胞内において発現させるための発現ベクターのことをいう。
　上述した態様のうち（a）の医薬組成物の発明に関して、より具体的には、このような医薬組成物には、以下の態様が含まれる：
（2-a-1）心筋細胞の増殖促進作用を有するmiRNAを規定する核酸を含む、心臓疾患治療用医薬組成物。
（2-a-2）miRNAが、成熟型miRNA及び当該miRNAの前駆体、並びにそれらの変異体及び類似物質からなる群から選択される物質である、上記（2-a-1）に記載の医薬組成物。
（2-a-3）miRNAが、SEQ ID NO: 1又はSEQ ID NO: 2からなるシード配列を含む物質である、上記（2-a-1）又は（2-a-2）に記載の医薬組成物。
（2-a-4）SEQ ID NO: 1からなるシード配列を含む物質が、miR-148a（SEQ ID NO: 3）、miR-148b（SEQ ID NO: 5）、miR-152（SEQ ID NO: 7）及びそれらの前駆体、並びにそれらの変異体及び類似物質からなる群から選択される物質である、上記（2-a-3）に記載の医薬組成物。
（2-a-5）SEQ ID NO: 2からなるシード配列を含む物質が、miR-373（SEQ ID NO: 9）及びその前駆体、並びにその変異体及び類似物質からなる群から選択される物質である、上記（2-a-3）に記載の医薬組成物。
（2-a-6）心筋細胞の増殖促進作用を有するmiRNAを規定する核酸を、心筋細胞に導入及び発現させるための発現ベクター又はリポソームとして含む、上記（2-a-1）～（2-a-5）のいずれか１項に記載の医薬組成物。
（2-a-7）ベクターが、ウイルスベクター又は非ウイルス性発現ベクターである、上記（2-a-6）に記載の医薬組成物。
（2-a-8）ウイルスベクターが、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（AAV）ベクター、レトロウイルスベクター、日本血球凝集性ウイルス（HVJ；別名、センダイウイルス）ベクター、レンチウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、ニワトリポックスウイルスベクター、パポバウイルスベクターから選択されるものである、上記（2-a-7）に記載の医薬組成物。
（2-a-9）miRNAが、少なくとも一つの修飾ヌクレオシド間結合、少なくとも一つの修飾糖部分、少なくとも一つの修飾塩基、又はこれらの組合せを含む、miRNA誘導体である、上記（2-a-1）～（2-a-8）のいずれか１項に記載の医薬組成物。
（2-a-10）心臓疾患が、心筋梗塞、虚血性心疾患、うっ血性心不全、肥大型心筋症、拡張型心筋症、心筋炎又は慢性心不全である、上記（2- a-1）～（2-a-9）のいずれか１項に記載の医薬組成物。
　また、上述した態様のうち（b）の治療方法の発明に関して、より具体的には、このような治療方法には、以下の態様が含まれる：
（2-b-1）心筋細胞の増殖促進作用を有するmiRNAを規定する核酸を、個体の心臓の障害部位に導入することにより、当該部位において心筋細胞を増殖させることを特徴とする心臓疾患の治療方法。
（2-b-2）miRNAが、成熟型miRNA及び当該miRNAの前駆体、並びにそれらの変異体及び類似物質からなる群から選択される物質である、上記（2-b-1）に記載の治療方法。
（2-b-3）miRNAが、SEQ ID NO: 1又はSEQ ID NO: 2からなるシード配列を含む物質である、上記（2-b-1）又は（2-b-2）に記載の治療方法。
（2-b-4）SEQ ID NO: 1からなるシード配列を含む物質が、miR-148a（SEQ ID NO: 3）、miR-148b（SEQ ID NO: 5）、miR-152（SEQ ID NO: 7）及びそれらの前駆体、並びにそれらの変異体及び類似物質からなる群から選択される物質である、上記（2-b-3）に記載の治療方法。
（2-b-5）SEQ ID NO: 2からなるシード配列を含む物質が、miR-373（SEQ ID NO: 9）及びその前駆体、並びにその変異体及び類似物質からなる群から選択される物質である、上記（2-b-3）に記載の治療方法。
（2-b-6）心筋細胞の増殖促進作用を有するmiRNAを規定する核酸の、個体の心臓の障害部位への導入を発現ベクター又はリポソームにより行う、上記（2-b-1）～（2-b-5）のいずれか１項に記載の治療方法。
（2-b-7）ベクターが、ウイルスベクター又は非ウイルス性発現ベクターである、上記（2-b-6）に記載の治療方法。
（2-b-8）ウイルスベクターが、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（AAV）ベクター、レトロウイルスベクター、日本血球凝集性ウイルス（HVJ；別名、センダイウイルス）ベクター、レンチウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、ニワトリポックスウイルスベクター、パポバウイルスベクターから選択されるものである、上記（2-b-7）に記載の治療方法。
（2-b-9）miRNAが、少なくとも一つの修飾ヌクレオシド間結合、少なくとも一つの修飾糖部分、少なくとも一つの修飾塩基、又はこれらの組合せを含む、miRNA誘導体である、上記（2-b-1）～（2-b-8）のいずれか１項に記載の治療方法。
（2-b-10）心臓疾患が、心筋梗塞、虚血性心疾患、うっ血性心不全、肥大型心筋症、拡張型心筋症、心筋炎又は慢性心不全である、上記（2-b-1）～（2-b-9）のいずれか１項に記載の治療方法。
　また、上述した態様のうち（c）の使用の発明に関して、より具体的には、このような使用には、以下の態様が含まれる：
（2-c-1）心臓疾患治療用医薬組成物の製造のための心筋細胞の増殖促進作用を有するmiRNAを規定する核酸の使用。
（2-c-2）miRNAが、成熟型miRNA及び当該miRNAの前駆体、並びにそれらの変異体及び類似物質からなる群から選択される物質である、上記（2-c-1）に記載の使用。
（2-c-3）miRNAが、SEQ ID NO: 1又はSEQ ID NO: 2からなるシード配列を含む物質である、上記（2-c-1）又は（2-c-2）に記載の使用。
（2-c-4）SEQ ID NO: 1からなるシード配列を含む物質が、miR-148a（SEQ ID NO: 3）、miR-148b（SEQ ID NO: 5）、miR-152（SEQ ID NO: 7）及びそれらの前駆体、並びにそれらの変異体及び類似物質からなる群から選択される物質である、上記（2-c-3）に記載の使用。
（2-c-5）SEQ ID NO: 2からなるシード配列を含む物質が、miR-373（SEQ ID NO: 9）及びその前駆体、並びにその変異体及び類似物質からなる群から選択される物質である、上記（2-c-3）に記載の使用。
（2-c-6）心筋細胞の増殖促進作用を有するmiRNAを規定する核酸を、心筋細胞に導入及び発現させるための発現ベクター又はリポソームとして含む、上記（2-c-1）～（2-c-5）のいずれか１項に記載の使用。
（2-c-7）ベクターが、ウイルスベクター又は非ウイルス性発現ベクターである、上記（2-c-6）に記載の使用。
（2-c-8）ウイルスベクターが、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（AAV）ベクター、レトロウイルスベクター、日本血球凝集性ウイルス（HVJ；別名、センダイウイルス）ベクター、レンチウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、ニワトリポックスウイルスベクター、パポバウイルスベクターから選択されるものである、上記（2-c-7）に記載の使用。
（2-c-9）miRNAが、少なくとも一つの修飾ヌクレオシド間結合、少なくとも一つの修飾糖部分、少なくとも一つの修飾塩基、又はこれらの組合せを含む、miRNA誘導体である、上記（2-c-1）～（2-c-8）のいずれか１項に記載の使用。
（2-c-10）心臓疾患が、心筋梗塞、虚血性心疾患、うっ血性心不全、肥大型心筋症、拡張型心筋症、心筋炎又は慢性心不全である、上記（2- c-1）～（2-c-9）のいずれか１項に記載の使用。
　更に、上述した態様のうち（d）の核酸の発明に関して、より具体的には、このような核酸には、以下の態様が含まれる：
（2-d-1）心臓疾患の治療において使用するための心筋細胞の増殖促進作用を有するmiRNAを規定する核酸。
（2-d-2）miRNAが、成熟型miRNA及び当該miRNAの前駆体、並びにそれらの変異体及び類似物質からなる群から選択される物質である、上記（2-d-1）に記載の核酸。
（2-d-3）miRNAが、SEQ ID NO: 1又はSEQ ID NO: 2からなるシード配列を含む物質である、上記（2-d-1）又は（2-d-2）に記載の核酸。
（2-d-4）SEQ ID NO: 1からなるシード配列を含む物質が、miR-148a（SEQ ID NO: 3）、miR-148b（SEQ ID NO: 5）、miR-152（SEQ ID NO: 7）及びそれらの前駆体、並びにそれらの変異体及び類似物質からなる群から選択される物質である、上記（2-d-3）に記載の核酸。
（2-d-5）SEQ ID NO: 2からなるシード配列を含む物質が、miR-373（SEQ ID NO: 9）及びその前駆体、並びにその変異体及び類似物質からなる群から選択される物質である、上記（2-d-3）に記載の核酸。
（2-d-6）心筋細胞の増殖促進作用を有するmiRNAを規定する核酸を、心筋細胞に導入及び発現させるための発現ベクター又はリポソームとして含む、上記（2-d-1）～（2-d-5）のいずれか１項に記載の核酸。
（2-d-7）ベクターが、ウイルスベクター又は非ウイルス性発現ベクターである、上記（2-d-6）に記載の核酸。
（2-d-8）ウイルスベクターが、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（AAV）ベクター、レトロウイルスベクター、日本血球凝集性ウイルス（HVJ；別名、センダイウイルス）ベクター、レンチウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、ニワトリポックスウイルスベクター、パポバウイルスベクターから選択されるものである、上記（2-d-7）に記載の核酸。
（2-d-9）miRNAが、少なくとも一つの修飾ヌクレオシド間結合、少なくとも一つの修飾糖部分、少なくとも一つの修飾塩基、又はこれらの組合せを含む、miRNA誘導体である、上記（2-d-1）～（2-d-8）のいずれか１項に記載の核酸。
（2-d-10）心臓疾患が、心筋梗塞、虚血性心疾患、うっ血性心不全、肥大型心筋症、拡張型心筋症、心筋炎又は慢性心不全である、上記（2- d-1）～（2-d-9）のいずれか１項に記載の核酸。
　本発明の第3の態様として、本発明者らは、上述した心筋細胞の増殖促進作用を有するmiRNAを規定する核酸を使用した、心筋細胞の増殖方法を提供する。より具体的には、このような心筋細胞の増殖方法には、以下の態様が含まれる：
（3-1）心筋細胞の増殖促進作用を有するmiRNAを規定する核酸を、心筋細胞に導入して発現させることを特徴とする心筋細胞の増殖方法。
（3-2）miRNAが、成熟型miRNA及び当該miRNAの前駆体、並びにそれらの変異体及び類似物質からなる群から選択される物質である、上記（3-1）に記載の方法。
（3-3）miRNAが、SEQ ID NO: 1又はSEQ ID NO: 2からなるシード配列を含む物質である、上記（3-1）又は（3-2）に記載の方法。
（3-4）SEQ ID NO: 1からなるシード配列を含む物質が、miR-148a（SEQ ID NO: 3）、miR-148b（SEQ ID NO: 5）、miR-152（SEQ ID NO: 7）及びそれらの前駆体、並びにそれらの変異体及び類似物質からなる群から選択される物質である、上記（3-3）に記載の方法。
（3-5）SEQ ID NO: 2からなるシード配列を含む物質が、miR-373（SEQ ID NO: 9）及びその前駆体、並びにその変異体及び類似物質からなる群から選択される物質である、上記（3-3）に記載の方法。
（3-6）心筋細胞の増殖促進作用を有するmiRNAを規定する核酸を、発現ベクター又はリポソームを用いて心筋細胞へ導入することを含む、上記（3-1）～（3-5）のいずれか1項に記載の方法。
（3-7）ベクターが、ウイルスベクター又は非ウイルス性発現ベクターである、上記（3-6）に記載の方法。
（3-8）ウイルスベクターが、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（AAV）ベクター、レトロウイルスベクター、日本血球凝集性ウイルス（HVJ；別名、センダイウイルス）ベクター、レンチウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、ニワトリポックスウイルスベクター、パポバウイルスベクターから選択されるものである、上記（3-7）に記載の方法。
（3-9）miRNAが、少なくとも一つの修飾ヌクレオシド間結合、少なくとも一つの修飾糖部分、少なくとも一つの修飾塩基、又はこれらの組合せを含む、miRNA誘導体である、上記（3-1）～（3-8）のいずれか1項に記載の方法。
　本発明に係るmiRNAを用いることにより、心筋細胞の増殖方法、心臓疾患治療用ベクター及び心臓疾患治療用医薬組成物を提供することができる。本発明に係る心筋細胞の増殖方法を用いれば、従来法よりも効率的に心筋細胞の細胞分裂を誘導し、細胞を増殖させることができ、当該方法により作製された心筋細胞は、各種薬剤のスクリーニング用及び移植治療用の細胞として利用することができる。また、当該方法を遺伝子治療に応用することにより、心筋細胞の壊死や欠失等に起因する心臓疾患の再生医療的治療の可能性が得られた。本発明に係るmiRNAは、心筋細胞に対して顕著に増殖活性を示すことが明らかになった。
図1は、実施例2において、miR-148a（SEQ ID NO: 3）、miR-152（SEQ ID NO: 7）、miR-373（SEQ ID NO: 9）をトランスフェクションした初代培養心筋細胞におけるKi67陽性心筋細胞率を示す図である。Ki67は、細胞核タンパク質であり、増殖細胞を検出するためのマーカーとして用いらるタンパク質である。 図2は、実施例3において、miR-148a（SEQ ID NO: 3）、miR-152（SEQ ID NO: 7）、miR-373（SEQ ID NO: 9）を発現する組換えアデノウイルスを感染させた初代培養心筋細胞におけるKi67陽性心筋細胞率を示す図である。Noneは未処理を示す。 図3-1は、実施例4において、miR-148a（SEQ ID NO: 3）、miR-152（SEQ ID NO: 7）、miR-373（SEQ ID NO: 9）をトランスフェクションした初代培養心筋細胞におけるリン酸化ヒストンH3（H3P）陽性心筋細胞率を示す図である。 図3-2は、実施例4において、miR-148a（SEQ ID NO: 3）、miR-152（SEQ ID NO: 7）、miR-373（SEQ ID NO: 9）を発現する組換えアデノウイルスを感染させた初代培養心筋細胞におけるH3P陽性心筋細胞率を示す図である。Noneは未処理を示す。 図3-3は、実施例4において、miR-148a（SEQ ID NO: 3）、miR-152（SEQ ID NO: 7）、miR-373（SEQ ID NO: 9）を発現する組換えアデノウイルスを感染させた初代培養心筋細胞を抗H3P抗体、抗TroponinT抗体、DAPIで免疫染色した細胞の顕微鏡写真である。H3P:緑、TroponinT:赤、DAPI:青 図4は、実施例5において、miR-148a（SEQ ID NO: 3）、miR-152（SEQ ID NO: 7）、miR-373（SEQ ID NO: 9）を発現する組換えアデノウイルスを生体内においてラット心臓に感染させた心臓組織切片におけるKi67陽性心筋細胞率を示す図である。
　本発明の実施において、分子生物学、微生物学、細胞生物学及び組換えDNA技術等の一般的方法及び従来技術について、当業者は、特に示されなければ、当該分野の標準的な参考書籍を参照し得る。これらには、例えば、Molecular Cloning：A Laboratory Manual 第3版（Sambrook & Russell, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001）；Current Protocols in Molecular biology（Ausubelら編、John Wiley & Sons, 1987）；Methods in Enzymologyシリーズ（Academic Press）；PCR Protocols: Methods in Molecular Biology（Bartlett & Striling編、Humana Press, 2003）；Animal Cell Culture: A Practical Approach 第3版（Masters編、Oxford University Press, 2000）；Antiboides：A Laboratory Manual（Harlowら＆ Lane編、Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1987）を参照できる。また、本明細書において参照される細胞培養、細胞生物学実験のための試薬及びキット類は市販されており（Sigma社、Aldrich社、Invitrogen/GIBCO社、Clontech社、Stratagene社等から）容易に入手することができる。
　本発明は、第1の態様として、心筋細胞の増殖促進作用を有するmiRNAを提供する。
　本発明は、第2の態様として、上述した心筋細胞の増殖促進作用を有するmiRNAを規定する核酸を使用して、心臓疾患を治療するための医薬組成物；心筋細胞の増殖促進作用を有するmiRNAを規定する核酸を、個体の心臓の障害部位に導入することにより、当該部位において心筋細胞を増殖させることを特徴とする心臓疾患の治療方法；心臓疾患治療用医薬組成物の製造のための心筋細胞の増殖促進作用を有するmiRNAを規定する核酸の使用；そして心臓疾患の治療において使用するための、心筋細胞の増殖促進作用を有するmiRNAを規定する核酸；もまた提供する。
　本発明は、第3の態様として、上述した心筋細胞の増殖促進作用を有するmiRNAを規定する核酸を使用した、心筋細胞の増殖方法を提供する。
　心筋細胞
　本発明に係る方法を用いて増殖させる対象とする心筋細胞は、一般に、成体型心筋細胞、幼体型心筋細胞、並びに胎児型心筋細胞のすべての発生段階の心筋細胞を含んでもよい。そして、本発明においては、哺乳動物の心臓組織内に存在する心筋細胞を直接の対象とすることができるが、本発明の第1の態様及び第3の態様においては、生体外の培養心筋細胞等を使用することもできる。
　本発明において、生体外の培養心筋細胞としては、どのような供給源由来の心筋細胞であっても使用することができ、例えば、生体心臓組織から酵素処理等の種々の方法により分離した心筋細胞、又はそれを適当な培養条件下で1～5日間程度培養した初代培養細胞も用いることができる。具体的な心筋細胞の培養法は数多くの参考文献に記載されているが、代表的な方法としては、Chienの方法及びその変法（Chien et al., The Journal of Clinical Investigation, 75:1770-1780, (1985)；Meidell et al., American Journal of Physiology, 251:H1076-H1084, (1986)；Tamamori et al., American Journal of Physiology, 275:H2036-H2040, (1998)）等を使用することができる。
　また、培養心筋細胞としては、上記の例に限らず、各種幹細胞から分化誘導して得られた心筋細胞もまた含まれる。本発明の実施に用いられる幹細胞とは、試験管内培養下で心筋細胞様形質を有する細胞に分化し得る性質を有した細胞を意味し、具体的には、既に培養細胞として広く使用されているマウス、サル、ヒト等の哺乳動物由来の胚性幹細胞（ES細胞）や人工多能性幹細胞（iPS細胞）、胚性生殖細胞（EG細胞）等の多能性幹細胞を挙げることができる。これらの細胞の作製、継代、保存法については、既に標準的なプロトコールが確立されており、当業者は、複数の参考書籍、例えば、Manipulating the Mouse Embryo：A laboratory manual（Hoganら編、Cold Spring Harbor Laborayory Press, 1994）や、Embryonic Stem Cells（Turksen編、Humana Press, 2002）、及び複数の参考文献（Matsui et al., Cell, 70:841-847, (1992)；Shamblott et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 95:13726-13731, (1998)；Okita et al., Nature, 448:313-317, (2007)； Takahashi et al., Cell, 131:861-872, (2007)）を参照することにより、これらの多能性幹細胞を容易に使用することができる。本発明に用いることができる幹細胞は、上述した幹細胞に限らず、ES細胞と類似の形質を有する幹細胞であればいずれであっても使用することができる。この場合、ES細胞と類似の形質とは、ES細胞に特異的な表面（抗原）マーカーの存在やES細胞特異的な遺伝子の発現、更にはテラトーマ（teratoma）形成能やキメラマウス形成能といった、ES細胞に特異的な細胞生物学的性質をもって定義することができる。
　また、ES細胞と類似の形質を有さない細胞又は多能性幹細胞ではない細胞であっても、少なくとも試験管内培養下で心筋細胞様形質を有する細胞に分化し得る性質を有した細胞であれば、本発明に記載の方法を用いることができる。この様な細胞の例として、骨髄細胞に由来する骨髄間葉系幹細胞（Bruder et al., USP 5,736,396；Pittenger et al., Science, 284:143-147, (1999)）やCMG細胞（Makino et al., The Journal of Clinical Investigation, 103:697-705, (1999)；WO01/048151）、筋組織に由来するSpoc細胞（WO03/035382）等の細胞を例として挙げることができる。
　本発明において、幹細胞から心筋細胞を作製する培養法としては、心筋細胞の分化誘導に適した方法であれば、いずれの培養法であっても用いることができる。具体的な分化誘導法については、既に複数の方法が確立されており、当業者であれば、例えば、Embryonic Stem Cells（Turksen編、Humana Press, 2002）の様な参考書籍や、複数の参考文献（Klug et al., The Journal of Clinical Investigation, 98:216-224, (1996)；Wobus et al., Journal of Molecular and Cellular Cardiology, 29:1525-1539, (1997)；Kehat et al., The Journal of Clinical Investigation, 108:407-414, (2001)； Xu et al., Circulation Research, 91:501-508, (2002)；Takahashi et al., Circulation, 107:1912-1916, (2003)；Field et al., USP 6,015,671；Xu et al., WO03/06950）を参照することにより、幹細胞から心筋細胞を分化誘導することができる。
　マイクロRNA（miRNA）
　本発明は、心筋細胞の増殖促進作用を有するマイクロRNA（miRNA）を提供する。本発明に係るmiRNAとしては、心筋細胞の増殖を促進するものであれば、どのようなmiRNAであってもよく、上記心筋細胞を増殖させるために使用することができる。
　本発明において、miRNAとは哺乳類を含む真核生物で非常に多く発現しているタンパク質をコードしない小さなRNAのことであり、発生、分化、増殖など様々な生命現象に関与していると考えられている。本発明において使用することができるmiRNAとしては、成熟型miRNA及び当該miRNAの前駆体、並びにそれらの変異体及び類似物質が含まれる。本発明に係るmiRNAは、一本鎖であってもよいし、二本鎖であってもよい。
　本発明において、成熟型miRNAとは完全にプロセシングされたmiRNAのことであり、15から30ヌクレオチドの長さ（多くは21から25ヌクレオチドの長さ）である。成熟型miRNAは、成熟型miRNA分子の5’側の1から12までのヌクレオチドのうちの少なくとも6個の連続するヌクレオチドを共有する（当該ヌクレオチド部分は「シード領域」とも呼ばれる（Brennecke et al., PLoS Biology, 3:e85, (2005)）、一群のmiRNAからなるmiRNAファミリーを構成することができる。従って、miRNAファミリーには、成熟型miRNAの5’領域が同一であるが、3’側は異なる、複数の成熟型miRNAが含まれる。同じmiRNAファミリーに属していれば3’側領域の核酸配列が異なっていても同様の機能を有することは、例えば、Bagpipe 3’UTR中にある1か所の8-merのシード領域の配列（シード配列）に関して報告されており（Brennecke et al., PLoS Biology, 3:e85, (2005)）、この事例の場合、前述した1か所の8-merのシード領域の配列が結合する配列と相補的な配列を5’領域に共有するmiRNAファミリーを構成するmiRNAの中の2つの異なるmiRNAが、3’側が異なるにも拘わらず、8-merターゲットを含むレポーター遺伝子の発現を抑制できることが報告されている。
　miRNAの前駆体とは、成熟型miRNAの前駆体RNAである。成熟型miRNAを作製する過程において、生細胞内においては、miRNAは、ゲノムDNA上に存在するmiRNA遺伝子から、まず数百～数千塩基程度のmiRNA一次転写産物（pri-miRNA）が転写され、それが核内でDroshaと呼ばれるRNase III酵素によってプロセシングされ、約70塩基程度のヘアピン構造を有する前駆体miRNA（pre-miRNA）となる。従って、本発明においてmiRNAの前駆体という場合、miRNA一次転写産物（pri-miRNA）及び前駆体miRNA（pre-miRNA）が含まれる。
　miRNA変異体とは、生体が元々持っている成熟型miRNA又は成熟型miRNAの前駆体と比較して、1又は数個のヌクレオチドが欠失、置換、挿入又は付加されたmiRNAである。ここで数個とは、例えば7～6個まで、好ましくは5～4個まで、更に好ましくは3～1個までである。上述したように、miRNAファミリーを構成する成熟型miRNA分子の5’側には、「シード領域」が存在し、同じmiRNAファミリーに属していれば3’側領域の核酸配列が異なっていても同様の機能を有する。従って、miRNA変異体は、成熟型miRNAのシード領域以外の部分において、ヌクレオチドが欠失、置換、挿入又は付加されたmiRNAであることが好ましい。
　miRNA類似物質とは、内在性の成熟型miRNA又は成熟型miRNAの前駆体を模倣するように合成されたmiRNAである。当該物質は市販されており（例えば、Ambion社から）容易に入手することができる。
　本発明のmiRNAは、その安定性を高めるために、例えば、核酸誘導体及び／又は改変型ヌクレオシド間結合を有する核酸が用いられる。これらの核酸誘導体は、公知のものを適宜選択して用いることができる。具体的には、例えば、メチルホスホネート（methylphosphonate）、ホスホロチオエート（phosphorothioate）、ホスホロジチオエート（phosphorodithioate）、ホスホラミデート（phosphoramidate）、ホスホトリエステル(phosphotriester)、スルホン(sulfone)、シロキサン（siloxane）、カルボネート（carbonate）、カルボキシメチルエステル（carboxymethylester）、アセトアミデート（acetamidate）、カルバメート(carbamate)、チオエーテル（thioether）、架橋型ホスホラミデート（bridged phosphoramidate）、架橋型メチレンホスホネート（bridged methylene phosphonate）、架橋型ホスホロチオエート（bridged phosphorothioate）、ジメチレン-スルフィド(dimethylene-sulfide)、ジメチレン-スルホキシド(dimethylene-sulfoxide)、ジメチレン-スルホン(dimethylene-sulfone)、2'-O-アルキル(2'-O-alkyl)、及び2'-デオキシ-2'-フルオロホスホロチオエート(2'-deoxy-2'-fluoro phosphorothioate)のヌクレオシド間結合を含む核酸等が挙げられる（Uhlmann & Peyman, Chemical Reviews, 90:543-584, (1990)、Schneider et al., Tetrahedron Letters, 31:335-338, (1990)）。更には、Locked Nucleic Acid（Koshkin et al., Journal of the American Chemical Society, 120:13252-13253 (1998)）やENA（US7335765）等の誘導体も挙げられる。このような核酸誘導体及び／又は改変型ヌクレオシド間結合を有するmiRNAを、本発明においてはmiRNA誘導体と呼ぶ。miRNA誘導体には、成熟型miRNAの誘導体、miRNAの前駆体の誘導体、miRNA変異体の誘導体、及びmiRNA類似物質の誘導体が含まれる。
　本発明において使用することができるmiRNAは、例えば、公知の手法を用いて、天然物から単離することにより、化学的に合成することにより、又は遺伝子組換え技術的に産生させることにより取得することができ、また、市販品として入手することもできる。例えば、成熟型miRNAは、Sanger miRbaseに登録されており、この登録されている全てのmiRNAは、Ambion社、Qiagen社、Sigma社、Thermo Scientific社等から入手することができる。
　miRNAを生体内の細胞又はin vitroにおける細胞の細胞内に送達するための手段としては、発現ベクター又はリポソームなど、当該技術分野において通常使用されている遺伝子送達手段のいずれであっても使用することができる。上記の成熟型miRNA又はmiRNAの前駆体は、オリゴ核酸若しくは誘導体の形で使用することも可能であるが、その発現効率や効果持続期間等の面から、発現ベクターに組み込んだ形で使用することが好ましい。
　遺伝子送達手段として発現ベクターを使用する場合、miRNAを発現し得るプロモーターを有したものであればどのようなものであってもよく、ウイルス性発現ベクター又は非ウイルス性の発現ベクターを使用することができる。
　ウイルス性発現ベクターとしては、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（AAV）、レトロウイルス、日本血球凝集性ウイルス（HVJ；別名、センダイウイルス）、レンチウイルス、ワクシニアウイルス、ニワトリポックスウイルス、SV40を代表とするパポバウイルス等に由来するベクターが例示されるが、好ましくは、アデノウイルスベクターやAAVベクター、HVJベクター、又はレンチウイルスベクターを使用することによって、効率的な遺伝子導入と導入した遺伝子の高レベル発現を行うことができる。
　これらのウイルスベクターによる遺伝子の導入は、哺乳動物の細胞に遺伝子を導入する最も強力な方法の一つであり、事実上、全ての種類のヒト細胞及び多くの非ヒト細胞に導入するために使用できる。
　また、これらのウイルスによる感染は細胞周期に依存しないため、様々な初代培養細胞系及び形質転換細胞系で遺伝子を発現させることができる。特に心筋細胞のようにDNA合成や細胞分裂を起こさない細胞でも効率良く遺伝子導入ができる。感染後に多くの細胞が組換えDNA（又はRNA）のコピーを複数受け取ることから、導入された遺伝子は一時的に高レベルに発現する。
　アデノウイルスベクターやHVJベクター等の場合、通常、DNA/RNAは細胞質にとどまり、核に取りこまれることはない。そのため、これらのウイルスベクターを使用した場合には、外来遺伝子が宿主細胞ゲノムに組込まれた時にランダムに発生する突然変異誘発性のエラーは殆ど生じないという利点もある。
　本発明の好ましい形態の1つとして用いられるアデノウイルスベクターは、ヒト胎児腎臓293細胞又は大腸菌を宿主とした相同組換えを用いた方法（Miyake et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 93:1320-1324, (1996)）や、簡単なin vitroライゲーションによる方法（Mizuguchi & Kay, Human Gene Therapy, 9:2577-2583, (1998)）により調製することができる。
　アデノウイルスは二本鎖DNAゲノムを有するDNAウイルスの一つであり、最も良く研究されているのは、ヒトのアデノウイルス5型と2型である。これらの野生型アデノウイルスのE1及びE3遺伝子の大部分を欠失することにより、複製能のないウイルスベクターを作製することができ、ウイルス粒子形成に有害な作用を及ぼすことなく、数kbの外来DNAを挿入することが可能となる。当該組換えアデノウイルスは、転写調節因子であるE1遺伝子を欠いているが、挿入した遺伝子特異的な転写ユニットによって、標的細胞の増殖や、その他のウイルス遺伝子の有無に依存せずに、挿入した目的遺伝子のみを発現させることができる。
　アデノ随伴ウイルス（AAV）は、パルボウイルス科に属する約4.7 kbの一本鎖DNAウイルスであり、1型から12型の血清型のAAVが知られている。AAVベクターは両端のITR（Inverted terminal repeat）にはさまれたRep（複製や組み込みに関与）とCap（カプシド）を目的遺伝子と置換することで作られる。このベクターをRep、Capを発現するプラスミドと共に293細胞に導入し、さらにアデノウイルスをヘルパーウイルスとして感染させ、核内に蓄積された組換えアデノ随伴ウイルスベクターを調整する。最近ではE1A、E1Bを発現する293細胞にE2A、E4、VAを発現するプラスミドを導入することでヘルパーウイルスを必要としない方法も開発されている。
　センダイウイルス（Sendai virus；SeV）はパラミクソウイルス属に属するげっ歯類のウイルスであり、別名、日本血球凝集性ウイルス（Hemagglutinating Virus of Japan；HVJ）とも呼ばれる。　SeVのゲノムはマイナス一本鎖RNA（mRNAと相補的）からなり、核蛋白（NP）、核蛋白リン酸化酵素（P）、ウイルス表面裏打ち蛋白（M）、赤血球凝集蛋白（HN）、膜融合蛋白（F）、及びRNA合成酵素（L）の6つの遺伝子をコードする。SeVはHN（hemaglutination-neuraminidase）蛋白により宿主細胞のシアル酸に吸着・分解することにより結合し、ゲノムを細胞質内に注入する。細胞内に移行したウイルスゲノムは自らがコードするL蛋白の働きにより遺伝子の転写・複製を行う。このステップは通常のウイルスと異なり細胞質で行われ、ウイルスゲノムが核内に移行することはない。
　SeVベクターは、導入細胞内でのベクターの自律複製に必要なN、P、L遺伝子以外のF、HN、M遺伝子を一つもしくは複数欠損させることにより、非伝播性ベクターとして作製することができる。F遺伝子欠失型ベクターは、バクテリオファージT7由来RNAポリメラーゼにより認識されるT7プロモーター下流に組換えベクターcDNAを挿入したプラスミド、T7プロモーター支配下でのN、P、F、L発現プラスミド、さらにT7 RNAポリメラーゼ発現組換えワクチニアウイルスを用い、サル腎由来LLC-MK2細胞に導入することにより作製されるが、最近では、6種のプラスミド（T7プロモーター下流に組換えベクターcDNAを挿入したプラスミドとCAGプロモーター支配下でのN、P、L、F、T7 RNAポリメラーゼ遺伝子発現プラスミド）のトランスフェクションのみによる簡便な作製法も可能となっている。
　アデノウイルスベクター及び他のウイルスベクターの総説、並びに作製法や使用法に関して、当業者は、複数の参考書籍を参照することができる。例えば、Gene Therapy Protocols: Methods in Molecular Medicine（Robbins編、Humana Press, 1997）、Gene Transfer in Cardiovascular System: Experimental Approaches & Therapeutic Implications（March編、Kluwer Academic Publishers, 1997）、Adenoviral Vectors for Gene Therapy（Curiel & Douglas編、Academic Press, 2002）等を挙げることができる。また、アデノウイルスベクターを作製するためのキットも市販されており（Invitrogen社のViraPowerTM アデノウイルス発現システム（#K4930）、タカラバイオ社のAdenovirus Expression Vector Kit（#6170）等から）容易に入手することができ、本発明の実施に利用可能である。
　また、AAVベクターやSeVベクターを作製するためのキットも市販されており（AAV Helper-Freeシステム（Stratagene社；#240071）、組換えセンダイウイルスミニベクター調製キット（MBL社；DV-0001）等）、容易に入手することができ、本発明の実施に利用可能である。
　非ウイルス性発現ベクターとしては、例えば、SV（Simian virus）40ウイルスプロモーター、サイトメガロウイルス（Cytomegaro virus；CMV）プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（Rous sarcoma virus）プロモーター等のウイルスに由来するプロモーター、β-アクチン・プロモーター、EF（elongation factor）1α・プロモーター等、トリβ-アクチン・プロモーターにCMVのエンハンサー及びウサギβ-グロビン遺伝子のポリA付加シグナル配列を組み込んだハイブリッド・プロモーターであるCAGプロモーター（Niwa et al., Gene, 108:193-199, (1991)）、及びPol.IIIプロモーターであるU6又はH1プロモーター等を有するベクターが挙げられるが、これらのベクターに限定されない。これらのプロモーターを利用可能な発現ベクターは、市販されており（Ambion社、Invitrogen社、TAKARA BIO社等から）容易に入手することができる。
　上記の遺伝子又は遺伝子ベクターの導入のための方法としては、公知の方法が全て使用可能であり、例えばリン酸カルシウムや電気パルスを用いたトランスフェクション法や、リポソーム等に目的の遺伝子を封入した上で細胞にトランスフェクションする方法、及びレトロウイルスやアデノウイルス等のウイルスベクターに目的の遺伝子を組み込み、当該組換えウイルスを細胞に感染させる方法等が挙げられる。この場合、ウイルスベクターとは、ウイルスDNA又はRNAの全長若しくは一部を欠損・変異させた核酸配列に、目的とする遺伝子を組み込み、発現することができる様にした構築物である。
　リポソームの具体例としては、N-［2,3-（ジオレイルオキシ）プロピル］-N,N,N-トリメチルアンモニウムクロリド（DOTMA）やジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（DOPE）等を含む脂質製剤を使用することができる。
　具体的なmiRNAの取得
　本発明者らは、心筋細胞に導入した際に顕著なBrdUの取り込み能力を示すか否かに基づいて、成熟型miRNAのライブラリーを検索したところ、心筋細胞の増殖促進作用を有する成熟型miRNAとして、miR-148a（SEQ ID NO: 3）、miR-148b（SEQ ID NO: 5）、miR-152（SEQ ID NO: 7）、及びmiR-373（SEQ ID NO: 9）等を見出し、これらをさらなる実験に使用した。
　本発明において使用することができる好ましいmiRNAとして、これらの成熟型miRNAの前駆体もまた、含まれる。例えば、成熟型miRNAの前駆体としては、各miRNAのmiRNA一次転写産物（pri-miRNA）又は前駆体miRNA（pre-miRNA）等を例として挙げることができる。その具体例としては、例えば、前述した具体的な成熟型miRNAをコードする遺伝子の一次転写産物（pri-miRNA）である、以下のものが、本発明において使用することができる好ましいmiRNAに含まれる：mir-148a（miR-148aの前駆体、SEQ ID NO: 4）、mir-148b（miR-148bの前駆体、SEQ ID NO: 6）、mir-152（miR-152の前駆体、SEQ ID NO: 8）、及びmir-373（miR-373の前駆体、SEQ ID NO: 10）。
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 　本発明において使用することができるmiRNAには、上記の表1に示した成熟型miRNA及び前駆体miRNAの変異体や類似物質、又は上記の表1に示したmiRNAの前駆体以外のmiRNAの前駆体（例えば、miRNA一次転写産物（pri-miRNA）など）及びその変異体や類似物質も含まれる。
　例えば、本発明において使用することができる成熟型miRNAであるmiR-148a（SEQ ID NO: 3）、miR-148b（SEQ ID NO: 5）及びmiR-152（SEQ ID NO: 7）は、それぞれのmiRNAの5’側に共通のシード配列、ucagugca（SEQ ID NO: 1）を有し、miR-148ファミリーを構成する。以下にmiR-148ファミリーに属するmiRNAの各配列を並べて示す。保存されているシード配列に下線を付す。
　miR-148a：ucagugcacuacagaacuuugu（SEQ ID NO: 3）
　miR-148b：ucagugcaucacagaacuuugu（SEQ ID NO: 5）
　miR-152：ucagugcaugacagaacuugg（SEQ ID NO: 7）。
　従って、本発明のmiRNAの一つとして、ucagugca（SEQ ID NO: 1）からなるシード配列を5'末端に含む成熟型miRNA若しくは当該miRNAの前駆体、又はそれらの変異体若しくは類似物質が含まれる。これらのmiRNAには、miR-148a（SEQ ID NO: 3）、miR-148b（SEQ ID NO: 5）、miR-152（SEQ ID NO: 7）及び当該miRNAの前駆体、並びにそれらの変異体及び類似物質からなる群から選択されるmiRNAが含まれる。例えば、成熟型miRNAであるmiR-148a（SEQ ID NO: 3）、miR-148b（SEQ ID NO: 5）、及びmiR-152（SEQ ID NO: 7）の前駆体としては、各miRNAのpri-miRNA、pre-miRNA等が挙げられる。その具体例としては、例えば、それぞれ下記のSEQ ID NO: 4、6そして8で表される前駆体が挙げられる。
　ヒトmir-148a：gaggcaaagu ucugagacac uccgacucug aguaugauag aagucagugc acuacagaac uuugucuc（SEQ ID NO: 4）
　ヒトmir-148b：caagcacgau uagcauuuga ggugaaguuc uguuauacac ucaggcugug gcucucugaa agucagugca ucacagaacu uugucucgaa agcuuucua（SEQ ID NO: 6）
　ヒトmir-152：uguccccccc ggcccagguu cugugauaca cuccgacucg ggcucuggag cagucagugc augacagaac uugggcccgg aaggacc（SEQ ID NO: 8）。
　また、本発明おいて使用することができる別の成熟型miRNAであるmiR-373は、そのmiRNAの5’側に共通のシード配列、gaagugcu（SEQ ID NO: 2）を有し、miR-373ファミリーを構成する。miR-373ファミリーに属するmiRNAの配列を示す。シード配列に下線を付す。
　miR-373：gaagugcuucgauuuuggggugu（SEQ ID NO: 9）。
　従って、本発明のmiRNAの一つとして、gaagugcu（SEQ ID NO: 2）からなるシード配列を5'末端に含む成熟型miRNA若しくは当該miRNAの前駆体、又はそれらの変異体若しくは類似物質が含まれる。これらのmiRNAには、miR-373（SEQ ID NO: 9）及び当該miRNAの前駆体、並びにそれらの変異体及び類似物質からなる群から選択されるmiRNAが含まれる。例えば、成熟型miRNAであるmiR-373（SEQ ID NO: 9）の前駆体としては、そのmiRNAのpri-miRNA、pre-miRNA等が挙げられる。その具体例としては、例えば、下記のSEQ ID NO: 10で表される前駆体が挙げられる。
　ヒトmiR-373：gggauacuca aaaugggggc gcuuuccuuu uugucuguac ugggaagugc uucgauuuug ggguguccc（SEQ ID NO: 10）。
　この様にして得られた本発明に係るmiRNAは、心筋細胞に対して顕著に増殖活性を示すことが明らかになった。
なお、本発明に係るmiRNAは、正常細胞の株化細胞であるMRC-5(ヒト胎児肺由来）細胞、WI-38(ヒト胎児肺由来）細胞及びMC3T3-E1(マウス頭蓋冠由来）細胞等に対しては、有意な増殖促進活性を示さなかった。
　遺伝子治療法としての適用
　本発明の別の態様として、本発明の実施に用いる、ウイルスベクター又は非ウイルス性ベクターなどの発現ベクターであって心筋細胞の増殖促進作用を有するmiRNAを規定する核酸を含むもの（以下、単に「遺伝子発現ベクター」という）、好ましくはウイルスベクター、更に好ましくはアデノウイルスベクター又はHVJベクター、AAVベクター、レンチウイルスベクター等を含む、遺伝子治療用医薬組成物が提供される。遺伝子発現ベクター中に含まれるmiRNAを規定する核酸は、既に説明した「具体的なmiRNAの取得」の項において説明されたmiRNAを規定する核酸であればどのようなものであってもよい。この遺伝子治療用医薬組成物は、心筋細胞の増殖促進作用を有するmiRNAを規定する核酸を含むことから、miRNAの作用により、心筋再生薬又は心臓疾患治療薬として用いることができる。治療の対象となる心臓疾患としては、心筋細胞の衰弱、機能停止又は死滅を伴うものであれば特にこれを限定しないが、具体例としては心筋梗塞、虚血性心疾患、うっ血性心不全、肥大型心筋症、拡張型心筋症、心筋炎、慢性心不全等を挙げることができる。
　医薬組成物の剤形は特に限定されず、慣用的方法により製剤化することができる。例えば、滅菌水や緩衝化生理食塩水等の薬学的に受容可能な薬剤キャリアや希釈液中に、本発明の遺伝子発現ベクターを含む注射可能な調製物の形態であってもよい。薬剤キャリアとしては、その他に適当な安定剤（例えば、ヌクレアーゼ阻害剤等）、キレート剤（例えば、EDTA等）、及び／又はその他の助剤も含むことができる。上記成分を含む医薬組成物は、必要に応じてろ過等の方法により滅菌し、無菌アンプル等の容器に満たすことができる。
　本発明の医薬組成物の投与量は、患者の年齢、性別、体重、症状、及び投与経路等の条件に応じて適宜増減して用いる必要があるが、当業者であれば、必要な用量を適宜、設定することが可能である。一般的には、成人1回当たりは有効成分のDNA量として1.0μg/kg～1.0 g/kg程度の範囲であり、好ましくは10μg/kg～100 mg/kg程度の範囲である。又、アデノウイルスベクター等のウイルスベクターを用いる場合、ウイルスの最終的な力価は、好ましくは107～1013pfu/mL、更に好ましくは109～1012 pfu/mLであることが望ましい。
　本発明の医薬組成物は、遺伝子発現ベクターが非ウイルス性ベクターに基づくものである場合に特に、リポソームとの複合体として供給してもよい。この様な形態によって、特に心筋細胞において高いトランスフェクション効率を実現できる可能性がある。リポソームの具体例としては、N-［2,3-（ジオレイルオキシ）プロピル］-N,N,N-トリメチルアンモニウムクロリド（DOTMA）やジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（DOPE）等を含む多くの新しい脂質製剤が開発され、様々な細胞系を用いたトランスフェクションが試験されている（Banerjee, Journal of BiomaterialsApplications, 16:3-21, (2001)；Maurer et al., Expert Opinion on Biological Therapy, 1:923-947, (2001)）。また、HVJ由来の融合形成性エンベロープを持つ融合形成性ウイルスリポソームを用いた方法、いわゆるHVJ-リポソーム法（Yonemitsu et al., International Journal of Oncology, 12:1277-1285, (1998)；Kaneda et al., Molecular Medicine Today, 5:298-303, (1999)）も有効である。これらの核酸導入を目的としたリポソームは市販されており、特にmiRNAの導入を対象としたものとしては、Lipofectamine RNAi MAX（Invitrogen社）、Oligofectamine（Invitrogen社）、siLentFect（BIO-RAD社）、HiPerFect（Qiagen社）等が利用できる。
　上記の遺伝子発現ベクター又はそれを含む医薬組成物は、心臓疾患患者の心臓の全体に導入しても良いが、障害部位に限局した導入を行うことが好ましい。本発明において障害部位とは、個体（ヒト又は非ヒト動物：以下同じ）における心筋細胞が衰弱、機能停止若しくは死滅した部位及びその近傍領域、又は個体における心筋細胞の衰弱、機能低下の進行若しくは死滅が予想される部位を意味する。この場合、遺伝子発現ベクター又はそれを含む医薬組成物を障害部位に導入する方法としては、浸透ポンプや浸透チューブ等を用いて、製剤を連続的に障害部位へ輸送することも可能であるが、開胸した上で注射器を用いて直接的に心臓に注入する方法や、X線透視下でカテーテルを用いて経血管的（間接的）に注入する方法等も挙げることができる。
　経血管的方法は遺伝子の導入を心臓に限局できるため好ましいが、この場合、遺伝子発現ベクター又はそれを含む医薬組成物は、血管内に注入し、血流を介して心筋細胞に輸送することもできるし、心筋層内に直接注入して心筋細胞と接触させることも可能である。この様なカテーテル等を用いた外科的手術手技は、当該分野で公知であり、参考書籍として、例えば、Gene Transfer in Cardiovascular System: Experimental Approaches & Therapeutic Implications（March編、Kluwer Academic Publishers, 1997）や、Vascular Surgery 第5版（Rutherford, W.B. Saunders, 2000）、Textbook of Interventional Cardiology 第4版（Topol 編、W.B. Saunders, 2002）等の成書を挙げることができる。また、上記の方法を実施するために用いるカテーテルは市販されており（Boston Scientific社、Edwards Lifesciences Corporation社等から）容易に入手することができる。
　本発明の方法により増殖させた心筋細胞の利用
　本発明に係る方法により増殖させた心筋細胞は、引き続き、公知の方法による細胞回収、分離、精製法を用いることにより、高純度の心筋細胞を効率的かつ多量に得ることができる。この様にして得られた心筋細胞を以下、本発明により調製された心筋細胞と呼ぶ。
　心筋細胞の精製方法は、公知となっている細胞分離精製の方法であればいずれも用いることができるが、その具体的例として、フローサイトメーターや磁気ビーズ、パンニング法等の抗原－抗体反応に準じた方法や、ショ糖、パーコール等の担体を用いた密度勾配遠心による細胞分画法を挙げることができる。
　また、別の心筋細胞選別法としては、前もって心筋細胞ソースとなる動物又はES細胞等の幹細胞の遺伝子に、人為的に薬剤耐性や異所性タンパク質の発現能を付与する様な修飾を加え、これらの指標をもとに心筋細胞を選択的に回収する方法が挙げられる。例えば、Field及び共同研究者らは、α型ミオシン重鎖プロモーターの制御下でネオマイシン（G418）耐性遺伝子を発現し得る遺伝子カセットを、マウスES細胞に導入することにより、そのES細胞が心筋細胞に分化し、それに伴いα型ミオシン重鎖遺伝子を発現した時のみ、G418を添加した培地中で生存し得る系を構築し、この方法によりG418耐性細胞として選別された細胞は、99％以上の確率で心筋細胞であることを報告している（USP 6,015,671；Klug et al., The Journal of Clinical Investigation, 98:216-224, (1996)）。
　本発明のまた別の態様として、本発明により調製された心筋細胞は、各種生理活性物質（例えば、薬物）や機能未知の新規遺伝子産物等の薬理評価及び活性評価に有用である。例えば、心筋細胞の機能調節に関する物質や薬剤、又は心筋細胞に対して毒性や傷害性を有する物質や薬剤のスクリーニングに利用することができる。さらなる態様では、本発明により調製された心筋細胞を含む評価キットは、上記スクリーニングのために有用である。
　スクリーニングに供する被験物質としては、培養系に添加できるものであれば種類を問わず、例えば、低分子化合物、高分子化合物、有機化合物、無機化合物、タンパク質、ペプチド、遺伝子、ウイルス、細胞、細胞培養液、微生物培養液等が挙げられる。遺伝子を効率的に培養系に導入する方法としては、レトロウイルス、アデノウイルス等のウイルスベクターを用いて培養系に添加する方法、又はリポソーム等に封入して培養系に添加する方法等が挙げられる。
　被験物質の評価は、心筋細胞機能の質的又は量的な変化を測定することで行なうことができる。心筋細胞の生存性を一例として挙げると、本発明により調製された心筋細胞を、適切な細胞密度になるように培養プレートに播種し、血清を含まない培地で培養すると細胞死（アポトーシス）を誘導することができるが、その際、適当量の被験物質を培地中に添加し、心筋細胞の生存率又は死亡率を測定すれば良い。心筋細胞の生存率又は死亡率の測定方法としては、トリパンブルー等の色素の取り込みを指標とした肉眼的な観察によるものでも良いし、脱水素酵素の活性（還元活性）を指標とした方法、さらにはアポトーシス細胞に特異的なカスパーゼ活性やアネキシンVの発現を指標とした方法を用いても良い。当該メカニズムを利用したキットは市販されており（Sigma社、Clonetech社、Promega社等から）容易に入手することができる。
　上記スクリーニング方法により得られた物質や薬剤は、心筋細胞の分化誘導作用や機能調節作用を有するため、例えば心筋梗塞、虚血性心疾患、うっ血性心不全、肥大型心筋症、拡張型心筋症、心筋炎、慢性心不全等の心臓疾患予防薬又は治療薬として用いることができる。これら化合物は新規な化合物であってもよいし、公知の化合物であってもよい。
　また、本発明により調製された心筋細胞は、心筋再生又は心臓疾患治療用の移植用細胞として用いることができる。心臓疾患としては、心筋梗塞、虚血性心疾患、うっ血性心不全、肥大型心筋症、拡張型心筋症、心筋炎、慢性心不全等を挙げることができる。移植用細胞としては、本発明により調製された心筋細胞を高純度で含むものであれば、細胞を培地等の水性担体に浮遊させたもの、細胞を生体分解性基質等の固相担体に包埋したもの、あるいは単層もしくは多層の心筋細胞シート（Shimizu et al., Circulation Research, 90:e40-e48, (2002)）に加工したもの等、どの様な形状のものでも用いることができる。
　上記の移植用心筋細胞を障害部位に移植する方法としては、開胸し、注射器を用いて直接心臓に注入する方法、心臓の一部を外科的に切開して移植する方法、さらにはカテーテルを用いた経血管的方法により移植する方法等（Murry et al., Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology, 67:519-526, (2002)；Menasche, The Annals of Thoracic Surgery, 75:S20-S28, (2003)；Dowell et al., Cardiovascular Research, 58:336-350, (2003)）が挙げられるが、特にこれを限定しない。この様な方法により、胎児心臓から回収した心筋細胞を心障害動物の心臓に移植すると、きわめて良い治療効果を示すことが報告されている（Menasche, The Annals of Thoracic Surgery, 75:S20-S28, (2003)；Reffelmann et al., Heart Failure Reviews, 8:201-211, (2003)）。ES細胞由来の心筋細胞は、胎児心臓由来の心筋細胞ときわめてよく似た形質を呈している（Maltsev et al., Mechanisms of Development, 44:41-50, (1993)；Maltsev et al., Circulation Research, 75:233-244, (1994)）。また、実際にES細胞由来の心筋細胞を成体心臓に移植した動物実験例では、胎児心筋を移植した例とほぼ変わらない、極めて高い生着性を示すことも確認されている（Klug et al., The Journal of Clinical Investigation, 98:216-224, (1996)）。そのため、心筋細胞の疲弊及び脱落に起因する上記の心臓疾患において、本発明記載の方法により調製した心筋細胞を、病的心臓組織に補充的に移植することにより、心機能の改善を促すことが期待できる。
　以下、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、以下の実施例は本発明の単なる例示を示すものであり、本発明の範囲を何ら限定するものではない。
　実施例1：初代培養心筋細胞を用いたBrdU取り込みを指標としたmiRNAライブラリースクリーニング
　生後2～4日目のラット（Wistar系、清水実験材料株式会社より入手）から心臓を摘出し、コラゲナーゼ処理により得られた細胞群からパーコール濃度勾配遠心分離（細胞を懸濁した密度1.082 g/mLのパーコール溶液を密度1.050 g/mL、1.060 g/mLのパーコール溶液に重層し、4℃、3000 rpm（2000 G）25分遠心）により心筋細胞画分を回収した。このようにして得た心筋細胞は、5％子牛血清（FCS；SAFC Bioscience社）を添加したイーグル最小培地（ナカライテスク社）に懸濁後、培養用ディッシュに播種し、炭酸ガスインキュベータ中、37℃で培養した。このようにして調製した心筋細胞（96 wellプレートあたり15,000 cells/well）に対して、Pre-miRTM miRNA Precursor Library-HumanV2（Ambion：miRBase Sequence Database Version 8.0に収載の328個のヒト成熟型miRNAをミミックするようにデザインされたライブラリー）各2 pmolをLipofectamineTM RNAiMAX（Invitrogen）を用いてトランスフェクションし、2日後に細胞増殖ELISA、BrdU化学発光キット（Roche）を用いてBrdUの取り込み量を測定し、陰性対照であるPre-miRTM miRNA Precursor Molecule－Negative control #1（Ambion）添加群におけるBrdUの取り込み量と比較して、顕著に高いBrdUの取り込み効果を呈したものを、DNAの合成能を顕著に促進する候補miRNAとして選択した。当該試験において、上記の候補miRNAの例として、miR-148a、miR-148b、miR-152及びmiR-373を選抜することができた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
 　実施例2：初代培養心筋細胞におけるmiRNA強制発現による細胞周期進行マーカーの解析
　心筋細胞（24 wellプレートあたり100,000 cells/well）に対して、実施例１で得られた候補miRNA、miR-148a、miR-148b、miR-152及びmiR-373のヒト成熟型miRNAをミミックするようにデザインされたPre-miRTM miRNA Precursor Moleculeと陰性対照のNegative control #1（全てAmbion）1 pmolをLipofectamineTMRNAiMAX（Invitrogen）を用いてトランスフェクションし、トランスフェクション2～4日後に細胞を4％パラホルムアルデヒドで固定した。
　次に抗Ki67抗体（ThermoSCIENTIFIC）（1：200希釈）及び抗TroponinT抗体（Thermo SCIENTIFIC）（1：200希釈）を反応させた後、Alexa FluorTM標識抗体（Alexa-488及びAlexa-568；Molecular Probes）（ともに1：400希釈）を用いて染色した。また、細胞核は4',6-ヂアミジン-2'-フェニルインドールジハイドロクロライド（4',6-Diamidine-2'-phenylindole dihydrochloride：DAPI）溶液（1μg/mL）で染色した。
　上記方法にて免疫染色を行った細胞について、心筋細胞中のKi67陽性率をIn Cell Analyzer1000（GE Healthcare社）を用いて計測した。Ki67核タンパク質は細胞周期のすべてのサイクルにおいて増殖している細胞で発現することから（Scholzen & Gerdes, Journal of Cellular Physiology, 182:311-22, 2000）、細胞周期が進行している細胞を検出するために用いた。
　この結果を図1に示した。
　この結果より、Negative control #1を使用した場合と比較して顕著な心筋細胞の増殖促進作用を有するmiRNAとしてmiR-148a、miR-148b、miR-152及びmiR-373を同定した。
　実施例3　初代培養心筋細胞におけるアデノウイルス発現miRNA強制発現による細胞周期進行マーカーの解析
　miR-148a、miR-152、miR-373を発現させるためのアデノウイルスベクターとしては、ViraPowerTM Adenoviral Expression System（Invitrogen社）を用いて作製した。即ち、それぞれのmiRNAの前駆体配列及び隣接した数百ヌクレオチドを含むヒトゲノムDNA断片を、ヒトゲノムDNAを鋳型として以下に示すプライマーを用いたPCRにより増幅した。
　hsa-miR-148a-F：5’-caccgaacacacctgcaggaagaaact-3’（SEQ ID NO: 11）
　hsa-miR-148a-R：5’-gttcccatttacagggtttaaccca-3’（SEQ ID NO: 12）
　hsa-miR-152-F：5’-caccgtcccagactcggctcccatca-3’（SEQ ID NO: 13）
　hsa-miR-152-R：5’-actcgaggtggacaccctgtgt-3’（SEQ ID NO: 14）
　hsa-miR-373-F：5’-caccgtgaccaaggggctgtatgca-3’（SEQ ID NO: 15）
　hsa-miR-373-R：5’-ctgcccaccccagaatatgcca-3’（SEQ ID NO: 16）。
　これらのPCR産物をpENTR/D-TOPOベクター（Invitrogen社）に挿入し、その塩基配列の確認を行い、Gateway system（Invitrogen社）を用いてpAd/CMV/V5-DESTベクター（Invitrogen社）に組み換え、pAd/CMV-miR-148a、pAd/CMV-miR-152、及びpAd/CMV-miR-373 を作製した。次にこれらのベクターを制限酵素PacIで切断し、ヒト腎臓由来の293A細胞へLipofectamine2000（Invitrogen社）を用いてトランスフェクションすることにより、組換えアデノウイルスAd-miR-148a、Ad-miR-152、及びAd-miR-373を作製した。　上記の方法で作製した組換えアデノウイルスは、CMVプロモーターの制御下で各挿入miRNAの前駆体が発現する構築になっており、哺乳動物細胞内で高発現させることが可能である。哺乳動物に発現したmiRNAの前駆体は哺乳動物の細胞内の酵素群により機能的な成熟型miRNAとなる。
　また、この実験において、市販のLacZ発現のための組換えアデノウイルス、Ad-LacZ（タカラバイオ株式会社）を使用した。
　引き続き、各組換えウイルスについて高力価ウイルス液の調製を行い、調製したウイルス液の力価は293A細胞を用いてプラーク・アッセイにより決定し、いずれも109～1010 pfu/mLの範囲内であった。なお、本明細書において、細胞当たりに感染させる生ウイルス粒子数を、以下、感染多重度（multiplicity of infection；moi）で表記する。即ち、1つの細胞に1個のウイルス粒子を感染させた場合を、moi＝1と表す。
　また、調製した各組換えウイルスを心筋細胞にmoi＝10～1000で添加し、2日後にmiRNeasy mini kit（Qiagen社）を用いてmiRNAを含む全RNAを回収した。その全RNA 10 ngを用いて、TaqMan MicroRNA reverse transcription kit（Applied Biosystems社）とTaqMan MicroRNA Assay（Applied Biosystems社）に付属のそれぞれのmiRNAに特異的な逆転写用プライマーを用いてcDNAを合成し、引き続きTaqMan MicroRNA Assay（Applied Biosystems社）に付属のそれぞれのmiRNAに特異的な順方向及び逆方向プライマーとTaqManプローブを用いて、Applied Biosystems 7900HT Fast Real time PCR systemにてリアルタイムPCR法を行い、成熟型miRNAとしての発現量を定量した。
　内在性コントロールとしてRNU6Bを用い、発現量を標準化した。その結果、ウイルスの用量依存的に成熟型miRNAが発現していることを確認した。
　このようにして調製した組換えウイルスAd-miR-148a、Ad-miR-152及びAd-miR-373と陰性対照としてAd-LacZを、心筋細胞（24 wellプレートに100,000 cells/well）に、moi＝10～100で添加し、2～4日後に細胞を4％パラホルムアルデヒドで固定した。
　次に抗Ki67抗体（ThermoSCIENTIFIC社）（1：200希釈）及び抗TroponinT抗体（ThermoSCIENTIFIC社）（1：200希釈）を反応させた後、Alexa FluorTM標識抗体（Alexa-488及びAlexa-568；Molecular Probes）（ともに1：400希釈）を用いて染色した。また、細胞核はDAPI溶液（1μg/mL）で染色した。
　上記方法にて免疫染色を行った細胞について、心筋細胞中のKi67陽性率をIn Cell Analyzer1000を用いて計測した。
　この結果を図2に示した。この図においてNoneは未処理を示す。
　この結果より、miR-148a、miR-152及びmiR-373のいずれの場合においても、陰性対照（LacZ）の場合と比較して、細胞周期進行マーカーであるKi67が陽性となり心筋細胞の細胞周期が亢進され、心筋細胞の増殖促進作用を有することが確認された。
　実施例4　初代培養心筋細胞におけるmiRNA強制発現またはアデノウイルス発現miRNA強制発現による細胞分裂マーカーの解析
　実施例2と同様の方法で、miR-148a、miR-148b、miR-152、miR-373及び陰性対照としてNegative control #1を心筋細胞にトランスフェクションした。また、実施例3と同様の方法でAd-miR-148a、Ad-miR-152及びAd-miR-373と陰性対照のAd-LacZを、心筋細胞に添加した。それぞれ、添加後2～3日後に細胞を4％パラホルムアルデヒドで固定した。
　次に抗リン酸化ヒストンH3（H3P）抗体（MILLIPORE社）（1：200希釈）及び抗TroponinT抗体（ThermoSCIENTIFIC社）（1：200希釈）を反応させた後、Alexa FluorTM標識抗体（Alexa-488及びAlexa-568；Molecular Probes）（ともに1：400希釈）を用いて染色した。また、細胞核はDAPI溶液（1μg/mL）で染色した。
　上記方法にて免疫染色を行った細胞について、心筋細胞中のH3P陽性率をIn Cell Analyzer1000を用いて計測した。ヒストンH3のSer-10のリン酸化は細胞の有糸分裂時に見られるクロマチンの凝集と密接に関連していることから（Adamas,R, The Journal of Cell Biology, 153: p. 865-880, 2001）、細胞分裂のマーカーとして用いた。
　この結果を図3-1、図3-2に示した。この図においてNoneは未処理を示す。また、上記免疫染色を行った細胞の顕微鏡写真を図3-3に示した。
　この結果より、miR-148a、miR-152及びmiR-373のいずれの場合においても、図3-1の場合には陰性対照（Negative control #1）と比較して、図3-2の場合には陰性対照（Ad-LacZ）と比較して、細胞分裂マーカーであるH3Pが陽性となり、有糸分裂中および細胞質分裂に進んでいる細胞が観察されることから、心筋細胞の細胞分裂が亢進しており、これらのマイクロRNAは心筋細胞の増殖促進作用を有することが確認された。
　実施例5：生体内における心筋細胞の増殖可能性の検討
　miR-148a、miR-152、miR-373の発現が、生体内における心筋細胞の増殖を起こすかどうかを確認するために、実施例3で調製した組換えウイルスAd-miR-148a、Ad-miR-152及びAd-miR-373（それぞれ1×10９pfu/mL）を、Wistar系ラット（250～300ｇ）を開胸して目視にて心尖部（apical region）の計4ヵ所に30G注射針を用いて総量200μL注入した。陰性対照としては、miR-141を使用することとし、目的とする配列を、実施例3の方法にしたがって、ヒトゲノムDNAを鋳型として以下に示すプライマー：
　hsa-miR-141-F：5’-caccgcagggatcctgggcctga-3’（SEQ ID NO: 17）
　hsa-miR-141-R：5’-cgggaagacaatggaggtgcct-3’（SEQ ID NO: 18）
を用いたPCRにより増幅し、このPCR産物を実施例3に記載の通りに用いてAd-miR-141を作製し、Ad-miR-141（1×10９pfu/mL）を、Wistar系ラット（250～300ｇ）を開胸して目視にて心尖部（apical region）の計4ヵ所に30G注射針を用いて総量200μL注入した。
　注入後4日間経過後、4％パラホルムアルデヒドを灌流して心臓組織を固定化し、切片を作製し、抗Ki67抗体（ThermoSCIENTIFIC社）（1：500希釈）及び抗TroponinT抗体（ThermoSCIENTIFIC社）（1：600希釈）を反応させた後、Alexa FluorTM標識抗体（Alexa-488及びAlexa-568；Molecular Probes）（ともに1：400希釈）を用いてそれぞれ緑色及び赤色に染色視覚化した。また、細胞核はDAPIを用いて青色に染色視覚化した。
　染色した心臓組織切片は蛍光顕微鏡を用いて観察し、DAPIとTroponin Tの共陽性細胞を心筋細胞、Ki67とTroponin Tの共陽性細胞を細胞周期が進行している心筋細胞とし、細胞周期が進行している心筋細胞の割合を測定した。各個体で測定する細胞数は300以上とした。その結果を図４に示した。図4において、miR-148a、miR-152又はmiR-373のアデノウイルスを感染させた心臓では、Ki67陽性心筋細胞の割合が明らかに増加していることが分かった。一方、陰性対照であるmiR-141のアデノウイルスを感染させた心臓では、Ki67陽性心筋細胞はほとんど認められなかった。
　この結果より、生体内においてもmiR-148a、miR-152及びmiR-373を発現させることにより、細胞周期進行マーカーであるKi67が陽性となり、心筋細胞の細胞周期が亢進され、増殖能を獲得したことが示された。
　SEQ ID NO: 1：miR-148ファミリーの5’側に共通のシード配列；
　SEQ ID NO: 2：miR-373ファミリーの5’側に共通のシード配列；
　SEQ ID NO: 11：miR-148a遺伝子のコード領域を増幅するためのフォワードプライマー、hsa-miR-148a-F；
　SEQ ID NO: 12：miR-148a遺伝子のコード領域を増幅するためのリバースプライマー、hsa-miR-148a-R；
　SEQ ID NO: 13：miR-152遺伝子のコード領域を増幅するためのフォワードプライマー、hsa-miR-152-F；
　SEQ ID NO: 14：miR-152遺伝子のコード領域を増幅するためのリバースプライマー、hsa-miR-152-R；
　SEQ ID NO: 15：miR-373遺伝子のコード領域を増幅するためのフォワードプライマー、hsa-miR-373-F；
　SEQ ID NO: 16：miR-373遺伝子のコード領域を増幅するためのリバースプライマー、hsa-miR-373-R；
　SEQ ID NO: 17：miR-141遺伝子のコード領域を増幅するためのフォワードプライマー、hsa-miR-141-F；
　SEQ ID NO: 18：miR-141遺伝子のコード領域を増幅するためのリバースプライマー、hsa-miR-141-R；
　その他の配列については、表1を参照。

Claims (20)

  1. 　心筋細胞の増殖促進作用を有するmiRNAを規定する核酸を含む、心臓疾患治療用医薬組成物。
  2. 　miRNAが、成熟型miRNA及び当該miRNAの前駆体、並びにそれらの変異体及び類似物質からなる群から選択される物質である、請求項1に記載の医薬組成物。
  3. 　miRNAが、SEQ ID NO: 1又はSEQ ID NO: 2からなるシード配列を含む物質である、請求項1又は2に記載の医薬組成物。
  4. 　SEQ ID NO: 1からなるシード配列を含む物質が、miR-148a（SEQ ID NO: 3）、miR-148b（SEQ ID NO: 5）、miR-152（SEQ ID NO: 7）、及びそれらの前駆体、並びにそれらの変異体及び類似物質からなる群から選択される物質である、請求項3に記載の医薬組成物。
  5. 　SEQ ID NO: 2からなるシード配列を含む物質が、miR-373（SEQ ID NO: 9）及びその前駆体、並びにその変異体及び類似物質からなる群から選択される物質である、請求項3に記載の医薬組成物。
  6. 　心筋細胞の増殖促進作用を有するmiRNAを規定する核酸を、心筋細胞に導入及び発現させるための発現ベクターとして含む、請求項1～5のいずれか1項に記載の医薬組成物。
  7. 　ベクターが、ウィルスベクターである、請求項6に記載の医薬組成物。
  8. 　miRNAが、少なくとも一つの修飾ヌクレオシド間結合、少なくとも一つの修飾糖部分、少なくとも一つの修飾塩基、又はこれらの組合せを含む、miRNA誘導体である、請求項1～7のいずれか1項に記載の医薬組成物。
  9. 　心臓疾患が、心筋梗塞、虚血性心疾患、うっ血性心不全、肥大型心筋症、拡張型心筋症、心筋炎又は慢性心不全である請求項1～8のいずれか1項に記載の医薬組成物。
  10. 　心筋細胞の増殖促進作用を有するmiRNAを規定する核酸を、個体の心臓の障害部位に導入することにより、当該部位において心筋細胞を増殖させることを特徴とする心臓疾患の治療方法。
  11. 　心臓疾患治療用医薬組成物の製造のための心筋細胞の増殖促進作用を有するmiRNAを規定する核酸の使用。
  12. 　心臓疾患の治療において使用するための心筋細胞の増殖促進作用を有するmiRNAを規定する核酸。
  13. 　心筋細胞の増殖促進作用を有するmiRNAを規定する核酸を、心筋細胞に導入して発現させることを特徴とする心筋細胞の増殖方法。
  14. miRNAが、成熟型miRNA及び当該miRNAの前駆体、並びにそれらの変異体及び類似物質からなる群から選択される物質である、請求項13に記載の方法。
  15. 　miRNAが、SEQ ID NO: 1又はSEQ ID NO: 2からなるシード配列を含む物質である、請求項13又は14に記載の方法。
  16. 　SEQ ID NO: 1からなるシード配列を含む物質が、miR-148a（SEQ ID NO: 3）、miR-148b（SEQ ID NO: 5）、miR-152（SEQ ID NO: 7）、及びそれらの前駆体、並びにそれらの変異体及び類似物質からなる群から選択される物質である、請求項15に記載の方法。
  17. 　SEQ ID NO: 2からなるシード配列を含む物質が、miR-373（SEQ ID NO: 9）及びその前駆体、並びにその変異体及び類似物質からなる群から選択される物質である、請求項15に記載の方法。
  18. 　心筋細胞の増殖促進作用を有するmiRNAを規定する核酸を、発現ベクターを用いて心筋細胞へ導入することを含む、請求項13～17のいずれか1項に記載の方法。
  19. 　ベクターが、ウィルスベクターである、請求項18に記載の方法。
  20. 　miRNAが、少なくとも一つの修飾ヌクレオシド間結合、少なくとも一つの修飾糖部分、少なくとも一つの修飾塩基、又はこれらの組合せを含む、miRNA誘導体である、請求項13～19のいずれか1項に記載の方法。
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