KR20130008560A

KR20130008560A - 마이크로 ｒｎａ를 이용한 심근 세포의 증식 방법

Info

Publication number: KR20130008560A
Application number: KR1020127024390A
Authority: KR
Inventors: 가요코 가와시마; 유이치 고시미즈
Original assignee: 다이이찌 산쿄 가부시키가이샤
Priority date: 2010-03-12
Filing date: 2011-03-11
Publication date: 2013-01-22
Also published as: US20130005796A1; EP2842577A1; US20140213633A1; AU2011225115A1; RU2012143607A; WO2011111824A1; SG184026A1; CA2792411A1; AU2011225115B2; CN102858376A; JPWO2011111824A1; BR112012022946A2; SG10201501610VA; EP2545941A1; AU2014224131A1; EP2545941A4; US20140213634A1

Abstract

본 발명은 심근 세포의 증식을 촉진하는 miRNA를 이용한 심근 세포의 증식 방법, 심장 질환 치료용 벡터 및 심장 질환 치료용 의약 조성물 등을 제공하는 것을 과제로 한다.
심근 세포에 대해 증식 촉진 작용을 가지는 miRNA를 이용한 심근 세포의 증식 방법, 상기 miRNA를 포함하는 심장 질환 치료용 벡터 및 상기 벡터를 포함하는 심장 질환 치료용 의약 조성물 등을 제공한다. miRNA로서는, 특히 성숙형 miRNA인 miR-148a, miR-148b, miR-152 및 miR-373, 상기 miRNA의 전구체, 및 이들의 변이체 및 유사 물질로 이루어진 군으로부터 선택되는 miRNA가 바람직하다.

Description

마이크로 ＲＮＡ를 이용한 심근 세포의 증식 방법{METHOD FOR PROLIFERATING CARDIOMYOCYTES USING MICRO-RNA}

본 발명은 마이크로 RNA를 이용한 심근 세포의 증식 방법, 심장 질환 치료용 벡터 및 심장 질환 치료용 의약 조성물에 관한 것이다.

성체에서 심근 세포는 세포 분열능을 상실하므로, 허혈이나 심근염 등의 각종 스트레스에 노출되어 일단 괴사 또는 소실되면, 보충되지 않는다. 그 결과, 잔존하는 심근 세포가 대상성 비대를 통해 심장 기능을 유지하려고 하지만, 이러한 상태가 지속되어 심근 조직의 허용 범위를 넘어서게 되면, 심근 세포는 더욱 더 피폐 또는 사멸되어, 최종적으로는 심근 기능의 저하, 즉 심부전이 발생되게 된다.

심부전을 비롯한 심장 질환은 일본인의 사망 원인의 2번째를 차지하고 있다. 또한, 심장 질환 환자는 예후가 매우 나빠, 5년 생존율이 약 50%에 불과하다. 그래서, 유효한 심부전 치료법을 개발하는 것이 의료 복지 및 의료 경제적인 관점에서 매우 유익할 것으로 생각된다.

지금까지 심부전 치료제로는 심근의 수축력을 높이는 디기탈리스 제제나 크산틴 제제 등의 강심제가 사용되고 있지만, 이들 약제는 장기간 투여시 오히려 병태를 악화시키는 경우도 있는 것으로 알려져 있다. 또한, 최근에는, β-차단제나 ACE 저해제 등, 교감신경계 또는 레닌-안지오텐신 시스템의 항진에 의해, 과잉의 심장 부하를 경감시키는 약제를 이용한 치료가 주를 이루고 있지만, 이들은 대증적 치료법에 불과할 뿐, 상해를 입은 심장 조직 자체를 회복시키는 것은 아니다.

한편, 심장 이식은 중증 심부전에 대한 근본적인 치료법이지만, 장기 기증자의 부족, 의료 윤리, 환자의 육체적 또는 경제적 부담감 등의 문제로 인해, 일반적인 치료법으로서 상기 방법을 이용하기는 어렵다.

마이크로 RNA(이하 「miRNA」라 함)는 세포내에 존재하는 21 - 25개의 염기 길이를 가지는 비-코딩 RNA이다. 이는 선충에서부터 포유류까지 폭넓게 보존되어 있으며, 생체내에서 다양한 유전자의 발현을 조절하는데 중요한 역할을 담당하는 분자로서 최근 주목받고 있다.

miRNA는, 게놈 DNA 상에 존재하는 miRNA 유전자로부터, 먼저, 약 수백 - 수천개의 염기로 구성된 miRNA 1차 전사 산물(pri-miRNA)로 전사된다. 이어, 핵내에서 Drosha로 불리우는 RNase III 효소에 의해 프로세싱되어, 약 70개의 염기로 구성된 헤어핀 구조를 가진 전구체 miRNA(pre-miRNA)가 된다. 그 후, Exportin-5에 의해 핵에서 세포질로 이동한 다음 Dicer라고 하는 RNase III 효소에 의해 프로세싱되어, 21 - 25개의 염기로 구성된 이중 가닥의 성숙형 miRNA(mature miRNA)로 만들어진다. 성숙형 miRNA는, 그 중 단일 가닥이 RNA 유도성 억제 복합체(RISC)라고 하는 단백질과 복합체를 형성하고, 상보 서열을 가진 표적 유전자의 mRNA에 결합하여, 표적 유전자의 발현을 억제하는 것으로 알려져 있다(비특허문헌 1, 2).

miRNA는 하나의 생물 종 당 약 1000 종이 존재하는 것으로 추측되며, 그 각각이 복수의 표적 유전자의 발현을 조절하고, 단백질을 코딩하는 유전자 전체의 약 1/3을 조절하는 것으로 생각된다(비특허문헌 3). 또한, miRNA는 발생, 분화 및 바이러스 감염시 생체 반응 등에 관여하는 것으로 밝혀지고 있으며, 인간 질환과의 관련성도 시사되고 있다. 특히, 암과 miRNA의 관계에 있어, 정상 조직과 암 조직 간에 발현 양식이 상이한 miRNA들이 다수 존재하고 있어, 발암 과정에 miRNA의 관여가 강력하게 시사되고 있으며, 발암을 촉진하는 miRNA, 종양을 억제하는 miRNA와 같이 2가지 타입이 존재하는 것으로 보고되어 있다(비특허문헌 4, 5, 6).

또한, 심장 질환과 관련하여, 정상 심장과 병에 걸린 심장에서의 miRNA의 발현 프로파일 분석에 대해 많은 연구 그룹들이 보고하고 있다. 그 일부는 구체적인 기능이 해명되었으며, 예컨대, 심장 비대에서는 miR-195의 발현이 증가하는데, 상기 miRNA를 강제 발현시킨 트랜스제닉(transgenic) 마우스에서는 심장이 비대해지고 확장형 심근증 또는 심부전이 발생하며(특허문헌 1, 비특허문헌 7), 심장 비대시 발현이 감소하는 miRNA인 miR-1은 심근 세포의 증식을 억제하는 것으로(특허문헌 2, 비특허문헌 8) 보고된 바 있다.

WO2009/062169 WO2006/107826

He & Hannon, Nature Reviews Genetics, 5: 522-531, (2004) Bartel, Cell, 116:281-297, (2004) Berezikov et al., Cell, 120:21-24, (2005) Esquela-Kerscher & Slack, Nature Reviews Cancer, 6:259-269, (2006) Kent & Mendell, Oncogene, 25:6188-6196, (2006) Zhang et al., Developmental Biology, 302:1-12, (2007) van Rooij et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 103:18255-18260, (2006) Zhao et al., Cell, 129: 303-317, (2007)

본 발명은 심근 세포의 증식을 촉진시키는 miRNA를 동정하여, 상기 miRNA를 이용한 심근 세포의 증식 방법, 심장 질환 치료용 벡터 및 심장 질환 치료용 의약 조성물 등을 제공하는 것을 과제로 한다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명자들은 심근 세포의 증식을 조절하는 인자로서 마이크로 RNA(이하, 「miRNA」라 함)에 착안하여 연구를 수행하고, 심근 세포의 증식을 조절하는 miRNA에 대한 분석을 실시하였다. 이에 연구를 거듭한 결과, 본 발명자들은 심근 세포의 증식을 조절하는 복수의 miRNA를 특정하는데 성공하였고, 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 제1 구현예로서, 본 발명자들은 심근 세포에 대한 증식 촉진 작용을 가지는 miRNA를 제공한다. 보다 구체적으로는, 본 발명의 miRNA는 하기 구현예를 포함한다:

(1-1) 심근 세포에 대해 증식 촉진 작용을 가지는 miRNA.

(1-2) miRNA가 성숙형 miRNA, 상기 miRNA의 전구체, 및 이들의 변이체 및 유사 물질로 이루어진 군으로부터 선택되는 물질인, 상기 (1-1)에 기재된 miRNA.

(1-3) miRNA가 서열번호 1 또는 서열번호 2로 이루어진 시드(seed) 서열을 포함하는 물질인, 상기 (1-1) 또는 (1-2)에 기재된 miRNA.

(1-4) 서열번호 1로 이루어진 시드 서열을 포함하는 물질이, miR-148a(서열번호 3), miR-148b(서열번호 5), miR-152(서열번호 7), 이들의 전구체, 및 이들의 변이체 및 유사 물질로 이루어진 군으로부터 선택되는 물질인, 상기 (1-3)에 기재된 miRNA.

(1-5) 서열번호 2로 이루어진 시드 서열을 포함하는 물질이, miR-373(서열번호 9), 그 전구체, 및 그 변이체 및 유사 물질로 이루어진 군으로부터 선택되는 물질인, 상기 (1-3)에 기재된 miRNA.

본 발명의 제2 구현예로서, 본 발명자들은, (a) 전술한 심근 세포에 대해 증식 촉진 작용을 가지는 miRNA를 코딩하는 핵산을 사용하여, 심장 질환을 치료하기 위한 의약 조성물, (b) 심근 세포에 대해 증식 촉진 작용을 가지는 miRNA를 코딩하는 핵산을 개체의 심장의 장애 부위에 도입함으로써, 상기 부위에서 심근 세포를 증식시키는 것을 특징으로 하는 심장 질환의 치료 방법, (c) 심장 질환을 치료하기 위한 의약의 제조용으로서, 심근 세포에 대해 증식 촉진 작용을 가지는 miRNA를 코딩하는 핵산의 용도, 또는 (d) 심장 질환의 치료에 사용하기 위한, 심근 세포에 대해 증식 촉진 작용을 가지는 miRNA를 코딩하는 핵산;으로서 기술할 수 있는, 심근 세포에 대해 증식 촉진 작용을 가지는 miRNA의 의약 용도에 관한 발명을 제공한다. 본 발명에서, 「miRNA를 코딩하는 핵산」이라고 할 경우, (i) 성숙형 miRNA, 상기 miRNA의 전구체, 및 이들의 변이체 및 유사 물질, 또는 (ii) 성숙형 miRNA, 상기 miRNA의 전구체, 및 이들의 변이체 및 유사 물질을 생체내 또는 세포 내에서 발현시키기 위한 발현 벡터를 일컫는다.

전술한 구현예들 중 (a)의 의약 조성물 발명에 있어서, 보다 구체적으로, 상기한 의약 조성물은 하기 구현예를 포함한다:

(2-a-1) 심근 세포에 대해 증식 촉진 작용을 가지는 miRNA를 코딩하는 핵산을 포함하는, 심장 질환 치료용 의약 조성물.

(2-a-2) miRNA가 성숙형 miRNA, 상기 miRNA의 전구체, 및 이들의 변이체 및 유사 물질로 이루어진 군으로부터 선택되는 물질인, 상기 (2-a-1)에 기재된 의약 조성물.

(2-a-3) miRNA가 서열번호 1 또는 서열번호 2로 이루어진 시드 서열을 포함하는 물질인, 상기 (2-a-1) 또는 (2-a-2)에 기재된 의약 조성물.

(2-a-4) 서열번호 1로 이루어진 시드 서열을 포함하는 물질이, miR-148a(서열번호 3), miR-148b(서열번호 5), miR-152(서열번호 7), 이들의 전구체, 및 이들의 변이체 및 유사 물질로 이루어진 군으로부터 선택되는 물질인, 상기 (2-a-3)에 기재된 의약 조성물.

(2-a-5) 서열번호 2로 이루어진 시드 서열을 포함하는 물질이, miR-373(서열번호 9), 그 전구체, 및 그 변이체 및 유사 물질로 이루어진 군으로부터 선택되는 물질인, 상기 (2-a-3)에 기재된 의약 조성물.

(2-a-6) 심근 세포에 대해 증식 촉진 작용을 가지는 miRNA를 코딩하는 핵산을, 심근 세포에 도입 및 발현시키기 위한 발현 벡터 또는 리포솜으로서 포함하는, 상기 (2-a-1) 내지 (2-a-5) 중 어느 한 항에 기재된 의약 조성물.

(2-a-7) 벡터가 바이러스 벡터 또는 비-바이러스성 발현 벡터인, 상기 (2-a-6)에 기재된 의약 조성물.

(2-a-8) 바이러스 벡터가 아데노바이러스 벡터, 아데노 수반 바이러스(AAV) 벡터, 레트로바이러스 벡터, 일본 혈구 응집성 바이러스(HVJ; 별명, 센다이 바이러스) 벡터, 렌티바이러스 벡터, 백시니아 바이러스 벡터, 치크 폭스바이러스 벡터(chik poxviral vector) 및 파포바 바이러스 벡터로부터 선택되는 것인, 상기 (2-a-7)에 기재된 의약 조성물.

(2-a-9) miRNA가 하나 이상의 변형된 뉴클레오티드간 결합, 하나 이상의 변형된 당 모이어티, 하나 이상의 변형된 염기 또는 이들의 조합을 포함하는 miRNA 유도체인, 상기 (2-a-1) 내지 (2-a-8) 중 어느 한 항에 기재된 의약 조성물.

(2-a-10) 심장 질환이 심근경색, 허혈성 심질환, 울혈성 심부전, 비대형 심근증, 확장형 심근증, 심근염 또는 만성 심부전인, 상기 (2- a-1) 내지 (2-a-9) 중 어느 한 항에 기재된 의약 조성물.

또한, 전술한 구현예들 중에서 (b)의 치료 방법에 관한 발명은, 보다 구체적으로는, 상기한 치료 방법은 하기 구현예를 포함한다:

(2-b-1) 심근 세포에 대해 증식 촉진 작용을 가지는 miRNA를 코딩하는 핵산을 개체 심장의 장애 부위에 도입함으로써, 상기 부위에서 심근 세포를 증식시키는 것을 특징으로 하는 심장 질환의 치료 방법.

(2-b-2) miRNA가 성숙형 miRNA, 상기 miRNA의 전구체, 및 이들의 변이체 및 유사 물질로 이루어진 군으로부터 선택되는 물질인, 상기 (2-b-1)에 기재된 치료 방법.

(2-b-3) miRNA가 서열번호 1 또는 서열번호 2로 이루어진 시드 서열을 포함하는 물질인, 상기 (2-b-1) 또는 (2-b-2)에 기재된 치료 방법.

(2-b-4) 서열번호 1로 이루어진 시드 서열을 포함하는 물질이, miR-148a(서열번호 3), miR-148b(서열번호 5), miR-152(서열번호 7), 이들의 전구체, 및 이들의 변이체 및 유사 물질로 이루어진 군으로부터 선택되는 물질인, 상기 (2-b-3)에 기재된 치료 방법.

(2-b-5) 서열번호 2로 이루어진 시드 서열을 포함하는 물질이, miR-373(서열번호 9), 그 전구체, 및 그 변이체 및 유사 물질로 이루어진 군으로부터 선택되는 물질인, 상기 (2-b-3)에 기재된 치료 방법.

(2-b-6) 심근 세포에 대해 증식 촉진 작용을 가지는 miRNA를 코딩하는 핵산이 발현 벡터 또는 리포솜에 의해 개체의 심장의 장애 부위로 도입되는, 상기 (2-b-1) 내지 (2-b-5) 중 어느 한 항에 기재된 치료 방법.

(2-b-7) 벡터가 바이러스 벡터 또는 비-바이러스성 발현 벡터인, 상기 (2-b-6)에 기재된 치료 방법.

(2-b-8) 바이러스 벡터가 아데노바이러스 벡터, 아데노 수반 바이러스(AAV) 벡터, 레트로바이러스 벡터, 일본 혈구 응집성 바이러스(HVJ; 별명, 센다이 바이러스) 벡터, 렌티바이러스 벡터, 백시니아 바이러스 벡터, 치크 폭스바이러스 벡터, 파포바 바이러스 벡터로부터 선택되는 것인, 상기 (2-b-7)에 기재된 치료 방법.

(2-b-9) miRNA가 하나 이상의 변형된 뉴클레오티드간 결합, 하나 이상의 변형된 당 모이어티, 하나 이상의 변형된 염기, 또는 이들의 조합을 포함하는 miRNA 유도체인, 상기 (2-b-1) 내지 (2-b-8) 중 어느 한 항에 기재된 치료 방법.

(2-b-10) 심장 질환이 심근경색, 허혈성 심질환, 울혈성 심부전, 비대형 심근증, 확장형 심근증, 심근염 또는 만성 심부전인, 상기 (2-b-1) 내지 (2-b-9) 중 어느 한 항에 기재된 치료 방법.

또한, 전술한 구현예들 중에서 (c)의 용도 발명은, 보다 구체적으로는, 상기한 용도는, 하기의 구현예를 포함한다:

(2-c-1) 심장 질환 치료용 의약 조성물의 제조용으로서의, 심근 세포에 대해 증식 촉진 작용을 가지는 miRNA를 코딩하는 핵산의 용도.

(2-c-2) miRNA가 성숙형 miRNA, 상기 miRNA의 전구체, 및 이들의 변이체 및 유사 물질로 이루어진 군으로부터 선택되는 물질인, 상기 (2-c-1)에 기재된 용도.

(2-c-3) miRNA가 서열번호 1 또는 서열번호 2로 이루어진 시드 서열을 포함하는 물질인, 상기 (2-c-1) 또는 (2-c-2)에 기재된 용도.

(2-c-4) 서열번호 1로 이루어진 시드 서열을 포함하는 물질이, miR-148a(서열번호 3), miR-148b(서열번호 5), miR-152(서열번호 7), 이들의 전구체, 및 이들의 변이체 및 유사 물질로 이루어진 군으로부터 선택되는 물질인, 상기 (2-c-3)에 기재된 용도.

(2-c-5) 서열번호 2로 이루어진 시드 서열을 포함하는 물질이, miR-373(서열번호 9), 그 전구체, 및 그 변이체 및 유사 물질로 이루어진 군으로부터 선택되는 물질인, 상기 (2-c-3)에 기재된 용도.

(2-c-6) 심근 세포에 대해 증식 촉진 작용을 가지는 miRNA를 코딩하는 핵산을, 심근 세포에 도입 및 발현시키기 위한 발현 벡터 또는 리포솜으로서 포함하는, 상기 (2-c-1) 내지 (2-c-5) 중 어느 한 항에 기재된 용도.

(2-c-7) 벡터가 바이러스 벡터 또는 비-바이러스성 발현 벡터인, 상기 (2-c-6)에 기재된 용도.

(2-c-8) 바이러스 벡터가 아데노바이러스 벡터, 아데노 수반 바이러스(AAV) 벡터, 레트로바이러스 벡터, 일본 혈구 응집성 바이러스(HVJ; 별명, 센다이 바이러스) 벡터, 렌티바이러스 벡터, 백시니아 바이러스 벡터, 치크 폭스바이러스 벡터, 파포바 바이러스 벡터로부터 선택되는 것인, 상기 (2-c-7)에 기재된 용도.

(2-c-9) miRNA가 하나 이상의 변형된 뉴클레오티드간 결합, 하나 이상의 변형된 당 모이어티, 하나 이상의 변형된 염기, 또는 이들의 조합을 포함하는 miRNA 유도체인, 상기 (2-c-1) 내지 (2-c-8) 중 어느 한 항에 기재된 용도.

(2-c-10) 심장 질환이 심근경색, 허혈성 심질환, 울혈성 심부전, 비대형 심근증, 확장형 심근증, 심근염 또는 만성 심부전인, 상기 (2- c-1) 내지 (2-c-9) 중 어느 한 항에 기재된 용도.

또한, 전술한 구현예들 중 (d)의 핵산 발명은, 보다 구체적으로는, 상기한 핵산은 하기 구현예를 포함한다:

(2-d-1) 심장 질환의 치료에 사용하기 위한, 심근 세포에 대해 증식 촉진 작용을 가지는 miRNA를 코딩하는 핵산.

(2-d-2) miRNA가 성숙형 miRNA, 상기 miRNA의 전구체, 및 이들의 변이체 및 유사 물질로 이루어진 군으로부터 선택되는 물질인, 상기 (2-d-1)에 기재된 핵산.

(2-d-3) miRNA가 서열번호 1 또는 서열번호 2로 이루어진 시드 서열을 포함하는 물질인, 상기 (2-d-1) 또는 (2-d-2)에 기재된 핵산.

(2-d-4) 서열번호 1로 이루어진 시드 서열을 포함하는 물질이, miR-148a(서열번호 3), miR-148b(서열번호 5), miR-152(서열번호 7), 이들의 전구체, 및 이들의 변이체 및 유사 물질로 이루어진 군으로부터 선택되는 물질인, 상기 (2-d-3)에 기재된 핵산.

(2-d-5) 서열번호 2로 이루어진 시드 서열을 포함하는 물질이, miR-373(서열번호 9), 그 전구체, 및 그 변이체 및 유사 물질로 이루어진 군으로부터 선택되는 물질인, 상기 (2-d-3)에 기재된 핵산.

(2-d-6) 심근 세포에 대해 증식 촉진 작용을 가지는 miRNA를 코딩하는 핵산을, 심근 세포에 도입 및 발현시키기 위한 발현 벡터 또는 리포솜으로서 포함하는, 상기 (2-d-1) 내지 (2-d-5) 중 어느 한 항에 기재된 핵산.

(2-d-7) 벡터가 바이러스 벡터 또는 비-바이러스성 발현 벡터인, 상기 (2-d-6)에 기재된 핵산.

(2-d-8) 바이러스 벡터가 아데노바이러스 벡터, 아데노 수반 바이러스(AAV) 벡터, 레트로바이러스 벡터, 일본 혈구 응집성 바이러스(HVJ; 별명, 센다이 바이러스) 벡터, 렌티바이러스 벡터, 백시니아 바이러스 벡터, 치크 폭스바이러스 벡터, 파포바 바이러스 벡터로부터 선택되는 것인, 상기 (2-d-7)에 기재된 핵산.

(2-d-9) miRNA가 하나 이상의 변형된 뉴클레오티드간 결합, 하나 이상의 변형된 당 모이어티, 하나 이상의 변형된 염기, 또는 이들의 조합을 포함하는 miRNA 유도체인, 상기 (2-d-1) 내지 (2-d-8) 중 어느 한 항에 기재된 핵산.

(2-d-10) 심장 질환이 심근경색, 허혈성 심질환, 울혈성 심부전, 비대형 심근증, 확장형 심근증, 심근염 또는 만성 심부전인, 상기 (2- d-1) 내지 (2-d-9) 중 어느 한 항에 기재된 핵산.

본 발명의 제3 구현예로서, 본 발명자들은, 전술한 심근 세포에 대해 증식 촉진 작용을 가지는 miRNA를 코딩하는 핵산을 이용하여 심근 세포를 증식시키는 방법을 제공한다. 보다 구체적으로, 상기한 심근 세포를 증식시키는 방법은 아래 구현예를 포함한다:

(3-1) 심근 세포에 대해 증식 촉진 작용을 가지는 miRNA를 코딩하는 핵산을 심근 세포에 도입하여 발현시키는 것을 특징으로 하는 심근 세포의 증식 방법.

(3-2) miRNA가 성숙형 miRNA, 상기 miRNA의 전구체, 및 이들의 변이체 및 유사 물질로 이루어진 군으로부터 선택되는 물질인, 상기 (3-1)에 기재된 방법.

(3-3) miRNA가 서열번호 1 또는 서열번호 2로 이루어진 시드 서열을 포함하는 물질인, 상기 (3-1) 또는 (3-2)에 기재된 방법.

(3-4) 서열번호 1로 이루어진 시드 서열을 포함하는 물질이, miR-148a(서열번호 3), miR-148b(서열번호 5), miR-152(서열번호 7), 이들의 전구체, 및 이들의 변이체 및 유사 물질로 이루어진 군으로부터 선택되는 물질인, 상기 (3-3)에 기재된 방법.

(3-5) 서열번호 2로 이루어진 시드 서열을 포함하는 물질이, miR-373(서열번호 9), 그 전구체, 및 그 변이체 및 유사 물질로 이루어진 군으로부터 선택되는 물질인, 상기 (3-3)에 기재된 방법.

(3-6) 심근 세포에 대해 증식 촉진 작용을 가지는 miRNA를 코딩하는 핵산을, 발현 벡터 또는 리포솜을 이용하여 심근 세포에 도입하는 것을 포함하는, 상기 (3-1) 내지 (3-5) 중 어느 한 항에 기재된 방법.

(3-7) 벡터가 바이러스 벡터 또는 비-바이러스성 발현 벡터인, 상기 (3-6)에 기재된 방법.

(3-8) 바이러스 벡터가 아데노바이러스 벡터, 아데노 수반 바이러스(AAV) 벡터, 레트로바이러스 벡터, 일본 혈구 응집성 바이러스(HVJ; 별명, 센다이 바이러스) 벡터, 렌티바이러스 벡터, 백시니아 바이러스 벡터, 치크 폭스바이러스 벡터, 파포바 바이러스 벡터로부터 선택되는 것인, 상기 (3-7)에 기재된 방법.

(3-9) miRNA가 하나 이상의 변형된 뉴클레오티드간 결합, 하나 이상의 변형된 당 모이어티, 하나 이상의 변형된 염기, 또는 이들의 조합을 포함하는 miRNA 유도체인, 상기 (3-1) 내지 (3-8) 중 어느 한 항에 기재된 방법.

본 발명에 따른 miRNA를 이용함으로써, 심근 세포의 증식 방법, 심장 질환 치료용 벡터 및 심장 질환 치료용 의약 조성물을 제공할 수 있다. 본 발명에 따른 심근 세포의 증식 방법을 이용하면, 종래 방법에 비해 효율적으로 심근 세포의 세포 분열을 유도하여, 세포를 증식시킬 수 있으며, 상기 방법에 의해 제조되는 심근 세포는 각종 약제의 스크리닝용 및 이식 치료용 세포로서 이용할 수 있다. 또한, 상기 방법을 유전자 치료에 응용함으로써, 심근 세포의 괴사나 결실 등으로 인한 심장 질환의 재생 의료적 치료 가능성을 획득할 수 있다. 본 발명에 따른 miRNA는 심근 세포에 대해 현저한 증식 활성을 나타내는 것으로 밝혀졌다.

도 1은, 실시예 2에 따른, miR-1-148a(서열번호 3), miR-152(서열번호 7), miR-373(서열번호 9)로 형질전환된 초대 배양 심근 세포에서의 Ki67 양성 심근 세포율을 나타낸 도면이다. Ki67는 세포 핵 단백질이며, 증식 세포를 검출하기 위한 마커로서 사용되는 단백질이다.
도 2는, 실시예 3에 따른, miR-1-148a(서열번호 3), miR-152(서열번호 7), miR-373(서열번호 9)을 발현하는 재조합 아데노바이러스로 감염된 초대 배양 심근 세포에서의 Ki67 양성 심근 세포율을 나타낸 도면이다. None은 무처리이다.
도 3-1은, 실시예 4에 따른, miR-1-148a(서열번호 3), miR-152(서열번호 7), miR-373(서열번호 9)으로 형질전환된 초대 배양 심근 세포에서의 인산화된 히스톤 H3(H3P)에 대한 양성 심근 세포율을 나타낸 도면이다.
도 3-2는, 실시예 4에 따른, miR-1-148a(서열번호 3), miR-152(서열번호 7), miR-373(서열번호 9)을 발현하는 재조합 아데노바이러스로 감염된 초대 배양 심근 세포에서의 H3P 양성 심근 세포율을 나타낸 도면이다. None은 무처리이다.
도 3-3은, 실시예 4에 따른, miR-1-148a(서열번호 3), miR-152(서열번호 7), miR-373(서열번호 9)을 발현하는 재조합 아데노바이러스로 감염된 초대 배양 심근 세포를 항-H3P 항체, 항-Troponin T 항체, DAPI로 면역 염색한 세포의 현미경 사진이다. H3P: 녹색, Troponin T: 적색, DAPI: 청색
도 4는, 실시예 5에 따른, miR-1-148a(서열번호 3), miR-152(서열번호 7), miR-373(서열번호 9)을 발현하는 재조합 아데노바이러스를 생체내에서 랫 심장에 감염시킨 심장 조직 절편에서의 Ki67 양성 심근 세포율을 나타낸 도면이다.

본 발명을 실시함에 있어, 분자 생물학, 미생물학, 세포 생물학 및 재조합 DNA 기술 등의 일반적인 방법들 및 종래 기술에 대해, 당업자는, 특별한 언급이 없는 한, 상기 분야의 표준 참고 서적을 참조할 수 있다. 예컨대, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Edition (Sambrook & Russell, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001); Current Protocols in Molecular biology (ed. by Ausubel et. al, John Wiley & Sons, 1987); Methods in Enzymology Series (Academic Press); PCR Protocols: Methods in Molecular Biology (ed. by Bartlett & Striling, Humana Press, 2003); Animal Cell Culture: A Practical Approach, 3rd Edition (ed. by Masters, Oxford University Press, 2000); Antibodies: A Laboratory Manual (ed. by Harlow et al. & Lane, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1987)를 참조할 수 있다. 또한, 본원에서 참조하는 세포 배양, 세포 생물학 실험용 시약 및 키트류는 시판되고 있어(Sigma, Aldrich, Invitrogen/GIBCO, Clontech, Stratagene), 용이하게 입수할 수 있다.

본 발명은, 제1 구현예로서, 심근 세포에 대해 증식 촉진 작용을 가지는 miRNA를 제공한다.

본 발명은, 제2 구현예로서, 전술한 심근 세포에 대해 증식 촉진 작용을 가지는 miRNA를 코딩하는 핵산을 사용하여, 심장 질환을 치료하기 위한 의약 조성물; 심근 세포에 대해 증식 촉진 작용을 가지는 miRNA를 코딩하는 핵산을, 개체의 심장의 장애 부위에 도입함으로써, 상기 부위에서 심근 세포를 증식시키는 것을 특징으로 하는 심장 질환의 치료 방법; 심장 질환 치료용 의약 조성물의 제조용으로서의 심근 세포에 대해 증식 촉진 작용을 가지는 miRNA를 코딩하는 핵산의 용도; 및 심장 질환의 치료에 사용하기 위한 심근 세포에 대해 증식 촉진 작용을 가지는 miRNA를 코딩하는 핵산을 또한 제공한다.

본 발명은, 제3 구현예로서, 전술한 심근 세포에 대해 증식 촉진 작용을 가지는 miRNA를 코딩하는 핵산을 이용하여 심근 세포를 증식시키는 방법을 제공한다.

심근 세포

본 발명에 따른 방법으로 증식시킬 대상인 심근 세포는, 일반적으로, 성체형 심근 세포, 유체형 심근 세포(juvenile cardiomyocyte), 및 태아형 심근 세포의 모든 발생 단계의 심근 세포를 포함할 수 있다. 아울러, 본 발명에서는, 포유동물의 심장 조직 내에 존재하는 심근 세포를 직접적인 대상으로 할 수 있으며, 본 발명의 제1 구현예 및 제3 구현예에 있어서, 생체 외의 배양 심근 세포 등을 사용할 수도 있다.

본원에서, 생체 외의 배양 심근 세포는 임의 공급원 유래의 심근 세포를 사용할 수 있으며, 예컨대 생체 심장 조직으로부터 효소 처리 등의 각종 방법으로 분리한 심근 세포, 또는 이를 적당한 배양 조건 하에서 약 1 - 5일간 배양시킨 초대 배양 세포도 사용할 수 있다. 구체적인 심근 세포 배양 방법은 다수의 참고 문헌들에 기술되어 있으며, 대표적인 방법으로서 Chien의 방법과 그 변형법(Chien et al., The Journal of Clinical Investigation, 75:1770-1780, (1985); Meidell et al., American Journal of Physiology, 251: H1076-H1084, (1986); Tamamori et al., American Journal of Physiology, 275: H2036-H2040, (1998)) 등을 사용할 수 있다.

또한, 배양 심근 세포는 상기한 예로만 한정되지 않으며, 각종 줄기 세포로부터 분화 유도하여 수득되는 심근 세포도 포함한다. 본 발명을 실시하는데 사용되는 줄기 세포는, 시험관 내 배양시 심근 세포 유사 표현형을 가진 세포로 분화될 수 있는 형질을 가진 세포를 의미하며, 구체적으로는, 이미 배양 세포로서 널리 사용되고 있는 마우스, 원숭이, 인간 등의 포유동물 유래의 배아 줄기 세포(ES 세포)나 인공 다능성 줄기 세포(iPS 세포), 배아 생식 세포(EG 세포) 등의 다능성 줄기 세포를 들 수 있다. 이들 세포의 제작, 계대, 보존법에 대해서는 이미 표준적인 프로토콜이 확립되어 있으며, 당업자는 복수의 참고 문헌, 예컨대, Manipulating the Mouse Embryo: A laboratory manual(Hogan 등, Cold Spring Harbor Laborayory Press, 1994)나, Embryonic Stem Cells(Turksen 등, Humana Press, 2002), 및 복수의 참고 문헌(Matsui et al., Cell, 70:841-847, (1992); Shamblott et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 95:13726-13731, (1998); Okita et al., Nature, 448:313-317, (2007); Takahashi et al., Cell, 131:861-872, (2007))을 참조함으로써, 이들 다능성 줄기 세포를 용이하게 사용할 수 있다. 본 발명에서 사용할 수 있는 줄기 세포는 전술한 줄기 세포로 한정되지 않으며, ES 세포와 유사한 형질을 가지는 줄기 세포이면 어떠한 것이라도 사용할 수 있다. 이 경우, ES 세포와 유사한 형질이란, ES 세포에 특이적인 표면(항원) 마커의 존재나 ES 세포 특이적인 유전자의 발현, 또한 테라토마(teratoma) 형성능 또는 키메라 마우스 형성능과 같은, ES 세포에 특이적인 세포 생물학적 성질로 정의될 수 있다.

또한, ES 세포와 유사한 형질을 갖지 않는 세포 또는 다능성 줄기 세포가 아닌 세포라도, 적어도 시험관내 배양 하에 심근 세포 유사 형질을 가지는 세포로 분화될 수 있는 성질을 가진 세포라면, 본 발명에 기재된 방법을 적용할 수 있다. 이러한 세포의 예로는, 골수 세포로부터 유래되는 골수간엽계 줄기 세포(Bruder et al., USP 5,736,396; Pittenger et al., Science, 284:143-147, (1999)) 또는 CMG 세포(Makino et al., The Journal of Clinical Investigation, 103:697-705, (1999); WO01/048151), 근 조직 유래의 Spoc 세포(WO03/035382) 등의 세포를 예로 들 수 있다.

본 발명에서, 줄기 세포로부터 심근 세포를 제조하는 배양 방법은, 심근 세포의 분화 유도에 적절한 방법이라면, 어떠한 배양 방법이라도 사용할 수 있다. 구체적인 분화 유도법과 관련하여 이미 복수의 방법들이 확립되어 있으며, 당업자라면, 예컨대, Embryonic Stem Cells(Turksen, Humana Press, 2002)과 같은 참고 문헌이나, 복수의 참고 문헌(Klug et al., The Journal of Clinical Investigation, 98:216-224, (1996); Wobus et al., Journal of Molecular and Cellular Cardiology, 29:1525-1539, (1997); Kehat et al., The Journal of Clinical Investigation, 108:407-414, (2001); Xu et al., Circulation Research, 91:501-508, (2002); Takahashi et al., Circulation, 107:1912-1916, (2003); Field et al., USP 6,015,671; Xu et al., WO03/06950)을 참조함으로써, 줄기 세포로부터 심근 세포를 분화 유도할 수 있다.

마이크로 RNA(miRNA)

본 발명은 심근 세포에 대해 증식 촉진 작용을 가지는 마이크로 RNA(miRNA)를 제공한다. 본 발명에 따른 miRNA는, 심근 세포의 증식을 촉진하는 한, 임의의 miRNA일 수 있으며, 상기 심근 세포를 증식시키기 위해 사용할 수 있다.

본원에서, miRNA는 포유류를 비롯한 진핵생물에서 매우 많이 발현되는 소형 단백질을 코딩하지 않는 RNA로서, 발생, 분화, 증식 등의 다양한 생명 현상에 관여하고 있는 것으로 보인다. 본원에서 사용할 수 있는 miRNA로는, 성숙형 miRNA, 상기 miRNA의 전구체, 및 이들의 변이체 및 유사 물질을 포함한다. 본 발명에 따른 miRNA는 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다.

본원에서, 성숙형 miRNA는 완전히 프로세싱된 miRNA이며, 15 - 30개의 뉴클레오티드 길이(많게는 21 - 25개의 뉴클레오티드 길이)이다. 성숙형 miRNA는, 성숙형 miRNA 분자의 5' 측의 1번에서 12번까지의 뉴클레오티드 영역에서 적어도 6개가 연속되는 뉴클레오티드를 공유하는(상기 뉴클레오티드 부분은 「시드 영역」이라고도 함) (Brennecke et al., PLoS Biology, 3: e85, (2005)), 일군의 miRNA로 이루어진 miRNA 패밀리를 구성할 수 있다. 따라서, miRNA 패밀리는, 성숙형 miRNA의 5' 영역은 동일하지만 3' 측은 상이한, 복수의 성숙형 miRNA를 포함한다. 동일한 miRNA 패밀리에 속하는 것이라면, 3' 측 영역의 핵산 서열이 상이하더라도, 동일한 기능을 가지는데, 예를 들면, Bagpipe 3'UTR 내 단일 위치에서 8-mer의 시드 영역의 서열(시드 서열)이 보고된 바가 있으며(Brennecke et al., PLoS Biology, 3: e85, (2005)), 이 경우, 전술한 단일 위치에 존재하는 8-mer의 시드 영역의 서열이 결합하는 서열과 상보적인 서열을 5' 영역에 공유하는 miRNA 패밀리를 구성하는 miRNA들 중에서, 2종의 다른 miRNA는 3' 측이 다르지만, 8-mer 타겟을 포함하는 리포터 유전자의 발현을 억제할 수 있는 것으로 보고되어 있다.

miRNA의 전구체는 성숙형 miRNA의 전구체 RNA이다. 성숙형 miRNA의 제조 과정에서, 살아있는 세포에서, miRNA는, 게놈 DNA 상에 존재하는 miRNA 유전자로부터, 먼저 약 수백 - 수천개의 염기로 이루어진 miRNA 1차 전사 산물(pri-miRNA)로 전사된 다음, 핵내에서 Drosha라고 하는 RNase III 효소에 의해 프로세싱되어 약 70개의 염기 길이의 헤어핀 구조를 가지는 전구체 miRNA(pre-miRNA)가 된다. 따라서, 본원에서 miRNA의 전구체에는 miRNA의 1차 전사 산물(pri-miRNA) 및 전구체 miRNA(pre-miRNA)가 포함된다.

miRNA 변이체는, 생물체가 본래 가지고 있는 성숙형 miRNA 또는 성숙형 miRNA의 전구체와 비교하여, 1개 또는 수개의 뉴클레오티드가 결실, 치환, 삽입 또는 부가된, miRNA이다. 여기서 수개란, 예컨대, 7 또는 6개 이하, 바람직하게는 5 또는 4개 이하, 더 바람직하게는 3 - 1개 이하이다. 전술한 바와 같이, miRNA 패밀리를 구성하는 성숙형 miRNA 분자의 5' 측에 「시드 영역」이 존재하며, 동일한 miRNA 패밀리에 속하면 3' 측 영역의 핵산 서열이 상이하더라도 동일한 기능을 가진다. 따라서, miRNA 변이체는, 성숙형 miRNA의 시드 영역 이외의 부분에서, 뉴클레오티드가 결실, 치환, 삽입 또는 부가된 miRNA인 것이 바람직하다.

miRNA 유사 물질은 내재성의 성숙형 miRNA 또는 성숙형 miRNA의 전구체를 모방하도록 합성된 miRNA이다. 이러한 물질은 시판되고 있어(예, Ambion), 용이하게 입수할 수 있다.

본 발명의 miRNA로는, 안정성을 높이기 위해, 예를 들면, 핵산 유도체 및/또는 변형된 뉴클레오티드간 결합을 포함하는 핵산이 사용된다. 이들 핵산 유도체는, 공지의 것으로부터 적절하게 선택하여 사용할 수 있다. 구체적으로, 예컨대, 메틸포스포네이트(methylphosphonate), 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 포스포로디티오에이트(phosphorodithioate), 포스포르아미데이트(phosphoramidate), 포스포트리에스테르(phosphotriester), 설폰(sulfone), 실록산(siloxane), 카르보네이트(carbonate), 카복시메틸에스테르(carboxymethylester), 아세트아미데이트(acetamidate), 카르바메이트(carbamate), 티오에테르(thioether), 가교형 포스포르아미데이트(bridged phosphoramidate), 가교형 메틸렌포스포네이트(bridged methylene phosphonate), 가교형 포스포로티오에이트(bridged phosphorothioate), 디메틸렌-설파이드(dimethylene-sulfide), 디메틸렌-설폭사이드(dimethylene-sulfoxide), 디메틸렌-설폰(dimethylene-sulfone), 2'-O-알킬 및 2'-데옥시-2'-플루오로포스포로티오에이트(2'-deoxy-2'-fluorophosphorothioate)와 같은, 뉴클레오티드간 결합을 포함하는 핵산 등을 들 수 있다(Uhlmann & Peyman, Chemical Reviews, 90:543-584, (1990)), Schneider et al., Tetrahedron Letters, 31:335-338, (1990)). 아울러, Locked Nucleic Acid(Koshkin et al., Journal of the American Chemical Society, 120:13252-13253 (1998)) 및 ENA(US7335765) 등의 유도체도 들 수 있다. 이러한 핵산 유도체 및/또는 변형된 뉴클레오티드간 결합을 포함하는 miRNA는, 본원에서 miRNA 유도체라 한다. miRNA 유도체는 성숙형 miRNA의 유도체, miRNA 전구체의 유도체, miRNA 변이체의 유도체, 및 miRNA 유사 물질의 유도체를 포함한다.

본원에서 이용가능한 miRNA는, 예컨대, 공지의 방법을 이용하여, 천연물로부터 분리함으로써, 화학적으로 합성함으로써, 또는 유전자 재조합 기술에 의해 생산함으로써 입수할 수 있거나, 또는 시판 제품으로서 입수할 수도 있다. 예컨대, 성숙형 miRNA는 Sanger miRbase에 등록되어 있으며, 등록되어 있는 모든 miRNA는 Ambion, Qiagen, Sigma, Thermo Scientific 등으로부터 입수할 수 있다.

miRNA를 생체내 세포 또는 시험관내 세포로 세포내 전달하기 위한 수단으로서, 발현 벡터 또는 리포솜 등과 같이, 상기 기술 분야에서 통상 사용되는 유전자 전달 수단들 중 임의의 수단을 사용할 수도 있다. 상기 성숙형 miRNA 또는 miRNA 전구체는, 올리고 핵산 또는 유도체의 형태로 사용할 수도 있지만, 발현 효율이나 효과 지속 기간 등의 측면에서 발현 벡터에 조합된 형태로 사용하는 것이 바람직하다.

유전자 전달 수단으로서 발현 벡터를 사용하는 경우, miRNA를 발현할 수 있는 프로모터를 포함하는 한 어느 것이라도 가능하며, 바이러스성 발현 벡터 또는 비-바이러스성의 발현 벡터를 사용할 수 있다.

바이러스성 발현 벡터로는 아데노바이러스, 아데노 수반 바이러스(AAV), 레트로바이러스, 일본 혈구 응집성 바이러스(HVJ; 별명, 센다이 바이러스), 렌티바이러스, 백시니아 바이러스, 치크 폭스바이러스, SV40를 대표되는 파포바 바이러스 등으로부터 유래되는 벡터를 예시할 수 있지만, 바람직하게는, 아데노바이러스 벡터, AAV 벡터, HVJ 벡터 또는 렌티바이러스 벡터를 사용하여, 효율적인 유전자 도입과 도입된 유전자의 고수준의 발현을 행할 수 있다.

이들 바이러스 벡터를 이용한 유전자 도입이 포유동물의 세포에 유전자를 도입하는 가장 강력한 방법의 한가지이며, 사실상, 모든 종류의 인간 세포 및 인간을 제외한 다수의 세포에 도입하기 위해 사용할 수 있다.

또한, 이들 바이러스에 의한 감염은 세포 주기에 의존하지 않으므로, 다양한 초대 배양 세포주 및 형질전환된 세포주에서 유전자를 발현시킬 수 있다. 특히 심근 세포와 같이 DNA 합성 또는 세포 분열을 일으키지 않는 세포에서도 양호한 효율로 유전자를 도입할 수 있다. 감염된 후 다수 세포들은 재조합 DNA(또는 RNA)를 다수 카피로 갖게 되므로, 도입된 유전자는 일시적으로 고수준으로 발현될 것이다.

아데노바이러스 벡터, HVJ 벡터 등의 경우, 통상, DNA/RNA는 세포질에 머물며, 핵에 도입되지 않는다. 따라서, 이들 바이러스 벡터를 사용하면, 외래 유전자가 숙주 세포 게놈에 도입될 때 랜덤으로 발생하는 돌연변이 유발성 에러가 거의 발생되지 않는 이점도 있다.

본 발명의 바람직한 일 구현예에서 사용될 수 있는 아데노바이러스 벡터는, 인간의 태아 신장 293 세포 또는 대장균을 숙주로 한 상동 재조합에 의한 방법(Miyake et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 93:1320-1324, (1996)), 또는 간단한 시험관내 라이게이션에 의한 방법(Mizuguchi & Kay, Human Gene Therapy, 9:2577-2583, (1998))으로, 제조할 수 있다.

아데노바이러스는 이중 가닥 DNA 게놈을 가지는 DNA 바이러스들 중 하나로, 가장 많이 연구되어 있는 것은 인간 아데노바이러스 5형과 2형이다. 이들 야생형 아데노바이러스에서 E1 및 E3 유전자 대부분을 결실시킴으로써, 복제능이 없는 바이러스 벡터를 제작할 수 있으며, 바이러스 입자 형성에 유해한 작용을 하지 않으면서, 수 kb의 외래 DNA를 삽입할 수 있다. 상기 재조합 아데노바이러스에는 전사 조절 인자인 E1 유전자가 결핍되어 있지만, 삽입되는 유전자 특이적인 전사 유닛에 의해, 표적 세포의 증식이나 그 외 바이러스 유전자의 존재 유무에 상관없이, 삽입된 목적 유전자만 발현시킬 수 있다.

아데노 수반 바이러스(AAV)는 파르보 바이러스 과에 속하는 약 4.7 kb의 단일 가닥 DNA 바이러스로, 혈청형 1형 - 12형의 AAV가 알려져 있다. AAV 벡터는 양쪽 단부의 ITR(Inverted terminal repeat) 사이에 위치하는 Rep(복제 또는 게놈 도입에 관여함) 및 Cap(캡시드)를 목적 유전자로 치환함으로써, 제조된다. 이 벡터는, Rep와 Cap를 발현하는 플라스미드와 함께, 293 세포에 도입한 다음, 아데노바이러스를 헬퍼 바이러스로 사용하여 감염시켜, 핵 내에 축적된 재조합 아데노 수반 바이러스 벡터를 만든다. 최근에는 E1A와 E1B를 발현하는 293 세포에, E2A, E4 및 VA를 발현하는 플라스미드를 도입함으로써, 헬퍼 바이러스가 필요없는 방법도 개발되었다.

센다이 바이러스(Sendai virus; SeV)는 파라믹소바이러스 속(Paramyxoviridae)에 속하는 설치류의 바이러스로, 별명으로 일본 혈구 응집성 바이러스(Hemagglutinating Virus of Japan; HVJ)로도 불리운다. SeV의 게놈은 (-) 단일 가닥 RNA(mRNA에 상보적임)로 이루어져 있으며, 핵단백(NP: nucleocapsid), 핵단백인산화효소(P: polymerase), 바이러스 표면 배접 단백질(M: matrix), 적혈구 응집 단백질(HN: hemagglutinin-neuraminidase), 막 융합 단백질(F: fusion protein), 및 RNA 합성 효소(L: large protein)인, 6개의 유전자를 코딩한다. SeV는 HN(hemaglutination-neuraminidase) 단백질에 의해 숙주 세포의 시알산에 흡착 및 분해함으로써 결합하여, 게놈을 세포질 내로 유입시킨다. 세포 내로 이행된 바이러스 게놈은 자신이 코딩하는 L 단백질의 기능에 의해 유전자의 전사 및 복제를 수행한다. 이러한 단계는 통상의 바이러스와는 다르게 세포질에서 이루어지며, 바이러스 게놈은 핵내로 이행되지 않는다.

SeV 벡터는, 도입된 세포내에서, 벡터의 자율적인 증식에 필요한 N, P, L 유전자를 제외한, F, HN 및 M 유전자 중 하나 또는 복수개를 제거함으로써, 비-전파성 벡터로서 제작할 수 있다. F 유전자 결실형 벡터는, 박테리오파지 T7 유래의 RNA 중합효소에 의해 인지되는 T7 프로모터 하류에 재조합 벡터 cDNA가 삽입된 플라스미드, T7 프로모터의 제어 하에 N, P, F 및 L을 발현하는 플라스미드, 및 T7 RNA 중합효소를 발현하는 재조합 벡시니아 바이러스를, 원숭이 신장 유래의 LLC-MK2 세포에 도입함으로써, 제조하지만, 최근에는, 6종의 플라스미드(T7 프로모터 하류에 재조합 벡터 cDNA가 삽입된 플라스미드, 및 CAG 프로모터의 제어 하에 N, P, L, F 및 T7 RNA 중합효소를 각각 발현하는 플라스미드)로 형질전환하는 단계만을 포함하는 간편한 제작법으로도 제조할 수 있게 되었다.

아데노바이러스 벡터 및 기타 바이러스 벡터에 대한 총설과, 제작법 또는 사용법에 대해서, 당업자는 복수의 참고 문헌들을 참조할 수 있다. 예컨대, Gene Therapy Protocols: Methods in Molecular Medicine(Robbins, Humana Press, 1997), Gene Transfer in Cardiovascular System: Experimental Approaches & Therapeutic Implications(March, Kluwer Academic Publishers, 1997), Adenoviral Vectors for Gene Therapy(Curiel & Douglas, Academic Press, 2002) 등을 들 수 있다. 또한, 아데노바이러스 벡터를 제작하기 위한 키트도 시판되고 있어(Invitrogen사의 ViraPower^TM 아데노바이러스 발현 시스템(#K4930), 다카라 바이오사의 Adenovirus Expression Vector Kit(#6170) 등), 용이하게 입수할 수 있으며, 본 발명을 실시하는데에도 이용할 수 있다.

또한, AAV 벡터나 SeV 벡터를 제작하기 위한 키트도 시판되고 있어(AAV Helper-Free 시스템(Stratagene; #240071), 재조합 센다이 바이러스 미니 벡터 제조 키트(MBL; DV-0001) 등), 용이하게 입수할 수 있으며, 본 발명을 실시하는데에도 이용할 수 있다.

비-바이러스성 발현 벡터로는, 예컨대, SV(Simian virus) 40 바이러스 프로모터, 사이토메갈로바이러스(Cytomegalo virus; CMV) 프로모터, 라우스 육종 바이러스(Rous sarcoma virus) 프로모터 등의 바이러스로부터 유래되는 프로모터, β-엑틴 프로모터, EF(elongation factor) 1α 프로모터 등, 트리 β-엑틴 프로모터에 CMV의 인핸서와 토끼 β-글로빈 유전자의 폴리-A 부가 시그널 서열로 구성된 하이브리드 프로모터인 CAG 프로모터(Niwa et al., Gene, 108:193-199, (1991)), 및 Pol.III 프로모터인 U6 또는 H1 프로모터 등을 포함하는 벡터를 들 수 있지만, 이들 벡터로 한정되지 않는다. 이들 프로모터를 이용할 수 있는 발현 벡터들이 시판되고 있어(Ambion, Invitrogen, TAKARA BIO), 용이하게 입수할 수 있다.

상기 유전자 또는 유전자 벡터를 도입하기 위한 방법에서, 공지의 방법들 모두 이용가능하며, 예를 들어, 인산 칼슘 또는 전기 펄스를 이용한 형질감염 방법, 리포솜 등에 목적 유전자를 넣은 상태로 세포로 형질감염시키는 방법, 그리고 레트로바이러스나 아데노바이러스 등의 바이러스 벡터에 목적 유전자를 조합시켜 재조합 바이러스를 세포에 감염시키는 방법 등을 들 수 있다. 여기서, 바이러스 벡터는 바이러스 DNA 또는 RNA의 전체 또는 일부가 결손 또는 변이된 핵산 서열에 목적 유전자를 삽입하여, 발현할 수 있도록 구축된 구축물이다.

리포솜의 구체예로는, N-[2,3-(디올레일옥시)프로필]-N,N,N-트리메틸암모늄 염클로라이드(DOTMA), 디올레일포스파티딜에타놀아민(DOPE) 등을 포함하는 지방질 제제를 사용할 수 있다.

구체적인 miRNA의 입수

본 발명자들은 심근 세포에 도입하였을 때 현저한 BrdU 흡수력(uptake ability)의 발휘 여부에 따라 성숙형 miRNA의 라이브러리를 검색하여, 심근 세포에 대해 증식 촉진 작용을 가지는 성숙형 miRNA로서 miR-148a(서열번호 3), miR-148b(서열번호 5), miR-152(서열번호 7), 및 miR-373(서열번호 9) 등을 발견하였으며, 이들을 새로운 실험에 사용하였다.

본원에서 사용할 수 있는 바람직한 miRNA는 이들 성숙형 miRNA의 전구체도 또한 포함한다. 예를 들어, 성숙형 miRNA의 전구체로는, 각 miRNA의 miRNA 1차 전사 산물(pri-miRNA) 또는 전구체 miRNA(pre-miRNA) 등을 예로서 들 수 있다. 구체예로는, 예컨대, 전술한 구체적인 성숙형 miRNA를 코딩하는 유전자의 1차 전사 산물(pri-miRNA)인, 아래에 나열한 서열들은, 본원에서 사용할 수 있는 바람직한 miRNA에 포함된다: mir-148a(miR-148a의 전구체, 서열번호 4), mir-148b(miR-148b의 전구체, 서열번호 6), mir-152(miR-152의 전구체, 서열번호 8), 및 mir-373(miR-373의 전구체, 서열번호 10).

miRNA 명	서열	서열번호
miR-148a	ucagugcacu acagaacuuu gu	3
mir-148a	gaggcaaagu ucugagacac uccgacucug aguaugauag aagucagugc acuacagaac uuugucuc	4
miR-148b	ucagugcauc acagaacuuu gu	5
mir-148b	caagcacgau uagcauuuga ggugaaguuc uguuauacac ucaggcugug gcucucugaa agucagugca ucacagaacu uugucucgaa agcuuucua	6
miR-152	ucagugcaug acagaacuug g	7
mir-152	uguccccccc ggcccagguu cugugauaca cuccgacucg ggcucuggag cagucagugc augacagaac uugggcccgg aaggacc	8
miR-373	gaagugcuuc gauuuugggg ugu	9
mir-373	gggauacuca aaaugggggc gcuuuccuuu uugucuguac ugggaagugc uucgauuuug ggguguccc	10

본원에서 사용할 수 있는 miRNA에는, 상기 표 1에 나타낸 성숙형 miRNA 및 전구체 miRNA의 변이체나 유사 물질, 또는 상기 표 1에 나타낸 miRNA의 전구체 이외의 miRNA의 전구체(예, miRNA 1차 전사 산물(pri-miRNA) 등) 및 그 변이체나 유사 물질도 포함된다.

예를 들면, 본원에서 사용할 수 있는 성숙형 miRNA인 miR-148a(서열번호 3), miR-148b(서열번호 5) 및 miR-152(서열번호 7)은, 각각의 miRNA의 5' 측에 공통의 시드 서열, ucagugca(서열번호 1)를 포함하는, miR-148 패밀리를 구성한다. 아래에 miR-148 패밀리에 속하는 miRNA의 각 서열을 열거하여 나타낸다. 보존된 시드 서열은 밑줄로 표시되어 있다.

miR-148a: ucagugcacuacagaacuuugu(서열번호 3)

miR-148b: ucagugcaucacagaacuuugu(서열번호 5)

miR-152: ucagugcaugacagaacuugg(서열번호 7).

따라서, 본 발명의 miRNA의 하나로서, ucagugca(서열번호 1)로 이루어진 시드 서열을 5' 말단에 포함하는 성숙형 miRNA 또는 상기 miRNA의 전구체, 또는 이들의 변이체 또는 유사 물질을 포함한다. 이들 miRNA에는, miR-148a(서열번호 3), miR-148b(서열번호 5), miR-152(서열번호 7), 상기 miRNA의 전구체, 및 이들의 변이체 및 유사 물질로 이루어진 군으로부터 선택되는 miRNA가 포함된다. 예를 들어, 성숙형 miRNA인 miR-148a(서열번호 3), miR-148b(서열번호 5), 및 miR-152(서열번호 7)의 전구체로서는, 각 miRNA의 pri-miRNA, pre-miRNA 등을 들 수 있다. 그 구체적인 예로, 예컨대 각각 아래 서열번호 4, 6 및 8로 표시되는 전구체를 들 수 있다.

인간 mir-148a: gaggcaaagu ucugagacac uccgacucug aguaugauag aagucagugc acuacagaac uuugucuc(서열번호 4)

인간 mir-148b: caagcacgau uagcauuuga ggugaaguuc uguuauacac ucaggcugug gcucucugaa agucagugca ucacagaacu uugucucgaa agcuuucua(서열번호 6)

인간 mir-152: uguccccccc ggcccagguu cugugauaca cuccgacucg ggcucuggag cagucagugc augacagaac uugggcccgg aaggacc(서열번호 8).

또한, 본원에 사용할 수 있는 다른 성숙형 miRNA인 miR-373은, miRNA의 5' 측에 공통된 시드 서열, gaagugcu(서열번호 2)를 포함하며, miR-373 패밀리를 구성한다. miR-373 패밀리에 속하는 miRNA의 서열을 아래에 나타낸다. 시드 서열은 밑줄로 표시되어 있다.

miR-373: gaagugcuucgauuuuggggugu(서열번호 9).

따라서, 본 발명의 miRNA의 하나로서, gaagugcu(서열번호 2)로 이루어진 시드 서열을 5' 말단에 포함하는 성숙형 miRNA 또는 상기 miRNA의 전구체, 또는 이들의 변이체 또는 유사 물질을 포함한다. 이들 miRNA에는, miR-373(서열번호 9), 상기 miRNA의 전구체, 및 이들의 변이체 및 유사 물질로 이루어진 군으로부터 선택되는 miRNA가 포함된다. 예컨대, 성숙형 miRNA인 miR-373(서열번호 9)의 전구체로는 상기 miRNA의 pri-miRNA, pre-miRNA 등을 들 수 있다. 구체적인 예로는 예컨대 아래 서열번호 10으로 표시되는 전구체를 들 수 있다.

인간 miR-373: gggauacuca aaaugggggc gcuuuccuuu uugucuguac ugggaagugc uucgauuuug ggguguccc(서열번호 10).

이렇게 수득되는 본 발명에 따른 miRNA는 심근 세포에 대해 현저한 증식 활성을 나타내는 것으로 확인되었다.

아울러, 본 발명에 따른 miRNA는 정상 세포주로부터 확립된 세포인 MRC-5(인간 태아 폐 유래) 세포, WI-38(인간 태아 폐 유래) 세포 및 MC3T3-E1(마우스 두엽관 유래) 세포 등에 대해서는 유의한 증식 촉진 활성을 나타내지 않았다.

유전자 치료법으로서의 적용

본 발명의 다른 구현예로서, 본 발명의 실시에 사용되는, 바이러스 벡터 또는 비-바이러스성 벡터 등의 발현 벡터로서 심근 세포에 대해 증식 촉진 작용을 가지는 miRNA를 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터(이하, 단순히 「유전자 발현 벡터」라 함), 바람직하게는 바이러스 벡터, 더 바람직하게는 아데노바이러스 벡터 또는 HVJ 벡터, AAV 벡터, 렌티바이러스 벡터 등을 포함하는, 유전자 치료용 의약 조성물을 제공한다. 유전자 발현 벡터에 포함되는 miRNA를 코딩하는 핵산은 상기에서 설명한 「구체적인 miRNA 입수」 단락에서 기술된 miRNA를 코딩하는 핵산들 중 임의의 것일 수 있다. 이러한 유전자 치료용 의약 조성물은 심근 세포에 대해 증식 촉진 작용을 가지는 miRNA를 코딩하는 핵산을 포함하므로, miRNA의 작용에 의해, 심근 재생제 또는 심장 질환 치료제로서 사용할 수 있다. 치료의 대상으로 되는 심장 질환은 심근 세포의 쇠약, 기능 정지 또는 사멸을 수반하는 한 특별히 한정되지 않으며, 구체적인 예로는 심근경색, 허혈성 심질환, 울혈성 심부전, 비대형 심근증, 확장형 심근증, 심근염, 만성 심부전 등을 들 수 있다.

의약 조성물의 제형은 특별히 한정되지 않으며, 관용적인 방법을 통해 제제화할 수 있다. 예컨대, 멸균수나 완충화된 생리식염수 등의 약학적으로 허용가능한 약제 캐리어나 희석액 중에, 본 발명의 유전자 발현 벡터를 포함하는 주사가능한 조제물 형태일 수도 있다. 약제 담체는 그 외에 적절한 안정제(예, 뉴클레아제 저해제 등), 킬레이트제(예, EDTA 등) 및/또는 다른 보조제도 포함할 수 있다. 상기 성분을 포함하는 의약 조성물은 필요에 따라 여과 등의 방법으로 멸균하고, 무균 앰플 등의 용기에 충전할 수 있다.

본 발명의 의약 조성물의 투여량은 환자의 연령, 성별, 체중, 증상 및 투여 경로 등의 조건에 따라 적절하게 증감하여 사용할 필요가 있지만, 당업자라면 필요한 용량을 적절하게 설정할 수 있다. 일반적으로는, 성인 1회 당 유효 성분의 DNA 양은 약 1.0 ㎍/kg - 약 1.0 g/kg의 범위이며, 바람직하게는 약 10 ㎍/kg - 약 100 mg/kg의 범위이다. 또한, 아데노바이러스 벡터 등의 바이러스 벡터를 사용하는 경우, 바이러스의 최종적인 역가는 바람직하게는 10⁷ - 10¹³ pfu/mL, 더 바람직하게는 10⁹ - 10¹² pfu/mL이다.

본 발명의 의약 조성물은, 유전자 발현 벡터가 비-바이러스성 벡터를 기반으로 하는 경우에는 특히 리포솜과의 복합체로서 제공될 수 있다. 이러한 형태는 특히 심근 세포에 대해 높은 형질전환 효율을 실현시킬 가능성을 가지고 있다. 리포솜에 대한 구체적인 예로서, N-[2,3-(디올레일옥시)프로필]-N,N,N-트리메틸암모늄 클로라이드(DOTMA), 디올레일포스파티딜 에탄올아민(DOPE) 등을 비롯하여, 수많은 새로운 지방질 제제가 개발되어 있으며, 다양한 세포주들에서 형질전환에 대한 실험이 진행되고 있다 (Banerjee, Journal of Biomaterials Applications, 16:3-21, (2001); Maurer et al., Expert Opinion on Biological Therapy, 1:923-947, (2001)). 또한, HVJ 유래의 융합 형성용 외막(envelope)을 포함하는 융합 형성용 바이러스 리포솜을 사용하는 방법, 소위 HVJ-리포솜 방법 (Yonemitsu et al., International Journal of Oncology, 12:1277-1285, (1998); Kaneda et al., Molecular Medicine Today, 5:298-303, (1999))도 유효하다. 핵산 도입을 목적으로 하는 이러한 리포솜들이 시판되고 있으며, 특히 miRNA의 도입을 대상으로 한 것으로는 Lipofectamine RNAi MAX (Invitrogen), Oligofectamine (Invitrogen), siLentFect (BIO-RAD), HiPerFect (Qiagen) 등을 이용할 수 있다.

상기의 유전자 발현 벡터 또는 그것을 포함하는 의약 조성물은, 심장 질환 환자의 심장 전체에 도입될 수 있지만, 장애 부위에 국한된 도입을 행하는 것이 바람직하다. 본원에서 장애 부위란, 개체(인간 또는 인간을 제외한 동물: 이하 동일함)에서 심근 세포가 쇠약, 기능 정지 또는 사멸된 부위 및 그 주변 영역, 또는 개체에서 심근 세포의 쇠약, 기능 저하의 진행 또는 사멸이 예상되는 부위를 의미한다. 이 경우, 유전자 발현 벡터 또는 그것을 포함하는 의약 조성물을 장애 부위에 도입하는 방법으로는, 침투 펌프나 침투 튜브 등을 사용하여 제제를 연속적으로 장애 부위로 수송하는 방법도 가능하며, 개흉한 후 주사기를 사용하여 직접 심장에 주입하는 방법 또는 X 선 투시 하에 카테터를 사용하여 경혈관적(간접적)으로 주입하는 방법 등도 있을 수 있다.

경혈관적 방법은 유전자의 도입을 심장으로만 국한할 수 있어 바람직하며, 이 경우, 유전자 발현 벡터 또는 이를 포함하는 의약 조성물은 혈관내에 주입하여 혈류를 통해 심근 세포로 수송하거나, 또는 심근층 내로 직접 주입하여 심근 세포와 접촉시킬 수도 있다. 이와 같은 카테터 등을 이용한 외과적 수술 기법은 당해 기술 분야에 공지되어 있으며, 참고 문헌으로서 예로, Gene Transfer in Cardiovascular System: Experimental Approaches & Therapeutic Implications (March, Kluwer Academic Publishers, 1997) 또는 Vascular Surgery 제5판 (Rutherford, W.B. Saunders, 2000), Textbook of Interventional Cardiology 제4판 (Topol, W.B. Saunders, 2002) 등의 문헌을 들 수 있다. 또한, 상기 방법을 실시하기 위해 사용되는 카테터는 시판되고 있어(Boston Scientific, Edwards Lifesciences Corporation 등), 용이하게 입수할 수 있다.

본 발명의 방법으로 증식시킨 심근 세포의 이용

본 발명에 따른 방법으로 증식시킨 심근 세포는 계속하여 공지의 방법에 의해 세포 회수, 분리, 정제함으로써, 고순도의 심근 세포를 효율적으로 보다 다량으로 수득할 수 있다. 이렇게 수득한 심근 세포를 이하, 본 발명에 따라 제조된 심근 세포라 한다.

심근 세포의 정제 방법으로는 공지된 세포 분리 및 정제 방법들을 모두 사용할 수 있으며, 구체적인 예로는 유세포 측정, 자기 비드 또는 패닝법 등의 항원-항체 반응에 준한 방법, 또는 자당, 퍼콜 등의 담체를 이용한 밀도 구배 원심 분리에 의한 세포 분획법을 들 수 있다.

또한, 심근 세포의 다른 선별법으로는, 미리 심근 세포의 공급원이 되는 동물이나 ES 세포 등의 줄기 세포의 유전자에, 인위적으로 약제 내성 또는 이소성 단백질(ectopic protein)의 발현능을 부여하도록 변형을 가하고, 이를 지표로 심근 세포를 선택적으로 회수하는 방법을 들 수 있다. 예를 들어, Field 및 공동 연구자들은, α형 미오신 중쇄 프로모터의 통제 하에 네오마이신(G418) 내성 유전자를 발현할 수 있는 유전자 카세트를 마우스 ES 세포에 도입함으로써, 상기 ES 세포가 심근 세포로 분화되고 그에 따라 α형 미오신 중쇄 유전자를 발현할 때만, G418가 첨가된 배지에서 생존할 수 있는 시스템을 구축하였고, 이러한 방법에 의해 G418 내성 세포로서 선별된 세포는 99% 이상의 확률로 심근 세포임을 보고하였다 (USP 6,015,671; Klug et al., The Journal of Clinical Investigation, 98:216-224, (1996)).

본 발명의 또 다른 구현예로서, 본 발명에 따라 제조된 심근 세포는 각종 생리 활성 물질(예, 약물) 또는 기능이 알려져 있지 않은 신규 유전자 산물 등의 약리 평가 및 활성 평가에 유용하다. 예를 들면, 심근 세포의 기능 조절과 관련된 물질이나 약제, 또는 심근 세포에 대해 독성 또는 상해성을 나타내는 물질이나 약제를 스크리닝하는데 이용할 수 있다. 추가적인 구현예로서, 본 발명에 따라 제조된 심근 세포를 포함하는 평가 키트는 상기 스크리닝에 유용하다.

스크리닝에 제공되는 피검 물질은 배양계에 첨가할 수 있는 임의 종류의 것이며, 예를 들어, 저분자 화합물, 고분자 화합물, 유기 화합물, 무기 화합물, 단백질, 펩타이드, 유전자, 바이러스, 세포, 세포 배양액, 미생물 배양액 등을 들 수 있다. 유전자를 효율적으로 배양계에 도입하는 방법으로는 레트로바이러스, 아데노바이러스 등의 바이러스 벡터를 사용하여 배양계에 첨가하는 방법, 또는 리포솜 등에 밀봉하여 배양계에 첨가하는 방법 등을 들 수 있다.

피검 물질에 대한 평가는 심근 세포 기능의 질적 또는 양적인 변화를 측정함으로써 행할 수 있다. 심근 세포의 생존성을 일례로 들면, 본 발명에 따라 제조된 심근 세포를 적정 세포 밀도로 배양 플레이트에 접종하여 무혈청 배지에서 배양하여 세포자살(아포토시스(apoptosis))을 유도할 수 있지만, 이 때, 적정량의 피검 물질을 배지에 첨가하여 심근 세포의 생존률 또는 사망률을 측정하면 된다. 심근 세포의 생존률 또는 사망률의 측정 방법은 트립판블루 등의 색소의 유입을 지표로 한 육안적인 관찰에 의해 수행할 수 있으며, 탈수소효소의 활성(환원 활성)을 지표로 한 방법, 또는 아포토시스(apoptosis) 세포에 특이적인 카스파제 활성이나 아넥신 V의 발현을 지표로 한 방법을 이용할 수도 있다. 이러한 메카니즘을 이용한 키트는 시판되고 있어(Sigma, Clonetech, Promega 등), 용이하게 입수할 수 있다.

상기 스크리닝 방법에 의해 확인되는 물질이나 약제는 심근 세포의 분화 유도 작용 또는 기능 조절 작용을 구비한 것이므로, 예를 들어, 심근경색, 허혈성 심질환, 울혈성 심부전, 비대형 심근증, 확장형 심근증, 심근염, 만성 심부전 등의 심장 질환 예방제 또는 치료제로서 사용할 수 있다. 이들 화합물은 신규 화합물이거나 공지 화합물일 수 있다.

또한, 본 발명에 따라 제조된 심근 세포는 심근 재생 또는 심장 질환 치료를 위한 이식용 세포로서 사용할 수 있다. 심장 질환으로는 심근경색, 허혈성 심질환, 울혈성 심부전, 비대형 심근증, 확장형 심근증, 심근염, 만성 심부전 등을 들 수 있다. 이식용 세포는, 본 발명에 따라 제조된 심근 세포를 고순도로 포함하는 한, 세포를 배지 등의 수성 비히클 중에 부유시킨 형태, 세포를 생분해성 기질 등의 고상 담체에 포매한 형태, 또는 단층 또는 다층의 심근 세포 시트 (Shimizu et al., Circulation Research, 90: e40-e48, (2002))로 가공된 형태 등의 임의 형태로 사용할 수 있다.

상기 이식용 심근 세포를 장애 부위에 이식하는 방법은 개흉한 후 주사기를 사용하여 직접 심장에 주입하는 방법, 심장의 일부를 외과적으로 절개하여 이식하는 방법, 또는 카테터를 사용한 경혈관적 방법에 의한 이식법 등 (Murry et al., Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology, 67:519-526, (2002); Menasche, The Annals of Thoracic Surgery, 75: S20-S28, (2003); Dowell et al., Cardiovascular Research, 58:336-350, (2003))을 들 수 있지만, 특별히 이러한 방법으로 한정되는 것은 아니다. 이러한 방법을 통해 태아 심장으로부터 회수한 심근 세포를 심장 장애가 있는 동물의 심장에 이식하면, 매우 양호한 치료 효과가 달성되는 것으로 보고되고 있다 (Menasche, The Annals of Thoracic Surgery, 75: S20-S28, (2003); Reffelmann et al., Heart Failure Reviews, 8:201-211, (2003)). ES 세포 유래의 심근 세포는 태아 심장 유래의 심근 세포와 매우 유사한 형질을 나타낸다 (Maltsev et al., Mechanisms of Development, 44:41-50, (1993); Maltsev et al., Circulation Research, 75:233-244, (1994)). 또한, 실제 ES 세포 유래의 심근 세포를 성체 심장에 이식한 동물 실험의 예에서, 태아 심근을 이식한 예와 거의 차이가 없는, 매우 높은 생착성이 확인되었다 (Klug et al., The Journal of Clinical Investigation, 98:216-224, (1996)). 따라서, 심근 세포의 피폐 및 탈락으로 인한 상기 심장 질환에서, 본 발명에 기재된 방법에 따라 제조된 심근 세포를 질환 상태의 심장 조직에 보충적으로 이식함으로써, 심장 기능 개선을 촉진시킬 수 있을 것으로 기대할 수 있다.

실시예

이하, 실시예를 들어 본 발명을 보다 구체적으로 설명하지만, 아래 실시예는 본 발명의 단순한 예시일 뿐이며, 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

실시예 1: 초대 배양 심근 세포를 이용한 BrdU 흡수를 지표로 한 miRNA 라이브러리 스크리닝

생후 2 - 4일령의 랫(Wistar계, SHIMIZU Laboratory Supplies Co., Ltd.로부터 입수)으로부터 심장을 적출하고, 콜라게나아제 처리에 의해 수득한 세포군으로부터, 퍼콜 농도 구배 원심분리(세포를 현탁 밀도 1.082 g/mL로 현탁한 퍼콜 용액을 밀도 1.050 g/mL 또는 1.060 g/mL의 퍼콜 용액에 중층하고, 4℃, 3000 rpm(2000 G)로 25분간 원심분리함)에 의해 심근 세포 분획을 회수하였다. 이렇게 수득한 심근 세포는 5% 소 태아 혈청(FCS; SAFC Bioscience)이 첨가된 이글 최소 배지(nakalai tesque)에 현탁하여, 배양용 디쉬에 접종한 다음, 이산화탄소 배앙기에서 37℃에서 배양하였다. 이렇게 제조한 심근 세포(96웰 플레이트 당 15,000 세포/웰)에, Pre-miR^TM miRNA Precursor Library-HumanV2(Ambion: miRBase Sequence Database Version 8.0에 수록된 328개의 인간 성숙형 miRNA를 모방하여 설계된 라이브러리) 각 2 pmol을, Lipofectamine^TM RNAiMAX(Invitrogen)를 사용하여 형질전환시키고, 2일 후, 세포 증식 ELISA, BrdU 화학 발광 키트(Roche)를 사용하여 BrdU의 흡수량을 측정하였으며, 음성 대조군인 Pre-miRTM miRNA Precursor Molecule-Negative control #1(Ambion) 첨가군에서의 BrdU 흡수량과 비교하여, BrdU 흡수 효과가 매우 높은 것으로 확인되는 것을 DNA 합성력을 현저하게 촉진하는 후보 miRNA로서 선택하였다. 상기 실험을 통해, 상기 후보 miRNA의 예로서, miR-148a, miR-148b, miR-152 및 miR-373을 선별할 수 있었다.

miRNA	서열번호	BrdU 값
miR-148a	3	2.7
miR-148b	5	2.3
miR-152	7	2.6
miR-373	9	2.9

실시예 2: 초대 배양 심근 세포에서 miRNA 강제 발현에 의한 세포 주기 진행 마커의 분석

심근 세포(24웰 플레이트 당 100,000 세포/웰)에, 실시예 1에서 수득한 후보 miRNA, miR-148a, miR-148b, miR-152 및 miR-373의 인간 성숙형 miRNA를 모방하도록 설계된 Pre-miRTM miRNA 전구체 분자 및 음성 대조군인 Negative control #1(모두 Ambion) 1 pmol을, Lipofectamine^TM RNAiMAX(Invitrogen)를 사용하여 형질전환시키고, 형질전환 2 - 4일 후, 세포를 4% 파라포름알데하이드로 고정하였다.

그런 후, 항Ki67 항체(Thermo SCIENTIFIC)(1:200 희석) 및 항-Troponin T 항체(Thermo SCIENTIFIC)(1:200 희석)를 반응시킨 후, Alexa Fluor^TM 표지 항체(Alexa-488 및 Alexa-568; Molecular Probes)(모두 1:400 희석)를 사용하여 염색하였다. 또한, 세포핵은 4',6-디아미딘-2'-페닐인돌 디하이드로클로라이드(4',6-Diamidine-2'-phenylindole dihydrochloride: DAPI) 용액(1 ㎍/mL)으로 염색하였다.

상기 방법으로 면역 염색한 세포를 대상으로, 심근 세포의 Ki67 양성율을 In Cell Analyzer1000(GE Healthcare)을 사용하여 계측하였다. Ki67 핵단백질은 세포 주기의 모든 사이클에서 증식하는 세포에서 발현되므로 (Scholzen & Gerdes, Journal of Cellular Physiology, 182:311-22, 2000), 세포 주기가 진행되고 있는 세포를 검출하기 위해 사용하였다.

그 결과는 도 1에 나타낸다.

이러한 결과로서, Negative control #1를 사용한 경우에 비해 심근 세포에 대한 증식 촉진 작용이 현저한 miRNA로서 miR-148a, miR-148b, miR-152 및 miR-373을 동정하였다.

실시예 3: 초대 배양 심근 세포에서 아데노바이러스 발현 miRNA 강제 발현에 의한 세포 주기 진행 마커의 분석

miR-148a, miR-152, miR-373를 발현하기 위한 아데노바이러스 벡터로, ViraPower^TM Adenoviral Expression System (Invitrogen)을 사용하여 제작하였다. 즉, 각각의 miRNA의 전구체 서열과 인접한 수백개의 뉴클레오티드를 포함하는 인간 게놈 DNA 단편을, 인간 게놈 DNA를 주형으로 사용하고, 아래에 나타낸 프라이머를 사용하여 PCR함으로써 증폭시켰다.

hsa-miR-148a-F: 5'-caccgaacacacctgcaggaagaaact-3'(서열번호 11)

hsa-miR-148a-R: 5'-gttcccatttacagggtttaaccca-3'(서열번호 12)

hsa-miR-152-F: 5'-caccgtcccagactcggctcccatca-3'(서열번호 13)

hsa-miR-152-R: 5'-actcgaggtggacaccctgtgt-3'(서열번호 14)

hsa-miR-373-F: 5'-caccgtgaccaaggggctgtatgca-3'(서열번호 15)

hsa-miR-373-R: 5'-ctgcccaccccagaatatgcca-3'(서열번호 16).

이들 PCR 산물을 pENTR/D-TOPO 벡터(Invitrogen)에 삽입하여 그 염기 서열을 확인하고, Gateway system(Invitrogen)을 사용하여 pAd/CMV/V5-DEST 벡터(Invitrogen)에 재조합함으로써, pAd/CMV-miR-148a, pAd/CMV-miR-152 및 pAd/CMV-miR-373를 제작하였다. 다음으로, 이들 벡터를 제한 효소 PacI로 절단하여, 인간 신장 유래의 293A 세포에 Lipofectamine2000(Invitrogen)을 사용하여 형질전환함으로써, 재조합 아데노바이러스 Ad-miR-148a, Ad-miR-152 및 Ad-miR-373을 제작하였다. 상기 방법으로 제작한 재조합 아데노바이러스에는 CMV 프로모터의 통제 하에 각각 삽입된 miRNA 전구체가 발현되도록 구축되어 있어, 포유동물 세포 내에서 고수준으로 발현시킬 수 있다. 포유동물에서 발현되는 miRNA 전구체는 포유동물의 세포내의 효소군에 의해 기능적인 성숙형 miRN로 처리된다.

또한, 이 실험에, 시판 중인 LacZ 발현용 재조합 아데노바이러스, Ad-LacZ(TAKATA BIO)를 사용하였다.

이어서, 각 재조합 바이러스에 대하여 고역가의 바이러스 용액을 조제하고, 조제한 바이러스 용액의 역가를 293A 세포를 이용한 플라그 분석(plaque assay)으로 결정한 바, 모두 10⁹ - 10¹⁰pfu/mL의 범위내였다. 그리고, 본원에서는, 세포 당 감염시키는 생 바이러스의 입자 수를 이하, 감염 다중도(multiplicity of infection; moi)로 표기한다. 즉, 하나의 세포에 하나의 바이러스 입자를 감염시켰을 경우를 moi=1로 나타낸다.

또한, 제조한 각 재조합 바이러스를 심근 세포에 moi = 10 - 1000으로 첨가하고, 2일 후 miRNeasy 미니 키트 (Qiagen)를 사용하여 miRNA를 포함하는 전체 RNA를 회수하였다. 전체 RNA 10 ng을 사용하고, TaqMan MicroRNA 역전사 키트 (Applied Biosystems)와 TaqMan MicroRNA 분석 (Applied Biosystems사)에 부속된 각각의 miRNA 특이적인 역전사용 프라이머를 사용하여 cDNA를 합성한 다음, TaqMan MicroRNA 분석 (Applied Biosystems)에 부속된 각각의 miRNA에 특이적인 정방향 및 역방향 프라이머와 TaqMan 프로브를 사용하여, Applied Biosystems 7900 HT 패스트 실시간 PCR 시스템에 의해 실시간 PCR을 수행함으로써, 성숙형 miRNA의 발현량을 정량하였다.

내재성 대조군으로서 RNU6B를 사용하고, 발현량을 표준화하였다. 그 결과, 바이러스 용량 의존적인 방식으로 성숙형 miRNA가 발현됨을 확인하였다.

이와 같이 제조한 재조합 바이러스 Ad-miR-148a, Ad-miR-152 및 Ad-miR-373과, 음성 대조군으로서 Ad-LacZ를, 심근 세포(24웰 플레이트에 100,000 세포/웰)에, moi = 10 - 100으로 첨가하고, 2 - 4일 후 세포를 4% 파라포름알데하이드로 고정하였다.

다음으로, 항-Ki67 항체(Thermo SCIENTIFIC)(1:200 희석) 및 항-Troponin T 항체(Thermo SCIENTIFIC)(1:200 희석)를 반응시킨 후, Alexa Fluor^TM 표지 항체(Alexa-488 및 Alexa-568; Molecular Probes)(모두 1:400 희석)를 사용하여 염색하였다. 또한, 세포핵을 DAPI 용액(1 ㎍/mL)으로 염색하였다.

상기 방법으로 면역염색을 수행한 세포에서, 심근 세포의 Ki67 양성율을 In Cell Analyzer1000를 사용하여 계측하였다.

이 결과는 도 2에 나타낸다. 도면에서 None은 미처리를 나타낸다.

이 결과로부터, miR-148a, miR-152 및 miR-373의 모든 경우들이, 음성 대조군(LacZ)의 경우와 비교하여, 세포 주기 진행 마커인 Ki67에 대해 양성인 것으로 나타나, 심근 세포의 세포 주기가 항진되어 심근 세포에 대해 증식 촉진 작용을 가지는 것으로 확인되었다.

실시예 4: 초대 배양 심근 세포에서 miRNA 강제 발현 또는 아데노바이러스 발현 miRNA 강제 발현에 의한 세포 분열 마커의 분석

실시예 2와 마찬가지의 방법으로, miR-148a, miR-148b, miR-152, miR-373 및 음성 대조군으로서 Negative control #1를 심근 세포에 형질전환하였다. 또한, 실시예 3과 마찬가지의 방법으로 Ad-miR-148a, Ad-miR-152 및 Ad-miR-373과 음성 대조군인 Ad-LacZ를, 심근 세포에 첨가하였다. 각각, 첨가 후 2 - 3일 후에 세포를 4% 파라포름알데하이드로 고정하였다.

다음으로, 항-인산화된 히스톤 H3(H3P) 항체 (MILLIPORE)(1:200 희석) 및 항-Troponin T 항체(Thermo SCIENTIFIC)(1:200 희석)를 반응시킨 후, Alexa Fluor^TM 표지 항체 (Alexa-488 및 Alexa-568; Molecular Probes)(모두 1:400 희석)로 염색하였다. 또한, 세포핵을 DAPI 용액(1 ㎍/mL)으로 염색하였다.

상기 방법으로 면역염색한 세포를 대상으로 심근 세포의 H3P 양성율을 In Cell Analyzer1000을 사용하여 계측하였다. 히스톤 H3의 Ser-10의 인산화는 세포의 유사분열시에 관찰되는 크로마틴의 응집과 밀접하게 관련되어 있으므로 (Adamas, R, The Journal of Cell Biology, 153: p. 865-880, 2001), 세포 분열 마커로서 사용하였다.

그 결과는 도 3-1과 도 3-2에 나타낸다. 이들 도면에서 None은 미처리를 나타낸다. 또한, 상기 면역 염색한 세포의 현미경 사진을 도 3-3에 나타낸다.

이러한 결과들로부터, miR-148a, miR-152 및 miR-373의 모든 경우들에서, 도 3-1의 경우 음성 대조군(Negative control #1)과 비교하여, 도 3-2의 경우 음성 대조군(Ad-LacZ)과 비교하여, 세포 분열 마커인 H3P에 대해 양성이었고, 유사분열 중인 세포와 세포질 분열이 진행되고 있는 세포가 관찰되어, 심근 세포의 세포 분열이 항진되었고, 이들 마이크로 RNA가 심근 세포에 대해 증식 촉진 작용을 나타내는 것으로 확인되었다.

실시예 5: 생체내에서 심근 세포의 증식 가능성 검토

miR-148a, miR-152, miR-373의 발현이 생체내에서 심근 세포의 증식을 유발하는지를 확인하기 위해, 실시예 3에서 제조한 재조합 바이러스 Ad-miR-148a, Ad-miR-152 및 Ad-miR-373 (각각 1 X 10⁹ pfu/mL)을, Wistar계 랫(250 - 300 g)을 개흉하여 육안 관찰에 의해 정점 부위(apical region)에, 총 4곳에 30 G 주사 바늘로 총량 200 ㎕를 주입하였다. 음성 대조군으로는 miR-141을 사용하였고, 타겟 서열을 실시예 3의 방법에 따라 인간 게놈 DNA를 주형으로 하여 아래에 나타낸 프라이머:

hsa-miR-141-F: 5'-caccgcagggatcctgggcctga-3'(서열번호 17)

hsa-miR-141-R: 5'-cgggaagacaatggaggtgcct-3'(서열번호 18)

를 사용하여 PCR로 증폭시킨 후, PCR 산물을 실시예 3에 기재된 바와 같이 이용하여 Ad-miR-141을 제작하였고, Ad-miR-141(1 X 10⁹ pfu/mL)을, Wistar계 랫(250 - 300 g)을 개흉하여 육안 관찰에 의해 심장 정점 영역에 총 4곳에 30G 주사 바늘로 총량 200 ㎕를 주입하였다.

주입한 다음 4일 경과 후, 4% 파라포름알데하이드를 관류하여 심장 조직을 고정시키고, 절편을 제작하여, 항-Ki67 항체 (Thermo SCIENTIFIC)(1:500 희석) 및 항-Troponin T 항체 (Thermo SCIENTIFIC)(1:600 희석)와 반응시킨 다음, Alexa Fluor^TM 표지 항체 (Alexa-488 및 Alexa-568; Molecular Probes)(모두 1:400 희석)를 사용하여 각각 녹색 및 적색으로 염색하여 가시화하였다. 또한, 세포 핵은 DAPI를 사용하여 청색으로 염색하여 가시화하였다.

염색한 심장 조직 절편은 형광 현미경을 사용하여 관찰하고, DAPI와 Troponin T의 공통 양성 세포를 심근 세포로, Ki67과 Troponin T의 공통 양성 세포를 세포 주기가 진행 중인 심근 세포로 분류하여, 세포 주기가 진행 중인 심근 세포의 비율을 측정하였다. 각 개체에서 측정하는 세포의 수는 300개 이상으로 하였다. 그 결과는 도 4에 나타낸다. 도 4에서, miR-1-148a, miR-152 또는 miR-373의 아데노바이러스로 감염된 심장에서 Ki67 양성 심근 세포의 비율이 명확하게 증가되는 것으로 확인되었다. 반면, 음성 대조군인 miR-141의 아데노바이러스를 감염시킨 심장에서는 Ki67 양성 심근 세포는 거의 확인되지 않았다.

이러한 결과로부터, 생체내에서 miR-148a, miR-152 및 miR-373를 발현시키면, 세포 주기 진행 마커인 Ki67에 대해 양성이 됨으로써, 심근 세포의 세포 주기가 항진되고 증식력이 획득되는 것으로 확인되었다.

서열번호 1: miR-148 패밀리의 5' 측에 공통된 시드 서열;
서열번호 2: miR-373 패밀리의 5' 측에 공통된 시드 서열;
서열번호 11: miR-148a 유전자의 코딩 영역을 증폭시키기 위한, 정방향 프라이머, hsa-miR-148a-F;
서열번호 12: miR-148a유전자의 코딩 영역을 증폭시키기 위한, 역방향 프라이머, hsa-miR-148a-R;
서열번호 13: miR-152 유전자의 코딩 영역을 증폭시키기 위한, 정방향 프라이머, hsa-miR-152-F;
서열번호 14: miR-152 유전자의 코딩 영역을 증폭시키기 위한, 역방향 프라이머, hsa-miR-152-R;
서열번호 15: miR-373 유전자의 코딩 영역을 증폭시키기 위한, 정방향 프라이머, hsa-miR-373-F;
서열번호 16: miR-373 유전자의 코딩 영역을 증폭시키기 위한, 역방향 프라이머, hsa-miR-373-R;
서열번호 17: miR-141 유전자의 코딩 영역을 증폭시키기 위한, 정방향 프라이머, hsa-miR-141-F;
서열번호 18: miR-141 유전자의 코딩 영역을 증폭시키기 위한, 역방향 프라이머, hsa-miR-141-R;
그 외의 서열은 표 1을 참조한다.

SEQUENCE LISTING <110> DAIICHI SANKYO COMPANY, LIMITED <120> METHOD FOR PROLIFERATING CARDIOMYOCYTES USING MICRO-RNA <130> FA1511-11015PCT <150> JP2010-056558 <151> 2010-03-12 <160> 18 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 8 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 1 ucagugca 8 <210> 2 <211> 8 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 2 gaagugcu 8 <210> 3 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 3 ucagugcacu acagaacuuu gu 22 <210> 4 <211> 68 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 4 gaggcaaagu ucugagacac uccgacucug aguaugauag aagucagugc acuacagaac 60 uuugucuc 68 <210> 5 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 5 ucagugcauc acagaacuuu gu 22 <210> 6 <211> 99 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 6 caagcacgau uagcauuuga ggugaaguuc uguuauacac ucaggcugug gcucucugaa 60 agucagugca ucacagaacu uugucucgaa agcuuucua 99 <210> 7 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 7 ucagugcaug acagaacuug g 21 <210> 8 <211> 87 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 8 uguccccccc ggcccagguu cugugauaca cuccgacucg ggcucuggag cagucagugc 60 augacagaac uugggcccgg aaggacc 87 <210> 9 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 9 gaagugcuuc gauuuugggg ugu 23 <210> 10 <211> 69 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 10 gggauacuca aaaugggggc gcuuuccuuu uugucuguac ugggaagugc uucgauuuug 60 ggguguccc 69 <210> 11 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Forward primer for amplifying coding region of miR-148a gene. <400> 11 caccgaacac acctgcagga agaaact 27 <210> 12 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Reverse primer for amplifying coding region of miR-148a gene. <400> 12 gttcccattt acagggttta accca 25 <210> 13 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Forward primer for amplifying coding region of miR-152 gene. <400> 13 caccgtccca gactcggctc ccatca 26 <210> 14 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Reverse primer for amplifying coding region of miR-152 gene. <400> 14 actcgaggtg gacaccctgt gt 22 <210> 15 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Forward primer for amplifying coding region of miR-373 gene. <400> 15 caccgtgacc aaggggctgt atgca 25 <210> 16 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Reverse primer for amplifying coding region of miR-373 gene. <400> 16 ctgcccaccc cagaatatgc ca 22 <210> 17 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Forward primer for amplifying coding region of miR-141 gene. <400> 17 caccgcaggg atcctgggcc tga 23 <210> 18 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Reverse primer for amplifying coding region of miR-141 gene. <400> 18 cgggaagaca atggaggtgc ct 22

Claims

심근 세포에 대해 증식 촉진 작용을 가지는 miRNA를 코딩하는 핵산을 포함하는, 심장 질환 치료용 의약 조성물.
제1항에 있어서, 상기 miRNA는 성숙형 miRNA, 상기 miRNA의 전구체, 및 이들의 변이체 및 유사 물질로 이루어진 군으로부터 선택되는 물질인 것을 특징으로 하는 의약 조성물.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 miRNA는 서열번호 1 또는 서열번호 2로 이루어진 시드 서열을 포함하는 물질인 것을 특징으로 하는 의약 조성물.
제3항에 있어서, 서열번호 1로 이루어진 시드 서열을 포함하는 물질은 miR-148a(서열번호 3), miR-148b(서열번호 5), miR-152(서열번호 7), 이들의 전구체, 및 이들의 변이체 및 유사 물질로 이루어진 군으로부터 선택되는 물질인 것을 특징으로 하는 의약 조성물.
제3항에 있어서, 서열번호 2로 이루어진 시드 서열을 포함하는 물질은 miR-373(서열번호 9), 그 전구체, 및 이들의 변이체 및 유사 물질로 이루어진 군으로부터 선택되는 물질인 것을 특징으로 하는 의약 조성물.
제1항 내지 제5항 중 어느 한항에 있어서, 상기 심근 세포에 대해 증식 촉진 작용을 가지는 miRNA를 코딩하는 핵산을, 심근 세포에 도입 및 발현시키기 위한 발현 벡터로서 포함하는 것을 특징으로 하는 의약 조성물.
제6항에 있어서, 상기 벡터는 바이러스 벡터인 것을 특징으로 하는 의약 조성물.
제1항 내지 제7항 중 어느 한항에 있어서, 상기 miRNA는 하나 이상의 변형된 뉴클레오티드간 결합, 하나 이상의 변형된 당 모이어티, 하나 이상의 변형된 염기 또는 이들의 조합을 포함하는 miRNA 유도체인 것을 특징으로 하는 의약 조성물.
제1항 내지 제8항 중 어느 한항에 있어서, 상기 심장 질환은 심근경색, 허혈성 심질환, 울혈성 심부전, 비대형 심근증, 확장형 심근증, 심근염 또는 만성 심부전인 것을 특징으로 하는 의약 조성물.
심근 세포에 대해 증식 촉진 작용을 가지는 miRNA를 코딩하는 핵산을, 개체의 심장의 장애 부위에 도입함으로써, 상기 부위에서 심근 세포를 증식시키는 것을 특징으로 하는 심장 질환의 치료 방법.
심장 질환 치료용 의약 조성물의 제조용으로서의 심근 세포에 대해 증식 촉진 작용을 가지는 miRNA를 코딩하는 핵산의 용도.
심장 질환의 치료에 사용하기 위한, 심근 세포에 대해 증식 촉진 작용을 가지는 miRNA를 코딩하는 핵산.
심근 세포에 대해 증식 촉진 작용을 가지는 miRNA를 코딩하는 핵산을 심근 세포에 도입하여 발현시키는 것을 특징으로 하는 심근 세포의 증식 방법.
제13항에 있어서, 상기 miRNA는 성숙형 miRNA, 상기 miRNA의 전구체, 및 이들의 변이체 및 유사 물질로 이루어진 군으로부터 선택되는 물질인 것을 특징으로 하는 심근 세포의 증식 방법.
제13항 또는 제14항에 있어서, 상기 miRNA는 서열번호 1 또는 서열번호 2로 이루어진 시드 서열을 포함하는 물질인 것을 특징으로 하는 심근 세포의 증식 방법.
제15항에 있어서, 서열번호 1로 이루어진 시드 서열을 포함하는 물질이 miR-148a(서열번호 3), miR-148b(서열번호 5), miR-152(서열번호 7), 이들의 전구체, 및 이들의 변이체 및 유사 물질로 이루어진 군으로부터 선택되는 물질인 것을 특징으로 하는 심근 세포의 증식 방법.
제15항에 있어서, 서열번호 2로 이루어진 시드 서열을 포함하는 물질이 miR-373(서열번호 9), 그 전구체, 및 이들의 변이체 및 유사 물질로 이루어진 군으로부터 선택되는 물질인 것을 특징으로 하는 심근 세포의 증식 방법.
제13항 내지 제17항 중 어느 한항에 있어서, 상기 심근 세포에 대해 증식 촉진 작용을 가지는 miRNA를 코딩하는 핵산을, 발현 벡터를 사용하여 심근 세포에 도입하는 것을 특징으로 하는 심근 세포의 증식 방법.
제18항에 있어서, 상기 벡터는 바이러스 벡터인 것을 특징으로 하는 심근 세포의 증식 방법.
제13항 내지 제19항 중 어느 한항에 있어서, 상기 miRNA는 하나 이상의 변형된 뉴클레오티드간 결합, 하나 이상의 변형된 당 모이어티, 하나 이상의 변형된 염기, 또는 이들의 조합을 포함하는 것을 특징으로 하는 심근 세포의 증식 방법.