CN103446593A - 人miR-148a在制备促进脂肪细胞分化药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明基于基因工程领域，公开了人miR-148a在制备促进脂肪细胞分化药物中的应用。本发明的技术方案为人miR-148a在制备促进脂肪细胞分化药物中的应用。本发明的研究表明人miR-148a能够促进脂肪细胞的分化，可用于制备促进脂肪细胞分化的药物。

Description

人miR-148a在制备促进脂肪细胞分化药物中的应用

技术领域

本发明属于基因工程领域，涉及人miR-148a在制备促进脂肪细胞分化药物中的应用。

背景技术

随着经济的发展，无论是发达国家还是发展中国家，肥胖患病率正以惊人的速度在不断上升。从全球范围来看，符合超重标准的成年人已超过十亿，其中三亿属于肥胖。2010年，WTO预测肥胖将出现全球化趋势，如何预防和治疗肥胖受到人们的普遍关心。理论上，“迈开腿，管住嘴”，即在控制饮食、增加运动使能量消耗超过摄入量的减肥措施，但是该模式收效甚微，因此，在分子水平上开展肥胖病因研究以寻找有效防治策略开始受到关注，尤其从近年来发现的非编码RNA角度寻找肥胖相关非编码RNA具有重要意义。miRNA是一类长度约为22-25nt的非编码RNA分子，通过对靶基因的转录后调控机制参与众多疾病，如肥胖、糖尿病、肿瘤、免疫系统疾病等的发病过程。

人脂肪前体细胞是一类具有增殖潜能、能够向脂肪细胞定向分化的特殊细胞，脂肪细胞的数量和体积由脂肪前体细胞向成熟脂肪细胞分化的程度决定，目前前体脂肪细胞过度增殖和分化已被认为是肥胖发生的重要环节。前体脂肪细胞分化为成熟脂肪细胞的一个重要标志是细胞内合成甘油三酯，并以脂肪小滴的形式存储在细胞内，脂质含量的多少可间接反映前体脂肪细胞的分化程度。因此，诱导人脂肪前体细胞分化为成熟脂肪细胞已成为肥胖研究的一个常用体外研究模型。

在先前研究中，我们发明人采用miRNA芯片（miRNA Array）技术筛选人脂肪细胞分化前后的差异表达miRNA，获得一条特异高表达于成熟脂肪细胞的miRNA——人miR-148a，提示其可能与肥胖的发生发展相关。该miRNA位于人Chr7p15.2，属于基因间的miRNA。但目前没有关于人miR-148a在脂肪细胞中的功能报道。

发明内容

本发明的目的是提供了人miR-148a在制备促进脂肪细胞分化药物中的应用。

本发明人在研究中发现人miR-148a能够显著促进脂肪细胞的分化，故提出了人miR-148a在制备促进脂肪细胞分化药物中的应用的技术方案。

本发明的有益效果：

本发明经过研究发现在人脂肪前体细胞中稳定表达人miR-148a，与阴性对照相比，显著促进脂肪细胞的分化，从而提出人miR-148a在制备促进脂肪细胞分化药物中应用的技术方案，根据本发明提出的技术方案可利用人miR-148a制备促进脂肪细胞分化的药物。

附图说明

图1：pGLV-H1-GFP/Puro载体图谱、插入位点及人miR-148a过表达慢病毒载体酶切及测序鉴定。

图2：人miR-148a过表达慢病毒感染人脂肪前体细胞株的鉴定

图3：脂肪细胞分化油红O染色图。图中A为转染空载pGLV-H1-GFP/Puro的人脂肪细胞；B为过表达人miR-148a的人脂肪细胞。Day1分化第1天；Day4为分化第4天；Day7为分化第7天；Day15为分化第15天。

图4：分化第15天脂肪细胞内甘油三脂含量比较图。其中：miR-148a：miR-148a过表达的前体脂肪细胞，NC：空载转染对照细胞。

具体实施方式

以下通过实施例对本发明作进一步阐述，但不限制本发明

实施例1

1材料和方法

1.1试验材料：人前体脂肪细胞株（Human Preadipocytes-visceral，HPA-v）购自美国Sciencell公司。本实验所需的pGLV-H1-GFP/Puro质粒购自上海吉玛公司，包装质粒Pcgvp、Rev、Vsvg购自美国Allele Biotech & Pharmaceuticals公司；pGLV-H1-miR-148a-GFP/Puro慢病毒载体由本实验小组自行构建；DNA、RNA抽提试剂盒购自德国Qiagen公司，miRNA逆转录试剂盒、miRNA检测试剂盒、TanMan基因表达mixⅡ购自美国ABI公司，TaKaRaDNA Polymerase Hot-Start Version PCR试剂盒购自日本Takara公司，脂肪细胞专有培养基7211购自美国Sciencell公司，限制性内切酶、T4连接酶购自美国NEB公司，引物由美国Invitrogen公司合成。

1.2实验方法：

（一）人miR-148a minigene的扩增及人miR-148a慢病毒过表达载体（pGLV-H1-miR-148a-GFP/Puro）的构建

（1）.DNA提取：按照以下步骤提取基因组DNA(德国Qiagen公司QIAamp DNAMini Kit)

1）取4ml离心管一只，加入600μl核裂解液，冰上冷却。

2）加入10-20mg解冻的人脂肪组织，匀浆机匀浆10秒。将裂解物移至1.5ml离心管中。65℃孵育30分钟。

3）待样品达到室温后，加入200μl蛋白沉淀液，涡旋震荡20秒，置于冰上冷却5分钟。

4）13,000×g离心4分钟，可见白色沉淀。将上清移至一新离心管中。

5）加入600μl异丙醇，轻轻颠倒混匀溶液，直至白色线状DNA形成。13,000×g离心1分钟，弃去上清。

6）加入600μl室温70%乙醇，轻轻颠倒离心管数次，13,000×g离心1分钟，小心弃去上清。将离心管倒置在干净的吸水纸上，自然干燥10-15分钟。

7）向离心管中加入50μl双蒸水，65℃孵育1小时，以充分溶解DNA，4℃保存。

（2）.人miR-148a minigene的扩增

（2.1）通过miRBase数据库获得人miR-148a的前体pre-miRNA-148a的序列；在NCBIblast中比对查找其所在的基因组序列，根据引物设计规则，采用Primer5软件设计扩增包括pre-miR-148a在内的序列，并在其上游和下游分别引入BamHI和EcoRI酶切位点，上游引物（含BamHI位点，下划线区域）5'-GCCGGATCCAATCTGAGGACGGGTAGGAAG-3’；下游引物（含EcoRI位点，下划线区域）5'-ACCGAATTCCAAGGGAAAGGCGCAGCGACGTG-3’，目的基因长度为443bp。（PCR试剂盒：TaKaRa

DNA Polymerase Hot-Start Version，Takara）

PCR反应条件为：预变性94℃5min；

（2.2）PCR产物切胶纯化回收（Gel/PCR Extraction Kit，Biomiga）

1）按照5μl PCR产物＋1μl上样缓冲液（6×）比例混匀后，在1.0％琼脂糖凝胶上电泳，在成像仪显色下，切取443bp的目的条带于离心管中。

2）加入1倍体积的Buffer GC，至于55℃水浴中8-10分钟，至凝胶完全融化。冷却至室温。

3）转移以上混合液至一带有收集管的吸附柱中，室温下，13,000×g离心1分钟，倒掉收集管中的废液。重复此步骤，直至剩余液体全部通过吸附柱。

4）加入650μl DNA Wash Buffer至吸附柱中，室温下，13,000×g离心30秒，倒掉废液，重复此步骤。

5）室温下，13,000×g开盖离心2分钟，去除残余的乙醇。

6）转移吸附柱至一新的1.5ml的离心管中，加入30-50μl在60℃预热的ddH₂O，室温放置数分钟，13,000×g离心1分钟。

（2.3）PCR产物及载体pGLV-H1-GFP/Puro双酶切

PCR产物及载体pGLV-H1-GFP/Puro分别按照下述反应体系，37℃反应1小时，得PCR产物目的片段及载体片段。

表1

酶切产物，加入2倍体积Buffer GC后，瞬时离心。其余步骤按照上述切胶纯化回收步骤进行纯化。

（2.4）PCR产物及载体pGLV-H1-GFP/Puro连接反应

按照载体片段和PCR产物目的片段数目比例1∶3左右加反应体系，体系中加入1μlT4DNA连接酶及1μl T4DNA Buffer，16℃过夜，得到连接产物（pGLV-H1-miR-148a-GFP/Puro）。以不加入目的片段的载体为对照。

（2.5）转化（无菌操作）

1）从-80℃冰箱取出TOP10感受态细胞，冰上融化，每200μl感受态细菌加入2-4μl连接产物，轻轻扣击管壁混匀细菌。

2）冰上30min，42℃热休克90sec，然后迅速放置冰上3min。

3）加入500μl预热到37℃的LB培养基，37℃200转/分钟培养90分钟。然后将菌液铺于含有Ampicillin抗生素（100mg/ml）的LB固体培养板。

4）37℃孵育，培养板先正置1h后倒置培养12-16小时后挑取克隆或于4℃保存。

（2.6）阳性克隆扩增和质粒抽提（质粒抽提试剂盒为德国QIAGEN公司PlasmidMini Kit）

1）取5ml无菌Ampicillin LB液体培养基（100mg/ml），加入到无菌的15ml试管中，用无菌移液器枪头在培养板上随机挑选阳性克隆，置于上述试管中，37℃200rpm振荡孵育过夜。

2）室温下，10,000rpm离心1分钟，收集菌体，并尽可能弃去上清

3）加入250μl Buffer A1，涡旋震荡混匀。

4）加入250μl Buffer B1，混匀后静置5分钟至溶液粘稠而澄清

5）加入350μl Buffer N1，立即反转多次，至溶液充分混匀，此时出现白色絮状沉淀。13,000rpm离心10分钟。

6）吸取上清至带有收集管的DNA吸附柱中，13,000rpm离心1分钟，弃去收集管中的废液。

7）加入500μl Buffer KB，室温下13,000rpm离心1分钟，弃去收集管中的废液。

8）加入500μl DNA Wash Buffer，13,000rpm离心1分钟，弃去收集管中的废液。充分此步骤后，开盖离心5分钟。

9）向吸附柱中加入50-100μl ddH₂O。

（2.7）pGLV-H1-miR-148a-GFP/Pur双酶切验证、测序及保种

按照前述酶切方法（表1）进行双酶切后，1%琼脂糖凝胶电泳，切开双条带及条带大小与目的条带分子量相符（约400多bp）进，进行测序验证。同时取无菌1.5ml离心管并作标记，加入0.15ml无菌甘油溶液,分别吸取0.85ml阳性克隆的菌液，加入相应标记的离心管中，充分混匀，贮存于-80℃保种。

构建载体及酶切、测序结果见图1。

1.2（二）慢病毒包装

在37℃、5%CO₂孵箱中，以含10%胎牛血清的DMEM高糖培养基培养病毒包装细胞HEK-293T细胞（美国ATCC）。将HEK-293T细胞按10⁵/ml密度均匀接种于6孔板中，待细胞融合度达80%左右时，共转染慢病毒表达质粒与包装质粒，转染试剂（美国Invtrogen公司Lipofectamine^TM2000）(μl)与表达和包装质粒总质量(μg)比例为2.5∶1，慢病毒表达质粒与包装质粒Pcgvp、Rev、Vsvg比例为1.5∶1.5∶1∶0.5（质量比）。转染12h换液，24h后使用荧光显微镜观察转染效率，于48h、72h收取细胞培养液上清（即病毒上清），0.45μM滤器过滤后，分装-80℃冻存。

1.2（三）慢病毒感染人脂肪前体细胞

在37℃、5%CO₂孵箱中，以含5%胎牛血清的人脂肪细胞专用培养基（7211，Sciencell）培养人脂肪前体细胞，按10⁵/ml密度接种于6孔板中，待细胞融合度达60%左右时，将收集的病毒上清与凝聚胺（polybrene，终浓度5μg/ml）一同加入人脂肪前体细胞，24h后换液，48h-72h在荧光显微镜通过观察荧光表达情况判断感染效率，80%以上细胞可见绿色荧光，表明感染效率达到80%以上（见图2），72h时使用RNA抽提试剂盒（TRIzol法）提取细胞总RNA。

1.2（四）Real-time PCR鉴定人miR-148a在人脂肪前体细胞中过表达

分别收集miR-148a慢病毒组（miR-148a过表达组）及空载对照组的人脂肪前体细胞，使用RNA抽提试剂盒（TRIzol法）抽提总RNA，Nanodrop2.0检测RNA浓度，定量150ng总RNA用于逆转录，经特异性茎环引物（美国ABI公司，miR-148a检测试剂盒）逆转录为cDNA，进一步使用相应引物探针（美国ABI公司，miR-148a检测试剂盒）检测人miR-148a的表达。Realtime PCR反应体系为：TanMan gene expression master MixII10μl，cDNA1μl，TanMan引物探针1μl，双蒸水8uμl，共20μl，在ABI7500运行，条件为：预变性95℃10min后，95℃15s，60℃1min，重复40个循环。用△△CT法计算人miR-148a的相对表达量。结果见图2。

1.2（五）脂肪细胞诱导分化及鉴定

将人miR-148a过表达及空载对照人脂肪前体细胞接种于6孔细胞培养板，感染慢病毒后，在荧光显微镜下观察感染效率。待细胞达100%融合后两天（记为0天）时开始诱导分化，培养液换用含0.5mM3异丁1甲基黄嘌呤、1uM地塞米松、5ug/ml胰岛素的无血清人脂肪细胞培养基。48h后，换液并加用1uM罗格列酮；于第4d起撤去MIX、地塞米松、罗格列酮，使用培养液中只含有5ug/ml胰岛素。每2-3天换液一次，至第15d约90％以上细胞已分化为成熟的脂肪细胞时，结束分化过程。经油红O染色法鉴定（第1天、第4天、第7天、第15天），显微镜下脂肪细胞中脂滴呈亮红色，且过表达miR-148a组脂滴多于对照组。结果见图3。采用甘油三酯检测试剂盒检测胞内甘油三酯含量。结果见图4。

2结果分析

油红O染色显示在整个刺激分化过程中，过表达人miR-148a的人脂肪前体细胞分化早于空载对照细胞。甘油三酯测定结果表明，刺激分化末稳定表达人miR-148a的分化脂肪细胞胞内酯质含量明显低于对照（胞内甘油三酯含量反映了脂质集聚程度，即反映了脂肪细胞分化程度）。结果表明，人miR-148a能够促进人脂肪细胞分化，可用于制备促进脂肪细胞分化的药物。

Claims (1)

1.人miR-148a在制备促进脂肪细胞分化药物中的应用。

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