CN103432595A - 人miR-26b在制备抑制脂肪细胞增殖药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于基因工程领域，公开了人miR-26b在制备抑制脂肪细胞增殖药物中的应用。本发明提出了人miR-26b在制备抑制脂肪细胞增殖药物中应用的技术方案。本发明的研究结果表明在人脂肪细胞中过表达miR-26b可以明显抑制脂肪细胞的增殖速度和细胞个数，可用于制备抑制脂肪细胞增殖的药物及减肥的药物。

Description

人miR-26b在制备抑制脂肪细胞增殖药物中的应用

技术领域

本发明属于基因工程领域，涉及人miR-26b在制备抑制脂肪细胞增殖药物中的应用。

背景技术

肥胖，是一种常见的能量代谢性疾病，是目前在全世界范围内增长最为迅速的慢性疾病。肥胖与冠心病、高血压、高脂血症、糖尿病、脑血管意外等多种疾病系密切相关，严重危害着患者的身心健康。加强对肥胖病因、发病机制及防治药物的研究己成为21世纪面临的最大公共卫生挑战之一。目前肥胖的治疗策略包括刺激中枢肾上腺素能受体或者阻止5-羟色胺再吸收的食欲抑制剂、消化性脂肪酶抑制剂以及激素调节剂。在这些药物中，仅阻止5-羟色胺再吸收的脂肪酶抑制剂、奥利司他和西布曲明是FDA许可的药物，但是会导致包括脂肪泻、头痛以及血压升高等副作用。因此，肥胖的治疗和预防依然是医学领域和预防领域里的热点问题之一。

已知肥胖是机体在遗传、环境、行为因素或三者相互作用下能量代谢失衡的结果，在细胞水平，肥胖表现为脂肪细胞的数目增多和体积增大，脂肪细胞的增多是由于前脂肪细胞的不断增殖和分化所引起，而脂肪细胞的体积反映了在特定细胞中脂质分解和合成之间的平衡。此外，随着遗传学和生物学的发展，遗传因素在肥胖发生中的重要性已倍受重视。近些年来，有关肥胖的病因学研究结果表明，肥胖发生的病因中遗传因素占40-70%，因此开展肥胖病因的遗传学研究，从基因工程方面入手，寻找一种能够抑制脂肪细胞增殖和分化的药物对于肥胖症的防治将起到非常重要的作用。

miR-26b是我们采用微流体芯片技术检测人原代脂肪前体细胞及诱导分化的成熟脂肪细胞miRNAs表达谱时发现的一条高表达于成熟脂肪细胞的miRNA，该miRNA位于人染色体2q35、CTDSP1基因的第4内含子，其成熟序列“UUCAAGUAAUUCAGGAUAGGU”在物种间高度保守。但该miRNA与脂肪细胞增殖之间的关系如何尚未知晓。

发明内容

本发明的目的是提供人miR-26b在制备抑制脂肪细胞增殖药物中的应用。

本发明另一个目的是提供人miR-26b在制备减肥药物中的应用。

本发明经研究发现，人miR-26b过表达组的脂肪细胞增殖速度明显慢于空载对照组脂肪细胞，细胞个数明显减少，且人miR-26b过表达组的脂肪细胞中S期细胞比例明显少于空载对照组，表明染色质合成期细胞减少，细胞增殖速度变慢。因此，本发明提出人miR-26b在制备抑制脂肪细胞增殖药物中的应用，进一步，可用于制备抑制脂肪细胞增殖药物。这些影响脂肪细胞增殖的药物既可以作用于全身的脂肪组织，也可以与靶向定位物质结合，从而作用于特定部位，抑制特定部位的脂肪细胞增殖。

本发明的有益效果

本发明检测了人miR-26b过表达对脂肪细胞增殖功能的影响，显示过表达miR-26b能抑制脂肪细胞增殖（细胞个数减少且增殖速度变慢），可用于制备抑制脂肪细胞增殖的药物及减肥药物，为肥胖的预防和治疗提供了新的手段。

附图说明

图1：pGLV-H1-GFP/Puro载体图谱、插入位点及人miR-26b过表达慢病毒载体酶切及测序鉴定。

图2：人miR-26b过表达慢病毒感染人脂肪前体细胞株的鉴定。

图3：人miR-26b过表达脂肪细胞和对照细胞生长曲线图。

图4：人miR-26b过表达脂肪细胞和对照细胞24、48小时细胞各周期分布图（G1：染色质合成前期，S：染色质合成期，G2/M：染色质合成后期及分裂期）。

具体实施方式

以下通过实施例对本发明作进一步的阐述。

实施例1

1材料和方法

1.1试验材料：人前体脂肪细胞株（Human Preadipocytes-visceral，HPA-v）购自美国Sciencell公司。本实验所需的pGLV-H1-GFP/Puro质粒购自上海吉玛公司，包装质粒Pcgvp、Rev、Vsvg购自美国Allele Biotech & Pharmaceuticals公司；pGLV-H1-miR-26b-GFP/Puro慢病毒载体由本实验小组自行构建；DNA、RNA抽提试剂盒购自德国Qiagen公司，miRNA逆转录试剂盒、miRNA检测试剂盒、TanMan基因表达mixⅡ购自美国ABI公司，TaKaRa LA 

DNA Polymerase Hot-Start Version PCR试剂盒购自日本Takara公司，脂肪细胞专有培养基7211购自美国Sciencell公司，限制性内切酶、T4连接酶购自美国NEB公司，引物由美国Invitrogen公司合成。

1.2（一）人miR-26b minigene的扩增及人miR-26b慢病毒过表达载体（pGLV-H1-miR-26b-GFP/Puro）的构建

（1）.DNA提取：按照以下步骤提取基因组DNA（德国Qiagen公司QIAamp DNAMini Kit）

1）取4ml离心管一只，加入600μl核裂解液，冰上冷却。

2）加入10-20mg解冻的人脂肪组织，匀浆机匀浆10秒。将裂解物移至1.5ml离心管中。65℃孵育30分钟。

3）待样品达到室温后，加入200μl蛋白沉淀液，涡旋震荡20秒，置于冰上冷却5分钟。

4）13,000×g离心4分钟，可见白色沉淀。将上清移至一新离心管中。

5）加入600μl异丙醇，轻轻颠倒混匀溶液，直至白色线状DNA形成。13,000×g离心1分钟，弃去上清。

6）加入600μl室温70%乙醇，轻轻颠倒离心管数次，13,000×g离心1分钟，小心弃去上清。将离心管倒置在干净的吸水纸上，自然干燥10-15分钟。

7）向离心管中加入50μl双蒸水，65℃孵育1小时，以充分溶解DNA，4℃保存，得基因组DNA。

（2）.人miR-26b minigene的扩增

（2.1）通过miRBase数据库获得人miR-26b的前体pre-miRNA-26b的序列；在NCBIblast中比对查找其所在的基因组序列，根据引物设计规则，采用Primer5软件设计扩增包括pre-miR-26b在内的序列，并在其上游和下游分别引入BamHI和EcoRI酶切位点，上游引物（含BamHI位点，下划线区域）5'-GCCGGATCCAGGCTCTTCCCACCAATCCG-3'；下游引物（含EcoRI位点，下划线区域）5'-ACCGAATTCGGCCAGCTACCCTGACCACT-3'。目的基因长度为451bp。（PCR试剂盒：TaKaRa LA 

DNA Polymerase Hot-Start Version，Takara）

（2.2）PCR产物切胶纯化回收（Gel/PCR Extraction Kit，Biomiga）

1）按照5μlPCR产物＋1μl上样缓冲液（6×）比例混匀后，在1.0％琼脂糖凝胶上电泳，在成像仪显色下，切取469bp的目的条带于离心管中。

2）加入1倍体积的Buffer GC，至于55℃水浴中8-10分钟，至凝胶完全融化。冷却至室温。

3）转移以上混合液至一带有收集管的吸附柱中，室温下，13,000×g离心1分钟，倒掉收集管中的废液。重复此步骤，直至剩余液体全部通过吸附柱。

4）加入650μl DNA Wash Buffer至吸附柱中，室温下，13,000×g离心30秒，倒掉废液，重复此步骤。

5）室温下，13,000×g开盖离心2分钟，去除残余的乙醇。

6）转移吸附柱至一新的1.5ml的离心管中，加入30-50μl在60℃预热的ddH₂O，室温放置数分钟，13,000×g离心1分钟。

（2.3）PCR产物及载体pGLV-H1-GFP/Puro双酶切

PCR产物及载体pGLV-H1-GFP/Puro分别按照下述反应体系，37℃反应1小时，得PCR产物目的片段及载体片段。

表1

酶切产物，加入2倍体积Buffer GC后，瞬时离心。其余步骤按照上述切胶纯化回收步骤进行纯化。

（2.4）PCR产物及载体pGLV-H1-GFP/Puro连接反应

按照载体片段和PCR产物目的片段数目比例1:3左右加反应体系，体系中加入1μlT4 DNA 连接酶及1μl T4 DNA Buffer，16℃过夜，得到连接产物（pGLV-H1-miR-26b-GFP/Puro）。以不加入目的片段的载体为对照。

（2.5）转化（无菌操作）

1）从-80℃冰箱取出TOP10感受态细胞，冰上融化，每200μl感受态细菌加入2-4μl连接产物，轻轻扣击管壁混匀细菌。

2）冰上30min，42℃热休克90sec，然后迅速放置冰上3min。

3）加入500μl预热到37℃的LB培养基，37℃200转/分钟培养90分钟。然后将菌液铺于含有Ampicillin抗生素（100mg/ml）的LB固体培养板。

4）37℃孵育，培养板先正置1h后倒置培养12-16小时后挑取克隆或于4℃保存。

（2.6）阳性克隆扩增和质粒抽提（质粒抽提试剂盒为德国QIAGEN公司PlasmidMini Kit）

1）取5ml无菌Ampicillin LB液体培养基（100mg/ml），加入到无菌的15ml试管中，用无菌移液器枪头在培养板上随机挑选阳性克隆，置于上述试管中，37℃200rpm振荡孵育过夜。

2）室温下，10,000rpm离心1分钟，收集菌体，并尽可能弃去上清

3）加入250μl Buffer A1，涡旋震荡混匀。

4）加入250μl Buffer B1，混匀后静置5分钟至溶液粘稠而澄清

5）加入350μl Buffer N1，立即反转多次，至溶液充分混匀，此时出现白色絮状沉淀。13,000rpm离心10分钟。

6）吸取上清至带有收集管的DNA吸附柱中，13,000rpm离心1分钟，弃去收集管中的废液。

7）加入500μl Buffer KB，室温下13,000rpm离心1分钟，弃去收集管中的废液。

8）加入500μl DNA Wash Buffer，13,000rpm离心1分钟，弃去收集管中的废液。重复此步骤后，开盖离心5分钟。

9）向吸附柱中加入50-100μl ddH₂O。

（2.7）pGLV-H1-miR26b-GFP/Puro双酶切验证、测序及保种

按照前述酶切方法（表1）进行双酶切后，1%琼脂糖凝胶电泳，切开双条带及条带大小与目的条带分子量相符，进行测序验证。同时取无菌1.5ml离心管并作标记，加入0.15ml无菌甘油溶液,分别吸取0.85ml阳性克隆的菌液，加入相应标记的离心管中，充分混匀，贮存于-80℃保种。

构建载体及酶切、测序结果见图1。

1.2（二）慢病毒包装

在37℃、5%CO₂孵箱中，以含10%胎牛血清的DMEM高糖培养基培养病毒包装细胞HEK-293T细胞（美国ATCC）。将HEK-293T细胞按10⁵/ml密度均匀接种于6孔板中，待细胞融合度达80%左右时，共转染慢病毒表达质粒与包装质粒，转染试剂（美国Invtrogen公司Lipofectamine^TM2000）(μl)与表达和包装质粒总质量(μg)比例为2.5:1，慢病毒表达质粒与包装质粒Pcgvp、Rev、Vsvg比例为1.5:1.5:1:0.5（质量比）。转染12h换液，24h后使用荧光显微镜观察转染效率，于48h、72h收取细胞培养液上清（即病毒上清），0.45μM滤器过滤后，分装-80℃冻存。

1.2（三）慢病毒感染人脂肪前体细胞

在37℃、5%CO₂孵箱中，以含5%胎牛血清的人脂肪细胞专用培养基（7211，Sciencell）培养人脂肪前体细胞，按10⁵/ml密度接种于6孔板中，待细胞融合度达60%左右时，将收集的病毒上清与凝聚胺（polybrene，终浓度5μg/ml）一同加入人脂肪前体细胞，24h后换液，48h-72h在荧光显微镜通过观察荧光表达情况判断感染效率，80%以上细胞可见绿色荧光，表明感染效率达到80%以上（见图2），感染72h时使用RNA抽提试剂盒（TRIzol法）提取细胞总RNA。

1.2（四）Real-time PCR鉴定人miR-26b在人脂肪前体细胞中过表达

分别收集miR-26b慢病毒组（miR-26b过表达组）及空载对照组的人脂肪前体细胞，使用RNA抽提试剂盒（TRIzol法）抽提总RNA，Nanodrop2.0检测RNA浓度，定量150ng总RNA用于逆转录，经特异性茎环引物（美国ABI公司，miR-26b检测试剂盒）逆转录为cDNA，进一步使用相应引物探针（美国ABI公司，miR-26b检测试剂盒）检测人miR-26b的表达。Realtime PCR反应体系为：TanMan gene expression master MixII10μl，cDNA1μl，TanMan引物探针1μl，双蒸水8μl，共20μl，在ABI7500运行，条件为：预变性95℃10min后，95℃15s，60℃1min，重复40个循环。用△△CT法计算人miR-26b的相对表达量。结果见图2。

1.2（五）脂肪细胞增殖的测定

A．将miR-26b过表达的前体脂肪细胞、空载对照细胞，接种于96孔细胞培养板，接种密度约为每孔2000个细胞，以PAM培养基培养96小时，分别于第0、12、24、48、72、96h时取细胞进行细胞生长活力测定(CCK-8法)，连续4天后，根据CCK-8吸光度值绘出生长曲线。

B．将miR-26b过表达的前体脂肪细胞、空载对照细胞，培养于细胞培养瓶，以无胎牛血清的PAM培养基培养48小时后，使细胞同步化，停留于G0期。恢复含胎牛血清的PAM培养基进行培养，并在恢复血清培养后的第0、24、48小时收取细胞，70%冰乙醇固定后经流式细胞仪检测细胞各周期分布，计算不同时间点S期细胞（染色质合成期）分布（代表细胞增殖能力）。

2．结果

通过CCK-8法试验发现，人miR-26b过表达组的细胞增殖速度明显慢于空载对照组细胞，细胞个数明显减少（见图3）；通过检测细胞周期发现，在恢复血清培养第24、48小时，人miR-26b过表达组的脂肪细胞中S期细胞比例明显少于空载对照组，表明染色质合成期细胞减少，细胞增殖速度变慢（见图4）。

Claims (2)

1.人miR-26b在制备抑制脂肪细胞增殖药物中的应用。

2.人miR-26b在制备减肥药中的应用。

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