CN107815442A

CN107815442A - 一种表达抗癌肽CB1a的重组腺病毒及其构建方法和应用

Info

Publication number: CN107815442A
Application number: CN201711041655.3A
Authority: CN
Inventors: 张军林; 岳硕豪; 龚仕涛; 赖晓晶; 谢立兰; 解举民; 郭晓红; 李毅
Original assignee: Wuhan Bioengineering Institute
Current assignee: Wuhan Bioengineering Institute
Priority date: 2017-10-30
Filing date: 2017-10-30
Publication date: 2018-03-20

Abstract

本发明公开了一种表达抗癌肽CB1a的重组腺病毒及其构建方法和应用。本发明以抗癌肽CB1a为目的基因构建重组腺病毒载体，实现抗癌肽CB1a的真核表达。通过MTT细胞相对活性检测和细胞划痕实验，证实了CB1a在体外实验中具有抑制癌细胞活性和迁移的作用，从而抑制癌细胞生长。本发明方法效率高、产量大，提供了一种未见报道的抗肿瘤细胞迁移和生长的基因治疗系统。

Description

一种表达抗癌肽CB1a的重组腺病毒及其构建方法和应用

技术领域

本发明涉及构建重组腺病毒的方法，具体说，是一种利用抗癌肽CB1a基因构建重组腺病毒的方法及重组腺病毒和在制备抑制舌癌细胞活性的药物中的应用。

背景技术

随着全球癌症患病比例的逐年增加，癌症已经成为全球死亡的主要原因和重大的公共卫生问题。在过去几十年里人们癌症的研究和治疗已经取得了重大进展。然而，传统的癌症治疗效果不理想，大多数化疗药物对癌细胞有杀伤性但也对健康快速分裂的细胞有杀伤性，并且也会抑制免疫系统，同时也存在着癌症耐药性以及瘤区药物浓度不足等问题。这大大降低了他们的治疗效果，其原因与药物对癌细胞特异性不足有关。

抗癌肽是一类小分子的多肽新型抗癌药物，通过与肿瘤细胞表面的静电贴附作用破坏癌细胞的细胞膜、影响肿瘤血管的形成、抑制癌细胞增殖和迁移等特点，已成为癌症治疗研究的一个新热点。CB1a是以天蚕素(Cecropins)家族中天蚕素B为模板，人工设计的衍生抗癌肽。有研究表明CB1a有抵抗胃癌、肺癌在内的几种癌细胞株的活性。其具有毒性低、特异性强、(Wu J M,Jan P S,Yu H C,et al.Structure and function of a customanticancer peptide,CB1a.[J].Peptides,2009,30(5):839-48.)不易形成耐药性等优点，具有抗癌的应用前景。然而，抗癌肽成为临床应用抗癌药物却面临着化学合成成本高，结构不稳定和多肽药物容易被降解等问题。

随着基础医学和分子病毒学的发展，人们对病毒载体不断地进一步改造和完善，病毒载体作为外源基因导入靶细胞的一种有效工具，使目的基因在靶细胞中得到表达从而达到治疗疾病的目标，在基因治疗中发挥着越来越重要的作用。腺病毒是一种线型双链DNA无包膜病毒，它的DNA和核心蛋白形成内核，蛋白外壳是直径约80nm的正二十面体，由240个六面体和12个位于正二十面体顶部的五面体构成。它通过受体介导的内吞作用进入细胞内，然后腺病毒基因组转移至细胞核内，进行靶标蛋白的表达，腺病毒的基因不会整合进入宿主细胞基因组中。腺病毒载体对靶细胞有较高的转染效率高，可以转染静止期或分裂期的细胞；对机体有较低的致病性；同时可获得较高的滴度，只需要通过一次的质粒转染，在后期可以通过腺病毒感染293A细胞进行病毒的扩增，通过纯化可以获得较高的病毒滴度；在体内不会随机整合到宿主细胞基因组中等特点，使其在基因治疗研究方面有了越来越多的应用。迄今为止,已经报道了1000多例病毒载体用于基因治疗的临床实验，而腺病毒载体就占26％。有研究报道利用腺病毒载体表达诱导细胞凋亡相关蛋白，从而达到抑癌的作用。

因此，使用腺病毒作为表达抗癌肽CB1a的载体具有可能性，并且可以使抗癌肽CB1a持续性的作用于癌细胞，发挥其对癌细胞的抑制作用，具有广阔的应用前景。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，提供一种表达抗癌肽CB1a的重组腺病毒及其构建方法和应用，该重组腺病毒能够高效表达、大量产生抗癌肽CB1a，可以使抗癌肽CB1a持续性的作用于癌细胞，发挥其对癌细胞的抑制作用，具有广阔的应用前景。

为实现本发明的目的，本发明提供以下技术方案：

在第一方面，本发明提供一种表达抗癌肽CB1a的重组腺病毒，其携带抗癌肽CB1a基因，优选地，所述抗癌肽CB1a基因的序列如SEQ ID NO:1所示；构建所述重组腺病毒所用的穿梭质粒为pAdTrack-CMV；构建所述重组腺病毒所用的病毒骨架质粒为pAdeasy-1；构建所述重组腺病毒所用的包装细胞为人胚肾293A细胞；

ATGAAGTGGAAGGTGTTCAAGAAGATCGAGAAGAAGTGGAAGGTGTTCAAGAAGATCGAGAAGGCCGGCCCCAAGTGGAAGGTGTTCAAGAAGATCGAGAAGTGA(SEQ ID NO:1)。

本发明提供的重组腺病毒，其表达抗癌肽CB1a，优选地，所述抗癌肽CB1a的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示；

KWKVFKKIEK KWKVFKKIEKAGPKWKVFKKIEK(SEQ ID NO：2)。

由于密码子的简并性，本发明所述抗癌肽CB1a基因的序列还可以包括任何能编码SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的核苷酸序列。

在第二方面，本发明提供一种重组腺病毒质粒，其通过携带抗癌肽CB1a基因的重组穿梭质粒与病毒骨架质粒同源重组得到；

优选地，所述重组穿梭质粒为pAdTrack-CMV携带抗癌肽CB1a基因构成的，本发明中表示为pAdTrack-CB1a；

优选地，所述病毒骨架质粒为pAdeasy-1；

优选地，所述同源重组发生在大肠杆菌内，优选大肠杆菌BJ5183。

在第三方面，本发明提供一种如第二方面所述的重组腺病毒质粒的构建方法，包括以下步骤：

1)目的基因CB1a的获得：

a、细胞总RNA的提取；

b、cDNA的获得；

c、CB1a基因扩增：CB1a基因扩增体系所用的引物如下：

重叠PCR引物(上游)：

GGGGTACCATGAAGTGGAAGGTGTTCAAGAAGATCGAGAAGAAGTGGAAGGTGTTCAAGAAGATCGAGAAGG；

重叠PCR引物(下游)：

GCTCTAGATCACTTCTCGATCTTCTTGAACACCTTCCACTTGGGGCCGGCCTTCTCGATCTTCTTGAACACC；

CB1a(sense)：CGGAATTCCGGCCACCATGAAGTGGAAGGTGTTCA；

CB1a(anti)：GCTCTAGAGCTCACTTCTCGATCTTCTTGAAC；

2)pMD-20T-CB1a载体的构建：

CB1a与pMD-20T载体连接体系：Solution I 5μL，pMD-20T载体0.5μL，重叠CB1a回收产物2.6μL，ddH₂O 1.9μL；连接体系置于16℃恒温仪过夜；

3)pAdTrack-CB1a穿梭载体的构建：

将正确的pMD-20T-CB1a、pAdTrack-CMV分别进行EcoR I、Xba I双酶切，琼脂糖凝胶电泳回收CB1a，线性化的pAdTrack-CMV，测定其浓度并进行连接；CB1a与Track载体连接体系：T4连接酶Buffer 10×2μL，T4连接酶2μL，CB1a回收产物2μL，pAdTrack-CMV 4μL，ddH₂O 10μL；连接体系置于16℃恒温仪过夜；转化DH5α大肠杆菌；

4)pAd-CB1a腺病毒骨架载体的构建：

pAdTrack-CB1a质粒Pme I单酶切体系：ddH₂O 29.5μL，B Buffer 10×5μL，pAdTrack-CB1a 15μL，Pme I 0.5μL；置于37℃恒温水浴锅单酶切；

DNA凝胶回收试剂盒进行胶回收，取回收产物与pAd-easy-1质粒一起转化BJ5183感受态中，提取质粒即为如第二方面所述的重组腺病毒质粒pAd-CB1a。

在第四方面，本发明提供一种如第一方面所述的重组腺病毒的制备方法，所述制备方法包括将如第二方面所述的重组腺病毒质粒线性化后转染哺乳动物细胞，优选人胚肾293细胞，观察荧光与细胞状态，及时少量补加培养基以维持细胞的正常生长，在3-5天后收取细胞与培养基，5000r/min，5min，得到包含所述重组腺病毒的上清液；

优选地，所述线性化采用PacI酶切线性化。

在第五方面，本发明提供一种如第一方面所述的重组腺病毒在制备抑制癌细胞迁移和生长的药物中的应用。

本发明的有益效果为：

本发明首次用重组腺病毒作为表达载体，在哺乳动物细胞(特别是人胚肾293细胞)中成功表达了抗癌肽CB1a，本发明重组腺病毒能够高效表达、大量产生抗癌肽CB1a。本发明重组腺病毒质粒构建方法简单、重复性强，能够快速转染哺乳动物细胞，经包装得到本发明的重组腺病毒，病毒滴度为10⁸pfu/mL。利用腺病毒表达CB1a多肽，使得癌细胞增殖受到抑制，而且抑制癌细胞的迁移和生长。

附图说明

图1CB1a重叠PCR琼脂糖凝胶电泳。

图2pMD-20T-CB1a双酶切鉴定。

图3PCR检测目的基因CB1a的整合。

图4Ad-CB1a感染细胞SCC9的mRNA的表达鉴定。

图5以不同感染复数Ad-AB1a处理SCC9细胞的存活率。

图6以不同感染复数处理LN299细胞的存活率。

图7以不同的感染复数处理U87细胞，测得在72h细胞的存活率。

图8以不同的感染复数处理A549细胞，测得在72h细胞的存活率。

图9感染复数MOI为10处理LN229细胞细胞迁移图。

图10感染复数MOI为10处理SCC9细胞在72h流式细胞仪检测细胞周期。

具体实施方式

通过以下详细说明结合附图可以进一步理解本发明的特点和优点。所提供的实施例仅是对本发明方法的说明，而不以任何方式限制本发明揭示的其余内容。【实施例1】获得目的基因CB1a

1、引物设计

在NCBI上查找CB1a的氨基酸序列，采用人源偏好的密码子设计和优化基因序列，优化后的序列如下：

CB1a的氨基酸序列(MMDB ID:144618)：

KWKVFKKIEK KWKVFKKIEKAGPKWKVFKKIEK(SEQ ID NO:1)。

根据如上基因序列利用Primer Premier 5设计重叠PCR引物，在第二次扩增引物中，上游引物添加EcoR I酶切位点，下游引物Xba I酶切位点。

重叠PCR引物(上游)：

GGGGTACCATGAAGTGGAAGGTGTTCAAGAAGATCGAGAAGAAGTGGAAGGTGTTCAAGAAGATCGAGAAGG。

重叠PCR引物(下游)：

GCTCTAGATCACTTCTCGATCTTCTTGAACACCTTCCACTTGGGGCCGGCCTTCTCGATCTTCTTGAACACC。

CB1a(sense)：CGGAATTCCGGCCACCATGAAGTGGAAGGTGTTCA；酶切位点：EcoR I。

CB1a(anti)：GCTCTAGAGCTCACTTCTCGATCTTCTTGAAC；酶切位点：Xba I。

2、CB1a目的基因的PCR获取

重叠PCR体系：ddH₂O 5.3μL，10×PCR Buffer 2μL，dNTP Mixture 2.5μL，rTaq酶0.2μL，重叠PCR引物(上游)5μL，重叠PCR引物(下游)5μL。PCR程序设定如下：95℃5min；95℃30s，55℃30s，72℃30s，30个循环；72℃5min，16℃15min。

重叠PCR反应产物用1％的琼脂糖凝胶电泳回收重叠PCR产物，再进行第二次PCR，加入酶切位点。

PCR反应体系如下：ddH₂O 17.5μL，10×PCR Buffer 2.5μL，dNTP Mixture 2μL，rTaq酶0.2μL，CB1a sens 1μL，CB1a anti 1μL，模板1μL。

PCR程序设定如下：94℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃30s，30个循环；72℃5min，16℃15min。PCR产物用1％的琼脂糖凝胶电泳(如图1约100bp条带即CB1a基因)。

【实施例2】携带CB1a基因的重组腺病毒的制备

1.重组腺病毒基因载体构建

1.1 pMD-20T-CB1a载体的构建与鉴定

CB1a与pMD-20T载体连接体系：Solution I 5μL，pMD-20T载体0.5μL，重叠CB1a回收产物2.6μL，ddH₂O 1.9μL。

连接体系置于16℃恒温仪过夜。EcoR I、Xba I双酶切鉴定，反应产物用1％的琼脂糖凝胶电泳(如图2，约100bp条带即CB1a基因)。由生工生物工程(上海)股份有限公司武汉测序部进行测序鉴定。

1.2 pAdTrack-CB1a穿梭载体的构建与鉴定

将正确的pMD-20T-CB1a、pAdTrack-CMV同时进行EcoR I、Xba I双酶切，琼脂糖凝胶电泳回收CB1a，线性化的pAdTrack-CMV，测定其浓度并进行连接。CB1a与Track载体连接体系：T4连接酶Buffer 10×2μL，T4连接酶2μL，CB1a回收产物2μL，pAdTrack-CMV 4μL，ddH₂O 10μL。

连接体系置于16℃恒温仪过夜。转化DH5α大肠杆菌，提取质粒后EcoR I、Xba I双酶切鉴定。反应产物用1％的琼脂糖凝胶电泳。

1.3 pAd-CB1a腺病毒骨架载体的构建与鉴定

pAdTrack-CB1a质粒Pme I单酶切体系：ddH₂O 29.5μL，B Buffer 10×5μL，pAdTrack-CB1a 15μL，Pme I 0.5μL。置于37℃恒温水浴锅单酶切反应鉴定，反应产物用1％的琼脂糖凝胶电泳。参考TIAN GEN的DNA凝胶回收试剂盒进行胶回收。取回收产物与pAd-easy质粒一起转化BJ5183感受态中，提取质粒即为pAd-CB1a。

将提取的pAd-CB1a质粒，使用Pac I置于37℃恒温水浴锅进行单酶切3h，Pac I单酶切体系：ddH₂O 9.8μL，Pac I Buffer 10×2μL，Plasmid 8μL，Pac I 0.2μL。反应产物用1％的琼脂糖凝胶电泳。

1.4中量质粒的提取

参考TIAN GEN公司高纯度中量质粒提取说明书，产物用1％的琼脂糖凝胶电泳鉴定。

1.5单酶切乙醇沉淀回收

将提取的pAd-CB1a质粒，使用Pac I置于37℃恒温水浴锅进行单酶切3h，Pac I单酶切体系：ddH₂O 9.8μL，Pac I Buffer 10×2μL，Plasmid 8μL，Pac I 0.2μL。酶切产物用乙醇沉淀回收步骤如下：

①取出酶切好的体系后，转移到1.5mLEp管中，并在体系中加入ddH₂O定容至200μL；

②加入1/10提及的乙酸钠(3mol/L，pH＝5.2)与体系中充分混合均匀；

③加入2倍体积预冷的无水乙醇，上下颠倒混匀。放置于-20℃，30min；

④12000rpm，4℃离心10min，收集DNA沉淀；

⑤打开管口，弃尽上清，加入1mL70％乙醇于Ep管中，将沉淀弹起洗涤充分。12000rpm，4℃离心5min，弃上清，室温风干乙醇；

⑥加入10μL ddH₂O溶解DNA。

2.制备重组腺病毒Ad-CB1a

2.1 pAd-CB1a载体的转染

①将293A细胞接入6孔板中，在接种12h后细胞汇合度达到70％，细胞状态较好，更换无血清培养基培养2h。

②配制转染试剂：A.8μL脂质体+150μL optin

B.3μg回收质粒+150μL optin

将A，B液室温静置5min，然后将其混合均匀，室温静置20min。

③将A，B混合，均匀滴加入相应孔板中，培养6-8h后，更换为含10％FBS的DMEM，然后继续培养并观察荧光与细胞状态。

④每24h检测一次荧光，及时少量补加培养基以维持细胞的正常生长，在3-5天后收取细胞与培养基。5000r/min，5min，将上清1mL分装，-20℃保存。

2.2 PCR鉴定重组腺病毒中的目的基因

①取含有病毒液的PBS 20μL，90℃水浴10min。

②10000r/min，5min，然后取1μL进行PCR检测，反应体系如下：rTaq酶0.2μL，病毒液上清1μL，CB1a(sense)0.25μL，CB1a(anti)0.25μL，dNTP(2.5mM)2μL，10×Buffer 2.5μL，H₂O 17.3μL。

③使用1.2％的琼脂糖凝胶电泳，分析电泳结果(如图3)，目标基因CB1a整合到腺病毒基因组中。

2.3重组腺病毒目的基因表达检测

①将SCC9接种于12孔板，细胞汇合度在60％时接入适量重组腺病毒，培养48h后收取所有细胞。

②每10⁵个细胞加入1mL TRIOL使细胞充分裂解，室温静置5min，4℃，12000r/min，10min。

③留取上清，每1mL TRIOL加入0.5mL的异丙醇，室温放置10min，4℃，12000r/min，10min。

④移去上清，加入75％的乙醇重悬洗涤RNA沉淀，4℃，12000r/min，10min。

⑤放置超净台中进行干燥，加入25μL无RNase的超纯水使其充分溶解。取出1μL分装测定浓度，剩余部分-80℃保存。

⑥DNAse处理提取的mRNA反应体系如下：mRNA 4μL，DNAse 0.5μL，dd H₂O 5.5μL。

37℃水浴，30min，水解mRNA提取过程中残留DNA；85℃，5min使DNAse失活。

⑦预处理DNAse处理之后的RNA，如下：Oblige dT primer 0.5μL，dNTP mixture0.5μL，dd H₂O 3μL，RNA1μg。将上述体系95℃水浴10min，冰浴5min，打开RNA存在的部分双链和高级结构。

⑧反转录mRNA检测其目的基因CB1a的表达，反转录体系如下：Prime script IIRTase 0.5μL，RNase Inhibitor 0.25μL，5×Buffer 2μL，预处理RNA 5μL，dd H₂O 2.25μL。反转录反应程序如下：42℃60min，94℃5min。得到细胞总mRNA反转录后的cDNA，通过PCR检测目的基因的表达；PCR体系如下：：rTaq酶0.2μL，模板0.2μL，Forward primer 1μL，Reverse primer 1μL，dNTP(2.5mM)2μL，10×Buffer 2.5μL，H₂O 18.1μL。PCR产物用1％的琼脂糖凝胶电泳(如图4)，Ad-CB1a感染组细胞和阳性对照均扩增出目的基因。

2.4腺病毒扩增与收集

①293A细胞生长状态较好时接种于10cm皿培养，细胞汇合度在70％左右，均匀滴加收集的含腺病毒的细胞培养基300μL。

②每24h观察一次荧光，细胞贴附率在40％-50％时收集细胞与培养基，12000r/min，4℃，10min，上清1.5mL分装。

③加入PBS重悬细胞，-80℃与37℃反复冻融3次，12000r/min，4℃，10min，收集上清分装，-80℃长期保存。

3.重组腺病毒滴度测定

①将293A细胞接种于96孔板中，每个孔约7000个细胞，以十二孔为一组测试一种病毒梯度，一种病毒重复三次，置于37℃，5％CO₂培养箱中培养24h；

②细胞汇合度为70％-80％时，跟换新鲜培养基，每孔90μL，加入病毒液。第一个孔加入10μL，轻吹混匀后，吸取10μL转入下一个孔，轻吹混匀后，按之前的步骤向后转移10μL，直到第11个孔，吸出的10μL直接丢弃。前四个稀释梯度可在1.5mL的EP管中进行，置于37℃，5％CO₂培养箱中培养24h；

③在倒置荧光显微镜下观察，从浓度高向低的方向顺序观察绿色荧光细胞的数量，当发现某一个孔之后的孔再无绿色荧光，则此孔作为计量孔(计为1U)，若在该孔前有个孔没有绿色荧光，也将此孔作为计量孔，然后计算病毒的滴度。病毒液的滴度＝(1U×计量孔相对于第1孔的稀释倍数)/第1孔加入病毒的体积。经实验测得病毒Ad-CB1a病毒滴度为10⁸。

【实施例3】抑制癌细胞作用检测

1、重组腺病毒感染癌细胞的MTT检测

①将癌细胞以5000个/孔接入96孔板，37℃，5％CO₂培养12h。

②加入不同感染复数的病毒，每一感染复数设置5个重复。

③在加入重组腺病毒分别培养至48h，72h，96h时分别加入20μL MTT(5mg/mL)，培养4h；然后移除培养基，加入200μL DMSO使紫色结晶完全溶解，在490nm测定吸光值，并记录数据分析细胞的存活率。分别用SCC9细胞(如图5)、LN229细胞(如图6)、U87细胞(如图7)、A549细胞(如图8)进行实验，结果显示，加入重组腺病毒后72h和48h后的抑制效果明显高于对照组，不同的感染复数MOI略有差异。

2、重组腺病毒对细胞迁移影响的检测

①先用记号笔在12孔板地面的背面位置画2条平行于中轴的标记线，然后将LN229接入12孔板中培养，第二天确保细胞能够铺满皿底80％的面积。

②每孔接入为10MOI的病毒，培养24h后，在皿底用200μL的Tip枪头垂直于中轴线竖直划过，用PBS清洗两次，将脱落的细胞洗去，然后更换为1％FBS的培养基。

③在0h，12h，24h，48h，72h分别拍取相同位子在倒置显微镜明场下的划痕，每个孔拍3个不同位子记录细胞在划痕处的迁移变化(如图9)，CB1a对癌细胞的迁移有显著的抑制作用。

④通过IPP计算出细胞在感染重组腺病毒之后的不同时间段的迁移距离，再分别计算出细胞的迁移速率。如图9所示，Ad-CB1a感染组的癌细胞划痕愈合明显慢于空病毒对照组Ad-EGFP。

3、重组腺病毒对癌细胞周期影响的检测

①以5×10⁵cells/孔接种于12孔板，培养12h，更换培养基后每孔加入相应感染复数的病毒。

②在72h，用0.25％胰酶消化收集全部细胞，1000g/min，5min收集细胞，PBS清洗两次。

③用预冷的250μL PBS悬浮细胞，再加入750μL预冷的无水乙醇吹打混匀，4℃固定处理12-24h。

④1000g/min离心5min收集固定的细胞，用1mL的PBS清洗两次，最后用100μL含有50μg/mLPI的PBS重悬细胞，室温避光静置30min，通过流式细胞仪分析细胞周期(如图10)，CB1a处理后出现了凋亡小峰，说明CB1a可以促进癌细胞的凋亡。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 武汉大学

<120> 一种表达抗癌肽CB1a的重组腺病毒及其构建方法和应用

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 105

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 1

atgaagtgga aggtgttcaa gaagatcgag aagaagtgga aggtgttcaa gaagatcgag 60

aaggccggcc ccaagtggaa ggtgttcaag aagatcgaga agtga 105

<210> 2

<211> 33

<212> PRT

<213> 人工序列()

<400> 2

Lys Trp Lys Val Phe Lys Lys Ile Glu Lys Lys Trp Lys Val Phe Lys

1 5 10 15

Lys Ile Glu Lys Ala Gly Pro Lys Trp Lys Val Phe Lys Lys Ile Glu

20 25 30

Lys

<210> 3

<211> 72

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 3

ggggtaccat gaagtggaag gtgttcaaga agatcgagaa gaagtggaag gtgttcaaga 60

agatcgagaa gg 72

<210> 4

<211> 72

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 4

gctctagatc acttctcgat cttcttgaac accttccact tggggccggc cttctcgatc 60

ttcttgaaca cc 72

<210> 5

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 5

cggaattccg gccaccatga agtggaaggt gttca 35

<210> 6

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 6

gctctagagc tcacttctcg atcttcttga ac 32

Claims

1.一种表达抗癌肽CB1a的重组腺病毒，其特征在于，其携带抗癌肽CB1a基因，所述抗癌肽CB1a基因的序列如SEQ ID NO:1所示；

构建所述重组腺病毒所用的穿梭质粒为pAdTrack-CMV；构建所述重组腺病毒所用的病毒骨架质粒为pAdeasy-1；构建所述重组腺病毒所用的包装细胞为人胚肾293A细胞。

2.根据权利要求1所述的重组腺病毒，其特征在于，其表达抗癌肽CB1a，所述抗癌肽CB1a的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

3.如权利要求1或2所述的重组腺病毒的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括将如权利要求3所述的重组腺病毒质粒线性化后转染人胚肾293A细胞，观察荧光与细胞状态，及时少量补加培养基以维持细胞的正常生长，在3-5天后收取细胞与培养基，5000 r/min，5min，得到包含所述重组腺病毒的上清液；

所述线性化采用PacI 酶切线性化。

4.一种重组腺病毒质粒，其特征在于，其通过携带抗癌肽CB1a基因的重组穿梭质粒与病毒骨架质粒同源重组得到；

所述重组穿梭质粒为pAdTrack-CMV 携带抗癌肽CB1a基因构成的；

所述病毒骨架质粒为pAdeasy-1 ；

所述同源重组发生在大肠杆菌内，大肠杆菌BJ5183。

5.如权利要求4所述的重组腺病毒质粒的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括将线性化的重组穿梭质粒pAdTrack-CB1a、病毒骨架质粒pAdeasy-1一起转化感受态大肠杆菌BJ5183进行同源重组，筛选阳性克隆，并从所述阳性克隆中提取所述重组腺病毒质粒；

所述线性化为PmeI酶切线性化。

6.一种如权利要求1或2所述的重组腺病毒在制备抑制癌细胞迁移和生长的药物中的应用。