CN109701018B

CN109701018B - 靶向干扰golph3基因表达在提高非小细胞肺癌放疗敏感性中的应用

Info

Publication number: CN109701018B
Application number: CN201811631525.XA
Authority: CN
Inventors: 陈国栋; 韩伟; 孔培忠; 聂莉莉; 杨苗苗
Original assignee: Hefei Institutes of Physical Science of CAS
Current assignee: Hefei Institutes of Physical Science of CAS
Priority date: 2018-12-29
Filing date: 2018-12-29
Publication date: 2021-08-13
Anticipated expiration: 2038-12-29
Also published as: CN109701018A

Abstract

本发明提供靶向干扰GOLPH3基因表达在提高非小细胞肺癌放疗敏感性中的应用。本发明提供能够作为调控细胞辐射敏感性的靶标GOLPH3基因，其对于细胞的辐射敏感性具有显著的调节功能。本发明还提供能够高效抑制GOLPH3基因表达的shRNA以及将shRNA导入细胞、实现高效稳定表达的腺病毒和慢病毒载体，实现了GOPLH3基因的高效沉默，GOPLH3基因的高效沉默导致细胞的辐射敏感性显著提高。本发明提供的提高细胞辐射敏感性的调控靶标以及特异性沉默GOLPH3基因的shRNA，可用于提高非小细胞肺癌等癌症放疗的敏感性，提高放疗治疗效果，为非小细胞肺癌等癌症的放疗增敏提供了一种新方法。

Description

靶向干扰GOLPH3基因表达在提高非小细胞肺癌放疗敏感性中的应用

技术领域

本发明涉及生物医药领域，具体涉及靶向干扰GOLPH3基因表达在提高非小细胞肺癌放疗敏感性中的应用。

背景技术

肺癌是全球第一的癌症杀手，每年全球新增病例120万人，每30秒就有一人死于肺癌。在中国，肺癌同样是发病率与死亡率最高的癌症，也是癌症防治工作中的重中之重。肺癌放射治疗是目前治疗肺癌的三大手段(手术、化疗、放疗)之一，但部分瘤细胞对放射线的抵抗性严重影响了肿瘤的治疗效果，因此放疗抗性一直是困扰临床肿瘤放疗的难题。通过提高细胞的放疗敏感性增强肿瘤杀伤效果，同时降低对正常细胞的损伤目前是放射生物学研究的热点之一。

细胞辐射抗性是细胞辐射反应的一种重要表现形式。辐射抗性有利于正常细胞逃避电离辐射的损伤，但不利于肿瘤细胞的放射治疗。因此，它既是辐射防护研究人员所关心的问题，也是令临床放射治疗研究人员感到棘手的问题。目前，肿瘤的放射敏感性及预后与某些基因的确切关系还不清楚。根据放射生物学，肿瘤细胞的内在放射敏感性主要与以下四点(4R)有关：(1)亚致死损伤的修复；(2)细胞周期时相的再分布；(3)肿瘤细胞的再氧合；(4)组织再群体化。影响放疗效果的因素很多，如肿瘤谷胱甘肽的含量、肿瘤的乏氧状态、肿瘤本身放射敏感性及辐射抗拒等，其中辐射抗拒被认为是肿瘤局部复发或放疗失败的重要原因，而肿瘤的放射敏感性与细胞中特定基因的表达及转录因子的活化水平差异等密切相关。这些特定基因经转录翻译成蛋白后，被定位到细胞不同部位，参与相应的信号通路，进而产生辐射抗性。

高尔基体磷蛋白3(Golgi phosphoprotein 3，GOLPH3)，又名GMx33或GPP34，是新近发现的一个癌蛋白，其定位于反面高尔基体网管状结构(trans-Golginetwork，TGN)，可诱导正常细胞发生转化，促使细胞增殖和分化过程失去平衡，最终导致细胞恶性转化以及肿瘤的发生。2009年，Scott等的研究发现，肺癌、乳腺癌、黑色素瘤、卵巢癌、前列腺癌等多种实体肿瘤中均存在5p13区域拷贝频率的异常增加，对此区域进行系统性分析后发现GOLPH3基因的表达与5p13区域的拷贝状态关系密切，并通过体内、体外等实验首次证实了GOLPH3是一个新的致癌基因。目前，国内外关于GOLPH3与人类肿瘤发生的研究，如横纹肌肉瘤、舌癌、食管癌、神经胶质细胞瘤等均有报道；其中，Hu等首次对GOLPH3与胃癌组织的关系进行了研究，结果发现，GOLPH3在胃癌组织中的表达高于正常组织，提示GOLPH3可能是胃癌预后不良的预测因子。进一步的研究也证实GOLPH3参与肿瘤细胞对放疗药物如阿霉素、伊立替康等的抗药性。

RNA干扰(RNA interference，RNAi)作为一种实用的分子生物学技术，近年来发展非常迅速。该技术可高效特异性地抑制基因表达，在实用性上比其它基因抑制技术具有更多的优点。利用双链小干扰RNA(siRNA)转染哺乳动物细胞即可选择性降解靶标mRNA。RNA干扰技术对靶标基因的沉默迅速且高效，由RNA聚合酶III启动子调控的小干扰RNA的表达可以产生长久的抑制蛋白合成的效应。siRNA介导的瞬时或稳定的基因沉默具有高度的特异性且无副作用。研究表明，表达小发夹RNA(shRNA)并在细胞内形成siRNA的载体能够增加转染细胞的种类，并能够更有效地发挥阻断基因表达的作用。

基因治疗中，如何将目的基因导入靶细胞并高效表达导入基因使其发挥生物学功能是影响基因治疗效果的关键。腺病毒载体具有高效传递和表达基因的能力，以腺病毒作为基因治疗的载体具有如下优点：(1)具有较广的宿主范围，能够感染除造血细胞以外的几乎所有细胞；(2)其感染不依賴于细胞分裂，可以感染分裂及非分裂细胞；(3)能髙效感染宿主细胞；(4)体外包装细胞可产生较高的病毒滴度。因此，腺病毒介导的RNA干扰技术可能成为一种肿瘤临床治疗的有效策略。

发明内容

为解决现有技术中的问题，本发明的目的在于提供靶向干扰GOLPH3基因表达在提高非小细胞肺癌放疗敏感性中的应用。

为实现上述目的，本发明的技术方案如下：本发明通过对细胞辐射敏感性与基因表达的关系进行大量的研究，发现GOLPH3基因(氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示)能够调控细胞辐射敏感性，通过抑制GOLPH3基因的表达，能够显著提高细胞，尤其是肿瘤细胞的辐射敏感性。在此基础上，本发明设计了一系列的抑制GOLPH3基因表达的shRNA，筛选得到两个能够高效抑制GOLPH3基因表达的shRNA(shGOL-1和shGOL-2)，shGOL-1的正义链和反义链序列分别如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示；shGOL-2的正义链和反义链序列分别如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示。进一步地，为实现shGOL-1和shGOL-2在细胞中的高效表达，本发明通过筛选确定腺病毒和慢病毒作为shGOL-1和shGOL-2表达的载体，分别构建了用于携带shGOL-1和shGOL-2的质粒载体，并利用该质粒载体制备了携带shGOL-1和shGOL-2的腺病毒和慢病毒。本发明制备的携带shGOL-1和shGOL-2的腺病毒和慢病毒在导入细胞后，能够实现shGOL-1和shGOL-2的高效稳定表达，进而高效、持续稳定地抑制GOLPH3基因的表达，显著提高细胞的辐射敏感性。

第一方面，本发明提供GOLPH3基因在调控细胞辐射敏感性中的应用，所述GOLPH3基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明中，所述GOLPH3基因在调控细胞辐射敏感性中的应用，为通过调控GOLPH3基因的表达量实现细胞辐射敏感性的调控。

第二方面，本发明提供GOLPH3抑制物在制备提高细胞辐射敏感性的药物中的应用。

本发明中，所述GOLPH3抑制物为GOLPH3基因表达抑制剂。

优选地，所述GOLPH3基因表达抑制剂为抑制GOLPH3基因表达的RNA。

更优选地，所述RNA为shRNA，所述shRNA包括shGOL-1和/或shGOL-2：

shGOL-1：

正义链1：5'-GCATGTTAAGGAAACTCAGCCCTCGAGGGCTGAGTTTCCTTAACATGCTTTTT-3'；

反义链1：5'-AAAAAGCATGTTAAGGAAACTCAGCCCTCGAGGGCTGAGTTTCCTTAACATGC-3'；

shGOL-2：

正义链2：5'-GCAGCGCCTCATCAAGAAAGTCTCGAGACTTTCTTGATGAGGCGCTGCTTTTT-3'；

反义链2：5'-AAAAAGCAGCGCCTCATCAAGAAAGTCTCGAGACTTTCTTGATGAGGCGCTGC-3'。

本发明中，所述细胞为哺乳动物细胞，可以为哺乳动物的正常细胞或肿瘤细胞。

优选地，所述细胞为肺癌细胞。更优选为非小细胞肺癌细胞。

本发明中，shGOL-1和shGOL-2为针对不同的靶区域设计的抑制GOLPH3基因表达的shRNA，shGOL-1和shGOL-2可以分别单独发挥抑制GOLPH3基因表达的作用，也可以联合作用共同发挥抑制GOLPH3基因表达的功能。

第三方面，本发明提供抑制GOLPH3基因表达的shRNA，包括shGOL-1和/或shGOL-2：shGOL-1：

正义链1：5'-GCATGTTAAGGAAACTCAGCCCTCGAGGGCTGAGTTTCCTTAACATGCTTTTT-3'；

反义链1：5'-AAAAAGCATGTTAAGGAAACTCAGCCCTCGAGGGCTGAGTTTCCTTAACATGC-3'；

shGOL-2：

正义链2：5'-GCAGCGCCTCATCAAGAAAGTCTCGAGACTTTCTTGATGAGGCGCTGCTTTTT-3'；

反义链2：5'-AAAAAGCAGCGCCTCATCAAGAAAGTCTCGAGACTTTCTTGATGAGGCGCTGC-3'；

第四方面，本发明提供包含所述shRNA的载体。

所述载体可以为针对任何宿主的任何复制型或非复制型载体，只要含有本发明所述的shRNA的载体均在本发明的保护范围内。

优选地，所述载体为慢病毒穿梭载体或腺病毒穿梭载体。

作为本发明的一种实施方式，所述载体为GV248载体和pDC311-U6载体。

本发明中，含有所述shRNA的慢病毒穿梭载体GV248或腺病毒穿梭载体pDC311-U6的制备可以采用本领域常规的方法制备，如将shRNA-1或shRNA-2分别与慢病毒穿梭载体GV248或腺病毒穿梭载体pDC311-U6连接，得到含有所述shRNA的载体。

第五方面，本发明提供包含所述shRNA或含有所述shRNA的载体的宿主细胞。

本发明中，所述宿主细胞包括但不限于微生物细胞、非繁殖性动物细胞或非繁殖性植物细胞。

第六方面，本发明提供一种病毒，所述病毒包含所述shRNA或含有所述shRNA的载体。

优选地，所述病毒为腺病毒或慢病毒。

本发明中，包含所述shRNA或含有所述shRNA的载体的病毒的制备方法包括将所述shRNA与载体连接，导入所述病毒的步骤。

第七方面，本发明提供包含所述shRNA的载体或包含所述shRNA或所述的载体的宿主细胞或含有所述shRNA或所述载体的病毒在提高细胞辐射敏感性或制备提高细胞辐射敏感性的药物中的应用。

优选地，所述细胞为肺癌细胞；更优选为非小细胞肺癌细胞。

第八方面，本发明提供包含所述病毒的药物。

本发明中，所述药物可用于提高肺癌，尤其是非小细胞肺癌的放疗敏感性，进而用于配合放疗提高非小细胞肺癌的治愈率。

本发明的有益效果在于：

(1)本发明提供能够作为调控细胞辐射敏感性的靶标GOLPH3基因，其对于细胞的辐射敏感性具有显著的调节功能。

(2)本发明提供能够高效抑制GOLPH3基因表达的shRNA以及将shRNA导入细胞、实现高效稳定表达的腺病毒和慢病毒载体，实现了GOPLH3基因的高效沉默。

(3)通过细胞的克隆形成实验和细胞凋亡检测分析本发明中GOPLH3基因沉默细胞的辐射敏感性，结果证明，干扰GOLPH3可显著提高细胞对放疗的敏感性。

本发明提供的提高细胞辐射敏感性的调控靶标以及特异性沉默GOLPH3基因的shRNA，可用于提高非小细胞肺癌等癌症放疗的敏感性，提高放疗治疗效果，为非小细胞肺癌放疗增敏提供了一种新方法。在临床治疗中，可以通过注射高滴度的含有本发明提供的shRNA的慢病毒或腺病毒于瘤体内，待病毒感染后给予放疗，达到增强肿瘤细胞放疗敏感性的作用。

附图说明

图1为本发明实施例1中携带干扰GOLPH3基因的shRNA的慢病毒RNA干扰载体和腺病毒RNA干扰载体；其中，A为慢病毒RNA干扰载体；B为腺病毒RNA干扰载体。

图2为本发明实施例1中GOLPH3基因稳定干扰的A549和SPC-A-1细胞株的GOLPH3蛋白表达水平检测；其中A为慢病毒介导的GOLPH3稳定干扰的A549和SPC-A-1细胞株的GOLPH3蛋白表达水平检测；B为腺病毒介导的GOLPH3稳定干扰的A549和SPC-A-1细胞株的GOLPH3蛋白表达水平检测。

图3为本发明实施例2中GOLPH3基因干扰的A549和SPC-A-1细胞在不同剂量辐射下克隆形成实验结果，其中A为GOLPH3基因干扰后A549和SPC-A-1细胞在不同剂量辐射下的克隆形成的平皿结果图；B为GOLPH3基因干扰后A549和SPC-A-1细胞在不同剂量辐射下的克隆形成的检测曲线拟合图。

图4为本发明实施例2中GOLPH3基因干扰后SPC-A-1细胞在辐射后的流式细胞分析细胞凋亡结果，其中，A为GOLPH3基因干扰后SPC-A-1细胞在辐射后的凋亡检测的流式图；B为三次独立重复流式检测的细胞凋亡率的统计分析结果，★中，表示差异显著，p<0.05(与NC辐射组比较)。

图5为本发明实施例2中GOLPH3基因干扰后SPC-A-1细胞辐射凋亡重要指标蛋白PARP的剪切情况的western blot检测。

具体实施方式

以下结合具体实施例，对本发明进一步阐述。应理解，这些实施例仅用于本发明而不用于限制本发明的范围。除非另有定义或说明，本专利所述的科学术语与本领域普通技术人员所理解具有相同的含义。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。其中，SPC-A-1、A549、HEK293A、HEK293FT细胞均购于中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库。

实施例1shRNA的序列设计、载体构建及GOLPH3基因干扰

一、细胞培养

人肺腺癌SPC-A-1细胞和A549细胞用RPMI-1640培养液(含有10％灭活胎牛血清、100U/mL青霉素和100U/mL链霉素)；人胚肾细胞系衍生系HEK293A和HEK293FT细胞用DMEM高糖培养液(含有10％灭活胎牛血清、100U/mL青霉素和100U/mL链霉素)，于37℃、5％CO₂细胞培养箱传代培养。

二、靶向GOLPH3基因的shRNA的设计合成

检索NCBI GenBank数据库获得GOLPH3基因全序列和RNA序列，通过对GOLPH3基因进行生物信息学分析，选择编码区作为siRNA设计的靶序列。在siRNA设计网站上进行初步设计和筛选，同时结合人工复筛，选取两处靶向序列分别为：GOLPH3-RNAi-1：GCATGTTAAGGAAACTCAGCC和GOLPH3-RNAi-2：GCAGCGCCTCATCAAGAAAGT。进一步结合载体信息，设计靶向GOLPH3基因的shRNA序列，经大量筛选和序列优化设计，最终确定两对能够高效抑制GOLPH3基因表达的shRNA，shGOL-1和shGOL-2，其序列如下(如SEQ ID NO.3～SEQ IDNO.6所示)：

shGOL-1：

正义链1：5'-GCATGTTAAGGAAACTCAGCCCTCGAGGGCTGAGTTTCCTTAACATGCTTTTT-3'；

反义链1：5'-AAAAAGCATGTTAAGGAAACTCAGCCCTCGAGGGCTGAGTTTCCTTAACATGC-3'；

shGOL-2：

正义链2：5'-GCAGCGCCTCATCAAGAAAGTCTCGAGACTTTCTTGATGAGGCGCTGCTTTTT-3'；

反义链2：5'-AAAAAGCAGCGCCTCATCAAGAAAGTCTCGAGACTTTCTTGATGAGGCGCTGC-3'；

以不针对任何基因的非特异性shRNA作为对照(NC)，对照的shRNA序列如下：

NC：

正义链：5'-TTCTCCGAACGTGTCACGTCTCGAGACGTGACACGTTCGGAGAATTTTT-3'；反义链：5'-AAAAATTCTCCGAACGTGTCACGTCTCGAGACGTGACACGTTCGGAGA A-3'。

为构建载体的需要，根据慢病毒穿梭载体及腺病毒穿梭载体多克隆位点信息，在上述shRNA序列的基础上，加上酶切位点序列后送于通用生物系统(安徽)有限公司合成shRNA，并进一步将其构建于慢病毒穿梭载体GV248(购自上海吉凯基生物有限公司)和腺病毒穿梭载体pDC311-U6(pDC311-U6载体为在购自Microbix公司的pDC311载体的基础上，将hU6启动子序列及一个BamHI酶切位点序列插入到Xbal酶切位点间构建得到pDC311-U6)上，其中，GV248-shGOL-1、GV248-shGOL-2和GV248-NC的载体结构示意图如图1的A所示，pDC311-U6-shGOL-1、pDC311-U6-shGOL-2和pDC311-U6-NC的载体结构示意图如图1的B所示。

三、慢病毒的包装及纯化

(1)细胞分盘：通过胰酶消化收集HEK293FT细胞，将细胞接种于10cm培养皿。将HEK293FT细胞置于含5％CO₂的37℃温箱中孵育8-24h，当细胞汇合达到80％左右满度时进行质粒转染。

(2)细胞转染：取两个无菌1.5mL EP管，一个EP管中加入700μL无血清DMEM，加入慢病毒穿梭质粒和包装质粒共20μg，使各个质粒的质量比例为：PSPAX2：PMD2G:GV248-shGOL-1(或GV248-shGOL-2)＝3:2:4；另一个EP管中加入700μl无血清DMEM，加入44μLlipofectamin2000，室温放置5min。然后将两管充分混匀，室温放置15-20min。将上述1400μL的混合液逐滴加入含HEK293FT细胞和培养基的培养皿中，轻轻摇动培养皿混匀后置于含5％CO₂的37℃温箱孵育，4-6h后更换完全培养基。

(3)换液：24h后吸去培养基，加入适量37℃预热的完全培养基，继续将细胞放置温箱孵育。

(4)收集病毒上清：分别于转染后48h、72h左右收集含慢病毒的上清。

(5)病毒的浓缩及纯化：将收集的病毒上清液4℃离心，1000rpm 5min，去除细胞碎片，然后0.45μm滤膜过滤。每管Beckman超速离心管中加入30mL病毒上清，然后在上清液的底部轻柔地加入2mL 20％蔗糖溶液(PBS配制)，形成一个蔗糖垫。4℃离心，25000rpm 2h。离心完毕后小心取出超速离心管，小心弃去上清液，留下管底半透明或白色沉淀。100μL冷PBS重悬沉淀，注意避免产生气泡。分装冻存于-80℃。避免反复冻融。

四、腺病毒包装及纯化

(1)质粒转染：将HEK293A细胞置于含5％CO2的37℃培养箱中孵育8-24h，当细胞汇合达到80％左右满度时进行质粒转染。使用lipofectamin2000共转染2μgpDC311-U6-shGOL-1或pDC311-U6-shGOL-2和1μg pBHGlox(delta)E1.3Cre质粒，转染6h后置换成新鲜培养液。

(2)病毒收集：收集前要观察病毒空斑是否形成。为了限制病毒的扩散而让空斑更好地形成，在培养液中加入低熔点琼脂糖，转染后一般在第10至21d可以在显微镜下看到小的空斑。空斑形成后将空斑与琼脂糖一起挑起，放入1mL新鲜培养基中培养过夜。通常挑取3-6个空斑不等，然后比较滴度，使用滴度最高的一个空斑进行后续实验。以此病毒为P1代病毒，以P1代腺病毒感染HEK293A细胞，连续进行三代感染，至P4代进行腺病毒的大量扩增，待空斑形成后收集病毒并对病毒进行体外纯化和浓缩。

(3)病毒扩增及纯化：接种HEK293A细胞至75cm²方瓶中，当密度达到90％，加入适量病毒上清感染细胞3-4d后，细胞几乎变圆，且有一半细胞漂浮，则收集所有细胞。约500×g转速离心，弃上清。以灭菌PBS重悬沉淀，反复冻融4次。在离心管中，由下向上依次缓慢加入6mL1.4g/mL CsCl、4.5mL 1.2g/mL CsCl和15mL病毒裂解上清液，进行CsCl密度梯度离心。超速离心机中，4℃下32000rpm离心3h。用注射器抽吸离心出的病毒带。配置透析液(含有10mM Tris，pH 8.0、2mM MgCl₂和5％sucrose)，灭菌处理。4℃透析，更换3次透析液，每次透析1h可基本去除CsCl，病毒保存于-80℃。

(4)病毒滴度测定(TCID₅₀)：96孔板中接种HEK293A细胞100μl，每孔细胞数约10⁴个，以2％DMEM培养。以2％DMEM将病毒液稀释成8个较高浓度(如10^-6-10^-13)，每个浓度重复10个，每孔加入病毒稀释液100μl。另留两排不加病毒液作为阴性对照。37℃培养箱中培养10d。10d后观察细胞，记数每排出现CPE的孔数，计算细胞病变率。(如某一浓度各孔细胞全部病变，比率为1，如无细胞病变，则比率为0)。计算T＝10×10^1+d(S-0.5)/ml，其中d＝Log 10稀释度(如为10倍稀释度，d＝1)，S＝各浓度细胞病变比率之和。

五、稳定干扰细胞株的建立

(1)病毒感染：将A549和SPC-A-1细胞接种于6孔板中，12-24h后换液，感染细胞时，细胞的最佳密度为30％-50％。分别在上述A549和SPC-A-1细胞中分别加入上述纯化的慢病毒，12h后更换新RPMI-1640完全培养基继续培养3d左右。

(2)嘌呤霉素筛选：更换含1.5μg/mL嘌呤霉素的RPMI-1640完全培养基，继续培养2周，期间正常传代，获得GOLPH3稳定干扰的A549和SPC-A-1细胞株。

六、蛋白免疫印迹实验分析GOLPH3基因干扰效果

(1)抽提蛋白样品：取出37℃培养箱中培养的GOLPH3稳定干扰的A549和SPC-A-1细胞，小心吸掉细胞培养基，避免吸走贴壁细胞，用预冷的PBS洗二次。加入100μl RIPA细胞裂解液裂解细胞，将细胞裂解物用细胞刮刀刮下并放入1.5mL的离心管中，4℃，12,000rpm离心10min，吸取上清置于另一离心管中，吸取少量用于BCA法测定蛋白浓度。于上清中加入适量的5×Loading buffer，沸水浴中煮10min使蛋白变性。将变性完的蛋白样品分装于-80℃保存或立即用于SDS-PAGE。

(2)SDS-PAGE：根据最后所需检测蛋白的分子量大小不同，配制浓度不同的聚丙烯酰胺凝胶。按配方配好胶后每孔加入20μg蛋白样品进行SDS-PAGE，80V电泳0.5h左右使蛋白质浓缩压成一条线，然后120V电泳1.5h左右，使不同分子量的蛋白质分开。

(3)转膜：电泳结束后，将分离胶切下。剪出与凝胶大小相同(略大)的PVDF膜一张和滤纸片两张，将其浸入电转缓冲液中。按顺序做成滤纸、凝胶、PVDF膜、滤纸的夹心，放入电转装置，注意凝胶上蛋白的转移方向为负极向正极。在电转槽中加电转缓冲液(14.4g甘氨酸，3.03g Tris-base，200mL甲醇，溶于双蒸水并定容到1,000mL)，根据所需蛋白质分子量的大小来调整电转的时间和电流的大小。电转完后，取出PVDF膜，做记号以区分蛋白面和非蛋白面。

(4)杂交：用封闭液(5％的脱脂奶粉，溶剂是TBST:20mM Tris-HCl pH 7.5、150mMNaCl和0.1％Tween20)室温封闭PVDF膜1h(摇床轻摇)。以适当比例(见于抗体说明书)稀释一级抗体(1:1000-1:10000)于封闭液中，室温摇床轻摇2h。用TBST溶液洗涤3次，每次摇床轻摇5-10min。再加入荧光偶联的二级抗体IgG稀释液(稀释比例同样见抗体说明书)，室温摇床轻摇60min。用TBST溶液洗涤3次，每次摇床轻摇5-10min。

(5)用近红外扫描仪扫描成像。

结果如图2所示，结果表明，在慢病毒感染后构建的A549和SPC-A-1的稳定细胞株Lv(shGOL-1)和Lv(shGOL-2)及腺病毒感染的A549和SPC-A-1细胞株Ad(shGOL-1)和Ad(shGOL-2)中，GOLPH3的蛋白表达水平显著被抑制，表明用于干扰GOLPH3基因的含有shRNA的慢病毒及腺病毒能够高效沉默GOPLH3基因。

实施例2GOLPH3基因沉默细胞的辐射敏感性分析：

一、克隆存活实验

(1)以不同剂量辐射(辐射剂量分别为0、1、2、4、6Gy)处理处于对数生长期的实施例1构建的以慢病毒为载体介导的GOLPH3干扰的A549和SPC-A-1细胞株(实验组)，以感染携带对照shRNA(NC)的慢病毒载体的A549和SPC-A-1细胞为对照。

(2)辐射后，用0.25％胰蛋白酶消化细胞并吹打成单细胞悬液；

(3)计数300个细胞接种于5mL预温37℃培养液的60mm培养皿中；以十字方向轻轻晃动培养皿，使细胞分散均匀，每个剂量点设3个重复；

(4)将培养皿移入CO₂培养箱,在37℃、5％CO₂和95％湿度环境下，静置培养9天后终止培养；

(5)弃去上清液，用PBS小心浸洗2次。4％多聚甲醛固定15min。然后去固定液，加适量1％结晶紫染色液染10～30min，然后用流水缓慢洗去染色液，空气干燥；

(6)将平皿倒置并叠加一张带网格的透明胶片，用肉眼直接计数克隆，或在显微镜下(低倍镜)计数大于50个细胞的克隆的数量。最后根据下列公式计算出克隆形成率：

克隆形成率(CFE)和存活分数(SF):

SF(％)＝(处理细胞克隆形成率/对照细胞克隆形成率)×100％；

结果如表1和图3所示，通过克隆形成实验分析细胞的辐射敏感性，与对照相比，以慢病毒为载体介导的GOLPH3稳定干扰的A549和SPC-A-1细胞株的辐射后克隆存活率显著降低，采用shGOL-1和shGOL-2干扰GOLPH3的A549细胞的辐射增敏比分别为1.30和2.02，采用shGOL-1和shGOL-2干扰GOLPH3的SPCA-1细胞的辐射增敏比分别为1.51和1.76(表1)，表明GOLPH3干扰能够提高细胞的辐射敏感性。

表1慢病毒介导构建的GOLPH3稳定干扰细胞株A549和SPCA-1的克隆存活实验

注：表1中RNAi-NC为对照shRNA干扰的对照组，GOLPH3-RNAi#1和GOLPH3-RNAi#2分别为采用shGOL-1和shGOL-2干扰GOLPH3的实验组；SF2Gy代表2Gy辐射下的克隆存活率；Dq代表准阈剂量，即克服肩宽剂量；SERDq代表增敏比。

二、细胞凋亡检测实验

采用Annexin V-APC/PI检测分析辐射后的细胞凋亡情况，方法如下：

(1)常规消化处于指数生长期的以慢病毒为载体介导的GOLPH3稳定干扰的SPC-A-1细胞株，以1×10⁵个细胞/皿的浓度接种于35mm培养皿中，37℃、5％CO₂细胞培养箱中培养过夜；以SPC-A-1细胞为对照；

(2)更换新鲜完全培养基后，于X射线辐照仪中照射(辐射剂量分别为0、4Gy)，放回细胞培养箱继续培养；

(3)照射后72h，用不含EDTA的胰酶消化收集后(注：胰酶消化的时间不宜过长，否则会影响细胞膜上磷脂酰丝氨酸与Annexin V-APC的结合)，在室温中，2000rpm离心5～10min，收集细胞；

(4)用预冷1×PBS(4℃)重悬细胞一次，2000rpm离心5-10min，洗涤细胞；加入100μL的1×Binding Buffer重悬细胞；

(5)Annexin V-APC/PI标记：加入APC Annexin V和PI各5μL。轻轻涡旋细胞，避光，室温孵育15min；

(6)加400μL 1×Binding Buffer，流式细胞仪分析。

结果如图4和图5所示，结果表明，采用shGOL-1和shGOL-2干扰GOLPH3后显著增加了辐射导致的SPCA-1细胞凋亡比率(图4)，Western-blot结果也显示干扰GOLPH3显著提高了辐射后PARP蛋白的裂解水平(图5)。上述实验结果证实干扰GOLPH3可显著提高细胞的放疗敏感性。

综上所述，本发明通过设计能够高效特异地沉默GOLPH3基因的shRNA，并利用非小细胞肺癌的细胞证明GOLPH3基因沉默能够显著提高细胞对放疗的敏感性，为包括非小细胞肺癌在内的癌症的放疗增敏提供了一种新方法。在临床治疗中，可以注射高滴度含有本发明shGOL-1和shGOL-2的shRNA序列的慢病毒或腺病毒于瘤体内，待病毒感染后给予放疗，实现肿瘤细胞放疗敏感性的提高。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 中国科学院合肥物质科学研究院

<120> 靶向干扰GOLPH3基因表达在提高非小细胞肺癌放疗敏感性中的应用

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 298

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Thr Ser Leu Thr Gln Arg Ser Ser Gly Leu Val Gln Arg Arg Thr

1 5 10 15

Glu Ala Ser Arg Asn Ala Ala Asp Lys Glu Arg Ala Ala Gly Gly Gly

20 25 30

Ala Gly Ser Ser Glu Asp Asp Ala Gln Ser Arg Arg Asp Glu Gln Asp

35 40 45

Asp Asp Asp Lys Gly Asp Ser Lys Glu Thr Arg Leu Thr Leu Met Glu

50 55 60

Glu Val Leu Leu Leu Gly Leu Lys Asp Arg Glu Gly Tyr Thr Ser Phe

65 70 75 80

Trp Asn Asp Cys Ile Ser Ser Gly Leu Arg Gly Cys Met Leu Ile Glu

85 90 95

Leu Ala Leu Arg Gly Arg Leu Gln Leu Glu Ala Cys Gly Met Arg Arg

100 105 110

Lys Ser Leu Leu Thr Arg Lys Val Ile Cys Lys Ser Asp Ala Pro Thr

115 120 125

Gly Asp Val Leu Leu Asp Glu Ala Leu Lys His Val Lys Glu Thr Gln

130 135 140

Pro Pro Glu Thr Val Gln Asn Trp Ile Glu Leu Leu Ser Gly Glu Thr

145 150 155 160

Trp Asn Pro Leu Lys Leu His Tyr Gln Leu Arg Asn Val Arg Glu Arg

165 170 175

Leu Ala Lys Asn Leu Val Glu Lys Gly Val Leu Thr Thr Glu Lys Gln

180 185 190

Asn Phe Leu Leu Phe Asp Met Thr Thr His Pro Leu Thr Asn Asn Asn

195 200 205

Ile Lys Gln Arg Leu Ile Lys Lys Val Gln Glu Ala Val Leu Asp Lys

210 215 220

Trp Val Asn Asp Pro His Arg Met Asp Arg Arg Leu Leu Ala Leu Ile

225 230 235 240

Tyr Leu Ala His Ala Ser Asp Val Leu Glu Asn Ala Phe Ala Pro Leu

245 250 255

Leu Asp Glu Gln Tyr Asp Leu Ala Thr Lys Arg Val Arg Gln Leu Leu

260 265 270

Asp Leu Asp Pro Glu Val Glu Cys Leu Lys Ala Asn Thr Asn Glu Val

275 280 285

Leu Trp Ala Val Val Ala Ala Phe Thr Lys

290 295

<210> 2

<211> 2678

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atattggaaa ggcgccgccg ccgcctccgc cttggagctc ggggtgtttc ggggactgcg 60

gccacaggca ggaaggcgct cctctcctgc cccgccgacg cccggccagc ccgcttcgcc 120

ctgacctgtt tcctcatgac tgcccccggc cctgctgccg acggacgtcg ccccggcgtc 180

cggatttaac acggaaaccc ggatcggagg ccgcgcgggg aggaggaggg cgacccggtc 240

ggtcctgcga ccctctcggc ccggctcggc gcctcggcgg gagccatgac ctcgctgacc 300

cagcgcagct ccggcctggt gcagcggcgc accgaggcct cccgcaacgc cgccgacaag 360

gagcgggcgg cgggcggcgg cgccggcagc agcgaggacg acgcgcagag ccgccgcgac 420

gagcaggacg acgacgacaa gggcgactcc aaggaaacgc ggctgaccct gatggaggaa 480

gtgctcctgc tgggcctcaa ggaccgcgag ggttacacat cattttggaa tgactgtata 540

tcatctggat tacgtggctg tatgttaatt gaattagcat tgagaggaag gttacaacta 600

gaggcttgtg gaatgagacg taaaagtcta ttaacaagaa aggtaatctg taagtcagat 660

gctccaacag gggatgttct tcttgatgaa gctctgaagc atgttaagga aactcagcct 720

ccagaaacgg tccagaactg gattgaatta cttagtggtg agacatggaa tccattaaaa 780

ttgcattatc agttaagaaa tgtacgggaa cgattagcta aaaacctggt ggaaaagggt 840

gtattgacaa cagagaaaca gaacttccta ctttttgaca tgacaacaca tcccctcacc 900

aataacaaca ttaagcagcg cctcatcaag aaagtacagg aagccgttct tgacaaatgg 960

gtgaatgacc ctcaccgcat ggacaggcgc ttgctggccc tcatttacct ggctcatgcc 1020

tcggacgtcc tggagaatgc ttttgctcct cttctggacg agcagtatga tttggctacc 1080

aagagagtgc ggcagcttct cgacttagac cctgaagtgg aatgtctgaa ggccaacacc 1140

aatgaggttc tgtgggcggt ggtggcggcg ttcaccaagt aactctgctc ggggtgaacc 1200

attctccttt ctctcaagta aaccagtagt ttttcttctg ttgacttctg gttttctgta 1260

atttgtactt tcccacacta taattggctt ctgttttaca aaatggtggg tggctttttc 1320

ttttttgtac gtgtacagga ttctgctggt acgagaggcc ttcctctttc tgtttttaaa 1380

aaaagtttta ctgccatatt ggcattccat tccctgttgc catcctcact gttacctgtt 1440

ttgggtttct ggtctacttt gactttcaaa gtacctccag cctcctcata cgcacagctt 1500

ttggatgacc tcagcttgag tttctccata tgtgcatgta catctagcat tctgcctaca 1560

gttcagacag aagtcacaaa aaggccttca actcaccaaa ggtaaatatc tgtatctatt 1620

aggacatttt ttacatagac ttcagttgag atgtatactt agcaaaatta tttttaaatt 1680

gaaacagcac agtaaatact taatataaaa tgtcccttgg attttgcttc ccatgtaaat 1740

ctattgtatt attacacttg ttataatttt aactataaag gtccaattgt ttcacagagc 1800

cagtttggga tgggctgcat tccatttatg ctgtatatag tttgaattat atataaatta 1860

ccccttcttc tggccacccc tgctcccatc ttagtatttt gcaagatcta atcagttgta 1920

cacctggtgc ccctcgcttg cttcaatcat ggttatttga tggcaaaatc gacctcttgt 1980

cgctgaagga gagagaaaag atgtgtgtct gattggtcct gggatttttt gagctgtgcc 2040

atttatggta ctctttgcct atgcatcccc ttgttagatt ttttttaaat tttatcttac 2100

tgtttttata atttctattg ggaagaggct tgtgaccagt accaatcttg agtttctttt 2160

tctgtccaca agtaaattaa tatctgctct gaaatgtcat ttatctactc acacattctt 2220

ggggaaaaaa atcaaatgtc agtcctagca gatgttgcat gtaaattggt agcaagtaat 2280

gattacaacc cagaggatta agaattttgt aacagaaagc tctatgtttt aattttttat 2340

atacaattag gataattagc attgtcagac tataaacctt tgctttttaa agtttatttt 2400

tactatttct ttatcacttt attgtatcat caccattggt ttcataatgt aaatactata 2460

tgttgaacaa attaaatgtc aaaatttttt attaccatag tccatgttaa tagtggggct 2520

ttcaggtgtt tagagatttt ttttgttgtt gttaacattc attgcaaaag tactagatgg 2580

tgtataactc tagagttgaa ttttaaggga ttccctaata tgtatactat ctttttatct 2640

gaagtaataa ataaacaatg atcttgaaag tgcctgaa 2678

<210> 3

<211> 53

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gcatgttaag gaaactcagc cctcgagggc tgagtttcct taacatgctt ttt 53

<210> 4

<211> 53

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

aaaaagcatg ttaaggaaac tcagccctcg agggctgagt ttccttaaca tgc 53

<210> 5

<211> 53

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gcagcgcctc atcaagaaag tctcgagact ttcttgatga ggcgctgctt ttt 53

<210> 6

<211> 53

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

aaaaagcagc gcctcatcaa gaaagtctcg agactttctt gatgaggcgc tgc 53

<210> 7

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ttctccgaac gtgtcacgtc tcgagacgtg acacgttcgg agaattttt 49

<210> 8

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

aaaaattctc cgaacgtgtc acgtctcgag acgtgacacg ttcggagaa 49

Claims

1.GOLPH3基因的表达抑制剂在制备提高非小细胞肺癌细胞辐射敏感性的药物中的应用，其特征在于，所述GOLPH3基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述GOLPH3基因表达抑制剂为抑制GOLPH3基因表达的RNA。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述RNA为shRNA，所述shRNA包括shGOL-1和/或shGOL-2：

shGOL-1：

正义链1：5'-GCATGTTAAGGAAACTCAGCCCTCGAGGGCTGAGTTTCCTTAACATGCTTTTT-3'；

反义链1：5'-AAAAAGCATGTTAAGGAAACTCAGCCCTCGAGGGCTGAGTTTCCTTAACATGC-3'；

shGOL-2：

正义链2：5'-GCAGCGCCTCATCAAGAAAGTCTCGAGACTTTCTTGATGAGGCGCTGCTTTTT-3'；

反义链2：5'-AAAAAGCAGCGCCTCATCAAGAAAGTCTCGAGACTTTCTTGATGAGGCGCTGC-3'。

4.包含shRNA编码基因的载体或包含shRNA编码基因或所述载体的宿主细胞在制备提高非小细胞肺癌细胞辐射敏感性的药物中的应用，

所述shRNA包括shGOL-1和/或shGOL-2：

shGOL-1：

正义链1：5'-GCATGTTAAGGAAACTCAGCCCTCGAGGGCTGAGTTTCCTTAACATGCTTTTT-3'；

反义链1：5'-AAAAAGCATGTTAAGGAAACTCAGCCCTCGAGGGCTGAGTTTCCTTAACATGC-3'；

shGOL-2：

正义链2：5'-GCAGCGCCTCATCAAGAAAGTCTCGAGACTTTCTTGATGAGGCGCTGCTTTTT-3'；

反义链2：5'-AAAAAGCAGCGCCTCATCAAGAAAGTCTCGAGACTTTCTTGATGAGGCGCTGC-3'。

5.包含shRNA编码基因的病毒在制备提高非小细胞肺癌细胞辐射敏感性的药物中的应用，所述shRNA包括shGOL-1和/或shGOL-2：

shGOL-1：

正义链1：5'-GCATGTTAAGGAAACTCAGCCCTCGAGGGCTGAGTTTCCTTAACATGCTTTTT-3'；

反义链1：5'-AAAAAGCATGTTAAGGAAACTCAGCCCTCGAGGGCTGAGTTTCCTTAACATGC-3'；

shGOL-2：

正义链2：5'-GCAGCGCCTCATCAAGAAAGTCTCGAGACTTTCTTGATGAGGCGCTGCTTTTT-3'；

反义链2：5'-AAAAAGCAGCGCCTCATCAAGAAAGTCTCGAGACTTTCTTGATGAGGCGCTGC-3'。