CN104450781A - 一种过表达ciapin1蛋白的细胞系及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种过表达CIAPIN1蛋白的细胞系及其制备方法和应用；该细胞系名称为BHK-21CIAPIN1⁺，保藏编号为CCTCCC2014149，其表达CIAPIN1蛋白的量是正常BHK-21细胞的10倍；该细胞系的制备方法为将CIAPIN1的cDNA序列插入真核表达质粒pIRESneo中，再转染BHK-21细胞；经含G418培养液筛选后细胞经极限稀释法获得阳性单克隆细胞，即为永生化过表达CIAPIN1蛋白的细胞系。本发明细胞系培养狂犬病病毒可显著影响病毒增值滴度，对该病毒的高效培养及其灭活疫苗的生产意义重大，本发明细胞系在狂犬病病毒的培养中具有很好的应用前景。

Description

一种过表达CIAPIN1蛋白的细胞系及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于生物技术和细胞遗传学领域，涉及一种过表达CIAPIN1蛋白的细胞系及其制备方法和应用。 

背景技术

CIAPIN 1 (cytokine induced apoptosis inhibitor 1) 又称anamorsin，是一个新近发现与凋亡相关的分子。CIAPIN 1在人类基因定位于16号染色体长臂。由8个外显子和7个内含子组成，相对分子质量为39000。在其N端60-99氨基酸位点发现generic methyltransferase profile结构域，C端部分序列与保守的基因COG5636同源，246-277氨基酸有Cx2Cx24Cx2C锌带结构域。CIAPIN 1在小鼠基因定位于8号染色体，成熟mRNA长度为1515bp，CDS长度为929bp。 

Shibayama等2004年第一次报道了该分子为细胞因子诱导的抗凋亡分子。研究还表明CIAPIN 1是RAS信号转导通路中的一个新调节分子，Ras信号途径是与许多细胞增殖有关的信号转导通路，该通路独立于凋亡调节分子caspase家族、Bcl-2家族等。Kanakura等发现CIAPIN 1可调节造血功能，CIAPIN 1基因在小鼠胚胎期IL-3诱导红系定向干细胞分化过程中起至关重要的作用，CIAPIN 1基因敲除小鼠由于于贫血而于胚胎期死亡。新近研究在成功制备了CIAPIN 1的单克隆抗体工作基础上，发现CIAPIN 1广泛分布于胎儿和成人的正常组织中，特别是在分化型组织和活性代谢组织中具有高表达。Hao等确定了CIAPIN 1的亚细胞定位为胞质、胞核，浓集于核仁。Li等通过腺病毒载体表达CIAPIN 1蛋白，以及通过SiRNA等技术证明了，CIAPIN 1蛋白的表达变化与肝细胞癌、胃癌密切相关。Hao等研究发现CIAPIN 1蛋白与肾癌、胃癌相关。Wang等人发现，肺癌组织中CIAPIN 1基因表达下调可能与肺癌发生密切相关，CIAPIN 1基因可能通过下调CyclinD 1、上调P27干预了细胞周期，从而抑制肿瘤的生长。上述研究结果揭示，CIAPIN 1对细胞的增殖及分化具有重要的调控作用，在某些癌症发生时表达异常，提示CIAPIN 1基因的表达与肿瘤的发生发展有密切联系。 

目前，关于CIAPIN1研究的报道还非常有限，主要集中在肿瘤相关性方面，然而这些结果业已证明CIAPIN 1对细胞的增殖及分化具有重要的调控作用，在细胞凋亡与抗凋亡中发挥重要作用。在前期的研究中，我们也发现狂犬病病毒（Rabies virus，RV）感染N2a细胞时可引起CIAPIN1蛋白上调表达，并且细胞适应性好的RV毒株感染时诱导的CIAPIN1蛋白上调表达量更高。这提示我们，不同细胞适应性的RV毒株，感染细胞时在细胞内增殖和代谢的速度不同，因而引起了不同的应答结果，导致CIAPIN1等蛋白的差异表达，这说明RV感染时CIAPIN1发挥着关键的调节作用。 

发明内容

本发明的目的在于提供一种过表达CIAPIN1蛋白的细胞系。 

本发明的另一目的在于提供一种过表达CIAPIN1蛋白的细胞系的制备方法。 

本发明的再一目的在于提供一种过表达CIAPIN1蛋白的细胞系的应用。 

本发明所采取的技术方案是： 

一种过表达CIAPIN1蛋白细胞系的制备方法，包括以下步骤：

1）构建重组真核表达质粒：RT-PCR扩增CIAPIN1蛋白的cDNA 序列，并将其插入真核表达质粒pIRESneo中，获得重组真核表达质粒pIRES-CI；

2）转染：将上述重组真核表达质粒转染BHK-21细胞；

3）筛选：将转染后的细胞以含G418 的培养液进筛选培养；

4）获得永生化过表达CIAPIN1蛋白的细胞系：将经筛选培养的细胞经极限稀释法获得阳性单克隆细胞，其中能过表达CIAPIN1蛋白的即为永生化过表达CIAPIN1蛋白的细胞系。

进一步的，步骤1）中编码CIAPIN1蛋白的cDNA 序列如SEQ ID NO：1 所示。 

进一步的，上述CIAPIN1蛋白cDNA的RT-PCR扩增引物为： 

CIAPIN1-F: GATATCATGGAGGAGTTTGGGATCTCC （SEQ ID NO：2）；

CIAPIN1-R: GAATTCCTAGGCATCCTGGAGATTGCTAT（SEQ ID NO：3）。

进一步的，步骤2）中的转染为：用FuGENE转染试剂介导重组真核表达质粒pIRES-CI传染汇合度为70-80%的单层BHK-21细胞，转染后的细胞用含5~10%(v/v)小牛血清的DMEM培养基进行培养。 

进一步的，步骤3）中G418的浓度为500μg/ml。 

一种过表达CIAPIN1蛋白的细胞系，其名称为BHK-21 CIAPIN1⁺，已保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏编号为CCTCC C2014149。 

进一步的，上述细胞系表达CIAPIN1蛋白的量是BHK-21细胞的8倍。 

本发明的有益效果是： 

1）本发明的细胞系可永久化的高量表达CIAPIN1蛋白，且易培养，增殖速度快，可无限扩大，性质稳定，易保存，方法技术成熟，重复性强，一般研究人员即可完成，具有遗传稳定性。

2）本发明过表达CIAPIN1蛋白的细胞系及其制备方法具有深远的研究性和广泛的应用性，包括研究宿主细胞免疫反应具有稳定性以及可表达所需蛋白的哺乳动物细胞的永生化，以及细胞和CIAPIN1蛋白对狂犬病病毒增殖滴度的影响。 

3）在制备过表达CIAPIN1蛋白细胞系的具体操作中，细胞摄取、整合、表达外源基因往往都是小概率事件，只有在特定的操作条件下才能提高这些小概率事件的发生；另外，外源基因整合到基因组中的概率小，而且是随机整合到基因组中的，故转染后的不同细胞表达的目的蛋白的量存在很大差异，且随着培养时间的延续，那些丢失了外源基因的细胞和很少表达目的基因的细胞会占据优势，强表达目的蛋白的细胞会越来越少；本发明方法通过优化每一步的操作，明显提高了基因重组细胞系的发生率，可获得许多高表达CIAPIN1蛋白的细胞系；并且经过筛选和验证，本发明获得一株超高表达CIAPIN1蛋白的细胞系（表达量是BHK-21细胞的8倍），其分类命名为叙利亚仓鼠肾细胞系BHK-21 CIAPIN1⁺，已于2014年7月30日保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏单位地址为中国武汉武汉大学，保藏编号为CCTCC NO:C2014149，经过多代的代培养仍具有走超高效的过表达CIAPIN1蛋白能力，且稳定性很好，是一株永久化过表达CIAPIN1蛋白的细胞系。 

附图说明

图1是G418压力筛选出的单克隆细胞株图； 

图2 Western Blot检测验证细胞系过表达CIAPIN1蛋白的情况。

具体实施方式

一种过表达CIAPIN1蛋白细胞系的制备方法，包括以下步骤： 

1）构建重组真核表达质粒：RT-PCR扩增CIAPIN1蛋白的cDNA 序列，并将其插入真核表达质粒pIRESneo中，获得重组真核表达质粒pIRES-CI；

2）转染：将上述重组真核表达质粒转染BHK-21细胞；

3）筛选：将转染后的细胞以含G418 的培养液进筛选培养；

4）获得永生化过表达CIAPIN1蛋白的细胞系：将经筛选培养的细胞经极限稀释法获得阳性单克隆细胞，其中能过表达CIAPIN1蛋白的即为永生化过表达CIAPIN1蛋白的细胞系。

优选的，步骤1）中编码CIAPIN1蛋白的cDNA 序列如SEQ ID NO：1 所示。 

优选的，CIAPIN1蛋白cDNA的RT-PCR扩增引物为： 

CIAPIN1-F: GATATCATGGAGGAGTTTGGGATCTCC （SEQ ID NO：2）；

CIAPIN1-R: GAATTCCTAGGCATCCTGGAGATTGCTAT（SEQ ID NO：3）。

优选的，步骤2）中的转染为：用FuGENE转染试剂介导重组真核表达质粒pIRES-CI传染汇合度为70-80%的单层BHK-21细胞，转染后的细胞用含5-10%（v/v）小牛血清的DMEM培养基进行恢复培养。 

优选的，步骤2）转染时的具体操作为：选用OD₂₆₀/OD₂₈₀为1.8～2.0的重组真核表达质粒pIRES-CI，先将pIRES-CI与FuGENE按质量体积比10μg：24μL混匀孵育30min后，再加入至汇合度为75%的单层BHK-21细胞中，轻晃摇匀，37℃，5% CO₂饱和湿度转染培养5~12h后，换成含5%（v/v）血清的DMEM培养基进行恢复培养40～50小时使细胞贴壁，每隔24h换一次培养基。 

优选的，步骤3）中G418的浓度为500μg/ml。 

下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。 

实施例1  重组pMD-CI克隆载体的构建和测序

1、寡核苷酸引物的设计与合成

根据GenBank中CIAPIN1核苷酸序列设计并合成克隆CIAPIN1 cDNA的引物：

CIAPIN1-F: 5’-GATATCATGGAGGAGTTTGGGATCTCC-3’（下划线部分为EcoR V酶切位点）；      

CIAPIN1-R: 5’-GAATTCCTAGGCATCCTGGAGATTGCTAT-3’（下划线部分为EcoR I酶切位点）。

2、BHK-21细胞总RNA的提取 

50ml细胞培养瓶的BHK-21细胞（乳仓鼠肾细胞，Baby Hamster Syrian Kindey）直接加1mL Trizol，室温放置5min，使其充分裂解，12 000r/min离心5min，取上清，按200μL氯仿/mL Trizol加入氯仿，振荡混匀室温放置15min，4℃ 12 000r/min离心15min，吸上清，至另一离心管中，按0.5mL异丙醇/mL Trizol加入异丙醇混匀，室温放置5～10min，4℃ 12 000r/min离心10min，弃上清，RNA沉于管底。按1mL 75%乙醇/mL Trizol加入75%乙醇，温和振荡离心管，4℃ 12 000r/min离心10min，弃上清，室温干燥后，加20μL RNase-free的水溶解，－80℃保存备用。

3、CIAPIN1基因片段全长cDNA合成 

总RNA 5μL，70℃加热10min，冰浴5min，加200U 反转录酶M-MLV，25pmol/μL引物F、25pmol/μL 引物R以及10mmol/L dNTPs各1μL，42℃反应60min，即得到cDNA。70℃水浴10min，灭活反转录酶。 取反转录产物10μL，10×PCR buffer 4μL、25mmol/L MgCL₂4μL、引物CIAPIN1-F（25pmol/μL）、CIAPIN1-R（25pmol/μL）及10mmol/L dNTPs各0.5μL，加水30μL，煮沸变性10min，冰浴5min，加Taqplus DNA聚合酶0.25μL（5U/μL）混匀，具体反应条件为94℃变性30sec，57℃退火40sec、72℃延伸90sec，25个循环后72℃再延伸10min，以1%琼脂糖凝胶电泳分析扩增效果。

4、重组pMD-CI载体的构建和验证 

将获得的PCR产物经胶回收纯化后直接克隆至pMD18-T载体质粒。转化大肠杆菌JM109。通过氨苄青霉素抗性筛选，获得重组质粒命名为pMD-CI。经酶切和PCR初步鉴定后，阳性重组质粒送交大连宝生物工程公司进行序列测定。

实施例2  重组真核表达载体pIRES-CI的构建

1、目的片段回收

称取1g琼脂糖于100mL 1×TAE中加热溶解；冷却至40-50℃时加入终浓度（V/V）为0.1%的EB，混匀后倒胶；插入胶回收齿梳，室温冷却备用；将上样混合物（90μL CIAPIN1 cDNA的 PCR产物+10μL 10×Loading Buffer）加于上样孔中。以5V/cm的电压，电泳至所需时间后，取出凝胶，在透射紫外灯上观察，或拍照。在紫外灯下切下目的条带，反复冻融3次，碾碎，分别用酚、氯仿抽提，无水乙醇沉淀，75%乙醇洗涤，溶于适量的水中，-20℃保存备用。

2、目的片段与真核表达载体pIRESneo的连接反应 

取约20ng用限制性内切酶水解的载体，加5～10倍量的目的DNA片段、10×连接缓冲液1μL，加蒸馏水至10μL，最后加入0.1～0.2weiss单位的T₄DNA连接酶，置16℃水浴过夜，取0.5-1μL连接反应液热激转化E.coli 感受态细胞。粘端连接，载体与片段的摩尔比约为1:5； 平端连接，载体与片段的摩尔比约为1:8；PCR产物与pIRESneo载体的连接，载体与片段的摩尔比约为1:8。

3、重组真核表达载体pIRES-CI的验证 

将上述转化后的感受态细胞进行筛选培养，挑取阳性菌落扩大培养，然进行酶切、PCR和测序验证，验证正确的阳性重组质粒即为重组真核表达载体pIRES-CI。

实施例3  过表达CIAPIN1蛋白的细胞系的建立

1、FuGENE介导pIRE-CI真核表达载体转染BHK-21细胞

1）准备质粒：重组质粒pIRE-CI经苯酚/氯仿反复抽提纯化，紫外分光光度计测其OD₂₆₀/OD₂₈₀为1.8～2.0，质粒用前需过滤除菌。

2）转染细胞的准备：在37℃、5% CO₂条件下培养BHK-21细胞18-24h，待细胞汇合度为75%时，开始转染。 

3）脂质体/DNA复合物的制备：在500μL无菌Eppendorf管中配液。A液：将10μgDNA稀释于250μL无血清无双抗的MEM培养其中。B液：将24μL FuGENE稀释于250μL无双抗无血清的MEM培养基中。混合AB两液，轻微震荡，充分混匀后，室温放置30min，获得脂质体/DNA复合物，此时如果溶液浑浊，不影响转染。如果出现沉淀，则停止转染。 

4）在DNA和FuGENE作用过程中，将汇合度为75%的细胞用无血清无双抗的MEM培养基清洗三次，加入2mL无血清无双抗的MEM培养基，然后将作用完毕的DNA/FuGENE混合物，加入到细胞上清中，轻晃摇匀，37℃，5% CO₂饱和湿度培养5~12h后，换入含5%（v/v）血清的DMEM培养基。 

2、G418抗性细胞的筛选 

转染后的BHK-21细胞在37℃，5% CO₂培养36小时，再传入6孔板中（转入6孔板前，细胞在96孔板中培养），12h后，待细胞贴壁后，加入G418浓度为500μg/ml的MEM培养基继续培养，每三天换一次液，直至出现细胞克隆。

3、获得永生化过表达CIAPIN1蛋白的细胞系： 

将6孔板中每孔加入含5%血清的MEM培养基，把长出细胞克隆的6孔板，在灯光下观察，可见单个细胞克隆（如图1所示），呈明显的不透明状，用记号笔画圈标记克隆的位置，在超净工作台上用无菌枪头挑取细胞克隆，打入96孔板，进行极限稀释法，依次传入24孔板，6孔板，30mL细胞培养瓶，50mL细胞培养瓶，逐步扩大培养，扩大培养时，保持G418的浓度，血清添加量为5%（v/v）。

实施例4  过表达CIAPIN1蛋白的细胞系的RT-PCR鉴定

提取过表达CIAPIN1蛋白的细胞系总RNA，方法同实施例1，并对总RNA进行定量，选取同样模板数量RNA进行RT-PCR。RT-PCR步骤同实施例1，对扩增结果进行半定量比较，选取PCR条带结果明显高于正常对照的组别为过表达细胞系。

在实验探索过程中，参考了许多真核细胞稳定转化的方法，尤其是有关稳定转化BHK-21细胞过表达目的蛋白的实验方法，不仅获得阳性单克隆细胞的概率低，而且假阳性高，即获得正确的含目的基因的重组BHK-21细胞，但RT-PCR检测显示细胞内目的基因RNA表达量与正常的BHK-21细胞相比，并没有明显的增加，不具有后续的利用价值。 

本发明方法，在现在技术的基础上，采用特定的引物、特定的转染方法（尤其是转染时各细节的控制）、特定的G418筛选浓度等特定条件参数，才能最有利于cDNA插入宿主细胞基因组中，提高了转染率，显著促进了出现具有高表达效果重组细胞系的概率。 

实施例5  过表达单克隆细胞系的Western Blot鉴定

1、蛋白质样品的制备

弃去培养液，预冷PBS漂洗两次；空干细胞培养瓶中的所有液体，枪抽；加入RIPA细胞裂解液(华特生H10200 107细胞/mL)；4℃ 放置，间断颠倒，至细胞完全脱落；每隔5～6分钟振荡器轻柔振荡一次，共4次；10,000×g，4℃离心5分钟，取上清；分装，标记，-80 ℃ 冻存备用。

2、蛋白质样品的定量 

使用BCA蛋白质定量试剂盒对各个所筛选的细胞蛋白质样品进行定量，依照说明书进行。

3、过表达单克隆细胞系的Western Blot鉴定 

配制15%的SDS-PAGE分离胶，迅速在两玻璃板的间隙中灌注，留出灌注积层胶所需空间，并在分离胶溶液上覆盖一层0.1% SDS，待分离胶完全聚合后倾出覆盖层液体，用去离子水洗涤数次以除去未聚合的丙烯酰胺，之后用滤纸将残留液体吸净，同时将配制好的5%的积层胶灌注并立即插入干净的TefLon梳子，积层胶聚合后小心拔出梳子，用电泳缓冲液小心冲洗电泳孔道。将制备的适量体积的质粒和等体积2×上样缓冲液混合后在100℃加热5min以使混杂在质粒中的细菌蛋白质变性，用微量进样器上样，30μg样品和低分子量标准蛋白Marker；对称依次再加相同的样品，然后用1×上样缓冲液补齐后按8V/cm进行电泳，待染料前沿进入分离胶时将电压提高到15V/cm，直至染料到达分离胶底部，关闭电源，小心取出凝胶并切除积层胶，然后在中间将凝胶切开，标记后分别用考马思亮蓝和银盐进行染色。

（1）将真核过表达CIAPIN1的细胞经SDS-PAGE电泳，方法同上。 

（2）电转移 切出含待转移的凝胶，包括宽分子量预染蛋白Marker，剪6张同样大小的滤纸和1张硝酸纤维素膜，将它们浸泡于转移缓冲液中，在塑料支架上依次叠放湿润的海绵、3层滤纸、凝胶、硝酸纤维素膜、3层滤纸和海绵，使其相互对齐，且各层之间无气泡存在，将支架加紧插入电泳槽中，硝酸纤维素膜一侧接阳极，凝胶一侧接阴极，32V电压4℃转移14～16h。 

（3）封闭 电转移结束后，加封闭液浸泡硝酸纤维素膜，室温封闭2小时或4℃过夜，同时对凝胶染色，检查蛋白转移是否完全。封闭后用洗涤缓冲液漂洗硝酸纤维素膜3次，每次5min。 

（4）与一抗结合 根据上样孔位置将硝酸纤维素膜切割成条，蛋白Marker纤维素膜条置于不含吐温的洗涤液中，留存备用。其它转印阴性对照(BHK-21细胞)，然后与1:200倍稀释的CIAPIN1抗体（Santa Clusz）于室温平缓摇动反应2～4h，回收抗体，将纤维素膜浸泡于大量洗涤缓冲液中，平缓摇动洗涤3次，每次10min。 

（5）与二抗结合 以HRP标记的羊抗兔IgG为第二抗体，分别与相应纤维素膜条反应。用洗涤缓冲液1:5 000稀释酶标二抗，将膜浸泡在二抗反应液中，室温平缓摇动反应2～4小时或4℃过夜，回收二抗，洗膜，方法同（4）。 

（6）显色 TMB显色液至适当，拍照。 

Western Blot结果如图2所示，图2A为2株（1号和2号）正常BHK-21细胞以及6株（3~8号）不同的G418抗性压力筛选的BHK-21细胞系GAPDH内参蛋白Western Blot结果；图2B为Western Blot检测2株（1号和2号）正常BHK-21细胞对照以及G418抗性压力筛选出的6株（3~8号）不同细胞系中CIAPIN1蛋白的表达情况； M为蛋白质Marker，综合比较图A和B，与对照组相比（1号和2号）可知，只有3、4、5号细胞系中CIAPIN1蛋白具有较明显的过表达现象，其中5号的过表达效果最明显，通过定量分析5号的CIAPIN1蛋白表达量是对照组的8倍，该细胞系命名为BHK-21 CIAPIN1⁺，已于2014年7月30日保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏编号为CCTCC C2014149。 

从上述结果可以看出，要获得超高表达CIAPIN1蛋白的细胞系的概率是非常低的；因为①外源基因进入细胞后，部分能够通过细胞质进入细胞核内，根据细胞类型，至多80%的进入核内的外源DNA得到瞬时表达；②极少数情况下，进入细胞的外源DNA通过系列非同源性分子间重组核连接，最终整合进细胞染色体，细胞基因组自由部分表达，所以整合并不一定意味着表达，只有整合到表达区的基因才会表达，而且整合到不同的染色体区段的外源基因的表达的量也是不同的，③而且随着培养时间的延续，那些丢失了外源基因的细胞和很少表达目的基因的细胞会占据优势，强表达目的蛋白的细胞会越来越少。由于摄取、整合、表达外源基因都是小概率事件，所以获得高表达CIAPIN1蛋白的细胞系更是小概率事件，只有通过优化每一步的操作，才能促进这种小小概率事件发生。 

应用

目前，关于CIAPIN1研究的报道还非常有限，主要集中在肿瘤相关性方面，然而这些结果业已证明CIAPIN 1对细胞的增殖及分化具有重要的调控作用，在细胞凋亡与抗凋亡中发挥重要作用。在前期的研究中，我们也发现狂犬病病毒（Rabies virus，RV）感染N2a细胞时可引起CIAPIN1蛋白上调表达，并且细胞适应性好的RV毒株感染时诱导的CIAPIN1蛋白上调表达量更高。这提示我们，不同细胞适应性的RV毒株，感染细胞时在细胞内增殖和代谢的速度不同，因而引起了不同的应答结果，导致CIAPIN1等蛋白的差异表达，这说明RV感染时CIAPIN1发挥着关键的调节作用。那么过表达CIAPIN1蛋白的细胞系在狂犬病病毒的培养中具有很好的应用前景，使用本发明过表达CIAPIN1蛋白的BHK-21细胞系培养狂犬病病毒可显著影响病毒增值滴度，这可能对狂犬病病毒的高效培养及其灭活疫苗的生产意义重大。

<110>  广东省农业科学院动物卫生研究所

 

<120>  一种过表达CIAPIN1蛋白的细胞系及其制备方法和应用

 

<130> 

 

<160>  3    

 

<170>  PatentIn version 3.5

 

<210>  1

<211>  942

<212>  DNA

<213>  人

 

<400>  1

gatatcatgg aggagtttgg gatctcctct ggccagcttg tggcagtgtt ctgggacaag       60

 

tcatctcctg aggaagccct aaaaaagctg gtggctagac tgcaagagtt aactggcagc      120

 

gagggccagg tattcatgga aaacgtcacc cagctgttgc agtcttcgca taaggaatcc      180

 

agcttcgatg tcattctgtc gggtgtagtc ccaggaagca cctctctgca cagtgctgag      240

 

gttctggctg agatggcccg gatcctccgg ccagggggct gtctttttct gaaagaacca      300

 

gtggagacag ctgaagttaa caatgacaaa atgaagatgg cctctaagct atgttcagcc      360

 

ctgactcttt ctggcctcgt ggaaataaaa gagttgcaga gggaggcctt aagccctgag      420

 

gaggtacagt ccgtgcagga gcacctgggc taccacagtg acagcctgcg ctcagtccgt      480

 

gtcactggca agaagccaaa ctttgaagtg ggttcttcta gccagctaaa gcttcccaac      540

 

aagaagtctt cttcagtgaa gcctgttgtg gatcctgctg ctgccaagct ctggaccctc      600

 

tcagcaaatg acatggagga tgacagtgtg gatctcattg actcagacga gctgcttgat      660

 

ccagaggatt tgaagaggcc tgacccagcc tccctgaagg ctccttcatg tggggaaggg      720

 

aaaaagagga aggcctgtaa gaactgcacc tgtggcctcg cagaggaact ggagcgggag      780

 

cagtccaagg cgcagagctc tcagcccaag tcagcctgtg gaaattgcta cctgggtgac      840

 

gctttccgct gtgccaactg cccctacctc gggatgccag ccttcaagcc tggcgagcag      900

 

gtgctcctga gcaatagcaa tctccaggat gcctaggaat tc                         942

 

 

<210>  2

<211>  27

<212>  DNA

<213>  人工引物

 

<400>  2

gatatcatgg aggagtttgg gatctcc                                           27

 

 

<210>  3

<211>  29

<212>  DNA

<213>  人工引物

 

<400>  3

gaattcctag gcatcctgga gattgctat                                         29

Claims (8)

1.一种过表达CIAPIN1蛋白细胞系的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

1）构建重组真核表达质粒：RT-PCR扩增CIAPIN1蛋白的cDNA 序列，并将其插入真核表达质粒pIRESneo中，获得重组真核表达质粒pIRES-CI；

2）转染：将上述重组真核表达质粒转染BHK-21细胞；

3）筛选：将转染后的细胞以含G418 的培养液进筛选培养；

4）获得永生化过表达CIAPIN1蛋白的细胞系：将经筛选培养的细胞经极限稀释法获得阳性单克隆细胞，其中能过表达CIAPIN1蛋白的即为永生化过表达CIAPIN1蛋白的细胞系。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤1）中编码CIAPIN1蛋白的cDNA 序列如SEQ ID NO：1 所示。

3.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于：CIAPIN1蛋白cDNA的RT-PCR扩增引物为：

CIAPIN1-F: GATATCATGGAGGAGTTTGGGATCTCC （SEQ ID NO：2）；

CIAPIN1-R: GAATTCCTAGGCATCCTGGAGATTGCTAT（SEQ ID NO：3）。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤2）中的转染为：用FuGENE转染试剂介导重组真核表达质粒pIRES-CI传染汇合度为70-80%的单层BHK-21细胞，转染后的细胞用含5~10%(v/v)小牛血清的DMEM培养基进行培养。

5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤3）中G418的浓度为500μg/ml。

6.权利要求1所述的一种过表达CIAPIN1蛋白的细胞系，其名称为BHK-21 CIAPIN1⁺，已保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏编号为CCTCC C2014149。

7.根据权利要求6所述的一种过表达CIAPIN1蛋白的细胞系，其特征在于：该细胞系表达CIAPIN1蛋白的量是BHK-21细胞的8倍。

8.权利要求1～7任一所述的过表达CIAPIN1蛋白的细胞系在狂犬病病毒培养中的应用。