CN104434973A - 一种强化细胞因子诱导的杀伤细胞功能的方法 - Google Patents

一种强化细胞因子诱导的杀伤细胞功能的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN104434973A
CN104434973A CN201410511726.1A CN201410511726A CN104434973A CN 104434973 A CN104434973 A CN 104434973A CN 201410511726 A CN201410511726 A CN 201410511726A CN 104434973 A CN104434973 A CN 104434973A
Authority
CN
China
Prior art keywords
cell
cytokine induced
tumor
key
socs1
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201410511726.1A
Other languages
English (en)
Inventor
郑义
都会
李智龙
肖艳归
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
SHENZHEN GOLD HARVEST BIOLOGICAL PHARMACEUTICAL HUBEI Co Ltd
Original Assignee
SHENZHEN GOLD HARVEST BIOLOGICAL PHARMACEUTICAL HUBEI Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by SHENZHEN GOLD HARVEST BIOLOGICAL PHARMACEUTICAL HUBEI Co Ltd filed Critical SHENZHEN GOLD HARVEST BIOLOGICAL PHARMACEUTICAL HUBEI Co Ltd
Priority to CN201410511726.1A priority Critical patent/CN104434973A/zh
Publication of CN104434973A publication Critical patent/CN104434973A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0011—Cancer antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/14—Blood; Artificial blood
    • A61K35/17—Lymphocytes; B-cells; T-cells; Natural killer cells; Interferon-activated or cytokine-activated lymphocytes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
    • A61K35/76—Viruses; Subviral particles; Bacteriophages
    • A61K35/761—Adenovirus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/515—Animal cells
    • A61K2039/5154—Antigen presenting cells [APCs], e.g. dendritic cells or macrophages
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/545—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the dose, timing or administration schedule
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/57—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2
    • A61K2039/572—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2 cytotoxic response
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/58—Medicinal preparations containing antigens or antibodies raising an immune response against a target which is not the antigen used for immunisation
    • A61K2039/585—Medicinal preparations containing antigens or antibodies raising an immune response against a target which is not the antigen used for immunisation wherein the target is cancer

Abstract

本发明提供了一种强化细胞因子诱导的杀伤细胞功能的方法。所述方法通过生物信息学分析方法分析并获得抗原表位，并将抗原表位与Ii-Kye融合成抗原表位多肽，然后将抗原表位多肽锚定在树突状细胞表面的MHC-II分子，再用重组腺病毒rAd-RNAi-SOCS1感染树突状细胞，进一步将树突状细胞与细胞因子诱导的杀伤细胞共同培养，然后用共同培养的细胞对荷瘤小鼠进行治疗，这样处理后的树突状细胞能够激活细胞因子诱导的杀伤细胞，增强细胞因子诱导的杀伤细胞对相关肿瘤的显著特异性杀伤功能。该发明提供了一种激活细胞治疗肿瘤的方法，其核心技术对其它病毒性疾病的治疗具有借鉴意义。

Description

一种强化细胞因子诱导的杀伤细胞功能的方法
技术领域
本发明涉及免疫细胞制备的方法，尤其涉及强化细胞因子诱导的杀伤细胞功能的方法。
背景技术
癌症问题日趋严峻，癌症的预防与控制面临巨大挑战。世界卫生组织国际癌症研究中心认为，未来癌症发病人数年均将会以3%~5%的速度递增，预计2020年全球将有2000万癌症新发病例，死亡病例将达1400万。据《2012年中国肿瘤登记年报》报告，我国肿瘤发病率和死亡率的概况为：每10万人有 286人患癌，肿瘤发病率随人群年龄逐渐上升，特别是50岁以上随年龄增加而大幅上升，50岁以上占全部发病的80%以上，每年肿瘤死亡人数为140~150万。
常规的肿瘤治疗手段，即手术、放疗和化疗，对于进展性的或晚期肿瘤仍然束手无策。许多肿瘤患者最终死于肿瘤的转移和耐药。由于肿瘤变异的特性，肿瘤对常规放射和化学治疗有明显的反弹效应。例如，当细胞毒性化疗药物将大部分肿瘤细胞摧毁后，少量对这种药物有抗性的细胞仍有能力成为新的肿瘤灶。更糟的是，这种肿瘤对先前有效的治疗不再产生反应，因为肿瘤细胞在细胞毒性药物的选择压力下会产生抗性。即在正常条件下存活而被选择出来的那部分肿瘤细胞导致了肿瘤的复发、发展和转移。因为肿瘤细胞具有一种重要的遗传可塑性，所以对任何致死性压力的抗性，都可以在肿瘤细胞群体中被进化选择出来。要成功地治疗肿瘤，可能需要多种针对肿瘤细胞不同存活机制的靶向制剂。
通常有两种解决方法：攻击肿瘤细胞本身改变成攻击维持肿瘤生长和存活的环境，或者使免疫系统像对付感染那样去杀伤肿瘤细胞。前一种策略，就其本质而言是被动的，因为肿瘤细胞是被间接的途径所杀伤。例如，抗血管生长治疗阻断肿瘤的血液供应，从而间接地杀伤肿瘤。这种治疗不容易诱导产生抗性，因为肿瘤环境中的基质细胞在基因上相对稳定。然而，由于其被动型，这种治疗仍然因肿瘤细胞的演化而容易复发，例如抗血管生长治疗中，血管又会再现，可能因为营养和低氧环境导致肿瘤干细胞的产生。与此相反，一种主动的、更具吸引力的策略是，在肿瘤患者中“唤醒”主动免疫反应，使其参与抗肿瘤治疗。这种策略的主要作用是规避肿瘤的异质性，而这种异质性是肿瘤细胞对选择压力反应的结果。在这点上，免疫系统特别适合于清除少量残存的肿瘤细胞，尤其是那种放疗和化疗很难杀灭的静止期细胞或肿瘤干细胞，这有助于延长患者无瘤生存期。
目前国内外非常关注免疫细胞治疗肿瘤。从上个世纪的80年代的LAK细胞，到1989年的细胞因子诱导的杀伤细胞（cytokine-induced killers, CIKs），肿瘤侵润淋巴细胞（TILs），这些免疫细胞治疗肿瘤无疑为患者的治疗带来了福音。2010年FDA批准DC细胞疫苗治疗前列腺癌具有里程碑意义，世界各国已有200多项治疗各种不同肿瘤的DC疫苗进入临床I、II期。近年来除了DC细胞疫苗外，其他免疫细胞和DCs联合使用用于肿瘤的治疗，如DC-CIK，DC-CTL和DC-NK，其中CIK应用较为广泛，DC-CIKs或CTL较单纯的效应细胞对肿瘤的治疗效果好，主要由于DC和效应细胞CIKs和CD8+T之间的相互作用，增加了效应细胞对肿瘤的特异杀伤和效应细胞的活化。但DC细胞和效应细胞的相互作用非常复杂，不仅存在MHC-I-表位多肽复合物和T细胞受体（TCR）作用的第一信号（signal-1）和共刺激分子和其受体之间的作用的第二信号（signal-2），以及细胞因子刺激的第三信号（signal-3），如附图1。
第一信号的产生是病原体感染DC细胞或DC细胞摄取突变或转化细胞后，对抗原进行加工处理，并把抗原表位和主要组织相关性复合物（MHC）结合成MHC/抗原表位复合物，然后成熟的DCs迁徙到类淋巴组织，把抗原信息呈递给辅助性T细胞或交叉递呈给CD8+T细胞，诱导机体对病原体或转化细胞或肿瘤细胞的免疫反应。显然，抗原表位和MHC分子的结合是启动特异免疫反应的关键步骤之一。
多肽免疫治疗的吸引力在于是有效T细胞反应的最小必需原件：MHC-I和/或II表位肽，制备简单方便。但是，当用多肽疫苗观察免疫反应时，有临床疗效的少，表明其免疫原性弱。MHC相关不变链（Ii）的一部分能加强MHC-II表位电荷，导致抗原特异的CD4+Th激活。这一策略的有效性在各种不同的体外体系、动物模型和临床实验中得到了证明。Ii-key杂交技术代表一个安全有效的多肽免疫治疗策略，在临床实验中显示有疗效。
MHC-II在抗原呈递细胞合成后不久，MHC-II异二聚体形成与在内质网的不变链（Ii蛋白）组装，从高尔基复合体转运到内吞作用途径，大部分Ii被低pH液泡中的蛋白酶从MHC-II分子上除去，仅剩下称为II类相关不变链多肽（CLIP）的Ii蛋白水解片断[Cresswell P. Assembly, transport, and function of MHC class II molecules. Ann Rev Immunol 1994; 12:259–93]。CLIP作为在MHC-II表位-结合沟中的看护者，抑制构象改变[Natarajan SK, Assadi M, Sadegh-Nasseri S. Stable peptide binding to MHC class II molecule is rapid and is determined by a receptive conformation shaped by prior association with low affinity peptides. J Immunol 1999;162(7):4030–6.]。当外源多肽结合新生的MHCII复合体后，以一个协同的方式除去CLIP。人类的HLA-DM或小鼠的H2-M在CLIP的替代中起关键作用[Denzin LK, Cresswell P. HLA-DM induces CLIP dissociation from MHC class II alpha beta dimers and facilitates peptide loading. Cell 1995;82(1):155–65.]。除了替代CLIP外，DM在极短时间内和没有结合表位肽的MHC-II相互作用产生一个接受多肽的构象，在抗原呈递中选择特异多肽/MHC-II 复合体[Denzin LK, Cresswell P. HLA-DM induces CLIP dissociation from MHC class II alpha beta dimers and facilitates peptide loading. Cell 1995;82(1):155–65.]。最近的研究表明Ii片断在抗原加工、表位和MHC-II分子结合能模拟HLA-DM功能。Ii-key的特性和用它修饰多肽疫苗使其成为加强多肽疫苗的抗原性的候选分子[Chou CL, Mirshahidi S, Su KW, Kim A, Narayan K, Khoruzhenko S, et al. Short peptide sequences mimic HLA-DM functions. Mol Immunol 2008;45(7):1935–43.]。早期研究表明Ii（小鼠Ii：77-92：LRMKLPKSAKPVQMR）的一个17氨基酸多肽序列能够大大加强I-E限制的抗原多肽呈递给反应的T细胞杂交瘤[Adams S, Humphreys RE. Invariant chain peptides enhancing or inhibiting the presentation of antigenic peptides by major histocompatibility complex class II molecules. Eur J Immunol 1995;25(6):1693–702.]。序列的C末端删去后，剩余（后来称为Ii-Key）N末端的LRMKLPK多肽, 仍保留了大部分活性[Adams S, Albericio F, Alsina J, Smith ER, Humphreys RE. Biological activity and therapeutic potential of homologs of an Ii peptide which regulates antigenic peptide binding to cell surface MHC class II molecules. Arzneimittelforschung 1997;47(9):1069–77.]。Ii蛋白的这个片断能够与MHC-II分子的别构位点结合，方便以前结合的多肽释放，加强了新的多肽与MHC-II的结合[Xu M, Jackson R, Adams S, Humphreys RE. Studies on activities of invariant chain peptides on releasing or exchanging of antigenic peptides at human Leukocyte antigen-DR1. Arzneimittelforschung 1999;49(9):791–9.]。
为了强化MHC-II表位肽疫苗的能力，Ii-Key/表位杂交体通过Ii-Key核心基序LRMK通过一个简单的多聚亚甲基桥和MHC-II表位的N末端连接而成[Humphreys RE, Adams S, Koldzic G, Nedelescu B, von Hofe E, Xu M. Increasing the potency of MHC class II-presented epitopes by linkage to Ii-Key peptide. Vaccine 2000;18(24):2693–7.]。最初Ii-Key/PGCC (aa 95-104)的杂交体的体外T细胞杂交瘤的增殖研究显示Ii-Key/PGCC (aa 95-104)杂交体刺激PGCC(aa 95-104)T细胞杂交瘤较PGCC(aa 95-104) 表位肽强200-250倍[11]。接下来的研究显示来源不同相关疾病的Th细胞体内外Ii-Key杂交体疫苗的作用[Kallinteris NL, Lu X, Wu S, Hu H, Li Y, Gulfo JV, et al. Ii-Key/MHC class II epitope hybrid peptide vaccines for HIV. Vaccine 2003;21(27-30):4128–32；Kallinteris NL, Wu S, Lu X, von Hofe E, Humphreys RE, Xu M. Linkage of Ii-Key segment to gp100(46-58) epitope enhances the production of epitope-specific antibodies. Vaccine 2005;23(17-18):2336–8；Kallinteris NL, Wu S, Lu X, Humphreys RE, von Hofe E, Xu M. Enhanced CD4+T-cell response in DR4-transgenic mice to a hybrid peptide linking the Ii-Key segment of the invariant chain to the melanoma gp100(48-58) MHC class II epitope. J Immunother 2005;28(4):352–8；Xu M, Lu X, Sposato M, Zinckgraf JW, Wu S, von Hofe E. Ii-Key/HPV16 E7 hybrid peptide immunotherapy for HPV16+ cancers. Vaccine 2009;27(34):4641–7；Gillogly ME, Kallinteris NL, Xu M, Gulfo JV, Humphreys RE, Murray GL. Ii-Key/HER-2/neu MHC class-II antigenic epitope vaccine peptide for breast cancer. Cancer Immunol Immunother 2004;53(6):490–6；Voutsas IF, Gritzapis AD, Mahaira LG, Salagianni M, von Hofe E, Kallinteris NL, et al. Induction of potent CD4+ T-cell-mediated antitumor responses by a helper HER-2/neu peptide linked to the Ii-Key moiety of the invariant chain.Int J Cancer 2007; 121(9):2031–41.]。 AE37，是一个HER2表位肽和Ii-key的杂交体，即使没有GM-CSF佐剂下免疫肿瘤患者，能诱导产生CD4+T细胞和抗-HER2免疫反应[Holmes JP, Benavides LC, Gates JD, Carmichael MG, Hueman MT, Mittendorf EA, et al. Results of the first phase I clinical trial of the novel II-key hybrid preventive HER-2/neu peptide (AE37) vaccine. J Clin Oncol 2008;26(20):3426–33；Gates JD, Clifton GT, Benavides LC, Sears AK, Carmichael MG, Hueman MT, et al. Circulating regulatory T-cells (CD4+CD25+FOXP3+) decrease in breast cancer patients after vaccination with a modified MHC class II HER2/neu (AE37) peptide. Vaccine 2010;28(47):7476–82；Perez SA, Kallinteris NL, Bisias S, Tzonis PK, Georgakopoulou K, Varla-Leftherioti M, et al. Results from a phase I clinical study of the novel Ii-Key/HER-2/neu((aa776-790)) hybrid peptide vaccine in patients with prostate cancer. Clin Cancer Res 2010;16(13):3495–506.]。图2描述了Ii-Key/表位肽和MHC-II结合。表明Ii-Key/抗原表位肽能够“劫持”以前的表位肽，让与Ii-Key融合的抗原表位肽与MHC-II分子结合，无需通过DC细胞对抗原加工处理。
附图2显示效应细胞激活后产生共抑制性信号，以减弱因效应细胞过度激活对机体产生的伤害，这种抑制性受体被称为“免疫检查点（immune checkpoint）”。主要有PD-1和共抑制性受体，如CTLA-4，B和T淋巴细胞减弱因子（B and T Lymphocyte Attenuator，BTLA或CD272），Tim-3(T cell Immunoglobulin and Mucin domain-3), LAG-3(Lymphocyte Activation Gene-3)等。其中PD-1/PD-L1信号途径是最重要的途径之一，大量证据表明PD-1是一个共抑制受体，在活化的T细胞表达，负调节T细胞功能【Drew M. Pardoll. The blockade of immune checkpoints in cancer immunotherapy. NATURE REVIEWS | CANCER. 2012, 12(253): 252-264.】。例如，PD-1在抗原-激活的CD8+T细胞高水平表达和CD8+T细胞耗损（T cell exhausion）相关。被耗损的CD8+T细胞渐渐失去效应功能，包括增殖能力、表达如IL-2、TNF-α和IFN-γ等细胞因子的能力，最终导致细胞凋亡。耗损的PD-1+CD8+T细胞在肿瘤的肿瘤侵润淋巴细胞（tumor-infiltrating lymphocytes，TILs）和慢性病毒性感染得到证明【Badoua C，Hans S, Merillon N,et al. PD-1–Expressing Tumor-Infiltrating T Cells Are a Favorable Prognostic Biomarker in HPV-Associated Head and Neck Cancer. Cancer Res.2013;73(1):128-138.Pai S. Adaptive immune resistance in HPV-associated head and neck squamous cell carcinoma. OncoImmunology.2013;2:5, e24065. Sznol M and Chen L. Antagonist Antibodies to PD-1 and B7-H1 (PD-L1) in the Treatment of Advanced Human Cancer. Clin Cancer Res. 2013; 19(5): 1021–1034. Bauzon M and Hermiston T. Armed therapeutic viruses – a disruptive therapy on the horizon of cancer immunotherapy.Frontiers in Immunology.2014; 5:1-10. Lyford-Pike S, Peng S, Young G,et al. Evidence for a role of the PD-1:PD-L1 pathway in immune resistance of HPV-associated head and neck squamous cell carcinoma. Cancer Res. 2013; 73(6): 1733–1741.】。但是，PD-1的表达抑制CD8+T细胞功能的确切机制未完全理解。除了PD-1、CTLA-4免疫检查点外，免疫细胞内在一些细胞因子的作用下存在抑制因子，以免免疫反应对机体造成损害。
无论是DC疫苗还是DC-CIK在体外的培养需要一组细胞因子。细胞因子是一类调节细胞生长、分化、增殖的多肽小分子，其不能直接进入细胞内发挥作用，需通过细胞因子受体介导，经相应信号传导途径发挥其生物学效应。细胞因子信号抑制因子(Suppressor of cytokine signaling，SOCS)是信号传导通路JAK/STAT的一个负调控分子家族，为SOCS1～7和CIS(cytokine-inducible SH2 domain-containing protein)等8种起负免疫调节作用胞质分子组成的超家族，含有WD-40重复序列及SOCS盒的蛋白(WSB)，锚蛋白重复序列及SOCS盒的蛋白(ASB)，SPRY结构域及SOCS盒的蛋白(SSB)等成员【Gilboa E．DC-Bsaed cancer vaccines[J]．J Clin Invest，2007，117(5)：1195】。SOCS1定位在16p12-pl3.1，人类SOCS1基因编码211个氨基酸，鼠和人的SOCS1蛋白有95%~99%氨基酸同源【Julie P, Delphine L, Frank P,et al. The many faces of the SOCS box[J]. Cytokine & Growth Factor Reviews, 2008,19: 371-381】。其中，SOCS1通过SH2结构域与细胞因子受体胞内段Janus激酶(Janus kinases,JAK)结合，使其泛素化后降解，从而阻滞IFN-α、IFN-7、IL-2、IL-6、IL-7、IL-12和IL-15等多种因子信号，抑制DCs和其他细胞内JAK-STAT信号通路。SOCS1被认为是防止自身免疫的重要调节分子，近年发现，SOCS1在DCs中发挥了相当的作用，是抗原提呈负性调控的一种重要机制【Yandava CN,Pillari A,Drazen JM．Radiation hybrid and cyto-genetic mapping of SOCS1 and SOCS2 to chromosomes 16pl3 and 12q，respectively[J]．Genomics，1999，61：108-111；Yoshimura A，NakaT，Kubo M．SOCS proteins，cytokine signaling and immune regulation[J]．Nat Rev Immunol，2007，7(6)：454-465】。SOCS结构见图附图3（a）,3（b）和3（c），SOCS蛋白功能见附图4。
SOCS1参与DCs的发生、成熟和活化，SOCS1缺陷的DCs释放细胞因子如IL-4和IFN-γ，可抑制GM-CSF介导人CD14+单核细胞来源的DCs发生，并负调控LPS和IL-4诱导的DCs成熟【于鸿,刘玉侠,贾艳华,等. SOCS1调节树突状细胞抗肿瘤免疫的研究进展[J]. 中国免疫学杂志，2009，25（6）:571-575】。SOCS1是一个独特的抑癌基因，SOCS1异位表达抑制某些造血特异性癌基因的转化活动。研究发现【Involvement of suppressors of cytokine signaling in toll-like receptor mediated block of dendritic cell differentiation[J]．Blood，2OO6,108(13)：4102-4108】发现SOCS1缺陷转基因小鼠支持在炎症相关的肿瘤的发展中SOCS1的负性作用，这种小鼠除T、B细胞外，其它所有类型细胞SOCS1表达都被敲除，发展成慢性结肠炎和结肠癌，显示缺乏SOCS1时IFN-γ-STAT1通路持续激活诱发结肠癌。大多数人肝细胞癌中SOCS1表达常常通过SOCS1启动子CpG岛的过度甲基化而被沉默，当敲除SOCS1后能增强IL-6介导的细胞增殖【Yoshida T，Ogata H，Kanmo M，et a1．SOCS1 is a suppressor of liver fibrosis and hepatitis -induced carcinogenesis[J]．J Exp Med，2004,199(12)：17O1-1707】。研究表明【Evel-Kabler K，Song XT，Aldrich M， et a1．SOCS1 restricts dendritic cells’ ability to break self tolerance and induce antitumor immune by regulating IL-12 production and signaling [J].J Clin Invest，2006,l16(1):90-100】，SOCS1沉默导致抗原呈递DCs的IL-12信号和下游细胞因子网络不受约束，从而导致宿主水平自身耐受的打破和自身免疫性病理反应。在抗原呈递DCs中siRNA技术沉默SOCS1基因强烈加强抗原特异性抗肿瘤免疫。与对照的siRNA转染的DCs相比，SOCS1 siRNA转染的DCs对LPS或IFN-γ的应答更强。抗原(OVA)肽脉冲的SOCS1-siRNA转染的DCs比对照组DCs更强烈地激发OVA-特异性CTL【Shen L．Eve1-Kabler K．Strube R, et a1．Silencing of SOCS1 enhances antigen presentation by dendritic cells and antigen-specific anti-tumor immunity[J]．Nat Biotechnol，2004,22(12)：1546-1553】。利用各种SOCS蛋白的小分子类似物结合药物传递系统可有效治疗炎症性疾病及癌症。宋海峰等【宋海峰,周军,潘科,等. 抑制SOCS1联合OK-432刺激的DC疫苗抗肿瘤效应的初步研究[J]. 癌症, 2008，27(7)：685-691】通过设计siRNA片段能有效下调iDC中SOCS1的表达，OK-432刺激DC成熟，CD80、CD83、CD86、HLA-DR等DC表面抗原明显表达上调，而负载肝癌抗原对DC表型无明显影响。SOCS1的下调可以促进DC成熟，负载肝癌抗原的DC能有效刺激自体淋巴细胞增殖，T细胞增殖率为(110.7±22.2)％，同时产生针对HepG2细胞的特异性杀伤作用，特异性细胞毒T淋巴细胞活性为(54.0±13.2)％。而针对K562细胞和EC109细胞杀伤率仅为 (14.5±15.5)％和(10.0±30.7)％ 。结果显示RNAi下调SOCS1表达，0K-432刺激负载肝癌全细胞抗原的DC，可以产生高效而特异性的抗肝癌的免疫应答。SOCS1在DCs介导的系统性自身免疫反应中起着不可忽视的抑制作用。SOCS1缺陷DCs免疫诱导了一种超Th1型免疫应答和抗肿瘤活性。江敏等【姜敏，秦霞，胡青海，等. SOCS 1基因沉默增强DO疫苗对肺癌动物模型的治疗效果[J].现代免疫学,2007,27（4）：294-299】研究发现，荷瘤小鼠接受疫苗治疗后，虽然未沉默SOCS1的DC也有一定疗效，但沉默SOCS1可使疗效显著增强，肺肿瘤生长明显趋缓，CD8+ CTL在体外对肿瘤的特异性杀伤大幅提高，分泌Thl型细胞因子IFN-γ、TNF-α亦进一步增加。可见，SOCS1是DC功能负性调节的重要分子，沉默S0CS1可以显著增强DC提呈抗原、启动T细胞免疫的能力。于鸿等【于鸿，张健，刘玉侠. RNA干扰抑制SOCS1表达增强树突状细胞抗肿瘤作用[J]. 中国实验诊断学,2009,13(5):598-601】针对SOCS1基因，采用化学合成法合成3对SOCS1 siRNA，并转染树突状细胞。Western blot检测树突状细胞SOCS1的表达情况，结果与空白对照组相比，SOCS1沉默的树突状细胞抗肿瘤活性显著提高，可以用于临床的肿瘤治疗。此外，SOCS1的沉默导致DCs细胞表达PD-L1降低，进一步刺激与DC共培养的效应细胞CIKs的活性。
发明内容
本发明通过生物信息学方法分析肿瘤的抗原表位，然后将抗原表位和Ii-Key融合成Ii-Key-抗原表位多肽，直接将Ii-Key-抗原表位多肽添加到培养的DCs，Ii-Key-抗原表位多肽通过Ii-Key锚定在DCs表面的MHC-Ⅱ分子后，去感染重组腺病毒rAd-RNAi-SOCS1，成功感染后与CIKs共同培养，可以大大增强CIKs对肿瘤细胞（以乳腺癌细胞系MCF-7为例）的特异性杀伤作用。在实验中，以乳腺癌为模型，将乳腺癌细胞系MCF-7（高表达HER2）接种裸鼠，用本发明的方法对荷瘤小鼠进行治疗，重组腺病毒rAd-RNAi-SOCS1感染的Ii-Key-抗原表位多肽锚定的DCs强化的CIKs对肿瘤具有显著的抑制作用，大大延长了荷瘤小鼠的总体存活时间。
本发明的技术方案如下：
步骤一，通过生物信息学方法分析获得肿瘤相关抗原表位；
步骤二，将步骤一中获得的抗原表位与Ii-Key融合；
步骤三，在树突状细胞培养过程中，将步骤二中融合形成的Ii-Key-抗原表位多肽添加到树突状细胞培养液的体系中；
步骤四，用重组腺病毒rAd-RNAi-SOCS1感染步骤三种培养的树突状细胞；
步骤五，将步骤四中经过重组腺病毒rAd-RNAi-SOCS1感染的树突状细胞与细胞因子诱导的杀伤细胞共同培养；
步骤六，将步骤五中经过共同培养的树突状细胞与细胞因子诱导的杀伤细胞注射到患者体内进行治疗。
所述生物信息学方法分析肿瘤相关抗原表位的方法为，以MCF-7高表达大HER2为抗原，生物信息学分析表明其表位为GVGSPYVSRLLGICL，然后与Ii-Key融合为Ac-LRMK-GVGSPYVSRLLGICL-NH2, 命名为肿瘤高表达抗原表位肽1，即Ii-Key-抗原表位多肽，标号为GH03；
所述DCs采用患者外周血细胞经过离心分离，洗涤，获得单核细胞（英文简称为PBMCs），再通过IL-4和GM-CSF培养获得；
所述CIKs采用患者外周血或健康小鼠脾经过分离成单核细胞后经过IL-1α、IFN-γ和抗CD3单抗，以及IL-2诱导制备；
所述的Ii-Key-抗原表位肽与DCs培养的第3天，加入GCP级别的浓度为1~5μg/mL 的GH03；
所述Ii-Key-抗原表位肽在树突状细胞培养液的体系中与树突状细胞共同培养时，Ii-Key-抗原表位多肽锚定在树突状细胞表面的MHC-Ⅱ分子上；
所述重组腺病毒rAd-RNAi-SOCS1感染树突状细胞的时间是，当树突状细胞培养过程中将GCP级别的浓度为1~5μg/mL 的GH03加入到树突状细胞培养液中并与树突状细胞共同培养1天时，才用重组腺病毒rAd-RNAi-SOCS1感染，且感染数为50；
所述的DCs与CIKs共同培养，是指将CIKs加入DCs在重组腺病毒rAd-RNAi-SOCS1感染1天时间后的培养液中，并与DCs共同培养，而且加入CIKs时，DCs数量和CIKs数量的比例为，DCs：CIKs=1:50。
所述一种强化细胞因子诱导的杀伤细胞的功能后，用于治疗肿瘤时，DCs与CIKs共同培养的时间或少于5天，才可用于治疗肿瘤。治疗肿瘤的流程为第一次向患者输入细胞总数为107的经过共同培养的细胞，隔一天后再向患者输入细胞总数为107的经过共同培养的细胞，隔一天再向患者输入细胞总数为107的经过共同培养的细胞。
本发明的有益效果：
1.DCs先后经历Ii-Key、GH03和重组腺病毒rAd-RNAi-SOCS1处理后，与CIKs共同培养时，强化CIKs的扩增数量和功能；
2.经过处理的CIKs，增强了对肿瘤细胞的特异性杀伤作用；
3.对实验组中荷瘤小鼠肿瘤细胞具有明显的抑制作用，显著延长实验组荷瘤小鼠的总体存活时间；
4.本发明的肿瘤抗原表位肽没有MHC人群限制性，不需要对抗原进行加工处理。
附图说明
图1为说明DCs细胞核效应细胞相互作用的示意图；
图2. 用抗原特异的表位肽和Ii-Key融合后结合DC细胞的示意图；
图3. 显示了SOCS结构特征，其中(a)Schematic representation of the general domain architecture of CIS and SOCS1–7, color coordinated with panels (b) and (c). (b) Structure of SOCS2 in complex with Elongin b(green) and Elongin c (orange). (c) Structure of SOCS4 in complex with Elongin b and c.；
图4.显示了SOCS蛋白功能；
图5. 为本发明流式细胞仪放大40倍镜和100倍镜分析培养三天的DCs状态示意图；
图6. 为本发明荧光显微镜检测GH03能够和DCs结合的示意图；
图7. 为本发明重组腺病毒rAd-RNAi-SOCS1感染DCs后用Real-time RT-PCR分析PD-L1 mRNA 水平；
图8. 为本发明显微镜观察CIKs增殖成熟的情况示意图；
图9. 为本发明流式细胞仪分析CIK的表面分子CD3、CD4、CD8和CD56的情况；
图10. 为本发明CIKs及共培养的DCs-CIKs表型分析示意图；
图11. 为本发明用LDH释放实验分析DC-CIKs对靶细胞（TC-1）的杀伤活性示意图。
具体实施方式
为了更好地说明本发明，现结合实施例与附图作进一步说明。
本发明为一种强化细胞因子诱导的杀伤细胞功能的方法。
步骤一：生物信息学分析肿瘤抗原表位
本发明一个较优实施方式中，通过生物信息学分析方法分析肿瘤的抗原表位，而具体用的肿瘤模型为乳腺癌模型，但不局限于乳腺癌模型。生物信息学分析方法分析的乳腺癌模型中，该乳腺癌模型的细胞系为MCH-7，MCF-7的细胞中含有高表达的HER2。经过生物信息学分析，获得HER2的抗原表位为GVGSPYVSRLLGICL，将所获得的HER2的抗原表位命名为肿瘤高表达抗原表位1。
步骤二：肿瘤抗原表位与 Ii-Key 融合成 Ii-Key- 抗原表位多肽
本发明一个较优实施方式中，肿瘤抗原表位肽与Ii-Key融合成Ii-Key-抗原表位多肽的方法是，通过生物信息学分析方法获得的肿瘤高表达抗原表位1与Ii-Key融合，融合物的系列号为Ac-LRMK-GVGSPYVSRLLGICL，命名为肿瘤高表达抗原表位肽1，即Ii-Key-抗原表位多肽，标号为GH03。
步骤三：树突状细胞（英文为： dendritic cell, 简称 DCs ）的培养
1.DCs的培养
本发明一种较优的实施方式中，DCs的培养是采用患者体外周血的DCs来培养，具体如下：
(1).从患者中采取外周血80毫升；
(2).用淋巴细胞分离液将(1)中采取来的患者人体的外周血进行离心分离，通过分离，获得外周血单核细胞（英文全称为： peripheral blood mononuclear cells，英文简称为：PBMCs）；
(3).将（2）中获得的PBMCs进行细胞计数；
(4).将（3）中已经进行细胞计数的PBMCs，按照106细胞/mL铺在细胞培养瓶中进行培养；
(5).把（4）中置于细胞培养瓶中的细胞进行4个小时的培养，培养经过4个小时时开始除去细胞培养瓶内的悬浮细胞；
(6).将（5）中去除掉细胞瓶内的悬浮细胞后残留在细胞培养瓶内的细胞，用含rhuGM-CSF(20ng/ml，PeproTech)和rhuIL-4(20 ng/ml，PeproTech)的完全培养液进行培养；
(7).待（6）中培养的细胞经过2天（48小时）的培养后，弃掉培养液的上清液，并用新鲜的含rhuGM-CSF 和rhuIL-4 的培养基代替；
(8).待（7）中用新鲜的含rhuGM-CSF 和rhuIL-4 的培养基培养的细胞，当培养经历24小时时，将没有粘附的粒细胞去掉；
(9).将经过（8）残留下的细胞，也即培养了3天的DCs，用流式细胞仪分析其表型。如图5所示，从图中可观察到，DCs培养的第三天，DCs贴壁成团，部分呈半悬浮状态，其效果与TNF-α处理后的呈半悬浮状态相同。
2.DCs表型检测
本发明一种较优实施方式中，需要对培养的DCs表型进行检测，具体的DCs表型检测有两种，一是经过腺病毒rAd-RNAi-SOCS1感染和在含LPS的新鲜培养液进行刺激24小时后进行流式检测，二是经过腺病毒rAd-RNAi-SOCS1感染和在不含LPS的新鲜培养液进行刺激24小时后进行流式检测。检测时，先将细胞浓度调为2×105 /mL，每个样品中先后加入1μL的FITC标记的小鼠CD80、CD83、CD86单抗，并设立空白(同型抗体)对照，在4℃中避光反应30分钟，经洗涤后上流式细胞仪检测。流式细胞仪具体操作如下所述：
(1).DCs培养7天后，以800r/min离心速度离心7分钟，弃掉上清液；
(2).用含2%牛血清的PBS洗液1mL洗涤已经弃掉上清液的DCs，洗涤2次；
(3).先后加入标记抗体（CD80、CD83、CD86）各1μL，至DCs终浓度为5mg/L；阴性对照组中加入FITC标记羊抗鼠lgG，终浓度为5mg/L；
(4).在4 ℃避光环境中，轻度震荡30 min，用1 mLPBS 洗涤2 次，弃掉上清液；
(5).加入400 μL 1 %多聚甲醛进行固定洗涤好的DCs；
(6).将固定好DCs的4 ℃暗处保存，上机分析。
3. GH03锚定DCs及其鉴定
在本发明的一个优选实施方式中， GH03锚定DCs及其锚定结果鉴定如下描述：
(1).取步骤三中培养的DCs，在其培养至用新鲜的含rhuGM-CSF 和rhuIL-4 的培养基代替培养时，加入浓度为1μg/mL 的GH03，孵育1天时间。
(2).GH03锚定DCs的鉴定。在用新鲜的含rhuGM-CSF 和rhuIL-4 的培养基代替培养时，加入浓度为1μg/mL 的GH03的步骤中，将“浓度为1μg/mL 的GH03”换成“用荧光标记的浓度为1μg/mL 的GH03”，并且用没有标记的GH03和有荧光标记的HbsAg的表位肽R837作为对照，对这三个样品进行1天时间的孵育，然后在荧光显微镜下观察，实验结果显示，荧光标记的GH03与DCs培养后，出现荧光，说明GH03能够锚定在DCs的表面，如图6所示，而如果用MHC-II抗体先对DCs封闭，再加入荧光标记的GH03，在显微镜下没有观察到DCs带有荧光，表明GH03确实结合在DCs表面的MHC-II分子上。
步骤四：重组腺病毒 rAd-RNAi-SOCS1 和重组腺病毒 rAd-RNAi-mSOCS1 的制备、鉴定和感染 DCs
1.重组腺病毒rAd-RNAi-SOCS1和其变异体重组腺病毒rAd-RNAi-mSOCS1的制备
本发明一个较优的实施方式中，
将重组表达载体RNAi-SOCS1-pShuttle和RNAi-mSOCS1-pShuttle分别用PI-Sce I和I-Ceu I（购自BD Clontech公司）进行双酶切，回收酶切产物，用Takara ligation Mixture分别连入Adeno-X表达系统（购自BD Clontech公司）中的Adeno-X病毒DNA中，置PCR仪中16℃连接过夜。将连接产物用Swa I酶切消化（Swa I酶切位点位于PI-Sce I与I-Ceu I之间），以去除未能与Adeno-X病毒DNA连接的基因片段。再次回收酶切产物，将shRNA-SOCS1与Adeno-X病毒DNA正确连接的重组腺病毒载体命名为pAdeno-X-RNAi-SOCS1，将pshRNA-mSOCS1与Adeno-X病毒DNA正确连接的重组腺病毒载体命名为Adeno-X-RNAi-mSOCS1。
用重组腺病毒载体pAdeno-X-RNAi-SOCS1和pAdeno-X-RNAi-mSOCS1分别转化大肠杆菌DH5α，Amp抗性平板挑选阳性克隆。分别提取重组腺病毒载体pAdeno-X-RNAi-SOCS1和pAdeno-X-RNAi-mSOCS1的DNA，将所得的重组质粒分别命名为pAdeno-X-RNAi-SOCS1和pAdeno-X-RNAi-mSOCS1。对重组质粒pAdeno-X-RNAi-SOCS1和pAdeno-X-RNAi-mSOCS1进行PCR扩增、酶切鉴定，将酶切鉴定正确的重组质粒送上海博亚生物技术有限公司测序。Pac I酶切pAdeno-X-RNAi-SOCS1和pAdeno-X-RNAi-mSOCS1使之线性化。
用线性化后的重组质粒pAdeno-X-RNAi-SOCS1和pAdeno-X-RNAi-mSOCS1分别转染HEK293细胞，培养转染后的细胞至细胞出现明显的病态效应(cytopathic effect,CPE)。从293T细胞得到了重组腺病毒Ad-EGFP。随着培养的时间的延长，分泌到培养液中的腺病毒再感染新的293T细胞，但后期会出现特有的细胞病变反应（CPE）。
重组腺病毒rAd-RNAi-SOCS1和rAd-RNAi-mSOCS1的制备，具体过程如下：
(1)用PBS洗涤上述出现明显病态效应的HEK293细胞2次，直接将HEK293细胞吹打下来(不用胰酶)，1500rpm室温下离心5min；500μl PBS重悬细胞；
(2)-20℃和37℃水浴反复冻融细胞3次，每次融化后短时间混匀细胞悬液；
(3)12000rpm室温离心10min，收集含病毒的上清，加入10%甘油，过滤除菌后作为重组病毒原液置-70℃冻存备用；
(4) 培养HEK293细胞，待细胞铺满瓶底50~70%时，加入步骤(3)制备的病毒原液250μl，继续培养；
(5)观察细胞的病态效应，待50%以上的细胞从培养板底浮起时，重复上述(1)-(3)步骤制备重组腺病毒rAd-RNAi-SOCS1和rAd-RNAi-mSOCS1，-20℃存放，以备测定病毒滴度或进一步制备高滴度病毒用。
2.重组腺病毒rAd-RNAi-SOCS1和重组腺病毒rAd-RNAi-mSOCS1的鉴定
本发明的一个较优实施方式中，重组腺病毒rAd-RNAi-SOCS1和 rAd-RNAi-mSOCS1的鉴定为，用超高速离心机回收上述制备的重组腺病毒rAd-RNAi-SOCS1和重组腺病毒rAd-RNAi-mSOCS1，然后用腺病毒滴定试剂盒测定重组腺病毒的滴度。结果表明，重组腺病毒rAd-RNAi-SOCS1的滴度为2.8x107pfu/ml，重组腺病毒rAd-RNAi-mSOCS1的滴度为2.5x107pfu/ml。
3.重组腺病毒rAd-RNAi-SOCS1感染GH03锚定的DCs
(1).本发明一个较优实施方式中，用步骤四制备的且经过鉴定的重组腺病毒rAd-RNAi-SOCS1去感染DCs，当感染复数（MOI）为50时，用SOCS1的突变体重组腺病毒rAd-siD-mSOCS1收集DCs。
(2).本发明一个较优实施方式中，用步骤四制备的且经过鉴定的重组腺病毒rAd-siD-mSOCS1收集DCs后，用Real-time RT-PCR分析收集来的DCs表达的PD-L1。结果表明重组腺病毒rAd-RNAi-SOCS1感染DCs后，PD-L1的表达降低，具体如图7所示。从图中可知，DCs和CIKs共同培养体系中，DCs和CIKs相互作用诱导的PD-1和PD-L1互作减弱，有利于DCs强化CIKs的功能。
步骤五：经过重组腺病毒 rAd-RNAi-SOCS1 感染的树突状细胞与细胞因子诱导的杀伤细胞（英文名为 cytokine-induced killers ，英文简称为 CIKs ）共同培养
本发明的一个较优实施方式中，用经过重组腺病毒rAd-RNAi-SOCS1感染的树突状细胞与细胞因子诱导的杀伤细胞共同培养时，需要先制备和培养细胞因子诱导的杀伤细胞，而细胞因子诱导的杀伤细胞的培养选用健康人的外周血作为CIKS的培养基础，具体培养如下：
1.外周血单核细胞（PBMCs）的分离与培养
(1).采健康人体外周血50mL，柠檬酸钠抗凝；
(2).从健康人中采取静脉血50mL；
(3).从（1）中取经过加入柠檬酸钠抗凝的外周血50mL，置于离心管中，并缓慢加入Ficoll淋巴细胞分离液，从（2）中取静脉血，在距离分层液界面上1厘米处沿离心管内壁缓慢添加到Ficoll淋巴细胞分离液上，切勿晃动混匀，注意加入的用于稀释的静脉血液柱与Ficoll淋巴细胞分离液液柱高之比为1.5:1，且两者液柱总高不能超过试管的2/3，待离心；
(4).将经过（3）处理后离心管置于水平离心机内，在室温中以2000r/min的离心速度离心20分钟；
(5).经过20分钟离心后，缓慢取出离心管，置于水平放置的离心管架上，此时可以观察到离心管分为4层：① 上层为血浆、大部分血小板和血液稀释液；② 下层为粒细胞和红细胞；③ 中层为Ficoll淋巴细胞分离液；④ Ficoll淋巴细胞分离液与血浆交界部位的灰白色层为单个核细胞层。此时，用毛细吸管轻轻插入灰白色层中，沿离心管内壁轻轻吸出灰白色单核细胞，转移入另一只洁净无菌的离心管中；
(6).将（5）所得的灰白色单核细胞悬液用1倍体积的PBS洗涤1次。具体操作为：往盛装灰白色单核细胞的离心管中加入1倍体积的PBS，置于离心机中，以1000r/min的离心速度，离心5分钟，离心结束后去掉上层清液；
(7).继续洗涤。往去掉上层清液的（6）中离心管中加入2倍体积的PBS，观察离心管中的悬浮细胞，用手工计数板计数，计数结束，开始以1000r/min的离心速度，离心5分钟，取出离心管，去掉上层清液，获取离心管底层的淋巴细胞；
(8).用无血清（FCS）培养液培养上步(7)中获得的淋巴细胞，获得终浓度为5x106／mL的悬浮细胞。
(9).对(8)中获得的悬浮细胞用台盼蓝染液进行细胞活性检查。具体操作方式为：取2滴细胞悬液加1滴2%台盼蓝染液，5分钟后用高倍显微镜镜检，死细胞会染成蓝色，活细胞不着色，计数200个细胞，计算活细胞半分率，一般细胞活性应在95%以上。
2.CIKs的培养
本发明一个较优实施方式中，CIKs的培养为，取上述经过细胞活性检验合格的单核细胞悬浮液，以5x106／mL加到75cm3的洁净的细胞培养瓶中，并同时加入IL-1α、IFN –γ和抗鼠CD3抗体各10ul/瓶，经过24小时的培养，补加IL-2 10μL/瓶，继续培养，每2天添加与以前体积等量的培养基，第10天用CD3-PE，CD56-FITC，CD4-FITC，CD8-FITC抗体流式细胞仪检测其表面标记。
3.CIKs分离后增殖与观察
本发明一个较优实施方式中，通过显微镜观察CIKs增殖成熟的情况，观察结果如图8所示，从图示结果可知，CIKs加入刺激因子培养24~48小时，开始出现小的克隆团，72小时时达到高峰。在观察中，如果出现大量悬浮细胞克隆团，需要用滴管吹散，并补充适量的培养液。每天观察2次细胞生长情况，根据细胞克隆团生长情况和培养液颜色补充培养液，出现大量悬浮细胞克隆团时，滴管吹散，添加培养液或者培养液颜色变淡时也要添加适量的培养液。整个过程只加培养液，不进行培养液的更换，随着细胞数量的扩增，传代分瓶培养。
4.DC-CIKs共同培养
本发明一个优选实施方式中，DC-CIKs共同培养系为，按照步骤三和步骤四的DCs培养步骤，培养至用重组腺病毒rAd-RNAi-SOCS1（MOI：50）在37℃感染DCs，感染时间为24小时，随后与同期按照步骤五培养的CIKs按照DCs：CIKs为1:50的比例，将CIKs加入到DCs培养液中，组成DC-CIKs共同培养体系，在培养瓶中继续共同培养5天。
5.流式细胞学检测DCs和CIKs的表型
本发明的一个较优实施方式中，DCs和CIKs培养过程中，需要进行表型检测，采用流式细胞学检测DCs和CIKs的表型。在DCs、CIKs培养第3天到第8天这个时间段内，收集相应细胞，进行处理后，使用流式细胞仪技术检测不成熟和成熟的DCs、CIKs的表型。
(1).DCs检测
(a).在培养了3天至8天时间段内的DCs中，收集各个时间段内的DCs，每次收集到的DCs立即置于事先已作好相应收集时间标记的离心管中，加入适量的PBS进行洗涤。洗涤时按照1000r/min的离心速度，离心10分钟；
(b).然后将洗涤后的DCs收集，按照每管105个细胞分装在5测定管，每个管中按照先后顺序加入抗小鼠的单抗CD80（FITC）、CD83（FITC）、CD86（PE）。同型对照组为鼠IgG，在室温中孵育30分钟;
(c).用PBS洗涤1次，按照1000r/min的离心速度，离心10分钟，加入加入500μL PBS上流式细胞仪检测分析。利用软件分析数据, 如图9所示。
(2).CIKs检测
(a).在培养了3天至8天时间段内的CIKs中，收集各个时间段内的CIKs，每次收集到的CIKs立即置于事先已作好相应收集时间标记的离心管中，加入适量的PBS进行洗涤。洗涤时按照1000r/min的离心速度，离心10分钟；
(b).然后将洗涤后的CIKs收集，按照每管105个细胞分装在5测定管，每个管中按照先后顺序加入抗小鼠的单抗CD3（FITC）/CD4（PE）、CD3（FITC）/CD8（PE）、CD3（FITC）/CD56（PE）。同型对照组为鼠IgG，在室温中孵育30分钟;
(c).用PBS洗涤1次，按照1000r/min的离心速度，离心10分钟，加入500μL PBS上流式细胞仪检测分析。利用软件分析数据, 如图10所示。
结果表明，用一组细胞因子可以在体外培养DCs。DCs成熟后其表面标记分子CD83和CD80显著增加，而CD14则显著减少，但CD40和CD86变化不明显。
验证 .DC-CIKs 在体内和体外强化对靶细胞的杀伤作用
本发明一个较优实施方式中，为证明重组腺病毒rAd-RNAi-SOCS1感染GH03锚定的DCs能够强化CIKs对靶细胞的杀伤，实施中优选乳腺癌细胞系MCF-7为研究对象。
按照步骤三培养DCs到第3天时，加入浓度为1μg/ml的GH03，以HbsAg的R187（aa183-191）（FLLTRILTI）作为对照，加入R187多肽的浓度为1μg/mL，24小时后，用重组腺病毒rAd-RNAi-SOCS1（MOI=50），刺激DCs成熟，然后与单独培养5天的CIKs混合，混合比例为DCs:CIKs=1:50，继续培养5天，然后以不同比例的DC-CIKs和靶细胞MCF-7细胞混合培养，混合比例为30:1；50:1；和100:1；培养24小时后，用试剂盒检测乳酸脱氢酶（英文简称为LDH）的活性。
在检测过程中，需要设置培养孔中只有靶细胞没有效应细胞作为空白对照，以验证自发的LDH的活性。培养孔中加Triton X-100（1%质量百分含量）表示最大释放活性。乳酸脱氢酶活性的计算公式为：(LDHtest–LDHspont)/(LDH total –LDHspont)] x 100（Shan, B.E., J.S. Hao, Q.X.. Li, and M.Tagawa. Antitumor Activity and Immune Enhancement of Murine Interleukin-23 Expressed in Murine Colon Carcinoma Cells Cellular & Molecular Immunology. 2006；3(1), 49-57）。公式中LDHtest、LDHspont和LDH total分别代表试验孔、自发释放孔和最大释放孔。实验中设置三个复孔，具体结果如表1所示。从表1中可看出，重组腺病毒rAd-RNAi-SOCS1感染GH03锚定的DCs激活的CIKs对靶细胞MCF-7的杀伤活性最强，图11也显示同样的结果。
具体实施例 1
(1).实验鼠情况：BALB/C（null）裸鼠，周龄为3-4周，购自广东省实验动物中心，在无特殊病原体的笼子里喂养；
(2).将培养的MCF-7细胞（ATCC）用PBS洗3次后，调整细胞密度为1×107/mL，每只小鼠皮下接种200μL上述MCF-7细胞，接种8天后，用肉眼观察到已形成肿瘤。
(3).将已成瘤的小鼠随机分成PBS、DC-CIKs(NO GH03）、DC-CIKs(GH03）细胞组,每组10只小鼠，静脉注射细胞总数为2×106，隔天注射，连续2次用同样的方法再注射细胞总数为2×106，观察小鼠的肿瘤生长情况。
(4).每两天用游标卡尺测量肿瘤的长和宽，计算肿瘤的体积大小（肿瘤体积的大小按照宽2X长/2计算）。当肿瘤大小达到2500mm3时，断颈处死小鼠。小鼠的存活率结果见表1所示。
结果表明：PBS组小鼠在注射后第14天内肿瘤大小达到2500mm3；当用免疫细胞治疗后，肿瘤的生长明显减慢，表明免疫细胞能够抑制肿瘤的生长。与DC-CIKs(NO GH03）组比较，DC-CIKs(GH03）组小鼠肿瘤明显被抑制，其中有30%完全消退，这也证实了我们的猜想，与体外的DC-CIKs（GH03）对肿瘤细胞的杀伤的结果符合。这表明重组腺病毒rAd-RNAi-SOCS1感染GH03锚定的DCs，与CIKs共培养过程中的相互作用能够强化CIKs对肿瘤的杀伤功能。
表1用小鼠实验后小鼠存活时间小鼠后的存活时间情况
存活时间 DC-CIKs( GH03) DC-CIKs(NO GH03) PBS
Day28 100% 100% 0%
Day30 100% 100% 0%
Day32 100% 100% 0%
Day34 100% 100% 0%
Day36 100% 90% 0%
Day40 100% 90% 0%
Day42 100% 90% 0%
Day44 100% 80% 0%
Day46 100% 80% 0%
Day48 100% 80% 0%
Day50 100% 70% 0%
Day52 100% 70% 0%
Day54 100% 60% 0%
Day56 100% 60% 0%
Day58 100% 60% 0%
Day60 100% 50% 0%
Day62 100% 50% 0%

Claims (11)

1.一种强化细胞因子诱导的杀伤细胞功能的方法，其特征在于：
步骤一，通过生物信息学方法分析获得肿瘤抗原表位；
步骤二，将步骤一中获得的抗原表位与Ii-Key融合；
步骤三，在树突状细胞培养过程中，将步骤二中融合形成的Ii-Key-抗原表位肽添加到树突状细胞培养液的体系中；
步骤四，用重组腺病毒rAd-RNAi-SOCS1感染步骤三中培养的树突状细胞；
步骤五，将步骤四中经过重组腺病毒rAd-RNAi-SOCS1感染的树突状细胞与细胞因子诱导的杀伤细胞共同培养；
步骤六，将步骤五中共同培养的树突状细胞与细胞因子诱导的杀伤细胞注射到患者体内进行治疗。
2.如权利要求1所述的一种强化细胞因子诱导的杀伤细胞功能的方法，其特征在于：所述抗原表位来源于肿瘤细胞的抗原表位。
3.如权利要求1所述的一种强化细胞因子诱导的杀伤细胞功能的方法，其特征在于：所述Ii-Key与抗原表位融合成为Ii-Key-抗原表位多肽。
4.如权利要求1所述的一种强化细胞因子诱导的杀伤细胞功能的方法，其特征在于：步骤三中树突状细胞原材料取自患者外周血或者健康小鼠骨髓，经过粒细胞-巨噬细胞（简称GM-CSF）和白细胞介素4（简称IL-4）诱导制备。
5.如权利要求1所述的一种强化细胞因子诱导的杀伤细胞功能的方法，其特征在于：所述细胞因子诱导的杀伤细胞原材料取自患者外周血或者健康小鼠脾，用IL-1α、IFN-γ和抗CD3单抗，以及IL-2诱导制备。
6.如权利要求1所述的一种强化细胞因子诱导的杀伤细胞功能的方法，其特征在于：所述Ii-Key-抗原表位多肽在树突状细胞培养液的体系中与树突状细胞共同培养时，Ii-Key-抗原表位多肽锚定在树突状细胞表面的MHC-Ⅱ分子上。
7.如权利要求1所述的一种强化细胞因子诱导的杀伤细胞功能的方法，其特征在于：所述树突状细胞培养时，加入GCP级别的Ii-Key-抗原表位多肽，且Ii-Key-抗原表位多肽的浓度为1~5μg/mL。
8.如权利要求1所述的一种强化细胞因子诱导的杀伤细胞功能的方法，其特征在于：所述Ii-Key-抗原表位多肽与树突状细胞共同培养1天时，用重组腺病毒rAd-RNAi-SOCS1感染，感染1天，感染复数为50。
9.如权利要求1所述的一种抗原表位锚定在树突状细胞表面的MHC-Ⅱ分子上强化细胞因子诱导的杀伤细胞的制备方法，其特征在于：步骤五中树突状细胞与细胞因子诱导的杀伤细胞共同培养的比例为树突状细胞：细胞因子诱导的杀伤细胞=1:50，共同培养时间或少于5天。
10.如权利要求1所述的一种强化细胞因子诱导的杀伤细胞功能的方法，其特征在于：所述树突状细胞与细胞因子诱导的杀伤细胞培养或少于5天后用于治疗肿瘤或病毒性疾病。
11.如权利要求1和10所述任一项的一种强化细胞因子诱导的杀伤细胞功能的方法，其特征在于：所述共同培养后的树突状细胞与细胞因子诱导的杀伤细胞用于治疗肿瘤或病毒性疾病时，每隔一天注射一次，每次注射细胞量为107，共计注射三次。
CN201410511726.1A 2014-09-29 2014-09-29 一种强化细胞因子诱导的杀伤细胞功能的方法 Pending CN104434973A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201410511726.1A CN104434973A (zh) 2014-09-29 2014-09-29 一种强化细胞因子诱导的杀伤细胞功能的方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201410511726.1A CN104434973A (zh) 2014-09-29 2014-09-29 一种强化细胞因子诱导的杀伤细胞功能的方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN104434973A true CN104434973A (zh) 2015-03-25

Family

ID=52882236

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201410511726.1A Pending CN104434973A (zh) 2014-09-29 2014-09-29 一种强化细胞因子诱导的杀伤细胞功能的方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN104434973A (zh)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106047810A (zh) * 2016-05-26 2016-10-26 深圳市金佳禾生物医药有限公司 一种新型DC‑CTLs细胞培养体系及其培养方法
CN106581065A (zh) * 2016-12-22 2017-04-26 南京佰泰克生物技术有限公司 miRNA‑146a及其抑制剂在提高CIK细胞杀伤力方面的应用
CN111040038A (zh) * 2019-12-25 2020-04-21 深圳市博圣康生物科技有限公司 Ii-Key杂交多肽及其肿瘤疫苗制备方法和应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1373668A (zh) * 1999-09-14 2002-10-09 抗原表达公司 杂交肽调制免役反应
CN101591646A (zh) * 2008-05-27 2009-12-02 清华大学深圳研究生院 一种治疗人宫颈癌的树突状细胞疫苗

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1373668A (zh) * 1999-09-14 2002-10-09 抗原表达公司 杂交肽调制免役反应
CN101591646A (zh) * 2008-05-27 2009-12-02 清华大学深圳研究生院 一种治疗人宫颈癌的树突状细胞疫苗

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
NECTARIA N. SOTIRIADOU等: "Ii-Key/HER-2/neu(776–790) hybrid peptides induce more eVective immunological responses over the native peptide in lymphocyte cultures from patients with HER-2/neu+ tumors", 《CANCER IMMUNOL IMMUNOTHER》 *
尚伟主编: "《临床肿瘤生物免疫治疗》", 31 January 2006, 天津科学技术出版社 *
张晓莉等主编: "《医学免疫学实验教程》", 31 August 2010, 北京大学医学出版社 *
陈明水等: "CIK细胞的体外扩增及其抗肿瘤特性的研究", 《福建医药杂志》 *
鞠秀丽主编: "《小儿白细胞疾病》", 28 February 2009, 山东大学出版社 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106047810A (zh) * 2016-05-26 2016-10-26 深圳市金佳禾生物医药有限公司 一种新型DC‑CTLs细胞培养体系及其培养方法
CN106581065A (zh) * 2016-12-22 2017-04-26 南京佰泰克生物技术有限公司 miRNA‑146a及其抑制剂在提高CIK细胞杀伤力方面的应用
CN111040038A (zh) * 2019-12-25 2020-04-21 深圳市博圣康生物科技有限公司 Ii-Key杂交多肽及其肿瘤疫苗制备方法和应用

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Jiang et al. Oncolytic adenovirus and tumor-targeting immune modulatory therapy improve autologous cancer vaccination
CN106574244B (zh) 用细胞因子组合物扩增淋巴细胞用于主动细胞免疫治疗
JP6175103B2 (ja) 免疫反応を増加させるための方法
Mao et al. MicroRNA-23a is involved in tumor necrosis factor-α induced apoptosis in mesenchymal stem cells and myocardial infarction
CN107810267A (zh) 修饰的γδ细胞及其用途
Sili et al. Production of good manufacturing practice-grade cytotoxic T lymphocytes specific for Epstein–Barr virus, cytomegalovirus and adenovirus to prevent or treat viral infections post-allogeneic hematopoietic stem cell transplant
CN101824400B (zh) 一种放大增殖抗原特异性t细胞的方法
Hodge et al. Overexpression of microRNA-155 enhances the efficacy of dendritic cell vaccine against breast cancer
Rainone et al. Immunological characterization of whole tumour lysate-loaded dendritic cells for cancer immunotherapy
CN110305906B (zh) 一种靶向pdl1的car嵌合受体的慢病毒载体及pdl1-car-t细胞
KR101415039B1 (ko) 자기유래 활성화 림프구의 대량 증식을 위한 배지 조성물 및 배양방법
CN108289909A (zh) 用于产生工程改造的人原代血液树突细胞系的方法
WO2012112079A1 (en) IMPROVING CELLULAR IMMUNOTHERAPEUTIC VACCINES EFFICACY WITH GENE SUPPRESSION IN DENDRITIC CELLS AND T-LYMPHOCYTES USING SiRNA
CN110575537A (zh) Dc疫苗和nkg2a拮抗剂的组合物及在抗乳腺癌或肝癌中的应用
EA012520B1 (ru) Способ получения цитотоксических лимфоцитов
Romain et al. CD 34‐derived dendritic cells transfected ex vivo with HIV‐G ag m RNA induce polyfunctional T‐cell responses in nonhuman primates
CN104434973A (zh) 一种强化细胞因子诱导的杀伤细胞功能的方法
CN103002915A (zh) 抑制Treg细胞的方法和组合物
Chen et al. EBV-upregulated B7-H3 inhibits NK cell–mediated antitumor function and contributes to nasopharyngeal carcinoma progression
CN107541499A (zh) 一种靶向免疫检测点tnfr2的cik的制备及其应用
CN114814231A (zh) 维甲酸诱导基因i在癌症治疗中的应用
CN106047810A (zh) 一种新型DC‑CTLs细胞培养体系及其培养方法
CA3200061A1 (en) Antigen specific t cells and methods of making and using same
CN101780283A (zh) 信号调节蛋白α在制备预防和治疗肿瘤的DC疫苗中的应用
CN103540591B (zh) 下调锌指蛋白A20表达的siRNA及其用途

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20150325

RJ01 Rejection of invention patent application after publication