CN103540591B

CN103540591B - 下调锌指蛋白A20表达的siRNA及其用途

Info

Publication number: CN103540591B
Application number: CN201210241285.9A
Authority: CN
Inventors: 陈虎; 张晓颖; 张斌
Original assignee: Affiliated Hospital of Academy of AMMS
Current assignee: Affiliated Hospital of Academy of AMMS
Priority date: 2012-07-12
Filing date: 2012-07-12
Publication date: 2016-12-21
Anticipated expiration: 2032-07-12
Also published as: CN103540591A

Abstract

本发明涉及能够下调锌指蛋白A20的siRNA分子，以及所述siRNA分子用于下调锌指蛋白A20、促进树突状细胞成熟和用于制备治疗急性髓性白血病的药物中的用途。本发明还涉及锌指蛋白A20的表达下调或沉默后得到的树突状细胞，所述树突状细胞优选为AML肿瘤细胞诱导产生的树突状细胞（AML‑DC）；本发明还涉及所述树突状细胞用于激活CTL和/或T细胞，以及用于制备治疗急性髓性白血病的药物中的用途。本发明建立了一种增强DC疫苗抗AML免疫应答的新方法，为AML的免疫治疗开辟了一个新方向。

Description

下调锌指蛋白A20表达的siRNA及其用途

技术领域

本发明涉及小干扰RNA分子及其用途，特别是能够下调锌指蛋白A20的小干扰RNA（siRNA）分子，以及所述siRNA分子用于下调锌指蛋白A20、促进树突状细胞成熟和用于制备治疗急性髓性白血病的免疫细胞或药物的用途。

背景技术

急性髓性白血病（Acute myeloid leukemia，AML）是一类我国常见且预后很差的恶性血液病肿瘤，目前仍有大量病人对常规治疗（化疗，造血干细胞移植，生物靶向治疗等）不敏感或治疗后复发，其中白血病微小残留病灶（Minimal residual disease，MRD）是治疗复发的主要障碍^［1-2］。近年来，肿瘤的细胞免疫治疗已经成为继手术、放疗、化疗后的第四种肿瘤治疗模式，并以安全有效，副作用小等优点逐渐被广大的医务工作者和患者认可^［3］。目前认为AML病人在化疗或者造血干细胞移植治疗后，辅以特异的个体化生物免疫治疗，有利于抑制或者消除残留白血病（MRD），延缓复发，取得良好的预后^［4］。在AML细胞生物免疫治疗中，以树突状细胞（Dendritic cell，DC）递呈肿瘤抗原诱导机体特异性抗肿瘤免疫的肿瘤生物治疗已成为目前临床试验研究的热点。

树突状细胞(Dendritic cell,DC)是人体内功能最强大的抗原递呈细胞，具有摄取、加工抗原，以MHCⅠ、Ⅱ类肽结合物的形式递呈抗原并促进T、B淋巴细胞增殖的能力，在天然免疫和获得性免疫中都发挥着极其重要的作用。随着对DC摄取、递呈抗原机理的不断认识，DC培养方法的不断成熟和完善，针对肿瘤的弱免疫原性、抗原调变现象、MHC分子下调或缺失、抗原加工递呈障碍等免疫特点而设计的DC疫苗已成为该领域的热点之一。这些发展为开辟肿瘤的生物治疗新途径奠定了理论和实验基础。目前应用比较多的是DC主要来源于正常细胞，即供者正常外周血和病人治疗缓解期正常造血状态下分离的DC细胞。但是正常细胞（包括供者）来源的DC也存在诸多不足：1：来源较少，不能满足临床需要；2:制备过程中需要抗原负载步骤；3:容易引发迟发型超敏反应等问题^［5-6］。有研究者发现了AML病人本身的AML肿瘤细胞也能诱导出DC样的细胞（即AML-DC），并应用于临床，因此我们进行生物免疫治疗所采用的细胞也包括AML-DC。

AML-DC的发现：1998年奥地利学者Oehler在研究粒细胞分化过程中发现在较高纯度的乳铁蛋白存在的条件下，晚幼粒细胞的发育途径可以发生逆转，在GM-CSF、IL-4和TNF-α存在的条件下，颠倒粒细胞成熟路径可以产DC样细胞，具有DC细胞的形态和表型，甚至有抗原递呈能力^［7］。这为我们提供了利用髓性肿瘤细胞诱导分化产生DC的机会。近些年来研究的比较成功的是CML-DC和AML-DC^［8］。CML-DC成熟度较高，能有效刺激同种异体T淋巴细胞反应，并在临床中有了一定的应用^［9］。通过体内扩增AML-DC，发现其表型和功能存在缺陷，并且分化不够彻底，去除诱导剂后会发生逆转，不成熟的DC会诱导免疫耐受。但是AML-DC具有来源丰富，不需要抗原负载和安全性高等优点，因此具有潜在的应用前景^［10］。

如何能够弥补AML-DC缺陷，使之应用于临床，应用的较多的有在培养过程中加入CD40配体，SCF，Ca2+等，但是由于AML-DC存在个体差异较大，没有一种方法能够做到简单适宜通用，如何更有效的促进DC细胞的成熟，是亟待解决的技术问题^［11-13］。

A20（tumor necrosis factor,alpha-induced protein3,TNFAIP3）是一种具有锌指结构的泛素修饰酶，它有两个泛素编辑区(Two ubiquitin-editing domains)：N末端去泛素化酶保护受体相互作用蛋白（RIP）免于降解；C末端泛素化连接酶促进RIP降解（A20结构见图1）^［14］。这使得A20具有两种不同的生物学效应，即是否泛素化来调节许多关键分子的降解^［15］。近年来的研究表明A20能够通过抑制TNF和TLR（Toll-like receptor）这两条激活途径来影响NF-κB生物活性。其主要机制如下：

⑴TNF途径：A20的C末端有7个锌指结构，至少4个锌指是抑制TNF介导的NF-κB激活所需要的；同时Dixit等认为A20的N端虽然具有去泛素化活性，但与抑制NF-κB无明显相关^［16］。在TNF途径中，TNF受体相关因子2和5（TNF receptor associated factor-2/5,TRAF2/5）可以使RIP1发生多泛素化，因此招集TGF-β激活酶-1（Transforming growthfactor-beta-activated kinase1，TAK1）和TAK1结合蛋白-2（TAK1-binding protein2，TAB2)复合物，TAK1是NF-κB激活所必需，因此RIP1的多泛素化是TNF途径的关键。Dixit及其研究小组的研究指出：A20是紧密和RIP1的去泛素化和再泛素化相关联的。A20可以通过C末端连接多个泛素分子，导致RIP1被蛋白酶体识别和降解，终止了TNF所诱导的NF-κB的激活。

⑵TLR途径：Boone^［17］及其研究人员设计的体外试验中，A20缺陷性巨噬细胞显示出了适应于TLR2,TLR3和TLR9配体增高的NF-κB的活性，提示A20负调控多种TLR途径。在TLR4信号通路中TRAF6（TNF受体相关因子6，包含一个RING指域，是许多泛素E3连接酶所共有的部分）和二聚体E2（也称泛素结合酶）催化生成氨基酸63(K63)-多泛素化链，此链介导TLR途径中下一个成分的激活，这个成分可能是MARKKK，比如TAK1。A20的N末端和C末端活性在此途径中可能是相互独立的产生作用。尽管在调控TLR信号中C末端泛素连接酶活性尚未得到评价，但是Boone及其研究小组的确指出了N末端有去泛素化酶，可以去泛素化TRAF6，减弱或者终止TLR诱导的NF-κB的活化。

另外，IKKγ是抑制性κB激酶（InhibitoryκB kinase，IKK）复合物三个组成亚基之一，它将来自上游的NIK信号传递给IKKα和IKKβ，在使用TNF或应答过表达TNFR1时，A20可以通过锌指结构与IKKγ结合，影响它的信号传递，进而阻断了NF-κB的激活。另外有相关研究证实，A20在体内炎症反应和细胞凋亡方面也存在广泛的调控作用^［18］。

目前的研究结果发现，A20在DC细胞的成熟、细胞因子产生及免疫刺激方面发挥重要作用，尤其在这种抗原递呈细胞中起关键的调节作用^［19］。A20沉默表达使得DCs能更好的激活CTLs和Th细胞，并抑制Treg细胞。这也提供了一种在肿瘤免疫治疗中以一种抗体特有的方式去对抗Treg所介导的抑制作用的方法^［20］。A20负向调控DCs细胞的成熟和细胞因子的产生，A20沉默表达的DC能自发表现和提高共刺激分子和促炎性细胞因子的表达，在起始期提高T细胞的反应性，并且通过产生IL-6及TNF-α来抑制Treg细胞所介导的自身免疫抑制作用，增强肿瘤浸润CTL细胞和Th细胞的活性，通过产生IL-6和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）来抗拒Treg所介导的抑制作用。因此，通过研究鉴别A20作为一种抗原呈递的负向调控因子在抗瘤免疫反应的起始期和效应期的控制作用，同时也提供了一种能以特异性的抗体方式对抗Treg所介导的抑制作用的方法，减少了Treg直接靶细胞的需要。

综上，通过下调锌指蛋白A20的表达来促进DC细胞的成熟，进而增强AML患者的免疫应答，可以为AML的免疫治疗提供一种新的途径。

发明内容

本发明即利用RNAi技术对三种不同来源的DC细胞中的锌指蛋白A20的表达进行下调，以促进DC细胞的成熟，特别是AML-DC细胞的成熟，进而增强AML患者的免疫应答，增强对AML肿瘤细胞的杀伤能力。具体地，本发明涉及以下几方面：

本发明的第一方面涉及下调A20表达的小干扰RNA分子，其包括正义链和反义链，其特征在于所述正义链或反义链包含选自以下（1）～（5）中任一项的至少一种序列：

（1）SEQ ID NO：27～SEQ ID NO：35中的任一序列；

（2）与SEQ ID NO：27～SEQ ID NO：35中任一序列的同一性至少为70%的序列，优选至少80%，更优选至少84%，更优选至少89%，更优选至少94%，例如为95%、96%、97%、98%、99%或100%，并具有下调A20表达的能力；

（3）经过改造的选自（1）或（2）中的序列，其是在所述序列的5’方向和/或3’方向上添加有至多30个核苷酸的序列，优选至多20个，更优选至多10个，更优选至多5个，例如为4个、3个、2个或1个，并具有下调A20表达的能力；

（4）经过改造的选自（1）或（2）中的序列，其是在所述序列的基础上经一个或者几个（例如1、2、3、4、5个、1－10个）核苷酸的截短和/或替换，并具有下调A20表达的能力；

（5）与上述（1）～（4）中任一序列对应的DNA序列。

在本发明的实施方案中，所述小干扰RNA分子的正义链选自SEQ IDNO：27～SEQ IDNO：35所示的序列，反义链为与其互补的序列。

为了增加稳定性、提高转染效率，在本发明的实施方案中，所述小干扰RNA分子包含选自SEQ ID NO：1～SEQ ID NO：18所示序列中的至少一种序列，优选为选自SEQ ID NO：1～SEQ ID NO：12所示序列中的至少一种序列，例如为SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2退火形成的Si-1，SEQ IDNO：3和SEQ ID NO：4退火形成的Si-2，SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6退火形成的Si-3，SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8退火形成的Si-4，SEQID NO：9和SEQ ID NO：10退火形成的Si-5和SEQ ID NO：11和SEQ IDNO：12退火形成的Si-6；更优选为Si-1。

本发明的第二方面涉及重组载体，其可操作地连接有第一方面的小干扰RNA分子。在本发明的实施方案中，所述重组载体为连接有本发明第一方面小干扰RNA分子的Ad5/F35腺病毒载体。

本发明的第三方面涉及组合物，其含有第一方面的小干扰RNA分子或者第二方面的重组载体，以及药学上可接受的载体。

本发明的第四方面涉及重组细胞，其包含有第一方面的小干扰RNA分子以及第二方面的重组载体。

本发明的第五方面涉及第一方面的小干扰RNA分子或者第二方面的重组载体用于下调细胞中锌指蛋白A20表达的用途。

其中所述的细胞为树突状细胞前体细胞、树突状细胞或体内其它具有抗原递呈能力的免疫细胞，如巨噬细胞，B细胞或者其他非专职抗原递呈细胞。

所述树突状细胞前体细胞是指能够通过诱导分化为树突状细胞的细胞，例如为外周血单个核细胞（PBMC）或髓系单核细胞（mo）。

在本发明的实施方案中，所述树突状细胞为正常人的树突状细胞，AML缓解期正常造血状态下的树突状细胞或者AML肿瘤细胞诱导产生的树突状细胞（AML-DC）。

本发明的第六方面涉及第一方面的小干扰RNA分子或者第二方面的重组载体用于促进树突状细胞成熟的用途；在本发明的实施方案中，所述树突状细胞为正常人的树突状细胞，AML缓解期正常造血状态下的树突状细胞或者AML肿瘤细胞诱导产生的树突状细胞（AML-DC）。

本发明的第七方面涉及第一方面的小干扰RNA分子或者第二方面的重组载体用于制备治疗炎症、恶性肿瘤或白血病的药物中的用途；例如，其中所述白血病为急性髓性白血病。

本发明的第八方面涉及将锌指蛋白A20的表达下调或沉默后得到的树突状细胞；在本发明的实施方案中，所述树突状细胞为正常人的树突状细胞，AML缓解期正常造血状态下的树突状细胞或者AML肿瘤细胞诱导产生的树突状细胞（AML-DC）。

其中所述将锌指蛋白A20的表达下调或沉默的方法为，通过RNA干扰或微小RNA（microRNA，miRNA）调控的方式下调或沉默DC中锌指蛋白A20的表达；在本发明的实施方案中，所述RNA干扰的方式为将第一方面的小干扰RNA分子或第二方面的重组载体导入树突状细胞中。

本发明的第九方面涉及第八方面的树突状细胞用于激活CTL和/或T细胞的用途；在本发明的实施方案中，所述CTL和/或T细胞来自AML患者。

在本发明的实施方案中，所述激活T细胞是指T细胞的细胞因子分泌量增加，所述细胞因子例如为IL-2、IL-4、IFN-γ、TNF-α、Perforin和/或Granzyme B。所述激活CTL细胞是指DC所诱导的CTL细胞杀伤AML肿瘤细胞的能力增强，提高CTL对肿瘤细胞的杀伤效率；所述肿瘤细胞优选为来自AML患者。

本发明的第十方面涉及第八方面的树突状细胞用于制备治疗炎症、恶性肿瘤和白血病的药物中的用途。例如，其中所述白血病为急性髓性白血病。

本发明还涉及下调A20表达的siRNA分子所针对的靶序列，所述靶序列选自以下序列中的至少一种：

（1）SEQ ID NO：27～SEQ ID NO：35中的任一序列或与其互补的序列；

（2）与SEQ ID NO：27～SEQ ID NO：35中的任一序列的同一性至少为70%的序列，优选至少80%，更优选至少84%，更优选至少89%，更优选至少94%；

（3）与（1）或（2）中任一序列对应的DNA序列。

发明的有益效果

本发明研究结果表明，锌指蛋白A20在正常细胞来源的DC和AML-DC中都起到了负向调控DC的作用，利用siRNA下调或者沉默其表达，可以对DC细胞起到“修饰”的作用，抑制DC自体的免疫抑制通路，促进DC成熟，激活抗白血病特异性的杀伤性T细胞（CTL），抑制调节性T细胞（Treg）和诱导更强更持久的特异性抗AML免疫应答，杀伤体内残存的肿瘤细胞（MRD），从而建立了一种增强抗恶性肿瘤和白血病特别是AML特异性免疫应答的新方法，该方法能够降低恶性肿瘤和白血病特别是AML复发率及提高患者的生存质量，也为恶性肿瘤和白血病特别是AML的免疫治疗开辟了一个新方向。

附图说明

图1锌指蛋白A20结构示意图

图2培养成熟的DCs在显微镜下形态（显微镜倍数40×）

A:AML-M2培养成熟的DC;B:AML-M3培养成熟的DC;

C:AML-M5培养成熟的DC;D:正常细胞来源培养成熟的DC

图3 AML-DCs与正常人DCs细胞表型流式分析结果（n=4）

其中纵坐标表示带有每种表型的细胞占全部细胞的百分比。结果表明AML-DC和正常DC相比较，在各种细胞表型中均存在缺陷，其中*表示该数据结果经过统计学分析具有意义，P值<0.05。

图4 siRNA脂质体转染法转染效率的流式检测结果

图5六条siRNA干扰效果的real-time PCR（RT-PCR）结果(n=3)

图6 3种siRNA转染DCs后A20mRNA的表达（PCR的电泳结果）

M：DNA marker；1：Si-1转染的DC；2：Si-2转染的DC；3：Si-3转染的DC；4：无关siRNA转染的DC；5：空白对照组

图7 3种siRNA转染后DCs中A20蛋白的表达（Western blot）

M：marker；1：Si-1转染的DC；2：Si-2转染的DC；3：Si-3转染的DC；4：无关siRNA转染的DC；5：空白对照组

图8 TNF-α刺激后不同时间点收获的DC中A20mRNA的表达(RT-PCR)

图9 TNF-α刺激后不同时间点DC中A20mRNA的表达（PCR的电泳结果）

M：DNA marker；1：TNF-α刺激后0h；2：TNF-α刺激后6h；3：TNF-α刺激后24h；4：TNF-α刺激后48h

图10 TNF-α刺激后不同时间点DC中A20蛋白的表达（Western blot）

M：marker；1：TNF-α刺激后0h；2：TNF-α刺激后6h；3：TNF-α刺激后24h；4：TNF-α刺激后48h

图11 AML-DCs成熟的细胞表型分析（n=4）（流式细胞分析结果）

其中纵坐标表示带有每种表型的细胞占全部细胞的百分比。结果表明A20经过siRNA干扰后的AML-DC同A20正常表达的AML-DC相比较，细胞表型的表达上均有很大提高。其中*表示该数据经过统计学分析，具有统计学意义。P<0.05）。

图12尼龙毛柱纯化后T细胞表型流式检测结果

图13 T细胞活化过程中细胞因子分泌的量的柱状分析图（n=4）（流式细胞分析结果）

A20被siRNA下调表达的AML-DCs，在刺激T细胞活化过程中细胞因子分泌的量比A20正常表达的AML-DCs要多，表明A20被siRNA下调表达的AML-DCs能更好的刺激T细胞活化。其中*表示数据经过统计学分析后，具有统计学意义，P<0.05。纵坐标为细胞因子分泌的量，单位是经过流式分析后的百分比数。

图14 AML-DCs介导的特异性CTL杀伤效率（n=4）（流式细胞分析结果）

Control（空白对照）组：2±0.283，normal A20（正常A20）组：16.65±1.517，siRNA组：22.65±1.548，normal A20组与siRNA组比较P=0.0015，纵坐标为杀伤百分比。

具体实施方式

本发明中，我们采用了三种来源的DC，分别为正常供者DC，病人缓解期DC和AML-DC。前两者因为均来自于正常造血状态下的细胞，因此统称为正常细胞来源的DC。我们利用设计的小干扰RNA（Small interfering RNA，siRNA）下调A20表达后，DC的成熟度明显提高；我们将这种DC与病人的T细胞共同培养后，通过胞内染色的方法检测发现T细胞活化过程中细胞因子分泌的量有所增加；于是我们将这种DC刺激培养出来的CTL细胞和病人的AML肿瘤细胞共同孵育，通过流式的方法检测AML肿瘤细胞的死亡情况，结果发现A20下调后的DC所诱导的CTL细胞杀伤AML肿瘤细胞的能力增强，其数据结果具有统计学意义。

在本发明中，诱导RNA干扰的小干扰RNA分子在细胞或机体内被转换为实施抑制基因表达的效应siRNA分子。

siRNA分子包括正义链和反义链，适用于本发明的siRNA分子可以通过本领域常用的方法制备。可以在体外制备siRNA，然后将其直接导入细胞中（例如通过转染）。更具体地，例如可以通过化学合成、体外转录或由siRNA表达质粒或病毒载体在细胞中表达，来制备本发明的的siRNA分子。

在本发明的实施方案中，根据抑制效果，挑选出抑制效果较好的，例如为Si-1、Si-2、Si-3、Si-4、Si-5和Si-6，其分别为SEQ ID NO：1和SEQ IDNO：2退火后形成的siRNA序列，SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4退火后形成的siRNA序列，SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6退火后形成的siRNA序列，以此类推；并进一步挑选出抑制效果最好的siRNA分子，例如为Si-1。

在本发明中，术语“可操作地连接”是指将核酸与另外的核酸序列置于在功能上具有关系的状态。这可以是相互连接的基因和控制序列以这样的方式连接，使得当适当的分子被结合到控制序列时，该基因的表达变得可行。例如，如果启动子控制编码序列的转录，那么该启动子将可操作性地与该序列结合。通常，术语“可操作地连接”是指被连接的DNA序列是相邻的，并且在分泌性前导序列的情况中，是相邻的且在阅读框内。所述序列的连接是通过在适当的限制酶位点上进行连接来实施的。如果所述位点不存在，可以使用根据常规方法合成的寡聚核苷酸衔接子或接头。

在本发明中，小干扰RNA（siRNA）指包括约10-60个核苷酸（或核苷酸类似物），能够指引或介导RNA干扰的RNA（或RNA类似物）。siRNA包括双链siRNA和单链siRNA，在本发明中一般是指双链siRNA，包括正义链和反义链。

在本发明中，所述同一性是指在比较的两条序列的对应窗口中相同核苷酸所占的比例，所述窗口的大小是指15个以上核苷酸组成的窗口，优选至少17，更优选至少约18或19至21-23或24-29个核苷酸的窗口，所述同一性至少70%，是指在对应窗口中至少70%的核苷酸相同，优选至少80%，更优选至少84%，更优选至少89%，更优选至少94%，例如95%，96%，97%，98%，99%或100%。其中不同的核苷酸优选位于序列的5′和/或3′端，例如位于距5′和/或3′端1-4个核苷酸序列内。

在本发明中，当锌指蛋白A20的核苷酸序列与本发明不同时，用于下调锌指蛋白A20的诱导RNA干扰分子的序列也随着序列的不同在对应位置上做相应的改变，以达到能够下调或沉默锌指蛋白A20表达的效果。

在本发明中，所述下调或沉默锌指蛋白A20的表达，是指在DC细胞中，锌指蛋白A20的蛋白、DNA、和/或RNA水平可观察到的降低或消失，例如减少至少约50%，60%，70%，80%，90%，95%，99%或更多的表达。抑制的结果可通过检测细胞或机体的表型或生化技术而证实，所述生化技术例如为Northern杂交，基因芯片，酶联免疫吸附试验（ELISA），Western Blot，荧光激活细胞分选（FACS）或放射免疫试验（RIA）等。

在本发明中，所述促进DC成熟是指DC成熟度较前提高，更有利于抗原的提呈，具体表现为通过流式检测DC成熟的表面标记较前有提高，如CD80、CD83、CD86、HLA-DR、CD54、HCCR7等。DC的成熟度越高，对于T细胞的刺激能力就越强，在T细胞活化过程中细胞因子分泌量会更多，同时T细胞活化的过程越好，所诱导的CTL细胞杀伤肿瘤细胞的能力也会更强。

在本发明的一个实施方案中，所述促进DC成熟是指DC诱导的T细胞的细胞因子分泌量增加，同时DC所诱导的CTL细胞杀伤AML肿瘤细胞的能力增强。

在本发明中，所述DC包括正常供者DC，病人缓解期DC和AML-DC，优选为AML-DC。由于AML-DC表面递呈有来自AML患者的抗原，因此其能够更好地诱导T细胞和CTL细胞的激活，增强对AML肿瘤细胞的杀伤作用。

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

在以下实施例中，如未特别说明，均同时采用三种DC细胞，即正常人DC细胞，AML缓解期DC细胞或AML-DC细胞进行实验，实验结果相似时只列出其中一种细胞的检测结果，例如仅列出正常人DC细胞的结果。

实施例1：DC细胞培养

正常细胞来源的DC培养：正常供者或者缓解期正常造血状态下的AML病人，经过费森尤斯血细胞分离机分离白细胞层（根据病人的血小板、白细胞、红细胞压积等指标来设定循环血量及采集时间），然后利用Ficoll淋巴细胞分离液2000r/min离心20分钟,收获单个核细胞（PBMC）,37℃5%CO₂孵箱中孵育2小时,轻摇培养瓶,收集悬浮细胞，通过尼龙毛柱分选T淋巴细胞以备用；剩余贴壁细胞加入含有人GM-CSF1000U/ml,人IL-4800U/ml的DC培养基，在37℃5%CO₂孵箱中孵育4天,诱导生成未成熟DC。并通过显微镜和流式细胞仪（采用DC单抗)监测和鉴定。第6天加入人TNF-α1000U/ml刺激DC成熟后收获DC细胞，DC的流式检测及免疫组织化学染色确定其特征性免疫表型。

AML-DC培养：分离单核细胞的过程与前相同，PBMC在37℃5%CO₂孵箱中孵育6小时，然后收集悬浮细胞计数后备用；其余与正常DC细胞培养方法相同。

A20下调表达的DC制备：将培养至第6天的DC细胞，在加入TNF-α后24h后按照脂质体转染法的说明（见实施例3脂质体转染法），将siRNA转染入DC细胞，6h后换成DC培养基。第7天收获DC，此为制备好的A20下调表达的DC细胞。

图2显示的是所培养的不同类型的AML患者的DC细胞和正常人的DC细胞，能够从细胞形态中判断出DC细胞，证明DC培养是成功的。图3表示的AML-DC和正常人DC在成熟度上的区别，统计学分析结果表明AML-DC成熟度较低。DC细胞只有成熟度越高，才能更好的刺激T细胞活化，实现其免疫上的相关功能。而AML-DC的成熟度较低，因此存在免疫缺陷，需要进行siRNA干扰等方法进行修饰后，才能应用于临床实践中并发挥作用。

实施例2siRNA制备：

根据GenBank A20mRNA序列（NM006290.2），用Ambion公司的siRNA在线设计工具siRNA Target Finder，找到以AA起始，GC含量低于50%，长度在21bp的候选序列（其中3＇端的2个碱基为悬头序列，其余19个碱基为靶序列）；根据Reynolds等关于siRNA自身序列特征的研究，按照其总结的siRNA设计规则评分，选择评分在6分以上的siRNA；将得到的序列在人基因库中进行Blast同源性比对，以排除RNAi脱靶效应；用RNA Structure4.0软件预测A20RNA二级结构，根据预测的结果选取了9条靶序列，分别位于A20的羧基末端和氨基末端两个功能区域。设计合成的siRNA序列为以下SEQ ID NO：1～18所示的序列，其中3＇端的2个碱基为悬头序列，其可以增加稳定性、提高转染效率，其余序列为靶序列或靶序列的反向互补序列。

siRNA1（Si-1，位于Zif-5区）：

F：5＇-GCACCAUGUUUGAAGGAUATT-3＇（SEQ ID NO：1，去掉3＇末端两个碱基后的序列为SEQ ID NO：27）

R：5＇-UAUCCUUCAAACAUGGUGCTT-3＇（SEQ ID NO：2）退火后为：

siRNA2（Si-2，位于Zif-2区）：

F：5＇-CACUGAAUGUGCAGCACAATT-3＇（SEQ ID NO：3，去掉3＇末端两个碱基后的序列为SEQ ID NO：28）

R：5＇-UUGUGCUGCACAUUCAGUGTG-3＇（SEQ ID NO：4）退火后为：

siRNA3（Si-3，位于氨基末端）：

F：5＇-GGUAGAUGAUUACUUUGAATT-3＇（SEQ ID NO：5，去掉3＇末端两个碱基后的序列为SEQ ID NO：29）

R：5＇-UUCAAAGUAAUCAUCUACCAG-3＇（SEQ ID NO：6）退火后为：

siRNA4（Si-4，位于氨基末端）：

F：5＇-UCUGGUAGAUGAUUACUUUTT-3＇（SEQ ID NO：7，去掉3＇末端两个碱基后的序列为SEQ ID NO：30）

R：5＇-AAAGUAAUCAUCUACCAGATT-3＇（SEQ ID NO：8）退火后为：

siRNA5（Si-5，位于Zif-1区）：

F：5＇-AAUGUGAAACGCCCAACUGTT-3＇（SEQ ID NO：9，去掉3＇末端两个碱基后的序列为SEQ ID NO：31）

R：5＇-CAGUUGGGCGUUUCACAUUTT-3＇（SEQ ID NO：10）退火后为：

siRNA6（Si-6，位于Zif-4区）：

F：5＇-AAGCCGGCUGCGUGUAUUUTT-3＇（SEQ ID NO：11，去掉3＇末端两个碱基后的序列为SEQ ID NO：32）

R：5＇-AAAUACACGCAGCCGGCUUTT-3＇（SEQ ID NO：12）退火后为：

siRNA-7（Si-7，位于Zif-2区）：

F：5＇-UGUGCAGCACAACGGAUUUTT-3＇（SEQ ID NO：13，去掉3＇末端两个碱基后的序列为SEQ ID NO：33）

R：5＇-AAAUCCGUUGUGCUGCACATT-3＇（SEQ ID NO：14）

siRNA-8（Si-8，位于Zif-3区）：

F：5＇-CGGAUUUUGUGAACGUUGCTT-3＇（SEQ ID NO：15，去掉3＇末端两个碱基后的序列为SEQ ID NO：34）

R：5＇-GCAACGUUCACAAAAUCCGTT-3＇（SEQ ID NO：16）

siRNA-9（Si-9，位于Zif-6区）：

F：5＇-GCUCAGAAUCAGAGAUUUCTT-3＇（SEQ ID NO：17，去掉3＇末端两个碱基后的序列为SEQ ID NO：35）

R：5＇-GAAAUCUCUGAUUCUGAGCTT-3＇（SEQ ID NO：18）荧光标记的siRNA（FAM-siRNA）：

F：5＇-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3＇（SEQ ID NO：19）

R：5＇-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3＇（SEQ ID NO：20）阴性对照的siRNA：

F：5＇-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3＇（SEQ ID NO：21）

R：5＇-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3＇（SEQ ID NO：22）

实施例3siRNA转染效率的检测：

转染效率的高低可以通过荧光标记的siRNA（FAM-siRNA）监测。FAM-siRNA转染细胞后，可以用流式细胞仪等检测，确定是否有效转染和优化转染条件。

可以采用瞬时转染或稳定转染的方法，在本发明中采用了瞬时转染的方法。当采用稳定转染方法时，可以利用小干扰RNA序列制备AD5/F35腺病毒载体，例如质粒为pDC316，启动子为U6。

转染：

①以24孔板为例，在转染前保证细胞密度达到30%-80%，每孔中加入约500μl的无抗生素培养基。取1μl/孔的Lipofectamine2000，用50μlOpti-MEMI Reduced Serum Medium稀释。轻轻混合后在室温孵育5min。

②取2μl FAM-siRNA，用50μl Opti-MEMI Reduced Serum Medium稀释，轻轻混合均匀。稀释的Lipofectamine2000经过5min的孵育后，与稀释的FAM-siRNA轻轻混合，室温静置20min，以形成FAM-siRNA-转染试剂混合物。

③将FAM-siRNA-转染试剂的混合液加入含有细胞及培养液的孔中，每孔约400μl，轻轻摇晃孔板使其混合。在37℃5%CO₂培养箱中培养。

④转染6h后可上机检测FAM-siRNA，即检测转染效率。

⑤FAM是一种绿色的荧光基团，由蓝光激发，激发波长为480nm，发射波长为520nm，可在流式细胞仪的FITC通道检测，结果见图4。

实验结果表明转染是成功的，并且确定了转染量（2μl）。

实施例4siRNA转染后检测沉默下调锌指蛋白A20表达的效果

提取DC细胞总RNA，加入20μl DEPC水溶解。取11μl RNA按照Fermentas逆转录试剂盒的说明逆转录出cDNA，进行实时定量PCR。

PCR的反应条件是：94℃，5min，（94℃，30s；60℃，1min）×45个循环，40℃，10s降温。

PCR的反应体系是：

A20的引物设计如下：

上游：5＇-TGTGAAACGCCCAACTGC-3＇（SEQ ID NO：23）

下游：5＇-ATTCTTTTGCCGCCTCTCTG-3＇（SEQ ID NO：24）

扩增产物长度为84bp。

GAPDH的序列：

上游：5＇-GGACCTGACCTGCCGTCTAG-3＇（SEQ ID NO：25）

下游：5＇-TAGCCCAGGATGCCCTTGAG-3＇（SEQ ID NO：26）扩增产物长度为99bp。

根据Roche LightCycler2.0自带的软件分析，得出样品中A20的浓度比率，根据此浓度比率判断得出实验结果。

使用实施例2制备的9条siRNA（即Si-1～Si-9）分别转染DC，转染24h后收获细胞按照上述方法行实时定量PCR检测，判断具有沉默效果较好的六条的siRNA（即Si-1～Si-6siRNA）实验结果见图5，然后利用Westernblotting和PCR方法检测Si-1～Si-3三条siRNA，得出Si-1～Si-3三条siRNA均具有较好的干扰效果，其中Si-1的干扰效果最好，实验结果见图6和图7，接下来的实验，即实施例5-11，均选取Si-1条siRNA。

实施例5siRNA的转染

首先检测A20在TNF-α刺激后的表达时间点，分别在其刺激后0h，6h，24h和48h收获DC进行RT-PCR检测，确定A20在TNF-α刺激后出现表达增高，24h表达最高，随后出现下降；Western blotting的结果与之相同。

具体的转染步骤与实施例3中FAM-siRNA相同，只是Si-1siRNA不需要避光，在转染4-6h后必须将培养基更换为含血清的完全培养基。

据不同的细胞密度计算siRNA及转染试剂的使用量，推荐siRNA：转染试剂体积之比为1：2-1：4，浓度之比为1：1。本实验采用的体积之比是1：3，浓度之比为1：1，不足的部分使用DEPC水补齐。

分别利用实时定量PCR和Western blot检测A20的mRNA和蛋白的表达情况，结果见图8、图9和图10。可以看出A20在DCs中的表达情况，即接受TNF-α刺激后出现活化和表达增高，因此在接下来的实验中均采用在TNF-α刺激之前转染Si-1siRNA。

实施例6siRNA下调A20后DCs表型的变化：

将培养中的DCs分成空白对照组和siRNA转染组，在加入TNF-α之前进行siRNA转染，在加入TNF-α后48h后收获成熟DCs，进行流式细胞仪检测表型改变。实验结果见图11，可以看出与未转染Si-1条siRNA的DC细胞相比，在转染Si-1条siRNA下调A20后，细胞因子的表达量明显提高，表明DC细胞的成熟度明显提高。

实施例7尼龙毛柱分离纯化T细胞和T细胞培养

①称取0.6g尼龙毛，细致撕均匀，填充于玻璃注射器中，尼龙毛柱高6cm，加入PBS/生理盐水反复冲洗，最后一次以预温37℃，含有10%FBS的RPMI1640培养液洗柱。

②加入分离单个核细胞进行贴壁2-6h后上尚未贴壁的细胞液，立即堵住针尖，以细长的滴管伸入柱内近尼龙毛界面滴加0.2ml，预温37℃，含有10%FBS的1640培养基封口（因为尼龙毛柱干后会影响淋巴细胞活性），垂直放置37℃，5%CO₂培养箱中培养30min。

③取出后，用培养基20-25ml冲洗，洗下的液体2000rpm，10min离心，弃去上清。

④计数细胞，留取少量作流式细胞分析。

⑤余下的部分用培养基调整浓度1×10⁶/ml。放于37℃，5%CO₂培养箱中培养，培养基中加入低浓度的IL-2。实验结果参见图12。从图12可以看出，CD3和CD8是T细胞的代表表型，越高表明大部分T细胞被纯化了；CD19是B细胞的表型，越低表明绝大部分B细胞都存留在了尼龙毛柱里结果表明T细胞经过尼龙毛柱分离纯化后，细胞纯度很高。

⑥按照上述方法分离T细胞后，第四天半量换液同时加入IL-2（半量换液，全量补因子），以后每3天半量换液一次。

实施例9T细胞活化的细胞内因子检测：

①收集AML初治或者复发的患者骨髓或者外周血进行DCs诱导培养，方法参见实施例1，第5天时DCs进行半量换液，并加入TNF-α诱导成熟。

同一天再次收集同一患者的外周血单个核细胞，按照实施例8分离纯化T细胞，计数后在低浓度的IL-2作用下进行培养。

②DCs在加入TNF-α24h后，使用Lipofectamine2000将Si-1siRNA转染入DCs中。6h为DCs进行换液，更换为含有血清的培养基。将T细胞和DCs按照10：1比例混合摇匀，继续放入37℃，5%CO2培养箱中培养。

③24h后镜下观察CTL细胞形态。然后按照刺激剂PMA25ng/ml，离子霉素1ug/ml，阻断剂BFA20ug/ml的比例加入每孔细胞中。

④4h后收集细胞，分装在4个1.5EP管中，1500rpm，5min离心，洗去刺激剂等，加入含有2%FBS的PBS1ml再次洗涤。

⑤取流式上样管，每管加入300μl细胞悬液。每管加入CD3（10μl）和CD8（3μl）抗体，室温避光保存15min，加入2ml PBS，1500rpm，5min洗涤。

⑥加入4%多聚甲醛室温固定20min。然后加入0.5ml的破膜剂，避光15min，加入2mlPBS后，1800rpm，4min离心洗涤。

⑦4管分为A、B、C、D管，A管加入IgG2a/IgG1Isotype Control和穿孔素（perforin）的同型对照；B管加入IFN-γ/IL-4；C管加入IL-2和TNF-α；D管加入Granzyme B和HumanPenrforin。全部放在4度，避光孵育30min。

⑧加入2ml PBS，1800rpm，4min离心洗涤，弃上清加入300μl PBSA后上流式细胞仪检测。

实验结果见图13。可以看出，与对照相比，AML-DC细胞在转染siRNA下调A20后，其促进T细胞活化产生的细胞因子的量明显增加，表明A20下调后的AML-DC能更好的促进T细胞活化，实现其免疫功能。

实施例10CTL细胞培养方法：

按照实施例7方法分离纯化的T细胞用含有10%FBS的1640液调整浓度为1×10⁶/ml，按照DC：T=1：20的比例在96孔板中进行培养，即每孔加入T细胞100μl左右，按照比例加入DC细胞，放入37℃5%CO₂培养箱中孵育72h，收获CTL细胞，并调整浓度为6×10⁶/ml留作效应细胞。其中所述DC细胞分成两组，一组为转染了Si-1siRNA的DC细胞（A20下调表达的细胞），一组为未转染的DC细胞（A20正常表达的细胞）。

实施例11流式检测CTL细胞杀伤方法：

⑴靶细胞复苏：在做杀伤实验前两天将冻存的AML肿瘤细胞复苏培养，方法为用含有10%FBS的1640液常规培养。

⑵CFSE染色靶细胞:靶细胞用CFSE（即CFDA-SE，羧基荧光素乙酰乙酸琥珀酰亚胺酯）缓冲液以1000rpm，离心5min，洗涤2次；台盼兰染色后计数，用CFSE缓冲液重悬细胞，调整细胞浓度为1×10⁷/ml，将CFSE加入细胞悬液中（终浓度为5μmol/ml），轻轻吹打均匀，置于37℃5%CO₂培养箱中孵育10min；取出后加入10倍体积的冷1640完全培养基（含10%FBS），轻轻混匀，4℃放置5min；标记号的细胞以1000rpm，4℃离心5min，洗涤3次；台盼兰计数，1640培养基重悬细胞并调整细胞数为1×10⁵/ml，备用。

⑶效靶细胞共培养：以实施例10制备的CTL细胞作为效应细胞（包括未转染Si-1siRNA的正常效应细胞和已转染Si-1siRNA的A20下调的效应细胞），按照效靶比为100：1；50：1；25：1；12.5：1，加入无菌的2ml流式管中，每管中加入靶细胞（1×10⁵/ml）100μl，效应细胞按照比例增加，并以只加靶细胞（即图14中的阴性对照组）或者效应细胞的培养条件作为对照。将流式管中的效靶细胞轻轻混匀，1000rpm，室温离心3min，使其细胞紧密接触，37℃5%CO₂培养箱中孵育4h。

⑷PI工作液：收集流式管中细胞，以流式缓冲液洗涤细胞2次，重悬细胞，加入浓度为50ug/ml的PI（质量浓度为2.5ug/ml），混匀，室温避光孵育15min。

⑸流式检测：CFSE+PI阳性的细胞为死亡的靶细胞，首先根据细胞的大小和密度确定肿瘤细胞群，再分析这群细胞中CFSE细胞中PI染色阳性的细胞，再根据CFSE+PI阳性细胞在CFSE细胞中的比例，计算出杀伤比例。

实验结果见图14，可以看出与阴性对照和正常A20的细胞相比，DC细胞在转染siRNA下调A20后，其促进CTL产生的对AML肿瘤细胞的杀伤效率明显提高。

尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，本领域技术人员将会理解。根据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修改和替换，这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。

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Claims

1.小干扰RNA分子在制备治疗白血病的药物中的用途，其中所述白血病为急性髓性白血病，其中所述小干扰RNA分子的序列如SEQ ID NO:27所示。

2.将锌指蛋白A20的表达下调或沉默后得到的树突状细胞在制备治疗白血病的药物中的用途，其中所述白血病为急性髓性白血病，其中所述将锌指蛋白A20的表达下调或沉默的方法为，将序列为SEQ ID NO:27的小干扰RNA分子导入树突状细胞中。

3.权利要求2的用途，其中所述树突状细胞为正常人的树突状细胞，急性髓性白血病缓解期正常造血状态下的树突状细胞或者急性髓性白血病肿瘤细胞诱导产生的树突状细胞。