CN106581065A - miRNA‑146a及其抑制剂在提高CIK细胞杀伤力方面的应用 - Google Patents

miRNA‑146a及其抑制剂在提高CIK细胞杀伤力方面的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了miRNA‑146a及其抑制剂在提高CIK细胞杀伤力方面的应用，miRNA‑146a可以作为药物靶标提高CIK细胞对肿瘤细胞的杀伤力，所述肿瘤细胞为白血病细胞。本发明发现，miRNA‑146a下调表达的CIK细胞比miRNA‑146a正常表达的CIK细胞具有更高的杀伤力，miRNA‑146a可以作为药物靶标提高CIK细胞对肿瘤细胞的杀伤力；环状六肽Cyclo(‑Gly‑Thr‑Phe‑Leu‑Tyr‑Ala‑)为miRNA‑146a的有效抑制剂，可以作为miRNA‑146a抑制剂用于提高CIK细胞对肿瘤细胞的杀伤力，天然化合物来源比合成的核苷酸类siRNA具有更高的化学稳定性。

Description

miRNA-146a及其抑制剂在提高CIK细胞杀伤力方面的应用
技术领域
本发明属于免疫领域，涉及CIK细胞的培养，具体涉及miRNA-146a及其抑制剂在提高CIK细胞杀伤力方面的应用。
背景技术
随着肿瘤临床治疗的发展，肿瘤免疫治疗方法受到广泛关注。细胞免疫治疗为肿瘤免疫治疗的一种，目的是通过改善患者的免疫系统，达到间接治疗肿瘤的目的。常用于细胞免疫治疗的细胞包括细胞因子诱导的杀伤(CIK)细胞、树突状细胞(DC)、自然杀伤(NK)细胞等。其中，CIK细胞是一种经体外诱导培养形成的具有肿瘤细胞杀伤活性的NK样T细胞，其克服了淋巴因子激活的杀伤细胞(LAK)、肿瘤浸润细胞(TIL)等细胞增殖能力差、对肿瘤细胞毒性低的缺点，能满足临床治疗的要求[Cytokine-induced NK-like T cells:frombench to bedside.JBiomed Biotechnol,2010]。
CIK细胞培养简单，将单个核细胞在体外培养，有序地添加IFN-γ、抗CD3单克隆抗体、IL-1α、IL-2进行诱导，2～3周以后即可收获大量具有强细胞毒性的效应细胞。收获的CIK细胞是异质细胞群，大约95％以上表达CD3+，还含有少量NK细胞。CIK细胞主要的效应群体是一群终末分化的T细胞，细胞表面表达CD3+CD56+。在单个核细胞中，原有CD3+CD56+表达很低；经过体外诱导以后，表达CD3+CD56+的细胞迅速扩增，这些细胞来源于单个核细胞中的CD3+CD56-细胞，是由CD3+CD56-细胞中的CD4-CD8+细胞诱导而来[Characterizationof the recognition and functional heterogeneity exhibited by cytokineinducedkiller cell subsets against acute myeloid leukaemia target cell.Immunology,2009]。
CIK细胞的体外增殖能力远优于LAK细胞，在短期培养后即可达到临床所需要的抗肿瘤效应细胞的数量。CIK细胞有广谱的、较强的杀伤肿瘤细胞的作用，对肿瘤细胞的毒性是非MHC限制的，对一些具有耐药性的肿瘤细胞系的毒性也不受影响[CIK cells frompatients with HCC possess strong cytotoxicity to multidrug-resistant cellline Bel-7402/R.World J Gastroenterol,2005]。CIK细胞对同种自体或者同种异体肿瘤均具有相似的细胞毒性，并且对一般的肿瘤干细胞样细胞也具有细胞毒性[Cytokineinduced killer cells eradicate bone and soft-tissue sarcomas.CancerRes,2014]。为了提高CIK的毒性和治疗效果，许多研究致力于CIK细胞。
发明内容
本发明首先提供miRNA-146a作为药物靶标在提高CIK细胞对肿瘤细胞的杀伤力中的应用；其次提供miRNA-146a抑制剂或含有该抑制剂的试剂或试剂盒在提高CIK细胞对肿瘤细胞杀伤力中的应用，并提供Cyclo(Gly-Thr-Phe-Leu-Tyr-Ala)作为有效miRNA-146a抑制剂。
本发明通过如下技术方案得以实现：
miRNA-146a作为药物靶标在提高CIK细胞对肿瘤细胞的杀伤力中的应用。
进一步地，所述肿瘤细胞为白血病细胞。
miRNA-146a抑制剂在提高CIK细胞对肿瘤细胞的杀伤力中的应用。
进一步地，所述肿瘤细胞为白血病细胞。
进一步地，miRNA-146a抑制剂为环状六肽，结构为Cyclo(-Gly-Thr-Phe-Leu-Tyr-Ala-)。
含miRNA-146a抑制剂的试剂或试剂盒在提高CIK细胞对肿瘤细胞杀伤力中的应用。
进一步地，所述肿瘤细胞为白血病细胞。
进一步地，miRNA-146a抑制剂为环状六肽，结构为Cyclo(-Gly-Thr-Phe-Leu-Tyr-Ala-)。
本发明优点：
本发明发现，miRNA-146a下调表达的CIK细胞比miRNA-146a正常表达的CIK细胞具有更高的杀伤力，miRNA-146a可以作为药物靶标提高CIK细胞对肿瘤细胞的杀伤力；环状六肽Cyclo(-Gly-Thr-Phe-Leu-Tyr-Ala-)为miRNA-146a的有效抑制剂，可以作为miRNA-146a抑制剂用于提高CIK细胞对肿瘤细胞的杀伤力，天然化合物来源比合成的核苷酸类siRNA具有更高的化学稳定性。
附图说明
图1为抑制组、对照组和阴性对照组CIK细胞miRNA-146a的相对表达量；
图2为不同组效应细胞对白血病K562/A02细胞系的杀伤活性；
图3为不同组效应细胞对白血病THP-1细胞系的杀伤活性；
图4为不同组效应细胞对白血病HL-60细胞系的杀伤活性。
具体实施方式
为了更好地解释本发明的技术方案，下面结合具体实施例进一步介绍。实施例中未特别强调的实验材料均为常规实验材料，属于本领域技术人员易于获得的范畴。
实施例1：miRNA-146a低表达对CIK细胞杀伤力的影响
一、实验材料
miRNA-146a inhibitor和inhibitor negative control由上海吉玛制药技术有限公司提供。肿瘤细胞为白血病细胞，包括K562/A02、THP-1及HL-60细胞。其他试剂或仪器均为分子生物学及免疫学常用的试剂或仪器。
二、实验方法
1、效应细胞CIK的分离培养
(1)单个核细胞的分离：采集健康志愿者外周血20mL，预冷的PBS 1:1稀释，缓慢加入淋巴细胞分离液上层，650g，4℃离心20min，收集白色细胞层，分离单个核细胞，1640培养基重悬细胞后置于37℃，5％CO2孵箱中孵育2h。
(2)CIK细胞的培养：收集单核细胞中的悬浮细胞，调整细胞密度至1×106/ml，在完全培养基(1640+10％FBS)中加入INF-γ(1000U/mL)，并于24h后添加IL-2(300U/mL)、IL-1α(l00U/mL)和抗人CD3单抗(50μg/mL)。每2-3d进行换液，并补充等量的细胞因子，连续培养7天，收集细胞备用。
2、效应细胞CIK的转染
转染试剂为美国Invitrogen公司生产的lipofectamine2000，严格按照使用说明操作。
(1)传细胞培养板：以6孔板为例，转染前一天，按1×106/ml密度接种CIK细胞于6孔板，每孔加2ml培养基，使转染时贴壁细胞密度达60％。
(2)用DEPC水稀释miRNA-146a inhibitor或inhibitor negative control(NC)，配制终浓度为20μM的存储液，分装使用。
(3)配制混合液：
miRNA-146a inhibitor或NC混合液：取10μl上述存储液，用opti-MEM稀释，轻轻混匀，配制250μl稀释液A；lipofectamine2000稀释液：取5μl lipofectamine2000，用opti-MEM稀释，轻轻混匀，配制250μl稀释液B。
(4)稀释液A和稀释液B室温孵育5分钟后，将二者轻轻混匀，室温孵育20分钟，配制总体积为500μl的稀释液C。
(5)将6孔板内原培养基吸去，PBS冲洗1次后吸去，每孔加入1.5ml opti-MEM。将稀释液C加入每孔，使得每孔液体总体积为2ml，miRNA-146a inhibitor或NC浓度为100nM。
(6)将6孔板放入细胞培养箱培养6小时，吸去含有miRNA-146a inhibitor或NC的培养基，PBS冲洗1次后，加入完全培养基2ml，放入细胞培养箱中继续培养48小时。
3、效应细胞CIK转染后miRNA-146a的表达量(qRT-PCR)
3.1细胞总RNA的提取
(1)吸去6孔板中的培养基，用PBS冲洗细胞2次，吸去PBS，每孔注入RNAiso Plus1ml，缓慢吹打细胞，使细胞充分裂解；
(2)将裂解液吸出转入1.5ml EP管中，冰上静置5min；
(3)在EP管中加入氯仿200μl，剧烈震荡混匀约15秒，冰上静置3min；然后于4℃条件下12000g/min离心15分钟；
(4)离心后吸取EP管中上层水相液体500μl转入新的1.5ml EP管中，加入异丙醇500μl，颠倒混匀，冰上静置10min；然后于4℃条件下12000g/min离心10分钟；
(5)将EP管中沉淀留下，加入75％乙醇1ml震荡混匀，重悬白色沉淀；然后于4℃条件下7500g/min离心10分钟；
(6)吸去EP管中液体，可见管中沉淀，室温中干燥5分钟后用DEPC水30μl左右溶解沉淀获得总RNA，置于4℃冰箱过夜；
(7)取2μl上述总RNA，加198μl DEPC水，配制200μl稀释的总RNA，测定浓度和纯度；置于-80℃冰箱保存备用。
3.2miRNA-146a逆转录
(1)将总RNA逆转录成cDNA
用Hairpin-itTMmiRNAs qPCR Quantitation Kit(上海吉玛制药技术有限公司)按照说明书在DEPC处理的200μl EP管中配制如下反应体系：5×RT Buffer，4μl；dNTP(10mM)，0.75μl；miR-RT primers(1μM)，1.2μl；MMLV Reverse Transcriptase(200U/μl)，0.2μl；RNA sample，1μg；加RNase Free H2O至20μl。将该体系轻轻混匀后，瞬时离心，设置反应条件如下：16℃，30min；42℃，30min；85℃，10min。反应产物cDNA置于-20℃冰箱保存备用。
(2)实时荧光定量PCR
将cDNA稀释3倍，然后混匀并吸取2μl作模板，用逆转录试剂盒按说明书配制如下反应体系：2×RT PCR Buffer，10μl；miR specific Primer set(5μM)，0.4μl；miRNA RTProduct，2μl；Taq DNA polymerase(5U/ml)，0.2μl；加ddH2O至20μl。将该体系轻轻混匀后，瞬时离心，设置反应条件如下：95℃，3min；95℃，12sec；62℃，40sec；40cycles。
miRNA-146a以U6为内参，miRNA-146a和U6的引物由上海吉玛制药技术有限公司提供。
miRNA-146a的上游引物为5’-CCGATGTGTATCCTCAGCTTTG-3’；
miRNA-146a下游引物为5’-GCTGAAGAACTGAATTTCAGAGGTC-3’；
U6的上游引物为5’-CTCGCTTCGGCAGCACATA-3’；
U6下游引物为5’-AACGCTTCACGAATTGCG-3’。
4、体外特异性杀伤试验
分别使用K562/A02，THP-1及HL-60细胞作为靶细胞，使用完全培养基调整细胞浓度为105个/mL，按照效靶5:1将效应细胞及靶细胞加入96孔板中，37℃、5％CO2孵育箱中培养48h。通过MTT检测试剂盒检测细胞活率。
杀伤活性(％)＝[1-(试验孔均值-效应对照孔均值)/靶细胞对照孔均值]×100％。
根据效应细胞的种类分为如下组别：
对照组：未转染CIK细胞；
抑制组：转染miRNA-146a inhibitor的CIK细胞；
阴性对照组：转染inhibitor negative control的CIK细胞。
三、实验结果
1、CIK细胞增殖情况和表型分析
从外周血分离获得单个核细胞，通过诱导刺激得到CIK细胞。经过传代培养，使用MTT检测试剂盒分析CIK细胞的增殖活性，从570nm的吸光值结果可以看出，初种细胞后的1-2d，CIK细胞生长缓慢，d3细胞进入快速生长期，6d以后细胞生长速度减缓。提取培养7d后的CIK，通过流式细胞仪检测其表面标志物，CIK细胞表面CD3+CD8+、CD3+CD56+双阳性比率分别为56.75％、52.84％，纯度较高。
2、CIK细胞转染后miRNA-146a表达情况
转染miRNA-146a inhibitor的CIK细胞(抑制组)中的miRNA-146a表达量显著下调，其与对照组CIK(不转染inhibitor或negative control)和阴性对照组CIK(转染inhibitor negativecontrol)的相对表达量如图1所示。
抑制组、对照组、阴性对照组的CIK细胞的活力及增殖行为基本一致，证明miRNA-146a低表达后并不影响CIK细胞的活力和增殖行为。
3、MTT比色法检测效应细胞的杀伤效应
抑制组、对照组效应细胞对不同白血病细胞系的杀伤活性见图2-4。结果可见，miRNA-146a下调表达的CIK细胞比miRNA-146a正常表达的CIK细胞具有更高的杀伤力。miRNA-146a可以作为药物靶标提高CIK细胞对肿瘤细胞的杀伤力。
实施例2：miRNA-146a抑制剂的筛选
一、实验材料
环状六肽Cyclo(-Gly-Thr-Phe-Leu-Tyr-Ala-)最早由Hiroshi Morita等人从自然界发现，并命名为dichotomin C，属于环肽类化合物[Dichotomins A-E,new cyclicpeptides from stellaria dichotoma L.var.lanceolata Bge.Tetrahedron,1996,52(4):1165-1176]。本发明中该环状六肽采用化学合成法合成。其他材料同实施例1。
二、实验方法
1、效应细胞CIK的分离培养
(1)单个核细胞的分离：采集健康志愿者外周血20mL，预冷的PBS 1:1稀释，缓慢加入淋巴细胞分离液上层，650g，4℃离心20min，收集白色细胞层，分离单个核细胞，1640培养基重悬细胞后置于37℃，5％CO2孵箱中孵育2h。
(2)CIK细胞的培养：收集单核细胞中的悬浮细胞，调整细胞密度至1×106/ml，在完全培养基(1640+10％FBS)中加入INF-γ(1000U/mL)，并于24h后添加IL-2(300U/mL)、IL-1α(l00U/mL)和抗人CD3单抗(50μg/mL)。每2-3d进行换液，并补充等量的细胞因子，连续培养7天，收集细胞备用。
2、环状六肽诱导CIK细胞低表达miRNA-146a
(1)传细胞培养板：以6孔板为例，转染前一天，按1×106/ml密度接种CIK细胞于6孔板，每孔加2ml培养基，使转染时贴壁细胞密度达60％。
(2)药物诱导：吸去6孔板中的培养基，PBS冲洗1次后，加入含有环状六肽(3μg/ml)的完全培养基2ml，放入细胞培养箱中继续培养48小时。
3、CIK细胞中miRNA-146a的表达(qRT-PCR)
3.1细胞总RNA的提取
(1)吸去6孔板中的培养基，用PBS冲洗细胞2次，吸去PBS，每孔注入RNAiso Plus1ml，缓慢吹打细胞，使细胞充分裂解；
(2)将裂解液吸出转入1.5ml EP管中，冰上静置5min；
(3)在EP管中加入氯仿200μl，剧烈震荡混匀约15秒，冰上静置3min；然后于4℃条件下12000g/min离心15分钟；
(4)离心后吸取EP管中上层水相液体500μl转入新的1.5ml EP管中，加入异丙醇500μl，颠倒混匀，冰上静置10min；然后于4℃条件下12000g/min离心10分钟；
(5)将EP管中沉淀留下，加入75％乙醇1ml震荡混匀，重悬白色沉淀；然后于4℃条件下7500g/min离心10分钟；
(6)吸去EP管中液体，可见管中沉淀，室温中干燥5分钟后用DEPC水30μl左右溶解沉淀获得总RNA，置于4℃冰箱过夜；
(7)取2μl上述总RNA，加198μl DEPC水，配制200μl稀释的总RNA，测定浓度和纯度；置于-80℃冰箱保存备用。
3.2miRNA-146a逆转录
(1)将总RNA逆转录成cDNA
用Hairpin-itTMmiRNAs qPCR Quantitation Kit(上海吉玛制药技术有限公司)按照说明书在DEPC处理的200μl EP管中配制如下反应体系：5×RT Buffer，4μl；dNTP(10mM)，0.75μl；miR-RT primers(1μM)，1.2μl；MMLV Reverse Transcriptase(200U/μl)，0.2μl；RNA sample，1μg；加RNase Free H2O至20μl。将该体系轻轻混匀后，瞬时离心，设置反应条件如下：16℃，30min；42℃，30min；85℃，10min。反应产物cDNA置于-20℃冰箱保存备用。
(2)实时荧光定量PCR
将cDNA稀释3倍，然后混匀并吸取2μl作模板，用逆转录试剂盒按说明书配制如下反应体系：2×RT PCR Buffer，10μl；miR specific Primer set(5μM)，0.4μl；miRNA RTProduct，2μl；Taq DNA polymerase(5U/ml)，0.2μl；加ddH2O至20μl。将该体系轻轻混匀后，瞬时离心，设置反应条件如下：95℃，3min；95℃，12sec；62℃，40sec；40cycles。
miRNA-146a以U6为内参，miRNA-146a和U6的引物由上海吉玛制药技术有限公司提供。
miRNA-146a的上游引物为5’-CCGATGTGTATCCTCAGCTTTG-3’；
miRNA-146a下游引物为5’-GCTGAAGAACTGAATTTCAGAGGTC-3’；
U6的上游引物为5’-CTCGCTTCGGCAGCACATA-3’；
U6下游引物为5’-AACGCTTCACGAATTGCG-3’。
4、体外特异性杀伤试验
分别使用K562/A02，THP-1及HL-60细胞作为靶细胞，使用完全培养基调整细胞浓度为105个/mL，按照效靶5:1将效应细胞及靶细胞加入96孔板中，37℃、5％CO2孵育箱中培养48h。通过MTT检测试剂盒检测细胞活率。
杀伤活性(％)＝[1-(试验孔均值-效应对照孔均值)/靶细胞对照孔均值]×100％。
根据效应细胞的种类分为如下组别：
对照组：常规CIK细胞；
抑制组：环状六肽处理的CIK细胞。
三、实验结果
1、CIK细胞增殖情况和表型分析
结果同实施例1。
不同处理的CIK细胞的活力及增殖行为基本一致，证明上述剂量下的环状六肽不影响CIK细胞的活力和增殖行为。
2、环肽处理后miRNA-146a表达情况
环状六肽处理的CIK细胞中的miRNA-146a表达量显著下调，为对照组的0.27倍。
3、MTT比色法检测效应细胞的杀伤效应
抑制组的CIK细胞对白血病细胞的杀伤力显著提高，以HL-60细胞系为例，为对照组CIK细胞杀伤力的2.86倍。
上述结果表明，环状六肽Cyclo(-Gly-Thr-Phe-Leu-Tyr-Ala-)可以作为miRNA-146a抑制剂用于提高CIK细胞对肿瘤细胞的杀伤力。
上述实施例仅用于进一步解释本发明的技术方案，本领域技术人员应当明白，任何简单替换或修改均不脱离本发明，本发明的保护范围并不受限于上述具体实施例。

Claims (8)

1.miRNA-146a作为药物靶标在提高CIK细胞对肿瘤细胞的杀伤力中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述肿瘤细胞为白血病细胞。
3.miRNA-146a抑制剂在提高CIK细胞对肿瘤细胞的杀伤力中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述肿瘤细胞为白血病细胞。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述miRNA-146a抑制剂为一种环状六肽，其结构为Cyclo(-Gly-Thr-Phe-Leu-Tyr-Ala-)。
6.含miRNA-146a抑制剂的试剂或试剂盒在提高CIK细胞对肿瘤细胞杀伤力中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述肿瘤细胞为白血病细胞。
8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述miRNA-146a抑制剂为一种环状六肽，其结构为Cyclo(-Gly-Thr-Phe-Leu-Tyr-Ala-)。
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