CN109481685A - Cd317抑制剂在制备治疗肝癌的药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及基因工程药物领域，尤其涉及CD317抑制剂在制备治疗肝癌的药物中的应用。本发明提供了CD317抑制剂对肝癌细胞增殖的抑制作用，以及对肝癌细胞周期转换的抑制作用，从而证明了CD317抑制剂对肝癌的治疗作用。结果表明，CD317 siRNA能够高效沉默肝癌细胞CD317的表达，显著抑制肝癌细胞细胞周期转换从而抑制癌细胞增殖。

Description

CD317抑制剂在制备治疗肝癌的药物中的应用

技术领域

本发明涉及基因工程药物领域，尤其涉及CD317抑制剂在制备治疗肝癌的药物中的应用。

背景技术

肝癌(liver cancer)是指发生于肝脏的恶性肿瘤，包括原发性肝癌和转移性肝癌两种，人们日常说的肝癌指的多是原发性肝癌。原发性肝癌(primary carcinoma ofliver)是指发生在肝细胞或肝内胆管细胞的癌肿。其中，肝细胞肝癌是一种严重影响人类生命健康的恶性肿瘤，其发病率和死亡率在全球所有肿瘤里分别位列第五和第三(A.Jemal,F.Bray,M.M.Center,J.Ferlay,E.Ward,D.Forman,Global cancer statistics,CA:a cancer journal for clinicians,61(2011)

69-90.)。肝细胞肝癌进展快、病程短，诊疗困难。尽管早期肝癌患者可以通过肝脏移植、手术或者射频消融术等手段进行治疗，但依然有较高的复发风险(J.Prieto,I.Melero,B.Sangro,Immunological landscape and immunotherapy of hepatocellularcarcinoma,Nat Rev Gastroenterol Hepatol,12(2015)681-700.)。而由于诊断技术的限制，大部分患者被发现时往往已经进入中晚期，治疗困难(I.Mederacke,R.F.Schwabe,NAD(+)supplementation as a novel approach to curing HCC？,Cancer cell,26(2014)777-778.)。迄今为止，手术配合化疗仍是中晚期肝癌患者最常用的治疗方案(J.M.Llovet,S.Ricci,V.Mazzaferro,P.Hilgard,E.Gane,J.F.Blanc,A.C.de Oliveira,A.Santoro,J.L.Raoul,A.Forner,M.Schwartz,C.Porta,S.Zeuzem,L.Bolondi,T.F.Greten,P.R.Galle,J.F.Seitz,I.Borbath,D.Haussinger,T.Giannaris,M.Shan,M.Moscovici,D.Voliotis,J.Bruix,S.I.S.Group,Borbath,D.Haussinger,T.Giannaris,M.Shan,M.Moscovici,D.Voliotis,J.Bruix,S.I.S.Group,Sorafenib in advancedhepatocellular carcinoma,The New England journal of medicine,359(2008)378-390.)，但术后高复发率和化疗后产生的耐药性严重限制了临床疗效。而多激酶抑制剂索拉菲尼(sorafenib)和瑞格拉菲尼(regorafenib)也仅能延长患者生存期(Nault JC,GallePR,Marquardt JU.The role of molecular enrichment on future therapies inhepatocellular carcinoma.J Hepatol.2018Jul；69(1):237-247.)。因此，临床上急需一些新的方法来提高肝癌的诊疗水平。

CD317又名BST-2(Bone Marrow Stromal Cell Antigen 2)、HM1.24、Tetherin,位于人19号染色体p13.2位点，编码181个氨基酸。CD317蛋白大小约为35kDa，是一种脂筏相关I型跨膜糖蛋白，定位于细胞膜表面以及各种细胞器膜的表面。研究发现，CD317是一种新型免疫应答因子，在抗病毒免疫方面发挥病毒颗粒束缚因子(Tetherin)的作用。此外，CD317是一个肿瘤相关抗原，在骨髓瘤、乳腺癌、结肠癌等恶性肿瘤上高表达。(Swiecki,M.,etal.(2013)."BST-2/tetherin:structural biology,viral antagonism,andimmunobiology of a potent host antiviral factor."Mol Immunol 54(2):132-139.)，CD317过表达对肿瘤细胞增殖、转移以及凋亡抵抗等恶性行为具有促进作用(1.Cai D,CaoJ,Li Z et al.Up-regulation of bone marrow stromal protein 2(BST2)in breastcancer with bone metastasis.BMC Cancer,2009,9:102.2.Sayeed，A.,et al.AberrantRegulation of BST2(Tetherin)Promoter Enhances Cell Proliferation andApoptosis Evasion in High Grade Breast Cancer Cells.Plos One,2013.8(6).)，但截止本发明公布之前，是否可以通过直接调控CD317的表达治疗肝癌尚缺乏明确的结论和直接的实验证据。

发明内容

有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供CD317抑制剂在制备治疗肝癌的药物中的应用，研究表明，CD317在肝细胞肝癌中表达明显上调，利用小干扰RNA敲减肝癌细胞系中CD317表达可以显著抑制癌细胞生长并抑制肝癌细胞周期转换。

本发明提供了CD317抑制剂在制备抑制肝癌细胞增殖的药物中的应用。

本发明实施例中，采用基因沉默技术使肝癌细胞中的CD317基因沉默，与未经沉默的细胞(空白对照，mock)相比，CD317沉默细胞的增殖曲线明显变得平缓。二者在同一时间段的OD490存在极显著的差异，p<0.05，这说明CD317表达的沉默能够显著抑制肝癌细胞的增殖。在本发明实施例中，采用人肝细胞肝癌细胞系对技术效果进行验证。具体的，采用高表达人CD317的人肝细胞肝癌细胞系，更进一步的，所述肝癌细胞为HepG2和/或Bel7402。其中，CD317沉默对HepG2细胞增殖的抑制效果更显著。

本发明还提供了CD317抑制剂在制备抑制肝癌细胞周期转换的药物中的应用。

本发明实施例中，与未经沉默的细胞(空白对照，mock)相比，CD317沉默细胞中处于G0/G1时期的细胞百分比显著增加，而处于S其的细胞百分比显著下降。处于G2/M期的细胞百分比则未显示明显变化。这说明CD317表达的沉默能够显著抑制肝癌细胞的周期转换。在本发明实施例中，采用人肝细胞肝癌细胞系对技术效果进行验证。具体的，采用高表达人CD317的人肝细胞肝癌细胞系，更进一步的，所述肝癌细胞为HepG2和/或Bel7402。在本发明实施例中，CD317基因沉默的HepG2细胞处于G0/G1时期的细胞百分比由55.57％增加至68.33％；而处于S期的细胞百分数则由29.96％下降至14.91％；经统计学分析，与MOCK相比，CD317沉默的HepG2细胞处于S期的细胞百分率或处于G0/G1时期的细胞百分率皆存在极显著差异，p<0.001。另一组试验中，CD317基因沉默的Bel7402细胞处于G0/G1时期的细胞百分比由58.75％增加至74.88％；而处于S期的细胞百分数则由27.16％下降至16.53％；经统计学分析，与MOCK相比，CD317沉默的Bel7402细胞处于S期的细胞百分率或处于G0/G1时期的细胞百分率皆存在极显著差异，p<0.01。其中，CD317沉默对HepG2细胞周期转换的抑制效果更显著。

基于CD317抑制剂对肝癌细胞周期转换的抑制作用，以及CD317抑制剂对肝癌细胞增殖的抑制作用，本发明提供了CD317抑制剂在制备治疗肝癌的药物中的应用。

本发明中，所述CD317抑制剂能够治疗的肝癌为肝细胞肝癌。

本发明中，所述CD317抑制剂是指通过各种靶向CD317的基因沉默技术，包括腺病毒介导的shRNA干扰技术或者慢病毒介导的Crispr CAS9技术，本发明实施例中，所述CD317抑制剂为CD317 siRNA、CD317 shRNA、shRNA的编码DNA或CD317 sgRNA。其中，CD317 siRNA是靶向CD317的小分子干扰RNA，能够导致mRNA的降解，使CD317基因沉默。CD317 shRNA是靶向CD317的短发夹RNA，其可以克隆到表达载体并表达短的干扰RNA的DNA分子，从而实现CD317基因的沉默。CD317 sgRNA是靶向CD317的向导RNA，sgRNA是基于Crispr基因敲除系统的重要组成部分，能够与cas9蛋白结合，引导cas9酶靶向基因组DNA对CD317进行剪切。

本发明提供的药物中还包括阳离子脂质体。本发明中，采用阳离子脂质体Lipofectamine 3000作为转染试剂。

本发明提供的药物中，所述CD317抑制剂为CD317 siRNA、CD317 shRNA、shRNA的编码DNA或CD317 sgRNA。

一些实施例中，所述CD317 siRNA包括SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的正义链和SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的反义链。

本发明所述的药物物还包含其他治疗剂，所述其他治疗剂选自其他用于治疗肝癌的药物，例如抗血管生成的药物和/或放化疗药物。所述药物的的剂型为注射液剂或注射用粉针剂。

本发明还提供了一种防治肝癌的方法，其为给予本发明所述的药物。具体为防治肝细胞肝癌的方法。

本发明提供了CD317抑制剂对肝癌细胞增殖的抑制作用，以及对肝癌细胞周期转换的抑制作用，从而证明了CD317抑制剂对肝癌的治疗作用。结果表明，CD317 siRNA能够高效沉默肝癌细胞CD317的表达，显著抑制肝癌细胞细胞周期转换从而抑制癌细胞增殖。

附图说明

图1示CD317特异性siRNA的沉默效果验证；

图2示CD317基因沉默抑制肝癌细胞增殖；

图3示CD317基因沉默抑制细胞周期G0/G1向S期的转换。

具体实施方式

本发明提供了CD317抑制剂在制备治疗肝癌的药物中的应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例

1、siRNA设计与转染

根据siRNA靶序列基本原则，针对人CD317基因转录本(NM_004335.3)设计1条21个核苷酸的siRNA序列，即siCD317,包括正义链和反义链，其碱基序列如下：

正义链:5’-CCAGGUCUUAAGCGUGAGAdTdT-3’,反义链：5’-UCUCACGCUUAAGACCUGGdTdT-3’；

本实施例选择的阴性对照(NC)siRNA碱基序列如下：

正义链:5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUdTdT-3’,反义链：5’-ACGUGACACGUUCGGAGAAdTdT-3’；

本发明所述干扰片段的3’端添加两个呈单链悬挂结构的脱氧核糖核苷酸，以增强siRNA在体内和体外的稳定性，防止降解。所述siRNA由上海吉玛公司合成。

根据本发明的优选实施例，选择目前较为常见的阳离子脂质体Lipofectamine3000作为转染试剂。

2、干扰效果验证

本发明选用的细胞系为高表达人CD317的人肝细胞肝癌细胞系HepG2和Bel7402。转染方法及结果验证如下：

(1)细胞转染

1)根据siRNA合成报告，加入适量DEPC水配制20μM贮存液；

2)接种细胞于12孔板，密度以过夜培养后细胞汇合度达到50％-60％为宜；

3)用50μL Opti-MEM培养基稀释4μL Lipofectamine 3000转染试剂，充分混匀，室温静置5分钟；

4)用50μL Opti-MEM培养基稀释2μL siRNA，充分混匀，室温静置5分钟；

5)将上述步骤2)跟步骤3)的稀释液混合，充分混匀后室温静置10分钟。此时混合液中siRNA与Lipofectamine3000的比例为1:2；

6)将步骤5)转染混合液逐滴加入细胞培养孔，然后十字交叉法混匀；

7)细胞继续培养36小时，以备后续实验。

(2)干扰效果检测

1)RNA抽提

a)转染siRNA 36h后，去除培养基，PBS洗涤一遍，加入1mL Trizol充分裂解细胞；

b)收集裂解液于1.5mL EP管中，加入200μL氯仿。颠倒混匀15s后室温静置3min,然后12000rpm，4℃离心15min；

c)吸取400μL上清，加入预冷的异丙醇400μL，混匀后12000rpm，4℃离心15min；

d)去除上清，用75％的乙醇清洗沉淀物，7500rpm，4℃离心8min。

e)真空干燥5min后加入20μL DEPC水，室温溶解5-10min；

f)用Nanodrop测定RNA浓度和纯度。

2)将上述RNA逆转录成cDNA

a)按下表配置逆转录反应A液,混匀后于70℃孵育5min,置冰上备用；

b)配制逆转录反应B液，体系如下所示：

c)将A液与B液混匀，于42℃温育1h，然后70℃孵育10min灭活逆转录酶，终止反应。

3)实时定量PCR测定CD317表达情况

a)在无核酸酶的PCR反应管中PCR反应液，体系如下：

b)在Bio-Rad CFX96实时荧光定量PCR仪上进行PCR扩增，条件如下：95℃变性30s；循环40次，[95℃15s，56℃15s，72℃20s/荧光信号检测]×40循环，扩增结束后，进行65-95℃熔解曲线分析收集；

c)采用2^-△△CT对PCR结果进行半定量分析。

siRNA沉默后，肝癌细胞的CD317表达情况如图1，图中，**示二者存在极显著差异，p<0.01；***示二者存在极显著差异，p<0.001。结果表明，siRNA可高效沉默HepG2(左)以及Bel7402(右)细胞中CD317的表达，沉默效果最高可达75％以上。

3、MTT检测细胞增殖

(1)转染siRNA 36h后，收集NC和siR317细胞，离心后重悬，计数；

(2)以5×10³cells/well铺96孔板，细胞贴壁后(8h)第一次检测的时间设为0点；

(3)放培养箱继续培养，于0，24h，48h，72h用MTT法检测细胞活力，绘制增殖曲线。

图2示CD317基因沉默后，肝癌细胞的增殖情况，结果表明，CD317的沉默能够显著抑制HepG2(左)以及Bel7402(右)细胞增殖。经统计学分析，经CD317沉默后HepG2细胞与mock组相比，p值＜0.0001，存在极显著差异。而经CD317沉默后Bel7402细胞与mock组相比，p值＜0.001，存在极显著差异。

4、流式细胞术分析CD317沉默对肝癌细胞周期的影响

(1)细胞预处理

1)细胞转染siRNA 36h后，胰蛋白酶-EDTA消化细胞，重悬至3×10 ⁵细胞/mL,接种于12孔板；

2)培养过夜后，换无血清培养基静息24h，然后换完全培养基继续培养12-24h；

(2)流式细胞术分析细胞周期

1)收集细胞，70％冷乙醇固定至少2h；

2)PBS洗涤后用细胞周期检测试剂盒(南京凯基)对细胞进行PI染色；

3)流式细胞仪分析细胞周期分布情况。

图3示CD317基因沉默后，肝癌细胞周期情况，结果表明，CD317的沉默能够显著抑制HepG2(左)以及Bel7402(右)细胞的周期转换。CD317基因沉默的HepG2细胞处于G0/G1时期的细胞百分比由55.57％增加至68.33％；而处于S期的细胞百分数则由29.96％下降至14.91％；经统计学分析，与MOCK相比，CD317沉默的HepG2细胞处于S期的细胞百分率或处于G0/G1时期的细胞百分率皆存在极显著差异，p<0.001。另一组试验中，CD317基因沉默的Bel7402细胞处于G0/G1时期的细胞百分比由58.75％增加至74.88％；而处于S期的细胞百分数则由27.16％下降至16.53％；经统计学分析，与MOCK相比，CD317沉默的Bel7402细胞处于S期的细胞百分率或处于G0/G1时期的细胞百分率皆存在极显著差异，p<0.01。

以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 深圳先进技术研究院

<120> CD317抑制剂在制备治疗肝癌的药物中的应用

<130> MP1832555

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> misc_feature

<222> (20)..(20)

<223> n为dT

<220>

<221> misc_feature

<222> (21)..(21)

<223> n为dT

<400> 1

ccaggucuua agcgugagan n 21

<210> 2

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> misc_feature

<222> (20)..(20)

<223> n为dT

<220>

<221> misc_feature

<222> (21)..(21)

<223> n为dT

<400> 2

ucucacgcuu aagaccuggn n 21

Claims (10)

1.CD317抑制剂在制备抑制肝癌细胞增殖的药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述肝癌细胞为HepG2和/或Bel7402。

3.CD317抑制剂在制备抑制肝癌细胞周期转换的药物中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述肝癌细胞为HepG2和/或Bel7402。

5.CD317抑制剂在制备治疗肝癌的药物中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述肝癌为肝细胞肝癌。

7.根据权利要求1～6任一项所述的应用，其特征在于，所述CD317抑制剂为CD317siRNA、CD317 shRNA、shRNA的编码DNA或CD317 sgRNA。

8.治疗肝癌的药物，其包括CD317抑制剂。

9.根据权利要求8所述的药物，其特征在于，所述CD317抑制剂为CD317 siRNA、CD317shRNA、shRNA的编码DNA或CD317 sgRNA。

10.根据权利要求9所述的药物，其特征在于，所述CD317 siRNA包括SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的正义链和SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的反义链。