CN101948544B - FAT10基因siRNA重组模拟病毒及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种模拟病毒，特别涉及FAT10基因siRNA重组模拟病毒及其制备方法和应用，该模拟病毒为融合多肽与FAT10基因siRNA重组表达载体的复合物，其中融合多肽由RGD肽与穿膜肽HIV-Tat49-57连接而成，FAT10基因siRNA重组表达载体通过甲胎蛋白启动子控制FAT10基因siRNA的表达；该模拟病毒可以靶向肝癌细胞并使FAT10基因siRNA局限在肝癌细胞中表达，特异性导致肝癌细胞中的FAT10基因表达沉默，避免损伤无关细胞，同时还具有转染效率高、制备方法简单省时等优点，可用于制备抗肝癌药物，在肝癌基因治疗领域有着良好的开发应用前景。

Description

FAT10基因siRNA重组模拟病毒及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一种模拟病毒，特别涉及FAT10基因siRNA重组模拟病毒，还涉及该模拟病毒的制备方法和应用。

背景技术

肝癌是常见的恶性肿瘤，位居恶性肿瘤发病率的第5位，其确切发病机制尚未完全明了。如何阻断慢性肝脏疾病向肝癌的恶性转化，或在肝癌早期加以干预，成为进一步提高肝癌治疗效果的关键。

FAT10又被称为双泛素(diubiquitin)，属于泛素蛋白家族中的泛素样修饰蛋白(UBLs)，是一个分子量为18kDa的包含165个氨基酸残基的蛋白质，由两个泛素样结构域融合而成。FAT10在细胞周期的调控中起到十分重要的作用，已被证明能与人纺锤体聚集检测点蛋白(mitotic arrest deficiency 2，MAD2)非共价结合。MAD2负责在有丝分裂时保持纺锤体的完整性，其功能受到抑制将导致染色体不分离或染色体不稳定，这是许多肿瘤发生的重要特征。已有研究发现，FAT10在肝癌、宫颈癌、卵巢癌、直肠癌、胰腺癌及小肠腺癌等恶性肿瘤中表达均明显上调，表明FAT10在恶性肿瘤的发生中起到一定作用。因此，抑制FAT10的过度表达，可能是调控肝癌基因表达的新途径。

RNA干扰(RNA interference，RNAi)是指内源性或外源性双链RNA(doublestranded RNA，dsRNA)引发生物体内同源mRNA降解从而表现出的基因转录后沉默现象，现已成为分子生物学家分析基因组功能和基因治疗的一个有力工具。小干扰RNA(small interference RNA，siRNA)是RNAi的效应分子，是一类长21～23个核苷酸的双链RNA，在体内可特异性降解与其序列互补的mRNA而引发基因沉默。文献(刘天德等.siRNA对肝癌细胞异常表达FAT10基因的抑制效应研究.新医学，2009，40(6)：358)报道了FAT10基因siRNA可以抑制人肝癌细胞株Hep3B中FAT10基因的表达，并抑制Hep3B细胞的生长。但该文献使用的是体外合成的siRNA，而siRNA在体内易被核酸酶降解，稳定性较差，产生的RNAi干扰效应时间短，不适用于长期基因沉默。最好是借助表达质粒或病毒载体等在细胞内持续产生siRNA，例如将编码短发卡RNA(short hairpin RNA，shRNA)的模板DNA序列插入载体启动子后构建重组表达载体，所得重组表达载体导入体内后持续转录出shRNA，shRNA再被体内RNaseIII家族的内切核酸酶Dicer剪切成siRNA，从而达到长期抑制靶基因表达的目的。虽然病毒载体介导的RNAi近年来受到人们重点关注，利用病毒载体可以解决质粒转染效率低、效果不稳定且某些类型细胞不能转染等问题，但其也存在诸如免疫原性和病毒性重组等安全性问题，以及制备过程复杂、容量有限、制得的病毒滴度较低等缺陷。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种FAT10基因siRNA重组模拟病毒，可以靶向肝癌细胞并使FAT10基因siRNA局限在肝癌细胞中表达，特异性导致肝癌细胞中的FAT10基因表达沉默，避免损伤无关细胞。

为达到上述目的，本发明的FAT10基因siRNA重组模拟病毒为融合多肽与FAT10基因siRNA重组表达载体的复合物；所述融合多肽由RGD肽与穿膜肽HIV-Tat49-57连接而成；所述FAT10基因siRNA重组表达载体通过甲胎蛋白(AFP)启动子控制FAT10基因siRNA的表达。

进一步，所述融合多肽的氨基酸序列如SEQ ID No.7所示；

进一步，所述FAT10基因siRNA的核苷酸序列为：正义链如SEQ ID No.1所示，反义链如SEQ ID No.2所示；

进一步，所述FAT10基因siRNA重组表达载体是将核苷酸序列分别如SEQID No.3和SEQ ID No.4所示的2条模板DNA单链经退火处理后插入pSilencer1.0-U6载体的启动子之后而得到；所述pSilencer 1.0-U6载体中的U6启动子被AFP启动子所替换。

RGD肽是一类含有Arg-Gly-Asp(RGD)序列的小肽，广泛存在于多种生物体内及同一种生物体的各种组织中。作为一种重要的细胞识别位点与信号启动分子，RGD肽在许多生命活动中发挥着重要的调节作用。目前研究较多的是关于RGD肽通过其所含的RGD序列竞争结合到细胞表面的整合素受体上从而产生抗血小板凝聚、抗肿瘤迁移以及抗肿瘤血管生成作用等方面。研究证实：整合素家族中α_υβ₃与细胞粘附和新生血管形成的关系最为密切，其配体RGD肽对肿瘤新生血管内皮细胞的粘附和迁移有明显抑制作用，且可诱导肿瘤细胞中caspase-3和caspase-7表达增高，从而促进肿瘤细胞的凋亡。本发明将RGD肽与阳离子穿膜肽HIV-Tat49-57连接构成富含正电荷的融合多肽，利用正负电荷吸引原理，该富含正电荷的融合多肽可以包装富含负电荷的FAT10基因siRNA重组表达载体，形成小而均匀的颗粒性肽-DNA复合物。这种颗粒模拟了天然病毒的结构，故称其为模拟病毒。本发明的融合多肽具有穿膜肽HIV-Tat49-57的穿膜活性，易于被抗原递呈细胞摄取，体内转染效率高；同时，通过RGD肽与肝癌细胞及新生血管内皮细胞表面整合素受体的特异性结合，可以引导模拟病毒靶向定位到肝癌细胞，达到杀伤肝癌细胞而不损害正常细胞的治疗目的，大大提高肝癌基因治疗的安全性和有效性，此外RGD肽本身也具有抗肿瘤迁移和抗肿瘤血管生成的作用，并能诱导肿瘤细胞的凋亡。以本发明的融合多肽为核酸载体，还具有无蓄积危害性和传染性，核酸容量无限制，制备方法简便等优点。本发明的RGD肽序列优选为RGDRGDRGD，即将三个RGD序列串联，其能够有效提高RGD肽的靶向能力。

目的基因的靶向性表达对肝癌的治疗极其重要。AFP是一种大分子糖蛋白，主要由胎儿肝细胞和卵黄囊产生。当胎儿出生后，AFP的合成逐渐停止，但当肝细胞发生癌变时，这种胚胎抗原的基因被激活，可重新产生大量的AFP。研究发现，约60％～70％的肝癌患者血清AFP水平升高。因此，AFP启动子具有肝癌细胞特异性，可启动外源基因在肝癌细胞中的特异性表达。在本发明中，以AFP启动子调控FAT10基因siRNA的表达，可使FAT10基因siRNA局限在肝癌细胞中表达，特异性导致肝癌细胞中的FAT10基因表达沉默，从而实现了基因治疗的靶向性，避免了对其它器官的不良反应。

本发明的目的之二在于提供所述FAT10基因siRNA重组模拟病毒的制备方法，操作简便，耗时少。

为达到此目的，本发明所述FAT10基因siRNA重组模拟病毒的制备方法，包括以下步骤：

a、采用化学合成法合成氨基酸序列如SEQ ID No.7所示的融合多肽；

b、构建FAT10基因siRNA重组表达载体：以人肝癌细胞株HepG2的基因组DNA为模板，采用核苷酸序列分别如SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示的上、下游引物通过PCR扩增获得AFP启动子片段，经限制性内切酶KpnI和ApaI双酶切后，与同样经KpnI和ApaI双酶切去除U6启动子的pSilencer 1.0-U6载体连接，获得重组载体pSiAFP；将核苷酸序列分别如SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示的2条模板DNA单链进行退火处理，获得双链DNA插入片段，经限制性内切酶ApaI和EcoRI双酶切后，与同样经ApaI和EcoRI双酶切的重组载体pSiAFP连接，获得FAT10基因siRNA重组表达载体pSiAFP/FAT10；

c、制备FAT10基因siRNA重组模拟病毒：于室温、涡旋条件下，向含有氯化钠和步骤b所得FAT10基因siRNA重组表达载体pSiAFP/FAT10的溶液中，缓慢滴加步骤a所得融合多肽溶液，滴加完毕后，室温继续涡旋25～35分钟，再静置25～35分钟，即得FAT10基因siRNA重组模拟病毒。

本发明的目的之三在于提供所述FAT10基因siRNA重组模拟病毒的应用。

为达到此目的，本发明提供了所述FAT10基因siRNA重组模拟病毒在制备抗肝癌药物中的应用。

体外实验结果证实，本发明的FAT10基因siRNA重组模拟病毒可以有效降低肝癌细胞HepG2中FAT10mRNA和FAT10蛋白的表达水平，能够引起HepG2细胞G1/S期阻滞，能够诱导肝癌细胞HepG2的凋亡而对正常细胞COS-7无影响。体内实验结果证实，本发明的FAT10基因siRNA重组模拟病毒能够有效抑制肿瘤的生长，能够延长荷瘤裸鼠的平均生存期并提高平均生存率。因此，本发明的FAT10基因siRNA重组模拟病毒可以用于制备抗肝癌药物。

本发明的有益效果在于：本发明的FAT10基因siRNA重组模拟病毒可以靶向肝癌细胞并使FAT10基因siRNA局限在肝癌细胞中表达，特异性导致肝癌细胞中的FAT10基因表达沉默，避免损伤无关细胞，同时，还具有转染效率高、制备方法简单省时等优点，可用于制备抗肝癌药物，在肝癌基因治疗领域有着良好的开发应用前景。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步的详细描述，其中：

图1为琼脂糖凝胶电泳鉴定AFP启动子片段的PCR扩增产物；

图2为透射电镜分析FAT10基因siRNA重组模拟病毒；

图3为实时定量RT-PCR法检测FAT10mRNA表达水平；

图4为Western blot法检测FAT10蛋白表达水平；

图5为MTT法检测细胞存活率；

图6为细胞凋亡率的检测；

图7为细胞周期的检测；

图8为两组小鼠的肿瘤生长曲线；

图9为两组小鼠的生存率比较。

具体实施方式

以下将参照附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。优选实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南(第三版，J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译，科学出版社，2002年)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

一、FAT10基因siRNA重组模拟病毒的制备与鉴定

1、FAT10基因siRNA重组表达载体的构建

(1)shRNA转录模板DNA的合成

根据文献(刘天德等.siRNA对肝癌细胞异常表达FAT10基因的抑制效应研究.新医学，2009，40(6)：358)报道的FAT10基因siRNA序列：正义链：5′-gcuc-aguggcacaagugaatt-3′(SEQ ID No.1)；反义链：5′-uucacuugugccacugagctg-3′(SEQ IDNo.2)；设计shRNA转录模板DNA单链2条：单链1：5′-cgctcagtggcacaagtgaattc-aagagattcacttgtgccactgagcttttttg-3′(SEQ ID No.3)；单链2：5′-aattcaaaaaagctcagtggc-acaagtgaatctcttgaattcacttgtgccactgagcgggcc-3′(SEQ ID No.4)；委托上海吉凯公司合成。

(2)AFP启动子片段的PCR扩增

利用Primer5在线软件设计AFP启动子片段的PCR扩增引物，其中上游引物序列为：5′-gcggtaccattctgtagtttgaggag-3′(SEQ ID No.5)，下划线部分为KpnI酶切位点；下游引物序列为：5′-atgggcccattggcagtggt ggaa-3′(SEQ ID No.6)，下划线部分为ApaI酶切位点；预期扩增片段大小为292bp。以HepG2细胞的基因组DNA为模板，建立50μl标准PCR反应体系，PCR反应参数为：94℃预变性5分钟，然后94℃变性1分钟、60℃退火1分钟、72℃延伸1分钟，共35个循环，最后72℃延伸5分钟。PCR产物经质量分数为1.5％的琼脂糖凝胶电泳鉴定(图1)、凝胶回收试剂盒切胶回收纯化后，与pMD18-T载体连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，用含有氨苄青霉素的LB平板筛选阳性克隆，次日挑取阳性克隆，小量扩增后提取质粒，送上海博亚生物技术有限公司测序验证，将阳性克隆质粒命名为pMD18-T/AFP。

(3)FAT10基因siRNA重组表达载体的构建

用限制性内切酶KpnI和ApaI自质粒pMD18-T/AFP中双酶切出AFP启动子片段，再与同样经KpnI和ApaI双酶切去除U6启动子的pSilencer 1.0-U6载体连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，用含有氨苄青霉素的LB平板筛选阳性克隆，次日挑取阳性克隆，小量扩增后提取质粒，送上海博亚生物技术有限公司测序验证后，将阳性克隆质粒命名为pSiAFP。

将2条shRNA转录模板DNA单链进行退火处理，得到双链DNA插入片段，经限制性内切酶ApaI和EcoRI双酶切后，再与同样经ApaI和EcoRI双酶切的质粒pSiAFP连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，用含有氨苄青霉素的LB平板筛选阳性克隆，次日挑取阳性克隆，小量扩增后提取质粒，送上海博亚生物技术有限公司测序验证后，将阳性克隆质粒命名为pSiAFP/FAT10，即获得FAT10基因siRNA重组表达载体。

2、融合多肽的合成

设计融合多肽的氨基酸序列为：RGDRGDRGDRKKRRQRRR(SEQ ID No.7)，其中N端下划线部分为RGD肽，C端斜体部分为穿膜肽HIV-Tat49-57。委托上海生工生物工程技术服务公司采用固相合成法进行合成融合多肽，合成方案采用标准Fmoc方案，即由去保护和激活交联两个反应反复循环直至合成目的多肽，获得的目的多肽粗品用高效液相色谱法进行纯化，纯化后的目的多肽经反相高效液相色谱法鉴定纯度为98.5％，经质谱法鉴定分子量与理论值一致，最后冷冻干燥，温度-70℃保存备用。

3、FAT10基因siRNA重组模拟病毒的制备及鉴定

于室温、涡旋条件下，向100μl含有浓度为1mg/ml的NaCl和浓度为500μg/ml的质粒pSiAFP/FAT10的溶液中，以5μl/min的速度滴加100μl浓度为1000μg/ml的融合多肽溶液，滴加完毕后，室温下继续涡旋30分钟，再静置30分钟，即得FAT10基因siRNA重组模拟病毒悬液。

将新鲜制备的FAT10基因siRNA重组模拟病毒悬液滴于200目铜网上，吸附3分钟，用吸水纸吸干表面液体，晾干30秒，再用质量体积分数为1％的醋酸铀溶液负染30秒，用吸水纸吸干表面液体，晾干30秒，置80kV透射电镜下观察形态。结果如图2所示，FAT10基因siRNA重组模拟病毒呈大小均一的近圆形颗粒，绝大多数颗粒长径小于20nm。

二、FAT10基因siRNA重组模拟病毒的效应检测

1、实时定量RT-PCR法检测FAT10mRNA表达水平

将HepG2细胞接种于96孔板，培养24小时后，加入FAT10基因siRNA重组模拟病毒悬液100μl感染细胞，同时设置对照组(加入PBS 100μl)，感染2天后，收集细胞，采用Trizol法抽提细胞总RNA。取细胞总RNA 1μg反转录制备cDNA，再分别以如下2对特异性引物：FAT10-F：5′-caatgcttcctgcctctgtg-3′(SEQ ID No.8)，FAT10-R：5′-tgcctctttgcctcatcacc-3′(SEQ ID No.9)；GAPDH-F：5′-tcccatcaccatcttc-cag-3′(SEQ ID No.10)，GAPDH-R：下游为：5′-aggagtgggtgtcgctg-3′(SEQ ID No.11)，在Bio-Rad iCycler仪上进行实时定量PCR，PCR反应条件为：95℃预变性1分钟，然后95℃变性45秒、57℃退火45秒、72℃延伸45秒，共进行30个循环。以GAPDHmRNA的表达为内参照，计算FAT10mRNA的相对表达量。实验重复三次，每次做三个复孔。结果如图3所示，本发明构建的FAT10基因siRNA重组模拟病毒能够有效降低HepG2细胞的FAT10mRNA表达水平，而对照组无此作用。

2、Western blot法检测FAT10蛋白表达水平

将HepG2细胞接种于96孔板，培养24小时后，加入FAT10基因siRNA重组模拟病毒悬液100μl感染细胞，同时设置对照组(加入PBS 100μl)，感染2天后，收集细胞，用PBS洗涤并重悬，超声裂解细胞，离心取上清液，采用质量分数为5％的浓缩胶、质量分数为12.5％的分离胶进行SDS-PAGE电泳，电泳完毕后电转印PVDF膜，用脱脂奶封闭1小时后，加入兔抗人FAT10多克隆抗体，37℃孵育1小时，PBST洗膜后，再加入羊抗兔IgG，37℃孵育1小时，PBST洗膜后，再加入发光底物，37℃孵育1分钟，暗室中用X光片曝光，显影，定影，观察FAT10蛋白表达水平。结果如图4所示，本发明构建的FAT10基因siRNA重组模拟病毒能够有效降低HepG2细胞的FAT10蛋白表达水平，而对照组无此作用。

3、MTT法检测细胞存活率

分别将HepG2细胞和美洲绿猴肾细胞COS-7接种于96孔板，培养24小时后，加入FAT10基因siRNA重组模拟病毒悬液100μl感染细胞，同时设置对照组(加入PBS 100μl)，感染2天后，每孔加入浓度为50mg/ml的MTT(用PBS配制)20μl，37℃培养4小时，弃去含MTT的培养液，加入酸化异丙醇100μl，待充分溶解后，在酶标仪上测定波长595nm处的吸光度A值，按下述公式计算细胞存活率：细胞存活率＝A_样品/A_对照×100％。结果如图5所示，经本发明的FAT10基因siRNA重组模拟病毒处理的肿瘤细胞HepG2的存活率明显下降，平均存活率为28％；而经该模拟病毒处理的正常细胞COS-7的存活率未见明显变化，平均存活率为86％。

4、细胞凋亡率的检测

分别将HepG2细胞和COS-7细胞接种于96孔板，培养24小时后，加入FAT10基因siRNA重组模拟病毒悬液100μl感染细胞，同时设置对照组(加入PBS100μl)，感染2天后，用PBS洗涤并重悬，再加入浓度为250μg/ml的FITC标记Annexin V 5μl和浓度为250μg/ml的PI 5μl，冰浴避光孵育10分钟，PBS洗涤后，用FACS Calibur流式细胞仪检测细胞凋亡情况。结果如图6所示，经本发明的FAT10基因siRNA重组模拟病毒处理的肿瘤细胞HepG2的凋亡率明显增加，平均凋亡率为28％；而经该模拟病毒处理的正常细胞COS-7的凋亡率未见明显变化，平均凋亡率为6％。

5、细胞周期的检测

分别将HepG2细胞和COS-7细胞接种于96孔板，培养24小时后，加入FAT10基因siRNA重组模拟病毒悬液100μl感染细胞，同时设置对照组(加入PBS 100μl)，感染2天后，用PBS洗涤，加入70％乙醇于4℃固定3小时，PBS洗涤2次，再加入终浓度为50mg/l的RNase，37℃消化30分钟，再加入终浓度为50mg/L的PI，4℃避光染色30分钟，用流式细胞仪检测，细胞周期分析采用美国Becton Diekinson公司的CellQuit Plot分析软件。结果如图7所示，HepG2细胞在转染本发明构建的FAT10基因siRNA重组模拟病毒后，G0/G1期细胞比例(68.3％)明显高于对照组(42.02％)，S期细胞比例(19.45％)明显低于对照组(25.19％)，G0/G1期比例增加，S期和G2M期比例下降，并有凋亡现象产生，说明本发明的FAT10基因siRNA重组模拟病毒能引起HepG2细胞G1/S期阻滞，而经该模拟病毒处理的正常细胞COS-7未出现明显的细胞周期阻滞现象。

6、体内抗肿瘤作用

将1×10⁵个HepG2细胞接种于裸鼠皮下建立荷瘤裸鼠，将荷瘤裸鼠随机分为对照组和实验组，对照组尾静脉注射PBS，实验组尾静脉注射本发明的FAT10基因siRNA重组模拟病毒，观察60天内两组小鼠的生存率和肿瘤体积，绘制肿瘤生长曲线。两组小鼠的肿瘤生长曲线如图8所示，可见第30天时，对照组小鼠肿瘤体积达到5000mm³，而实验组小鼠肿瘤生长缓慢，肿瘤体积仅为2000mm³。两组小鼠的生存率比较如图9所示，对照组小鼠于30天内全部死亡，而实验组小鼠60天的生存率为50％，说明本发明的FAT10基因siRNA重组模拟病毒能够有效抑制肿瘤的生长，能够延长荷瘤裸鼠的平均生存期并提高平均生存率。

当然，本发明中的FAT10基因siRNA除了上述实施例中所用siRNA之外，还可以是其它FAT10基因siRNA，例如文献(刘天德等.siRNA对肝癌细胞异常表达FAT10基因的抑制效应研究.新医学，2009，40(6)：358)中报道的其它3个siRNA序列，都可以实现本发明目的。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过参照本发明的优选实施例已经对本发明进行了描述，但本领域的普通技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离所附权利要求书所限定的本发明的精神和范围。

Claims (5)

1.FAT10基因siRNA重组模拟病毒，其特征在于：该模拟病毒为融合多肽与FAT10基因siRNA重组表达载体的复合物；所述融合多肽由RGD肽与穿膜肽HIV-Tat49-57连接而成，氨基酸序列如SEQ ID No.7所示；所述FAT10基因siRNA重组表达载体通过甲胎蛋白启动子控制FAT10基因siRNA的表达。

2.根据权利要求1所述的FAT10基因siRNA重组模拟病毒，其特征在于：所述FAT10基因siRNA的核苷酸序列为：正义链如SEQ ID No.1所示，反义链如SEQ ID No.2所示。

3.根据权利要求2所述的FAT10基因siRNA重组模拟病毒，其特征在于：所述FAT10基因siRNA重组表达载体是将核苷酸序列分别如SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示的2条模板DNA单链经退火处理后插入pSilencer 1.0-U6载体的启动子之后而得到；所述pSilencer 1.0-U6载体中的U6启动子被甲胎蛋白启动子所替换。

4.权利要求1所述的FAT10基因siRNA重组模拟病毒的制备方法，其特征在于：

a、采用化学合成法合成氨基酸序列如SEQ ID No.7所示的融合多肽；

b、构建FAT10基因siRNA重组表达载体：以人肝癌细胞株HepG2的基因组DNA为模板，采用核苷酸序列分别如SEQ IDNo.5和SEQ ID No.6所示的上、下游引物通过PCR扩增获得甲胎蛋白启动子片段，经限制性内切酶KpnI和ApaI双酶切后，与同样经KpnI和ApaI双酶切去除U6启动子的pSilencer 1.0-U6载体连接，获得重组载体pSiAFP；将核苷酸序列分别如SEQ ID No.3和SEQ IDNo.4所示的2条模板DNA单链进行退火处理，获得双链DNA插入片段，经限制性内切酶ApaI和EcoRI双酶切后，与同样经ApaI和EcoRI双酶切的重组载体pSiAFP连接，获得FAT10基因siRNA重组表达载体pSiAFP/FAT10；

c、制备FAT10基因siRNA重组模拟病毒：于室温、涡旋条件下，向含有氯化钠和步骤b所得FAT10基因siRNA重组表达载体pSiAFP/FAT10的溶液中缓慢滴加步骤a所得融合多肽溶液，滴加完毕后，室温继续涡旋25～35分钟，再静置25～35分钟，即得FAT10基因siRNA重组模拟病毒。

5.权利要求1所述的FAT10基因siRNA重组模拟病毒在制备抗肝癌药物中的应用。

Images