CN106103716A - Rna干扰dna聚合酶并抑制dna合成的方法及其复合物组分 - Google Patents
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Abstract
在细胞内抑制DNA合成的方法和组分(或成分或配方)在此公开。RNA抑制DNA合成的方法可以用在多个方面,例如 多种生物分析方法,研究细胞的工具,细胞同步化,细胞生长抑制。又例如,抑制肿瘤细胞的DNA合成可用于抑制癌细胞和治疗癌症。RNA可以是任何RNA,如细胞RNA,细胞信使mRNA,细胞核糖体rRNA,细胞转移核糖核酸tRNA,合成RNA(包括生物合成的、化学合成的或生物化学合成的RNA),重组RNA,修饰过的RNA(包括生物修饰的、化学修饰的或生物化学修饰的RNA)。RNA序列可以是一个复杂的混合物,一个序列,或简单的混合物。RNA可以是各种长度的片段,类似的长度的片段,长的片段,短的片段,或是它们的组合。RNA可以有足够的数量以便减少或抑制细胞中的DNA合成。组分可以有RNA,有靶向性的分子,和医药上可接受的载体。有靶向性的分子可以是识别并攻击肿瘤的多肽分子。
Description
相关申请交叉引用
本申请拥有美国临时专利(申请号:61/845,793;申请日期:2013年7月12日)的优先权,并特此将其全部内容并入本文作为参考。
联邦政府资助研究相关说明
本发明在政府的支持下,根据国立卫生研究院(NIH)提供的第R01GM095881号拨款进行。政府享有本发明的某些权利。
发明的领域
总的来说,本发明是在DNA合成以及调控领域的发明。
发明的背景
RNA广泛地参与基因表达和调控,尤其是基因转录、mRNA成熟、细胞内基因转译等方面(Fire等人,1998年;Mello和Conte,2004年;Ma等人,2005年;Macrae等人,2006年;Sudarsan等人,2006年;Cheah等人,2007年;Nagano等人,2008年;Quo等人,2010年;Heo和Sung,2011年;Wiedenheft等人,2012年)。这些观察结果与RNA世界假说(Gesteland等人,2006年),及核糖体RNA和肽基转移核酶等RNA的功能保护是一致的(Nissen等人,2000年;Harms等人,2001年;Agmon,2009年;Fox等人,2012年)。然而,尽管在原核生物和真核生物中DNA合成受到高度调控,但目前尚不清楚RNA是否能直接影响体外和体内的DNA聚合与合成(Nishitani和Lygerou,2002年;Paulsson和Chattoraj,2006年)。
由于dNTP存在于细胞中,调控DNA前体(dNTP)的可得到性和数量水平被认为是调控DNA合成的主要方法(Ji和Mathews,1991年;Chabes和Stillman,2007年;Rampazzo等人,2010年;Gon等人,2011年;Niida等人,2011年)。dNTP的不适当数量和不平衡性,可能会妨碍DNA聚合,并影响DNA的准确性,导致突变、基因组不稳定,甚至细胞死亡(Elledge和Davis,1990年;Mathews和Ji,1992年;Zhao等人,1998年;Mathews,2006年)。因此,严格调控dNTP的数量水平有助于在细胞内调节DNA的合成。
本发明旨在提供RNA抑制DNA合成的方法和其复合物组分,及通过抑制DNA合成来抑制细胞及细胞生长的方法和及该方法中的组分。本发明还提供了通过抑制DNA合成来抑制癌细胞及癌细胞生长,达到治疗癌症目的的方法及该方法中的组分。
发明的简要总结
在细胞内抑制DNA合成的方法和复合物组分在此公开。该方法包括将RNA和细胞接触。RNA可以是任何RNA,如细胞RNA、细胞信使mRNA、细胞核糖体rRNA、细胞转移核糖核酸tRNA、合成RNA、重组RNA、修饰的RNA及其组合。RNA可以是一个复杂的序列混合物,单一序列,或任何序列之间的混合物。RNA可以是各种长度的片段、类似长度的片段、长片段、短片段,或其组合。RNA可以有足够的数量以便减少或抑制细胞中的DNA合成。
公开的RNA抑制DNA合成作用可用于如分析法等方法中,作为研究工具影响所研究的细胞、细胞培养中同步化细胞周期,及抑制细胞生长。
在一些方法步骤组分条件下,细胞可以是个体身上的细胞。在一些方法步骤组分条件下,抑制细胞的DNA合成可以抑制细胞。在一些方法步骤组分条件下,细胞可以是癌细胞。在一些方法步骤组分条件下,抑制癌细胞的DNA合成可以抑制癌症细胞。在一些方法步骤组分条件下,抑制细胞的DNA合成可以抑制细胞的生长。在一些方法步骤组分条件下,抑制细胞的DNA合成可以抑制细胞的复制。在一些方法步骤组分条件下,抑制细胞的DNA合成可以杀死细胞。在一些方法步骤组分条件下,RNA可以提供给个体。在一些情况下,RNA被用来接触并进攻细胞。
在一些方法步骤组分条件下,RNA序列复杂度是1,000或更多,是10,000或更多,是100,000或更多。在一些方法步骤组分条件下,RNA序列复杂度是1,000或更少,是100或更少,是10或更少。在一些方法步骤组分条件下,RNA的序列可以与细胞同源。在一些方法步骤组分条件下,RNA不功能性地编码蛋白质。
在一些方法步骤组分条件下,RNA可以存在于复合物组分中。在一些方法步骤组分条件下,该复合物组分也可以包括医药上可接受的载体。在一些方法步骤组分条件下,该复合物组分也可以包括靶向性分子。在一些方法步骤组分条件下,靶向性分子可以是肿瘤靶向性多肽。
我们在此公开癌症的治疗方法和复合物组分。这个方法也包括给患癌症个体提供含有RNA,靶向性分子,和医药上可接受的载体的复合物。在一些方法步骤组分条件下,靶向性分子可以是肿瘤靶向性多肽。
在一些方法步骤组分条件下,复合物组分可包括RNA和医药上可接受的载体。在一些方法步骤组分条件下,复合物组分可包括RNA、靶向性分子和医药上可接受的载体。在一些方法步骤组分条件下,复合物组分可包括RNA、靶向性分子和医药上可接受的载体,其中靶向性分子是肿瘤靶向性多肽。
下文将介绍所公开方法和复合物组分的其他优越性,从阅读中也可以理解到其优越性,还可从实践该方法和复合物组分中感受其优越性。该方法和复合物组分的优越性可以通过运用该专利权项得以实现。要明白上述的整体性描述和以下的详细描述和解释仅是为该发明提供范例和注解,并不成为该发明的限制。
附图简要描述
附图并入本专利申请中,并构成本专利申请的一部分,用于说明所公开方法及复合物组分的多个实施例,并解释所公开方法及复合物组分的原则。
图1展示在有或没有RNA存在下,DNA合成与脱氧核苷三磷酸浓度的关系。
图2展示外源DNA聚合酶和细胞RNA对细胞DNA合成以及细胞生长的抑制机理。
图3A、3B和3C展示与DNA聚合酶结合的脱氧核苷三磷酸的结构及DNA聚合酶脱氧核糖核苷三磷酸二磷酸酶活性的反应机理。(a)肌苷三磷酸焦磷酸酶(或二磷酸酶)和ITP复合物的活性位点(PDB ID:2Q16)。(b)ddATP结构结合到DNA聚合酶活性位点(PDB ID:3EZ5)的顺序及dNTPs二磷酸水解酶水解dATP的结构模型(dATP与攻击性水分子是蓝绿色的)。在DNA聚合酶结构中(PDB ID:3EZ5),金属离子和配位水分子分别用淡蓝色和红色球体表示;(c)在存在RNA的条件下,DNA聚合酶转化为dNTPs二磷酸水解酶的机制。可激活水分子或3'-HO,作为亲核试剂攻击参入的dNTP。释放焦磷酸盐,作为每个反应的副产物。途 径I:水分子活化使得dNTP水解,然后攻击α位点上参入的dNTP。途径II:3'-OH活化使得dNTP聚合,然后攻击α位点上参入的dNTP。
发明专利的详细说明
参照下面具体实施例的详细描述和其所包含的例子和附图,及前文和下文的描述,更容易理解所公开的方法和复合物组分。
RNA广泛地参与基因表达调控,尤其是基因转录、mRNA成熟、细胞内基因转译等方面。然而,目前还不知道RNA是否可以直接参与调节DNA聚合和复制。在原核生物和真核生物中,DNA合成是一个受高度调控的过程。调控DNA前体(dNTP)的可得到性被认为是调控DNA合成以及修复的主要方法。dNTPs的不适当数量和不平衡性,可能会妨碍DNA聚合(合成)和准确性,导致突变,基因组不稳定,甚至细胞死亡。由于dNTP在细胞中的持续存在,严格控制dNTP有助于抑制细胞周期的S期之前和之后DNA的随意合成,其中RNA浓度可能会高于S期的RNA浓度。我们首先发现在RNA的存在下DNA聚合酶有新的活性,使DNA聚合酶转化为三磷酸脱氧苷二磷酸水解酶(dNTPs二磷酸水解酶)或焦磷酸酶。与DNA聚合酶结合后,RNA将其转化为酶,可把dNTP水解为dNMP和焦磷酸。聚合酶转换和dNTPs二磷酸水解酶活性产生的dNTP水解,都可以抑制DNA聚合。这是首次观察到RNA干扰DNA聚合酶的活性以及DNA聚合。
癌细胞几乎一直处于DNA合成模式(或S期),DNA前体(dNTP)的数量对肿瘤生长非常关键。我们目前发现的抑制dNTP可得到性的方法普遍应用于显著抑制癌症DNA的合成,从而抑制肿瘤细胞增殖。用序列非特异性RNA来抑制dNTP的仿真方法,能帮助研发在细胞内能够稳定表达的药物RNA分子,并能把药物RNA选择性地送入癌细胞内,以便产生特异性的抗肿瘤活性。由于基于RNA的DNA聚合酶抑制和活性转换的方法广泛适用于各种细胞;因此,当RNA分子用于治疗各种癌症时,这些RNA分子将具有广谱抑制癌症的能力。
其它用于干扰RNA的方法有完全不同的细胞生长抑制机制。他们通过与mRNA特异性结合(或封阻)及水解来使mRNA失活,以抑制蛋白质合成。我们披露的方法考虑一种更深层面上的策略(或称抑制性RNA),以便抑制DNA合成,从而防止细胞生长。
DNA合成和修复可以选择性地被所披露的DNA合成抑制性RNA抑制。通过偶联RNA与能识别特定蛋白质的化合物,如出现在不同细胞周期、癌细胞和(或)肿瘤,和(或)癌症发展不同阶段的特异性蛋白质,所披露的RNA可靶向拟抑制的细胞。所披露的复合物组分可用于治疗疾病和研究细胞及细胞生理学,如影响特定的靶细胞或细胞阶段。
这里公开的方法和复合物组分可以用来抑制细胞中DNA的合成。该方法包括将RNA和细胞接触。RNA可以是任何RNA,如细胞RNA、细胞信使mRNA、细胞核糖体rRNA、细胞转移核糖核酸tRNA、合成RNA、重组RNA、修饰的RNA及其组合。RNA可以是一个复杂的序列混合物、单一序列或任何序列之间的混合物。RNA可以是各种长度的片段、类似长度的片段、长片段、短片段,或其组合。RNA可以有足够的数量以便减少或抑制细胞中的DNA合成。本发明使用的“完整的细胞”系指在未分级细胞中发现或可从未分级细胞隔离的大部分或所有材料或成分产生或相关的材料或成分。换言之,无需采取任何特殊措施从其他细胞中分级某些成分也可产生完整的细胞成分。
公开的RNA抑制DNA合成作用可用于如分析法等方法中,作为研究工具影响所研究的细胞、细胞培养中同步化细胞周期,及抑制细胞生长。
在一些方法步骤组分条件下,细胞可以是个体身上的细胞。在一些方法步骤组分条件下,抑制细胞的DNA合成可以抑制细胞。在一些方法步骤组分条件下,细胞可以是癌细胞。在 一些方法步骤组分条件下,抑制癌细胞的DNA合成可以抑制癌症细胞。在一些方法步骤组分条件下,抑制细胞的DNA合成可以抑制细胞的生长。在一些方法步骤组分条件下,抑制细胞的DNA合成可以抑制细胞的复制。在一些方法步骤组分条件下,抑制细胞的DNA合成可以杀死细胞。在一些方法步骤组分条件下,RNA可以提供给个体。在一些情况下,RNA被用来接触并进攻细胞。
在一些方法步骤组分条件下,RNA序列复杂度是1,000或更多,是10,000或更多,是100,000或更多。在一些方法步骤组分条件下,RNA序列复杂度是1,000或更少,是100或更少,是10或更少。在一些方法步骤组分条件下,RNA的序列可以与细胞同源。在一些方法步骤组分条件下,RNA不功能性地编码蛋白质。
在一些方法步骤组分条件下,RNA可以存在于复合物组分中。在一些方法步骤组分条件下,该复合物组分也可以包括医药上可接受的载体。在一些方法步骤组分条件下,该复合物组分也可以包括靶向性分子。在一些方法步骤组分条件下,靶向性分子可以是肿瘤靶向性多肽。
我们在此公开癌症的治疗方法和复合物组分。这个方法也包括给患癌症个体提供含有RNA,靶向性分子,和医药上可接受的载体的复合物。在一些方法步骤组分条件下,靶向性分子可以是肿瘤靶向性多肽。
在一些方法步骤组分条件下,复合物组分可包括RNA和医药上可接受的载体。在一些方法步骤组分条件下,复合物组分可包括RNA、靶向性分子和医药上可接受的载体。在一些方法步骤组分条件下,复合物组分可包括RNA、靶向性分子和医药上可接受的载体,其中靶向性分子是肿瘤靶向性多肽。
要明白上述公开的方法和复合物组分是可以调整的,并不仅仅局限于特殊的合成方法、特殊的分析手段或特殊的试剂(除非特别提出)。也要明白此处使用的各种术语仅用于描述具体实施例,不能成为该方法和复合物组分及其应用的限制。
本发明公开了可用于所公开的方法和复合物组分,或与其结合使用,或用于准备所述方法和复合物组分的材料、复合物组分及成分,或所述方法和复合物组分的产物。本发明还公开了所述及其他材料;需明白当公开所述材料的组合、子集、交互及群组时,虽然未明确公开所述化合物的各种个体和集体组合及排列的特定参考,但本发明专门考虑并描述了上述各项。例如,若公开讨论了RNA,并讨论了可对RNA等大量分子进行的许多修饰,则专门考虑了RNA的所有组合和排列及可能的修饰,除非另有专门说明。因此,若公开了一类分子A、B和C及另一类分子D、E和F,还公开了A—D的组合分子示例,则即使没有进行单独列举,但本发明考虑了上述组合的个体和集体。因此,就这个例子而言,专门分别考虑了组合A—E、A—F、B—D、B—E、B—F、C—D、C—E及C—F,还宜视为公开了A、B及C;D、E及F;以及A—D的组合示例。此外,上述考虑和公开的每种材料、复合物组分和成分等,还可专门单独包括或排除在所述材料的任何基团、亚群和清单中。所述概念适用于本发明的各个方面,包括但不限于制备和使用公开复合物组分的方法步骤。因此,若可能进行各种附加步骤,需明白在所公开方法的任何具体实施例或其组合中可以进行每个附加步骤,专门考虑并视为公开了每个所述组合。
A.核糖核酸
公开的组合物组分和方法将核糖核酸(RNA)用作影响DNA聚合酶活性、细胞生长及细胞周期的活性成分。RNA可以是任何RNA,如细胞RNA、细胞信使mRNA、细胞核糖体rRNA、细胞转移核糖核酸tRNA、合成RNA、重组RNA、修饰的RNA及其组合。RNA的核苷酸碱基序列为非特异性序列,可将RNA用作影响DNA聚合酶活性、细胞生长和细胞 周期的活性成分,换言之,RNA的化学性质和化学结构产生所述效果,而不是RNA的任何特异性核苷酸序列。因此,一般来说RNA的核苷酸序列用于公开的复合物组分和方法是不重要的。然而,使用缺乏某些或所有序列特异性性能或功能的RNA可能是有用的。例如,RNA可以缺乏转化起始、转化终止、特异性结合核糖体rRNA或核糖体蛋白质、特异性结合氨基酰转移酶、miRNA、snRNA及siRNA特异性功能等功能序列。在一些方法步骤组分条件下,使用具有某些序列特异性性能或功能的RNA可能是有用的。例如,使用具有siRNA功能的RNA可能有利于提供两种或多种RNA功能,作用于细胞、组织和含RNA的个体。
公开复合物组分和方法所用的RNA可以具有任何序列、长度和复杂度。我们发现RNA对DNA聚合酶的作用不取决于所述特征。相反,RNA对DNA聚合酶的作用取决于DNA聚合酶接触的RNA的数量。
RNA可以是自然RNA或来源于自然源的RNA。例如,RNA可以是细胞RNA、细胞信使mRNA、细胞核糖体rRNA、细胞转移核糖核酸tRNA、合成RNA、重组RNA、修饰的RNA及其组合。通常,可以使用从细胞和组织分离的RNA,不管存在的RNA的比例或不同种类和序列组合。这可用于合成和制备前述公开复合物组分和方法所用的RNA。然而,在使用前,还可以加工、修改、分级、细分自然RNA。在某些实施例中,可专门或优先使用特定片段和种类的RNA。分离和分级不同种类RNA的技术是已知的,可用于合成公开的RNA。
本发明使用的“自然RNA”系指存在于、分离或直接衍生自细胞内自然产生RNA的RNA。术语“自然RNA”不包括体外合成RNA,及重组产生的RNA。体外合成或重组或人工产生的、具有或匹配自然RNA序列的RNA,不得视为本发明所指的“自然RNA”。
RNA可以是人工RNA。本发明使用的“人工RNA”系指不存在于、分离或直接衍生自细胞内自然产生RNA的RNA。术语“人工RNA”包括体外合成的RNA及重组产生的RNA。体外合成或重组或人工产生的、具有或匹配自然RNA序列的RNA,被视为本发明所指的“人工RNA”。因此,术语“人工RNA”不排除具有或匹配自然RNA序列,但在体外合成的及重组产生的RNA。
RNA可以是合成RNA。本发明使用的“合成RNA”系指体外合成的RNA。合成作用可以是化学的、酶催化的合成或其组合。在某些实施例中,优选酶催化合成。术语“合成RNA”不包括重组产生的RNA。具有或匹配自然RNA序列,但合成产生的RNA被视为本发明所指的“合成RNA”。
RNA可以是修饰的RNA。本发明使用的“修饰的RNA”系指至少包含一种核苷酸类似物或替代物的核酸。核苷酸类似物为含有某种修饰的碱基、糖基或磷酸基的核苷酸。核苷酸替代物是磷酸基和(或)糖基被替换的核苷酸或核苷酸类似物。本发明其他部门详细说明了修饰的RNA、核苷酸类似物和核苷酸替代物。
RNA可以是重组RNA。本发明使用的“重组RNA”系指在通过酶催化作用,从细胞内或体外通过酶催化作用重组或人工形成中产生的RNA。在某些实施例中,优选体外重组产生的RNA。术语“重组RNA”不包括合成产生的RNA。具有或匹配自然RNA序列,但重组产生的RNA被视为本发明所指的“重组RNA”。
自然RNA、人工RNA、合成RNA和重组RNA可单独使用,或以任何组合形式使用。在某些实施例中,优选一种类型和来源的RNA。
RNA可以是一个复杂的序列混合物、单一序列或任何序列之间的混合物。例如,RNA可以是细胞RNA、具有相同序列的RNA、具有两种或更多不同序列的一组RNA分子,或其组合。通常,细胞RNA和细胞信使mRNA是具有多种不同序列的RNA分子复杂的不均匀混合物。通常,细胞核糖体rRNA和细胞转移核糖核酸tRNA是具有多种不同序列的RNA分子不复杂的不均匀混合物。
核酸混合物中不同核苷酸序列的数量通常描述为核算混合物的复杂度。通常用核酸混合物中存在的单一序列核苷酸的总长来说明核酸的复杂度。细胞RNA由细胞中产生的各种RNA分子组成,因此具有较高的复杂度。本发明使用的核酸(如RNA分子)或核酸混合物(如RNA分子混合物)的复杂度系指RNA的动力学复杂度。动力学复杂度被定义为确保每种核苷酸序列在核酸混合物中仅出现一次所需的核苷酸中测量得到的核酸数量。除非本发明另有说明,核酸或RNA复杂度系指动力学复杂度。
在一些方法步骤组分条件下,RNA的序列复杂度可能是10或更多、100或更多、1,000或更多、10,000或更多,或100,000或更多。在一些方法步骤组分条件下。RNA的序列复杂度可能是10,000或更少、1,000或更少、100或更少,或10.
在一些方法步骤组分条件下,RNA的序列复杂度可能是从6至10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100、125、150、175、200、300、400、500、750、1,000、2,000、3,000、4,000、5,000、7,500、10,000、20,000、30,000、40,000、50,000、75,000或100,000。在一些方法步骤组分条件下,RNA的序列复杂度可能是从10至15、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100、125、150、175、200、300、400、500、750、1,000、2,000、3,000、4,000、5,000、7,500、10,000、20,000、30,000、40,000、50,000、75,000或100,000。在一些方法步骤组分条件下,RNA的序列复杂度可能是从15至20、25、30、40、50、60、70、80、90、100、125、150、175、200、300、400、500、750、1,000、2,000、3,000、4,000、5,000、7,500、10,000、20,000、30,000、40,000、50,000、75,000或100,000。在一些方法步骤组分条件下,RNA的序列复杂度可能是从20至25、30、40、50、60、70、80、90、100、125、150、175、200、300、400、500、750、1,000、2,000、3,000、4,000、5,000、7,500、10,000、20,000、30,000、40,000、50,000、75,000或100,000。在一些方法步骤组分条件下,RNA的序列复杂度可能是从30至40、50、60、70、80、90、100、125、150、175、200、300、400、500、750、1,000、2,000、3,000、4,000、5,000、7,500、10,000、20,000、30,000、40,000、50,000、75,000或100,000。在一些方法步骤组分条件下,RNA的序列复杂度可能是从50至60、70、80、90、100、125、150、175、200、300、400、500、750、1,000、2,000、3,000、4,000、5,000、7,500、10,000、20,000、30,000、40,000、50,000、75,000或100,000。在一些方法步骤组分条件下,RNA的序列复杂度可能是从60至70、80、90、100、125、150、175、200、300、400、500、750、1,000、2,000、3,000、4,000、5,000、7,500、10,000、20,000、30,000、40,000、50,000、75,000或100,000。在一些方法步骤组分条件下,RNA的序列复杂度可能是从80至90、100、125、150、175、200、300、400、500、750、1,000、2,000、3,000、4,000、5,000、7,500、10,000、20,000、30,000、40,000、50,000、75,000或100,000。在一些方法步骤组分条件下,RNA的序列复杂度可能是从90至100、125、150、175、200、300、400、500、750、1,000、2,000、3,000、4,000、5,000、7,500、10,000、20,000、30,000、40,000、50,000、75,000或100,000。在一些方法步骤组分条件下,RNA的序列复杂度可能是从100至125、150、175、200、300、400、500、750、1,000、2,000、3,000、4,000、5,000、7,500、10,000、20,000、30,000、40,000、50,000、75,000或100,000。在一些方法步骤组分条件下,RNA的序列复杂度可能是从125 至150、175、200、300、400、500、750、1,000、2,000、3,000、4,000、5,000、7,500、10,000、20,000、30,000、40,000、50,000、75,000或100,000。在一些方法步骤组分条件下,RNA的序列复杂度可能是从150至175、200、300、400、500、750、1,000、2,000、3,000、4,000、5,000、7,500、10,000、20,000、30,000、40,000、50,000、75,000或100,000。在一些方法步骤组分条件下,RNA的序列复杂度可能是从175至200、300、400、500、750、1,000、2,000、3,000、4,000、5,000、7,500、10,000、20,000、30,000、40,000、50,000、75,000或100,000。在一些方法步骤组分条件下,RNA的序列复杂度可能是从200至300、400、500、750、1,000、2,000、3,000、4,000、5,000、7,500、10,000、20,000、30,000、40,000、50,000、75,000或100,000。在一些方法步骤组分条件下,RNA的序列复杂度可能是从400至500、750、1,000、2,000、3,000、4,000、5,000、7,500、10,000、20,000、30,000、40,000、50,000、75,000或100,000。在一些方法步骤组分条件下,RNA的序列复杂度可能是从500至750、1,000、2,000、3,000、4,000、5,000、7,500、10,000、20,000、30,000、40,000、50,000、75,000或100,000。在一些方法步骤组分条件下,RNA的序列复杂度可能是从750至1,000、2,000、3,000、4,000、5,000、7,500、10,000、20,000、30,000、40,000、50,000、75,000或100,000。在一些方法步骤组分条件下,RNA的序列复杂度可能是从1,000至2,000、3,000、4,000、5,000、7,500、10,000、20,000、30,000、40,000、50,000、75,000或100,000。在一些方法步骤组分条件下,RNA的序列复杂度可能是从3,000至4,000、5,000、7,500、10,000、20,000、30,000、40,000、50,000、75,000或100,000。在一些方法步骤组分条件下,RNA的序列复杂度可能是从4,000至5,000、7,500、10,000、20,000、30,000、40,000、50,000、75,000或100,000。在一些方法步骤组分条件下,RNA的序列复杂度可能是从5,000至7,500、10,000、20,000、30,000、40,000、50,000、75,000或100,000。在一些方法步骤组分条件下,RNA的序列复杂度可能是从7,500至10,000、20,000、30,000、40,000、50,000、75,000或100,000。在一些方法步骤组分条件下,RNA的序列复杂度可能是从10,000至20,000、30,000、40,000、50,000、75,000或100,000。在一些方法步骤组分条件下,RNA的序列复杂度可能是从20,000至30,000、40,000、50,000、75,000或100,000。在一些方法步骤组分条件下,RNA的序列复杂度可能是从30,000至40,000、50,000、75,000或100,000。在一些方法步骤组分条件下,RNA的序列复杂度可能是从50,000至75,000或100,000。在一些方法步骤组分条件下,RNA的序列复杂度可能是从75,000至100,000。
所用RNA分子的长度并不重要。RNA可以是各种长度的片段、类似长度的片段、长片段、短片段,或其组合。例如,RNA分子可以是6、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100、125、150、175、200、300、400、500、750或1,000长的核苷酸。例如,这可以是RNA分子的平均或中位数长度。在一些方法步骤组分条件下,RNA分子可以是从6至10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100、125、150、175、200、300、400、500、750或1,000长的核苷酸。在一些方法步骤组分条件下,RNA分子可以是从10至15、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100、125、150、175、200、300、400、500、750或1,000长的核苷酸。在一些方法步骤组分条件下,RNA分子可以是从15至20、25、30、40、50、60、70、80、90、100、125、150、175、200、300、400、500、750或1,000长的核苷酸。在一些方法步骤组分条件下,RNA分子可以是从20至25、30、40、50、60、70、80、90、100、125、150、175、200、300、400、500、750或1,000长的核苷酸。在一些方法步骤组分条件下,RNA分子可以是从30至40、50、60、70、80、90、100、125、150、175、200、300、400、500、750或1,000长的核苷酸。在一些方法步骤组分条件下,RNA分子可以是从50至60、70、80、90、100、125、150、175、200、300、400、500、750或1,000长的核苷酸。在一些方法步骤组分条件下,RNA分子可以是从60至70、80、90、100、125、150、175、200、300、400、 500、750或1,000长的核苷酸。在一些方法步骤组分条件下,RNA分子可以是从80至90、100、125、150、175、200、300、400、500、750或1,000长的核苷酸。在一些方法步骤组分条件下,RNA分子可以是从90至100、125、150、175、200、300、400、500、750或1,000长的核苷酸。在一些方法步骤组分条件下,RNA分子可以是从100至125、150、175、200、300、400、500、750或1,000长的核苷酸。在一些方法步骤组分条件下,RNA分子可以是从125至150、175、200、300、400、500、750或1,000长的核苷酸。在一些方法步骤组分条件下,RNA分子可以是从150至175、200、300、400、500、750或1,000长的核苷酸。在一些方法步骤组分条件下,RNA分子可以是从175至200、300、400、500、750或1,000长的核苷酸。在一些方法步骤组分条件下,RNA分子可以是从200至300、400、500、750或1,000长的核苷酸。在一些方法步骤组分条件下,RNA分子可以是从400至500、750或1,000长的核苷酸。在一些方法步骤组分条件下,RNA分子可以是从500至750或1,000长的核苷酸。在一些方法步骤组分条件下,RNA分子可以是从750至1,000长的核苷酸。
优选复杂度在6至30核苷酸、由单一种类的RNA分子(及RNA分子具有相同长度和序列)组成的RNA。
RNA可以有足够的数量以便减少或抑制细胞中的DNA合成。例如,RNA可以从约1ng/kg至约1g/kg。可基于主体内约一半RNA数量的因子、达到靶细胞或组织的RNA百分比或数量,及靶细胞中RNA作用于DNA合成的效果等调节RNA数量。
在一些方法步骤组分条件下,RNA可以主要包括同源序列细胞。本发明使用的“同源序列细胞”系指存在于相关细胞的自然RNA或DNA内的序列。与细胞同源的RNA可以是自然RNA、人工RNA、合成RNA、修饰的RNA或重组RNA。因此,与细胞同源系指存在于RNA内的序列,而不是产生RNA的方式。
在一些方法步骤组分条件下,RNA不功能性地编码蛋白质,这意味着RNA不包括大量开放解读码组、功能转化控制序列或因子,或其组合。
1.修饰的RNA
RNA可以是修饰的RNA或包括修饰的RNA。例如,公开的RNA由核苷酸、核苷酸类似物或核苷酸替代物组成。RNA主要由A、C、G和U组成。对于用于公开复合物组分和方法的RNA,由可减少RNA在细胞内的降解的核苷酸组成的RNA是有用的。
核苷酸是一种含碱基、糖基和磷酸基的分子。核苷酸可通过其磷酸基和糖基连在一起,形成核苷间环连。核苷酸的碱基可以是腺嘌呤-9-基(A)、胞嘧啶-1-基(C)、鸟嘌呤-9-基(G)、尿嘧啶-1-基(U)和胸腺嘧啶-1-基(T)。核苷酸糖基是核糖或脱氧核糖。核苷酸的磷酸基是五价磷酸盐。核苷酸的参考示例为3'-腺苷一磷酸(3'-AMP)或5'-鸟苷一磷酸(5'-GMP)。现有技术和本发明中可使用很多不同所述类型的分子。
已知很多修饰的核苷酸,且可以用于本发明公开的RNA。核苷酸类似物是含有某种修饰的碱基、糖基或磷酸基的核苷酸。现有技术较好地了解了核苷酸修饰物,例如,其可能包括5-甲基胞嘧啶(5-Me-C)、5-羟甲基胞嘧啶、黄嘌呤、次黄嘌呤和2-氨基腺嘌呤,及糖基或磷酸基修饰物。碱基修饰物可能包括自然及合成的A、C、G和T/U修饰物及不同嘌呤或嘧啶碱基,如尿嘧啶-5-基、次黄嘌呤-9-基(I)和2-氨基腺嘌呤-9-基。修饰碱基包括但不限于5-甲基胞嘧啶(5-me-C)、5-羟甲基胞嘧啶、黄嘌呤、次黄嘌呤、2-氨基腺嘌呤、腺嘌呤和鸟嘌呤的6-甲基和其他烷基衍生物、腺嘌呤和鸟嘌呤的2-丙基和其他烷基衍生物、2-硫尿嘧啶、2-代胸腺嘧啶和2-巯基胞嘧啶、5-卤代尿嘧啶和胞嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶和胞嘧啶、6-偶氮尿嘧啶、胞嘧啶和胸腺嘧啶、5-尿嘧啶(假尿嘧啶)、4-硫尿嘧啶、8-halo、8-氨基、8-硫醇、8-硫代烷基、8-羟基和其他8-替代的腺嘌呤和鸟嘌呤、5-halo,尤其是5-溴、5-三氟甲基和其他5-替代的尿嘧啶和胞嘧啶、7-甲基尿嘧啶和7-甲基腺嘧啶、8-氮鸟嘌呤和8-氮杂腺嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤和7-脱氮杂腺嘌呤,及3-脱氮鸟嘌呤和3-脱氮杂腺嘌呤。其他碱基修饰物可在德国应用化学国际版1991年刊载(30,613)的Englisch等人的美国专利(专利号:3,687,808)和CRC出版社1993年刊登的Sanghvi,Y.S.所著、Crooke,S.T.和Lebleu,B.编辑的第289-302页第15章“反义的研究与应用”中查询。某些核苷酸类似物,如5-替代的嘧啶、6-氮杂嘧啶类化合物及N-2,N-6和O-6替代的嘌呤,包括2-氨基丙基腺嘌呤、5-丙炔基尿嘧啶和5-丙炔基胞嘧啶。5-甲基胞嘧啶可增加二聚体形成的稳定性。其他修饰碱基可作为通用碱基。通用碱基包括3-硝基吡咯和5-硝基吲哚。通用碱基代替正常碱基,但不偏离碱基配对。换言之,通用碱基可以是含其他碱基的碱基对。碱基修饰物通常与糖基修饰物结合,如2'-O-甲氧乙基,实现增加二聚体稳定性等特殊性能。专利号分别为4,845,205、5,130,302、5,134,066、5,175,273、5,367,066、5,432,272、5,457,187、5,459,255、5,484,908、5,502,177、5,525,711、5,552,540、5,587,469、5,594,121、5,596,091、5,614,617和5,681,941的美国专利详细描述了一系列碱基修饰物。特此将其全部内容并入本文作为参考,尤其是描述碱基修饰物及其合成、使用和并入寡核苷酸和核酸等方面的内容。
核苷酸类似物还包括糖基修饰物。糖基修饰物包括核糖和脱氧核糖的自然修饰物及合成修饰物,如糖基-锁核酸。糖基修饰物包括但不限于在2'位点上的以下修饰物:OH;F;O-、S-、Se-、或N-烷基;O-、S-、Se-或N-烯基;O-、S-、Se-或N-炔基;或O-烷基-O-烷基,其中烷基、烯基和炔基可被Cl至C10、烷基或C2至C10烯基和炔基代替或不被代替。2'糖基修饰物还包括但不限于-O[(CH2)n O]m CH3、-O(CH2)n OCH3、-O(CH2)n NH2、-O(CH2)n CH3、-O(CH2)n-ONH2和-O(CH2)nON[(CH2)n CH3)]2,其中n和m为从1至10的数。
在2'位点上的其他修饰物包括但不限于:C1至C10低级烷基、替代的低级烷基、烷芳基、芳烷基、O-烷芳基或O-芳烷基、SH、SCH3、SeCH3、OCN、Cl、Br、CN、CF3、OCF3、SOCH3、SO2CH3、SeOCH3、SeO2CH3、ONO2、NO2、N3、NH2、杂环烷基、杂环烷芳基、氨基烷基氨基、聚烷基氨基、替代的甲硅烷基、RNA裂开基团、信息基团、嵌入剂、改善寡核苷酸药代动力学性能的基团,或改善寡核苷酸药效的基团,及其他具有类似性能的替代物。类似修饰还可在糖基其他位点进行,尤其是3'端核苷酸上糖基3'位点,或2'-5'连接的寡核苷酸,及5'端核苷酸的5'位点。修饰糖基还可能包括在桥接环氧位置上修饰物的糖基,如CH2和S。核苷酸糖类似物还具有糖类似物,如环丁基代替戊呋喃糖。由大量美国专利公开了所述修饰糖基结构物的制备方法,如专利号分别为4,981,957、5,118,800、5,319,080、5,359,044、5,393,878、5,446,137、5,466,786、5,514,785、5,519,134、5,567,811、5,576,427、5,591,722、5,597,909、5,610,300、5,627,053、5,639,873、5,646,265、5,658,873、5,670,633和5,700,920的专利,特此将其全部内容并入本文作为参考,尤其是描述修饰糖基结构物及其合成、使用和并入核苷酸、寡核苷酸和核酸等方面的内容。
核苷酸类似物还可在磷酸基上进行修饰。修饰磷酸基包括但不限于可通过修饰使得两个核苷酸之间的环连含硫代磷酸酯、手性硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、氨烷基磷酸三酯、甲基和其他烷基磷酸酯,包括3'-亚烃基膦酸酯和手性磷酸酯、次磷酸基、氨基磷酸酯,包括3'-氨基磷酰胺和氨基磷酸烷基酯、硫羰基氨基磷酸酯、硫羰基磷酸烷基酯、硫羰基烷基磷酸三酯和硼烷磷酸酯。需明白所述磷酸盐或两种核苷酸之间修饰的磷酸盐环连可通过3'-5' 环连或2'-5'环连,且所述环连可能含有反向极性,如3'-5'至5'-3'或2'-5'至5'-2'。还包括各种盐、混合盐和游离酸。大量美国专利公开了制备和使用含修饰的磷酸酯的核苷酸的方法,包括但不限于专利号为3,687,808、4,469,863、4,476,301、5,023,243、5,177,196、5,188,897、5,264,423、5,276,019、5,278,302、5,286,717、5,321,131、5,399,676、5,405,939、5,453,496、5,455,233、5,466,677、5,476,925、5,519,126、5,536,821、5,541,306、5,550,111、5,563,253、5,571,799、5,587,361和5,625,050的专利,特此将其全部内容并入本文作为参考,尤其是描述修饰磷酸基及其合成、使用和并入核苷酸、寡核苷酸和核酸等方面的内容。
需明白核苷酸类似物仅需含单一修饰物,但还可在一种基团或不同基团之间含多种修饰物。
核苷酸替代物为功能和特性类似于核苷酸的分子,但不包括磷酸基,如肽核酸(PNA)。核苷酸替代物为将以沃森-克里克或Hoogsteen方式识别互补的核酸并与其杂交(碱基对)的分子,但所示分子通过磷酸基以外的其他集团环连在一起。核苷酸替代物在与适当靶向核酸相互作用时还能匹配双螺旋结构。
核苷酸替代物为磷酸基和(或)糖基被替代的核苷酸或核苷酸类似物。核苷酸替代物不含标准的磷原子。例如,磷酸盐替代物可以是短链烷基或环烷基核苷间环连、混合杂原子和烷基或环烷基核苷间环连,或一种或多种短链杂原子或杂环核苷间环连。这些包括具有吗啉代环连(部分由核苷酸的糖部分形成);硅氧烷主链;硫化物、亚砜和砜主链;甲酰基和硫代甲酰基主链;亚甲基甲酰基和硫代甲酰基主链;含主链的烯烃;氨基磺酸盐主链;甲基氨基和亚甲基肼基主链;磺酸盐和磺酰胺主链;酰胺主链和其他具有混合N、O、S和CH2成分的替代物。大量美国专利公开了制备和使用所述类型的磷酸盐替代物的方法,包括但不限于专利号为5,034,506、5,166,315、5,185,444、5,214,134、5,216,141、5,235,033、5,264,562、5,264,564、5,405,938、5,434,257、5,466,677、5,470,967、5,489,677、5,541,307、5,561,225、5,596,086、5,602,240、5,610,289、5,602,240、5,608,046、5,610,289、5,618,704、5,623,070、5,663,312、5,633,360、5,677,437和5,677,439的专利,特此将其全部内容并入本文作为参考,尤其是描述磷酸基替代物及其合成、使用和并入核苷酸、寡核苷酸和核酸等方面的内容。
还需明白核苷酸替代物的糖基和磷酸基均可由酰胺类环连(氨乙基甘氨酸)(PNA)等进行替代。美国专利(专利号:5,539,082、5,714,331和5,719,262)公开了制备和使用PNA分子的方法,特此将其全部内容并入本文作为参考。见Nielsen等人,科学254:1497-1500(1991年)。
公开的RNA可由不同或相同种类的核苷酸组成。例如,RNA中的一种或多种核苷酸可以是核糖核苷酸、2'-O-甲基核糖核苷酸,或核糖核苷酸与2'-O-甲基核糖核苷酸的混合物;约10%至约50%的核苷酸可以为核糖核苷酸、2'-O-甲基核糖核苷酸,或核糖核苷酸与2'-O-甲基核糖核苷酸的混合物;约50%或更好的核苷酸可以是核糖核苷酸、2'-O-甲基核糖核苷酸,或核糖核苷酸与2'-O-甲基核糖核苷酸的混合物;或所有核苷酸为核糖核苷酸、2'-O-甲基核糖核苷酸,或核糖核苷酸与2'-O-甲基核糖核苷酸的混合物。所述RNA可称之为嵌合RNA。
B.靶向性分子
通过包括或结合靶向性分子或靶向多肽与RNA组分,可以靶向RNA组分,或相反,RNA组分可以靶向靶向性分子或靶向多肽。通过这种方式,RNA组分可以视为靶向靶向性分子或靶向多肽。为方便起见,除非另有说明,参考RNA组分或其他化合物或组分的靶向性,旨在说明RNA组分或其他化合物或组分包括或结合了适当的靶向性分子或靶向多肽。
靶向性分子可选择性地靶向肿瘤组织、损伤组织、再生组织、受伤部位、手术部位、血管生成部位、发炎部位、关节炎部位、肺组织、肺动脉高血压肺血管、肺动脉高血压损伤、重构的肺动脉,或肺胞间隙。RNA组分可选择性地靶向损伤组织、再生组织、受伤部位、手术部位、血管生成部位、发炎部位、关节炎部位、肺组织、肺动脉高血压肺血管、肺动脉高血压损伤、重构的肺动脉,或肺胞间隙。
例如,公开的RNA组分可靶向脑细胞、大脑干细胞、脑组织和(或)脑血管、肾脏细胞、肾脏干细胞、肾脏组织和(或)肾脏血管、皮肤细胞、皮肤干细胞、皮肤组织和(或)皮肤血管、肺细胞、肺组织和(或)肺血管、胰腺细胞、胰腺组织和(或)胰腺血管、肠道细胞、肠道组织和(或)肠道血管、肾上腺细胞、肾上腺组织和(或)肾上腺血管、视网膜细胞、视网膜组织和(或)视网膜血管、肝细胞、肝组织和(或)肝血管、前列腺细胞、前列腺组织和(或)前列腺血管、子宫内膜细胞、子宫内膜组织和(或)子宫内膜血管、卵巢细胞、卵巢组织和(或)卵巢血管、骨细胞、骨组织和(或)骨血管、骨髓细胞、骨髓组织和(或)骨髓血管、软骨细胞、软骨组织和(或)软骨血管、干细胞、胚胎干细胞、多能干细胞、诱导多能干细胞、成体干细胞、造血干细胞、神经干细胞、骨髓间充质干细胞、乳腺干细胞、内皮干细胞、成体嗅觉干细胞、神经嵴干细胞、癌症干细胞、血细胞、红细胞、血小板、白血球、粒细胞、中性粒细胞、嗜酸粒细胞、嗜碱粒细胞、淋巴样细胞、淋巴细胞、单核细胞、损伤血管、受损组织的血管、炎症组织的血管、粥样硬化斑块,或其组合。
人们熟知癌症和肿瘤的靶向疗法(Wu等人,癌症靶向治疗,癌症分子杂志2(2):57-66(2006年))。通常,肿瘤靶向性依赖于作为靶向含不同种类效应分子配体的设备的细胞表面上表达的肿瘤抗原。在所述方法中,药物可通过肿瘤特异性MoAbs或结合在肿瘤细胞内受体上的肽配体,主动靶向肿瘤。
众所周知靶向性分子和靶向多肽的示例。例如,有效的肿瘤靶向性多肽包括RGD、CAR、LyP-1、NGR和RGR多肽。原型肿瘤靶向性多肽是RGD。CAR具有肿瘤穿透性能。所述多肽在肿瘤内具有独特的靶向性;优选地,在肿瘤的缺氧/低营养区域累计多肽(Proc Natl AcadSci等人,自然医学8:751-755(2002年);Laakkonen等人,美国国家科学院院刊,101:9381-9386(2004年);Karmali等人,纳米医学,5:73-82(2009年))。CRGRRST(RGR;SEQ ID NO:185;Joyce等人,癌细胞4:393-403(2003年))是一种已成功用于靶向肿瘤内细胞因子抗体组合的多肽(Hamzah等人,临床研究杂志118:1691-1699,(2008年))。这种多肽是线状的,简化了合成。NGR多肽靶向血管生成的血管,包括患肿瘤的血管生成的血管、整合素av和a5pi(美国专利,专利号:6,576,239和6,177,542,及美国专利申请公开说明书,编号:20090257951)。
可使用肿瘤血管靶向多肽靶向肿瘤和癌症,如CNGRC(SEQ ID NO:9)何其他具有NGR序列的多肽(美国专利,专利号:6,177,542和6,576,239;美国专利申请公开说明书,编号:20090257951);RGD多肽和RGR多肽。其他肿瘤靶向性多肽包括CSRPRRSEC(SEQ ID NO:10)、CSRPRRSVC(SEQ ID NO:11)和CSRPRRSWC(SEQ ID NO:12)(Hoffman等人,癌症细胞,第4卷(2003))、F3(KDEPQRRSARLSAKPAPPKPEPKPKKAPAKK;(SEQ ID NO:13))、PQRRSARLSA(SEQID NO:14)、PKRRSARLSA(SEQ ID NO:15)(美国专利,专利号:7,544,767)和CGRECPRLCQSSC(SEQ ID NO:16)。
RGD多肽为含RGD(Arg-Gly-Asp)序列的多肽,靶向血管生产和肿瘤血管。NGR多肽为含NGR(Asn-Gly-Arg)序列的多肽,靶向血管生产和肿瘤血管。NGR多肽包括CNGRCVSGCAGRC(SEQ ID NO:17)、NGRAHA(SEQ ID NO:18)、CVLNGRMEC(SEQ ID NO: 19)和CNGRC(SEQ ID NO:20)。GSL多肽为含GSL(Gly-Ser-Leu)序列的多肽,靶向肿瘤血管。GSL多肽包括CGSLVRC(SEQ ID NO:21)和CLSGSLSC(SEQ ID NO:22)。
有效的NGR多肽包括X2CNGRCX2(SEQ ID NO:23)、CX2(C/X)NGR(C/X)X2C(SEQ IDNO:24)和CNGRCX6(SEQ ID NO:25)(其中“X”是任何氨基酸),可以是线状的或圆形的。NGR多肽包括CNGRCVSGCAGRC(SEQ ID NO:26)、NGRAHA(SEQ ID NO:27)、CVLNGRMEC(SEQ ID NO:28)、CNGRC(SEQ ID NO:29)、ALNGREESP(SEQ ID NO:30)、CVLNGRME(SEQ ID NO:31)、CKVCNGRCCG(SEQ ID NO:32)、CEMCNGRCMG(SEQ ID NO:33)、CPLCNGRCAL(SEQ ID NO:34)、CPTCNGRCVR(SEQ ID NO:35)、CGVCNGRCGL(SEQ ID NO:36)、CEQCNGRCGQ(SEQ ID NO:37)、CRNCNGRCEG(SEQ ID NO:38)、CVLCNGRCWS(SEQ ID NO:39)、CVTCNGRCRV(SEQ ID NO:40)、CTECNGRCQL(SEQ ID NO:41)、CRTCNGRCLE(SEQ ID NO:42)、CETCNGRCVG(SEQ ID NO:43)、CAVCNGRCGF(SEQ ID NO:44)、CRDLNGRKVM(SEQ ID NO:45)、CSCCNGRCGD(SEQ ID NO:46)、CWGCNGRCRM(SEQ ID NO:47)、CPLCNGRCAR(SEQ ID NO:48)、CKSCNGRCLA(SEQ ID NO:49)、CVPCNGRCHE(SEQ ID NO:50)、CQSCNGRCVR(SEQ ID NO:51)、CRTCNGRCQV(SEQ ID NO:52)、CVQCNGRCAL(SEQ ID NO:53)、CRCCNGRCSP(SEQ ID NO:54)、CASNNGRVVL(SEQ ID NO:55)、CGRCNGRCLL(SEQ ID NO:56)、CWLCNGRCGR(SEQ ID NO:57)、CSKCNGRCGH(SEQ ID NO:58)、CVWCNGRCGL(SEQ ID NO:59)、CIRCNGRCSV(SEQ ID NO:60)、CGECNGRCVE(SEQ ID NO:61)、CEGVNGRRLR(SEQ ID NO:62)、CLSCNGRCPS(SEQ ID NO:63)、CEVCNGRCAL(SEQ ID NO:64)。
其他靶向多肽包括:脑靶向多肽,如CNSRLHLRC(SEQ ID NO:65)、CENWWGDVC(SEQID NO:66)、WRCVLREGPAGGCAWFNRHRL(SEQ ID NO:67)、CLSSRLDAC(SEQ ID NO:68)、CVLRGGRC(SEQ ID NO:69)、CNSRLQLRC(SEQ ID NO:70)、CGVRLGC(SEQ ID NO:71)、CKDWGRIC(SEQ ID NO:72)、CLDWGRIC(SEQ ID NO:73)、CTRITESC(SEQ ID NO:74)、CETLPAC(SEQ IDNO:75)、CRTGTLFC(SEQ ID NO:76)、CGRSLDAC(SEQ ID NO:77)、CRHWFDVVC(SEQ ID NO:78)、CANAQSHC(SEQ ID NO:79)、CGNPSYRC(SEQ ID NO:80)、YPCGGEAVAGVSSVRTMCSE(SEQ ID NO:81)、LNCDYQGTNPATSVSVPCTV(SEQ ID NO:82);肾靶向多肽,如CLPVASC(SEQ ID NO:83)、CGAREMC(SEQ ID NO:84)、CKGRSSAC(SEQ ID NO:85)、CWARAQGC(SEQ ID NO:86)、CLGRSSVC(SEQ ID NO:87)、CTSPGGSC(SEQ ID NO:88)、CMGRWRLC(SEQ ID NO:89)、CVGECGGC(SEQ IDNO:90)、CVAWLNC(SEQ ID NO:91)、CRRFQDC(SEQ ID NO:92)、CLMGVHC(SEQ ID NO:93)、CKLLSGVC(SEQ ID NO:94)、CFVGHDLC(SEQ ID NO:95)、CRCLNVC(SEQ ID NO:96)、CKLMGEC(SEQ ID NO:97);皮肤靶向多肽,如CARSKNKDC(SEQ ID NO:98)、CRKDKC(SEQ ID NO:99)、CVALCREACGEGC(SEQ ID NO:100)、CSSGCSKNCLEMC(SEQ ID NO:101)、CIGEVEVC(SEQ ID NO:102)、CKWSRLHSC(SEQ ID NO:103)、CWRGDRKIC(SEQ ID NO:104)、CERVVGSSC(SEQ ID NO:105)、CLAKENVVC(SEQ ID NO:106);肺靶向多肽,如CGFECVRQCPERC(SEQ ID NO:107)、CGFELETC(SEQ ID NO:108)、CTLRDRNC(SEQ ID NO:109)、CIGEVEVC(SEQ ID NO:110)、CGKRYRNC(SEQ ID NO:111)、CLRPYLNC(SEQ ID NO:112)、CTVNEAYKTRMC(SEQ ID NO:113)、CRLRSYGTLSLC(SEQ ID NO:114)、CRPWHNQAHTEC(SEQ ID NO:115);胰腺靶向多肽,如SWCEPGWCR(SEQ ID NO:116)、CKAAKNK(SEQ ID NO:117)、CKGAKAR(SEQ ID NO:118)、VGVGEWSV(SEQ ID NO:119);肠道靶向多肽,如YSGKWGW(SEQ ID NO:120);子宫靶向多肽,如GLSGGRS(SEQ ID NO:121);肾上腺靶向多肽,如LMLPRAD(SEQ ID NO:122)、LPRYLLS(SEQ IDNO:123);视 网膜靶向多肽,如CSCFRDVCC(SEQ ID NO:124)、CRDVVSVIC(SEQ ID NO:125);内脏靶向多肽,如YSGKWGK(SEQ ID NO:126)、GISALVLS(SEQ ID NO:127)、SRRQPLS(SEQ IDNO:128)、MSPQLAT(SEQ ID NO:129)、MRRDEQR(SEQ ID NO:130)、QVRRVPE(SEQ ID NO:131)、VRRGSPQ(SEQ ID NO:132)、GGRGSWE(SEQ ID NO:133)、FRVRGSP(SEQ ID NO:134)、RVRGPER(SEQ ID NO:135);肝靶向多肽,如:VKSVCRT(SEQ ID NO:136)、WRQNMPL(SEQ ID NO:137)、SRRFVGG(SEQ ID NO:138)、ALERRSL(SEQ ID NO:139)、ARRGWTL(SEQ ID NO:140);前列腺靶向多肽,如SMSIARL(SEQ ID NO:141)、VSFLEYR(SEQ ID NO:142)、RGRWLAL(SEQ ID NO:143);卵巢靶向多肽,如EVRSRLS(SEQ ID NO:144)、VRARLMS(SEQ ID NO:145)、RVGLVAR(SEQID NO:146)、RVRLVNL(SEQ ID NO:147);血块粘合靶向多肽,如CREKA(SEQ ID NO:148)、CLOT1和CLOT2;心脏靶向多肽,如CRPPR(SEQ ID NO:149)、CGRKSKTVC(SEQ ID NO:150)、CARPAR(SEQ ID NO:151)、CPKRPR(SEQ ID NO:152)、CKRAVR(SEQ ID NO:153)、CRNSWKPNC(SEQ ID NO:154)、RGSSS(SEQ ID NO:155)、CRSTRANPC(SEQ ID NO:156)、CPKTRRVPC(SEQID NO:157)、CSGMARTKC(SEQ ID NO:158)、GGGVFWQ(SEQ ID NO:159)、HGRVRPH(SEQ ID NO:160)、VVLVTSS(SEQ ID NO:161)、CLHRGNSC(SEQ ID NO:162)、CRSWNKADNRSC(SEQ ID NO:163)、CGRKSKTVC(SEQ ID NO:164)、CKRAVR(SEQ ID NO:165)、CRNSWKPNC(SEQ ID NO:166)、CPKTRRVPC(SEQ ID NO:167)、CSGMARTKC(SEQ ID NO:168)、CARPAR(SEQ ID NO:169)和CPKRPR(SEQ ID NO:170)。
靶向性分子还可以根据其靶标进行定义。例如,众所周知,很多抗原和蛋白质可有效进行靶向。任何可结合、选择性地结合、靶向、选择性地靶向靶标分子的分子可用作靶向性分子。例如,抗体、核酸适体和可结合靶标分子的化合物可用作靶向性分子。可作为靶向性分子的有效靶标分子包括整合素av、整合素avβ3、整合素avp 5、整合素a5pl、氨肽酶N、肿瘤内皮细胞标志物(TEM)、内皮唾酸蛋白、p32、受体gClq、膜联蛋白-1、核仁素、纤连蛋白ED-B、纤维蛋白—纤连蛋白复合物、白介素-11受体α和蛋白酶裂解的胶原蛋白IV。所述及其他示例参见Ruoslahti等人,细胞生物学,2010年(doi:10.1083/jbc.200910104),特此将其全部内容并入本文作为参考,尤其是说明和参考靶标分子方面的内容。
RNA组分可包括许多靶向性分子。举例来说,RNA组分可至少包括1、5、10、15、20、25、50、75、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500、525、550、575、600、625、650、675、700、625、750、775、800、825、850、875、900、925、950、975、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900、2000、2250、2500、2750、3000、3500、4000、4500、5000、5500、6000、6500、7000、7500、8000、8500、9000、9500、10,000、15,000、20,000、25,000、30,000、35,000、40,000、45,000、50,000、75,000或100,000或更多靶向性分子。RNA组分还可以包括许多上述数量之间的靶向性分子。
需明白,尽管半胱氨酸残基在其一端或两端显示很多靶向和靶向基序和序列,但所示半胱氨酸残基通常不用于靶向性功能。通常,由于使用识别靶向性和靶向性序列的方法,因此存在半胱氨酸。所示末端半胱氨酸可用于传递多肽,如本发明公开的多肽。出于上述原因,还需明白可在任何公开的多肽末端加入半胱氨酸残基。
很多靶向性分子和靶向多肽靶向靶标组织的血管。然而,为方便起见,在本发明公开的某些地方进行寻靶,以靶向靶向性分子或靶向多肽可能实际靶向的血管相关组织。因此,本发明中,靶向肿瘤血管的靶向多肽可靶向肿瘤组织或肿瘤细胞。
C.内化因子
公开的RNA可包括一种或多种内化因子。内化因子可并入或融入RNA组分的其他多肽成分,如多肽靶向性分子。内化因子为可允许与其结合的内化因子和成分通过生物膜的分子,通常为多肽或氨基酸序列。例如,内化因子包括细胞穿透肽(CPP)和CendR肽。内化入细胞的多肽通常是细胞穿透肽。有两种所述多肽:疏水性和阳离子肽(Zorko和Langel,先进药物输送评论,57:529-45(2005年))。阳离子肽通常用于向细胞内引入核酸和蛋白质,包括原型细胞穿透肽(CPP)、Tat肽和穿膜肽(Derossi等人,Trends Cell Biol.8,84-7(1998年);Meade和Dowdy,先进药物输送评论,59(2-3):134-40(2007年))。疱疹病毒蛋白VP22可以进入及存在于细胞内,并携带有效负载(Elliott和O'Hare,1997年;Brewis等人,分子治疗,7,262-270(2003年))。美国专利公开说明书(编号:2010/0322862)详细说明了CendR肽。
内化因子可包括选自一组触角足、TAT肽、HIV-Tat肽、穿膜肽、Antp-3A(Antp突变)、Buforin II、Transportan、两性模型肽(MAP)、K-FGF、Ku70、Prion、pVEC、Pep-1、SynBl、Pep-7、HN-1、Bis-Guanidinium-Spermidine-Cholesterol(BGSC)和Bis-Guanidinium-Tren-Cholesterol(BGTC)的蛋白质的氨基酸序列。表1为一些内化因子的示例。
表1:内化因子
公开的RNA组分可进一步包括氨基酸序列SEQ ID NO:171、SEQ ID NO:172(Bucci,M.等人,2000年,自然医学,6,1362-1367)、SEQ ID NO:173(Derossi,D.等人,1994年,生物化学杂志,269,10444-10450)、SEQ ID NO:174(Fischer,P.M.等人,2000年,肽研究杂志,55,163-172)、SEQ ID NO:175(Frankel,A.D.和Pabo,C.O.,1988年,细胞,55,1189-1193;Green,M.和Loewenstein,P.M.,1988年,细胞,55,1179-1188)、SEQ ID NO:176(Park,C.B.等人,2000年,美国国家科学院院刊,97,8245-8250)、SEQ ID NO:177(Pooga,M.等人,1998年,FASEB J.12,67-77)、SEQ ID NO:178(Oehlke,J.等人,1998年,生物化学与生物物理学学报,1414,127-139)、SEQ ID NO:179(Lin,Y.Z.等人,1995年,生物化学杂志,270,14255-14258)、SEQ ID NO:180(Sawada,M.等人,2003年,自然细胞生物学杂志,5,352-357)、SEQID NO:181(Lundberg,P.等人,2002年,生物化学与生物物理学研究通讯,299,85-90)、SEQID NO:182(Elmquist,A.等人,2001年,实验细胞研究,269,237-244)、SEQ ID NO:183(Morris,M.C.等人,2001年,自然生物技术,19,1173-1176)、SEQ ID NO:184(Rousselle,C.等人,2000年,分子药理学,57,679-686)、SEQ ID NO:185(Gao,C.等人,2002年,生物有机化学与医药化学,10,4057-4065),或SEQ ID NO:186(Hong,F.D.和Dayman,G.L.,2000年,癌症研究,60,6551-6556)。公开的RNA组分还可进一步包括Bis-Guanidinium-Spermidine-Cholesterol(BGSC)或Bis-Guanidinium-Tren-Cholesterol(BGTC)(Vigneron,J.P.等人,1998年,美国国家科学院院刊,93,9682-9686)。
D.内体逃逸信号
内体逃逸信号是化合物和复合物组分,包括聚合物和序列,其在响应pH变化时,能引起内体破坏或裂解,或供多核苷酸或蛋白质等不可透过膜的化合物从细胞内部内膜包围的囊泡(如内体或溶酶体)逃逸。内体释放对于传递大量内吞但不能穿过细胞膜的分子是非常重要的。内体逃逸信号在生理相关的pH值范围内(通常为pH 5.5-8)转换其理化特性。所述转换可导致化合物溶解性、与其他化合物相互作用的能力发生改变,及疏水性或亲水性发生转 换。典型的内体逃逸信号可能具有pH可滴定基团或pH不稳定基团或键。本发明使用的pH可滴定基团,根据生理条件下的pH值,即pH值的范围为4—8,在水里可逆地接受或捐出质子。pH可滴定基团在4—8的pH范围内具有pKa's,并在所述范围内作为缓冲液。因此,pH可滴定基团在内体较低pH环境下增加或丢失电荷。可进行酸碱滴定,通过实验方法确定在生理pH值范围内可滴定的基团,若基团缓冲液pH值在4—8的范围内,则可通过实验方法确定所述基团。在所述pH值范围内可进行缓冲的基团包括但不限于:羧酸、咪唑、N代替的咪唑、吡啶、酚类和多胺。例如,在内体逃逸信号内有效的氨基酸是组氨酸。具有pH可滴定基团的化合物可通过所谓的质子海绵效应破坏内部囊泡。一种可逆掩蔽的膜活性化合物,其中掩蔽剂通过pH不稳定键附于化合物上,可被视为一种内体逃逸信号。
一种内体逃逸化合物的子集为融合化合物,包括融合肽。融合肽可促进寡聚化合物等试剂的内核释放至细胞质。人们相信,融合肽在酸性pH下改变构象,有效破坏内吞体膜的稳定性,从而增强内吞体内容物的细胞质传递。例如,融合肽包括从多粘菌素B、流感HA2、GALA、KALA、EALA、蜂毒肽及蜂毒肽衍生的肽、Alzheimerβ3-淀粉样肽和其他类似物质衍生的肽。在酸性pH条件下,内体和溶酶体内的化合物和复合物选择性地进行表面电荷反转(从阴离子至阳离子),是导致化合物和复合物内体和溶酶体快速逃逸的机理。一种促进内体逃逸的方法模仿病毒性感染过程中病毒包膜与宿主细胞内体膜的融合。根据流感病毒的融合域,合成了数种合成融合肽。Oliveira等人(融合肽增强内体逃逸,改善致癌基因siRNA诱导的沉默,国际制药学杂志,331(2):211-214(2007年))评估了流感衍生的融合肽diINF-7对siRNA靶向性表皮生长因子受体(EGFR)和K-ras致癌基因基因沉默效率的影响。对于两种标靶而言,加入diINF-7融合肽后,发现基因沉默活动明显增强,从而将内体逃逸鉴定为siRNA沉默效率的限制因素。
E.RNA组分
公开的RNA可提供并传递至组分内的靶向组织和细胞。例如,所述RNA组分可按配方制备,保护RNA免受降解或消除,增加个体内RNA的半衰期,辅助RNA内化成细胞和组织,及其他有利于药剂成分的特性。除了保护RNA外,RNA组分还可按配方制备,以靶向RNA至特定组织和细胞,及内化RNA为细胞和组织。可通过纳入一种或多种靶向性分子作为部分RNA组分,完成RNA组分的靶向。可通过纳入一种或多种内化因子作为部分RNA组分,完成RNA的内化。
提供了需服用所述组分的个体、个人或患者服用有效治疗剂量的一种或多种核酸相关组分和制剂配方。配方可以是任何一种或更多不同类型,如溶剂、混悬剂、药片、分散片、药丸、胶囊、粉剂、延缓/缓释剂型、口服丹药,或肠胃外投药的无菌溶液或混悬剂。配方可含一种或多种核酸和(或)一种或多种核酸载体,如下所示。在某些实施例中,所述再也可以基于载体尺寸或靶向性分子的存在,靶向特异性细胞。在某些实施例中,载体可传递核酸至靶向细胞的胞液。在某些实施例中,载体可以传递核酸至靶向细胞的细胞核。
1.核酸载体组分
向需服用所述化合物的个体、个人或患者传递任何治疗性化合物可能受到任何一种或多种因素的阻碍,如化合物到达靶向细胞或组织的能力受限,或限制化合物进入细胞或在细胞内运送化合物。典型地,核酸类药物输送至相应的细胞内靶向部位,即细胞核或胞液。因为生物系统产生多种屏障,以防止外部基因物质侵入,因此核酸可结合复杂的传递机器进行传递,克服所述屏障。很多核酸在细胞或血浆内稳定的时间有限。然而,本发明所述组分可稳定核酸,然后进行分散便于进行细胞传递。组分可以含有一种或多种核酸载体,每种核酸载体单独含有一种或多种需运输的核酸。组分可制备成多种适合需服用所述组分的个体、个人或患者服用的配方。
已经研发出了很多载荷,如分子克隆和基因治疗领域的载体,用于传递DNA、RNA及DNA和RNA的合成或半合成衍生物等核酸。本发明所述载体可用于传递公开的RNA。常规载体包括病毒载体、质粒载体、粘粒体和人工染色体等载体。非病毒载体包括基于脂类、聚合物和无机物质的载体。在某些实施例中,可利用修饰的核酸,如防止酶催降解的衍生物和(或)核酸偶合物,包括核酸与聚合物、脂类、靶向性分子、内化因子或其组合等,来完成所述传递。非病毒载体具有免疫低反应和方便大规模生产的优点。尽管与一些病毒载体相比,非病毒载体的传递效率较低,但其最大容忍剂量(MTD)较高,可在体内产生相当可观疗效。
①.传递用的生物载体
大多数核酸类药物在摄入细胞后只具有生物活性。公开的RNA旨在作用于细胞的细胞核。为进入最终靶向部位,核酸类药物需克服生物系统为防止外部微生物和外源基因物质侵入而产生的多个屏障。
因为肾小球过滤的截断值约为20,000Da,所以在注射入血液后,大多是低分子量药物快速被肾脏排出(Seymour等人,生物医学材料研究杂志,1987年,21:1341-1358)。在某些实施例中,增加运载工具的分子重量可增加血液浓度水平和传递效果。在某些实施例中,载体的质量约大于20,000Da、约大于40,000Da、约大于80,000Da、约大于100,000Da或约大于200,000Da。载体的质量,包括脂类、核酸耦合物和聚合及无机纳米粒子等病毒载体和非病毒载体,可设计为任何允许进行有效传递的任何质量。在某些实施例中,本发明所述载体保护核酸免受细胞外核酸酶降解或消化。
首先观察到直径大于300nm的粒子,在到达靶向组织前,快速被肝、脾和肺内的网状内皮系统(RES)捕获(Ikomi等人,放射学,1995年,196:107-113)。通过仔细控制载体特性,如分子量和电荷密度,及控制粒子形成,可以控制载体直径。在某些实施例中,载体的平均几何直径小于500nm、小于400nm、小于300nm、小于275nm、小于250nm、小于225nm、小于200nm。在某些实施例中,载体的平均几何直径约为60nm、75nm、100nm、125nm、150nm、175nm、200nm、225nm、250nm、275nm、300nm、325nm或350nm。在某些实施例中,平均集合直径在75—250nm之间或50—300nm之间。在某些实施例中,一种载体种群中30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或更多的载体的直径小于300nm。在某些实施例中,一种载体种群中10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或更多的载体的直径小于大于50nm但小于300nm。
在某些实施例中,控制载体电荷旨在改善传递效果。因为大多数血清蛋白具有净负电荷,因此阳离子载体可在白蛋白等血清蛋白中形成聚集体。所述聚集体可在费、皮肤或肠道等器官内聚集,形成良好的毛细结构,并可能阻塞血液(Pouton等人,先进药物输送评论,2001年,46:187-203)。然而,表面负电荷太强的载体可能被肝内的枯否细胞等非实质细胞从血液中排除(Hashida等人,控释杂志,1996年,41:91-97)。在某些实施例中,表面电荷小于+500mV、小于+400mV、小于+300mV、小于+200mV、小于+100mV、小于+50mV、小于+30mV或小于0mV的载体会防止聚集体形成。在某些实施例中,表面电荷大于-500mV、大于-400mV、大于-300mV、大于-200mV、大于-100mV、大于-50mV、大于-30mV或大于0mV的载体可能防止非实质细胞进行排除。在某些实施例中,载荷的表面电荷可能在-100mV至+100mV之间、-50mV至+50mV之间、-30mV至+30mV之间,或-15mV至+15mV之间。因此,在某些实施例中,可仔细控制两种表面电荷和载体大小,以有效克服细胞外屏障。在某些实施例中,可能明显改善质量大于20,000Da、直径小于250nm、表面电荷在-30mV至+30mV之间的载荷的传递效果。
尽管疏水性小分子主要自由扩散至胞液,但带电荷的分子很难穿由磷脂双分子层组成的透浆膜。带较高负电荷的核酸类药物,如公开的RNA,可能更难与浆膜相互作用;由于阳离 子糖化膜蛋白含量较高,因此浆膜的细胞外表面带有很多负电荷。大多数载体可通过内吞作用、吞噬作用或巨胞饮途径内化入细胞内(Conner等人,自然,2003年,422:37-44)。直径约为1—10μm的较大颗粒可通过吞噬作用或巨胞饮进行内化。
根据配体-受体相互作用,将内吞作用分为受体介导的内吞和非特异性内吞。各种配体诱导受体介导的内吞,可增强传递至靶向细胞的特异性。另一方面,非特异性内吞在无任何配体的情况下,介导核酸类药物载体的内化。在很多情况下,非特异性内吞可通过传递载体和浆膜表面上的蛋白聚糖之间的静电相互作用进行诱导(Mislick等人,美国国家科学院院刊,1996年,93:12349-12354)。阳离子载体可更有效地与具有带负电荷的硫酸盐或羧酸盐基团的蛋白聚糖相互作用,使得其产生比阳离子载体更高的内吞作用效率。根据所述机理,内吞作用还可分类为网格蛋白介导的内吞(见Schmid,生物化学年鉴,1991年,66:511-548),小窝蛋白介导的内吞(见Pelkmans等人,Traffic,2002年,3:311-320)和网格蛋白及小窝蛋白独立内吞(见Damke等人,细胞生物学杂志,1995年,131:69-80)。
在内吞作用中,内体逐渐被内吞体膜内的ATP酶酸化。酸化过程从7.4的普通生理pH值至4.8的溶酶体pH值。完全酸化的内体将于溶酶体融合。通过在酸化早期阶段降解或灭活前从内体逃逸的载体,可改善胞液内完整核酸的成功传递。在某些实施例中,利用在pH值大于5、pH值大于5.5、pH值大于6.0或pH值大于6.5时从内体逃逸的载体,可完成完整核酸的有效传递。
优选地,公开的RNA通过胞液传递至细胞核内。胞液不是可以自由扩散大分子的简单液相,而是具有主要由肌动蛋白微丝组成的良好网状结构的凝胶状相。铃动力直径为85nm的大分子的扩散速度明显低于胞液内小分子的速度。在某些情况下,如前所述,由于核酸酶防止病毒DNA或RNA侵入,导致游离DNA的胞质浓度快速降低,半衰期为90min(见Lechardeur等人,基因,1999年,6:482-497)。因此,保护核酸免受核酸酶攻击,可增强传递至细胞核的效力,且不损害活性。病毒由微管丝主动快速地传输过胞液。在某些实施例中,载体通过模仿活性病毒运输,在靠近核被膜的位置快速传递(即在30分钟内)。在某些实施例中,载体导致胞液内核酸的半衰期大于120分钟、大于180分钟或大于240分钟。在某些实施例中,载体导致胞液内核酸的半衰期为240—1,800分钟、240—1,000分钟,或360—600分钟。在某些实施例中,载体在少于45分钟、少于40分钟、少于35分钟、少于30分钟、少于25分钟或少于20分钟的时间内,通过胞液传递核酸至细胞核内。
核酸传递至细胞核的最后阶段为穿过核被膜。沿着浆膜和内吞体膜,核被膜的双层双分子层结构可以是核酸传递的一个主要屏障。核孔复合物(NPC)控制胞液和核质之间大分子运输,但NPC的被动扩散截断值约为9nm,因此游离pDNA或聚合物-pDNA复合物等大分子很难通过NPC被动扩散进入细胞核。然而,大分子在有丝分裂过程中核被膜分裂时进入核质。NPC的打开状态促进了直径小于26nm的颗粒的主动运输,因此通过耦合集合输入蛋白,控制核酸蛋白运输的细胞核定位信号(NLS),可成功将核酸传递至细胞核内。在其他实施例中,载体利用碳水化合物结合受体、凝集素克服细胞核屏障进入细胞核,或直接破坏核被膜进入细胞核。
美国专利公开了细胞核靶向性分子的示例,如专利号为10100143454、20100099627、20090305329、20090176710、20090087899、20070231862、20070212332、20060242725、20060233807、20060147922、20060070133、20060051315、20050147993、20050071088、20030166601、20030125283、20030083261、20030003100、20020068272和20020055174的专利,特此将其全部内容并入本文作为参考,尤其是说明细胞核靶向性分子和基序方面的内容。
②.常规载体
常规载体,如克隆技术中常用的常规载体,主要包括DNA或RNA分子,用作携带外来基因材料至细胞内的工具。一般而言,常规载体为核酸分子(主要是DNA或RNA),用于转移过客核酸(即DNA或RNA)至宿主细胞。在某些实施例中,载体为常规载体,例如病毒载体。尽管载体可用于传送拟在细胞内表达的核酸,但公开的RNA不会在细胞内表达。因此,载体不会或不需要促进核酸复制或表达。例如,不会促进基因材料着生或复制的载体可传送核酸类药物。在某些实施例中,病毒载体等常规载体可含有能在细胞内释放核酸的可断键。例如,可用一种或多种可水解的键修饰常规载体,以促进核酸的传送和释放。
腺病毒、腺伴随病毒(AAV)等病毒和逆转录病毒形成了传送其基因组至宿主细胞的复杂机制。在某些实施例中,若可防止原始病毒基因的表达,则病毒体制可用作传送核酸的有效工具。有研究报告表明,甚至修饰的病毒载体可能诱导过度免疫反应,因为其仍在表面含有病毒壳体蛋白。在某些实施例中,病毒载体不用作载体。熟知该领域的人应明白如何确定特殊病毒载体是否诱导免疫反应,并能鉴于治疗效果考虑免疫反应程度是否为过度。
在某些实施例中,载体可以是病毒载体。可以进行修饰以传送核酸的实验用病毒载体包括但不限于重组逆转录病毒(如WO 90/07936;WO 94/03622;WO 93/25698;WO 93/25234;USPN 5,219,740;WO 93/11230;WO 93/10218和WO 91/02805)、甲病毒属载体(如辛德毕斯病毒载体、塞姆利基森林病毒(ATCC VR-67;ATCC VR-1247),罗氏河病毒(ATCC VR.-373;ATCC VR-1246)和委内瑞拉马脑炎病毒(ATCC VR-923;ATCC VR-1250;ATCC VR 1249;ATCC VR-532))、腺伴随病毒(AAV)载体(如WO 94/12649,WO 93/03769;WO 93/19191;WO94/28938;WO 95/11984和WO 95/00655),及痘病毒载体(如禽痘病毒、牛痘病毒等)。RNA病毒优选公开的RNA组分的病毒载体。
可通过适用于所选病毒载体的方法,并根据该领域已知方法(如注射服用(如肌肉注射、皮下注射、静脉注射等)、口服等),将所述载体传送给个体。在某些实施例中,病毒载体含有一种或多种可在细胞内释放核酸的可断键。
③.脂质体载体
在某些实施例中,载体为脂质体载体(即脂质体),如隐形脂质体,或含一种或多种脂类。在某些实施例中,脂质体为表面修饰的脂质体。在某些实施例中,脂质体包括聚(乙二醇)脂类(PEG修饰的或长循环脂质体或隐形脂质体)。在某些实施例中,载体为双脂质氨基酸(DILA2)。参见美国专利申请(申请号:12/114,284)。在某些实施例中,脂质体载体包括克雷布斯循环类似物,如WO 2011/031561A2所描述的类似物。
脂质体是一种具有由一种或多种磷酸双分子层封闭的含水内部的囊泡。经证明,所述囊泡具有输送治疗剂和(或)诊断剂至靶向组织或器官的实用功能。可利用该领域熟知的方法,用一种或多种囊泡形成的脂质形成脂质体。术语“囊泡形成的脂质”宜理解为能形成脂质体囊泡的脂质。参见美国专利(专利号:5,225,212)。典型的囊泡形成的脂质包括磷脂胆碱(PC)、磷脂酰丝氨酸(PS)、磷脂酰肌醇(PI)、胆固醇琥珀酸单酯(CHEMS)、磷脂酰乙醇胺(PE)、油酸(OA)、磷脂酸(PA)、磷脂酰甘油(PG)、单唾液酸神经节苷脂(GM1)、结合到聚乙二醇的磷脂酰乙醇胺(PEG-PE,可从位于阿拉巴马州伯明翰的Avanti Polar Lipids公司购买)和胆固醇。
在某些实施例中,脂质体载体是pH敏感的脂质体。pH敏感的脂质体在酸性pH下起解,是一种非常有益的载体。在某些实施例中,pH敏感的脂质体在pH值低于6、低于5.5、低于5.0或低于4.5的情况下分解。
可通过在脂质体制剂中加入pH敏感的脂质来构象本发明公开的脂质体为pH敏感的脂质体。pH敏感的脂质体系指脂质体的设计和构象,使得脂质体在接触不同于脂质体构象的pH 值时,脂质体结构将分解(如由于双分子层的不稳定导致的分解)。一般而言,pH敏感的脂质体可包括上述识别的囊泡形成的脂质加上一种或多种pH敏感的脂质。术语“pH敏感的脂质”系指含极性端(在中性pH条件下带负电荷)和非极性端的脂质。pH敏感的脂质的极性端首先是未质子化的,随着pH值的升高,变成质子化的,最后pH值降低。在某些实施例中,pH敏感的脂质在pH值大于6.0、大于6.5、大于7.0或大于7.4时是未质子化的。在某些实施例中,pH敏感的脂质在pH值小于6.5、小于6.0、小于5.5、小于5.0或小于4.8时是质子化的。优选地,pH敏感的脂质在pH约为6.0或更小时是质子化的。pH酸性越高时,pH敏感的脂质的极性端起解极性双分子层,从而起解脂质体。pH敏感的脂质包括自然产生的分子(如油酸)或合成的分子(如二酰基-甘油-3-琥珀酸,可从位于阿拉巴马州伯明翰的Avanti PolarLipids公司购买)。
在某些实施例中,脂质体载体包括一种或多种酸不稳定的键、一种或多种可水解的键或其组合。酸不稳定的键包括含原酸酯基团、腙、顺式乙酰甲基、乙缩醛、缩酮、硅醚、硅氮烷、亚胺、柠康酐、顺丁烯二酸酐、冠醚、氮杂冠醚、硫杂冠醚、二硫苄基基团、顺式乌头酸、顺式羧基三烯酸、甲基丙烯酸及其混合物的键。酸不稳定的基团和键参见美国专利(专利号:7,098,032、6,897,196、6,426,086、7,138,382、5,563,250和5,505,931)。可水解的键或基团参见美国专利(专利号:6,849,272和6,200,599)。
脂质包括但不限于1,2-二油酰基-sn-甘油酸-3-磷脂酰胆碱(DOPC)、蛋磷脂酰胆碱(EPC)、二月桂酰磷脂酰胆碱(DLPC)、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(DMPC)、二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、1-肉豆蔻酰-2-棕榈酰磷脂酰胆碱(MPPC)、1-棕榈酰-2-肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(PMPC)、1-棕榈酰-2-硬脂酰磷脂酰胆碱(PSPC)、1-硬脂酰-2-棕榈酰磷脂酰胆碱(SPPC)、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(DMPC)、1,2-二油酰基-sn-甘油酸-3-磷酸胆碱(DAPC)、1,2-双花生四烯酰-sn-甘油酸-3-磷酸胆碱(DBPC)、1,2-dieicosenoyl sn-甘油酸-3-磷酸胆碱(DEPC)、棕榈酰油酰磷脂酰胆碱(POPC)、二亚油酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)、双肉豆蔻磷脂酰乙醇胺(DMPE)、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺(DPPE)、棕榈酰油酰磷脂酰乙醇胺(POPE)、溶血磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰甘油、双肉豆蔻磷脂酰丝氨酸(DMPS)、二棕榈酰磷脂酰丝氨酸(DPPS)、脑磷脂酰丝氨酸(EPS)、二月桂酰磷脂酰甘油(DLPG)、二肉豆蔻酰磷脂酰甘油(DMPG)、二棕榈酰磷脂酰甘油(DPPG)、二硬脂酰磷脂酰甘油(DSPG)、二油酰磷脂酰甘油(DOPG)、胆固醇或聚乙二醇(PEG)。
④.纳米粒载体
在某些实施例中,载体可以是粒子或纳米粒子。粒子可以是集合粒子或非聚合粒子。该领域已知制备和加载粒子和纳米粒子的方法。
在某些实施例中,纳米粒子是聚合粒子。药物传输领域已知大量聚合物和粒子形成的方法。在某些实施例中,聚合粒子基体包括一种或多种聚合物。聚合物可以是自然或不自然(合成)聚合物。聚合物还可以是均聚物或包括两种或更多单体的共聚物。就序列而言,共聚物可以是随机、嵌段或包括随机、嵌段序列的组合的共聚物。在某些实施例中,聚合物可以是线型聚合物或支化聚合物。在某些实施例中,利用树状聚合物制备聚合粒子。
在某些实施例中,聚合物包括美国食品药品监督管理局(PDA)根据21C.F.R.§177.2600批准用于人体的聚合物,包括但不限于聚脂(如聚乳酸、聚(乳酸-共-乙醇酸)、聚己内酯、聚戊内酯、聚(l,3-二恶烷-2酮));聚酸酐(如聚(癸二酸酸酐));聚醚(如聚乙二醇);聚氨酯;聚甲基丙烯酸酯;聚丙烯酸酯;和聚氰丙烯酸。
聚合物包括聚乙烯、聚碳酸酯(如聚(l,3-二恶烷-2酮))、聚酸酐(如聚(癸二酸酸酐))、聚醇酸(如聚(p-羟烷基酯))、聚丙基富马酸、聚己内酯、聚己内酯(如聚己内酰胺)、聚缩醛、 聚醚、聚脂(如聚乳酸、聚乙交酯)、聚(原酸酯)、基丙烯酸酯、聚乙烯醇、聚氨酯、聚磷腈、聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯、聚脲、聚苯乙烯和聚胺。
在某些实施例中,聚合物可以是亲水性聚合物。例如,聚合物可以包括阴离子基团(如磷酸基、硫酸基、羧酸基);阳离子基团(如季胺基);或极性基团(如羟基、硫醇基、胺基)。
在某些实施例中,聚合物可以用一种或多种基团和(或)功能基团进行修饰。根据本发明,可使用任何基团或功能基团。在某些实施例中,聚合物可以用聚乙二醇(PEG)、碳水化合物和(或)多糖衍生物无环聚缩醛进行修饰(Papisov,2001年,ACS Symposium Series,786:301)。在某些实施例中,聚合物可以用脂质或脂肪酸基团进行修饰。
在某些实施例中,聚合物可以是聚脂,包括含乳酸和乙醇酸的共聚物,如聚(乳酸-共-乙醇酸)合聚(交酯-共-乙交酯)(以下统称为“PLGA”);和含乙醇酸的均聚物(以下简称为“PGA”)、含乳酸的均聚物,如聚-L-乳酸,聚-D-乳酸、聚-D,L-乳酸、聚-L-交酯、聚-D-交酯和聚-D,L-交酯(以下统称为“PLA”)。在某些实施例中,典型的聚脂包括聚醇酸;聚乙二醇化聚合物和交酯与乙交酯的共聚物(如聚乙二醇化的PLA、聚乙二醇化的PGA、聚乙二醇化的PLGA及其衍生物)。在某些实施例中,聚脂包括聚酸酐、聚(原酸酯)、聚乙二醇化的聚(原酸酯)、聚(己内酯)、聚乙二醇化的聚(己内酯)、聚赖氨酸、聚乙二醇化的聚赖氨酸、聚(乙烯亚胺)、聚乙二醇化的聚(乙烯亚胺)、聚(L-乳酸-共-L-赖氨酸)、聚(丝氨酸酯)、聚(4-羟基-L-脯氨酸酯)、聚[a-(4-氨基丁基)-L-乙醇酸]及其衍生物。
在某些实施例中,聚合物可以是PLGA。PLGA是生物适合的和生物可降解的乳酸和乙醇酸共聚物,PLGA的种类由乳酸和乙醇酸的比例不同而不同。乳酸可以是L-乳酸、D-乳酸或D,L-乳酸。PLGA的降解速度可通过变更乳酸和乙醇酸的比例来进行调节。在某些实施例中,PLGA的乳酸和乙醇酸的比例约为85:15、约为75:25、约为60:40、约为50:50、约为40:60、约为25:75或约为15:85。
在某些实施例中,聚合物可以是一种或多种丙烯酸聚合物。在具体实施例中,丙烯酸聚合物包括丙烯酸和甲基丙烯酸共聚物、甲基丙烯酸甲酯共聚物、乙氧基乙基甲基丙烯酸、氰乙基甲基丙烯酸酯、胺烷基甲基丙烯酸酯共聚物、聚(丙烯酸)、聚(甲基丙烯酸)、甲基丙烯酸烷基酰胺共聚物、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(甲基丙烯酸酐)、甲基丙烯酸甲酯、聚甲基丙烯酸酯、聚(甲基丙烯酸甲酯)共聚物、聚丙烯酰胺、胺烷基丙烯酸甲酯共聚物、甲基丙烯酸缩水甘油酯共聚物、聚氰丙烯酸酯,及包含一种或多种前述聚合物的组合。丙烯酸聚合物可包括丙烯酸与甲基丙烯酸酯类完全聚合的共聚物,其中季铵基团含量较低。
在某些实施例中,聚合物可以是阳离子聚合物。通常阳离子聚合物能浓缩和(或)保护带负电荷的核酸链(如DNA、RNA或其衍生物)。含胺的聚合物,如聚(赖氨酸)(Zauner等人,1998年,先进药物输送评论,30:97;及Kabanov等人,1995年,生物共轭化学,6:7)、聚(乙烯亚胺)(PEL;Boussif等人,1995年,美国国家科学院院刊,1995年,92:7297),和聚(酰胺-胺)树状聚合物(Kukowska-Latallo等人,1996年,美国国家科学院院刊,93:4897;Tang等人,1996年,生物共轭化学,7:703;和Haensler等人,1993年,生物共轭化学,4:372)在生理pH值下带正电荷,与核酸形成离子对,并调节各种细胞系之间的传染。典型的阳离子聚合物包括聚赖氨酸、聚酰胺酸、聚(酰胺基胺)和其他氨基酸衍生的聚合物。典型的聚赖氨酸包括聚-L-赖氨酸、聚-L-D-赖氨酸、外消旋聚-DL-赖氨酸及其衍生物和共聚物。聚酰胺酸(PAA)是合成聚合物家族,其特征在于存在叔胺基团和酰胺基团,所述基团沿聚合物结构匀称排列。可以以受控的方式进行合成所述聚酰胺酸,以提供较好定义的聚合物和树状聚合物。
在某些实施例中,缩合带负荷的聚合物能避免核酸被核酸酶消化。在某些实施例中,核酸与聚合物的比例(重量/重量比)约为2:1、1:1、0.9:1、0.8:1、0.7:1、0.6:1、0.5:1、0.4:1、0.3:1、0.2:1或约为0.1:1。在某些实施例中,胺与磷酸(N:P)的比或正电荷与负电荷的比大 于1。在某些实施例中,N:P或正电荷与负电荷的比约为1.1:1、1.2:1、1.3:1或1.4:1。在某些实施例中,阳离子聚合物与疏水基团共轭。例如,阳离子聚合物可以与脂质基团共轭。典型的基团包括胆固醇、月桂酸和肉豆蔻酸。在某些实施例中,阳离子聚合物可与温度敏感的聚合物或低聚物共轭。在体温下进行亲水-疏水转换的聚合物或低聚物与阳离子聚合物共轭,可优化体温下浓度较高的核酸。
在某些实施例中,聚合物可以是含阳离子侧链的可降解的聚脂(Putnam等人,1999年,大分子,32:3658;Barrera等人,1993年,美国化学协会汇报,115:11010;Kwon等人,1989年,大分子,22:3250;Lim等人,1999年,美国化学协会汇报,121:5633;和Zhou等人,1990年,大分子,23:3399。)所述聚脂包括聚(L-交酯-共-L-赖氨酸)(Barrera等人,1993年,美国化学协会汇报,115:11010)、聚(丝氨酸酯)(Zhou等人,1990年,大分子,23:3399)和聚(4-羟基-L-脯氨酸酯)(Putnam等人,1999年,大分子,32:3658;和Lim等人,1999年,美国化学协会汇报,121:5633)。近期研究证明,聚(4-羟基-L-脯氨酸酯)通过静电相互作用缩合质粒DNA,并调节基因转译(Putnam等人,1999年,大分子,32:3658;和Lim等人,1999年,美国化学协会汇报,121:5633)。所述新的聚合物比聚(赖氨酸)和PEI的毒性更低,并能降解为无毒代谢物。
在某些实施例中,粒子可以是无机粒子。研究表明,用不同化学复合物组分共沉淀DNA和磷酸钙(CaP粒子),可提供含DNA的CaP粒子,并成功转染哺乳动物细胞(Chen等人,1989年,分子细胞生物学,2745-2752)。无机粒子可通过共沉淀一种或多种医药上可接受的盐进行制备,包括形成的医药上可接受的酸加成盐、金属盐、胺盐、有机胺加成盐、氨基酸加成盐等。无机酸盐可包括盐酸盐、硫酸盐、硝酸盐和磷酸盐。有机酸盐可包括醋酸盐、马来酸盐、延胡索酸盐、柠檬酸盐、甲烷磺酸盐、草酸盐、丙二酸盐、琥珀酸盐和酒石酸盐。金属盐可包括碱金属盐,如钠盐和钾盐;碱土金属盐,如镁盐和钙盐;铝盐;锌盐等。铵盐可包括胺、四乙胺等。有机胺盐可包括吗啉、哌啶等的盐。氨基酸盐可包括甘氨酸、苯基丙氨酸、赖氨酸、天冬氨酸、谷氨酸等的盐。典型的无机粒子包括磷酸钙粒子、氯化钙粒子等。在某些实施例中,粒子可以是由一种或多种有机聚合物或一种或多种有机聚合物的共沉淀稳定化的无机粒子
2.药剂剂型
公开的复合物组分可配制成适当的药物制剂,如溶剂、混悬剂、药片、分散片、药丸、胶囊、粉剂、延缓/缓释剂型、口服丹药,或肠胃外投药的无菌溶液或混悬剂。在具体实施例中,公开的复合物组分含治疗有效剂量的核酸,可利用该领域已知技术和程序配制成药剂成分。需明白,治疗有效剂量将取决于多种因素,包括但不限于剂型类型和给药途径;拟治疗的特异性病或障碍;复合物组分中其他治疗剂的存在、剂量和效力等。在公开的RNA组分中,有效剂量可以是有效传输一定量的RNA值靶向细胞的细胞核从而抑制DNA聚合的剂量。例如,RNA剂量可以约1ng/kg至1g/kg。可根据RNA在个体内的半衰期、到达靶向细胞或组织的RNA的存在或剂量,及RNA在靶向细胞内抑制DNA合成的效果德国因素,调节RNA剂量。
在某些实施例中,公开的复合物组分可以配制成单剂量给药。为配制复合物组分,活性剂(如公开的RNA)(重量比)在选择的、有效浓度的载体内溶解、悬浮、分散或混合,从而解除治疗条件或减轻一种或多种症状。公开的活性剂可包括在医药上可接受的载体内,但剂量应足以发挥治疗有效作用,但不会对患者产生不良的副作用。治疗有效浓度可通过对化合物进行体内、体外和体内系统实验进行确定,然后依此推测个体的剂量。药物复合物活性剂的浓度将取决于活性成分的吸收、失活及排泄率、药剂的物理化学特征、用药方案、给药剂量和该领域现有技术已知的其他因素。
可制备无毒载体制成的、含活性剂(范围是0.005%—100%,剂量平衡)的剂型或复合物。该领域现有技术已知所述复合物的制备方法。涉及的复合物可含0.001%-100%的活性成分,或(在一个实施例中)含0.1-95%的活性成分。
可使用增溶活性剂或提高善生物利用度的方法。该领域现有技术已知的所述方法,包括但不限于使用二甲亚砜(DMSO)等助溶剂、使用等表面活性剂,或在含水碳酸氢钠内溶解。一种或多种活性剂的药物复合物可并入聚合物基体,如羟丙基甲基纤维素、凝胶、渗透膜、渗透系统、多层包衣、微粒、脂质体、微球体、纳米球等。活性剂可以在微粒化或其他剂型中悬浮,或进行衍生化(如通过增加一种或多种聚乙二醇链),以产生更易溶解的活性产物或提高生无可用度。
例如,可通过在水、盐水、葡萄糖水、甘油、乙二醇、乙醇等载体内溶解、分散或混合活性剂和备选药物佐剂,制备医药上可给药的复合物液体,从而形成溶剂或混悬剂。若需要,拟服用的药物复合物还可含少量无毒的辅助物质,如润湿剂、乳化剂、增溶剂、pH缓冲剂,及醋酸盐、柠檬酸钠、环糊精衍生物、单月桂酸山梨醇酐酯、三乙醇胺乙酸钠、油酸三乙醇胺和其他所述药剂等。
口服剂型可以是固体、凝胶或液体。固体剂型可以是药片、胶囊、颗粒和粉剂。口服药片类型包括压缩、咀嚼含片和药片,可包有肠溶衣、糖或薄膜。胶囊可以是硬的或软胶胶囊,而颗粒和粉剂可以是含该领域现有技术已知的其他成分组合物的非泡腾或泡腾剂型。
在具体实施例中,剂型为固体剂型,在一个实施例中,剂型为胶囊或药片。药片、药丸、胶囊和锭剂等含一种或多种以下成分或类似性质的化合物:粘结剂、润滑剂、稀释剂、助流剂、崩解剂、着色剂、甜味剂、芳香剂、润湿剂、肠溶衣和薄膜包衣。
活性剂或其医药上可接受的盐可以以保护其免受胃部酸性环境影响的复合物的形式提供。例如,复合物可配制成肠溶衣,使其在胃部保持完整性,并在肠道内释放活性成分。复合物还可以配制成抗酸药或所述成分的组合。
单位剂型为胶囊时,除上述材料外,其可含有液体载体,如脂肪油。此外,单位剂型可含不同其他材料,所述材料修饰单位剂型的外观,如糖包衣和其他肠溶剂。
在所有药片和胶囊的实施例中,药片和胶囊剂型可包有该领域现有技术已知的材料,以修饰或维持活性成分的溶解。例如,药片和胶囊可包有常规肠内易消化的包衣,如水杨酸苯酯、蜡和邻苯二甲酸乙酸纤维素。
药物复合物可以是肠胃外投药的剂型。可注射剂型可制备成常规剂型,即液体溶剂或混悬剂、注射前可溶解或悬浮在液体内的固体剂型,或乳剂。可注射剂型、溶剂和乳剂还可含一种或多种赋形剂。此外,若需要,拟投药的药物复合物还可含少量无毒辅助物质,如湿润剂或乳化剂、pH缓冲剂、稳定剂、溶解性增强剂和乙酸钠、单月桂酸山梨醇酐酯、油酸三乙醇胺和环糊精等其他药剂。所述肠胃外投药复合物活性成分的百分比主要取决于特异型性质、化合物活动和个体需要。
肠胃外投药的制备包括适用于注射的无菌溶剂、使用前适用于与溶剂结合的无菌干燥可溶性产物,如冻干粉,包括皮下注射用片、适用于注射的无菌混悬剂、使用前适用于与载体结合的无菌干燥不可溶性产物。溶剂可以是水溶剂,也可以是非水溶剂。
单位剂量的肠胃外投药可包装在安瓿、药瓶或带针头的注射器内。所有肠胃外投药的制备可以是无菌的,如该领域已知技术和实践一样。本专利公开的可注射复合物可优选局部和(或)全身用药。
本专利涉及了缓释或持续释放制剂的植入,以维持剂量的恒定水平。在所述情况下,本专利公开的活性剂可分散入固体基体内,可选包有外部速率控制薄膜的基体。化合物从固体基体扩散(可选通过外部薄膜扩散),以受控的释放速度维持释放。固体基体和薄膜可用任何该领域现有技术已知的适用材料进行制备,包括但不限于聚合物、生物可消化聚合物和水凝胶。
冻干粉可以重组为溶剂、乳剂和其他混合物供给药。还可重组和配制成固体或凝胶。无菌冻干粉可通过溶解核酸或核酸载体进行制备。所述溶剂可含有赋形剂,可提高粉剂或粉剂制成的溶剂的稳定性并改善其药理活性成分。所述溶剂还可含有缓冲剂,如柠檬酸盐、钠盐或磷酸钾或其他该领域现有技术已知的所述缓冲剂。该领域现有技术中标准条件下,冻干后溶剂的无菌过滤产生所需要的剂型。在一个实施例中,产生的溶剂将分入药瓶内进行冻干。每个药瓶将含有单剂量或多剂量的化合物。冻干粉可储存在适当条件下,如在约4℃至室温的温度条件下。用水重组所述冻干粉(便于注射),产生肠胃外投药用的剂型。就重组而言,冻干粉加入无菌水或其他适当载体内。精确剂量取决于所选的化合物。所述剂量可根据经验进行确定。
公开的核酸和载体可配制成靶向拟治疗个体的特定组织、受体或身体其他区域的剂型。该领域现有技术提供了很多著名的所述靶向方法。在一个实施例中,脂质体混悬剂,包括靶向组织的脂质体,如靶向肿瘤的脂质体,还可适用于医药上可接受的载体。可根据该领域现有技术已知方法制备所述载体。
可配制复合物以产生一种或多种活性剂(包括核酸或核酸载体)的速释或缓释剂型。本发明还公开了在一定时段内维持核酸治疗有效剂量水平的持续释放剂型。在含多种活性剂的复合物中,活性剂和单独配制,以控制每种活性剂的释放时段和(或)时间。
所述持续释放和(或)延时释放剂型可通过该领域普通技术已知的传输设备的持续释放来实现。所述药物复合物可用于利用羟丙基甲基纤维素、其他聚合物基体、凝胶、渗透膜、穿透系统、多层包衣、微粒、纳米粒、脂质体、微球体、纳米球等产生缓释或持续释放的一种或多用活性剂。活性剂还可悬浮、微粒化或衍生为不同释放类型的活性成分。
术语“高”、“较高”、“增加”、“提升”或“提高”系指与对照组相比,增加至基础水平以上。术语“低”、“较低”、“降低”或“减少”系指与对照组相比,降低至基础水平以下。
本发明所用术语“调节”系指于适当的对照组相比,化合物以某些可测量的方式改变活性的能力。由于存在所分析的化合物,与不存在所述化合物的对照组相比,其活性可能增加或降低。与不存在所述化合物的活性水平相比,优选地,活性至少增加25%;更优选地,至少增加50%;最优选地,至少增加100%。相似地,与不存在所述化合物的活性水平相比,优选地,活性至少降低25%;更优选地,至少降低50%;最优选地,至少降低100%。增加已知活性的化合物是“激动剂”。降低或防止已知活性的化合物是“拮抗剂”。
术语“抑制”系指减少或降低活动或表达。这可以是活性或表达的完全抑制或部分抑制。可以对比抑制与对照组或标准水平。抑制可以是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100%。
本发明所用术语“监测”系指该领域用于测量活性的任何方法。
本发明所用术语“提供”系指在该领域某些已知物质中增加化合物或分子的任何形式。例如,提供可包括使用吸量管、微量分注器、注射器、针头、管、喷雾枪等。所述工具可以是手动的,也可以是自动的。其可包括通过提供核酸至平皿、细胞、组织、无细胞系统等任何形式或任何其他形式进行转染,所述转染可以是体外的,也可以是体内的。
本发明所用术语“预防”系指在疾病临床症状或条件产生前服用化合物,以预防出现所述疾病或条件相关失常的物理表征。
本发明所用术语“需要治疗”系指护理者(就人类而言,如医生、护士、护理师或个体;就动物而言,包括非人类哺乳动物,如兽医)所做的、关于个体需要或将得益于治疗的判断。所述判断基于护理者专业知识范围内的各种因素做出,包括个体生病或即将生病的了解,并认为可用本发明公开的化合物进行治疗。
本发明所用的“个体”包括但不限于动物、植物、细菌、病毒、蘑菇虫和任何其他有机体或实体。个体可以是脊椎动物,更具体而言,可以是哺乳动物(如人类、马、猪、兔子、狗、羊、山羊、非人类灵长类动物、奶牛、猫、豚鼠或啮齿动物)、鱼、鸟或爬行动物或两栖动物。个体可以是无脊椎动物,更具体而言,可以是节肢动物(如昆虫或甲壳纲动物)。术语未说明年龄或性别。因此,其包括成年和新生个体及胎儿,不论雄性或磁性(男女)。患者系指患有疾病或障碍的个体。术语“患者”包括人类和兽医个体。
术语“治疗”系指对个体进行药物治疗,以治愈、减轻、稳定或预防疾病、病理状况或障碍。所述术语包括积极治疗,即直接专门改善疾病、病理状况或障碍的治疗,也包括病因治疗,即直接去除引起相关疾病、病理状况或障碍病因的治疗。此外,所述术语还包括姑息治疗,即旨在减缓症状,而不是治愈疾病、病理状况或障碍的治疗;预防性治疗,即旨在最小化或部分或完全抑制相关疾病、病理状况或障碍发展的治疗;和支持性治疗,即用于补充其他特异性疗法,以改善相关疾病、病理状况或障碍的治疗。需明白旨在治愈、减轻、稳定或预防疾病、病理状况或障碍的治疗,实际上不必产生治愈、减轻、稳定或预防的结果。可以根据本发明和该领域现有技术测量或评估治疗效果是否适用于相关疾病、病理状况或障碍。所述测量和评估可以是定性和(或)定量的。例如,疾病、病理状况或障碍和(或)其症状的特性或特征可降低至任何效果或任何数量。
细胞可以是体外细胞。或者细胞可以是体内细胞及个体细胞。术语“细胞”可以是任何有机体的细胞,包括但不限于细菌。
在某一方面,本发明公开的化合物可给药给需要减轻或改善确认的医疗状况的人类或动物等个体,包括但不限于小鼠、狗、猫、马、牛科动物或绵羊等。
本发明使用的术语化合物的“有效剂量”系指无毒,但足以产生所需结果的化合物的剂量。本发明下文将指出,所需的确切剂量因个体不同而不同,这取决于物种、年龄和个体的一般情况、疾病的严重程度、所用的具体化合物、给药模式等。因此,不可能规定确切的“有效剂量”。然而,可根据个人的普通技术知识,通过常规实验确定适当的有效剂量。
本发明所述化合物剂量或量足以产生传输方法所需的效果。剂量不宜过大,导致不良副作用,如多余的交叉反应、过敏感应等。通常,剂量因个体年龄、状况、性别和疾病严重程度不同而不同,并可通过个人的现有技术知识进行确定。个别医生可根据个体的临床状况调整剂量。剂量、给药方案和给药途径等也可不同。
可通过评估病史、体征、症状和有利于评估需进行癌症或其他疾病和(或)状况治疗的个体的状况的客观实验室实验,确定根据本发明所述方法,化合物或复合物组分的具体剂量的给药效果。所述体征、症状和客观实验室实验可不同,这取决于任何治疗所述患者的临床医生或进行该领域所述实验的研究人员已知的需治疗或预防的具体疾病或状况。例如,若根 据适当对照组和(或)一般族群或具体个体疾病的正常发展情况的对比:(1)个体的身体状况有所改善(如肿瘤局部或完全退化),(2)疾病或状况的发展稳定、减慢或逆转,或(3)减少其他药物的需求或避免使用其他药物,则具体的治疗方案将视为是有效的。
术语“医药上可接受的”系指不是生物学上或不合适的材料,即可与选定的化合物一起给药给个体,不会产生任何不良生物效应,或以有毒的方式与药物复合物的任何其他成分相互作用的材料。
F.混合物
本发明公开了公开方法进行或准备进行过程中形成的混合物。当所述方法涉及混合或接触复合物组分或成分或片段时,进行所述方法可产生大量不同的混合物,例如,若方法包括3个混合步骤,若步骤单独进行,则在每个步骤结束后将产生独特的混合物。此外,在完整所有步骤时也会形成混合物,无论所述步骤是怎么进行的。本发明考虑了进行公开方法的混合物及含本发明公开的任何试剂、复合物组分或成分的混合物。
示例
示例1:RNA干扰DNA聚合酶并抑制DNA合成
RNA参与细胞内众多生命活动的调控,包括转录和转化。然而,目前还没有证据表明RNA是否可以直接影响DNA聚合。我们发现RNA可以通过更改DNA聚合酶活性,并将DNA聚合酶转化为三磷酸脱氧苷二磷酸水解酶(dNTP-DPase)的方式直接干扰DNA的合成。该实例详细介绍了RNA对DNA聚合酶功能影响现象的发现及其过程分析。研究发现,DNA聚合酶的A、B、C和X家族成员普遍具有类似于dNTPs二磷酸水解酶的活性。此外,尽管额外的RNA对细胞是致命的,添加dNTPs却可以使细胞存活。而且,dNTPs二磷酸水解酶能够与DNA聚合酶竞争dNTPs。当细胞中dNTPs含量相对较低时,dNTPs二磷酸水解酶通过水解dNTPs阻碍细胞内DNA的合成。然而,当细胞内dNTPs含量相对较高时,细胞内DNA合成并没有受到影响。这项分子水平上的研究表明DNA聚合酶在细胞内存在多种功能,也表明RNA具有干扰和调节细胞DNA合成和DNA聚合酶活性的功能。
A.结论
1.在RNA存在的条件下DNA聚合酶具有三磷酸脱氧苷二磷酸水解酶的活性
在RNA和(或)DNA聚合酶存在的条件下孵育dNTPs。研究结果发现dNTPs只在RNA和DNA聚合酶同时存在时被水解。DNA聚合酶依赖RNA的dNTPs二磷酸水解酶活性对dNTP的水解过程如下:
短到6个核苷酸的单链RNA仍然具有协助聚合酶水解dNTPs的功能。在DNA聚合过程中,RNA可以将大肠杆菌DNA聚合酶I(DNA pol.I)转变为dNTPs二磷酸水解酶,将dNTPs水解为dNMPs和焦磷酸(ppi)。当DNA聚合酶I或者RNA单独存在时,dATP(或dCTP)没有被水解,然而,当这两者同时存在时,dATP(或dCTP)会被水解为dAMP(或dCMP)。令人兴奋的是,Klenow(DNA聚合酶I大片段,没有5’-3’外切酶活性)和Klenow突变体(3’-5’exo-,没有3’-5’核酸外切酶活性)也具有依赖RNA的dNTPs二磷酸水解酶活性。这三种酶的dNTPs二磷酸水解酶活性说明是DNA聚合酶聚合活性的片段本身具有dNTPs二磷 酸水解酶活性,而不是因为5'-3',3'-5'核酸外切酶的活性。因此,DNA聚合酶的聚的活性位点可能就是水解dNTPs的活性位点。我们将dATP降解产物进行高分辨质谱分析,确认产物就是dAMP。
在不同长度的RNA(浓度均为200nM)存在的条件下,用DNA聚合酶I的Klenow大片段(50nM)水解α-32P-dATP。对以下一系列的实验进行分析:非标记的dATP;非标记的dATP与32P-α-dATP的共斑点;32P-α-dATP;32P-α-dATP与Klenow聚合酶;32P-α-dATP与6-mer RNA;32P-α-dATP与Klenow DNA聚合酶及6-mer RNA;32P-a-dATP与不同种类的RNA(TR-RNA(12nt),TC-RNA(12nt;TC-RNA互补链TR-RNA),TR-RNA/TC-RNA双链,18-mer RNA和24-merRNA);32P-α-dATP,Klenow和不同种类的RNA(TR-RNA(12nt),TC-RNA(12nt;TC-RNA补充链TR-RNA),TR-RNA/TC-RNA双链,18-mer RNA和24-mer RNA)和非标记的dAMP。在RNA(大肠杆菌或酵母中的总RNA)存在的条件下,分别用大肠杆菌DNA聚合酶I,Klenow和Klenow(3'-5'exo-)去水解α-32P-dCTP。此外,分别用DNA聚合酶.I,Klenow和Klenow(3’-5’exo-)去水解α-32P-dATP,并进行分析。
2.NTPs是dNTP被水解为dNMP和焦磷酸的抑制剂
dNTPs二磷酸水解酶水解dATP的活性会受到ATP和CTP的抑制,而ATP并不能被其水解。同样,ATP或CTP可以抑制dCTP的水解。依赖RNA的dNTPs二磷酸水解酶水解dNTPs的活性受到NTPs的抑制作用可能是由于NTPs与dNTPs竞争dNTPs二磷酸水解酶的活性位点。此外,研究证明在dNTPs二磷酸水解酶水解dNTP的反应中可以形成焦磷酸。通过依赖RNA的dNTPs二磷酸水解酶水解γ-32P-dATP产生的产物,可被焦磷酸酶水解为单磷酸,从而确认焦磷酸的产生。
分析了在细胞RNA存在的条件下,对大肠杆菌DNA聚合酶I水解γ-32P-dATP产生焦磷酸的过程。进行以下一系列的实验:在10mM NaOH存在条件下加热-32P-dATP,产生了32P-标记的焦磷酸和单磷酸;在10mM NaOH存在条件下加热γ-32P-ATP,然后用无机焦磷酸酶水解,形成的焦磷酸转化成了单磷酸;用无机焦磷酸酶孵育γ-ATP(没有反应);用DNA聚合酶I和RNA孵育γ-ATP(没有反应),这表明NTP不是dNTPs二磷酸水解酶的底物;用DNA聚合酶I和RNA孵育γ-32P-dATP,γ-32P-dATP被水解成dAMP和32P-焦磷酸;用DNA聚合酶I和RNA孵育γ-32P-dATP,然后用焦磷酸酶进行消化,形成的32P-焦磷酸被转变成磷酸及γ-32P-ATP和γ-32P-dATP。
3.合成的RNA与DNA聚合酶结合并将其转变成dNTPs二磷酸水解酶
通过凝胶迁移实验分析大肠杆菌DNA聚合酶I和转录的32P-标记-RNA(69nt.),发现DNA聚合酶能够与合成的RNA相结合。此结果与文献中报道的DNA聚合酶I和Klenow都可以与ssDNA、dsDNA、DNA引物和模板复合物相结合的现象是一致的(Freemont等人,1988年;Wowor等人,2010年),也有文章报道过DNA聚合酶和RNA之间特异性结合(Pavlov&Karam,1994年)。此外,实验表明,不同来源的细胞RNA均能够激活依赖RNA的dNTPs二磷酸水解酶的活性。例如,通过分析在合成的RNA((RNA-1:人类总RNA;RNA-2:大肠杆菌总RNA)存在的条件下,Klenow对α-32P-dCTP的水解作用,得出人类和大肠杆菌的总RNA均能激活Klenow DNA聚合酶的dNTPs二磷酸水解酶的活性。
4.在RNA存在时,DNA聚合酶普遍具有dNTPs二磷酸水解酶活性
为了检测依赖RNA的dNTP水解是否能在很多其他DNA聚合酶中观察到,我们对一些DNA聚合酶进行了类似的研究。令人惊讶的是,DNA聚合酶A、B、C和X家族成员都表现出了类似于dNTPs二磷酸水解酶的活性。此结论通过分析大肠杆菌DNA聚合酶I(A家族聚合酶),T7DNA聚合酶(A家族),和T4 DNA聚合酶(B家族)水解α-32P-dATP,及人类 DNA聚合酶β(X家族)和大肠杆菌DNA聚合酶III(-亚基;聚合酶III;C家族)水解α-32P-dATP实验得以验证。
5.dNTPs浓度较低时,RNA能够有效抑制DNA的体外聚合反应
鉴于DNA聚合酶具备依赖于RNA的dNTPs二磷酸水解酶活性,说明RNA可能会直接影响DNA的聚合,特别是在dNTPs浓度相对较低时。将RNA加入到含有dNTPs,模板和引物的DNA聚合反应体系中,当无RNA存在时,DNA聚合反应能够在低浓度dNTPs条件下正常进行(如3μM)。然而,在相同dNTPs浓度条件下(3μM),加入额外的RNA,DNA合成会受到干扰。在缺少和存在RNA时,DNA合成完成50%需要的dNTPs浓度分别是1.8和6.7μM(图1)。同时,实验发现当dNTPs浓度相对较高时(10μM),RNA的存在对DNA合成的影响并不明显。另外,当RNA含量较低时,DNA聚合反应受到的影响也并不显著。但是,提高RNA浓度,当dNTPs浓度相对较低(3.5μM)时,DNA合成明显受到抑制,甚至被彻底阻断。以上实验结果说明RNA能够在dNTPs含量较低的情况下直接干扰DNA的体外合成。
评估了在缺少和存在RNA,以及不同浓度dNTPs(0、100、250、500、750nM、1μM、3、10、30和100μM)条件下的DNA合成。还评估了在不同浓度RNA条件下,通过dNTPs水解抑制DNA聚合酶的现象。将DNA模板(55-mer,200nM)与5'-32P标记的引物(21-mer,20nM)进行退火,进行反应[含DNA聚合酶I、dNTPs(分别为3.5μM)],然后加入不同浓度的大肠杆菌总RNA(0、5、25、50、100、150、200、250、300、350和400ng/μL),孵育30min。
6.额外加入的RNA抑制DNA合成并导致细胞死亡,然而加入dNTPs和NTPs可以解救细胞
此外,因为DNA聚合酶依赖于RNA的dNTPs二磷酸水解酶的活性能够在体外影响DNA的聚合,说明细胞内额外存在的RNA可能会引起细胞的生存和死亡(两种极端表型)。尽管DNA聚合酶在整个细胞周期中普遍存在,额外的DNA聚合酶也可以被引入细胞内。为了证明外源DNA聚合酶和RNA能够被转入细胞中,我们利用允许被动扩散RNA和DNA的感受态细胞。同样地,我们通过向培养基中添加dNTPs来控制细胞内dNTPs含量。因此,通过CaCl2方法可以制备化学感受态大肠杆菌细胞,所述感受态细胞同样允许质粒的渗透。实验原理如下:通过向感受态细胞转入额外的DNA聚合酶和细胞的RNA,细胞内会产生dNTPs二磷酸水解酶以减少细胞内dNTPs含量,进而干扰细胞DNA合成并产生可观察到的表型(即细胞生长抑制或死亡)。实验结果表明只向细胞培养基中加入相当少的DNA聚合酶或者RNA,对细胞生长不会有明显的影响。相反,同时向细胞培养基中加入DNA聚合酶和细胞RNA,则能够明显的观察到细胞生长受抑制和细胞死亡的现象,即使是在加入量很低的情况下也能观察到这种现象。实验结果表明如果向细胞中加入额外的dNTPs来补偿被dNTPs二磷酸水解酶降解的dNTPs,细胞就能够继续进行DNA的合成并正常生存下去。此外,为了监测额外的DNA聚合酶、RNA和(或)dNTPs转入细胞中,同时将带抗性基因的质粒转入感受态细胞,使得细胞在相应的抗生素存在的条件下生长。在细胞生长过程中会合成基因组和质粒DNA(以下简称细胞的DNA)。
因此,首先将质粒,dNTPs、NTPs、细胞RNA和(或)聚合酶作为添加剂,以不同的组合方式加入到感受态细胞的培养基中。随后,通过热激感受态细胞和添加剂,进行转换和穿透,紧接着进行细胞培养基孵化和涂板。DNA聚合酶和RNA对细胞内DNA合成的协同抑制效应,可通过向细胞内转入DNA聚合酶,RNA和dNTPs的实验进行验证。添加剂单独的(或者组合形式)分别加入到感受态细胞中,热激过后在37℃培养10min,随后加入α-32P-dATP在37℃分别培养0、5、10、20和30分钟,每一个时间点向各实验组中均添加以下成分:水,RNA(50ng/L),DNA聚合酶(50nM),RNA(50ng/L)和DNA聚合酶(50nM)。 每个培养皿上的每组感受态细胞管中加入的添加剂分别是:水;RNA;大肠杆菌DNA聚合酶I;dNTPs(分别为10μM);RNA和DNA聚合酶I;RNA和DNA聚合酶I;RNA、DNA聚合酶I和dNTPs;RNA,DNA聚合酶I和NTPs(分别为10μM);及RNA、DNA聚合酶I、dNTPs和NTPs。在实验中,每组添加剂的空白对照是水。
此实验证实了RNA对DNA聚合酶和DNA合成的调控。实验结果如下:(I)与对照组相比,单独添加相对低浓度的DNA聚合酶或者细胞RNA并不能明显抑制细胞DNA合成,其中水是添加剂。将α-32P-dATP作为dATP添加剂加入细胞培养基中,采用放射性同位素追踪的方法来监测DNA的合成。当细胞存活下来并进行生长时,α-32P-dATP放射性被整合到细胞DNA中;最终,在加热裂解细胞后,聚丙烯酰氨凝胶电泳分析细胞DNA。当细胞没有生长或者死亡时,细胞内不会有DNA的合成,因此利用放射自显影法也不能再胶片上检测到具有放射性标记的DNA。使用6%的PAGE胶时,800nt以上的DNA序列不能被有效分离,然而短片段的DNA在涂片X射线胶片上是可见的。(II)实验发现即使加入低浓度的DNA聚合酶和RNA也能明显抑制细胞内DNA的合成,表明dNTPs二磷酸水解酶已经形成并水解dNTPs,直接抑制细胞内DNA的合成。同样的现象在单克隆细胞里都能被观察到。(III)与对照组相比,单独添加低浓度的DNA聚合酶或者RNA并不能有效抑制细胞的生长;其中水是添加剂。然而,在培养基中加入相对较高浓度的RNA(终浓度:200ng/μL)会抑制细胞内DNA的合成,导致细胞死亡,这可能是由于内源性DNA聚合酶参与进来。有趣的是,在细胞培养基中加入dNTPs(各组分终浓度分别为10μM)时,DNA又重新开始合成,将细胞从RNA致死效应中拯救出来。(IV)实验发现同时添加相对较低浓度的DNA聚合酶与RNA能够明显地抑制了细胞生长,这一现象与之前的实验结果一致,也与添加dNTPs可以补充细胞内由于dNTPs二磷酸水解酶水解作用而导致的dNTPs损耗,使细胞复活的实验原理相符合(图2)。因此,额外添加的dNTPs包括在DNA聚合酶和RNA内,发现(V)添加dNTPs可以补充被损耗的dNTPs,使细胞从添加DNA聚合酶与RNA所引起的致死效应中复活。据此原理推测,添加NTPs也可以抑制dNTPs二磷酸水解酶的活性,拯救细胞。因此,我们将NTPs与DNA聚合酶和RNA一起添加到细胞中,发现(VI)NTPs能够有效抑制dNTPs二磷酸水解酶对细胞的毒性影响,从而拯救细胞(图2)。此外,使用酵母菌和人体细胞内总RNA进行细胞存活与致死实验时,得到了相同的实验结果。
B.讨论
本研究表明dNTPs二磷酸水解酶的活性较低,在RNA存在的情况下,只有部分DNA聚合酶转变为dNTPs二磷酸水解酶(图1)。为了简化实验中的定量分析,我们将抑制最大全长DNA片段合成量达到一半时所需的dNTP浓度定义为dNTPs半量浓度,即dNTP-C50。在体外实验中,在不存在或存在RNA的条件下,dNTP-C50的值分别为1.8和6.7μM。当无RNA存在时,在极低浓度的dNTP条件下(每组dNTP浓度均为3μM,图2),DNA聚合酶仍然能高效合成全长DNA片段;当存在RNA时,在dNTP浓度较低的情况下(每组dNTP浓度均为3μM),dNTPs二磷酸水解酶对dNTPs的水解作用非常显著,进而干扰DNA聚合。然而,由于dNTPs二磷酸水解酶的活性较低,当dNTP浓度较高(如10μM)时,其对dNTPs的水解作用相对减弱,不能显著地干扰DNA聚合。
为了进一步验证体内是否存在RNA干扰DNA合成的现象,我们利用感受态细胞和低浓度细胞dNTP进行了相关实验。实验结果显示细胞内RNA含量会干扰DNA的合成(图2),这种现象在dNTP含量较低时尤其显著。在细胞生长阶段有大量细胞RNA被转录生成,而此时dNTP含量较低,DNA聚合酶依赖于RNA的dNTPs二磷酸水解酶的活性可能有效抑制了非程序性的细胞DNA合成,从而保证了基因组的完整性。鉴于dNTP含量在调节细胞内DNA合成过程中的重要作用,这种RNA依赖性机制与通过控制DNA前体物(dNTPs)的可得到性和含量调控DNA聚合的调节机制是相一致的(Ji&Mathews,1991年;Chabes&Stillman, 2007年;Rampazzo等人,2010年;Gon等人,2011年;Niida等人,2011年)。然而,在细胞周期中的S期,dNTP含量较高,这种RNA干扰机制则不能影响DNA的合成。
体外观察到的RNA干扰DNA聚合酶及DNA合成的现象与体内观察到的依赖于RNA的DNA合成抑制现象相一致,无论是体外还是体内,dNTP含量对于调节RNA对DNA合成的干扰作用都至关重要。由于RNA在细胞周期的各个阶段是普遍存在的,而且细胞生长G期细胞内具备大量的RNA及低含量的dNTP,RNA与dNTPs含量之间的密切联系为细胞G期非程序性DNA合成的抑制提供了重要依据。
此外,结构分析(图3)与实验观察到的DNA聚合酶RNA依赖于的dNTPs二磷酸水解酶的活性对dNTP的水解现象是一致的。以ddATP与嗜热脂肪芽孢杆菌DNA聚合酶的活性位点相结合的晶体结构为基础,我们已经建立了dNTPs二磷酸水解酶水解dATP的结构模型(PDBID:3EZ5)(Golosov等人,2010年)。该模型显示:从dATP结合与聚合模式到dATP水解模式的转换只需要对DNA聚合酶与加入的dATP复合物进行微弱的改变(如dATP的糖折叠与攻击性水分子的微弱转变)(图3B)。该结构分析与DNA聚合酶因细微的构造改变而转变成二磷酸酶的现象是一致的。此外,该将该结构模型与肌苷三磷酸焦磷酸酶(或者二磷酸酶或ITP-DPase)和ITP复合物的结构作对比(Savchenko等人,2007年)(PDB ID:2Q16;图3A和3B),发现dATP-DPase与ITP-DPase结构在其三磷酸水解过程中具有惊人的相似性,如两者均具备二价金属离子催化机制,依赖于阳离子的水分子活化作用,结合两种核酸碱基dATP及dITP的疏水袋,以及通过芳香环堆叠的相互作用来增强结合亲和性。
研究表明DNA聚合酶的活性位点与dNTs的水解相关联,这与结构分析结果相一致(图3)。有趣的是,从化学角度分析,DNA聚合酶对dNTPs的聚合作用与水解作用是紧密相关的(图3c)。当水分子(亲核试剂)攻击dNTPs的α位磷酸基团时即发生水解作用(途径I);当活化的3’位羟基末端(亲核试剂)攻击dNTPs的α位磷酸基团时即发生DNA聚合作用(途径II);在这两个相似的反应(过程)中,焦磷酸作为离去基团及副产品被释放出来。以上结果说明RNA的结合会微弱地改变DNA聚合酶的构象,随后聚合酶的活性位点重组成其他构象,具有催化dNTP水解的功能。因此,聚合酶在自身环境中细微的构象改变可能会导致其反应由dNTP聚合转变成水解,潜在地提高聚合酶的编辑能力。
实验结果表明RNA能够与DNA聚合酶结合,并使其转变成三磷酸脱氧苷二磷酸水解酶(dNTP-DPase),选择性的将dNTPs水解为dNMPs与焦磷酸。结构分析显示微小的构象改变都会促进聚合酶结构的转变。另外,研究发现NTPs不是dNTPs二磷酸水解酶的底物,但可以作为该反应的抑制物。除此之外,体内实验及体外实验均发现,当dNTP浓度较低时,在RNA存在的条件下,dNTPs二磷酸水解酶的活性能耗尽DNA合成中的dNTPs,从而对DNA聚合产生不利影响。然而,当dNTP浓度较高时,DNA的合成则不受影响。此外,研究发现当dNTP浓度较低时,高含量的RNA会抑制细胞内的DNA合成及细胞增殖,而加入额外的dNTPs和(或)NTPs则能够解救细胞;研究还发现DNA聚合酶A、B、C、X家族成员普遍可以具备类似dNTPs二磷酸水解酶的活性。在分子层面的发现表明细胞内DNA聚合酶具备多种功能,细胞内RNA可能通过反馈机制调节非程序性DNA合成,例如细胞周期G期内对DNA合成的调控。
C.材料和方法
DNA聚合酶依赖于RNA的dNTPs二磷酸水解酶对dNTP的水解作用
反应液(5μL)包含各种单独的DNA聚合酶,RNA(小分子RNAs和大肠杆菌、酵母或人类总RNA,或其他RNAs),0.1μL α-32P-dATP(或γ-32P-dATP,α-32P-dCTP,α-32P-CTP或α-32P-ATP),缓冲液(终浓度:10mM Tris-HCl,10mM MgCl2,50mM NaCl,1mM DTT,pH 7.9)和水,在37℃水浴中培养30min至1h。然后用薄层色谱法(TLC)进行反应分析。在阴性对照试验中用水替代RNA或者DNA聚合酶。
dNTPs二磷酸水解酶对dNTP的水解作用的薄层色谱法(TLC)分析:100微米厚度的薄层色谱板购买于美国美光公司。在TLS上点样0.2μL(或0.5μL)的反应液,进行相应的对照。板的底部淹没在洗脱液中(异丙醇:氢氧化铵:水=5:4:2或6:3:1),使加样点在洗脱液上方一英寸的距离,室温下,在密封的展缸中跑色谱板30-45min。
凝胶迁移实验分析DNA聚合酶与RNA的结合:采用凝胶迁移实验检测RNA与DNA聚合酶的结合效果。混合物(5μL),含有32P-标记的RNA 69-mer(终浓度为50nM)、DNA聚合酶I(0、20、40、60或80nM)和结合缓冲液(终浓度分别为10mM KCI、1mM DTT、5%甘油,pH 7.0),室温下孵育30min,后放于4℃过夜。向结合液中加入凝胶染料(终浓度0mM KCI、1mM DTT、5%甘油、0.001%二甲苯蓝(重量体积比)),用10%的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳在电泳缓冲液(5mM Tris-HCl、10mM EDTA和pH 7.5)中进行沉积。凝胶在250V的电压下预跑1h,沉积样品后,凝胶在恒压(250V)下跑1h;以上操作均在4℃下进行。将胶固定于含7%乙酸(甲醇溶液中),干燥后扫描。使用图像定量分析软件对放射条带进行定量分析。以酶的浓度为X轴坐标,DNA聚合酶与RNA复合物(结合部分)的浓度为Y轴坐标,利用Sigma Plot绘制凝胶迁移实验分析得出的数据图。从结合曲线上测定出解离常数。
RNA在体外对DNA聚合的抑制:反应体系(5μL)包含5′-32P-标记的DNA引物21.1(1μL、100nM;终浓度:20nM);DNA模板55.1(0.5μL、2μM;终浓度:200nM)0.5μL 10X缓冲液(终浓度分别为:10mM Tris-HCl、10mM MgCl2、50mM NaCl、1mM DTT,pH 7.9),0.8μL dNTPs(终浓度分别为:3.5mM),0.2μL DNA聚合酶I(终浓度为50nM)和2μL TR-RNA(12nt;终浓度分别为0、25、50、75、100、150、200、300、400nM)或2μL大肠杆菌总RNA(终浓度分别为0、5、25、50、100、150、200、250、300、350或400ng/μL),在37℃下孵育30min。在阴性对照组中用水替代RNA。孵育后,通过添加凝胶染料(含7M尿素和1mM EDTA)猝灭反应并立即放置于干冰上。用变性聚丙烯酰胺凝胶(15%重量体积比;丙烯酰胺:双丙烯酰胺=19:1)和放射自显影法对进行反应分析。通过图像量化软件对产品条带进行量化分析。
低浓度dNTP条件下RNA依赖性的dNTPs二磷酸水解酶对细胞内DNA合成的干扰作用:分别在微量离心管(1.5mL)中加入大肠杆菌感受态细胞(10μL;BL21表达载体),pUC19质粒(0.5pmol),和不同添加剂(或添加剂组合),轻轻混匀。再加入不同量的DNA聚合酶和(或)RNA。进行转化后(包括在冰上转化5min),在37℃下孵育10min。向每个离心管中添加SOC培养基(50nL)和α-32P-dATP(1μL),轻轻混匀。在37℃下孵育20min,离心收集细胞团块。在Tris缓冲液(10μL,20mM,pH 8.5)中完全悬浮细胞团块,并向每个离心管中加入凝胶染料(10μL)。样品在95℃下加热5min裂解细胞,分别取10μL样品进行变性聚丙烯酰胺凝胶(6%凝胶)电泳分析。通过放射自显影直观化合成的细胞DNA。
低浓度dNTPs条件下RNA依赖性的dNTPs二磷酸水解酶对细胞生长的抑制及致死作用:分别在微量离心管(1.5mL)中加入大肠杆菌感受态细胞(10μL;BL21表达载体),pUC19质粒(0.5pmol),和不同添加剂(或添加剂组合),轻轻混匀。将离心管置于冰上30min,在42℃下热激1min,随后立即将离心管置于冰上5min,进行转化。向每个离心管中添加SOC培养基(50nL),以225rpm的转速,在37℃下摇动30min。在LB-氨苄青霉素培养板上涂布细菌培养基(10μL),将板置于37℃过夜培养,第二天就能直观观察到大肠杆菌菌落。
寡核苷酸的合成和纯化
6-mer RNA:5'-UCGACA-3'TR-RNA(12nt):5'-AUCCGAGUCAGG-3'(SEQ ID NO:1);
TC-RNA(12nt;TC-RNA互补TR-RNA):5'-CCUGACUCGGAU-3'(SEQ ID NO:2);
18-mer-RNA:5'-UCGACAUCGACA-UCGACA-3'(SEQ IDNO:3);
24-mer RNA:5'-UCGACAUCGACAUCGACAUCGACA-3'(SEQ ID NO:4);
RNA24.1:5'-AUGUGGAUUGGCGAUAAAAAACAA-3'(SEQ IDNO:5);
RNA-69mer:5'-rGGGAGCCCUGUCACCGGAUGUGCUUUCCGGUCUGAUGAGUCCGU-GAGGACAAAACAGGGCUCCCGAAUU-3'(SEQ ID NO:6);
DNA模板(55.1):5'-d(TGTACGTTTCGGCCTTTCGGCCTCATCAGGTTGCCTATAGTGAGTCGTATTACGC)-3'(SEQ ID NO:7);
DNA引物(21.1):5'-d(GCGTAATACGACTCACTATAG)-3'(SEQ IDNO:8);
其它RNA样品:人类总RNA,酵母细胞的总RNA,大肠杆菌细胞的总RNA,RNA梯(0.2、0.5、1.0、2.0、4.0和6.0kb)。
DNA引物(21.1),DNA模板(55.1),RNA24.1寡聚核苷酸序列通过固相合成的方法合成。用ABB 92 DNA/RNA合成仪进行化学合成,在合成的DNA中加入含水氢氧化铵,55℃过夜反应,将合成的DNA从柱子上水解下来。RNA的去保护参照文献(Carrasco等人,2004年)的方法。使用12或19%的尿素-聚丙烯酰胺凝胶进行产品分离(7M尿素,89mM Tris-HCl,89mM硼酸和2mM EDTA,凝胶的大小为40cm x35cm x1.6mm)。凝胶首先在700V的电压下跑1h,不用冷却,保持板温暖。然后将样品与染料混合、点样,跑胶2-4h。电泳结束后,将所需的寡核苷酸条带从凝胶上切下,放于TLC板顶部,在紫外下观察。将切下的凝胶放于1.5mL的微量离心管中压碎,加入3倍体积的水。将离心管在室温中放置于旋转器中浸泡过夜。用乙醇沉淀法回收寡核苷酸,通过紫外分光光光度计测定寡核苷酸的浓度。
体外RNA的转录:从带有T7 RNA聚合酶启动子基因的质粒pHHRZ上转录得到69-merRNA,使用AmpliscribeTM转录试剂盒(Epicentre)进行体外转录反应。一种典型的转录反应体系(20μL)包含50ng质粒(1μL),4μL 5X缓冲液(200mM Tris-HCl,pH 7.5,30mM MgCl2,50mM NaCl,10mM DTT,10mM亚精胺),10mM NTPs(各组分均为10mM,共8μL),0.05U/μL T7RNA聚合酶(1μL),核糖核酸酶游离水(6μL)。在37℃下孵育1h,柱子离心纯化回收69-merRNA,然后用乙醇进行沉淀。
细胞总RNA的提取:用RNA纯化试剂盒(Epicentre)分别从大肠杆菌细胞和酵母细胞中提取总RNA。简言之,将过夜培养(0.5mL)的大肠杆菌(0.5-3 xlO6细胞)或酵母菌培养基用含有蛋白激酶K的组织或细胞裂解液(300μL)进行裂解,在65℃下孵育10min。然后向裂解液中加入MPC蛋白沉淀试剂(150μL),离心10min(≥10,000Xg),收集上清。用70%的异丙醇沉淀回收上清中的核酸。再加入200μL DNase I溶液于孵育的核酸中,在37℃下反应10min除去污染物DNA。加入70%的异丙醇,在4℃下离心10min(≥10,000Xg),回收无DNA的RNA。人前列腺癌细胞总RNA和RNA梯(0.2、0.5、1.0、2.0、4.0和6.0kb,150ng/pL)均买自美光技术公司(美国)。
DNA聚合酶依赖RNA的dNTPs二磷酸水解酶的dNTP水解作用分析:反应液(5μL)包括各种单独的DNA聚合酶,细胞RNA(终浓度:200ng/μL;大肠杆菌、酵母或人类总RNA,和其他RNA),0.1μLα-32P-dATP(或γ-32P-dATP,α-32P-dCTP,α-32P-CTP或α-32P-ATP),缓冲液(终浓度:10mM Tris-HCl、10mM MgCl2、50mM NaCl、1mM DTT,pH7.9)和水,在37℃水浴中孵育30min到1h。用TLC(薄层色谱法)分析反应。在每个阴性对照实验中,RNA或DNA聚合酶用水代替。DNA聚合酶[大肠杆菌DNA聚合酶I,Klenow,和Klenow(3'-5' 外切酶)]从新英格兰生物实验室购买的。根据我们实验室要求,Dpo4用由国家卫生研究院的Roger Woodgate博士赠送的Dpo4表达质粒,而最初使用的Dpo4样品是由Zucai Suo博士(俄亥俄州立大学)赠送。人类DNA聚合酶β和E及大肠杆菌DNA聚合酶III(α-亚基)是Michael O'Donnell博士(洛克菲勒大学)赠送的。其他聚合酶是从商业公司购买的。
三磷酸的碱性水解:用氢氧化钠(总量:14μL)水解γ-32P-ATP:γ-32P-ATP(2μL)、NaOH(1.4μL,100mM;终浓度:10mM)和水(10.6μL)混合均匀,在90℃下加热反应1h。水解产物用作标志物进行TLC分析。
焦磷酸酶反应:反应液(5μL)包括γ-32P-dATP dNTPs二磷酸水解酶水解(2μL),0.5μL缓冲液(终浓度:10mM Tris-HCl,10mM MgCl2,50mM NaCl,1mM DTT,pH 7.9),无机焦磷酸酶(0.25μL;0.05U;EC 3.6.1.1)和水(2.25μL),在37℃下孵育15min后进行TLC分析。
多核苷酸激酶反应:反应液(10μL)包含DNA引物21.1(从1μM中提取的1μL)、10XPNK缓冲液(1μL;终浓度:70mM Tris-HCl,10mM MgCl2,5mM DTT,pH7.6),γ-32P-ATP(0.5μL,3000Ci/mmol,5mCi/ml),T4多核苷酸激酶(1U,1μL)和水(6.5μL),在37℃水浴中孵育1h,然后在68℃下加热10min使酶失活。添加NaCl(1.1μL,3M;终浓度0.3M)和100%乙醇(33.3μL),用乙醇沉淀法回收32p-标记的DNA,然后离心(14000rpm),移除上清液。团块用70%乙醇清洗3次,干燥后溶解在水中(10μL)。
RNA抑制体外DNA的聚合反应:反应液(5μL)包含5′-32P-标记的DNA引物21.1(1μL,100nM;终浓度:20nM),DNA模板55.1(0.5μL,2μM;终浓度:200nM),0.5μL 10X缓冲液(终浓度:10mM Tris-HCl,10mM MgCl2,50mM氯化钠,1mM DTT,pH 7.9),0.8μL dNTP(各底物终浓度均为3.5μM),0.2μL DNA聚合酶Ⅰ(终浓度50nM)和2μL TR-RNA(12nt;终浓度:0、25、50、75、100、150、200、300、400nM)或2μL大肠杆菌总RNA(终浓度:0、5、25、50、100、150、200、250、300、350和400ng/μL),在37℃下孵育30分钟。在阴性对照反应中,用水代替细胞RNA。孵育后,添加凝胶染料(含7M尿素和1mM乙二胺四乙酸)进行猝灭反应,然后立即放置在干冰上。用变性聚丙烯酰胺凝胶(15%重量体积比;丙烯酰胺:双丙烯酰胺=19:1)和放射自显影法进行反应分析;产物条带用图像量化软件来进行定量分析。
dNTPs二磷酸水解酶对dNTPs的水解作用的薄层色谱法(TLC)分析:100微米厚度的薄层色谱板是从购买于美国美光公司。在TLS上点样0.2μL(或0.5μL)的反应液,进行相应的对照。板的底部淹没在洗脱液中(异丙醇:氢氧化铵:水=5:4:2或6:3:1),使加样点在洗脱液上方一英寸的距离,室温下,在密封的展缸中跑色谱板30-45min。
FPLC和MS分析dNTPs水解产物;在添加DNA聚合酶I前,从反应混合物(150μL)取出50μL溶液,其中含有大肠杆菌总RNA(终浓度200ng/μL),100μM dATP(终浓度)和反应缓冲液(终浓度:10mM Tris-HCl,10mM MgC12,50mM NaCl,1mM DTT,pH 7.9)。所述溶液作为“0min”的反应液。向其他反应液(100μL)中添加DNA聚合酶Ⅰ(终浓度:100nM),开始dATP水解反应,在37℃水浴中孵育。反应开始30min、1h后分别取等量的溶液(分别为50μL),分别作为“30min”和“1h”的反应液。三种反应溶液用阴离子交换柱(HiTrapQHP,5mL,Amersham生物科学)进行分析,产物用FPLC进行纯化。具体操作过程如下:首先用10个柱体积(CV)的缓冲液B(终浓度:10mM磷酸钠,pH 7.8,1M NaCl)冲洗柱子以除去杂质,然后用10CV的缓冲液A(10mM磷酸钠,pH 7.8)冲洗来平衡柱子。上样到FPLC后,先用5CV的缓冲液A冲洗柱子,接着用超过60mL的缓冲液B以1mL/min的速度洗脱柱子,并用259nm的紫外吸收进行监测。dATP、dADP或dAMP的保留时间是是通过分析每个反应液,然后共注射dATP、dADP或dAMP来决定的。dATP水解产物用FPLC 和高效液相色谱法(脱盐)进行纯化,最终产品用MS进行分析确定其为dAMP(摩尔分子式:C10H14N5O6P;[M-H+]":330(计算的:330))。
凝胶迁移实验分析DNA聚合酶与RNA的结合:采用凝胶迁移实验检测RNA与DNA聚合酶的结合效果。混合物(5μL),含有32P-标记的RNA 69-mer(终浓度为50nM)、DNA聚合酶I(0、20、40、60或80nM)和结合缓冲液(终浓度分别为10mM KCI、1mM DTT、5%甘油,pH 7.0),室温下孵育30min,后放于4℃过夜。向结合液中加入凝胶染料(终浓度0mM KCI、1mM DTT、5%甘油、0.001%二甲苯蓝(重量体积比)),用10%的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳在电泳缓冲液(5mM Tris-HCl、10mM EDTA和pH 7.5)中进行沉积。凝胶在250V的电压下预跑1h,沉积样品后,凝胶在恒压(250V)下跑1h;以上操作均在4℃下进行。将胶固定于含7%乙酸(甲醇溶液中),干燥后扫描。使用图像定量分析软件对放射条带进行定量分析。以酶的浓度为X轴坐标,DNA聚合酶与RNA复合物(结合部分)的浓度为Y轴坐标,利用Sigma Plot绘制凝胶迁移实验分析得出的数据图。从结合曲线上测定出解离常数。
低浓度dNTP条件下RNA依赖性的dNTPs二磷酸水解酶对细胞内DNA合成的干扰作用:实验对大肠杆菌(BL21;购自Invitrogen公司)、细胞RNA(大肠杆菌总RNA)和(或)DNA聚合酶I,及其细胞内的DNA合成进行了研究。在转化前,将细胞的RNA(终浓度:50ng/μL)和(或)DNA聚合酶I(终浓度:50nM)加入到含有pUC19质粒的细胞悬液(0.5pmol)中。转化操作如下:先将离心管置于冰上冷冻30min,然后在42℃条件下热激1min,随后立即置于冰上冷冻5分钟。转化(10μL/管)后在37℃条件下培养10min,再加入SOC培养基(50μL)和α-32P-dATP(2μL),轻微混匀。各自取出10μL立即于-80℃冻存。这些样品作为零分钟的对照组,其余在37℃条件下,225rpm培养。分别于5、10、20和30min各自取出10μL并立即置于-80℃冻存。最后将这些样品高速离心10min,得到团块。在Tris缓冲液(10μL,20mM,pH 8.5)中完全悬浮细胞团块,并向每个离心管中加入凝胶染料(10μL)。样品在95℃下加热5min裂解细胞,分别取10μL样品进行变性聚丙烯酰胺凝胶(6%凝胶)电泳分析。通过放射自显影直观化合成的细胞DNA,并使用图像量化软件来对进行定量分析。
同时加入了低剂量RNA和聚合酶时,细胞出现死亡现象。显然,DNA聚合酶和RNA在细胞死亡中具有协同作用,这一结论可以通过分析细胞DNA的合成来确认(图S2)。少量DNA聚合酶和RNA的结合即可几乎完全抑制DNA的合成,这很可能就是DNA聚合酶和细胞RNA引起细胞死亡,造成感受态细胞dNTP枯竭的机制。
低浓度dNTPs条件下RNA依赖性的dNTPs二磷酸水解酶对细胞生长的抑制及致死作用:从Invitrogen公司购买化学法感受态大肠杆菌细胞(Top10)。向一小瓶感受态细胞(20μL)中加入10pmol pUC19质粒(4μL,购自Invitrogen公司),将混合物分装入8个离心管中(每管3μL)。向这些离心管中加入以下组分的不同组合:水,细胞RNA(大肠杆菌,酵母菌或人的总RNA),DNA聚合酶I,dNTPs(终浓度:10μM),和(或)NTPs(终浓度:10μM)。最终每个离心管内混合物体积为5μL。将离心管置于冰上30min,然后在42℃下热激细胞45s。再将离心管放回冰上2min,加入LB(1mL,不加抗生素)。在37℃下培养半小时。分别取50μL培养基涂布在LB-氨苄青霉素培养皿上。在37℃下过夜培养,第二天即可观察到大肠杆菌菌落。
实验中使用了来源于三种不同有生物体的总RNA样本:大肠杆菌,酵母菌和人。细菌在单独添加额外的水,细胞RNA,Klenow或dNTPs的情况下可以正常生长,但在同时加入了细胞RNA和DNA聚合酶的情况下,感受态细胞不能存活。然而,在RNA和DNA聚合酶存在的情况下再加入额外的dNTPs和(或)NTPs,细胞可以恢复生长。加入的dNTPs可以补充被依赖于RNA的dNTPs二磷酸水解酶活性水解的dNTPs,而加入NTPs则可以有效抑制dNTPs二磷酸水解酶的活性。
dNTPs二磷酸水解酶结构模型分析:该模型的研究结果(图3)与DNA聚合酶依赖于RNA的dNTPs二磷酸水解酶的活性造成dNTP水解的结果一致。以ddATP与嗜热脂肪芽孢杆菌DNA聚合酶的活性位点相结合的晶体结构为基础,我们已经建立了dATP水解模型(PDBID:3EZ5)。这个模型揭示了DNA聚合酶只需细微的变化(图3B)(例如,dATP分子轻微的旋转和攻击性水分子的移位)即可使它从结合与聚合dATP的状态转变为水解dATP的状态。这和我们观察到的DNA聚合酶可以作为二磷酸酶的实验现象是一致的。
此外,我们将该模型和肌苷三磷酸焦磷酸酶(或者二磷酸酶)以及ITP(PDBID:2016;图3A和3B)的复合物结构相比较。我们发现dNTPs二磷酸水解酶作用模型和三磷酸焦磷酸酶在三磷酸水解反应中具有惊人的相似性,如两者均具备二价金属离子催化机制,依赖于阳离子的水分子活化作用,酸碱基结合的疏水袋,以及通过芳香环堆叠的相互作用来增强亲和性。
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需明白公开的方法和复合物组分并不限制所述特定方法、协议和试剂的变更。同时需明白本发明所用术语仅用于说明具体实施例,不限制本发明的范围,所述范围仅由随附的权利要求进行限制。
必须指出本发明及随附的权利要求中,单数形式“a”、“an”和“the”包括其复数意义,除非内容另有明确说明。例如,提及“a RNA”应包括其复数含义,如RNAs;提及“the RNA”应系指一种或多种RNAs及现有技术已知的当量等。
在说明书及本说明书的权利要求中,单词“comprise(包括)”及其“comprising”和“comprises”等变形系指“包括但不限于”,且不排除其他添加剂、成分、整体或步骤。
“任选的”或“任选地”系指随后说明的事件、情况或材料可能或不可能发生或存在,且所述描述包括事件、情况或材料发生或存在的情况及未发生或不存在的情况。
本发明用“约”一个具体值和(或)“约”其他具体值的方式表示范围。当以所述形式表示范围时,特别涉及并考虑公开的范围为从一个具体值和(或)至其他具体值的范围,除非内容另有明确说明。类似地,当值为近似值时,使用先行词“约”需理解为具体值组成其他特别涉及并考虑公开的实施例,除非内容另有明确说明。需进一步理解,每个范围的端点与其他端点显著相关,但独立于其他端点,除非内容另有明确说明。最后,需理解明确公开的范围包含的所有的单个值及所述值的子范围,也特别涉及并考虑公开的值,除非内容另有明确说明。不考虑明确公开的实施例的特殊情况,前述内容应适用。
除非另有规定,本发明所用的所有技术和科学术语具有与公开的方法和复合物主分所属技术领域普通理解相同的含义。尽管在本发明方法和复合物组分的实践和试验可能使用任何与公开方法和复合物组分类似或相等的其他方法和材料,但本发明特别说明了有效的方法、设备和材料。本发明引用的出版物及其材料特此专门并入本发明作为参考。本发明任何内容不得解释为承认本发明不能因为是在先发明而先于所述披露,也不承认任何参考构成先前技术。关于参考文献中作者的讨论,申请人保留质疑所引用文件准确性和相关性的权利。需清楚明白尽管本发明引用了大量出版物,但所述引用不得理解为承认任何所述文件构成该技术领域公知常识的一部分。
尽管材料、复合物组分、成分、步骤、计算等描述可能包括大量选项和可选项,但这不得理解为也不承认所述选项和可选项相当于彼此,尤其是明显的可选项。因此,例如不同RNAs的清单不表明所列的RNAs对另一种RNA而言是显著的,或承认其是相同或显著的。
本发明公开的每种化合物或成分旨在作为且宜视为本发明的具体公开。此外,在本发明中可识别的亚群旨在作为且宜视为本发明的具体公开。因此,特别提及任何化合物或组分或其子组可明确包括或排除在适用的化合物或组分或其亚群中,或包括或排除在化合物或组分列表中。例如,作为一种选项,本发明描述任何一种化合物或组分时特别涉及一组RNAs,但不是tRNA、siRNA、snRNA、mRNA或rRNA。又例如,当本发明描述每种RNA,但不转化所述RNA时,特别涉及一组RNAs。mRNA和siRNA可分别和明确包括或排除在化合物或成分及本发明公开的方法内。
本发明公开的技术仅通过常规实验确认或能确认本发明描述方法和复合物组分具体实施例的很多等效实施例。所述实施例旨在纳入下述权利要求中。
Claims (18)
1.是一个抑制细胞中DNA合成的方法,该方法包括使RNA和细胞接触。
2.在权利要求1中, 其中的细胞是一个体的细胞,抑制细胞的DNA合成抑制细胞。
3.在权利要求2中,其中的细胞是癌细胞,抑制癌细胞的DNA合成抑制癌细胞。
4.在2或3的权利要求中,RNA被提供给个体。
5.在任何1-4的权利要求中, RNA是修饰过的RNA。
6.在任何1-5的权利要求中,组成成分中含有RNA,也有医药上可接受的载体。
7.在任何1-6的权利要求中,RNA被用来接触并进攻细胞。
8.在权利要求7中, 组成成分中含有至少一个有靶向性的分子。
9.在权利要求8中, 组成成分中含有的靶向性分子是识别并进攻肿瘤的多肽。
10.在任何1-9的权利要求中, RNA序列的多样性可以是多达1x104或更多。
11.在任何1-10的权利要求中,RNA的序列可以与细胞同源。
12.在任何1-11的权利要求中,RNA不功能编码蛋白质。
13.在任何1-12的权利要求中,抑制细胞的DNA合成会抑制细胞的生长。
14.在任何1-13的权利要求中,抑制细胞的DNA合成会抑制细胞的复制。
15.在任何1-14的权利要求中,抑制细胞的DNA合成会杀死细胞。
16.治疗癌症的一种方法,该方法包括向患有癌症的个体提供一个复合物,该复合物包含RNA、靶向性分子,和医药上可接受的载体。
17.在权利要求16中, 靶向性分子是识别并进攻肿瘤的多肽。
18.一个复合物,该复合物包含RNA、识别并进攻肿瘤的靶向性分子,和医药上可接受的载体。
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2014
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