CN110381980A - 核酸-多肽组合物以及诱导外显子跳读的方法 - Google Patents

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Abstract

本文公开了在错误剪接的mRNA转录物中诱导插入、缺失、复制或改变以诱导外显子跳读或外显子包含的分子和药物组合物。本文描述的还包括用于治疗疾病或病症的方法，其包括在错误剪接的mRNA转录物中诱导插入、缺失、复制或改变以诱导外显子跳读或外显子包含的分子或药物组合物。

Description

核酸-多肽组合物以及诱导外显子跳读的方法
交叉引用
本申请要求于2017年9月22日提交的第62/561,939号美国临时专利申请和2017年1月6日提交的第62/443,514号美国临时专利申请的权益，其中每一个通过引用整体并入本文。
序列表
本申请包含以ASCII格式通过电子方式提交的序列表，其通过引用整体并入于此。所述ASCII副本创建于2017年12月22日，命名为45532-715_601_SL.txt，大小为210,534字节。
背景技术
RNA功能的调节是治疗方面的开发领域。影响mRNA稳定性的药物，如反义寡核苷酸和短干扰RNA，是调节RNA功能的一种方式。另一组寡核苷酸可以通过改变前mRNA的加工来调节RNA功能，以在最终基因产物—编码的蛋白质—中包括或从中排除前mRNA的特定区域。因此，寡核苷酸治疗剂代表调节疾病状态的蛋白质表达的手段，因此具有作为治疗剂的用途。
发明内容
在某些实施方案中，本文公开了用于调节RNA加工的分子和药物组合物。
在某些实施方案中，本文公开了治疗有需要的受试者中由错误剪接的mRNA转录物引起的疾病或病症的方法，该方法包括：向该受试者施用多核酸分子缀合物；其中所述多核酸分子缀合物缀合至细胞靶向结合部分；其中多核苷酸任选地包含至少一个2’修饰的核苷酸、至少一个修饰的核苷酸间连接或至少一个反向脱碱基部分；其中所述多核酸分子缀合物在错误剪接的mRNA转录物中诱导插入、缺失、复制或改变，以在错误剪接的mRNA转录物中诱导外显子跳读(exon skipping)或外显子包含(exon inclusion)，从而生成完全加工的mRNA转录物；并且其中所述完全加工的mRNA转录物编码功能性蛋白质，从而治疗所述受试者的所述疾病或病症。在一些实施方案中，所述疾病或病症的特征还在于所述mRNA中的一个或多个突变。在一些实施方案中，所述疾病或病症包括神经肌肉疾病、遗传病、癌症、遗传性疾病或心血管疾病。在一些实施方案中，所述疾病或病症是肌营养不良症。在一些实施方案中，所述疾病或病症是杜氏肌营养不良症。在一些实施方案中，所述外显子跳读是DMD基因的外显子8、23、35、43、44、45、50、51、52、53 或55的外显子跳读。在一些实施方案中，所述外显子跳读是DMD基因的外显子23的外显子跳读。在一些实施方案中，所述多核酸分子缀合物包含式(I)的结构：
A-X-B
式I
其中，
A包含结合部分；
B由多核苷酸组成；且
X由键或第一连接体组成。
在一些实施方案中，所述多核酸分子缀合物包含式(II)的结构：
A-X-B-Y-C
式II
其中，
A包含结合部分；
B由多核苷酸组成；
C由聚合物组成；
X由键或第一连接体组成；且
Y由键或第二连接体组成。
在一些实施方案中，所述多核酸分子缀合物包含式(III)的结构：
A-X-C-Y-B
式III
其中，
A包含结合部分；
B由多核苷酸组成；
C由聚合物组成；
X由键或第一连接体组成；且
Y由键或第二连接体组成。
在一些实施方案中，所述至少一个2’修饰的核苷酸包括吗啉代、2’-O- 甲基、2’-O-甲氧基乙基(2’-O-MOE)、2’-O-氨基丙基、2’-脱氧、T-脱氧-2’-氟代、2’-O-氨基丙基(2’-O-AP)、2’-O-二甲基氨基乙基 (2’-O-DMAOE)、2’-O-二甲基氨基丙基(2’-O-DMAP)、T-O-二甲基氨基乙氧基乙基(2’-O-DMAEOE)或2’-O-N-甲基乙酰胺基(2’-O-NMA) 修饰的核苷酸。在一些实施方案中，所述至少一个2’修饰的核苷酸包括锁定核酸(LNA)、亚乙基核酸(ENA)或肽核酸(PNA)。在一些实施方案中，所述至少一个2’修饰的核苷酸包含吗啉代。在一些实施方案中，所述至少一个反向碱基部分是至少一个末端。在一些实施方案中，所述至少一个修饰的核苷酸间连接包括硫代磷酸酯连接或二硫代磷酸酯连接。在一些实施方案中，所述多核酸分子的长度为至少约10至约30 个核苷酸。在一些实施方案中，所述多核酸分子的长度为至少以下之一：约15至约30、约18至约25、约18至约24、约19至约23或约20至约22个核苷酸。在一些实施方案中，所述多核酸分子的长度为至少约 16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个核苷酸。在一些实施方案中，所述多核酸分子包含至少以下之一：约5％至约100％的修饰、约 10％至约100％的修饰、约20％至约100％的修饰、约30％至约100％的修饰、约40％至约100％的修饰、约50％至约100％的修饰、约60％至约 100％的修饰、约70％至约100％的修饰、约80％至约100％的修饰和约 90％至约100％的修饰。在一些实施方案中，所述多核酸分子包含至少以下之一：约10％至约90％的修饰、约20％至约90％的修饰、约30％至约90％的修饰、约40％至约90％的修饰、约50％至约90％的修饰、约60％至约90％的修饰、约70％至约90％的修饰和约80％至约100％的修饰。在一些实施方案中，所述多核酸分子包含至少以下之一：约10％至约80％的修饰、约20％至约80％的修饰、约30％至约80％的修饰、约40％至约 80％的修饰、约50％至约80％的修饰、约60％至约80％的修饰和约70％至约80％的修饰。在一些实施方案中，所述多核酸分子包含至少以下之一：约10％至约70％的修饰、约20％至约70％的修饰、约30％至约70％的修饰、约40％至约70％的修饰、约50％至约70％的修饰和约60％至约 70％的修饰。在一些实施方案中，所述多核酸分子包含至少以下之一：约10％至约60％的修饰、约20％至约60％的修饰、约30％至约60％的修饰、约40％至约60％的修饰和约50％至约60％的修饰。在一些实施方案中，所述多核酸分子包含至少以下之一：约10％至约50％的修饰、约20％至约50％的修饰、约30％至约50％的修饰和约40％至约50％的修饰。在一些实施方案中，所述多核酸分子包含至少以下之一：约10％至约40％的修饰、约20％至约40％的修饰和约30％至约40％的修饰。在一些实施方案中，所述多核酸分子包含至少以下之一：约10％至约30％的修饰和约20％至约30％的修饰。在一些实施方案中，所述多核酸分子包含约10％至约20％的修饰。在一些实施方案中，所述多核酸分子包含约15％至约 90％、约20％至约80％、约30％至约70％或约40％至约60％的修饰。在一些实施方案中，所述多核酸分子包含至少约15％、20％、30％、40％、 50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％的修饰。在一些实施方案中，所述多核酸分子包含至少约3、约4、约5、约6、约7、约8、约9、约 10、约11、约12、约13、约14、约15、约16、约17、约18、约19、约20、约21、约22个或更多个修饰。在一些实施方案中，所述多核酸分子包含至少约1、约2、约3、约4、约5、约6、约7、约8、约9、约10、约11、约12、约13、约14、约15、约16、约17、约18、约19、约20、约21、约22个或更多个修饰的核苷酸。在一些实施方案中，所述多核酸分子包含单链。在一些实施方案中，所述多核酸分子包含两条或更多条链。在一些实施方案中，所述多核酸分子包含第一多核苷酸和与所述第一多核苷酸杂交以形成双链多核酸分子的第二多核苷酸。在一些实施方案中，所述第二多核苷酸包含至少一个修饰。在一些实施方案中，所述第一多核苷酸和所述第二多核苷酸为RNA分子。在一些实施方案中，所述第一多核苷酸和所述第二多核苷酸为siRNA分子。在一些实施方案中，X和Y独立地为键、可降解连接体、不可降解连接体、可切割连接体或非聚合连接体基团。在一些实施方案中，X为键。在一些实施方案中，X为C1-C6烷基。在一些实施方案中，Y为C1-C6烷基。在一些实施方案中，X为同双官能连接体或异双官能连接体，任选地缀合至C1-C6烷基。在一些实施方案中，Y为同双官能连接体或异双官能连接体。在一些实施方案中，所述结合部分是抗体或其结合片段。在一些实施方案中，所述抗体或其结合片段包括人源化抗体或其结合片段、嵌合抗体或其结合片段、单克隆抗体或其结合片段、单价Fab’、二价Fab2、单链可变片段(scFv)、双抗体、微抗体、纳米抗体、单域抗体(sdAb) 或者骆驼科抗体或其结合片段。在一些实施方案中，C为聚乙二醇。在一些实施方案中，C具有约5000Da的分子量。在一些实施方案中，A-X 缀合至B的5’端且Y-C缀合至B的3’端。在一些实施方案中，Y-C缀合至B的5’端且A-X缀合至B的3’端。在一些实施方案中，A-X、Y-C 或其组合缀合至核苷酸间连接基团。在一些实施方案中，方法进一步包括D。在一些实施方案中，D缀合至C或A。在一些实施方案中，D根据式(IV)缀合至式(II)的分子缀合物：
(A-X-B-Y-Cc)-L-D
式IV
其中，
A包含结合部分；
B由多核苷酸组成；
C由聚合物组成；
X由键或第一连接体组成；
Y由键或第二连接体组成；
L由键或第三连接体组成；
D由内体溶解(endosomolytic)部分组成；且
c为0至1的整数；并且
其中所述多核苷酸包含至少一个2’修饰的核苷酸、至少一个修饰的核苷酸间连接或反向脱碱基部分；并且D缀合在A、B或C上的任何地方。
在一些实施方案中，D为INF7或蜂毒肽。在一些实施方案中，L为C1-C6烷基。在一些实施方案中，L为同双官能连接体或异双官能连接体。在一些实施方案中，方法进一步包括至少第二结合部分A。在一些实施方案中，所述至少第二结合部分A缀合至A、B或C。
在一些实施方案中，本文公开了在错误剪接的mRNA转录物中诱导插入、缺失、复制或改变以在错误剪接的mRNA转录物中诱导外显子跳读或外显子包含的方法，该方法包括：使靶细胞与多核酸分子缀合物接触，其中多核苷酸包含至少一个2’修饰的核苷酸、至少一个修饰的核苷酸间连接或至少一个反向脱碱基部分；使所述多核酸分子缀合物与靶细胞内错误剪接的mRNA转录物杂交，以在所述错误剪接的mRNA转录物中诱导插入、缺失、复制或改变，从而诱导外显子跳读或外显子包含，其中所述错误剪接的mRNA转录物能够编码功能形式的蛋白质；并且从前一步的完全加工的mRNA转录物翻译所述功能形式的蛋白质。在一些实施方案中，所述靶细胞是受试者的靶细胞。在一些实施方案中，所述错误剪接的mRNA转录物进一步诱导疾病或病症。在一些实施方案中，所述疾病或病症的特征还在于所述mRNA中的一个或多个突变。在一些实施方案中，所述疾病或病症包括神经肌肉疾病、遗传病、癌症、遗传性疾病或心血管疾病。在一些实施方案中，所述疾病或病症是肌营养不良症。在一些实施方案中，所述疾病或病症是杜氏肌营养不良症。在一些实施方案中，所述外显子跳读是DMD基因的外显子8、23、35、 43、44、45、50、51、52、53或55的外显子跳读。在一些实施方案中，所述外显子跳读是DMD基因的外显子23的外显子跳读。在一些实施方案中，所述多核酸分子缀合物包含式(I)的结构：
A-X-B
式I
其中，
A包含结合部分；
B由多核苷酸组成；且
X由键或第一连接体组成。
在一些实施方案中，所述多核酸分子缀合物包含式(II)的结构：
A-X-B-Y-C
式II
其中，
A包含结合部分；
B由多核苷酸组成；
C由聚合物组成；
X由键或第一连接体组成；且
Y由键或第二连接体组成。
在一些实施方案中，所述多核酸分子缀合物包含式(III)的结构：
A-X-C-Y-B
式III
其中，
A包含结合部分；
B由多核苷酸组成；
C由聚合物组成；
X由键或第一连接体组成；且
Y由键或第二连接体组成。
在一些实施方案中，所述至少一个2’修饰的核苷酸包括吗啉代、2’-O- 甲基、2’-O-甲氧基乙基(2’-O-MOE)、2’-O-氨基丙基、2’-脱氧、T-脱氧-2’-氟代、2’-O-氨基丙基(2’-O-AP)、2’-O-二甲基氨基乙基 (2’-O-DMAOE)、2’-O-二甲基氨基丙基(2’-O-DMAP)、T-O-二甲基氨基乙氧基乙基(2’-O-DMAEOE)或2’-O-N-甲基乙酰胺基(2’-O-NMA) 修饰的核苷酸。在一些实施方案中，所述至少一个2’修饰的核苷酸包含锁定核酸(LNA)、亚乙基核酸(ENA)、肽核酸(PNA)。在一些实施方案中，所述至少一个2’修饰的核苷酸包含吗啉代。在一些实施方案中，所述至少一个反向碱基部分是至少一个末端。在一些实施方案中，所述至少一个修饰的核苷酸间连接包括硫代磷酸酯连接或二硫代磷酸酯连接。在一些实施方案中，所述多核酸分子的长度为至少约10至约30 个核苷酸。在一些实施方案中，所述多核酸分子的长度为至少以下之一：约15至约30、约18至约25、约18至约24、约19至约23或约20至约22个核苷酸。在一些实施方案中，所述多核酸分子的长度为至少约 16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个核苷酸。在一些实施方案中，所述多核酸分子包含至少以下之一：约5％至约100％的修饰、约 10％至约100％的修饰、约20％至约100％的修饰、约30％至约100％的修饰、约40％至约100％的修饰、约50％至约100％的修饰、约60％至约 100％的修饰、约70％至约100％的修饰、约80％至约100％的修饰和约 90％至约100％的修饰。在一些实施方案中，所述多核酸分子包含至少以下之一：约10％至约90％的修饰、约20％至约90％的修饰、约30％至约90％的修饰、约40％至约90％的修饰、约50％至约90％的修饰、约60％至约90％的修饰、约70％至约90％的修饰和约80％至约100％的修饰。在一些实施方案中，所述多核酸分子包含至少以下之一：约10％至约80％的修饰、约20％至约80％的修饰、约30％至约80％的修饰、约40％至约 80％的修饰、约50％至约80％的修饰、约60％至约80％的修饰和约70％至约80％的修饰。在一些实施方案中，所述多核酸分子包含至少以下之一：约10％至约70％的修饰、约20％至约70％的修饰、约30％至约70％的修饰、约40％至约70％的修饰、约50％至约70％的修饰和约60％至约 70％的修饰。在一些实施方案中，所述多核酸分子包含至少以下之一：约10％至约60％的修饰、约20％至约60％的修饰、约30％至约60％的修饰、约40％至约60％的修饰和约50％至约60％的修饰。在一些实施方案中，所述多核酸分子包含至少以下之一：约10％至约50％的修饰、约20％至约50％的修饰、约30％至约50％的修饰和约40％至约50％的修饰。在一些实施方案中，所述多核酸分子包含至少以下之一：约10％至约40％的修饰、约20％至约40％的修饰和约30％至约40％的修饰。在一些实施方案中，所述多核酸分子包含至少以下之一：约10％至约30％的修饰和约20％至约30％的修饰。在一些实施方案中，所述多核酸分子包含约10％至约20％的修饰。在一些实施方案中，所述多核酸分子包含约15％至约 90％、约20％至约80％、约30％至约70％或约40％至约60％的修饰。在一些实施方案中，所述多核酸分子包含至少约15％、20％、30％、40％、 50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％的修饰。在一些实施方案中，所述多核酸分子包含至少约3、约4、约5、约6、约7、约8、约9、约 10、约11、约12、约13、约14、约15、约16、约17、约18、约19、约20、约21、约22个或更多个修饰。在一些实施方案中，所述多核酸分子包含至少约1、约2、约3、约4、约5、约6、约7、约8、约9、约10、约11、约12、约13、约14、约15、约16、约17、约18、约19、约20、约21、约22个或更多个修饰的核苷酸。在一些实施方案中，所述多核酸分子包含单链。在一些实施方案中，所述多核酸分子包含两条或更多条链。在一些实施方案中，所述多核酸分子包含第一多核苷酸和与所述第一多核苷酸杂交以形成双链多核酸分子的第二多核苷酸。在一些实施方案中，所述第二多核苷酸包含至少一个修饰。在一些实施方案中，所述第一多核苷酸和所述第二多核苷酸是RNA分子。在一些实施方案中，所述第一多核苷酸和所述第二多核苷酸是siRNA分子。在一些实施方案中，X和Y独立地为键、可降解连接体、不可降解连接体、可切割连接体或非聚合连接体基团。在一些实施方案中，X为键。在一些实施方案中，X为C1-C6烷基。在一些实施方案中，Y为C1-C6烷基。在一些实施方案中，X为同双官能连接体或异双官能连接体，任选地缀合至C1-C6烷基。在一些实施方案中，Y为同双官能连接体或异双官能连接体。在一些实施方案中，所述结合部分是抗体或其结合片段。在一些实施方案中，所述抗体或其结合片段包括人源化抗体或其结合片段、嵌合抗体或其结合片段、单克隆抗体或其结合片段、单价Fab’、二价Fab2、单链可变片段(scFv)、双抗体、微抗体、纳米抗体、单域抗体(sdAb) 或者骆驼科抗体或其结合片段。在一些实施方案中，C为聚乙二醇。在一些实施方案中，C具有约5000Da的分子量。在一些实施方案中，A-X 缀合至B的5’端且Y-C缀合至B的3’端。在一些实施方案中，Y-C缀合至B的5’端且A-X缀合至B的3’端。在一些实施方案中，A-X、Y-C 或其组合缀合至所述核苷酸间连接基团。在一些实施方案中，方法进一步包括D。在一些实施方案中，D缀合至C或A。在一些实施方案中， D根据式(IV)缀合至式(II)的分子缀合物：
(A-X-B-Y-Cc)-L-D
式IV
其中，
A包含结合部分；
B由多核苷酸组成；
C由聚合物组成；
X由键或第一连接体组成；
Y为键或第二连接体；
L由键或第三连接体组成；
D由内体溶解部分组成；且
c为0至1的整数；并且
其中多核苷酸包含至少一个2’修饰的核苷酸、至少一个修饰的核苷酸间连接或反向脱碱基部分；并且D缀合在A、B或C上的任何地方。在一些实施方案中，D为INF7或蜂毒肽。在一些实施方案中，L为C1-C6烷基。在一些实施方案中，L为同双官能连接体或异双官能连接体。在一些实施方案中，方法进一步包括至少第二结合部分A。在一些实施方案中，所述至少第二结合部分A缀合至A、B或C。在一些实施方案中，所述方法是体内方法。在一些实施方案中，所述方法是体外方法。在一些实施方案中，所述受试者是人。
在某些实施方案中，本文公开了包含通过任一种本文公开的方法获得的分子和药学上可接受的赋形剂的药物组合物。在一些实施方案中，所述药物组合物被配制为纳米颗粒制剂。在一些实施方案中，所述药物组合物被配制用于肠胃外、口服、鼻内、颊部、直肠或透皮给药。
在某些实施方案中，本文公开了包含通过任一种本文公开的方法获得的分子的药盒。
在某些实施方案中，本文公开了包含多核酸分子缀合物的组合物，其中所述多核酸分子缀合物包含含有与SEQ ID NO:54-972具有至少 60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、 99％或100％序列同一性的序列的多核苷酸。在某些实施方案中，本文公开了包含多核酸分子缀合物的组合物，其中所述多核酸分子缀合物包含含有与SEQ ID NO:54-972具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、 98％、99％或100％序列同一性的序列的多核苷酸。在某些实施方案中，所述多核酸分子缀合物包含式(I)的结构：
A-X-B
式I
其中，
A包含结合部分；
B由多核苷酸组成；且
X由键或第一连接体组成。
在某些实施方案中，所述多核酸分子缀合物包含式(II)的结构：
A-X-B-Y-C
式II
其中，
A包含结合部分；
B由多核苷酸组成；
C由聚合物组成；
X由键或第一连接体组成；且
Y由键或第二连接体组成。
在某些实施方案中，所述多核酸分子缀合物包含式(III)的结构：
A-X-C-Y-B
式III
其中，
A包含结合部分；
B由多核苷酸组成；
C由聚合物组成；
X由键或第一连接体组成；且
Y由键或第二连接体组成。
在某些实施方案中，所述至少一个2’修饰的核苷酸包括吗啉代、2’-O- 甲基、2’-O-甲氧基乙基(2’-O-MOE)、2’-O-氨基丙基、2’-脱氧、T-脱氧-2’-氟代、2’-O-氨基丙基(2’-O-AP)、2’-O-二甲基氨基乙基 (2’-O-DMAOE)、2’-O-二甲基氨基丙基(2’-O-DMAP)、T-O-二甲基氨基乙氧基乙基(2’-O-DMAEOE)或2’-O-N-甲基乙酰胺基(2’-O-NMA) 修饰的核苷酸。在一些实施方案中，所述至少一个2’修饰的核苷酸包含吗啉代。
在某些实施方案中，本文公开了治疗疾病或病症的方法，其包括：向受试者施用多核酸分子缀合物；其中所述多核酸分子缀合物包含靶细胞结合部分和靶向的前mRNA特异性剪接调节多核酸部分；其中所述靶细胞结合部分与靶细胞特异性结合，并且所述靶向的前mRNA特异性剪接调节多核酸部分在所述靶细胞中诱导靶向的前mRNA转录物的插入、缺失、复制或改变，以在所述靶向的前mRNA转录物中诱导剪接事件，从而生成mRNA转录物；并且其中所述mRNA转录物编码与未处理的靶细胞中的相同蛋白质相比得到修饰的蛋白质，从而治疗所述受试者的所述疾病或病症。在某些实施方案中，所述剪接事件是外显子跳读。在某些实施方案中，所述剪接事件是外显子包含。在某些实施方案中，所述疾病或病症的特征还在于所述前mRNA中的一个或多个突变。在某些实施方案中，所述疾病或病症包括神经肌肉疾病、遗传病、癌症、遗传性疾病或心血管疾病。在某些实施方案中，所述疾病或病症是肌营养不良症。在某些实施方案中，所述疾病或病症是杜氏肌营养不良症。在某些实施方案中，所述剪接事件是DMD基因的外显子8、23、35、43、 44、45、50、51、52、53或55的剪接事件。在某些实施方案中，所述剪接事件是DMD基因的外显子23的剪接事件。在某些实施方案中，所述剪接事件是PAH、MSTN或K-Ras基因的外显子的剪接事件。在某些实施方案中，所述多核酸分子缀合物包含式(I)的结构：
A-X-B
式I
其中，
A包含结合部分；
B由多核苷酸组成；且
X由键或第一连接体组成。
在某些实施方案中，所述多核酸分子缀合物包含式(II)的结构：
A-X-B-Y-C
式II
其中，
A包含结合部分；
B由多核苷酸组成；
C由聚合物组成；
X由键或第一连接体组成；且
Y由键或第二连接体组成。
在某些实施方案中，所述多核酸分子缀合物包含式(III)的结构：
A-X-C-Y-B
式III
其中，
A包含结合部分；
B由多核苷酸组成；
C由聚合物组成；
X由键或第一连接体组成；且
Y由键或第二连接体组成。
在某些实施方案中，所述多核酸分子缀合物任选地包含至少一个2’修饰的核苷酸、至少一个修饰的核苷酸间连接或至少一个反向脱碱基部分。在某些实施方案中，所述至少一个2’修饰的核苷酸包括吗啉代、2’-O- 甲基、2’-O-甲氧基乙基(2’-O-MOE)、2’-O-氨基丙基、2’-脱氧、T-脱氧-2’-氟代、2’-O-氨基丙基(2’-O-AP)、2’-O-二甲基氨基乙基 (2’-O-DMAOE)、2’-O-二甲基氨基丙基(2’-O-DMAP)、T-O-二甲基氨基乙氧基乙基(2’-O-DMAEOE)或2’-O-N-甲基乙酰胺基(2’-O-NMA) 修饰的核苷酸。在某些实施方案中，所述至少一个2’修饰的核苷酸包含锁定核酸(LNA)、亚乙基核酸(ENA)或肽核酸(PNA)。在某些实施方案中，所述至少一个2’修饰的核苷酸包含吗啉代。在某些实施方案中，所述至少一个反向碱基部分是至少一个末端。在某些实施方案中，所述至少一个修饰的核苷酸间连接包括硫代磷酸酯连接或二硫代磷酸酯连接。在某些实施方案中，所述多核酸分子在长度上包含至少约10至约 30个核苷酸。在某些实施方案中，所述多核酸分子包含至少约15％、20％、 30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％的修饰。在某些实施方案中，所述多核酸分子包含单链。在某些实施方案中，所述多核酸分子包含两条或更多条链。在某些实施方案中，所述多核酸分子包含第一多核苷酸和与所述第一多核苷酸杂交以形成双链多核酸分子的第二多核苷酸。在某些实施方案中，所述第二多核苷酸包含至少一个修饰。在某些实施方案中，所述第一多核苷酸和所述第二多核苷酸包含RNA 分子。在某些实施方案中，所述第一多核苷酸和所述第二多核苷酸包含 siRNA分子。在某些实施方案中，X为键。在某些实施方案中，X和Y 独立地为键、可降解连接体、不可降解连接体、可切割连接体或非聚合连接体基团。在某些实施方案中，X和Y独立地为键、可降解连接体、不可降解连接体、可切割连接体或非聚合连接体基团。在某些实施方案中，X为C1-C6烷基。在某些实施方案中，X或Y为C1-C6烷基。在某些实施方案中，X或Y为C1-C6烷基。在某些实施方案中，所述结合部分是抗体或其结合片段。在某些实施方案中，所述结合部分是抗体或其结合片段。在某些实施方案中，所述结合部分是抗体或其结合片段。在某些实施方案中，C为聚乙二醇。在某些实施方案中，C为聚乙二醇。在某些实施方案中，A-X缀合至B的5’端且Y-C缀合至B的3’端。在某些实施方案中，Y-C缀合至B的5’端且A-X缀合至B的3’端。在某些实施方案中，方法进一步包括D。在某些实施方案中，D缀合至C或 A。在某些实施方案中，方法进一步包括至少第二结合部分A。在某些实施方案中，方法进一步包括至少第二结合部分A。在某些实施方案中，方法进一步包括至少第二结合部分A。
在某些实施方案中，本文公开了在靶向的前mRNA转录物中诱导剪接事件的方法，其包括：(a)使靶细胞与多核酸分子缀合物接触，其中所述多核酸分子缀合物包含靶细胞结合部分和靶向的前mRNA剪接调节多核酸部分；(b)使所述靶向的前mRNA剪接调节多核酸部分与靶细胞内的所述靶向的前mRNA转录物杂交，以在所述靶向的前mRNA 转录物中诱导剪接事件，从而产生mRNA转录物；(c)任选地，在靶细胞中翻译步骤(b)的mRNA转录物，以产生蛋白质。在某些实施方案中，所述剪接事件是外显子跳读。在某些实施方案中，所述剪接事件是外显子包含。在某些实施方案中，所述靶向的前mRNA转录物诱导疾病或病症。在某些实施方案中，所述疾病或病症包括神经肌肉疾病、遗传病、癌症、遗传性疾病或心血管疾病。在某些实施方案中，所述多核酸分子缀合物：
a)包含式(I)的结构：
A-X-B
式I
其中，
A包含结合部分；
B由多核苷酸组成；且
X由键或第一连接体组成；
b)包含式(II)的结构：
A-X-B-Y-C
式II
其中，
A包含结合部分；
B由多核苷酸组成；
C由聚合物组成；
X由键或第一连接体组成；且
Y由键或第二连接体组成；或者
c)包含式(III)的结构：
A-X-C-Y-B
式III
其中，
A包含结合部分；
B由多核苷酸组成；
C由聚合物组成；
X由键或第一连接体组成；且
Y由键或第二连接体组成。
在某些实施方案中，所述多核酸分子缀合物任选地包含至少一个2’修饰的核苷酸、至少一个修饰的核苷酸间连接或至少一个反向脱碱基部分。在某些实施方案中，所述至少一个2’修饰的核苷酸包括吗啉代、2’-O- 甲基、2’-O-甲氧基乙基(2’-O-MOE)、2’-O-氨基丙基、2’-脱氧、T-脱氧-2’-氟代、2’-O-氨基丙基(2’-O-AP)、2’-O-二甲基氨基乙基 (2’-O-DMAOE)、2’-O-二甲基氨基丙基(2’-O-DMAP)、T-O-二甲基氨基乙氧基乙基(2’-O-DMAEOE)或2’-O-N-甲基乙酰胺基(2’-O-NMA) 修饰的核苷酸。在某些实施方案中，所述至少一个2’修饰的核苷酸包含锁定核酸(LNA)、亚乙基核酸(ENA)、肽核酸(PNA)。在某些实施方案中，所述至少一个2’修饰的核苷酸包含吗啉代。在某些实施方案中，所述至少一个反向碱基部分是至少一个末端。在某些实施方案中，所述至少一个修饰的核苷酸间连接包括硫代磷酸酯连接或二硫代磷酸酯连接。在某些实施方案中，所述多核酸分子在长度上包含至少约10至约30个核苷酸。在某些实施方案中，所述多核酸分子包含至少约15％、20％、 30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％的修饰。在某些实施方案中，所述多核酸分子包含至少约3、约4、约5、约6、约7、约8、约9、约10、约11、约12、约13、约14、约15、约16、约17、约18、约19、约20、约21、约22个或更多个修饰。在某些实施方案中， X和Y独立地为键、可降解连接体、不可降解连接体、可切割连接体或非聚合连接体基团。在某些实施方案中，X为键。在某些实施方案中， X为C1-C6烷基。在某些实施方案中，Y为C1-C6烷基。在某些实施方案中，X为同双官能连接体或异双官能连接体，任选地缀合至C1-C6烷基。在某些实施方案中，Y为同双官能连接体或异双官能连接体。在某些实施方案中，所述结合部分是抗体或其结合片段。在某些实施方案中，C 为聚乙二醇。在某些实施方案中，A-X缀合至B的5’端且Y-C缀合至B 的3’端。在某些实施方案中，Y-C缀合至B的5’端且A-X缀合至B的 3’端。在某些实施方案中，A-X、Y-C或其组合缀合至核苷酸间连接基团。在某些实施方案中，方法进一步包括D。在某些实施方案中，D缀合至C或A。在某些实施方案中，方法进一步包括至少第二结合部分A。
在某些实施方案中，本文公开了包含靶细胞结合部分和靶向的前 mRNA特异性剪接调节多核酸部分的多核酸分子缀合物组合物，其中所述靶向的前mRNA特异性剪接调节多核酸部分包含与SEQ ID NO: 54-972具有60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、 97％、98％、99％或100％序列同一性的序列。在某些实施方案中，所述多核酸分子缀合物：
a)包含式(I)的结构：
A-X-B
式I
其中，
A包含结合部分；
B由多核苷酸组成；且
X由键或第一连接体组成；
b)包含式(II)的结构：
A-X-B-Y-C
式II
其中，
A包含结合部分；
B由多核苷酸组成；
C由聚合物组成；
X由键或第一连接体组成；且
Y由键或第二连接体组成；或者
c)包含式(III)的结构：
A-X-C-Y-B
式III
其中，
A包含结合部分；
B由多核苷酸组成；
C由聚合物组成；
X由键或第一连接体组成；且
Y由键或第二连接体组成。
在某些实施方案中，药物组合物被配制成纳米颗粒制剂。
附图说明
图1描绘了末端核苷酸扩展的二氨基磷酸酯吗啉代寡聚物(PMO) 序列(SEQ IDNO:28)。
图2A描绘了末端核苷酸扩展的硫代磷酸酯反义寡核苷酸(PS ASO)序列(SEQ IDNO:29)。
图2B描绘了充分扩展的硫代磷酸酯反义寡核苷酸(PS ASO)序列(SEQ ID NO:29)。
图3描绘了使用Taqman qPCR对总RNA中跳读的DMD mRNA 进行定量的方法。
图4描绘了用疏水相互作用色谱(HIC)方法2产生的抗CD71 mAb-PMO反应混合物的色谱图。
图5A描绘了使用大小排阻色谱(SEC)方法1产生的抗CD71 mAb 的色谱图。
图5B描绘了使用大小排阻色谱(SEC)方法1产生的抗CD71 mAb-PMO DAR 1,2的色谱图。
图5C描绘了使用大小排阻色谱(SEC)方法1产生的抗CD71 mAb-PMO DAR>2的色谱图。
图6A描绘了使用疏水相互作用色谱(HIC)方法2产生的抗CD71 mAb的色谱图。
图6B描绘了使用疏水相互作用色谱(HIC)方法2产生的纯化的抗CD71 mAb-PMODAR 1,2缀合物的色谱图。
图6C描绘了使用疏水相互作用色谱(HIC)方法2产生的纯化的抗CD71 mAb-PMODAR>2缀合物的色谱图。
图7A描绘了使用疏水相互作用色谱(HIC)方法3对抗CD71 Fab-PMO进行快速蛋白质液相色谱(FPLC)纯化的色谱图。
图7B描绘了使用SEC方法1产生的抗CD71 Fab的色谱图。
图7C描绘了使用SEC方法1产生的抗CD71 Fab-PMO DAR1缀合物的色谱图。
图7D描绘了使用SEC方法1产生的抗CD71 Fab-PMO DAR 2缀合物的色谱图。
图7E描绘了使用SEC方法1产生的抗CD71 Fab-PMO DAR 3缀合物的色谱图。
图7F描绘了使用HIC方法4产生的抗CD71 Fab的色谱图。
图7G描绘了使用HIC方法4产生的抗CD71 Fab-PMO DAR 1缀合物的色谱图。
图7H描绘了使用HIC方法4产生的抗CD71 Fab-PMO DAR 2缀合物的色谱图。
图7I描绘了使用HIC方法4产生的抗CD71 Fab-PMO DAR 3缀合物的色谱图。
图8A描绘了使用SAX方法2产生的抗CD71 mAb-PS ASO反应混合物的色谱图。
图8B描绘了使用SEC方法1产生的抗CD71 mAb的色谱图。
图8C描绘了使用SEC方法1产生的抗CD71 mAb-PS ASO DAR 1 缀合物的色谱图。
图8D描绘了使用SEC方法1产生的抗CD71 mAb-PS ASO DAR 2 缀合物的色谱图。
图8E描绘了使用SEC方法1产生的抗CD71 mAb-PS ASO DAR 3 缀合物的色谱图。
图8F描绘了使用SAX方法2产生的抗CD71 mAb-PS ASO DAR 1 缀合物的色谱图。
图8G描绘了使用SAX方法2产生的抗CD71 mAb-PS ASO DAR 2 缀合物的色谱图。
图8H描绘了使用SAX方法2产生的抗CD71 mAb-PS ASO DAR 3 缀合物的色谱图。
图9描绘了使用PMO和抗CD71 mAb-PMO缀合物检测分化 C2C12细胞中的外显子23跳读的巢式PCR的琼脂糖凝胶。
图10描绘了使用PMO、抗CD71 mAb-PMO和抗CD71 Fab-PMO 缀合物检测分化C2C12细胞中的外显子23跳读的巢式PCR的琼脂糖凝胶。
图11描绘了使用PMO、ASO、DAR1的缀合抗CD71 mAb-ASO (“ASC-DAR1”)、DAR2的缀合抗CD71 mAb-ASO(“ASC-DAR2”) 和DAR3的缀合抗CD71 mAb-ASO(“ASC-DAR3”)检测分化C2C12 细胞中的外显子23跳读的巢式PCR的琼脂糖凝胶。
图12A描绘了检测野生型小鼠腓肠肌中的外显子23跳读的巢式 PCR的琼脂糖凝胶，该小鼠施用了抗CD71 mAb-PMO缀合物的单次静脉内注射。
图12B是来自腓肠肌的PCR产物的定量图。
图12C是使用Taqman qPCR对来自野生型小鼠腓肠肌的体内外显子跳读进行定量的图。
图13A描绘了在单次静脉内注射后检测野生型小鼠心肌中的外显子23跳读的巢式PCR的琼脂糖凝胶。
图13B是来自心肌的PCR产物的定量图。
图14描绘了来自跳读的和野生型PCR产物的DNA片段的测序数据(分别为SEQ IDNO:976-977)。
图15A是使用Taqman qPCR对野生型小鼠腓肠肌中的体内外显子跳读进行定量的图。
图15B是使用巢式PCR对野生型小鼠腓肠肌中的体内外显子跳读进行定量的图。
图15C是使用Taqman qPCR对野生型小鼠膈肌中的体内外显子跳读进行定量的图。
图15D是使用巢式PCR对野生型小鼠膈肌中的体内外显子跳读进行定量的图。
图15E是使用Taqman qPCR对野生型小鼠心肌中的体内外显子跳读进行定量的图。
图15F是使用巢式PCR对野生型小鼠心肌中的体内外显子跳读进行定量的图。
图16A描绘了在单次静脉内(i.v.)注射后检测CD71 mAb-PMO 缀合物诱导野生型小鼠膈肌组织中的MSTN外显子2跳读的PCR的琼脂糖凝胶。
图16B描绘了在单次静脉内(i.v.)注射后检测CD71 mAb-PMO 缀合物诱导野生型小鼠心肌组织中的MSTN外显子2跳读的PCR的琼脂糖凝胶。
图16C描绘了在单次静脉内(i.v.)注射后检测CD71 mAb-PMO 缀合物诱导野生型小鼠腓肠肌组织中的MSTN外显子2跳读的PCR的琼脂糖凝胶。
图17描绘了检测ASGPR mAb-PMO缀合物诱导原代小鼠肝细胞中的PAH外显子11跳读的PCR的琼脂糖凝胶。
图18描绘了在单次静脉内(i.v.)注射后检测ASGPR mAb-PMO 缀合物诱导野生型小鼠肝脏中的PAH外显子11跳读的PCR的琼脂糖凝胶。
具体实施方式
核酸(例如，RNAi)疗法是具有高选择性和特异性的靶向疗法。然而，在一些情况下，核酸疗法也受到细胞内摄取不良、靶细胞中的细胞内浓度不足和低效力的阻碍。为了解决这些问题，探索了核酸组合物的各种修饰，例如，用于更好稳定和/或降低毒性的新型连接体，用于提高靶标特异性和/或靶标递送的结合部分的优化，以及用于提高稳定性和 /或降低脱靶效应的核酸聚合物修饰。
在一些情况下，使用寡核苷酸的一个这样的领域是用于治疗肌营养不良症。肌营养不良症包括数种影响肌肉的疾病。杜氏肌营养不良症是一种严重的肌营养不良症形式，由DMD基因中的突变引起。在一些情况下，DMD基因中的突变破坏翻译阅读框并导致无功能的肌养蛋白 (dystrophin)。
在某些实施方案中，本文描述了涉及核酸疗法以在错误剪接的 mRNA转录物中诱导插入、缺失、复制或改变以诱导外显子跳读或外显子包含的方法和组合物，其用来恢复翻译阅读框。在一些实施方案中，本文描述的还包括用于治疗以错误加工的mRNA转录物为特征的疾病或病症的方法和组合物，其中在除去外显子后，该mRNA能够编码功能性蛋白质，从而治疗该疾病或病症。在另外的实施方案中，本文描述的包括用于治疗该疾病或病症的药物组合物和药盒。
RNA加工
RNA在基因表达和细胞生理学的调节中具有重要作用。RNA的适当加工对于功能蛋白质的翻译是至关重要的。RNA加工的改变，如 RNA的错误剪接的结果，可导致疾病。例如，剪接位点的突变导致过早终止密码子的暴露、外显子的丢失或内含子的包含。在一些情况下，RNA 加工的改变导致插入、缺失或复制。在一些情况下，RNA加工的改变导致外显子的插入、缺失或复制。在一些情况下，RNA加工的改变导致内含子的插入、缺失或复制。
备选的转录或剪接事件包括但不限于外显子跳读、选择性3’剪接位点选择、选择性5’剪接位点选择、内含子保留、互斥外显子、备选启动子用法和备选聚腺苷酸化。在一些实施方案中，剪接事件导致外显子的插入、缺失或复制，例如，通过外显子跳读或外显子包含。
外显子跳读
外显子跳读是RNA剪接的一种形式。在一些情况下，当外显子被跳过或从加工的mRNA中剪接出来时发生外显子跳读。作为外显子跳读的结果，加工的mRNA不含有跳读的外显子。在一些情况下，外显子跳读导致表达改变的产物。
在一些情况下，使用反义寡核苷酸(AON)来诱导外显子跳读。在一些情况下，AON是与特定mRNA或前mRNA序列结合的短核酸序列。例如，AON结合剪接位点或外显子增强子。在一些情况下，AON 与特定mRNA或前mRNA序列的结合生成双链区。在一些情况下，双链区的形成发生在剪接体或与剪接体缔合的蛋白质通常会结合的位点处，并导致外显子被跳过。在一些情况下，外显子的跳读导致转录物阅读框的恢复并允许产生部分功能性蛋白质。
外显子包含
在一些情况下，RNA中的突变导致外显子跳读。在一些情况下，突变是剪接位点处、剪接位点附近和距剪接位点一定距离中的至少一种。在一些情况下，突变导致剪接位点失活或弱化、破坏外显子剪接增强子或内含子剪接增强子以及产生外显子剪接沉默子或内含子剪接增强子中的至少一个。在一些情况下，突变改变RNA的二级结构。在一些情况下，突变改变RNA的二级结构导致破坏对外显子识别至关重要的信号的可及性。
在一些情况下，AON的使用会导致包含跳读的外显子。在一些情况下，AON与剪接位点、剪接位点附近的位点和远离剪接位点的位点中的至少一个结合。在一些情况下，AON在RNA中的位点处结合，以防止外显子剪接增强子或内含子剪接增强子的破坏。在一些情况下，AON 在RNA中的位点处结合，以防止产生外显子剪接沉默子或内含子剪接沉默子。
内含子保留
在一些情况下，RNA中的突变导致内含子保留。内含子保留导致内含子保留在成熟mRNA转录物中。在一些情况下，保留的内含子的存在阻止或减少功能蛋白质的翻译。在一些情况下，内含子保留发生在编码区、非编码区中、5’UTR或3’UTR处。当内含子保留发生在编码区中时，在一些情况下，保留的内含子符合读框地编码氨基酸，或者位置不准，从而由于终止密码子或读框移位而产生截短的蛋白质或非功能性蛋白质的错位。在一些情况下，内含子保留在两个外显子之间、位于5’ UTR处或位于3’UTR处。
在一些情况下，AON用来与部分加工的mRNA杂交，以启动保留的内含子的去除。在一些情况下，AON与内含子剪接增强子或内含子剪接沉默子杂交。在一些情况下，AON在内含子的5’剪接位点、3’剪接位点、分支点、聚嘧啶段、内含子沉默子位点、隐蔽内含子剪接位点、假剪接位点或内含子增强子处或距其一定距离处杂交。在一些情况下， AON与内含子的内部区域杂交。
适应症
一些实施方案中，本文所述的多核酸分子或药物组合物用于治疗以缺陷mRNA为特征的疾病或病症。在一些实施方案中，本文所述的多核酸分子或药物组合物用于通过在错误剪接的mRNA转录物中诱导插入、缺失、复制或改变来诱导剪接事件而治疗疾病或病症。在一些实施方案中，该剪接事件是外显子跳读或外显子包含。在一些实施方案中，该剪接事件是内含子保留。
在一些实施方案中，本文所述的多核酸分子或药物组合物用于通过在错误剪接的mRNA转录物中诱导插入、缺失、复制或改变来诱导外显子跳读或外显子包含而治疗疾病或病症。
大部分人类蛋白质编码基因被选择性地剪接。在一些情况下，突变导致不正确的剪接或部分剪接的mRNA。例如，突变位于蛋白质编码基因中的剪接位点、沉默子或增强子序列、外显子序列或内含子序列中的至少一个中。在一些情况下，突变导致基因功能障碍。在一些情况下，突变导致疾病或病症。
在一些情况下，由不正确剪接或部分剪接的mRNA引起的疾病或病症包括但不限于神经肌肉疾病、遗传病、癌症、遗传性疾病或心血管疾病。
在一些情况下，遗传疾病或病症包括常染色体显性病症、常染色体隐性病症、X连锁显性病症、X连锁隐性病症、Y连锁病症、线粒体疾病或多因素或多基因病症。
在一些情况下，诸如高胆固醇血症的心血管疾病由不正确剪接或部分剪接的mRNA引起。在高胆固醇血症中，已经显示低密度脂蛋白受体(LDLR)的外显子12中的单核苷酸多态性促进外显子跳读。
在一些情况下，不正确剪接或部分剪接的mRNA会导致癌症。例如，不正确剪接或部分剪接的mRNA影响与癌症有关的细胞过程，包括但不限于增殖、运动性和药物反应。在一些情况下是实体癌症或血液学癌症。在一些情况下，该癌症是膀胱癌、肺癌、脑癌、黑素瘤、乳腺癌、非霍奇金淋巴瘤、宫颈癌、卵巢癌、结直肠癌、胰腺癌、食道癌、前列腺癌、肾癌、皮肤癌、白血病、甲状腺癌、肝癌或子宫癌。
在一些情况下，不正确剪接或部分剪接的mRNA会导致神经肌肉疾病或病症。示例性神经肌肉疾病包括肌营养不良症，如杜氏肌营养不良症、贝克肌营养不良症、面肩肱型肌营养不良症、先天性肌营养不良症或肌强直性营养不良。在一些情况下，肌营养不良症是遗传性的。在一些情况下，肌营养不良症是由自发突变引起的。贝克肌营养不良症和杜氏肌营养不良症已被证明与DMD基因的突变有关，该基因编码肌养蛋白。面肩肱型肌营养不良症已被证明与双同源框4(DUX4)基因的突变有关。
在一些情况下，不正确剪接或部分剪接的mRNA会导致杜氏肌营养不良症。杜氏肌营养不良症导致严重的肌无力，并且由DMD基因的突变引起，其阻止了功能性肌养蛋白的产生。在一些情况下，杜氏肌营养不良症是DMD基因中的外显子突变的结果。在一些情况下，杜氏肌营养不良症是DMD基因中外显子1、2、3、4、5、6、7、18、19、20、 21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、 37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、 69、70、71、72、73、74、75、76、77、78和79中的至少一个的突变的结果。在一些情况下，杜氏肌营养不良症是DMD基因中外显子3、4、 5、6、7、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、 32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、 48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62和63中的至少一个的突变的结果。在一些情况下，杜氏肌营养不良症是DMD 基因中外显子8、23、35、43、44、45、50、51、52、53和55中的至少一个的突变的结果。在一些情况下，多个外显子发生突变。例如，外显子48-50的突变在杜氏肌营养不良症患者中是常见的。在一些情况下，杜氏肌营养不良症是外显子51突变的结果。在一些情况下，杜氏肌营养不良症是外显子23突变的结果。在一些情况下，突变涉及外显子的缺失。在一些情况下，突变涉及外显子的复制。在一些情况下，突变涉及外显子中的点突变。例如，已经显示一些患者在DMD基因的外显子51中具有无义点突变。
在一些情况下，本文所述的多核酸分子或药物组合物用于治疗肌营养不良症。在一些情况下，本文所述的多核酸分子或药物组合物用于治疗杜氏肌营养不良症、贝克肌营养不良症、面肩肱型肌营养不良症、先天性肌营养不良症或肌强直性营养不良。在一些情况下，本文所述的多核酸分子或药物组合物用于治疗杜氏肌营养不良症。
多核酸分子
在一些实施方案中，本文所述的多核酸分子在错误剪接的mRNA 转录物中诱导插入、缺失、复制或改变，以诱导外显子跳读或外显子包含。在一些情况下，该多核酸分子恢复翻译阅读框。在一些情况下，该多核酸分子产生功能性和截短的蛋白质。
在一些情况下，多核酸分子靶向mRNA序列。在一些情况下，多核酸分子靶向剪接位点。在一些情况下，多核酸分子靶向顺式调节元件。在一些情况下，多核酸分子靶向反式调节元件。在一些情况下，多核酸分子靶向外显子剪接增强子或内含子剪接增强子。在一些情况下，多核酸分子靶向外显子剪接沉默子或内含子剪接沉默子。
在一些情况下，多核酸分子靶向在内含子或外显子中发现的序列。例如，多核酸分子靶向在外显子中发现的、介导所述外显子的剪接的序列。在一些情况下，多核酸分子靶向外显子识别序列。在一些情况下，多核酸分子靶向外显子上游的序列。在一些情况下，多核酸分子靶向外显子下游的序列。
如上所述，多核酸分子靶向错误加工的mRNA转录物，后者导致疾病或病症，不限于神经肌肉疾病、遗传病、癌症、遗传性疾病或心血管疾病。
在一些情况下，多核酸分子靶向在引起疾病或病症的基因中突变的外显子。示例性疾病或病症包括但不限于家族性自主神经功能异常 (FD)、脊髓性肌萎缩(SMA)、中链酰基辅酶A脱氢酶(MCAD) 缺乏、Hutchinson-Gilford早老综合征(HGPS)、I型肌强直性营养不良 (DM1)、II型肌强直性营养不良(DM2)、常染色体显性色素性视网膜炎(RP)、杜氏型肌营养不良症(DMD)、1型小头骨发育不良先天性侏儒(MOPD1)(Taybi-Linder综合征(TALS))、颞叶痴呆伴帕金森病-17(FTDP-17)、福山先天性肌营养不良症(FCMD)、肌萎缩侧索硬化(ALS)、高胆固醇血症和囊性纤维化(CF)。与疾病或病症有关的示例性基因包括但不限于IKBKAP、SMN2、MCAD、LMNA、DMPK、 ZNF9、MAPT、FKTN、TDP-43、LDLR、CFTR、DMD、PAH、MSTN 和K-Ras。在一些实施方案中，该基因是DMD、PAH、MSTN或K-Ras。
在一些情况下，本文所述的多核酸分子靶向位于引起疾病或病症的基因的外显子的外显子-内含子接界处的区域。在一些实施方案中，该基因是IKBKAP、SMN2、MCAD、LMNA、DMPK、ZNF9、MAPT、FKTN、 TDP-43、LDLR、CFTR、DMD、PAH、MSTN或K-Ras。在一些实施方案中，本文所述的多核酸分子靶向位于MSTN的外显子1、2或3的外显子-内含子接界处的区域。在一些实施方案中，本文所述的多核酸分子靶向位于MSTN的外显子2的外显子-内含子接界处的区域。在一些实施方案中，本文所述的多核酸分子靶向位于PAH的外显子1、2、3、4、5、 6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或21的外显子-内含子接界处的区域。在一些实施方案中，本文所述的多核酸分子靶向位于PAH的外显子11的外显子-内含子接界处的区域。
在一些情况下，所述多核酸分子与位于引起疾病或病症的基因的至少一个外显子的5’内含子-外显子接界或3’外显子-内含子接界处的靶区域杂交。在一些实施方案中，该基因是IKBKAP、SMN2、MCAD、LMNA、 DMPK、ZNF9、MAPT、FKTN、TDP-43、LDLR、CFTR、DMD、PAH、MSTN或K-Ras。在一些实施方案中，本文所述的多核酸分子靶向MSTN 的外显子1、2或3的5’内含子-外显子接界或3’外显子-内含子接界。在一些实施方案中，本文所述的多核酸分子靶向位于MSTN的外显子2的 5’内含子-外显子接界或3’外显子-内含子接界处的区域。在一些实施方案中，本文所述的多核酸分子靶向位于PAH的外显子1、2、3、4、5、 6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或21的 5’内含子-外显子接界或3’外显子-内含子接界处的区域。在一些实施方案中，本文所述的多核酸分子靶向位于PAH的外显子11的5’内含子- 外显子接界或3’外显子-内含子接界处的区域。
在一些情况下，所述多核酸分子与位于引起疾病或病症的基因的至少一个外显子的5’内含子-外显子接界处的靶区域杂交。在一些实施方案中，该基因是IKBKAP、SMN2、MCAD、LMNA、DMPK、ZNF9、MAPT、 FKTN、TDP-43、LDLR、CFTR、DMD、PAH、MSTN或K-Ras。在一些实施方案中，本文所述的多核酸分子靶向位于MSTN的外显子1、2或3 的5’内含子-外显子接界处的区域。在一些实施方案中，本文所述的多核酸分子靶向位于MSTN的外显子2的5’内含子-外显子接界处的区域。在一些实施方案中，本文所述的多核酸分子靶向位于PAH的外显子1、2、 3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20 或21的5’内含子-外显子接界处的区域。在一些实施方案中，本文所述的多核酸分子靶向位于PAH的外显子11的5’内含子-外显子接界处的区域。
在一些情况下，所述多核酸分子与位于引起疾病或病症的基因的至少一个外显子的3’外显子-内含子接界处的靶区域杂交。在一些实施方案中，该基因是IKBKAP、SMN2、MCAD、LMNA、DMPK、ZNF9、MAPT、 FKTN、TDP-43、LDLR、CFTR、DMD、PAH、MSTN或K-Ras。在一些实施方案中，本文所述的多核酸分子靶向位于MSTN的外显子1、2或3 的3’外显子-内含子接界处的区域。在一些实施方案中，本文所述的多核酸分子靶向位于MSTN的外显子2的3’外显子-内含子接界处的区域。在一些实施方案中，本文所述的多核酸分子靶向位于PAH的外显子1、2、 3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20 或21的3’外显子-内含子接界处的区域。在一些实施方案中，本文所述的多核酸分子靶向位于PAH的外显子11的3’外显子-内含子接界处的区域。
在一些情况下，本文所述的多核酸分子靶向引起疾病或病症的基因的外显子的剪接位点。在一些实施方案中，该基因是IKBKAP、SMN2、 MCAD、LMNA、DMPK、ZNF9、MAPT、FKTN、TDP-43、LDLR、CFTR、 DMD、PAH、MSTN或K-Ras。在一些实施方案中，本文所述的多核酸分子靶向MSTN的外显子1、2或3的剪接位点。在一些实施方案中，本文所述的多核酸分子靶向MSTN的外显子2的剪接位点。在一些实施方案中，本文所述的多核酸分子靶向PAH的外显子1、2、3、4、5、6、 7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或21的剪接位点。在一些实施方案中，本文所述的多核酸分子靶向PAH的外显子11的剪接位点。如本文所用的，剪接位点包括规范剪接位点、隐蔽剪接位点或选择性剪接位点，其能够在错误剪接的mRNA转录物中诱导插入、缺失、复制或改变，以诱导外显子跳读或外显子包含。
在一些情况下，本文所述的多核酸分子靶向引起疾病或病症的基因的外显子上游(或5’)至少1000个核苷酸(nt)、500nt、400nt、300 nt、200nt、100nt、80nt、60nt、50nt、40nt、30nt、20nt、10nt或5 nt的区域。在一些实施方案中，该基因是IKBKAP、SMN2、MCAD、LMNA、DMPK、ZNF9、MAPT、FKTN、TDP-43、LDLR、CFTR、 DMD、PAH、MSTN或K-Ras。在一些情况下，本文所述的多核酸分子靶向MSTN基因的外显子1、2或3上游(或5’)至少1000nt、500nt 、400nt、300nt、200nt、100nt、80nt、60nt、50nt、40nt、30nt、 20nt、10nt或5nt的区域。在一些情况下，本文所述的多核酸分子靶向 MSTN基因的外显子2上游(或5’)至少1000nt、500nt、400nt、300nt 、200nt、100nt、80nt、60nt、50nt、40nt、30nt、20nt、10nt或5 nt的区域。在一些情况下，本文所述的多核酸分子靶向PAH基因的外显子1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17 、18、19、20或21上游(或5’)至少1000nt、500nt、400nt、300nt 、200nt、100nt、80nt、60nt、50nt、40nt、30nt、20nt、10nt或5 nt的区域。在一些情况下，本文所述的多核酸分子靶向PAH基因的外显子11上游(或5’)至少1000nt、500nt、400nt、300nt、200nt、100 nt、80nt、60nt、50nt、40nt、30nt、20nt、10nt或5nt的区域。
在一些情况下，所述多核酸分子与引起疾病或病症的基因的至少一个外显子上游(或5’)的靶区域杂交。在一些实施方案中，该基因是 IKBKAP、SMN2、MCAD、LMNA、DMPK、ZNF9、MAPT、FKTN、TDP-43、 LDLR、CFTR、DMD、PAH、MSTN或K-Ras。在一些情况下，所述多核酸分子与MSTN基因的外显子1、2或3中的至少一个上游(或5’) 的靶区域杂交。在一些情况下，所述多核酸分子与MSTN基因的至少一个外显子2上游(或5’)约5、10、15、20、50、100、200、300、400或500bp的靶区域杂交。在一些情况下，所述多核酸分子与PAH基因的外显子1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、 17、18、19、20或21中的至少一个上游(或5’)的靶区域杂交。在一些情况下，所述多核酸分子与PAH基因的至少一个外显子11上游(或 5’)约5、10、15、20、50、100、200、300、400或500bp的靶区域杂交。
在一些情况下，本文所述的多核酸分子靶向引起疾病或病症的基因的外显子下游(或3’)至少1000个核苷酸(nt)、500nt、400nt、300 nt、200nt、100nt、80nt、60nt、50nt、40nt、30nt、20nt、10nt或5 nt的区域。在一些实施方案中，该基因是IKBKAP、SMN2、MCAD、LMNA、DMPK、ZNF9、MAPT、FKTN、TDP-43、LDLR、CFTR、 DMD、PAH、MSTN或K-Ras。在一些情况下，本文所述的多核酸分子靶向MSTN基因的外显子1、2或3下游(或3’)至少1000个核苷酸(nt)、500nt、400nt、300nt、200nt、100nt、80nt、60nt、50nt、40nt 、30nt、20nt、10nt或5nt的区域。在一些情况下，本文所述的多核酸分子靶向MSTN基因的外显子2下游(或3’)至少1000个核苷酸(nt )、500nt、400nt、300nt、200nt、100nt、80nt、60nt、50nt、40nt 、30nt、20nt、10nt或5nt的区域。在一些情况下，本文所述的多核酸分子靶向PAH基因的外显子1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12 、13、14、15、16、17、18、19、20或21下游(或3’)至少1000个核苷酸(nt)、500nt、400nt、300nt、200nt、100nt、80nt、60nt、50nt 、40nt、30nt、20nt、10nt或5nt的区域。在一些情况下，本文所述的多核酸分子靶向PAH基因的外显子11下游(或3’)至少1000个核苷酸(nt)、500nt、400nt、300nt、200nt、100nt、80nt、60nt、50nt 、40nt、30nt、20nt、10nt或5nt的区域。
在一些情况下，所述多核酸分子与引起疾病或病症的基因的至少一个外显子下游(或3’)的靶区域杂交。在一些实施方案中，该基因是 IKBKAP、SMN2、MCAD、LMNA、DMPK、ZNF9、MAPT、FKTN、TDP-43、 LDLR、CFTR、DMD、PAH、MSTN或K-Ras。在一些情况下，所述多核酸分子与MSTN基因的外显子1、2或3中的至少一个下游(或3’) 约5、10、15、20、50、100、200、300、400或500bp的靶区域杂交。在一些情况下，所述多核酸分子与MSTN基因的至少一个外显子2下游 (或3’)约5、10、15、20、50、100、200、300、400或500bp的靶区域杂交。在一些情况下，所述多核酸分子与PAH基因的外显子1、2、3、 4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或 21中的至少一个下游(或3’)约5、10、15、20、50、100、200、300、 400或500bp的靶区域杂交。在一些情况下，所述多核酸分子与PAH基因的至少一个外显子11下游(或3’)约5、10、15、20、50、100、200、 300、400或500bp的靶区域杂交。
在一些情况下，本文所述的多核酸分子靶向引起疾病或病症的基因的外显子内的内部区域。在一些实施方案中，该基因是IKBKAP、SMN2、 MCAD、LMNA、DMPK、ZNF9、MAPT、FKTN、TDP-43、LDLR、CFTR、 DMD、PAH、MSTN或K-Ras。在一些情况下，本文所述的多核酸分子靶向MSTN基因的外显子1、2或3内的内部区域。在一些情况下，本文所述的多核酸分子靶向MSTN基因的外显子2内的内部区域。在一些情况下，本文所述的多核酸分子靶向PAH基因的外显子1、2、3、4、5、 6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或21内的内部区域。在一些情况下，本文所述的多核酸分子靶向PAH基因的外显子11内的内部区域。
在一些情况下，多核酸分子靶向导致神经肌肉疾病或病症的错误加工的mRNA转录物。在一些情况下，神经肌肉疾病或病症是杜氏肌营养不良症、贝克肌营养不良症、面肩肱型肌营养不良症、先天性肌营养不良症或肌强直性营养不良。在一些情况下，多核酸分子靶向导致杜氏肌营养不良症、贝克肌营养不良症、面肩肱型肌营养不良症、先天性肌营养不良症或肌强直性营养不良的错误加工的mRNA转录物。在一些情况下，多核酸分子靶向导致杜氏肌营养不良症的错误加工的mRNA转录物。
在一些情况下，多核酸分子靶向在引起杜氏肌营养不良症的DMD 基因中突变的外显子。在引起杜氏肌营养不良症的DMD基因中突变的示例性外显子包括但不限于外显子3、4、5、6、7、18、19、20、21、 22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、 38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、 54、55、56、57、58、59、60、61、62和63。在一些情况下，多核酸分子靶向与突变的外显子相邻的序列。例如，如果外显子50缺失，则多核酸分子靶向外显子51中的序列，从而跳过外显子51。在另一种情况下，如果在外显子23中存在突变，则多核酸分子靶向外显子22中的序列，从而跳过外显子23。
在一些情况下，本文所述的多核酸分子靶向DMD基因的外显子 3、4、5、6、7、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、 30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、 46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、 62或63的外显子-内含子接界处的区域。在一些情况下，本文所述的多核酸分子靶向位于DMD基因的外显子8、23、35、43、44、45、50、 51、52、53或55的外显子-内含子接界处的区域。在一些情况下，本文所述的多核酸分子靶向位于DMD基因的外显子8的外显子-内含子接界处的区域。在一些情况下，本文所述的多核酸分子靶向位于DMD基因的外显子23的外显子-内含子接界处的区域。在一些情况下，本文所述的多核酸分子靶向位于DMD基因的外显子35的外显子-内含子接界处的区域。在一些情况下，本文所述的多核酸分子靶向位于DMD基因的外显子43的外显子-内含子接界处的区域。在一些情况下，本文所述的多核酸分子靶向位于DMD基因的外显子44的外显子-内含子接界处的区域。在一些情况下，本文所述的多核酸分子靶向位于DMD基因的外显子45的外显子-内含子接界处的区域。在一些情况下，本文所述的多核酸分子靶向位于DMD基因的外显子48的外显子-内含子接界处的区域。在一些情况下，本文所述的多核酸分子靶向位于DMD基因的外显子49的外显子-内含子接界处的区域。在一些情况下，本文所述的多核酸分子靶向位于DMD基因的外显子50的外显子-内含子接界处的区域。在一些情况下，本文所述的多核酸分子靶向位于DMD基因的外显子51 的外显子-内含子接界处的区域。在一些情况下，本文所述的多核酸分子靶向位于DMD基因的外显子52的外显子-内含子接界处的区域。在一些情况下，本文所述的多核酸分子靶向位于DMD基因的外显子53的外显子-内含子接界处的区域。在一些情况下，本文所述的多核酸分子靶向位于DMD基因的外显子55的外显子-内含子接界处的区域。
在一些情况下，所述多核酸分子与位于DMD基因的外显子3、4、 5、6、7、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、 32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、 48、49、50、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62和63中的至少一个的5’内含子-外显子接界处或3’外显子-内含子接界处的靶区域杂交。在一些情况下，所述多核酸分子与位于DMD基因的外显子8、 23、35、43、44、45、50、51、52、53或55的5’内含子-外显子接界处或3’外显子-内含子接界处的靶区域杂交。
在一些情况下，所述多核酸分子与位于DMD基因的外显子3、4、 5、6、7、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、 32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、 48、49、50、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62和63中的至少一个的5’内含子-外显子接界处的靶外区域杂交。在一些情况下，该多核酸分子与位于DMD的外显子8、23、35、43、44、45、50、51、 52、53或55的5’内含子-外显子接界处的靶区域杂交。在一些情况下，该多核酸分子与位于DMD基因的外显子8的5’内含子-外显子接界处的靶区域杂交。在一些情况下，该多核酸分子与位于DMD基因的外显子 23的5’内含子-外显子接界处的靶区域杂交。在一些情况下，该多核酸分子与位于DMD基因的外显子35的5’内含子-外显子接界处的靶区域杂交。在一些情况下，该多核酸分子与位于DMD基因的外显子43的 5’内含子-外显子接界处的靶区域杂交。在一些情况下，该多核酸分子与位于DMD基因的外显子44的5’内含子-外显子接界处的靶区域杂交。在一些情况下，该多核酸分子与位于DMD基因的外显子45的5’内含子 -外显子接界处的靶区域杂交。在一些情况下，该多核酸分子与位于DMD 基因的外显子50的5’内含子-外显子接界处的靶区域杂交。在一些情况下，该多核酸分子与位于DMD基因的外显子51的5’内含子-外显子接界处的靶区域杂交。在一些情况下，该多核酸分子与位于DMD基因的外显子52的5’内含子-外显子接界处的靶区域杂交。在一些情况下，该多核酸分子与位于DMD基因的外显子53的5’内含子-外显子接界处的靶区域杂交。在一些情况下，该多核酸分子与位于DMD基因的外显子 55的5’内含子-外显子接界处的靶区域杂交。
在一些情况下，所述多核酸分子与位于DMD基因的外显子3、4、 5、6、7、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、 32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、 48、49、50、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62和63中的至少一个的3’外显子-内含子接界处的靶区域杂交。在一些情况下，该多核酸分子与位于DMD基因的外显子8、23、35、43、44、45、50、 51、52、53或55的3’外显子-内含子接界处的靶区域杂交。在一些情况下，该多核酸分子与位于DMD基因的外显子8的3’外显子-内含子接界处的靶区域杂交。在一些情况下，该多核酸分子与位于DMD基因的外显子23的3’外显子-内含子接界处的靶区域杂交。在一些情况下，该多核酸分子与位于DMD基因的外显子35的3’外显子-内含子接界处的靶区域杂交。在一些情况下，该多核酸分子与位于DMD基因的外显子43 的3’外显子-内含子接界处的靶区域杂交。在一些情况下，该多核酸分子与位于DMD基因的外显子44的3’外显子-内含子接界处的靶区域杂交。在一些情况下，该多核酸分子与位于DMD基因的外显子45的3’外显子 -内含子接界处的靶区域杂交。在一些情况下，该多核酸分子与位于DMD 基因的外显子50的3’外显子-内含子接界处的靶区域杂交。在一些情况下，该多核酸分子与位于DMD基因的外显子51的3’外显子-内含子接界处的靶区域杂交。在一些情况下，该多核酸分子与位于DMD基因的外显子52的3’外显子-内含子接界处的靶区域杂交。在一些情况下，该多核酸分子与位于DMD基因的外显子53的3’外显子-内含子接界处的靶区域杂交。在一些情况下，该多核酸分子与位于DMD基因的外显子55的3’外显子-内含子接界处的靶区域杂交。
在一些情况下，本文所述的多核酸分子靶向DMD基因的外显子 3、4、5、6、7、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、 30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、 46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、 62或63的剪接位点。在一些情况下，本文所述的多核酸分子靶向DMD 基因的外显子8、23、35、43、44、45、50、51、52、53或55的剪接位点。在一些情况下，本文所述的多核酸分子靶向DMD基因的外显子8 的剪接位点。在一些情况下，本文所述的多核酸分子靶向DMD基因的外显子23的剪接位点。在一些情况下，本文所述的多核酸分子靶向DMD 基因的外显子35的剪接位点。在一些情况下，本文所述的多核酸分子靶向DMD基因的外显子43的剪接位点。在一些情况下，本文所述的多核酸分子靶向DMD基因的外显子44的剪接位点。在一些情况下，本文所述的多核酸分子靶向DMD基因的外显子45的剪接位点。在一些情况下，本文所述的多核酸分子靶向DMD基因的外显子48的剪接位点。在一些情况下，本文所述的多核酸分子靶向DMD基因的外显子49的剪接位点。在一些情况下，本文所述的多核酸分子靶向DMD基因的外显子50的剪接位点。在一些情况下，本文所述的多核酸分子靶向DMD基因的外显子51的剪接位点。在一些情况下，本文所述的多核酸分子靶向DMD基因的外显子52的剪接位点。在一些情况下，本文所述的多核酸分子靶向 DMD基因的外显子53的剪接位点。在一些情况下，本文所述的多核酸分子靶向DMD基因的外显子55的剪接位点。如本文所用的，剪接位点包括规范剪接位点、隐蔽剪接位点或选择性剪接位点，其能够在错误剪接的mRNA转录物中诱导插入、缺失、复制或改变，以诱导外显子跳读或外显子包含。
在一些实施方案中，本文所述的多核酸分子靶向部分剪接的 mRNA序列，该序列包含与杜氏肌营养不良症有关的其它外显子，如外显子3、4、5、6、7、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、 29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、 62或63。
在一些情况下，本文所述的多核酸分子靶向DMD基因的外显子 3、4、5、6、7、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29 、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60 、61、62或63上游(或5’)至少1000个核苷酸(nt)、500nt、400nt 、300nt、200nt、100nt、80nt、60nt、50nt、40nt、30nt、20nt、10nt或5nt的区域。在一些情况下，本文所述的多核酸分子靶向DMD基因的外显子8、23、35、43、44、45、50、51、52、53或55上游(或 5’)至少1000nt、500nt、400nt、300nt、200nt、100nt、80nt、60nt 、50nt、40nt、30nt、20nt、10nt或5nt的区域。在一些情况下，本文所述的多核酸分子靶向DMD基因的外显子8上游(或5’)至少1000 nt、500nt、400nt、300nt、200nt、100nt、80nt、60nt、50nt、40nt 、30nt、20nt、10nt或5nt的区域。在一些情况下，本文所述的多核酸分子靶向DMD基因的外显子23上游(或5’)至少1000nt、500nt、400 nt、300nt、200nt、100nt、80nt、60nt、50nt、40nt、30nt、20nt、 10nt或5nt的区域。在一些情况下，本文所述的多核酸分子靶向DMD 基因的外显子35上游(或5’)至少1000nt、500nt、400nt、300nt、200 nt、100nt、80nt、60nt、50nt、40nt、30nt、20nt、10nt或5nt的区域。在一些情况下，本文所述的多核酸分子靶向DMD基因的外显子43 上游(或5’)至少1000nt、500nt、400nt、300nt、200nt、100nt、80nt 、60nt、50nt、40nt、30nt、20nt、10nt或5nt的区域。在一些情况下，本文所述的多核酸分子靶向DMD基因的外显子44上游(或5’)至少1000nt、500nt、400nt、300nt、200nt、100nt、80nt、60nt、50nt 、40nt、30nt、20nt、10nt或5nt的区域。在一些情况下，本文所述的多核酸分子靶向DMD基因的外显子45上游(或5’)至少1000nt、 500nt、400nt、300nt、200nt、100nt、80nt、60nt、50nt、40nt、30 nt、20nt、10nt或5nt的区域。在一些情况下，本文所述的多核酸分子靶向DMD基因的外显子48上游(或5’)至少1000nt、500nt、400nt 、300nt、200nt、100nt、80nt、60nt、50nt、40nt、30nt、20nt、10 nt或5nt的区域。在一些情况下，本文所述的多核酸分子靶向DMD基因的外显子49上游(或5’)至少1000nt、500nt、400nt、300nt、200nt 、100nt、80nt、60nt、50nt、40nt、30nt、20nt、10nt或5nt的区域。在一些情况下，本文所述的多核酸分子靶向DMD基因的外显子50上游(或5’)至少1000nt、500nt、400nt、300nt、200nt、100nt、80nt 、60nt、50nt、40nt、30nt、20nt、10nt或5nt的区域。在一些情况下，本文所述的多核酸分子靶向DMD基因的外显子51上游(或5’)至少1000nt、500nt、400nt、300nt、200nt、100nt、80nt、60nt、50nt 、40nt、30nt、20nt、10nt或5nt的区域。在一些情况下，本文所述的多核酸分子靶向DMD基因的外显子52上游(或5’)至少1000nt、 500nt、400nt、300nt、200nt、100nt、80nt、60nt、50nt、40nt、30 nt、20nt、10nt或5nt的区域。在一些情况下，本文所述的多核酸分子靶向DMD基因的外显子53上游(或5’)至少1000nt、500nt、400nt 、300nt、200nt、100nt、80nt、60nt、50nt、40nt、30nt、20nt、10 nt或5nt的区域。在一些情况下，本文所述的多核酸分子靶向DMD基因的外显子55上游(或5’)至少1000nt、500nt、400nt、300nt、200nt 、100nt、80nt、60nt、50nt、40nt、30nt、20nt、10nt或5nt的区域。
在一些情况下，所述多核酸分子与DMD基因的外显子3、4、5、 6、7、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、 32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、 48、49、50、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62和63中的至少一个上游(或5’)的靶区域杂交。在一些情况下，该多核酸分子与DMD基因的外显子8、23、35、43、44、45、50、51、52、53或55 中的至少一个上游(或5’)的靶区域杂交。在一些情况下，该多核酸分子与DMD基因的外显子3、4、5、6、7、18、19、20、21、22、23、 24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、52、53、54、55、56、 57、58、59、60、61、62和63中的至少一个上游(或5’)约5、10、 15、20、50、100、200、300、400或500bp的靶区域杂交。
在一些情况下，本文所述的多核酸分子靶向DMD基因的外显子 3、4、5、6、7、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29 、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60 、61、62或63下游(或3’)至少1000个核苷酸(nt)、500nt、400nt 、300nt、200nt、100nt、80nt、60nt、50nt、40nt、30nt、20nt、10nt或5nt的区域。在一些情况下，本文所述的多核酸分子靶向DMD基因的外显子8、23、35、43、44、45、50、51、52、53或55下游(或 3’)至少1000个核苷酸(nt)、500nt、400nt、300nt、200nt、100nt、 80nt、60nt、50nt、40nt、30nt、20nt、10nt或5nt的区域。在一些情况下，本文所述的多核酸分子靶向DMD基因的外显子8下游(或3’) 至少1000个核苷酸(nt)、500nt、400nt、300nt、200nt、100nt、80nt、 60nt、50nt、40nt、30nt、20nt、10nt或5nt的区域。在一些情况下，本文所述的多核酸分子靶向DMD基因的外显子23下游(或3’)至少 1000个核苷酸(nt)、500nt、400nt、300nt、200nt、100nt、80nt、 60nt、50nt、40nt、30nt、20nt、10nt或5nt的区域。在一些情况下，本文所述的多核酸分子靶向DMD基因的外显子35下游(或3’)至少 1000个核苷酸(nt)、500nt、400nt、300nt、200nt、100nt、80nt、 60nt、50nt、40nt、30nt、20nt、10nt或5nt的区域。在一些情况下，本文所述的多核酸分子靶向DMD基因的外显子43下游(或3’)至少 1000个核苷酸(nt)、500nt、400nt、300nt、200nt、100nt、80nt、 60nt、50nt、40nt、30nt、20nt、10nt或5nt的区域。在一些情况下，本文所述的多核酸分子靶向DMD基因的外显子44下游(或3’)至少 1000个核苷酸(nt)、500nt、400nt、300nt、200nt、100nt、80nt、 60nt、50nt、40nt、30nt、20nt、10nt或5nt的区域。在一些情况下，本文所述的多核酸分子靶向DMD基因的外显子45下游(或3’)至少1000个核苷酸(nt)、500nt、400nt、300nt、200nt、100nt、80nt、60nt、50nt、40nt、30nt、20nt、10nt或5nt的区域。在一些情况下，本文所述的多核酸分子靶向DMD基因的外显子48下游(或3’)至少 1000个核苷酸(nt)、500nt、400nt、300nt、200nt、100nt、80nt、 60nt、50nt、40nt、30nt、20nt、10nt或5nt的区域。在一些情况下，本文所述的多核酸分子靶向DMD基因的外显子49下游(或3’)至少 1000个核苷酸(nt)、500nt、400nt、300nt、200nt、100nt、80nt、 60nt、50nt、40nt、30nt、20nt、10nt或5nt的区域。在一些情况下，本文所述的多核酸分子靶向DMD基因的外显子50下游(或3’)至少 1000个核苷酸(nt)、500nt、400nt、300nt、200nt、100nt、80nt、 60nt、50nt、40nt、30nt、20nt、10nt或5nt的区域。在一些情况下，本文所述的多核酸分子靶向DMD基因的外显子51下游(或3’)至少 1000个核苷酸(nt)、500nt、400nt、300nt、200nt、100nt、80nt、 60nt、50nt、40nt、30nt、20nt、10nt或5nt的区域。在一些情况下，本文所述的多核酸分子靶向DMD基因的外显子52下游(或3’)至少 1000个核苷酸(nt)、500nt、400nt、300nt、200nt、100nt、80nt、 60nt、50nt、40nt、30nt、20nt、10nt或5nt的区域。在一些情况下，本文所述的多核酸分子靶向DMD基因的外显子53下游(或3’)至少 1000个核苷酸(nt)、500nt、400nt、300nt、200nt、100nt、80nt、 60nt、50nt、40nt、30nt、20nt、10nt或5nt的区域。在一些情况下，本文所述的多核酸分子靶向DMD基因的外显子55下游(或3’)至少 1000个核苷酸(nt)、500nt、400nt、300nt、200nt、100nt、80nt、60nt、50nt、40nt、30nt、20nt、10nt或5nt的区域。
在一些情况下，所述多核酸分子与DMD基因的外显子3、4、5、 6、7、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、 32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、 48、49、50、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62和63中的至少一个下游(或3’)的靶区域杂交。在一些情况下，所述多核酸分子与DMD基因的外显子3、4、5、6、7、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、 40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、52、53、54、55、56、 57、58、59、60、61、62和63中的至少一个下游(或3’)约5、10、15、20、50、100、200、300、400或500bp的靶区域杂交。在一些情况下，所述多核酸分子与DMD基因的外显子8、23、35、43、44、45、 50、51、52、53或55中的至少一个下游(或3’)约5、10、15、20、 50、100、200、300、400或500bp的靶区域杂交。
在一些情况下，本文所述的多核酸分子靶向DMD基因的外显子 3、4、5、6、7、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、 30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、 46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、 62或63内的内部区域。在一些情况下，本文所述的多核酸分子靶向DMD 基因的外显子8、23、35、43、44、45、50、51、52、53或55内的内部区域。在一些情况下，本文所述的多核酸分子靶向DMD基因的外显子 8内的内部区域。在一些情况下，本文所述的多核酸分子靶向DMD基因的外显子23内的内部区域。在一些情况下，本文所述的多核酸分子靶向DMD基因的外显子35内的内部区域。在一些情况下，本文所述的多核酸分子靶向DMD基因的外显子43内的内部区域。在一些情况下，本文所述的多核酸分子靶向DMD基因的外显子44内的内部区域。在一些情况下，本文所述的多核酸分子靶向DMD基因的外显子45内的内部区域。在一些情况下，本文所述的多核酸分子靶向DMD基因的外显子48 内的内部区域。在一些情况下，本文所述的多核酸分子靶向DMD基因的外显子49内的内部区域。在一些情况下，本文所述的多核酸分子靶向 DMD基因的外显子50内的内部区域。在一些情况下，本文所述的多核酸分子靶向DMD基因的外显子51内的内部区域。在一些情况下，本文所述的多核酸分子靶向DMD基因的外显子52内的内部区域。在一些情况下，本文所述的多核酸分子靶向DMD基因的外显子53内的内部区域。在一些情况下，本文所述的多核酸分子靶向DMD基因的外显子55内的内部区域。
在一些情况下，所述多核酸分子与DMD基因的外显子3、4、5、 6、7、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、 32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、 48、49、50、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62和63中的至少一个内的靶区域杂交。在一些情况下，所述多核酸分子与DMD 基因的外显子8、23、35、43、44、45、50、51、52、53或55中的至少一个内的靶区域杂交。
在一些实施方案中，本文所述的多核酸分子靶向包含外显子51 的部分剪接的mRNA序列。在一些情况下，该多核酸分子与外显子51 上游(或5’)的靶区域杂交。在一些情况下，该多核酸分子与外显子51 上游(或5’)约5、10、15、20、50、100、200、300、400或500bp的靶区域杂交。在一些情况下，该多核酸分子与外显子51下游(或3’) 的靶区域杂交。在一些情况下，该多核酸分子与外显子51下游(或3’) 约5、10、15、20、50、100、200、300、400或500bp的靶区域杂交。
在一些情况下，所述多核酸分子与外显子51内的靶区域杂交。在一些情况下，所述多核酸分子与位于5’内含子-外显子51接界处或3’外显子51-内含子接界处的靶区域杂交。
在一些实施方案中，所述多核酸分子包含与感兴趣的靶序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、 96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的序列。在一些实施方案中，所述多核酸分子包含与感兴趣的靶序列具有至少50％序列同一性的序列。在一些实施方案中，所述多核酸分子包含与感兴趣的靶序列具有至少60％序列同一性的序列。在一些实施方案中，所述多核酸分子包含与感兴趣的靶序列具有至少70％序列同一性的序列。在一些实施方案中，所述多核酸分子包含与感兴趣的靶序列具有至少75％序列同一性的序列。在一些实施方案中，所述多核酸分子包含与感兴趣的靶序列具有至少80％序列同一性的序列。在一些实施方案中，所述多核酸分子包含与感兴趣的靶序列具有至少85％序列同一性的序列。在一些实施方案中，所述多核酸分子包含与感兴趣的靶序列具有至少90％序列同一性的序列。在一些实施方案中，所述多核酸分子包含与感兴趣的靶序列具有至少95％序列同一性的序列。在一些实施方案中，所述多核酸分子包含与感兴趣的靶序列具有至少96％序列同一性的序列。在一些实施方案中，所述多核酸分子包含与感兴趣的靶序列具有至少97％序列同一性的序列。在一些实施方案中，所述多核酸分子包含与感兴趣的靶序列具有至少98％序列同一性的序列。在一些实施方案中，所述多核酸分子包含与感兴趣的靶序列具有至少99％序列同一性的序列。在一些实施方案中，所述多核酸分子由感兴趣的靶序列组成。
在一些实施方案中，所述多核酸分子包含第一多核苷酸和第二多核苷酸。在一些情况下，第一多核苷酸包含与感兴趣的靶序列具有至少 50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、 97％、98％、99％或100％序列同一性的序列。在一些情况下，第二多核苷酸包含与感兴趣的靶序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的序列。在一些情况下，所述多核酸分子包含与感兴趣的靶序列具有至少 50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、 97％、98％、99％或100％序列同一性的第一多核苷酸和与感兴趣的靶序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、 95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的第二多核苷酸。
在一些实施方案中，本文所述的多核酸分子包含RNA或DNA。在一些情况下，多核酸分子包含RNA。在一些情况下，RNA包含短干扰RNA(siRNA)、短发夹RNA(shRNA)、微小RNA(miRNA)、双链RNA(dsRNA)、转移RNA(tRNA)、核糖体RNA(rRNA)或核内不均一RNA(hnRNA)。在一些情况下，RNA包含shRNA。在一些情况下，RNA包含miRNA。在一些情况下，RNA包含dsRNA。在一些情况下，RNA包含tRNA。在一些情况下，RNA包含rRNA。在一些情况下，RNA包含hnRNA。在一些情况下，RNA包含siRNA。在一些情况下，多核酸分子包含siRNA。
在一些实施方案中，所述多核酸分子的长度为约10至约50个核苷酸。在一些情况下，多核酸分子的长度为约10至约30、约15至约30、约18至约25、约18至约24、约19至约23或约20至约22个核苷酸。
在一些实施方案中，所述多核酸分子的长度为约50个核苷酸。在一些情况下，多核酸分子的长度为约45个核苷酸。在一些情况下，多核酸分子的长度为约40个核苷酸。在一些情况下，多核酸分子的长度为约 35个核苷酸。在一些情况下，多核酸分子的长度为约30个核苷酸。在一些情况下，多核酸分子的长度为约25个核苷酸。在一些情况下，多核酸分子的长度为约20个核苷酸。在一些情况下，多核酸分子的长度为约 19个核苷酸。在一些情况下，多核酸分子的长度为约18个核苷酸。在一些情况下，多核酸分子的长度为约17个核苷酸。在一些情况下，多核酸分子的长度为约16个核苷酸。在一些情况下，多核酸分子的长度为约15个核苷酸。在一些情况下，多核酸分子的长度为约14个核苷酸。在一些情况下，多核酸分子的长度为约13个核苷酸。在一些情况下，多核酸分子的长度为约12个核苷酸。在一些情况下，多核酸分子的长度为约 11个核苷酸。在一些情况下，多核酸分子的长度为约10个核苷酸。在一些情况下，多核酸分子的长度为约10至约50个核苷酸。在一些情况下，多核酸分子的长度为约10至约45个核苷酸。在一些情况下，多核酸分子的长度为约10至约40个核苷酸。在一些情况下，多核酸分子的长度为约10至约35个核苷酸。在一些情况下，多核酸分子的长度为约 10至约30个核苷酸。在一些情况下，多核酸分子的长度为约10至约25 个核苷酸。在一些情况下，多核酸分子的长度为约10至约20个核苷酸。在一些情况下，多核酸分子的长度为约15至约25个核苷酸。在一些情况下，多核酸分子的长度为约15至约30个核苷酸。在一些情况下，多核酸分子的长度为约12至约30个核苷酸。
在一些实施方案中，所述多核酸分子包含第一多核苷酸。在一些情况下，多核酸分子包含第二多核苷酸。在一些情况下，多核酸分子包含第一多核苷酸和第二多核苷酸。在一些情况下，第一多核苷酸为有义链或过客链。在一些情况下，第二多核苷酸为反义链或指导链。
在一些实施方案中，所述多核酸分子为第一多核苷酸。在一些实施方案中，第一多核苷酸的长度为约10至约50个核苷酸。在一些情况下，第一多核苷酸的长度为约10至约30、约15至约30、约18至约25、约18至约24、约19至约23或约20至约22个核苷酸。
在一些情况下，第一多核苷酸的长度为约50个核苷酸。在一些情况下，第一多核苷酸的长度为约45个核苷酸。在一些情况下，第一多核苷酸的长度为约40个核苷酸。在一些情况下，第一多核苷酸的长度为约 35个核苷酸。在一些情况下，第一多核苷酸的长度为约30个核苷酸。在一些情况下，第一多核苷酸的长度为约25个核苷酸。在一些情况下，第一多核苷酸的长度为约20个核苷酸。在一些情况下，第一多核苷酸的长度为约19个核苷酸。在一些情况下，第一多核苷酸的长度为约18个核苷酸。在一些情况下，第一多核苷酸的长度为约17个核苷酸。在一些情况下，第一多核苷酸的长度为约16个核苷酸。在一些情况下，第一多核苷酸的长度为约15个核苷酸。在一些情况下，第一多核苷酸的长度为约14个核苷酸。在一些情况下，第一多核苷酸的长度为约13个核苷酸。在一些情况下，第一多核苷酸的长度为约12个核苷酸。在一些情况下，第一多核苷酸的长度为约11个核苷酸。在一些情况下，第一多核苷酸的长度为约10个核苷酸。在一些情况下，第一多核苷酸的长度为约10至约50个核苷酸。在一些情况下，第一多核苷酸的长度为约10至约45 个核苷酸。在一些情况下，第一多核苷酸的长度为约10至约40个核苷酸。在一些情况下，第一多核苷酸的长度为约10至约35个核苷酸。在一些情况下，第一多核苷酸的长度为约10至约30个核苷酸。在一些情况下，第一多核苷酸的长度为约10至约25个核苷酸。在一些情况下，第一多核苷酸的长度为约10至约20个核苷酸。在一些情况下，第一多核苷酸的长度为约15至约25个核苷酸。在一些情况下，第一多核苷酸的长度为约15至约30个核苷酸。在一些情况下，第一多核苷酸的长度为约12至约30个核苷酸。
在一些实施方案中，所述多核酸分子为第二多核苷酸。在一些实施方案中，第二多核苷酸的长度为约10至约50个核苷酸。在一些情况下，第二多核苷酸的长度为约10至约30、约15至约30、约18至约25、约18至约24、约19至约23或约20至约22个核苷酸。
在一些情况下，第二多核苷酸的长度为约50个核苷酸。在一些情况下，第二多核苷酸的长度为约45个核苷酸。在一些情况下，第二多核苷酸的长度为约40个核苷酸。在一些情况下，第二多核苷酸的长度为约 35个核苷酸。在一些情况下，第二多核苷酸的长度为约30个核苷酸。在一些情况下，第二多核苷酸的长度为约25个核苷酸。在一些情况下，第二多核苷酸的长度为约20个核苷酸。在一些情况下，第二多核苷酸的长度为约19个核苷酸。在一些情况下，第二多核苷酸的长度为约18个核苷酸。在一些情况下，第二多核苷酸的长度为约17个核苷酸。在一些情况下，第二多核苷酸的长度为约16个核苷酸。在一些情况下，第二多核苷酸的长度为约15个核苷酸。在一些情况下，第二多核苷酸的长度为约14个核苷酸。在一些情况下，第二多核苷酸的长度为约13个核苷酸。在一些情况下，第二多核苷酸的长度为约12个核苷酸。在一些情况下，第二多核苷酸的长度为约11个核苷酸。在一些情况下，第二多核苷酸的长度为约10个核苷酸。在一些情况下，第二多核苷酸的长度为约10至约50个核苷酸。在一些情况下，第二多核苷酸的长度为约10至约45 个核苷酸。在一些情况下，第二多核苷酸的长度为约10至约40个核苷酸。在一些情况下，第二多核苷酸的长度为约10至约35个核苷酸。在一些情况下，第二多核苷酸的长度为约10至约30个核苷酸。在一些情况下，第二多核苷酸的长度为约10至约25个核苷酸。在一些情况下，第二多核苷酸的长度为约10至约20个核苷酸。在一些情况下，第二多核苷酸的长度为约15至约25个核苷酸。在一些情况下，第二多核苷酸的长度为约15至约30个核苷酸。在一些情况下，第二多核苷酸的长度为约12至约30个核苷酸。
在一些实施方案中，所述多核酸分子包含第一多核苷酸和第二多核苷酸。在一些情况下，多核酸分子进一步包含钝端、突出端或其组合。在一些情况下，该钝端为5’钝端、3’钝端或两者。在一些情况下，该突出端为5’突出端、3’突出端或两者。在一些情况下，该突出端包含1、2、 3、4、5、6、7、8、9或10个非碱基配对核苷酸。在一些情况下，该突出端包含1、2、3、4、5或6个非碱基配对核苷酸。在一些情况下，该突出端包含1、2、3或4个非碱基配对核苷酸。在一些情况下，该突出端包含1个非碱基配对核苷酸。在一些情况下，该突出端包含2个非碱基配对核苷酸。在一些情况下，该突出端包含3个非碱基配对核苷酸。在一些情况下，该突出端包含4个非碱基配对核苷酸。
在一些实施方案中，所述多核酸分子的序列与本文所述的靶序列至少40％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、 95％、98％、99％或99.5％互补。在一些实施方案中，多核酸分子的序列与本文所述的靶序列至少50％互补。在一些实施方案中，多核酸分子的序列与本文所述的靶序列至少60％互补。在一些实施方案中，多核酸分子的序列与本文所述的靶序列至少70％互补。在一些实施方案中，多核酸分子的序列与本文所述的靶序列至少80％互补。在一些实施方案中，多核酸分子的序列与本文所述的靶序列至少90％互补。在一些实施方案中，多核酸分子的序列与本文所述的靶序列至少95％互补。在一些实施方案中，多核酸分子的序列与本文所述的靶序列至少99％互补。在一些情况下，多核酸分子的序列与本文所述的靶序列100％互补。
在一些实施方案中，所述多核酸分子的序列与本文所述的靶序列具有5个或更少的错配。在一些实施方案中，多核酸分子的序列与本文所述的靶序列具有4个或更少的错配。在一些情况下，多核酸分子的序列与本文所述的靶序列具有3个或更少的错配。在一些情况下，多核酸分子的序列与本文所述的靶序列具有2个或更少的错配。在一些情况下，多核酸分子的序列与本文所述的靶序列具有1个或更少的错配。
在一些实施方案中，与本文所述的靶序列杂交的多核酸分子的特异性是该多核酸分子与靶序列的95％、98％、99％、99.5％或100％序列互补性。在一些情况下，该杂交是高度严格的杂交条件。
在一些实施方案中，所述多核酸分子具有降低的脱靶效应。在一些情况下，“脱靶”或“脱靶效应”是指其中针对给定靶标的多核酸聚合物通过直接或间接地与另一mRNA序列、DNA序列或者细胞蛋白质或其它部分相互作用而引起非预期效应的任何情况。在一些情况下，当由于其它转录物与多核酸分子的有义链和/或反义链之间的部分同源性或互补性而导致其它转录物同时降解时，发生“脱靶效应”。
在一些实施方案中，多核酸分子包含天然、合成或人工核苷酸类似物或碱基。在一些情况下，多核酸分子包含DNA、RNA和/或核苷酸类似物的组合。在一些情况下，该合成或人工核苷酸类似物或碱基在核糖部分、磷酸部分、核苷部分或其组合中的一种或多种处包含修饰。
在一些实施方案中，核苷酸类似物或人工核苷酸碱基包含在核糖部分的2’羟基处具有修饰的核酸。在一些情况下，该修饰包括H、OR、 R、卤素、SH、SR、NH2、NHR、NR2或CN，其中R为烷基部分。示例性的烷基部分包括但不限于卤素、硫、硫醇、硫醚、硫酯、胺(伯、仲或叔胺)、酰胺、醚、酯、醇和氧。在一些情况下，该烷基部分进一步包含修饰。在一些情况下，该修饰包括偶氮基团、酮基团、醛基团、羧基、硝基、亚硝基、腈基团、杂环(例如，咪唑、肼基或羟基氨基) 基团、异氰酸酯或氰酸酯基团，或者含硫基团(例如，亚砜、砜、硫化物和二硫化物)。在一些情况下，该烷基部分进一步包含杂取代。在一些情况下，杂环基团的碳被氮、氧或硫替代。在一些情况下，杂环取代包括但不限于吗啉代、咪唑和吡咯烷子基(pyrrolidino)。
在一些情况下，2’羟基处的修饰是2’-O-甲基修饰或2’-O-甲氧基乙基(2’-O-MOE)修饰。在一些情况下，2’-O-甲基修饰向核糖部分的 2’羟基添加甲基，而2’O-甲氧基乙基修饰向核糖部分的2’羟基添加甲氧基乙基。腺苷分子的2’-O-甲基修饰和尿苷的2’-O-甲氧基乙基修饰的示例性化学结构如下所示。
在一些情况下，2’羟基处的修饰是2’-O-氨基丙基修饰，其中包含丙基连接体的延伸胺基团将胺基团与2’氧结合。在一些情况下，该修饰通过每个糖从胺基团引入一个正电荷来中和寡核苷酸分子的磷酸酯衍生的整体负电荷，从而由于其两性离子性质来改善细胞摄取性质。2’-O- 氨基丙基核苷亚磷酰胺的示例性化学结构如下所示。
在一些情况下，2’羟基处的修饰是锁定或桥连的核糖修饰(例如，锁定核酸或LNA)，其中在2’碳处键合的氧分子通过亚甲基与4’碳连接，从而形成2′-C,4′-C-氧基-亚甲基连接的双环核糖核苷酸单体。LNA的化学结构的示例性表示如下所示。左侧所示的表示突出了LNA单体的化学连接性。右侧所示的表示突出了LNA单体的呋喃糖环的锁定的3′-内(3E)构象。
在一些情况下，2’羟基处的修饰包括亚乙基核酸(ENA)，例如 2’-4’-亚乙基桥连的核酸，其将糖构象锁定为C3’-内糖折叠(puckering) 构象。ENA是桥连核酸类别的修饰核酸的一部分，该修饰核酸也包含 LNA。ENA和桥连核酸的示例性化学结构如下所示。
在一些实施方案中，2’羟基处的其它修饰包括2’-脱氧、T-脱氧-2’- 氟代、2’-O-氨基丙基(2’-O-AP)、2’-O-二甲基氨基乙基(2’-O-DMAOE)、 2’-O-二甲基氨基丙基(2’-O-DMAP)、T-O-二甲基氨基乙氧基乙基 (2’-O-DMAEOE)或2’-O-N-甲基乙酰胺基(2’-O-NMA)。
在一些实施方案中，核苷酸类似物包含修饰的碱基，诸如但不限于5-丙炔基尿苷、5-丙炔基胞苷、6-甲基腺嘌呤、6-甲基鸟嘌呤、N,N,- 二甲基腺嘌呤、2-丙基腺嘌呤、2-丙基鸟嘌呤、2-氨基腺嘌呤、1-甲基肌苷、3-甲基尿苷、5-甲基胞苷、5-甲基尿苷和其它在5位置处具有修饰的核苷酸、5-(2-氨基)丙基尿苷、5-卤代胞苷、5-卤代尿苷、4-乙酰基胞苷、 1-甲基腺苷、2-甲基腺苷、3-甲基胞苷、6-甲基尿苷、2-甲基尿苷、7-甲基尿苷、2,2-二甲基尿苷、5-甲基氨基乙基尿苷、5-甲基氧基尿苷、脱氮核苷酸如7-脱氮-腺苷、6-偶氮尿苷、6-偶氮胞苷、6-偶氮胸苷、5-甲基 -2-硫尿苷、其它硫代碱基如2-硫代尿苷和4-硫代尿苷和2-硫代胞苷、二氢尿苷、假尿苷、辫苷、古嘌苷、萘基和取代的萘基、任何O-烷基化和 N-烷基化嘌呤和嘧啶如N6-甲基腺苷、5-甲基羰基甲基尿苷、尿苷5-羟乙酸、吡啶-4-酮、吡啶-2-酮、苯基和修饰的苯基如氨基酚或2,4,6-三甲氧基苯、充当G夹(clamp)核苷酸的修饰的胞嘧啶、8-取代的腺嘌呤和鸟嘌呤、5-取代的尿嘧啶和胸腺嘧啶、氮杂嘧啶、羧基羟烷基核苷酸、羧基烷基氨基烷基核苷酸以及烷基羰基烷基化核苷酸。修饰的核苷酸还包括在糖部分被修饰的核苷酸，以及具有非核糖基的糖或其类似物的核苷酸。例如，在一些情况下，糖部分是或基于甘露糖、阿拉伯糖、吡喃葡萄糖、吡喃半乳糖、4’-硫代核糖和其它糖、杂环或碳环。术语核苷酸还包含本领域已知的通用碱基。例如，通用碱基包括但不限于3-硝基吡咯、5-硝基吲哚或水粉蕈素。
在一些实施方案中，核苷酸类似物进一步包含吗啉代、肽核酸(PNA)、甲基磷酸酯核苷酸、硫醇磷酸酯核苷酸、2’-氟代N3-P5’-亚磷酰胺、1’,5’-失水己糖醇核酸(HNA)或其组合。吗啉代或二氨基磷酸酯吗啉代寡核苷酸(PMO)包括其结构模拟天然核酸结构但偏离正常的糖和磷酸酯结构的合成分子。在一些情况下，五元核糖环被含有四个碳、一个氮和一个氧的六元吗啉代环取代。在一些情况下，核糖单体通过二氨基磷酸酯基团而不是磷酸酯基团连接。在这样的情况下，骨架改变去除所有正电荷和负电荷，使得吗啉代中性分子能够穿过细胞膜而无需借助细胞递送剂，诸如带电荷的寡核苷酸所使用的细胞递送剂。
在一些实施方案中，肽核酸(PNA)不含糖环或磷酸酯连接，并且碱基通过寡聚甘氨酸样分子连接并适当间隔，因此消除了骨架电荷。
在一些实施方案中，一个或多个修饰任选地在核苷酸间连接处发生。在一些情况下，修饰的核苷酸间连接包括但不限于硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、甲基磷酸酯、5’-亚烷基磷酸酯、5’-甲基磷酸酯、3’-亚烷基磷酸酯、三氟化硼、3’-5’连接或2’-5’连接的硼烷磷酸酯和硒基磷酸酯、磷酸三酯、硫羰基烷基磷酸三酯、氢磷酸酯键、烷基磷酸酯、烷基硫代磷酸酯、芳基硫代磷酸酯、硒化磷酸酯(phosphoroselenoate)、二硒化磷酸酯、次膦酸酯、氨基磷酸酯、3’-烷基氨基磷酸酯、氨基烷基氨基磷酸酯、硫羰基氨基磷酸酯、哌嗪磷酸酯、苯胺硫代磷酸酯 (phosphoroanilothioate)、苯胺磷酸酯(phosphoranilidate)、酮、砜、磺胺、碳酸酯、氨基甲酸酯、亚甲基肼(methylenehydrazo)、亚甲基二甲基亚肼(methylenedimethylhydrazo)、formacetal、硫代甲缩醛、肟、亚甲基亚胺、亚甲基甲基亚胺、硫代酰胺、具有核糖乙酰基的连接、氨乙基甘氨酸、甲硅烷基或硅氧烷连接、具有或不具有杂原子的烷基或环烷基连接，例如，1至10个饱和或不饱和的和/或取代的和/或含有杂原子的碳，具有吗啉代结构、酰胺或聚酰胺的连接，其中碱基直接或间接地连接到骨架的氮杂氮，及其组合。硫代磷酸酯反义寡核苷酸(PS ASO) 是包含硫代磷酸酯连接的反义寡核苷酸。示例性PS ASO如下所示。
在一些情况下，所述修饰是甲基或硫醇修饰，如甲基磷酸酯或硫醇磷酸酯修饰。示例性的硫醇磷酸酯核苷酸(左)和甲基磷酸酯核苷酸 (右)如下所示。
在一些情况下，修饰的核苷酸包括但不限于2’-氟代N3-P5’-亚磷酰胺，如下所示：
在一些情况下，修饰的核苷酸包括但不限于己糖醇核酸(或1’,5’- 失水己糖醇核酸(HNA))，如下所示：
在一些实施方案中，一个或多个修饰进一步任选地包括核糖部分、磷酸骨架和核苷的修饰，或者3’或5’末端处的核苷酸类似物的修饰。例如，3’末端任选地包含3’阳离子基团，或用3’-3’连接在3’末端处反转核苷。在另一替代方案中，3’末端任选地与氨基烷基缀合，例如3’C5-氨基烷基dT。在另一替代方案中，3’末端任选地与脱碱基位点缀合，例如与脱嘌呤或脱嘧啶位点缀合。在一些情况下，5’末端与氨基烷基缀合，例如与5’-O-烷基氨基取代基缀合。在一些情况下，5’末端与脱碱基位点缀合，例如与脱嘌呤或脱嘧啶位点缀合。
在一些实施方案中，所述多核酸分子包含一个或多个本文所述的人工核苷酸类似物。在一些情况下，多核酸分子包含1、2、3、4、5、6、 7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、20、25个或更多个本文所述的人工核苷酸类似物。在一些实施方案中，该人工核苷酸类似物包含2’-O-甲基、2’-O-甲氧基乙基(2’-O-MOE)、2’-O-氨基丙基、2’- 脱氧、T-脱氧-2’-氟代、2’-O-氨基丙基(2’-O-AP)、2’-O-二甲基氨基乙基(2’-O-DMAOE)、2’-O-二甲基氨基丙基(2’-O-DMAP)、T-O-二甲基氨基乙氧基乙基(2’-O-DMAEOE)或2’-O-N-甲基乙酰胺基(2’-O-NMA) 修饰、LNA、ENA、PNA、HNA、吗啉代、甲基磷酸酯核苷酸、硫醇磷酸酯核苷酸、2’-氟代N3-P5’-亚磷酰胺或其组合。在一些情况下，多核酸分子包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、 16、17、18、20、25个或更多个人工核苷酸类似物，该人工核苷酸类似物选自2’-O-甲基、2’-O-甲氧基乙基(2’-O-MOE)、2’-O-氨基丙基、2’- 脱氧、T-脱氧-2’-氟代、2’-O-氨基丙基(2’-O-AP)、2’-O-二甲基氨基乙基(2’-O-DMAOE)、2’-O-二甲基氨基丙基(2’-O-DMAP)、T-O-二甲基氨基乙氧基乙基(2’-O-DMAEOE)或2’-O-N-甲基乙酰胺基(2’-O-NMA) 修饰、LNA、ENA、PNA、HNA、吗啉代、甲基磷酸酯核苷酸、硫醇磷酸酯核苷酸、2’-氟代N3-P5’-亚磷酰胺或其组合。在一些情况下，多核酸分子包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、 16、17、18、20、25个或更多个2’-O-甲基修饰的核苷酸。在一些情况下，多核酸分子包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、 14、15、16、17、18、20、25个或更多个2’-O-甲氧基乙基(2’-O-MOE) 修饰的核苷酸。在一些情况下，多核酸分子包含1、2、3、4、5、6、7、 8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、20、25个或更多个硫醇磷酸酯核苷酸。
在一些情况下，所述多核酸分子包含至少以下之一：约5％至约 100％的修饰、约10％至约100％的修饰、约20％至约100％的修饰、约 30％至约100％的修饰、约40％至约100％的修饰、约50％至约100％的修饰、约60％至约100％的修饰、约70％至约100％的修饰、约80％至约100％的修饰和约90％至约100％的修饰。
在一些情况下，所述多核酸分子包含至少以下之一：约10％至约 90％的修饰、约20％至约90％的修饰、约30％至约90％的修饰、约40％至约90％的修饰、约50％至约90％的修饰、约60％至约90％的修饰、约 70％至约90％的修饰和约80％至约100％的修饰。
在一些情况下，所述多核酸分子包含至少以下之一：约10％至约 80％的修饰、约20％至约80％的修饰、约30％至约80％的修饰、约40％至约80％的修饰、约50％至约80％的修饰、约60％至约80％的修饰和约 70％至约80％的修饰。
在一些情况下，所述多核酸分子包含至少以下之一：约10％至约 70％的修饰、约20％至约70％的修饰、约30％至约70％的修饰、约40％至约70％的修饰、约50％至约70％的修饰和约60％至约70％的修饰。
在一些情况下，所述多核酸分子包含至少以下之一：约10％至约 60％的修饰、约20％至约60％的修饰、约30％至约60％的修饰、约40％至约60％的修饰和约50％至约60％的修饰。
在一些情况下，所述多核酸分子包含至少以下之一：约10％至约 50％的修饰、约20％至约50％的修饰、约30％至约50％的修饰和约40％至约50％的修饰。
在一些情况下，所述多核酸分子包含至少以下之一：约10％至约 40％的修饰、约20％至约40％的修饰和约30％至约40％的修饰。
在一些情况下，所述多核酸分子包含至少以下之一：约10％至约 30％的修饰和约20％至约30％的修饰。
在一些情况下，所述多核酸分子包含约10％至约20％的修饰。
在一些情况下，所述多核酸分子包含约15％至约90％、约20％至约80％、约30％至约70％或约40％至约60％的修饰。
在另外的情况下，所述多核酸分子包含至少约15％、20％、30％、 40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％的修饰。
在一些实施方案中，所述多核酸分子包含至少约1、约2、约3、约4、约5、约6、约7、约8、约9、约10、约11、约12、约13、约14、约15、约16、约17、约18、约19、约20、约21、约22个或更多个修饰。
在一些情况下，所述多核酸分子包含至少约1、约2、约3、约4、约5、约6、约7、约8、约9、约10、约11、约12、约13、约14、约 15、约16、约17、约18、约19、约20、约21、约22个或更多个修饰的核苷酸.
在一些情况下，约5％至约100％的所述多核酸分子包含本文所述的人工核苷酸类似物。在一些情况下，约5％、10％、15％、20％、25％、 30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、 85％、90％、95％或100％的所述多核酸分子包含本文所述的人工核苷酸类似物。在一些情况下，约5％的多核酸分子包含本文所述的人工核苷酸类似物。在一些情况下，约10％的多核酸分子包含本文所述的人工核苷酸类似物。在一些情况下，约15％的多核酸分子包含本文所述的人工核苷酸类似物。在一些情况下，约20％的多核酸分子包含本文所述的人工核苷酸类似物。在一些情况下，约25％的多核酸分子包含本文所述的人工核苷酸类似物。在一些情况下，约30％的多核酸分子包含本文所述的人工核苷酸类似物。在一些情况下，约35％的多核酸分子包含本文所述的人工核苷酸类似物。在一些情况下，约40％的多核酸分子包含本文所述的人工核苷酸类似物。在一些情况下，约45％的多核酸分子包含本文所述的人工核苷酸类似物。在一些情况下，约50％的多核酸分子包含本文所述的人工核苷酸类似物。在一些情况下，约55％的多核酸分子包含本文所述的人工核苷酸类似物。在一些情况下，约60％的多核酸分子包含本文所述的人工核苷酸类似物。在一些情况下，约65％的多核酸分子包含本文所述的人工核苷酸类似物。在一些情况下，约70％的多核酸分子包含本文所述的人工核苷酸类似物。在一些情况下，约75％的多核酸分子包含本文所述的人工核苷酸类似物。在一些情况下，约80％的多核酸分子包含本文所述的人工核苷酸类似物。在一些情况下，约85％的多核酸分子包含本文所述的人工核苷酸类似物。在一些情况下，约90％的多核酸分子包含本文所述的人工核苷酸类似物。在一些情况下，约95％的多核酸分子包含本文所述的人工核苷酸类似物。在一些情况下，约96％的多核酸分子包含本文所述的人工核苷酸类似物。在一些情况下，约97％的多核酸分子包含本文所述的人工核苷酸类似物。在一些情况下，约98％的多核酸分子包含本文所述的人工核苷酸类似物。在一些情况下，约99％的多核酸分子包含本文所述的人工核苷酸类似物。在一些情况下，约100％的多核酸分子包含本文所述的人工核苷酸类似物。在一些实施方案中，所述人工核苷酸类似物包括2’-O-甲基、2’-O-甲氧基乙基(2’-O-MOE)、 2’-O-氨基丙基、2’-脱氧、T-脱氧-2’-氟代、2’-O-氨基丙基(2’-O-AP)、 2’-O-二甲基氨基乙基(2’-O-DMAOE)、2’-O-二甲基氨基丙基 (2’-O-DMAP)、T-O-二甲基氨基乙氧基乙基(2’-O-DMAEOE)或 2’-O-N-甲基乙酰胺基(2’-O-NMA)修饰、LNA、ENA、PNA、HNA、吗啉代、甲基磷酸酯核苷酸、硫醇磷酸酯核苷酸、2’-氟代N3-P5’-亚磷酰胺或其组合。
在一些实施方案中，所述多核酸分子包含约1至约25个修饰，其中该修饰包含本文所述的人工核苷酸类似物。在一些实施方案中，多核酸分子包含约1个修饰，其中该修饰包含本文所述的人工核苷酸类似物。在一些实施方案中，多核酸分子包含约2个修饰，其中该修饰包含本文所述的人工核苷酸类似物。在一些实施方案中，多核酸分子包含约3个修饰，其中该修饰包含本文所述的人工核苷酸类似物。在一些实施方案中，多核酸分子包含约4个修饰，其中该修饰包含本文所述的人工核苷酸类似物。在一些实施方案中，多核酸分子包含约5个修饰，其中该修饰包含本文所述的人工核苷酸类似物。在一些实施方案中，多核酸分子包含约6个修饰，其中该修饰包含本文所述的人工核苷酸类似物。在一些实施方案中，多核酸分子包含约7个修饰，其中该修饰包含本文所述的人工核苷酸类似物。在一些实施方案中，多核酸分子包含约8个修饰，其中该修饰包含本文所述的人工核苷酸类似物。在一些实施方案中，多核酸分子包含约9个修饰，其中该修饰包含本文所述的人工核苷酸类似物。在一些实施方案中，多核酸分子包含约10个修饰，其中该修饰包含本文所述的人工核苷酸类似物。在一些实施方案中，多核酸分子包含约11个修饰，其中该修饰包含本文所述的人工核苷酸类似物。在一些实施方案中，多核酸分子包含约12个修饰，其中该修饰包含本文所述的人工核苷酸类似物。在一些实施方案中，多核酸分子包含约13个修饰，其中该修饰包含本文所述的人工核苷酸类似物。在一些实施方案中，多核酸分子包含约14个修饰，其中该修饰包含本文所述的人工核苷酸类似物。在一些实施方案中，多核酸分子包含约15个修饰，其中该修饰包含本文所述的人工核苷酸类似物。在一些实施方案中，多核酸分子包含约16 个修饰，其中该修饰包含本文所述的人工核苷酸类似物。在一些实施方案中，多核酸分子包含约17个修饰，其中该修饰包含本文所述的人工核苷酸类似物。在一些实施方案中，多核酸分子包含约18个修饰，其中该修饰包含本文所述的人工核苷酸类似物。在一些实施方案中，多核酸分子包含约19个修饰，其中该修饰包含本文所述的人工核苷酸类似物。在一些实施方案中，多核酸分子包含约20个修饰，其中该修饰包含本文所述的人工核苷酸类似物。在一些实施方案中，多核酸分子包含约21个修饰，其中该修饰包含本文所述的人工核苷酸类似物。在一些实施方案中，多核酸分子包含约22个修饰，其中该修饰包含本文所述的人工核苷酸类似物。在一些实施方案中，多核酸分子包含约23个修饰，其中该修饰包含本文所述的人工核苷酸类似物。在一些实施方案中，多核酸分子包含约24个修饰，其中该修饰包含本文所述的人工核苷酸类似物。在一些实施方案中，多核酸分子包含约25个修饰，其中该修饰包含本文所述的人工核苷酸类似物。
在一些实施方案中，多核酸分子由两个单独的多核苷酸装配而成，其中一个多核苷酸包含有义链，而第二个多核苷酸包含该多核酸分子的反义链。在其它实施方案中，有义链经由连接体分子与反义链连接，在一些情况下，该连接体分子是多核苷酸连接体或非核苷酸连接体。
一些实施方案中，多核酸分子包含有义链和反义链，其中有义链中的嘧啶核苷酸包含2'-O-甲基嘧啶核苷酸，有义链中的嘌呤核苷酸包含 2'-脱氧嘌呤核苷酸。在一些实施方案中，多核酸分子包含有义链和反义链，其中有义链中存在的嘧啶核苷酸包含2'-脱氧-2'-氟代嘧啶核苷酸，并且其中有义链中存在的嘌呤核苷酸包含2'-脱氧嘌呤核苷酸。
在一些实施方案中，多核酸分子包含有义链和反义链，其中嘧啶核苷酸当存在于所述反义链中时是2'-脱氧-2'-氟代嘧啶核苷酸，并且嘌呤核苷酸当存在于所述反义链中时是2'-O-甲基嘌呤核苷酸。
在一些实施方案中，多核酸分子包含有义链和反义链，其中嘧啶核苷酸当存在于所述反义链中时是2'-脱氧-2'-氟代嘧啶核苷酸，并且其中嘌呤核苷酸当存在于所述反义链中时包含2'-脱氧-嘌呤核苷酸。
在一些实施方案中，多核酸分子包含有义链和反义链，其中有义链在有义链的5’端、3’端或者5’和3’两端包括末端帽部分。在其它实施方案中，该末端帽部分是反向脱氧脱碱基部分。
在一些实施方案中，多核酸分子包含有义链和反义链，其中反义链在反义链的3’端包含磷酸骨架修饰。在一些情况下，该磷酸骨架修饰是硫代磷酸酯。
在一些实施方案中，多核酸分子包含有义链和反义链，其中反义链在反义链的3’端包含甘油基修饰。
在一些实施方案中，多核酸分子包含有义链和反义链，其中有义链包含一个或多个，例如，约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、 12、13、14、15、16、17、18、19、20个或更多个硫代磷酸酯核苷酸间连接，和/或一个或多个(例如，约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个)2′-脱氧、2′-O-甲基、2′-脱氧-2′-氟代，和/或约一个或多个(例如，约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个)通用碱基修饰的核苷酸，和可选的在有义链的3’端、5’端或者3’和5’两端的末端帽分子；并且其中反义链包含约1至约10个或更多个，特别是约1、2、3、4、5、 6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个或更多个硫代磷酸酯核苷酸间连接，和/或一个或多个(例如，约1、2、3、4、 5、6、7、8、9、10个或更多个)2'-脱氧、2'-O-甲基、2'-脱氧-2'-氟代，和/或一个或多个(例如，约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多) 通用碱基碱基修饰的核苷酸，和可选的在反义链的3’端、5’端或者3’和 5’两端的末端帽分子。在其它实施方案中，有义链和/或反义链的一个或多个，例如约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个嘧啶核苷酸用2′-脱氧、2′-O-甲基和/或2′-脱氧-2′-氟代核苷酸进行化学修饰，具有或不具有一个或多个，例如约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个硫代磷酸酯核苷酸间连接和/或存在于相同或不同链中的、在3’端、5’端或者3’和5’两端的末端帽分子。
在一些实施方案中，多核酸分子包含有义链和反义链，其中有义链包含约1至约25个，例如，约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、 12、13、14、15、16、17、18、19、20个或更多个硫代磷酸酯核苷酸间连接，和/或一个或多个(例如，约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个)2′-脱氧、2′-O-甲基、2′-脱氧-2′-氟代，和/或一个或多个(例如，约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个)通用碱基修饰的核苷酸，以及可选的在有义链的3’端、5’端或者3’和5’两端的末端帽分子；并且其中反义链包含约1至约25个或更多个，例如约1、2、3、4、 5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个或更多个硫代磷酸酯核苷酸间连接，和/或一个或多个(例如，约1、2、3、 4、5、6、7、8、9、10个或更多个)2′-脱氧、2′-O-甲基、2′-脱氧-2′-氟代，和/或一个或多个(例如，约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个)通用碱基修饰的核苷酸，以及可选的在反义链的3’端、5’端或者3’和5’两端的末端帽分子。在其它实施方案中，有义链和/或反义链的一个或多个，例如约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个嘧啶核苷酸用2′-脱氧、2′-O-甲基和/或2′-脱氧-2′-氟代核苷酸进行化学修饰，具有或不具有约1至约25个或更多个，例如约1、2、3、4、5、6、7、 8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个或更多个硫代磷酸酯核苷酸间连接和/或存在于相同或不同链中的、在3’端、5’端或者 3’和5’两端的末端帽分子。
在一些实施方案中，多核酸分子包含有义链和反义链，其中反义链包含一个或多个，例如，约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、 12、13、14、15、16、17、18、19、20个或更多个硫代磷酸酯核苷酸间连接，和/或约一个或多个(例如，约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10 个或更多个)2′-脱氧、2′-O-甲基、2′-脱氧-2′-氟代，和/或一个或多个(例如，约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个)通用碱基修饰的核苷酸，以及可选的在有义链的3’端、5’端或者3’和5’两端的末端帽分子；并且其中反义链包含约1至约10个或更多个，特别是约1、2、3、 4、5、6、7、8、9、10个或更多个硫代磷酸酯核苷酸间连接，和/或一个或多个(例如，约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个)2′- 脱氧、2′-O-甲基、2′-脱氧-2′-氟代，和/或一个或多个(例如，约1、2、 3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个)通用碱基修饰的核苷酸，以及可选的在反义链的3’端、5’端或者3’和5’两端的末端帽分子。在其它实施方案中，有义链和/或反义链的一个或多个，例如约1、2、3、4、5、 6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个或更多个嘧啶核苷酸用2′-脱氧、2′-O-甲基和/或2′-脱氧-2′-氟核苷酸进行化学修饰，具有或不具有一个或多个，例如，约1、2、3、4、5、6、7、8、9、 10个或更多个硫代磷酸酯核苷酸间连接和/或存在于相同或不同链中的、在3’端、5’端或者3’和5’两端的末端帽分子。
在一些实施方案中，多核酸分子包含有义链和反义链，其中反义链包含约1至约25个或更多个，例如，约1、2、3、4、5、6、7、8、9、 10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个或更多个硫代磷酸酯核苷酸间连接，和/或一个或多个(例如，约1、2、3、4、5、6、7、8、 9、10个或更多个)2′-脱氧、2′-O-甲基、2′-脱氧-2′-氟代，和/或一个或多个(例如，约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个)通用碱基修饰的核苷酸，以及可选的在有义链的3’端、5’端或者3’和5’两端的末端帽分子；并且其中反义链包含约1至约25个或更多个，例如约1、 2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、 20个或更多个硫代磷酸酯核苷酸间连接，和/或一个或多个(例如，约1、 2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个)2′-脱氧、2′-O-甲基、2′-脱氧 -2′-氟代，和/或一个或多个(例如，约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10 个或更多个)通用碱基修饰的核苷酸，以及可选的在反义链的3’端、5’端或者3’和5’两端的末端帽分子。在其它实施方案中，有义链和/或反义链的一个或多个，例如约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个嘧啶核苷酸用2′-脱氧、2′-O-甲基和/或2′-脱氧-2′-氟核苷酸进行化学修饰，具有或不具有约1至约5个，例如约1、2、3、4、5个或更多个硫代磷酸酯核苷酸间连接和/或存在于相同或不同链中的、在3’端、5’端或者3’和5’两端的末端帽分子。
在一些实施方案中，本文所述的多核酸分子是化学修饰的短干扰核酸分子，其在该多核酸分子的每条链中具有约1至约25个，例如，约 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、 19、20个或更多个硫代磷酸酯核苷酸间连接。
在另一个实施方案中，本文所述的多核酸分子包含2′-5′核苷酸间连接。在一些情况下，该2′-5′核苷酸间连接位于一条或两条序列链的3’端、5’端或者3’和5’两端。在其它实例中，该2'-5′核苷酸间连接存在于一条或两条序列链内的各个其它位置，例如，多核酸分子的一条或两条链中的嘧啶核苷酸的约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个，包括每个核苷酸间连接，包含2'-5′核苷酸间连接，或者多核酸分子的一条或两条链中的嘌呤核苷酸的约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个，包括每个核苷酸间连接，包含2'-5′核苷酸间连接。
在一些实施方案中，多核酸分子是单链多核酸分子，其在细胞或重建的体外系统中介导RNAi活性，其中该多核酸分子包含与靶核酸序列具有互补性的单链多核苷酸，并且其中一个或多个存在于该多核酸中的嘧啶核苷酸是2'-脱氧-2'-氟代嘧啶核苷酸(例如，其中所有嘧啶核苷酸是2'-脱氧-2'-氟代嘧啶核苷酸，或者多个嘧啶核苷酸是2'-脱氧-2'-氟代嘧啶核苷酸)，并且其中该多核酸中存在的任何嘌呤核苷酸是2'-脱氧嘌呤核苷酸(例如，其中所有嘌呤核苷酸是2'-脱氧嘌呤核苷酸，或者多个嘌呤核苷酸是2'-脱氧嘌呤核苷酸)，以及任选地存在于反义序列的3’端、5’端或者3’和5’两端的末端帽修饰，该多核酸分子任选地在多核酸分子的3’端还包含约1至约4个(例如，约1、2、3或4个)末端2'- 脱氧核苷酸，其中该末端核苷酸进一步包含一个或多个(例如，1、2、3 或4个)硫代磷酸酯核苷酸间连接，并且其中该多核酸分子任选地还包含末端磷酸基团，例如5’末端磷酸基团。
在一些情况下，与天然多核酸分子相比，本文所述的一种或多种人工核苷酸类似物对核酸酶具有抗性，该核酸酶例如是核糖核酸酶如 RNA酶H、脱氧核糖核酸酶如DNA酶或者外切核酸酶如5’-3’外切核酸酶和3’-5’外切核酸酶。在一些情况下，包含2’-O-甲基、2’-O-甲氧基乙基(2’-O-MOE)、2’-O-氨基丙基、2’-脱氧、T-脱氧-2’-氟代、2’-O-氨基丙基(2’-O-AP)、2’-O-二甲基氨基乙基(2’-O-DMAOE)、2’-O-二甲基氨基丙基(2’-O-DMAP)、T-O-二甲基氨基乙氧基乙基(2’-O-DMAEOE) 或2’-O-N-甲基乙酰胺基(2’-O-NMA)修饰、LNA、ENA、PNA、HNA、吗啉代、甲基磷酸酯核苷酸、硫醇磷酸酯核苷酸、2’-氟代N3-P5’-亚磷酰胺或其组合的人工核苷酸类似物对核酸酶具有抗性，该核酸酶例如是核糖核酸酶如RNA酶H、脱氧核糖核酸酶如DNA酶或者外切核酸酶如 5’-3’外切核酸酶和3’-5’外切核酸酶。在一些情况下，2’-O-甲基修饰的多核酸分子是核酸酶抗性的(例如，RNA酶H、DNA酶、5’-3’外切核酸酶或3’-5’外切核酸酶抗性)。在一些情况下，2’O-甲氧基乙基(2’-O-MOE) 修饰的多核酸分子是核酸酶抗性的(例如，RNA酶H、DNA酶、5’-3’外切核酸酶或3’-5’外切核酸酶抗性)。在一些情况下，2’-O-氨基丙基修饰的多核酸分子是核酸酶抗性的(例如，RNA酶H、DNA酶、5’-3’外切核酸酶或3’-5’外切核酸酶抗性)。在一些情况下，2’-脱氧修饰的多核酸分子是核酸酶抗性的(例如，RNA酶H、DNA酶、5’-3’外切核酸酶或3’-5’外切核酸酶抗性)。在一些情况下，T-脱氧-2’-氟代修饰的多核酸分子是核酸酶抗性的(例如，RNA酶H、DNA酶、5’-3’外切核酸酶或3’-5’外切核酸酶抗性)。在一些情况下，2’-O-氨基丙基(2’-O-AP) 修饰的多核酸分子是核酸酶抗性的(例如，RNA酶H、DNA酶、5’-3’外切核酸酶或3’-5’外切核酸酶抗性)。在一些情况下，2’-O-二甲基氨基乙基(2’-O-DMAOE)修饰的多核酸分子是核酸酶抗性的(例如，RNA酶H、DNA酶、5’-3’外切核酸酶或3’-5’外切核酸酶抗性)。在一些情况下，2’-O-二甲基氨基丙基(2’-O-DMAP)修饰的多核酸分子是核酸酶抗性的(例如，RNA酶H、DNA酶、5’-3’外切核酸酶或3’-5’外切核酸酶抗性)。在一些情况下，T-O-二甲基氨基乙氧基乙基(2’-O-DMAEOE)修饰的多核酸分子是核酸酶抗性的(例如，RNA酶H、DNA酶、5’-3’外切核酸酶或3’-5’外切核酸酶抗性)。在一些情况下，2’-O-N-甲基乙酰胺基(2’-O-NMA)修饰的多核酸分子是核酸酶抗性的(例如，RNA 酶H、DNA酶、5’-3’外切核酸酶或3’-5’外切核酸酶抗性)。在一些情况下，LNA修饰的多核酸分子是核酸酶抗性的(例如，RNA酶H、DNA 酶、5’-3’外切核酸酶或3’-5’外切核酸酶抗性)。在一些情况下，ENA 修饰的多核酸分子是核酸酶抗性的(例如，RNA酶H、DNA酶、5’-3’外切核酸酶或3’-5’外切核酸酶抗性)。在一些情况下，HNA修饰的多核酸分子是核酸酶抗性的(例如，RNA酶H、DNA酶、5’-3’外切核酸酶或3’-5’外切核酸酶抗性)。在一些情况下，吗啉代是核酸酶抗性的(例如，RNA酶H、DNA酶、5’-3’外切核酸酶或3’-5’外切核酸酶抗性)。在一些情况下，PNA修饰的多核酸分子对核酸酶具有抗性(例如，RNA 酶H、DNA酶、5’-3’外切核酸酶或3’-5’外切核酸酶抗性)。在一些情况下，甲基磷酸酯核苷酸修饰的多核酸分子是核酸酶抗性的(例如，RNA 酶H、DNA酶、5’-3’外切核酸酶或3’-5’外切核酸酶抗性)。在一些情况下，硫醇磷酸酯核苷酸修饰的多核酸分子是核酸酶抗性的(例如，RNA 酶H、DNA酶、5’-3’外切核酸酶或3’-5’外切核酸酶抗性)。在一些情况下，包含2’-氟代N3-P5’-亚磷酰胺的多核酸分子是核酸酶抗性的(例如，RNA酶H、DNA酶、5’-3’外切核酸酶或3’-5’外切核酸酶抗性)。在一些情况下，本文所述的5’缀合物抑制5’-3’核酸外切切割。在一些情况下，本文所述的3’缀合物抑制3’-5’核酸外切切割。
在一些实施方案中，相对于等同的天然多核酸分子，本文所述的一种或多种人工核苷酸类似物对其mRNA靶标具有增加的结合亲和力。相对于等同的天然多核酸分子，包含2’-O-甲基、2’-O-甲氧基乙基 (2’-O-MOE)、2’-O-氨基丙基、2’-脱氧、T-脱氧-2’-氟代、2’-O-氨基丙基(2’-O-AP)、2’-O-二甲基氨基乙基(2’-O-DMAOE)、2’-O-二甲基氨基丙基(2’-O-DMAP)、T-O-二甲基氨基乙氧基乙基(2’-O-DMAEOE) 或2’-O-N-甲基乙酰胺基(2’-O-NMA)修饰、LNA、ENA、PNA、HNA、吗啉代、甲基磷酸酯核苷酸、硫醇磷酸酯核苷酸或2’-氟代N3-P5’-亚磷酰胺的一种或多种人工核苷酸类似物对其mRNA靶标具有增加的结合亲和力。在一些情况下，相对于等同的天然多核酸分子，2’-O-甲基修饰的多核酸分子对其mRNA靶标具有增加的结合亲和力。在一些情况下，相对于等同的天然多核酸分子，2’-O-甲氧基乙基(2’-O-MOE)修饰的多核酸分子对其mRNA靶标具有增加的结合亲和力。在一些情况下，相对于等同的天然多核酸分子，2’-O-氨基丙基修饰的多核酸分子对其 mRNA靶标具有增加的结合亲和力。在一些情况下，相对于等同的天然多核酸分子，2’-脱氧修饰的多核酸分子对其mRNA靶标具有增加的结合亲和力。在一些情况下，相对于等同的天然多核酸分子，T-脱氧-2’- 氟代修饰的多核酸分子对其mRNA靶标具有增加的结合亲和力。在一些情况下，相对于等同的天然多核酸分子，2’-O-氨基丙基(2’-O-AP)修饰的多核酸分子对其mRNA靶标具有增加的结合亲和力。在一些情况下，相对于等同的天然多核酸分子，2’-O-二甲基氨基乙基(2’-O-DMAOE)修饰的多核酸分子对其mRNA靶标具有增加的结合亲和力。在一些情况下，相对于等同的天然多核酸分子，2’-O-二甲基氨基丙基(2’-O-DMAP) 修饰的多核酸分子对其mRNA靶标具有增加的结合亲和力。在一些情况下，相对于等同的天然多核酸分子，T-O-二甲基氨基乙氧基乙基 (2’-O-DMAEOE)修饰的多核酸分子对其mRNA靶标具有增加的结合亲和力。在一些情况下，相对于等同的天然多核酸分子，2’-O-N-甲基乙酰胺基(2’-O-NMA)修饰的多核酸分子对其mRNA靶标具有增加的结合亲和力。在一些情况下，相对于等同的天然多核酸分子，LNA修饰的多核酸分子对其mRNA靶标具有增加的结合亲和力。在一些情况下，相对于等同的天然多核酸分子，ENA修饰的多核酸分子对其mRNA靶标具有增加的结合亲和力。在一些情况下，相对于等同的天然多核酸分子， PNA修饰的多核酸分子对其mRNA靶标具有增加的结合亲和力。在一些情况下，相对于等同的天然多核酸分子，HNA修饰的多核酸分子对其 mRNA靶标具有增加的结合亲和力。在一些情况下，相对于等同的天然多核酸分子，吗啉代修饰的多核酸分子对其mRNA靶标具有增加的结合亲和力。在一些情况下，相对于等同的天然多核酸分子，甲基磷酸酯核苷酸修饰的多核酸分子对其mRNA靶标具有增加的结合亲和力。在一些情况下，相对于等同的天然多核酸分子，硫醇磷酸酯核苷酸修饰的多核酸分子对其mRNA靶标具有增加的结合亲和力。在一些情况下，相对于等同的天然多核酸分子，包含2’-氟代N3-P5’-亚磷酰胺的多核酸分子对其mRNA靶标具有增加的结合亲和力。在一些情况下，增加的亲和力用较低的Kd、较高的解链温度(Tm)或其组合说明。
在一些实施方案中，本文所述的多核酸分子是手性纯的(或立体纯的)多核酸分子，或是包含单一对映体的多核酸分子。在一些情况下，多核酸分子包含L-核苷酸。在一些情况下，多核酸分子包含D-核苷酸。在一些情况下，多核酸分子组合物包含少于30％、25％、20％、15％、 10％、5％、4％、3％、2％、1％或更少的其镜像对映体。在一些情况下，多核酸分子组合物包含少于30％、25％、20％、15％、10％、5％、4％、 3％、2％、1％或更少的外消旋混合物。在一些情况下，多核酸分子是在美国专利公开2014/194610和2015/211006以及PCT公开WO2015107425 中描述的多核酸分子。
在一些实施方案中，进一步修饰本文所述的多核酸分子以包含适体缀合部分。在一些情况下，该适体缀合部分是DNA适体缀合部分。在一些情况下，该适体缀合部分是Alphamer(Centauri Therapeutics)，其包含识别特定细胞表面靶标的适体部分和呈现特定表位以供连接至循环抗体的部分。在一些情况下，进一步修饰本文所述的多核酸分子以包含如美国专利8,604,184、8,591,910和7,850,975中所述的适体缀合部分。
在另外的实施方案中，修饰本文所述的多核酸分子以增加其稳定性。在一些实施方案中，该多核酸分子为RNA(例如，siRNA)。在一些情况下，通过一个或多个上述修饰来修饰多核酸分子以增加其稳定性。在一些情况下，在2’羟基位置处修饰多核酸分子，诸如通过2’-O-甲基、 2’-O-甲氧基乙基(2’-O-MOE)、2’-O-氨基丙基、2’-脱氧、T-脱氧-2’- 氟代、2’-O-氨基丙基(2’-O-AP)、2’-O-二甲基氨基乙基(2’-O-DMAOE)、 2’-O-二甲基氨基丙基(2’-O-DMAP)、T-O-二甲基氨基乙氧基乙基(2’-O-DMAEOE)或2’-O-N-甲基乙酰胺基(2’-O-NMA)修饰，或者通过锁定或桥连核糖构象(例如，LNA或ENA)修饰多核酸分子。在一些情况下，多核酸分子被2’-O-甲基和/或2’-O-甲氧基乙基核糖修饰。在一些情况下，多核酸分子还包含吗啉代、PNA、HNA、甲基膦酸酯核苷酸、硫醇膦酸酯核苷酸和/或2’-氟代N3-P5’-亚磷酰胺以增加其稳定性。在一些情况下，多核酸分子是手性纯的(或立体纯的)多核酸分子。在一些情况下，修饰手性纯的(或立体纯的)多核酸分子以增加其稳定性。为了增加递送稳定性而对RNA的合适的修饰对于技术人员将会是显而易见的。
在一些实施方案中，本文所述的多核酸分子具有RNAi活性，其调节由与疾病或病症有关的基因诸如但不限于IKBKAP、SMN2、MCAD、 LMNA、DMPK、ZNF9、MAPT、FKTN、TDP-43、LDLR、CFTR、DMD、 PAH、MSTN或K-Ras编码的RNA的表达。在一些情况下，本文所述的多核酸分子是下调IKBKAP、SMN2、MCAD、LMNA、DMPK、ZNF9、 MAPT、FKTN、TDP-43、LDLR、CFTR、DMD、PAH、MSTN或K-Ras 中的至少一个的表达的双链siRNA分子，其中该双链siRNA分子的一条链包含与IKBKAP、SMN2、MCAD、LMNA、DMPK、ZNF9、MAPT、 FKTN、TDP-43、LDLR、CFTR、DMD、PAH、MSTN或K-Ras中的至少一个的核苷酸序列或者由IKBKAP、SMN2、MCAD、LMNA、DMPK、 ZNF9、MAPT、FKTN、TDP-43、LDLR、CFTR、DMD、PAH、MSTN 或K-Ras中的至少一个编码的RNA或其部分互补的核苷酸序列，并且其中该双链siRNA分子的第二条链包含与IKBKAP、SMN2、MCAD、 LMNA、DMPK、ZNF9、MAPT、FKTN、TDP-43、LDLR、CFTR、DMD、 PAH、MSTN或K-Ras中的至少一个的核苷酸序列或者由IKBKAP、SMN2、 MCAD、LMNA、DMPK、ZNF9、MAPT、FKTN、TDP-43、LDLR、CFTR、 DMD、PAH、MSTN或K-Ras中的至少一个编码的RNA或其部分基本相似的核苷酸序列。在一些情况下，本文所述的多核酸分子是下调 IKBKAP、SMN2、MCAD、LMNA、DMPK、ZNF9、MAPT、FKTN、TDP-43、 LDLR、CFTR、DMD、PAH、MSTN或K-Ras中的至少一个的表达的双链siRNA分子，其中该siRNA分子的每条链包含约15至25、18至24 或19至约23个核苷酸，并且其中每条链包含与另一条链的核苷酸互补的至少约14、17或19个核苷酸。在一些情况下，本文所述的多核酸分子是下调IKBKAP、SMN2、MCAD、LMNA、DMPK、ZNF9、MAPT、 FKTN、TDP-43、LDLR、CFTR、DMD、PAH、MSTN或K-Ras中的至少一个的表达的双链siRNA分子，其中该siRNA分子的每条链包含约 19至约23个核苷酸，并且其中每条链包含与另一条链的核苷酸互补的至少约19个核苷酸。在一些情况下，该RNAi活性发生在细胞内。在其它情况下，该RNAi活性发生在重建的体外系统中。
在一些实施方案中，本文所述的多核酸分子具有RNAi活性，其调节由与肌营养不良症有关的基因诸如但不限于DMD、DUX4、DYSF、 EMD或LMNA编码的RNA的表达。在一些情况下，本文所述的多核酸分子是下调DMD、DUX4、DYSF、EMD或LMNA中的至少一个的表达的双链siRNA分子，其中该双链siRNA分子的一条链包含与DMD、 DUX4、DYSF、EMD或LMNA中的至少一个的核苷酸序列或由DMD、 DUX4、DYSF、EMD或LMNA中的至少一个编码的RNA或其部分互补的核苷酸序列，并且其中该双链siRNA分子的第二条链包含与DMD、 DUX4、DYSF、EMD或LMNA中的至少一个的核苷酸序列或由DMD、DUX4、DYSF、EMD或LMNA中的至少一个编码的RNA或其部分基本相似的核苷酸序列。在一些情况下，本文所述的多核酸分子是下调DMD、 DUX4、DYSF、EMD或LMNA中的至少一个的表达的双链siRNA分子，其中该siRNA分子的每条链包含约15至25、18至24或19至约23个核苷酸，并且其中每条链包含与另一条链的核苷酸互补的至少约14、17 或19个核苷酸。在一些情况下，本文所述的多核酸分子是下调DMD、 DUX4、DYSF、EMD或LMNA中的至少一个的表达的双链siRNA分子，其中该siRNA分子的每条链包含约19至约23个核苷酸，并且其中每条链包含与另一条链的核苷酸互补的至少约19个核苷酸。在一些情况下，该RNAi活性发生在细胞内。在其它情况下，该RNAi活性发生在重建的体外系统中。
在一些实施方案中，本文所述的多核酸分子具有调节由DMD基因编码的RNA的表达的RNAi活性。在一些情况下，本文所述的多核酸分子是下调DMD表达的单链siRNA分子，其中该单链siRNA分子包含与DMD的核苷酸序列或由DMD编码的RNA或其部分互补的核苷酸序列。在一些情况下，本文所述的多核酸分子是下调DMD表达的单链 siRNA分子，其中该siRNA分子包含约15至25、18至24或19至约 23个核苷酸。在一些情况下，本文所述的多核酸分子是下调DMD表达的单链siRNA分子，其中该siRNA分子包含约19至约23个核苷酸。在一些情况下，该RNAi活性发生在细胞内。在其它情况下，该RNAi 活性发生在重建的体外系统中。
在一些情况下，所述多核酸分子是包含自身互补的有义和反义区的双链多核苷酸分子，其中反义区包含与靶核酸分子中的核苷酸序列或其部分互补的核苷酸序列，并且有义区具有对应于靶核酸序列或其部分的核苷酸序列。在一些情况下，所述多核酸分子由两个单独的多核苷酸装配而成，其中一条链是有义链，而另一条链是反义链，其中反义链和有义链是自身互补的(例如，每条链包含与另一条链中的核苷酸序列互补的核苷酸序列；例如其中反义链和有义链形成双链体或双链结构，例如其中双链区域为约19、20、21、22、23个或更多个碱基对)；反义链包含与靶核酸分子中的核苷酸序列或其部分互补的核苷酸序列，并且有义链包含对应于靶核酸序列或其部分的核苷酸序列。或者，所述多核酸分子由单个寡核苷酸装配而成，其中该多核酸分子的自身互补的有义和反义区通过基于核酸或非基于核酸的连接体连接。
在一些情况下，所述多核酸分子是具有双链体、不对称双链体、发夹或不对称发夹二级结构的多核苷酸，具有自身互补的有义和反义区，其中反义区包含与单独的靶核酸分子中的核苷酸序列或其部分互补的核苷酸序列，并且有义区具有对应于靶核酸序列或其部分的核苷酸序列。在其它情况下，所述多核酸分子是环状单链多核苷酸，其具有两个或更多个环结构和包含自身互补的有义和反义区的茎，其中反义区包含与靶核酸中的核苷酸序列或其部分互补的核苷酸序列，并且有义区具有对应于靶核酸序列或其部分的核苷酸序列，并且其中该环状多核苷酸在体内或体外加工，以生成能够介导RNAi的活性多核酸分子。在另外的情况下，所述多核酸分子还包含单链多核苷酸，其具有与靶核酸分子中的核苷酸序列或其部分互补的核苷酸序列(例如，在这样的多核酸分子不需要在多核酸分子内存在对应于靶核酸序列的核苷酸序列或其部分时)，其中该单链多核苷酸进一步包含末端磷酸基团，如5’-磷酸(参见例如 Martinez等人,2002,Cell.,110,563-574和Schwarz等人,2002,Molecular Cell,10,537-568)或5′,3′-二磷酸。
在一些情况下，不对称是线性多核酸分子，其包含反义区、包含核苷酸或非核苷酸的环部分以及包含比反义区更少的核苷酸的有义区，使得有义区具有足够的互补核苷酸，以与反义区发生碱基配对并与环形成双链体。例如，不对称发夹多核酸分子包含长度足以在细胞或体外系统中介导RNAi的反义区(例如约19至约22个核苷酸)和包含约4至约8个核苷酸的环区域，以及具有约3至约18个与反义区互补的核苷酸的有义区。在一些情况下，不对称发夹多核酸分子还包含化学修饰的5’末端磷酸基团。在另外的情况下，不对称发夹多核酸分子的环部分包含核苷酸、非核苷酸、连接体分子或缀合物分子。
在一些实施方案中，不对称双链体是具有包含有义区和反义区的两条单独的链的多核酸分子，其中有义区包含比反义区更少的核苷酸，使得有义区具有足够的互补核苷酸，以与反义区发生碱基配对并形成双链体。例如，不对称双链多核酸分子包含长度足以在细胞或体外系统中介导RNAi的反义区(例如约19至约22个核苷酸)和具有约3至约18 个与反义区互补的核苷酸的有义区。
在一些情况下，通用碱基是指几乎没有区别地与每个天然 DNA/RNA碱基形成碱基对的核苷酸碱基类似物。通用碱基的非限制性实例包括C-苯基、C-萘基和其它芳族衍生物、肌苷、唑类羧酰胺和硝基唑衍生物，如3-硝基吡咯、4-硝基吲哚、5-硝基吲哚和6-硝基吲哚，如本领域已知的(参见例如Loakes,2001,Nucleic Acids Research,29, 2437-2447)。
多核酸分子合成
在一些实施方案中，使用本领域已知的程序，使用化学合成和/ 或酶促连接反应构建本文所述的多核酸分子。例如，使用天然存在的核苷酸或各种修饰的核苷酸以化学方式合成多核酸分子，该修饰的核苷酸被设计用于增加分子的生物稳定性或者增加多核酸分子与靶核酸之间形成的双链体的物理稳定性。示例性方法包括在美国专利5,142,047、 5,185,444、5,889,136、6,008,400和6,111,086、PCT公开WO2009099942 或欧洲公开1579015中描述的那些方法。另外的示例性方法包括在以下文献中描述的那些方法：Griffey等人,“2’-O-aminopropyl ribonucleotides: a zwitterionic modification that enhancesthe exonuclease resistance and biological activity of antisenseoligonucleotides,”J.Med.Chem. 39(26):5100-5109(1997))；Obika等人"Synthesis of2′-O,4′-C-methyleneuridine and-cytidine.Novel bicyclic nucleosides having afixed C3,-endo sugar puckering".Tetrahedron Letters 38(50):8735 (1997)；Koizumi,M."ENA oligonucleotides as therapeutics".Current opinion in moleculartherapeutics 8(2):144–149(2006)；和Abramova等人 ,“Novel oligonucleotideanalogues based on morpholino nucleoside subunits-antisense technologies:newchemical possibilities,”Indian Journal of Chemistry 48B:1721-1726(2009)。或者，使用表达载体以生物学方式产生多核酸分子，其中多核酸分子已经以反义方向(即，从插入的多核酸分子转录的RNA将会与感兴趣的靶多核酸分子呈反义方向)亚克隆到该表达载体中。
在一些实施方案中，通过串联合成方法合成多核酸分子，其中两条链被合成为由可切割连接体隔开的单个连续寡核苷酸片段或链，随后将其切割以提供单独的片段或链，它们杂交并允许纯化双链体。
在一些情况下，多核酸分子还由两个不同的核酸链或片段装配而成，其中一个片段包括有义区，而第二个片段包括该分子的反义区。
用于掺入例如糖、碱基和磷酸修饰的其它修饰方法包括：Eckstein 等人,国际公开PCT No.WO 92/07065；Perrault等人Nature,1990,344, 565-568；Pieken等人Science,1991,253,314-317；Usman和Cedergren, Trends in Biochem.Sci.,1992,17,334-339；Usman等人,国际公开PCT No.WO 93/15187；Sproat,美国专利5,334,711和Beigelman等人,1995, J.Biol.Chem.,270,25702；Beigelman等人,国际PCT公开No.WO 97/26270；Beigelman等人,美国专利5,716,824；Usman等人,美国专利 5,627,053；Woolf等人,国际PCT公开No.WO 98/13526；Thompson等人,1998年4月20日提交的U.S.Ser.No.60/082,404；Karpeisky等人, 1998,Tetrahedron Lett.,39,1131；Earnshaw和Gait,1998,Biopolymers(Nucleic Acid Sciences),48,39-55；Verma和Eckstein,1998,Annu.Rev. Biochem.,67,99-134；和Burlina等人,1997,Bioorg.Med.Chem.,5, 1999-2010。这些出版物描述了确定糖、碱基和/或磷酸修饰等掺入核酸分子中的位置而无需调节催化的一般方法和策略。
在一些情况下，虽然采用硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯和/或5’-甲基膦酸酯连接对多核酸分子核苷酸间连接的化学修饰改善了稳定性，但过度修饰有时会引起毒性或活性降低。因此，当设计核酸分子时，在一些情况下，这些核苷酸间连接的量被最小化。在这样的情况下，这些连接的浓度的降低导致这些分子的毒性降低、功效提高以及更高的特异性。
核酸-多肽缀合物
在一些实施方案中，多核酸分子进一步缀合至多肽A以供递送至目标部位。在一些情况下，多核酸分子缀合至多肽A和可选的聚合部分。
在一些情况下，至少一个多肽A缀合至至少一个B。在一些情况下，至少一个多肽A缀合至至少一个B以形成A-B缀合物。在一些实施方案中，至少一个A缀合至B的5’末端、B的3’末端、B上的内部位点或其任意组合。在一些情况下，至少一个多肽A缀合至至少两个B。在一些情况下，至少一个多肽A缀合至至少2、3、4、5、6、7、8个或更多个B。
在一些实施方案中，至少一个多肽A在至少一个B的一个末端缀合，而至少一个C在所述至少一个B的相对末端缀合，以形成A-B-C 缀合物。在一些情况下，至少一个多肽A在至少一个B的一个末端缀合，而至少一个C在所述至少一个B上的内部位点缀合。在一些情况下，至少一个多肽A直接缀合至至少一个C。在一些情况下，至少一个B通过至少一个C间接缀合至至少一个多肽A，以形成A-C-B缀合物。
在一些情况下，至少一个B和/或至少一个C以及可选的至少一个D缀合至至少一个多肽A。在一些情况下，至少一个B在末端(例如， 5’末端或3’末端)缀合至至少一个多肽A，或者通过内部位点缀合至至少一个多肽A。在一些情况下，至少一个C直接缀合至至少一个多肽A，或者通过至少一个B间接地缀合至至少一个多肽A。如果通过至少一个 B间接缀合，则至少一个C与至少一个多肽A在相同的末端缀合在B 上、与至少一个多肽A在相对的末端缀合，或者独立地在内部位点缀合。在一些情况下，至少一个另外的多肽A进一步缀合至至少一个多肽A、 B或C。在另外的情况下，至少一个D任选地直接或间接地缀合至至少一个多肽A、至少一个B或至少一个C。如果直接缀合至至少一个多肽 A，则至少一个D也任选地缀合至至少一个B，以形成A-D-B缀合物，或者任选地缀合至至少一个B和至少一个C，以形成A-D-B-C缀合物。在一些情况下，至少一个D直接缀合至至少一个多肽A，并间接缀合至至少一个B和至少一个C，以形成D-A-B-C缀合物。如果间接缀合至至少一个多肽A，则至少一个D还任选地缀合至至少一个B，以形成A-B-D 缀合物，或者任选地缀合至至少一个B和至少一个C，以形成A-B-D-C 缀合物。在一些情况下，至少一个另外的D进一步缀合至至少一个多肽 A、B或C。
在一些实施方案中，多核酸分子缀合物包含如下所示的构建体：
在一些实施方案中，多核酸分子缀合物包含如下所示的构建体：
在一些实施方案中，多核酸分子缀合物包含如下所示的构建体：
在一些实施方案中，多核酸分子缀合物包含如下所示的构建体：
在一些实施方案中，多核酸分子缀合物包含如下所示的构建体：
在一些实施方案中，多核酸分子缀合物包含如下所示的构建体：
在一些实施方案中，多核酸分子缀合物包含如下所示的构建体：
在一些实施方案中，多核酸分子缀合物包含如下所示的构建体：
在一些实施方案中，多核酸分子缀合物包含如下所示的构建体：
在一些实施方案中，多核酸分子缀合物包含如下所示的构建体：
在一些实施方案中，多核酸分子缀合物包含如下所示的构建体：
在一些实施方案中，多核酸分子缀合物包含如下所示的构建体：
如上所示的仅用于表示目的，并且包括人源化抗体或其结合片段、嵌合抗体或其结合片段、单克隆抗体或其结合片段、单价Fab’、二价Fab2、单链可变片段(scFv)、双抗体、微抗体、纳米抗体、单域抗体(sdAb)或者骆驼科抗体或其结合片段。
结合部分
在一些实施方案中，结合部分A是多肽。在一些情况下，该多肽是抗体或其片段。在一些情况下，该片段是结合片段。在一些情况下，该抗体或其结合片段包括人源化抗体或其结合片段、鼠抗体或其结合片段、嵌合抗体或其结合片段、单克隆抗体或其结合片段、单价Fab’、二价Fab2、F(ab)'3片段、单链可变片段(scFv)、双scFv、(scFv)2、双抗体、微抗体、纳米抗体、三抗体、四抗体、二硫键稳定的Fv蛋白(dsFv)、单域抗体(sdAb)、Ig NAR、骆驼科抗体或其结合片段、双特异性抗体或其结合片段，或者它们的化学修饰的衍生物。
在一些情况下，A为抗体或其结合片段。在一些情况下，A为人源化抗体或其结合片段、鼠抗体或其结合片段、嵌合抗体或其结合片段、单克隆抗体或其结合片段、单价Fab’、二价Fab2、F(ab)'3片段、单链可变片段(scFv)、双scFv、(scFv)2、双抗体、微抗体、纳米抗体、三抗体、四抗体、二硫键稳定的Fv蛋白(“dsFv”)、单域抗体(sdAb)、Ig NAR、骆驼科抗体或其结合片段、双特异性抗体或其结合片段，或者它们的化学修饰的衍生物。在一些情况下，A为人源化抗体或其结合片段。在一些情况下，A为鼠抗体或其结合片段。在一些情况下，A为嵌合抗体或其结合片段。在一些情况下，A为单克隆抗体或其结合片段。在一些情况下，A为单价Fab’。在一些情况下，A为二价Fab2。在一些情况下，A为单链可变片段(scFv)。
在一些实施方案中，结合部分A是双特异性抗体或其结合片段。在一些情况下，该双特异性抗体是三官能抗体或双特异性微抗体。在一些情况下，该双特异性抗体是三官能抗体。在一些情况下，该三官能抗体是全长单克隆抗体，其包含针对两种不同抗原的结合位点。
在一些情况下，该双特异性抗体是双特异性微抗体。在一些情况下，该双特异性微抗体包括二价Fab2、F(ab)'3片段、双scFv、(scFv)2、双抗体、微抗体、三抗体、四抗体或双特异性T细胞接合物(BiTE)。在一些实施方案中，该双特异性T细胞接合物是包含两个单链可变片段 (scFv)的融合蛋白，其中这两个scFv靶向两种不同抗原的表位。
在一些实施方案中，结合部分A是双特异性微抗体。在一些情况下，A为双特异性Fab2。在一些情况下，A为双特异性F(ab)'3片段。在一些情况下，A为双特异性双scFv。在一些情况下，A为双特异性(scFv)2。在一些实施方案中，A为双特异性双抗体。在一些实施方案中，A为双特异性微抗体。在一些实施方案中，A为双特异性三抗体。在其它实施方案中，A为双特异性四抗体。在其它实施方案中，A为双特异性T细胞接合物(BiTE)。
在一些实施方案中，结合部分A是三特异性抗体。在一些情况下，该三特异性抗体包括F(ab)'3片段或三抗体。在一些情况下，A为三特异性F(ab)'3片段。在一些情况下，A为三抗体。在一些实施方案中，A为三特异性抗体，如Dimas等人,“Development of atrispecific antibody designed to simultaneously and efficiently target threedifferent antigens on tumor cells,”Mol.Pharmaceutics,12(9):3490-3501(2015)所述。
在一些实施方案中，结合部分A是识别细胞表面蛋白质的抗体或其结合片段。在一些情况下，结合部分A是识别肌细胞上的细胞表面蛋白质的抗体或其结合片段。被抗体或其结合片段识别的示例性的细胞表面蛋白质包括但不限于Sca-1、CD34、Myo-D、肌细胞生成蛋白、MRF4、 NCAM、CD43和CD95(Fas)。
在一些情况下，细胞表面蛋白质包括分化簇(CD)细胞表面标志物。示例性的CD细胞表面标志物包括但不限于CD1、CD2、CD3、CD4、 CD5、CD6、CD7、CD8、CD9、CD10、CD11a、CD11b、CD11c、CD11d、 CDw12、CD13、CD14、CD15、CD15s、CD16、CDw17、CD18、CD19、 CD20、CD21、CD22、CD23、CD24、CD25、CD26、CD27、CD28、 CD29、CD30、CD31、CD32、CD33、CD34、CD35、CD36、CD37、 CD38、CD39、CD40、CD41、CD42、CD43、CD44、CD45、CD45RO、 CD45RA、CD45RB、CD46、CD47、CD48、CD49a、CD49b、CD49c、CD49d、CD49e、CD49f、CD50、CD51、CD52、CD53、CD54、CD55、 CD56、CD57、CD58、CD59、CDw60、CD61、CD62E、CD62L(L-选择蛋白)、CD62P、CD63、CD64、CD65、CD66a、CD66b、CD66c、 CD66d、CD66e、CD79(例如、CD79a、CD79b)、CD90、CD95(Fas)、CD103、CD104、CD125(IL5RA)、CD134(OX40)、CD137(4-1BB)、 CD152(CTLA-4)、CD221、CD274、CD279(PD-1)、CD319(SLAMF7)、 CD326(EpCAM)等。
在一些情况下，结合部分A是识别CD细胞表面标志物的抗体或其结合片段。在一些情况下，结合部分A是识别CD1、CD2、CD3、CD4、 CD5、CD6、CD7、CD8、CD9、CD10、CD11a、CD11b、CD11c、CD11d、 CDw12、CD13、CD14、CD15、CD15s、CD16、CDw17、CD18、CD19、 CD20、CD21、CD22、CD23、CD24、CD25、CD26、CD27、CD28、 CD29、CD30、CD31、CD32、CD33、CD34、CD35、CD36、CD37、CD38、CD39、CD40、CD41、CD42、CD43、CD44、CD45、CD45RO、 CD45RA、CD45RB、CD46、CD47、CD48、CD49a、CD49b、CD49c、 CD49d、CD49e、CD49f、CD50、CD51、CD52、CD53、CD54、CD55、 CD56、CD57、CD58、CD59、CDw60、CD61、CD62E、CD62L(L-选择蛋白)、CD62P、CD63、CD64、CD65、CD66a、CD66b、CD66c、 CD66d、CD66e、CD79(例如、CD79a、CD79b)、CD90、CD95(Fas)、 CD103、CD104、CD125(IL5RA)、CD134(OX40)、CD137(4-1BB)、 CD152(CTLA-4)、CD221、CD274、CD279(PD-1)、CD319(SLAMF7)、 CD326(EpCAM)或其组合的抗体或其结合片段。
在一些实施方案中，结合部分A非特异性地缀合至多核酸分子(B)。在一些情况下，结合部分A经由赖氨酸残基或半胱氨酸残基以非位点特异性方式缀合至多核酸分子(B)。在一些情况下，结合部分A经由赖氨酸残基以非位点特异性方式缀合至多核酸分子(B)。在一些情况下，结合部分A经由半胱氨酸残基以非位点特异性方式缀合至多核酸分子 (B)。
在一些实施方案中，结合部分A以位点特异性方式缀合至多核酸分子(B)。在一些情况下，结合部分A通过赖氨酸残基、半胱氨酸残基、在5’末端、3’末端、非天然氨基酸或者酶修饰或酶催化的残基经由位点特异性方式缀合至多核酸分子(B)。在一些情况下，结合部分A 通过赖氨酸残基经由位点特异性方式缀合至多核酸分子(B)。在一些情况下，结合部分A通过半胱氨酸残基经由位点特异性方式缀合至多核酸分子(B)。在一些情况下，结合部分A在5’末端经由位点特异性方式缀合至多核酸分子(B)。在一些情况下，结合部分A在3’末端经由位点特异性方式缀合至多核酸分子(B)。在一些情况下，结合部分A 通过非天然氨基酸经由位点特异性方式缀合至多核酸分子(B)。在一些情况下，结合部分A通过酶修饰或酶催化的残基经由位点特异性方式缀合至多核酸分子(B)。
在一些实施方案中，一个或多个多核酸分子(B)缀合至结合部分 A。在一些情况下，约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、 14、15、16个或更多个多核酸分子缀合至一个结合部分A。在一些情况下，约1个多核酸分子缀合至一个结合部分A。在一些情况下，约2个多核酸分子缀合至一个结合部分A。在一些情况下，约3个多核酸分子缀合至一个结合部分A。在一些情况下，约4个多核酸分子缀合至一个结合部分A。在一些情况下，约5个多核酸分子缀合至一个结合部分A。在一些情况下，约6个多核酸分子缀合至一个结合部分A。在一些情况下，约7个多核酸分子缀合至一个结合部分A。在一些情况下，约8个多核酸分子缀合至一个结合部分A。在一些情况下，约9个多核酸分子缀合至一个结合部分A。在一些情况下，约10个多核酸分子缀合至一个结合部分A。在一些情况下，约11个多核酸分子缀合至一个结合部分A。在一些情况下，约12个多核酸分子缀合至一个结合部分A。在一些情况下，约13个多核酸分子缀合至一个结合部分A。在一些情况下，约14 个多核酸分子缀合至一个结合部分A。在一些情况下，约15个多核酸分子缀合至一个结合部分A。在一些情况下，约16个多核酸分子缀合至一个结合部分A。在一些情况下，所述一个或多个多核酸分子是相同的。在其它情况下，所述一个或多个多核酸分子是不同的。
在一些实施方案中，缀合至结合部分A的多核酸分子(B)的数目形成比值。在一些情况下，该比值被称为DAR(药物-抗体)比，其中如本文提及的药物为多核酸分子(B)。在一些情况下，多核酸分子 (B)与结合部分A的DAR比为约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、 11、12、13、14、15、16或更大。在一些情况下，多核酸分子(B)与结合部分A的DAR比为约1或更大。在一些情况下，多核酸分子(B) 与结合部分A的DAR比为约2或更大。在一些情况下，多核酸分子(B)与结合部分A的DAR比为约3或更大。在一些情况下，多核酸分子(B) 与结合部分A的DAR比为约4或更大。在一些情况下，多核酸分子(B) 与结合部分A的DAR比为约5或更大。在一些情况下，多核酸分子(B) 与结合部分A的DAR比为约6或更大。在一些情况下，多核酸分子(B) 与结合部分A的DAR比为约7或更大。在一些情况下，多核酸分子(B) 与结合部分A的DAR比为约8或更大。在一些情况下，多核酸分子(B) 与结合部分A的DAR比为约9或更大。在一些情况下，多核酸分子(B) 与结合部分A的DAR比为约10或更大。在一些情况下，多核酸分子(B) 与结合部分A的DAR比为约11或更大。在一些情况下，多核酸分子(B) 与结合部分A的DAR比为约12或更大。
在一些情况下，多核酸分子(B)与结合部分A的DAR比为约1、 2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16。在一些情况下，多核酸分子(B)与结合部分A的DAR比为约1。在一些情况下，多核酸分子(B)与结合部分A的DAR比为约2。在一些情况下，多核酸分子(B)与结合部分A的DAR比为约3。在一些情况下，多核酸分子(B)与结合部分A的DAR比为约4。在一些情况下，多核酸分子(B) 与结合部分A的DAR比为约5。在一些情况下，多核酸分子(B)与结合部分A的DAR比为约6。在一些情况下，多核酸分子(B)与结合部分A的DAR比为约7。在一些情况下，多核酸分子(B)与结合部分A 的DAR比为约8。在一些情况下，多核酸分子(B)与结合部分A的 DAR比为约9。在一些情况下，多核酸分子(B)与结合部分A的DAR 比为约10。在一些情况下，多核酸分子(B)与结合部分A的DAR比为约11。在一些情况下，多核酸分子(B)与结合部分A的DAR比为约12。在一些情况下，多核酸分子(B)与结合部分A的DAR比为约 13。在一些情况下，多核酸分子(B)与结合部分A的DAR比为约14。在一些情况下，多核酸分子(B)与结合部分A的DAR比为约15。在一些情况下，多核酸分子(B)与结合部分A的DAR比为约16。
在一些情况下，多核酸分子(B)与结合部分A的DAR比为1、 2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16。在一些情况下，多核酸分子(B)与结合部分A的DAR比为1。在一些情况下，多核酸分子(B)与结合部分A的DAR比为2。在一些情况下，多核酸分子(B)与结合部分A的DAR比为4。在一些情况下，多核酸分子(B) 与结合部分A的DAR比为6。在一些情况下，多核酸分子(B)与结合部分A的DAR比为8。在一些情况下，多核酸分子(B)与结合部分A 的DAR比为12。
在一些情况下，与包含不含结合部分A的多核酸分子(B)的缀合物相比，包含多核酸分子(B)和结合部分A的缀合物具有改善的活性。在一些情况下，改善的活性导致增强的生物学相关功能，例如，改善的稳定性、亲和力、结合、功能活性和在治疗或预防疾病状态中的功效。在一些情况下，该疾病状态是基因的一个或多个突变外显子的结果。在一些情况下，与包含不含结合部分A的多核酸分子(B)的缀合物相比，包含多核酸分子(B)和结合部分A的缀合物导致一个或多个突变外显子的外显子跳读增加。在一些情况下，与包含不含结合部分A的多核酸分子(B)的缀合物相比，在包含多核酸分子(B)和结合部分A 的缀合物中，外显子跳读增加至少或约5％、10％、20％、25％、30％、 40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或超过95％。
在一些实施方案中，使用本领域已知的常规技术进一步修饰抗体或其结合片段，例如，通过单独或组合地使用氨基酸缺失、插入、置换、添加和/或通过重组和/或本领域已知的其它任何修饰(例如，翻译后和化学修饰，如糖基化和磷酸化)。在一些情况下，该修饰进一步包括用于调节与Fc受体的相互作用的修饰。在一些情况下，所述一个或多个修饰包括例如国际公开WO97/34631中描述的那些修饰，该文献公开了参与Fc域与FcRn受体之间的相互作用的氨基酸残基。在抗体或其结合片段的氨基酸序列的核酸序列中引入此类修饰的方法是本领域技术人员公知的。
在一些情况下，抗体结合片段进一步包括其衍生物，并且包括含有至少一个CDR的多肽序列。
在一些情况下，如本文所用的术语“单链”意指双特异性单链构建体的第一和第二结构域共价连接，优选地为单个核酸分子可编码的共线氨基酸序列的形式。
在一些情况下，双特异性单链抗体构建体涉及包含两个抗体衍生的结合域的构建体。在这样的实施方案中，双特异性单链抗体构建体是串联双scFv或双抗体。在一些情况下，scFv含有通过连接体肽连接的 VH和VL域。在一些情况下，连接体的长度和序列足以确保第一和第二结构域中的每一个可以彼此独立地保留其差异结合特异性。
在一些实施方案中，与本文所用的结合或相互作用定义至少两个抗原相互作用位点彼此的结合/相互作用。在一些情况下，抗原相互作用位点定义多肽的基序，其显示出与特定抗原或特定抗原组的特异性相互作用的能力。在一些情况下，结合/相互作用也被理解为定义特异性识别。在这样的情况下，特异性识别是指抗体或其结合片段能够与每个靶分子的至少两个氨基酸特异性地相互作用和/或结合。例如，特异性识别涉及抗体分子的特异性，或其辨别靶分子的特定区域的能力。在另外的情况下，抗原相互作用位点与其特定抗原的特异性相互作用导致信号起始，例如，由于诱导抗原构象的改变、抗原的寡聚化等。在进一步的实施方案中，结合的实例是“匙-锁原理”的特异性。因此，在一些情况下，抗原相互作用位点和抗原的氨基酸序列中的特定基序由于其一级、二级或三级结构以及所述结构的二级修饰而彼此结合。在这样的情况下，抗原相互作用位点与其特定抗原的特异性相互作用也导致位点与抗原的简单结合。
在一些情况下，特异性相互作用进一步指抗体或其结合片段的交叉反应性降低或脱靶效应降低。例如，与感兴趣的多肽/蛋白质结合但不与或基本上不与其它任何多肽结合的抗体或其结合片段被认为对感兴趣的多肽/蛋白质具有特异性。抗原相互作用位点与特定抗原的特异性相互作用的实例包括配体对其受体的特异性，例如抗原决定簇(表位)与抗体的抗原结合位点的相互作用。
缀合化学
在一些实施方案中，多核酸分子B缀合至结合部分。在一些情况下，该结合部分包括氨基酸、肽、多肽、蛋白质、抗体、抗原、毒素、激素、脂质、核苷酸、核苷、糖、碳水化合物、聚合物如聚乙二醇和聚丙二醇，以及所有这些物质类别的类似物或衍生物。结合部分的其它实例还包括类固醇如胆固醇、磷脂、二酰基甘油和三酰基甘油、脂肪酸、烃(例如，饱和的、不饱和的或含有取代基)、酶底物、生物素、洋地黄毒苷和多糖。在一些情况下，该结合部分是抗体或其结合片段。在一些情况下，多核酸分子进一步缀合至聚合物和可选的内体溶解部分。
在一些实施方案中，多核酸分子通过化学连接过程缀合至结合部分。在一些情况下，多核酸分子通过天然连接缀合至结合部分。在一些情况下，缀合如下所述：Dawson等人.“Synthesis of proteins by native chemical ligation,”Science 1994,266,776–779；Dawson等人.“Modulation of Reactivity in Native Chemical Ligation through theUse of Thiol Additives,”J.Am.Chem.Soc.1997,119,4325–4329；Hackeng等人.“Protein synthesis by native chemical ligation:Expanded scope by usingstraightforward methodology.,”Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1999,96,10068– 10073；或Wu等人.“Building complex glycopeptides:Development of a cysteine-free nativechemical ligation protocol,”Angew.Chem.Int.Ed.2006, 45,4116–4125。在一些情况下，缀合如美国专利8,936,910所述。在一些实施方案中，多核酸分子经由天然连接化学位点特异性或非特异性地缀合至结合部分。
在一些情况下，多核酸分子通过利用“无痕”偶联技术(Philochem) 的定点方法缀合至结合部分。在一些情况下，该“无痕”偶联技术利用结合部分上的N-末端1,2-氨基硫醇基团，其随后与含有醛基团的多核酸分子缀合(参见Casi等人,“Site-specific tracelesscoupling of potent cytotoxic drugs to recombinant antibodies forpharmacodelivery,”JACS 134(13): 5887-5892(2012))。
在一些情况下，多核酸分子通过利用掺入结合部分中的非天然氨基酸的定点方法缀合至结合部分。在一些情况下，该非天然氨基酸包括对乙酰基苯丙氨酸(pAcPhe)。在一些情况下，pAcPhe的酮基团选择性地与衍生自烷氧基-胺的缀合部分偶联以形成肟键(参见Axup等人, “Synthesis of site-specific antibody-drug conjugates usingunnatural amino acids,”PNAS 109(40):16101-16106(2012))。
在一些情况下，多核酸分子通过利用酶催化过程的定点方法缀合至结合部分。在一些情况下，该定点方法利用SMARTagTM技术 (Redwood)。在一些情况下，SMARTagTM技术包括通过甲酰甘氨酸生成酶(FGE)在醛标签的存在下通过氧化过程从半胱氨酸生成甲酰甘氨酸(FGly)残基，随后经由肼基-Pictet-Spengler(HIPS)连接将FGly缀合至烷基肼官能化多核酸分子(参见Wu等人,“Site-specific chemical modification of recombinantproteins produced in mammalian cells by using the genetically encodedaldehyde tag,”PNAS 106(9):3000-3005(2009)； Agarwal等人,“A Pictet-Spenglerligation for protein chemical modification,” PNAS 110(1):46-51(2013))。
在一些情况下，酶催化过程包含微生物转谷氨酰胺酶(mTG)。在一些情况下，多核酸分子利用微生物转谷氨酰胺催化的过程缀合至结合部分。在一些情况下，mTG催化识别序列内谷氨酰胺的酰胺侧链与官能化多核酸分子的伯胺之间的共价键形成。在一些情况下，mTG由茂源链霉菌(Streptomyces mobarensis)产生(参见Strop等人,“Location matters:site of conjugation modulates stability and pharmacokinetics of antibody drugconjugates,”Chemistry and Biology 20(2)161-167(2013))。
在一些情况下，多核酸分子通过如PCT公开WO2014/140317中描述的方法缀合至结合部分，该方法利用序列特异性转肽酶。
在一些情况下，多核酸分子通过如美国专利公开2015/0105539和 2015/0105540中描述的方法缀合至结合部分。
抗体或其结合片段的产生
在一些实施方案中，使用本领域已知可用于合成多肽(例如，抗体)的任何方法产生本文所述的多肽(例如，抗体及其结合片段)，特别是通过化学合成或通过重组表达，并且优选地通过重组表达技术产生。
在一些情况下，重组地表达抗体或其结合片段，并且由化学合成的寡核苷酸装配编码该抗体或其结合片段的核酸(例如，如Kutmeier等人,1994,BioTechniques 17:242所述)，该方法包括合成含有编码抗体的序列部分的重叠寡核苷酸，退火并连接这些寡核苷酸，然后通过PCR扩增所连接的寡核苷酸。
或者，任选地通过使用可与序列的3′和5′端杂交的合成引物的 PCR扩增，或者通过使用对特定基因序列具有特异性的寡核苷酸探针的克隆，从合适的来源(例如，抗体cDNA文库，或由表达免疫球蛋白的任何组织或细胞生成的cDNA文库)生成编码抗体的核酸分子。
在一些情况下，任选地通过对动物如兔进行免疫来生成多克隆抗体，或者更优选地，通过生成单克隆抗体，来生成抗体或其结合片段，例如，如Kohler和Milstein(1975,Nature 256:495-497)所述，或者如 Kozbor等人(1983,Immunology Today 4:72)或Cole等人(1985， Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy,Alan R.Liss,Inc.,pp.77-96)所述。或者，任选地通过针对结合特定抗原的Fab片段的克隆筛查Fab 表达文库(例如，如Huse等人,1989,Science 246:1275-1281所述)，或通过筛查抗体文库(参见，例如，Clackson等人,1991,Nature 352:624； Hane等人,1997Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94:4937)，来获得编码至少抗体的Fab部分的克隆。
在一些实施方案中，使用被开发用于通过将来自具有适当抗原特异性的小鼠抗体分子的基因与来自具有适当生物活性的人抗体分子的基因剪接而产生“嵌合抗体”的技术(Morrison等人,1984,Proc.Natl.Acad. Sci.81:851-855；Neuberger等人,1984,Nature312:604-608；Takeda等人, 1985,Nature 314:452-454)。嵌合抗体是其中不同部分来源于不同动物物种的分子，例如具有衍生自鼠单克隆抗体的可变区和人免疫球蛋白恒定区的抗体，例如人源化抗体。
在一些实施方案中，针对产生单链抗体所描述的技术(美国专利 4,694,778；Bird,1988,Science 242:423-42；Huston等人,1988,Proc.Natl. Acad.Sci.USA 85:5879-5883；和Ward等人,1989,Nature 334:544-54)适于产生单链抗体。通过经由氨基酸桥连接Fv区的重链和轻链片段产生单链多肽来形成单链抗体。还任选地使用在大肠杆菌(E.coli)中装配功能性Fv片段的技术(Skerra等人,1988,Science 242:1038-1041)。
在一些实施方案中，通过常规技术(例如，电穿孔、脂质体转染和磷酸钙沉淀)将包含抗体的核苷酸序列的表达载体或抗体的核苷酸序列转移至宿主细胞，然后通过常规技术培养转染的细胞以产生抗体。在具体实施方案中，抗体的表达受组成型、诱导型或组织特异性启动子调节。
在一些实施方案中，利用多种宿主表达载体系统表达本文所述的抗体或其结合片段。此类宿主表达系统代表通过其产生抗体的编码序列并随后纯化的载体，而且也代表当用适当的核苷酸编码序列转化或转染时原位表达抗体或其结合片段的细胞。这些包括但不限于用含有抗体或其结合片段编码序列的重组噬菌体DNA、质粒DNA或粘粒DNA表达载体转化的微生物如细菌(例如，大肠杆菌和枯草芽孢杆菌(B.subtilis))；用含有抗体或其结合片段编码序列的重组酵母表达载体转化的酵母(例如，毕赤酵母(SaccharomycesPichia))；用含有抗体或其结合片段编码序列的重组病毒表达载体(例如，杆状病毒)感染的昆虫细胞系统；用重组病毒表达载体(例如，花椰菜花叶病毒(CaMV)和烟草花叶病毒(TMV))感染或用含有抗体或其结合片段编码序列的重组质粒表达载体(例如，Ti质粒)转化的植物细胞系统；或者带有重组表达构建体的哺乳动物细胞系统(例如，COS、CHO、BH、293、293T、3T3细胞)，所述重组表达构建体含有源自哺乳动物细胞基因组的启动子(例如，金属硫蛋白启动子)或源自哺乳动物病毒的启动子(例如，腺病毒晚期启动子；痘苗病毒7.5K启动子)。
对于重组蛋白的长期高产量生产，优选稳定表达。在一些情况下，任选地对稳定表达抗体的细胞系进行工程化。不使用含有病毒复制起点的表达载体，而是用通过适当的表达控制元件(例如，启动子、增强子、序列、转录终止子、聚腺苷酸化位点等)和选择性标记控制的DNA转化宿主细胞。在引入外源DNA后，使工程化细胞在富集培养基中生长 1-2天，然后切换到选择性培养基。重组质粒中的选择性标记赋予对选择的抗性，并允许细胞将质粒稳定整合到其染色体中，并生长形成灶点 (focus)，然后将该灶点克隆并扩充成细胞系。该方法可有利地用来对表达抗体或其结合片段的细胞系进行工程化。
在一些情况下，使用多种选择系统，包括但不限于分别在tk-、 hgprt-或aprt-细胞中使用的单纯疱疹病毒胸苷激酶(Wigler等人,1977, Cell 11:223)、次黄嘌呤-鸟嘌呤转磷酸核糖基酶(Szybalska&Szybalski, 192,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 48:202)和腺嘌呤转磷酸核糖基酶(Lowy 等人,1980,Cell 22:817)基因。此外，使用抗代谢物抗性作为选择以下基因的基础：dhfr，其赋予对氨甲蝶呤的抗性(Wigler等人,1980,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:357；O'Hare等人,1981,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78:1527)；gpt，其赋予对霉酚酸的抗性(Mulligan&Berg,1981,Proc.Natl. Acad.Sci.USA 78:2072)；neo，其赋予对氨基糖苷类G-418的抗性 (Clinical Pharmacy 12:488-505；Wu和Wu,1991,Biotherapy 3:87-95； Tolstoshev,1993,Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol.32:573-596；Mulligan, 1993,Science 260:926-932；以及Morgan和Anderson,1993,Ann.Rev.Biochem.62:191-217；May,1993,TIB TECH 11(5):155-215)；以及hygro，赋予对潮霉素的抗性(Santerre等人,1984,Gene 30:147)。重组DNA技术领域中公知的可使用的方法描述于Ausubel等人(编著),1993,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons,NY；Kriegler,1990, Gene Transfer and Expression,A Laboratory Manual,Stockton Press,NY；以及第12和13章,Dracopoli等人(编著),1994,Current Protocolsin Human Genetics,John Wiley&Sons,NY.；Colberre-Garapin等人,1981,J.Mol.Biol.150:1。
在一些情况下，通过载体扩增来增加抗体的表达水平(综述参见 Bebbington和Hentschel,The use of vectors based on gene amplification for the expressionof cloned genes in mammalian cells in DNA cloning,第3卷 (Academic Press,NewYork,1987))。当表达抗体的载体系统中的标记可扩增时，宿主细胞培养物中存在的抑制剂水平的增加将增加标记基因的拷贝数。由于扩增的区域与抗体的核苷酸序列相关，因此抗体的产生也将增加(Crouse等人,1983,Mol.Cell Biol.3:257)。
在一些情况下，使用本领域已知的用于纯化或分析抗体或抗体缀合物的任何方法，例如，通过色谱法(例如，离子交换色谱法、亲和色谱法，特别是针对蛋白A后的特定抗原的亲和色谱法，以及大小柱色谱法)、离心、差异溶解度，或通过用于纯化蛋白质的其它任何标准技术。示例性的色谱方法包括但不限于强阴离子交换色谱法、疏水相互作用色谱法、大小排阻色谱法和快速蛋白质液相色谱法。
聚合物缀合部分
在一些实施方案中，聚合物部分C进一步缀合至本文所述的多核酸分子、本文所述的结合部分或其组合。在一些情况下，聚合物部分C 缀合至多核酸分子。在一些情况下，聚合物部分C缀合至结合部分。在其它情况下，聚合物部分C缀合至多核酸分子结合部分分子。在另外的情况下，聚合物部分C如上所示缀合。
在一些情况下，聚合物部分C是天然或合成聚合物，其由支链或非支链单体的长链和/或二维或三维的单体交联网络组成。在一些情况下，聚合物部分C包括多糖、木质素、橡胶或聚环氧烷(例如，聚乙二醇)。在一些情况下，至少一个聚合物部分C包括但不限于α-、ω-二羟基聚乙二醇、可生物降解的基于内酯的聚合物，例如聚丙烯酸、聚乳酸(PLA)、聚(乙醇酸)(PGA)、聚丙烯、聚苯乙烯、聚烯烃、聚酰胺、聚氰基丙烯酸酯、聚酰亚胺、聚对苯二甲酸乙二酯(PET、PETG)、聚对苯二甲酸乙二醇酯(PETE)、聚丁二醇(PTG)或聚氨酯及其混合物。如本文所用的，混合物是指在同一化合物内以及在嵌段共聚物中使用不同聚合物。在一些情况下，嵌段共聚物是其中至少一部分聚合物由另一聚合物的单体构成的聚合物。在一些情况下，聚合物部分C包括聚环氧烷。在一些情况下，聚合物部分C包括PEG。在一些情况下，聚合物部分C 包括聚乙烯酰亚胺(PEI)或羟乙基淀粉(HES)。
在一些情况下，C为PEG部分。在一些情况下，该PEG部分在多核酸分子的5’末端缀合，而结合部分在多核酸分子的3’末端缀合。在一些情况下，该PEG部分在多核酸分子的3’末端缀合，而结合部分在多核酸分子的5’末端缀合。在一些情况下，该PEG部分缀合至多核酸分子的内部位点。在一些情况下，该PEG部分、结合部分或其组合缀合至多核酸分子的内部位点。在一些情况下，该缀合是直接缀合。在一些情况下，该缀合经由天然连接。
在一些实施方案中，聚环氧烷(例如，PEG)是多分散或单分散化合物。在一些情况下，多分散材料包含不同分子量的材料的分散分布，其特征在于平均重量(重均)大小和分散性。在一些情况下，单分散PEG 包含一种大小的分子。在一些实施方案中，C为多分散或单分散的聚环氧烷(例如，PEG)，并且指示的分子量表示聚环氧烷(例如，PEG) 分子的分子量的平均值。
在一些实施方案中，聚环氧烷(例如，PEG)的分子量为约200、 300、400、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、 1450、1500、1600、1700、1800、1900、2000、2100、2200、2300、2400、 2500、2600、2700、2800、2900、3000、3250、3350、3500、3750、4000、4250、4500、4600、4750、5000、5500、6000、6500、7000、7500、8000、 10,000、12,000、20,000、35,000、40,000、50,000、60,000或100,000Da。
在一些实施方案中，C为聚环氧烷(例如，PEG)，并且具有约 200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、 1400、1450、1500、1600、1700、1800、1900、2000、2100、2200、2300、2400、2500、2600、2700、2800、2900、3000、3250、3350、3500、3750、 4000、4250、4500、4600、4750、5000、5500、6000、6500、7000、7500、 8000、10,000、12,000、20,000、35,000、40,000、50,000、60,000或100,000 Da的分子量。在一些实施方案中，C为PEG，并且具有约200、300、 400、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1450、 1500、1600、1700、1800、1900、2000、2100、2200、2300、2400、2500、 2600、2700、2800、2900、3000、3250、3350、3500、3750、4000、4250、 4500、4600、4750、5000、5500、6000、6500、7000、7500、8000、10,000、 12,000、20,000、35,000、40,000、50,000、60,000或100,000Da的分子量。在一些情况下，C的分子量为约200Da。在一些情况下，C的分子量为约300Da。在一些情况下，C的分子量为约400Da。在一些情况下， C的分子量为约500Da。在一些情况下，C的分子量为约600Da。在一些情况下，C的分子量为约700Da。在一些情况下，C的分子量为约800 Da。在一些情况下，C的分子量为约900Da。在一些情况下，C的分子量为约1000Da。在一些情况下，C的分子量为约1100Da。在一些情况下，C的分子量为约1200Da。在一些情况下，C的分子量为约1300Da。在一些情况下，C的分子量为约1400Da。在一些情况下，C的分子量为约1450Da。在一些情况下，C的分子量为约1500Da。在一些情况下， C的分子量为约1600Da。在一些情况下，C的分子量为约1700Da。在一些情况下，C的分子量为约1800Da。在一些情况下，C的分子量为约 1900Da。在一些情况下，C的分子量为约2000Da。在一些情况下，C 的分子量为约2100Da。在一些情况下，C的分子量为约2200Da。在一些情况下，C的分子量为约2300Da。在一些情况下，C的分子量为约 2400Da。在一些情况下，C的分子量为约2500Da。在一些情况下，C 的分子量为约2600Da。在一些情况下，C的分子量为约2700Da。在一些情况下，C的分子量为约2800Da。在一些情况下，C的分子量为约 2900Da。在一些情况下，C的分子量为约3000Da。在一些情况下，C 的分子量为约3250Da。在一些情况下，C的分子量为约3350Da。在一些情况下，C的分子量为约3500Da。在一些情况下，C的分子量为约3750Da。在一些情况下，C的分子量为约4000Da。在一些情况下，C 的分子量为约4250Da。在一些情况下，C的分子量为约4500Da。在一些情况下，C的分子量为约4600Da。在一些情况下，C的分子量为约 4750Da。在一些情况下，C的分子量为约5000Da。在一些情况下，C 的分子量为约5500Da。在一些情况下，C的分子量为约6000Da。在一些情况下，C的分子量为约6500Da。在一些情况下，C的分子量为约 7000Da。在一些情况下，C的分子量为约7500Da。在一些情况下，C 的分子量为约8000Da。在一些情况下，C的分子量为约10,000Da。在一些情况下，C的分子量为约12,000Da。在一些情况下，C的分子量为约20,000Da。在一些情况下，C的分子量为约35,000Da。在一些情况下，C的分子量为约40,000Da。在一些情况下，C的分子量为约50,000 Da。在一些情况下，C的分子量为约60,000Da。在一些情况下，C的分子量为约100,000Da。
在一些实施方案中，聚环氧烷(例如，PEG)包含离散的环氧乙烷单元(例如4至约48个环氧乙烷单元)。在一些情况下，包含离散的环氧乙烷单元的聚环氧烷是直链。在其它情况下，包含离散的环氧乙烷单元的聚环氧烷是支链。
在一些情况下，聚合物部分C是包含离散的环氧乙烷单元的聚环氧烷(例如，PEG)。在一些情况下，聚合物部分C包含约4至约48 个环氧乙烷单元。在一些情况下，聚合物部分C包含约4、约5、约6、约7、约8、约9、约10、约11、约12、约13、约14、约15、约16、约17、约18、约19、约20、约21、约22、约23、约24、约25、约26、约27、约28、约29、约30、约31、约32、约33、约34、约35、约36、约37、约38、约39、约40、约41、约42、约43、约44、约45、约46、约47或约48个环氧乙烷单元。
在一些情况下，聚合物部分C是离散的PEG，其包含，例如，约 4至约48个环氧乙烷单元。在一些情况下，聚合物部分C是离散的PEG，其包含，例如，约4、约5、约6、约7、约8、约9、约10、约11、约 12、约13、约14、约15、约16、约17、约18、约19、约20、约21、约22、约23、约24、约25、约26、约27、约28、约29、约30、约31、约32、约33、约34、约35、约36、约37、约38、约39、约40、约41、约42、约43、约44、约45、约46、约47或约48个环氧乙烷单元。在一些情况下，聚合物部分C是离散的PEG，其包含，例如，约4个环氧乙烷单元。在一些情况下，聚合物部分C是离散的PEG，其包含，例如，约5个环氧乙烷单元。在一些情况下，聚合物部分C是离散的PEG，其包含，例如，约6个环氧乙烷单元。在一些情况下，聚合物部分C是离散的PEG，其包含，例如，约7个环氧乙烷单元。在一些情况下，聚合物部分C是离散的PEG，其包含，例如，约8个环氧乙烷单元。在一些情况下，聚合物部分C是离散的PEG，其包含，例如，约9个环氧乙烷单元。在一些情况下，聚合物部分C是离散的PEG，其包含，例如，约 10个环氧乙烷单元。在一些情况下，聚合物部分C是离散的PEG，其包含，例如，约11个环氧乙烷单元。在一些情况下，聚合物部分C是离散的PEG，其包含，例如，约12个环氧乙烷单元。在一些情况下，聚合物部分C是离散的PEG，其包含，例如，约13个环氧乙烷单元。在一些情况下，聚合物部分C是离散的PEG，其包含，例如，约14个环氧乙烷单元。在一些情况下，聚合物部分C是离散的PEG，其包含，例如，约15个环氧乙烷单元。在一些情况下，聚合物部分C是离散的 PEG，其包含，例如，约16个环氧乙烷单元。在一些情况下，聚合物部分C是离散的PEG，其包含，例如，约17个环氧乙烷单元。在一些情况下，聚合物部分C是离散的PEG，其包含，例如，约18个环氧乙烷单元。在一些情况下，聚合物部分C是离散的PEG，其包含，例如，约 19个环氧乙烷单元。在一些情况下，聚合物部分C是离散的PEG，其包含，例如，约20个环氧乙烷单元。在一些情况下，聚合物部分C是离散的PEG，其包含，例如，约21个环氧乙烷单元。在一些情况下，聚合物部分C是离散的PEG，其包含，例如，约22个环氧乙烷单元。在一些情况下，聚合物部分C是离散的PEG，其包含，例如，约23个环氧乙烷单元。在一些情况下，聚合物部分C是离散的PEG，其包含，例如，约24个环氧乙烷单元。在一些情况下，聚合物部分C是离散的PEG，其包含，例如，约25个环氧乙烷单元。在一些情况下，聚合物部分C是离散的PEG，其包含，例如，约26个环氧乙烷单元。在一些情况下，聚合物部分C是离散的PEG，其包含，例如，约27个环氧乙烷单元。在一些情况下，聚合物部分C是离散的PEG，其包含，例如，约 28个环氧乙烷单元。在一些情况下，聚合物部分C是离散的PEG，其包含，例如，约29个环氧乙烷单元。在一些情况下，聚合物部分C是离散的PEG，其包含，例如，约30个环氧乙烷单元。在一些情况下，聚合物部分C是离散的PEG，其包含，例如，约31个环氧乙烷单元。在一些情况下，聚合物部分C是离散的PEG，其包含，例如，约32个环氧乙烷单元。在一些情况下，聚合物部分C是离散的PEG，其包含，例如，约33个环氧乙烷单元。在一些情况下，聚合物部分C是离散的 PEG，其包含，例如，约34个环氧乙烷单元。在一些情况下，聚合物部分C是离散的PEG，其包含，例如，约35个环氧乙烷单元。在一些情况下，聚合物部分C是离散的PEG，其包含，例如，约36个环氧乙烷单元。在一些情况下，聚合物部分C是离散的PEG，其包含，例如，约 37个环氧乙烷单元。在一些情况下，聚合物部分C是离散的PEG，其包含，例如，约38个环氧乙烷单元。在一些情况下，聚合物部分C是离散的PEG，其包含，例如，约39个环氧乙烷单元。在一些情况下，聚合物部分C是离散的PEG，其包含，例如，约40个环氧乙烷单元。在一些情况下，聚合物部分C是离散的PEG，其包含，例如，约41个环氧乙烷单元。在一些情况下，聚合物部分C是离散的PEG，其包含，例如，约42个环氧乙烷单元。在一些情况下，聚合物部分C是离散的 PEG，其包含，例如，约43个环氧乙烷单元。在一些情况下，聚合物部分C是离散的PEG，其包含，例如，约44个环氧乙烷单元。在一些情况下，聚合物部分C是离散的PEG，其包含，例如，约45个环氧乙烷单元。在一些情况下，聚合物部分C是离散的PEG，其包含，例如，约 46个环氧乙烷单元。在一些情况下，聚合物部分C是离散的PEG，其包含，例如，约47个环氧乙烷单元。在一些情况下，聚合物部分C是离散的PEG，其包含，例如，约48个环氧乙烷单元。
在一些情况下，聚合物部分C是(Quanta Biodesign Ltd) 。
在一些实施方案中，聚合物部分C包含基于阳离子粘酸的聚合物 (cMAP)。在一些情况下，cMAP包含至少一个重复亚单位的一个或多个亚单位，并且该亚单位结构表示为式(V)：
其中m在每次出现时独立地为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10，优选4-6或5；并且n在每次出现时独立地为1、2、3、4或5。在一些实施方案中，m和n为例如约10。
在一些情况下，cMAP进一步缀合至PEG部分，生成cMAP-PEG 共聚物、mPEG-cMAP-PEGm三嵌段聚合物或cMAP-PEG-cMAP三嵌段聚合物。在一些情况下，PEG部分的范围为约500Da至约50,000Da。在一些情况下，PEG部分的范围为约500Da至约1000Da、大于1000Da 至约5000Da、大于5000Da至约10,000Da、大于10,000至约25,000Da、大于25,000Da至约50,000Da，或这些范围中的两个或更多个的任意组合。
在一些情况下，聚合物部分C是cMAP-PEG共聚物、 mPEG-cMAP-PEGm三嵌段聚合物或cMAP-PEG-cMAP三嵌段聚合物。在一些情况下，聚合物部分C是cMAP-PEG共聚物。在其它情况下，聚合物部分C是mPEG-cMAP-PEGm三嵌段聚合物。在另外的情况下，聚合物部分C是cMAP-PEG-cMAP三嵌段聚合物。
在一些实施方案中，聚合物部分C如上所示缀合至多核酸分子、结合部分和可选的内体溶解部分。
内体溶解部分
在一些实施方案中，式(I)的分子：A-X-B-Y-C，进一步包含另外的缀合部分。在一些情况下，该另外的缀合部分是内体溶解部分。在一些情况下，该内体溶解部分是细胞区室释放组分，诸如能够从本领域已知的任何细胞区室释放的化合物，该细胞区室例如是内体、溶酶体、内质网(ER)、高尔基体、微管、过氧化物酶体或细胞内的其它囊泡体。在一些情况下，该内体溶解部分包含内体溶解多肽、内体溶解聚合物、内体溶解脂质或内体溶解小分子。在一些情况下，该内体溶解部分包含内体溶解多肽。在其它情况下，该内体溶解部分包含内体溶解聚合物。
内体溶解多肽
在一些实施方案中，式(I)的分子：A-X-B-Y-C，进一步缀合至内体溶解多肽。在一些情况下，该内体溶解多肽是pH依赖性膜活性肽。在一些情况下，该内体溶解多肽是两亲性多肽。在另外的情况下，该内体溶解多肽是拟肽。在一些情况下，该内体溶解多肽包含INF、蜂毒肽、 meucin或其各自的衍生物。在一些情况下，该内体溶解多肽包含INF或其衍生物。在其它情况下，该内体溶解多肽包含蜂毒肽或其衍生物。在另外的情况下，该内体溶解多肽包含meucin或其衍生物。
在一些情况下，INF7为24个残基的多肽，其序列包含 CGIFGEIEELIEEGLENLIDWGNA(SEQ ID NO:1)或 GLFEAIEGFIENGWEGMIDGWYGC(SEQ ID NO:2)。在一些情况下， INF7或其衍生物包含以下序列： GLFEAIEGFIENGWEGMIWDYGSGSCG(SEQ ID NO:3)、GLFEAIEGFIENGWEGMIDGWYG-(PEG)6-NH2(SEQ ID NO:4)或 GLFEAIEGFIENGWEGMIWDYG-SGSC-K(GalNAc)2(SEQ ID NO:5)。
在一些情况下，蜂毒肽是26个残基的多肽，其序列包含CLIGAILKVLATGLPTLISWIKNKRKQ(SEQ ID NO:6)或 GIGAVLKVLTTGLPALISWIKRKRQQ(SEQ IDNO:7)。在一些情况下，蜂毒肽包含如美国专利8,501,930中描述的多肽序列。
在一些情况下，meucin是来源于蝎子条斑钳蝎(Mesobuthus eupeus) 的毒腺的抗微生物肽(AMP)。在一些情况下，meucin包括meucin-13 和meucin-18，meucin-13的序列包含IFGAIAGLLKNIF-NH2(SEQ ID NO: 8)，meucin-18的序列包含FFGHLFKLATKIIPSLFQ(SEQID NO:9)。
在一些情况下，内体溶解多肽包括其序列与INF7或其衍生物、蜂毒肽或其衍生物或者meucin或其衍生物具有至少50％、60％、70％、80％、 90％、95％或99％序列同一性的多肽。在一些情况下，内体溶解部分包括INF7或其衍生物、蜂毒肽或其衍生物或者meucin或其衍生物。
在一些情况下，内体溶解部分是INF7或其衍生物。在一些情况下，内体溶解部分包含与SEQ ID NO:1-5具有至少50％、55％、60％、65％、 70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的多肽。在一些情况下，内体溶解部分包含与SEQID NO:1 具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、 96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的多肽。在一些情况下，内体溶解部分包含与SEQ ID NO:2-5具有至少50％、55％、60％、65％、 70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的多肽。在一些情况下，内体溶解部分包含SEQ ID NO:1。在一些情况下，内体溶解部分包含SEQ ID NO:2-5。在一些情况下，内体溶解部分由SEQ ID NO:1组成。在一些情况下，内体溶解部分由SEQ ID NO:2-5组成。
在一些情况下，内体溶解部分是蜂毒肽或其衍生物。在一些情况下，内体溶解部分包含与SEQ ID NO:6或7具有至少至少50％、55％、 60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、 99％或100％序列同一性的多肽。在一些情况下，内体溶解部分包含与 SEQ ID NO:6具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、 90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的多肽。在一些情况下，内体溶解部分包含与SEQ ID NO:7具有至少50％、55％、60％、 65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或 100％序列同一性的多肽。在一些情况下，内体溶解部分包含SEQ IDNO: 6。在一些情况下，内体溶解部分包含SEQ ID NO:7。在一些情况下，内体溶解部分由SEQID NO:6组成。在一些情况下，内体溶解部分由 SEQ ID NO:7组成。
在一些情况下，内体溶解部分是meucin或其衍生物。在一些情况下，内体溶解部分包含与SEQ ID NO:8或9具有至少50％、55％、60％、 65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或 100％序列同一性的多肽。在一些情况下，内体溶解部分包含与SEQ ID NO:8具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、 95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的多肽。在一些情况下，内体溶解部分包含与SEQID NO:9具有至少50％、55％、60％、65％、 70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的多肽。在一些情况下，内体溶解部分包含SEQ ID NO:8。在一些情况下，内体溶解部分包含SEQ ID NO:9。在一些情况下，内体溶解部分由SEQ ID NO:8组成。在一些情况下，内体溶解部分由SEQ ID NO:9组成。
在一些情况下，内体溶解部分包含如表1所示的序列。
表1.
在一些情况下，内体溶解部分包含Bak BH3多肽，后者通过拮抗抑制剂靶标如Bcl-2和/或Bcl-xL诱导凋亡。在一些情况下，内体溶解部分包含Albarran等人,“Efficientintracellular delivery of a pro-apoptotic peptide with a pH-responsivecarrier,”Reactive&Functional Polymers 71: 261-265(2011)描述的Bak BH3多肽。
在一些情况下，内体溶解部分包含PCT公开WO2013/166155或 WO2015/069587中描述的多肽(例如，细胞穿透多肽)。
连接体
在一些实施方案中，本文所述的连接体是可切割连接体或不可切割连接体。在一些情况下，该连接体是可切割连接体。在其它情况下，该连接体是不可切割连接体。
在一些情况下，所述连接体是非聚合连接体。非聚合连接体是指不含通过聚合过程生成的单体重复单元的连接体。示例性的非聚合连接体包括但不限于C1-C6烷基(例如，C5、C4、C3、C2或C1烷基)、同双官能交联体、异双官能交联体、肽连接体、无痕连接体、自牺牲(self-immolative)连接体、基于马来酰亚胺的连接体或其组合。在一些情况下，非聚合连接体包含C1-C6烷基(例如，C5、C4、C3、C2或C1烷基)、同双官能交联体、异双官能交联体、肽连接体、无痕连接体、自牺牲连接体、基于马来酰亚胺的连接体或其组合。在另外的情况下，非聚合连接体不包含超过两个相同类型的连接体，例如，超过两个同双官能交联体，或超过两个肽连接体。在其它情况下，非聚合连接体任选地包含一个或多个反应性官能团。
在一些情况下，非聚合连接体不包含以上描述的聚合物。在一些情况下，非聚合连接体不包含由聚合物部分C所包含的聚合物。在一些情况下，非聚合连接体不包含聚环氧烷(例如PEG)。在一些情况下，非聚合连接体不包含PEG。
在一些情况下，所述连接体包括同双官能连接体。示例性的同双官能连接体包括但不限于Lomant试剂二硫代双(琥珀酰亚胺基丙酸酯) DSP、3′3′-二硫代双(磺基琥珀酰亚胺基丙酸酯)(DTSSP)、二琥珀酰亚胺基辛二酸酯(DSS)、双(磺基琥珀酰亚胺基)辛二酸酯(BS)、二琥珀酰亚胺基酒石酸酯(DST)、二磺基琥珀酰亚胺基酒石酸酯(磺基DST)、双(琥珀酰亚胺基琥珀酸酯)乙二醇酯(EGS)、二琥珀酰亚胺基戊二酸酯(DSG)、N,N′-二琥珀酰亚胺基碳酸酯(DSC)、二甲基己二酰亚胺酯(DMA)、二甲基庚二酰亚胺酯(DMP)、二甲基辛二酰亚胺酯(DMS)、二甲基-3,3′-二硫代双丙酰亚胺酯(DTBP)、1,4-二-3′-(2′-吡啶基二硫代) 丙酰胺基)丁烷(DPDPB)、双马来酰亚胺己烷(BMH)、含芳基卤的化合物(DFDNB)如1,5-二氟-2,4-二硝基苯或1,3-二氟-4,6-二硝基苯、 4,4′-二氟-3,3′-二硝基苯基砜(DFDNPS)、双-[β-(4-叠氮基水杨基氨基) 乙基]二硫化物(BASED)、甲醛、戊二醛、1,4-丁二醇二缩水甘油醚、己二酸二酰肼、碳酰肼、邻甲苯胺、3,3′-二甲基联苯胺、联苯胺、α,α′- 对二氨基联苯、二碘-对二甲苯磺酸、N,N′-亚乙基-双(碘乙酰胺)或N,N′- 六亚甲基-双(碘乙酰胺)。
在一些实施方案中，所述连接体包括异双官能连接体。示例性的异双官能连接体包括但不限于胺反应性和巯基交联体，诸如N-琥珀酰亚胺基3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(sPDP)、长链N-琥珀酰亚胺基3-(2- 吡啶基二硫代)丙酸酯(LC-sPDP)、水溶性长链N-琥珀酰亚胺基3-(2- 吡啶基二硫代)丙酸酯(磺基-LC-sPDP)、琥珀酰亚胺基氧羰基-α-甲基 -α-(2-吡啶基二硫代)甲苯(sMPT)、磺基琥珀酰亚胺基-6-[α-甲基-α-(2- 吡啶基二硫代)甲苯酰胺基]己酸酯(磺基-LC-sMPT)、琥珀酰亚胺基 -4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-甲酸酯(sMCC)、磺基琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-甲酸酯(磺基-sMCC)、间-马来酰亚胺基苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯(MBs)、间-马来酰亚胺基苯甲酰基-N-羟基磺基琥珀酰亚胺酯(磺基-MBs)、N-琥珀酰亚胺基(4-碘乙酰基)氨基苯甲酸酯(sIAB)、磺基琥珀酰亚胺基(4-碘乙酰基)氨基苯甲酸酯(磺基-sIAB)、琥珀酰亚胺基-4-(对-马来酰亚胺基苯基)丁酸酯 (sMPB)、磺基琥珀酰亚胺基-4-(对-马来酰亚胺基苯基)丁酸酯(磺基 -sMPB)、N-(γ-马来酰亚胺基丁酰基氧基)琥珀酰亚胺酯(GMBs)、N-(γ- 马来酰亚胺基丁酰基氧基)磺基琥珀酰亚胺酯(磺基-GMBs)、琥珀酰亚胺基6-((碘乙酰基)氨基)己酸酯(sIAX)、琥珀酰亚胺基6-[6-(((碘磺基琥珀酰亚胺)氨基)己酰基)氨基]己酸酯(sIAXX)、琥珀酰亚胺基4-(((碘磺基琥珀酰亚胺)氨基)甲基)环己烷-1-甲酸酯(sIAC)、琥珀酰亚胺基6-((((4-碘磺基琥珀酰亚胺)氨基)甲基)环己烷-1-羰基)氨基)己酸酯 (sIACX)、对-硝基苯基碘乙酸酯(NPIA)；羰基反应性和巯基反应性交联体，诸如4-(4-N-马来酰亚胺基苯基)丁酸酰肼(MPBH)、4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧基-酰肼-8(M2C2H)、3-(2-吡啶基二硫代) 丙酰基酰肼(PDPH)；胺反应性和光反应性交联体，诸如N-羟基琥珀酰亚胺基-4-叠氮基水杨酸(NHs-AsA)、N-羟基磺基琥珀酰亚胺基-4- 叠氮基水杨酸(磺基-NHs-AsA)、磺基琥珀酰亚胺基-(4-叠氮基水杨基酰胺基)己酸酯(磺基-NHs-LC-AsA)、磺基琥珀酰亚胺基-2-(ρ-叠氮基水杨基酰胺基)乙基-1,3′-二硫丙酸酯(sAsD)、N-羟基琥珀酰亚胺基-4- 叠氮基苯甲酸酯(HsAB)、N-羟基磺基琥珀酰亚胺基-4-叠氮基苯甲酸酯(磺基-HsAB)、N-琥珀酰亚胺基-6-(4′-叠氮基-2′-硝基苯基氨基)己酸酯(sANPAH)、磺基琥珀酰亚胺基-6-(4′-叠氮基-2′-硝基苯基氨基)己酸酯(磺基-sANPAH)、N-5-叠氮基-2-硝基苯甲酰基氧琥珀酰亚胺(ANB-NOs)、磺基琥珀酰亚胺基-2-(间-叠氮基-邻-硝基苯甲酰胺基)- 乙基-1,3′-二硫代丙酸酯(sAND)、N-琥珀酰亚胺基-4(4-叠氮基苯基)1,3′- 二硫代丙酸酯(sADP)、N-磺基琥珀酰亚胺基(4-叠氮基苯基)-1,3′-二硫代丙酸酯(磺基-sADP)、磺基琥珀酰亚胺基4-(ρ-叠氮基苯基)丁酸酯(磺基-sAPB)、磺基琥珀酰亚胺基2-(7-叠氮基-4-甲基香豆素-3-乙酰胺)乙基-1,3′-二硫代丙酸酯(sAED)、磺基琥珀酰亚胺基7-叠氮基-4-甲基香豆素-3-乙酸酯(磺基-sAMCA)、ρ-硝基苯基重氮基丙酮酸酯(ρNPDP)、ρ-硝基苯基-2-重氮基-3,3,3-三氟丙酸酯(PNP-DTP)；巯基反应性和光反应性交联体，诸如1-(ρ-叠氮基水杨基酰胺基)-4-(碘乙酰胺基)丁烷 (AsIB)、N-[4-(ρ-叠氮基水杨基酰胺基)丁基]-3′-(2′-吡啶基二硫代)丙酰胺(APDP)、二苯甲酮-4-碘乙酰胺、二苯甲酮-4-马来酰亚胺；羰基反应性和光反应性交联体，诸如ρ-叠氮基苯甲酰基酰肼(ABH)；羧酸酯反应性和光反应性交联体，诸如4-(ρ-叠氮基水杨基酰胺基)丁胺(AsBA)；以及精氨酸反应性和光反应性交联体，诸如ρ-叠氮基苯基乙二醛(APG)。
在一些情况下，所述连接体包含反应性官能团。在一些情况下，该反应性官能团包含对结合部分上存在的亲电子基团具有反应性的亲核基团。示例性的亲电子基团包括羰基，如醛、酮、羧酸、酯、酰胺、烯酮、酰卤或酸酐。在一些实施方案中，该反应性官能团是醛。示例性的亲核基团包括酰肼、肟、氨基、肼、缩氨基硫脲、肼羧酸酯和芳基肼。
在一些实施方案中，所述连接体包含马来酰亚胺基团。在一些情况下，马来酰亚胺基团也被称为马来酰亚胺间隔基。在一些情况下，该马来酰亚胺基团进一步包含己酸，形成马来酰亚胺己酰基(mc)。在一些情况下，该连接体包含马来酰亚胺己酰基(mc)。在一些情况下，该连接体是马来酰亚胺己酰基(mc)。在其它情况下，该马来酰亚胺基团包括马来酰亚胺甲基，例如如上所述的琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-甲酸酯(sMCC)或磺基琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-甲酸酯(磺基-sMCC)。
在一些实施方案中，所述马来酰亚胺基团是自稳定的马来酰亚胺。在一些情况下，自稳定的马来酰亚胺利用二氨基丙酸(DPR)并入邻近马来酰亚胺的碱性氨基，以提供硫代琥珀酰亚胺环水解的分子内催化，从而阻止马来酰亚胺发生通过逆迈克尔反应的消除反应。在一些情况下，自稳定的马来酰亚胺是Lyon等人,“Self-hydrolyzing maleimidesimprove the stability and pharmacological properties of antibody-drugconjugates,” Nat.Biotechnol.32(10):1059-1062(2014)描述的马来酰亚胺基团。在一些情况下，所述连接体包含自稳定的马来酰亚胺。在一些情况下，所述连接体是自稳定的马来酰亚胺。
在一些实施方案中，所述连接体包含肽部分。在一些情况下，该肽部分包含至少2、3、4、5、6、7、8个或更多个氨基酸残基。在一些情况下，该肽部分是可切割的肽部分(例如，酶促或化学地)。在一些情况下，该肽部分是不可切割的肽部分。在一些情况下，该肽部分包含Val-Cit(缬氨酸-瓜氨酸)、Gly-Gly-Phe-Gly(SEQ ID NO:973)、Phe-Lys、 Val-Lys、Gly-Phe-Lys、Phe-Phe-Lys、Ala-Lys、Val-Arg、Phe-Cit、Phe-Arg、 Leu-Cit、Ile-Cit、Trp-Cit、Phe-Ala、Ala-Leu-Ala-Leu(SEQ ID NO:974) 或Gly-Phe-Leu-Gly(SEQ ID NO:975)。在一些情况下，所述连接体包含肽部分，诸如：Val-Cit(缬氨酸-瓜氨酸)、Gly-Gly-Phe-Gly(SEQID NO:973)、Phe-Lys、Val-Lys、Gly-Phe-Lys、Phe-Phe-Lys、Ala-Lys、 Val-Arg、Phe-Cit、Phe-Arg、Leu-Cit、Ile-Cit、Trp-Cit、Phe-Ala、 Ala-Leu-Ala-Leu(SEQ ID NO:974)或Gly-Phe-Leu-Gly(SEQ ID NO: 975)。在一些情况下，所述连接体包含Val-Cit。在一些情况下，所述连接体是Val-Cit。
在一些实施方案中，所述连接体包含苯甲酸基团或其衍生物。在一些情况下，该苯甲酸基团或其衍生物包含对氨基苯甲酸(PABA)。在一些情况下，该苯甲酸基团或其衍生物包含γ-氨基丁酸(GABA)。
在一些实施方案中，所述连接体包含任意组合的马来酰亚胺基团、肽部分和/或苯甲酸基团中的一种或多种。在一些实施方案中，所述连接体包含马来酰亚胺基团、肽部分和/或苯甲酸基团的组合。在一些情况下，该马来酰亚胺基团是马来酰亚胺己酰基(mc)。在一些情况下，该肽基团是val-cit。在一些情况下，该苯甲酸基团是PABA。在一些情况下，所述连接体包含mc-val-cit基团。在一些情况下，所述连接体包含 val-cit-PABA基团。在另外的情况下，所述连接体包含mc-val-cit-PABA 基团。
在一些实施方案中，所述连接体是自牺牲连接体或自消除连接体。在一些情况下，所述连接体是自牺牲连接体。在其它情况下，所述连接体是自消除连接体(例如，环化自消除连接体)。在一些情况下，所述连接体包括美国专利9,089,614或PCT公开WO2015038426中描述的连接体。
在一些实施方案中，所述连接体是树枝型连接体。在一些情况下，树枝型连接体包含支化的多官能连接体部分。在一些情况下，树枝型连接体用来增加多核苷酸B与结合部分A的摩尔比。在一些情况下，树枝型连接体包含PAMAM树枝状高分子。
在一些实施方案中，所述连接体是无痕连接体或者在切割后不会给结合部分A、多核苷酸B、聚合物C或内体溶解部分D留下连接体部分(例如，原子或连接体基团)的连接体。示例性的无痕连接体包括但不限于锗连接体、硅连接体、硫连接体、硒连接体、氮连接体、磷连接体、硼连接体、铬连接体或苯肼连接体。在一些情况下，所述连接体是如Hejesen等人,“A traceless aryl-triazene linker for DNA-directed chemistry,”Org Biomol Chem11(15):2493-2497(2013)描述的无痕芳基- 三氮烯连接体。在一些情况下，所述连接体是Blaney等人,“Traceless solid-phase organic synthesis,”Chem.Rev.102:2607-2024(2002)描述的无痕连接体。在一些情况下，连接体是美国专利6,821,783中描述的无痕连接体。
在一些情况下，所述连接体是以下文献中描述的连接体：美国专利6,884,869；7,498,298；8,288,352；8,609,105；或8,697,688；美国专利公开2014/0127239；2013/028919；2014/286970；2013/0309256； 2015/037360；或2014/0294851；或者PCT公开WO2015057699；WO2014080251；WO2014197854；WO2014145090；或WO2014177042。
在一些实施方案中，X、Y和L独立地为键或连接体。在一些情况下，X、Y和L独立地为键。在一些情况下，X、Y和L独立地为连接体。
在一些情况下，X为键或连接体，例如非聚合连接体。在一些情况下，X为键。在一些情况下，X为非聚合连接体。在一些情况下，该非聚合连接体为C1-C6烷基。在一些情况下，X为C1-C6烷基，例如， C5、C4、C3、C2或C1烷基。在一些情况下，该C1-C6烷基是未取代的 C1-C6烷基。如在非聚合连接体的语境中，特别是在X的语境中所使用的，烷基意指含有最多六个碳原子的饱和直链或支链烃基团。在一些情况下，X包括以上所述的同双官能连接体或异双官能连接体。在一些情况下，X包括异双官能连接体。在一些情况下，X包括sMCC。在其它情况下，X包括任选地缀合至C1-C6烷基的异双官能连接体。在其它情况下，X包括任选地缀合至C1-C6烷基的sMCC。在另外的情况下，X 不包含由聚合物部分C所包含的聚合物，例如X不包含聚环氧烷(例如， PEG分子)。
在一些情况下，Y为键或连接体，例如非聚合连接体。在一些情况下，Y为键。在其它情况下，Y为非聚合连接体。在一些实施方案中， Y为C1-C6烷基。在一些情况下，Y为以上所述的同双官能连接体或异双官能连接体。在一些情况下，Y为以上所述的同双官能连接体。在一些情况下，Y为以上所述的异双官能连接体。在一些情况下，Y包含马来酰亚胺基团，诸如上述马来酰亚胺己酰基(mc)或自稳定的马来酰亚胺基团。在一些情况下，Y包含肽部分，如Val-Cit。在一些情况下，Y 包含苯甲酸基团，如PABA。在另外的情况下，Y包含马来酰亚胺基团、肽部分和/或苯甲酸基团的组合。在另外的情况下，Y包含mc基团。在另外的情况下，Y包含mc-val-cit基团。在另外的情况下，Y包含 val-cit-PABA基团。在另外的情况下，Y包含mc-val-cit-PABA基团。在一些情况下，Y不包含由聚合物部分C所包含的聚合物，例如Y不包含聚环氧烷(例如，PEG分子)。
在一些情况下，L为键或连接体，任选地为非聚合连接体。在一些情况下，L为键。在其它情况下，L为连接体，任选地为非聚合连接体。在一些实施方案中，L为C1-C6烷基。在一些情况下，L为以上所述的同双官能连接体或异双官能连接体。在一些情况下，L为以上所述的同双官能连接体。在一些情况下，L为以上所述的异双官能连接体。在一些情况下，L包含马来酰亚胺基团，诸如上述马来酰亚胺己酰基(mc) 或自稳定的马来酰亚胺基团。在一些情况下，L包含肽部分，如Val-Cit。在一些情况下，L包含苯甲酸基团，如PABA。在另外的情况下，L包含马来酰亚胺基团、肽部分和/或苯甲酸基团的组合。在另外的情况下， L包含mc基团。在另外的情况下，L包含mc-val-cit基团。在另外的情况下，L包含val-cit-PABA基团。在另外的情况下，L包含 mc-val-cit-PABA基团。在一些情况下，当L任选地作为非聚合连接体时，其不包含由聚合物部分C所包含的聚合物，例如L不包含聚环氧烷(例如，PEG分子)。
药物制剂
在一些实施方案中，本文所述的药物制剂通过多种给药途径施用于受试者，该给药途径包括但不限于肠胃外(例如，静脉内、皮下、肌肉内)、口服、鼻内、颊部、直肠或透皮给药途径。在一些情况下，本文所述的药物组合物被配制用于肠胃外(例如，静脉内、皮下、肌肉内、动脉内、腹膜内、鞘内、大脑内、脑室内或颅内)给药。在其它情况下，本文所述的药物组合物被配制用于口服给药。在其它情况下，本文所述的药物组合物被配制用于鼻内给药。
在一些实施方案中，所述药物制剂包括但不限于水性液体分散体、自乳化分散体、固溶体、脂质体分散体、气雾剂、固体剂型、粉末、立即释放制剂、控制释放制剂、快速熔化制剂、片剂、胶囊、丸剂、延迟释放制剂、延长释放制剂、脉冲释放制剂、多颗粒制剂(例如，纳米颗粒制剂)以及立即和控制释放混合型制剂。
在一些情况下，所述药物制剂包括多颗粒制剂。在一些情况下，所述药物制剂包括纳米颗粒制剂。在一些情况下，纳米颗粒包含cMAP、环糊精或脂质。在一些情况下，纳米颗粒包括固体脂质纳米颗粒、聚合物纳米颗粒、自乳化纳米颗粒、脂质体、微乳液或胶束溶液。另外的示例性纳米颗粒包括但不限于顺磁性纳米颗粒、超顺磁性纳米颗粒、金属纳米颗粒、富勒烯样材料、无机纳米管、树枝状高分子(诸如具有共价连接的金属螯合物)、纳米纤维、纳米角、纳米洋葱、纳米棒、纳米绳和量子点。在一些情况下、纳米颗粒是金属纳米颗粒，例如钪、钛、钒、铬、锰、铁、钴、镍、铜、锌、钇、锆、铌、钼、钌、铑、钯、银、镉、铪、钽、钨、铼、锇、铱、铂、金、钆、铝、镓、铟、锡、铊、铅、铋、镁、钙、锶、钡、锂、钠、钾、硼、硅、磷、锗、砷、锑及其组合、合金或氧化物的纳米颗粒。
在一些情况下，纳米颗粒包含核或者核和壳，如在核-壳纳米颗粒中。
在一些情况下，纳米颗粒进一步涂覆有用于附接功能元件的分子 (例如，与本文所述的多核酸分子或结合部分中的一种或多种)。在一些情况下，涂层包含硫酸软骨素、硫酸葡聚糖、羧甲基葡聚糖、藻酸、果胶、角叉菜聚糖、岩藻多糖、琼脂胶、紫菜聚糖、刺梧桐胶、结冷胶、黄原胶、透明质酸、葡糖胺、半乳糖胺、壳多糖(或壳聚糖)、聚谷氨酸、聚天冬氨酸、溶菌酶、细胞色素C、核糖核酸酶、胰蛋白酶原、胰凝乳蛋白酶原、α-胰凝乳蛋白酶、聚赖氨酸、聚精氨酸、组蛋白、鱼精蛋白、卵清蛋白、糊精或环糊精。在一些情况下，纳米颗粒包括石墨烯涂覆的纳米颗粒。
在一些情况下，纳米颗粒具有小于约500nm、400nm、300nm、 200nm或100nm的至少一个维度。
在一些情况下，纳米颗粒制剂包含顺磁性纳米颗粒、超顺磁性纳米颗粒、金属纳米颗粒、富勒烯样材料、无机纳米管、树枝状高分子(诸如具有共价连接的金属螯合物)、纳米纤维、纳米角、纳米洋葱、纳米棒、纳米绳或量子点。在一些情况下，本文所述的多核酸分子或结合部分直接或间接地缀合至纳米颗粒。在一些情况下，至少1、5、10、15、 20、30、40、50、60、70、80、90、100个或更多个本文所述的多核酸分子或结合部分直接或间接地缀合至纳米颗粒。
在一些实施方案中，所述药物制剂包含递送载体，例如重组载体，将多核酸分子递送到细胞中。在一些情况下，该重组载体是DNA质粒。在其它情况下，该重组载体是病毒载体。示例性的病毒载体包括衍生自腺相关病毒、逆转录病毒、腺病毒或甲病毒的载体。在一些情况下，能够表达多核酸分子的重组载体在靶细胞中提供稳定的表达。在另外的情况下，使用提供多核酸分子的瞬时表达的病毒载体。
在一些实施方案中，所述药物制剂包含基于与本文公开的组合物的相容性以及所需剂型的释放谱性质而选择的载体或载体材料。示例性的载体材料包括，例如，粘合剂、悬浮剂、崩解剂、填充剂、表面活性剂、增溶剂、稳定剂、润滑剂、润湿剂、稀释剂等。药学上相容的载体材料包括但不限于阿拉伯胶、明胶、胶体二氧化硅、甘油磷酸钙、乳酸钙、麦芽糖糊精、甘油、硅酸镁、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、胆固醇、胆固醇酯、酪蛋白酸钠、大豆卵磷脂、牛磺胆酸、磷脂酰胆碱、氯化钠、磷酸三钙、磷酸氢二钾、纤维素和纤维素缀合物、糖硬脂酰乳酸钠、角叉菜胶、甘油单酯、甘油二酯、预胶化淀粉等。参见，例如，Remington: The Scienceand Practice of Pharmacy,第十九版(Easton,Pa.:Mack Publishing Company,1995)；Hoover,John E.,Remington’s Pharmaceutical Sciences,Mack Publishing Co.,Easton,Pennsylvania 1975；Liberman,H.A. 和Lachman,L.编著,Pharmaceutical DosageForms,Marcel Decker,New York,N.Y.,1980；以及Pharmaceutical Dosage Forms andDrug Delivery Systems,第七版(Lippincott Williams&Wilkins1999)。
在一些情况下，所述药物制剂进一步包含pH调节剂或缓冲剂，其包括酸，如乙酸、硼酸、柠檬酸、乳酸、磷酸和盐酸；碱，如氢氧化钠、磷酸钠、硼酸钠、柠檬酸钠、乙酸钠、乳酸钠和三羟甲基氨基甲烷；和缓冲液，如柠檬酸盐/右旋糖、碳酸氢钠和氯化铵。这样的酸、碱和缓冲液以将组合物的pH维持在可接受范围内所需的量包含在内。
在一些情况下，所述药物制剂包含使组合物的重量摩尔渗透压浓度处于可接受范围内所需的量的一种或多种盐。这样的盐包括具有钠、钾或铵阳离子以及氯离子、柠檬酸根、抗坏血酸根、硼酸根、磷酸根、碳酸氢根、硫酸根、硫代硫酸根或亚硫酸氢根阴离子的那些盐；合适的盐包括氯化钠、氯化钾、硫代硫酸钠、亚硫酸氢钠和硫酸铵。
在一些情况下，所述药物制剂进一步包含用来稳定化合物的稀释剂，因为它们提供更稳定的环境。本领域中利用溶解在缓冲溶液(其也提供pH控制或维持)中的盐作为稀释剂，包括但不限于磷酸盐缓冲盐水溶液。在某些情况下，稀释剂增加组合物的体积，以便于压缩或者产生用于均匀掺合以供胶囊填充的足够体积。这类化合物包括例如乳糖、淀粉、甘露醇、山梨醇、右旋糖、微晶纤维素如磷酸氢钙、磷酸二钙二水合物；磷酸三钙、磷酸钙；无水乳糖、喷雾干燥的乳糖；预胶化淀粉、可压缩糖，如(Amstar)；甘露醇、羟丙基甲基纤维素、乙酸硬脂酸羟丙基甲基纤维素、基于蔗糖的稀释剂、糖果糖；一碱式硫酸钙一水合物、硫酸钙二水合物；乳酸钙三水合物、葡萄糖结合剂 (dextrate)；水解谷物固体、直链淀粉；粉状纤维素、碳酸钙；甘氨酸、高岭土；甘露醇、氯化钠；肌醇、膨润土等。
在一些情况下，所述药物制剂包含崩解剂以便于物质的分解或崩解。术语“崩解”包括当与胃肠液接触时剂型的溶解和分散。崩解剂的实例包括淀粉，例如天然淀粉如玉米淀粉或马铃薯淀粉，预胶化淀粉如 National 1551或或羟基乙酸淀粉钠如或纤维素如木制品，甲基结晶纤维素，例如PH101、 PH102、 PH105、 P100、Ming 和甲基纤维素，交联羧甲纤维素，或交联纤维素如交联羧甲基纤维素钠交联羧甲基纤维素或交联的交联羧甲纤维素，交联淀粉如羟基乙酸淀粉钠，交联聚合物如聚维酮、交联聚乙烯吡咯烷酮，藻酸盐如藻酸或藻酸的盐如藻酸钠，粘土如 HV(硅酸镁铝)，树胶如琼脂、瓜尔胶、刺槐豆胶、刺梧桐胶、果胶或黄蓍胶，羟基乙酸淀粉钠，膨润土，天然海绵，表面活性剂，树脂如阳离子交换树脂，柑橘浆，十二烷基硫酸钠，十二烷基硫酸钠与淀粉的组合，等等。
在一些情况下，所述药物制剂包含填充剂，如乳糖、碳酸钙、磷酸钙、磷酸氢钙、硫酸钙、微晶纤维素、纤维素粉末、右旋糖、葡萄糖结合剂、葡聚糖、淀粉、预胶化淀粉、蔗糖、木糖醇、乳糖醇、甘露醇、山梨醇、氯化钠、聚乙二醇等。
润滑剂和助流剂也任选地包含在本文所述的药物制剂中，用于预防、减少或抑制材料的粘附或摩擦。示例性的润滑剂包括例如硬脂酸，氢氧化钙，滑石，硬脂酰富马酸钠，烃如矿物油，或氢化植物油如氢化大豆油高级脂肪酸及其碱金属和碱土金属盐，如铝、钙、镁、锌盐，硬脂酸，硬脂酸钠，甘油，滑石，蜡，硼酸，苯甲酸钠，乙酸钠，氯化钠，亮氨酸，聚乙二醇(例如，PEG-4000)或甲氧基聚乙二醇如CarbowaxTM，油酸钠，苯甲酸钠，山萮酸甘油酯，聚乙二醇，十二烷基硫酸镁或十二烷基硫酸钠，胶体二氧化硅如SyloidTM，淀粉如玉米淀粉，硅油，表面活性剂，等等。
增塑剂包括用来软化微胶囊化材料或膜涂层以使其更不易碎的化合物。合适的增塑剂包括例如聚乙二醇如PEG 300、PEG 400、PEG 600、 PEG 1450、PEG 3350和PEG 800、硬脂酸、丙二醇、油酸、三乙基纤维素和三醋精。增塑剂也用作分散剂或润湿剂。
增溶剂包括诸如三醋精、柠檬酸三乙酯、油酸乙酯、辛酸乙酯、十二烷基硫酸钠、多库酯钠、维生素E TPGS、二甲基乙酰胺、N-甲基吡咯烷酮、N-羟乙基吡咯烷酮、聚乙烯吡咯烷酮、羟丙基甲基纤维素、羟丙基环糊精、乙醇、正丁醇、异丙醇、胆固醇、胆汁盐、聚乙二醇200-600、四氢呋喃聚乙二醇醚(glycofurol)、二乙二醇单乙基醚(transcutol)、丙二醇、二甲基异山梨醇等化合物。
稳定剂包括诸如任何抗氧化剂、缓冲液、酸、防腐剂等化合物。
悬浮剂包括诸如聚乙烯吡咯烷酮如聚乙烯吡咯烷酮K12、聚乙烯吡咯烷酮K17、聚乙烯吡咯烷酮K25或聚乙烯吡咯烷酮K30、乙烯基吡咯烷酮/乙酸乙烯酯共聚物(S630)、聚乙二醇(例如，聚乙二醇具有约 300至约6000，或约3350至约4000，或约7000至约5400的分子量)、羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、乙酸硬脂酸羟甲基纤维素、聚山梨醇酯-80、羟乙基纤维素、藻酸钠、树胶如黄蓍胶和阿拉伯胶、瓜尔胶、黄原胶(包括黄原树胶)、糖、纤维素如羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、羟丙基甲基纤维素、羟乙基纤维素、聚山梨醇酯-80、藻酸钠、聚乙氧基化失水山梨醇单月桂酸酯、聚乙氧基化失水山梨醇单月桂酸酯、聚维酮等化合物。
表面活性剂包括诸如十二烷基硫酸钠、多库酯钠、吐温60或80、三醋精、维生素ETPGS、失水山梨醇单油酸酯、聚氧乙烯失水山梨醇单油酸酯、聚山梨醇酯、泊洛沙姆(polaxomer)、胆汁盐、单硬脂酸甘油酯、环氧乙烷和环氧丙烷的共聚物如(BASF)等化合物。另外的表面活性剂包括聚氧乙烯脂肪酸甘油酯和植物油，例如聚氧乙烯(60)氢化蓖麻油；以及聚氧乙烯烷基醚和烷基苯基醚，例如辛苯昔醇 (octoxynol)10、辛苯昔醇40。有时，包含表面活性剂以增强物理稳定性或用于其它目的。
粘度增强剂包括例如甲基纤维素、黄原胶、羧甲基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、乙酸硬脂酸羟丙基甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯、卡波姆、聚乙烯醇、藻酸盐、阿拉伯胶、壳聚糖及其组合。
润湿剂包括诸如油酸、单硬脂酸甘油酯、失水山梨醇单油酸酯、失水山梨醇单月桂酸酯、油酸三乙醇胺、聚氧乙烯失水山梨醇单油酸酯、聚氧乙烯失水山梨醇单月桂酸酯、多库酯钠、油酸钠、十二烷基硫酸钠、多库酯钠、三醋精、吐温80、维生素E TPGS、铵盐等化合物。
治疗方案
在一些实施方案中，施用本文所述的药物组合物用于治疗应用。在一些实施方案中，该药物组合物每天一次、每天两次、每天三次或更多次施用。该药物组合物每日、每天一次、每隔一天、每周五天、每周一次、每隔一周、每月两周、每月三周、每月一次、每月两次、每月三次或更多次施用。该药物组合物施用至少1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、12 个月、18个月、2年、3年或更久。
在一些实施方案中，一种或多种药物组合物同时、依次或间隔一段时间施用。在一些实施方案中，一种或多种药物组合物同时施用。在一些情况下，一种或多种药物组合物依次施用。在另外的情况下，一种或多种药物组合物间隔一段时间施用(例如，第一药物组合物的第一次施用在第一天，然后在施用至少第二药物组合物之前间隔至少1、2、3、 4、5天或更多天)。
在一些实施方案中，两种或更多种不同的药物组合物共同施用。在一些情况下，两种或更多种不同的药物组合物同时共同施用。在一些情况下，两种或更多种不同的药物组合物依次共同施用，而在施用之间没有时间间隔。在其它情况下，两种或更多种不同的药物组合物依次共同施用，在施用之间间隔约0.5小时、1小时、2小时、3小时、12小时、 1天、2天或更久。
在患者的状况确实得到改善的情况下，根据医生的判断，继续给予组合物的施用；或者，将所施用的组合物的剂量暂时减少或暂时暂停某一时间长度(即“休药期”)。在一些情况下，休药期的长度在2天与 1年之间不等，仅举例而言，包括2天、3天、4天、5天、6天、7天、 10天、12天、15天、20天、28天、35天、50天、70天、100天、120 天、150天、180天、200天、250天、280天、300天、320天、350天或365天。休药期期间的剂量减少为10％-100％，仅举例而言，包括10％、 15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％。
一旦患者的病况出现改善，如有必要，施用维持剂量。随后，根据症状的变化，可将给药剂量或频率或两者降低至该疾病、病症或病况的改善得以保持的水平。
在一些实施方案中，对应于这样的量的给定药剂的量根据诸如具体化合物、疾病严重程度、需要治疗的受试者或宿主的特征(例如，体重)等因素而变化，然而其仍然根据与该实例有关的具体情况以本领域已知的方式常规地确定，该具体情况包括例如所施用的具体药剂、给药途径以及所治疗的受试者或宿主。在一些情况下，所需的剂量方便地以单剂量或以分剂量呈现，该分剂量同时(或在短时间段内)施用或以适当的间隔施用，例如每天2、3、4个或更多个亚剂量。
前述范围仅为提示性的，因为关于个体治疗方案的变量的数量巨大，并且相距这些推荐值的相当大的偏差并不罕见。这样的剂量根据多个变量而改变，这些变量不限于所用化合物的活性、待治疗的疾病或病况、给药方式、受试个体的需求、所治疗的疾病或病况的严重程度以及执业医师的判断。
在一些实施方案中，此类治疗方案的毒性和治疗功效通过在细胞培养物或实验动物中的标准药学程序来确定，包括但不限于LD50(对群体的50％致死的剂量)和ED50(对群体的50％在治疗上有效的剂量) 的确定。毒性效果与治疗效果之间的剂量比是治疗指数，并且表示为 LD50与ED50之比。优选表现出高治疗指数的化合物。使用从细胞培养试验和动物研究获得的数据来制定用于人类的剂量范围。此类化合物的剂量优选处于包含ED50且具有最小毒性的循环浓度范围内。根据所用的剂型和所用的给药途径，剂量在该范围内变化。
药盒/制品
在某些实施方案中，本文公开了与本文所述的一种或多种组合物和方法一起使用的药盒和制品。这样的药盒包括载具、包装或被区室化为接纳一个或多个容器如小瓶、管等的容器，每个容器包含将在本文所述的方法中使用的一个单独要素。合适的容器包括，例如，瓶、小瓶、注射器和试管。在一个实施方案中，容器由诸如玻璃或塑料等各种材料形成。
本文提供的制品含有包装材料。药物包装材料的实例包括但不限于泡罩包装、瓶、管、袋、容器、瓶以及适于所选制剂及预期的给药和治疗方式的任何包装材料。
例如，容器包含本文所述的靶核酸分子。这样的药盒任选地包含关于其在本文所述方法中的使用的标识性描述或标签或说明。
药盒通常包括列出内容物的标签和/或使用说明书，以及具有使用说明的包装插页。通常也将会包括一套说明书。
在一个实施方案中，标签处于容器上或与容器相关联。在一个实施方案中，当构成标签的字母、数字或其它字符附着、模制或蚀刻在容器本身上时，标签处于容器上；当标签存在于也容纳容器的接纳器或载具内(例如作为包装插页)时，标签与容器相关联。在一个实施方案中，标签用来指示内容物将用于具体治疗应用。标签也指示关于内容物诸如在本文所述方法中的使用的指导。
在某些实施方案中，药物组合物在含有一个或多个单位剂型的包装或分配器装置中提供，该单位剂型含有本文提供的化合物。例如，该包装包含金属或塑料箔，如泡罩包装。在一个实施方案中，该包装或分配器装置伴随有给药说明书。在一个实施方案中，该包装或分配器还伴随有由监管药物制造、使用或销售的政府机构所规定形式的、与容器相关联的公告，该公告反映出该机构已批准该药物形式用于人类或兽医给药。这样的公告例如是由美国食品和药品管理局批准用于处方药的标记或已批准的产品插页。在一个实施方案中，还制备含有在相容性药物载体中配制的本文提供的化合物的组合物，将该组合物置于适当的容器中，并标出用于治疗所指示的病况。
某些术语
除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与所请求保护的主题所属领域的技术人员所一般理解的含义相同的含义。应当理解，前面的一般描述和以下详细描述均仅为示例性和说明性的，并非限制任何所请求保护的主题。在本申请中，除非另有具体说明，否则单数的使用包括复数。必须指出，如在本说明书和所附权利要求书中使用的，除非上下文另有明确说明，否则单数形式“一个”、“一种”和“该”包括复数指代物。在本申请中，除非另有说明，否则“或”的使用意指“和/ 或”。此外，术语“包括”以及其它形式如“包含”、“含有”和“具有”的使用是非限制性的。
如本文所用的，范围和量可表示为“约”特定值或范围。“约”还包括准确量。因此，“约5μL”意指“约5μL”，并且还指“5μL”。通常，术语“约”包括预期在实验误差内的量。
本文使用的章节标题仅用于组织结构的目的，而不应理解为限制所描述的主题。
如本文所用的，术语“个体”、“受试者”和“患者”意指任何哺乳动物。在一些实施方案中，该哺乳动物为人。在一些实施方案中，该哺乳动物为非人类。这些术语均不要求或不限于以医疗保健工作者(例如，医生、注册护士、执业护士、医师助理、护理员或临终关怀工作者)的监督(例如，持续或间歇性)为特征的情况。
如本文所用的，术语“DMD”、“DMD基因”及其等同物是指编码肌养蛋白的DMD基因。另外，术语“DMD”和“DMD基因”可互换使用，并且这两个术语均指肌养蛋白基因。
实施例
提供这些实施例仅仅是为了说明目的，并非限制本文提供的权利要求的范围。
实施例1.反义寡核苷酸序列和合成
合成了二氨基磷酸酯吗啉代寡聚物(PMO)、硫代磷酸酯反义寡核苷酸(PS ASO)和反义寡核苷酸(ASO)。
PMO序列是5’GGCCAAACCTCGGCTTACCTGAAAT3’伯胺( SEQ ID NO:28)并且可见于图1，其末端核苷酸扩展。PMO在分子的 3’端含有C3-NH2缀合柄以供缀合。使用标准固相合成方案将PMO完全装配在固相上，并通过HPLC纯化。
PS ASO序列是胺-C6-GGCCAAACCUCGGCUUACCU(SEQ ID NO:29)并且可见于图2A-2B，其末端核苷酸扩展。PS ASO的结构包含磷酸骨架，该磷酸骨架为100％硫代磷酸酯连接，并且所有核糖均含有2’2’OMe修饰。PS ASO还在分子的5’端含有C6-NH2缀合柄以供缀合。使用标准固相亚磷酰胺化学法将PS ASO完全装配在固相上，并通过HPLC纯化。
使用标准固相亚磷酰胺化学法将ASO完全装配在固相上，并通过 HPLC纯化。ASO在分子的5’端含有C6-NH2缀合柄以供缀合。
实施例2.DMD外显子跳读的检测
确定分化的C1C12细胞中DMD外显子23跳读的方法
将小鼠成肌细胞C2C12细胞以50,000-100,000/孔接种在24孔板中的0.5mL 10％FBS RPMI 1640培养基中，并在37℃和5％CO2下孵育过夜。在第二天，将细胞转换到分化培养基(2％马血清RPMI 1640 和1μM胰岛素)并孵育3-5天。孵育后，加入样品并孵育24小时。样品处理后，每天更换1mL新鲜培养基(不含化合物)再持续2天。在处理开始后72小时，收获细胞。使用InviTrap RNA Cell HTS 96试剂盒 (B-Bridge International#7061300400)分离RNA，并使用High Capacity cDNA Reverse transcription试剂盒(ThermoFisher#4368813)进行逆转录。使用DreamTaqTM PCR Mastermix(ThermoFisher#K1072)进行PCR 反应。初级PCR采用表2中的方案，使用外显子20引物(Ex20F 5’-CAGAATTCTGCCAATTGCTGAG)(SEQ ID NO:30)和外显子26 引物(Ex26R 5’-TTCTTCAGCTTGTGTCATCC)(SEQ ID NO:31)来扩增跳读的和未跳读的分子。
表2.PCR方案
热启动 95℃持续2分钟
变性 95℃持续0.5分钟
引物的退火 50℃持续0.5分钟
引物延伸 72℃持续1分钟
最终延伸 72℃持续5分钟
循环数 10
对于巢式PCR，将初级PCR反应用水稀释100倍，并用5μl进行巢式PCR反应(50μl总反应体积)。巢式PCR采用表3中的方案，使用外显子20引物(Ex20F2：5’-ACCCAGTCTACCACCCTATC)(SEQ ID NO:32)和外显子25引物(Ex25R：5’-CTCTTTATCTTCTGCCCACCTT)(SEQ ID NO:33)来扩增跳读的和未跳读的分子。
表3.巢式PCR方案
热启动 95℃持续2分钟
变性 95℃持续0.5分钟
引物的退火 50℃持续0.5分钟
引物延伸 72℃持续1分钟
最终延伸 72℃持续5分钟
循环数 35
使用4％TAE琼脂糖凝胶分析PCR反应。野生型(WT)DMD 产物具有788个碱基对的预期大小和575个碱基对的跳读DMDΔ23。
动物
所有动物研究均按照机构动物管理和使用委员会(IACUC)的方案在ExploraBioLabs进行，遵守USDA动物福利法案中概述的规定以及“实验动物管理和使用指南(Guidefor the Care and Use of Laboratory Animals)”(国家研究委员会(National ResearchCouncil)出版物，第8 版，2011年修订)。所有小鼠均获自Charles River Laboratories或Harlan Laboratories。
体内小鼠模型
通过静脉内(iv)注射向WT CD-1小鼠(4-6周龄)给予指定的反义缀合物(ASC)和剂量。“裸”PMO或ASO通过肌肉内注射以指定的剂量给药。在4天、7天或14天后，收获心脏和腓肠肌组织，并在液氮中骤冻。用Trizol和RNeasy Plus 96试剂盒(Qiagen，#74192)分离RNA，并使用High Capacity cDNA Reverse transcription试剂盒 (ThermoFisher#4368813)进行逆转录。如所述进行巢式PCR反应。在 4％(或1％)TAE琼脂糖凝胶中分析PCR反应，其通过光密度测定法进行定量。
为了证实在处理的小鼠中的外显子23跳读，从4％琼脂糖凝胶中分离DNA片段并测序。
为了定量地确定跳读的DMD mRNA拷贝数，设计qPCR引物/探针组，以对跳读的和WTDMD mRNA进行定量(图3)。设计qPCR定量标准，并使用如表4所见的设计的PCR引物通过PCR产生。对于WT 和DMD的qPCR标准，在PCR后，从琼脂糖凝胶中分离出733个碱基对的片段。对于跳读DMA的qPCR标准，使用巢式引物。
qPCR引物/探针的扩增效率经确定在预期效率的10％以内。按照制造商的说明书，在QuantStudio 7和TaqmanTM PCR Universal Mastermix II(ThermoFisher#4440041)中进行qPCR反应。
表4.
实施例3：缀合物合成
分析和纯化方法
分析和纯化方法按照表5-11进行。
表5.大小排阻色谱(SEC)方法
表6.疏水相互作用色谱(HIC)方法1
表7.疏水相互作用色谱(HIC)方法2
表8.疏水相互作用色谱(HIC)方法3
表9.疏水相互作用色谱(HIC)方法4
表10.强阴离子交换色谱(SAX)方法1
表11.强阴离子交换色谱(SAX)方法2
抗转铁蛋白受体抗体
使用的抗小鼠转铁蛋白受体抗体或抗CD71 mAb是结合小鼠 CD71或小鼠转铁蛋白受体1(mTfR1)的大鼠IgG2a亚类单克隆抗体。该抗体由BioXcell生产，并且可商购获得(目录号BE0175)。
抗CD71抗体吗啉代反义寡核苷酸缀合物(抗CD71 mAb-PMO)
抗CD71 mAb-PMO缀合
通过加入4当量的三(2-羧乙基)膦(TCEP)水溶液并在37℃下孵育4小时，对硼酸盐缓冲液(25mM四硼酸钠，25mM NaCl，1mM 二亚乙基三胺五乙酸，pH 8.0)中的抗CD71抗体(10mg/mL)进行还原。通过将DMSO中的PMO(50mg/mL)与DMSO中的10当量SMCC (10mg/mL)一起孵育一小时，将4(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷羧酸 N-羟基琥珀酰亚胺酯(SMCC)与二氨基磷酸酯吗啉代寡聚物(PMO) 3’端上的伯胺偶联。使用MWCO为3kDa的Amicon Ultra-15离心过滤器单元，通过超滤除去未缀合的SMCC。用乙酸盐缓冲液(10mM乙酸钠，pH 6.0)洗涤PMO-SMCC三次并立即使用。将还原的抗体与2.25 当量的PMO-SMCC混合，并在4℃孵育过夜。然后将反应混合物的pH 降至7.5，并在室温下向混合物中加入8当量的N-乙基马来酰亚胺保持 30分钟以猝灭未反应的半胱氨酸。通过疏水相互作用色谱(HIC)方法 2分析反应混合物显示了抗体-PMO缀合物以及未反应的抗体和PMO (图4)。图4显示了用HIC方法2产生的抗CD71 mAb-PMO反应混合物的色谱图，其中显示游离抗体峰(1)、游离PMO(2)、DAR 1 (3)、DAR2(4)、DAR 3(5)、DAR>3(6)。“DAR”是指药物与抗体之比。括号中的数字是指色谱图中的峰。
纯化
使用HIC方法1，用AKTA Explorer FPLC纯化反应混合物。将含有药物与抗体之比为1(DAR 1)和2(DAR 2)的缀合物的级分合并，并用MWCO为50kDa的Amicon Ultra-15离心过滤器单元与DAR大于 2的缀合物分开浓缩。在分析之前，使用Amicon Ultra-15离心过滤器单元对浓缩的缀合物进行PBS(pH 7.4)缓冲液交换。
纯化的缀合物的分析
通过大小排阻色谱法(SEC)和HIC来表征分离的缀合物。SEC 方法1用来证实不存在高分子量聚集体和未缀合的PMO(图5A-5C)。图5A显示了使用SEC方法1产生的抗CD71 mAb的色谱图。图5B显示了使用SEC方法1产生的抗CD71 mAb-PMO DAR 1,2的色谱图。图 5C显示了使用SEC方法1产生的DAR大于2的抗CD71 mAb-PMO的色谱图。“DAR”是指药物与抗体之比。
使用HIC方法2，通过分析型HPLC评估缀合物的纯度(图6A-6C)。图6A显示了使用HIC方法2产生的抗CD71 mAb的色谱图。图6B显示了使用HIC方法2产生的纯化的抗CD71mAb-PMO DAR 1,2缀合物的色谱图。图6C显示了使用HIC方法2产生的纯化的抗CD71 mAb-PMO DAR>2缀合物的色谱图。将每个样品的260/280nm UV吸光度比值与已知比例的PMO和抗体的标准曲线进行比较，以确认DAR。DAR 1,2样品的平均DAR约为1.6，而DAR大于2的样品的平均DAR约为3.7。“DAR”是指药物与抗体之比。
抗CD71 Fab吗啉代反义寡核苷酸缀合物(抗CD71 Fab-PMO)
用胃蛋白酶进行的抗体消化
将20mM乙酸盐缓冲液(pH4.0)中的抗CD71抗体(5mg/mL) 与固定化的胃蛋白酶在37℃下孵育3小时。除去树脂，使用MWCO为 30kDa的Amicon Ultra-15离心过滤器单元，用PBS(pH7.4)洗涤反应混合物。收集并使用大小排阻色谱(SEC)方法2纯化保留物以分离 F(ab’)2片段。
抗CD71(Fab)-PMO缀合
通过加入10当量的TCEP水溶液并在37℃下孵育2小时来还原硼酸盐缓冲液(pH8.0)中的F(ab')2片段(15mg/mL)。通过将DMSO 中的PMO(50mg/mL)与DMSO中的10当量SMCC(10mg/mL)孵育1小时，将SMCC添加至PMO 3’端的伯胺。使用MWCO为3kDa 的Amicon Ultra-15离心过滤器单元通过超滤除去未缀合的SMCC。用乙酸盐缓冲液(pH 6.0)洗涤PMO-SMCC三次并立即使用。使用MWCO 为10kDa的Amicon Ultra-15离心过滤器单元将还原的F(ab')片段(Fab) 缓冲液交换到硼酸盐缓冲液(pH 8.0)中，添加1.75当量的PMO-SMCC，并在4℃下孵育过夜。然后将反应混合物的pH降至7.5，并在室温下向混合物中加入6当量的N-乙基马来酰亚胺保持30分钟以猝灭未反应的半胱氨酸。通过疏水相互作用色谱(HIC)方法3分析反应混合物显示了抗CD71(Fab)-PMO缀合物以及未反应的Fab(图7A)。图7A显示了使用HIC方法3对抗CD71 Fab-PMO进行FPLC纯化的色谱图。
纯化
使用HIC方法3，用AKTA Explorer FPLC纯化反应混合物。将含有DAR为1、2和3的缀合物的级分合并并分别浓缩。在分析之前，使用MWCO为10kDa的Amicon Ultra-15离心过滤器单元，对浓缩的缀合物进行PBS(pH 7.4)缓冲液交换。
纯化的缀合物的分析
通过SEC和HIC表征分离的缀合物。SEC方法1用来证实不存在高分子量聚集体和未缀合的PMO。见图7B-7E。图7B显示了使用SEC 方法1产生的抗CD71 Fab的色谱图。图7C显示了使用SEC方法1产生的抗CD71 Fab-PMO DAR 1缀合物的色谱图。图7D显示了使用SEC 方法1产生的抗CD71 Fab-PMO DAR 2缀合物的色谱图。图7E显示了使用SEC方法1产生的抗CD71Fab-PMO DAR 3缀合物的色谱图。使用HIC方法4通过分析型HPLC评估缀合物的纯度。见图7F-7I。图7F 显示了使用HIC方法4产生的抗CD71 Fab的色谱图。图7G显示了使用HIC方法4产生的抗CD71 Fab-PMO DAR 1缀合物的色谱图。图7H 显示了使用HIC方法4产生的抗CD71Fab-PMO DAR 2缀合物的色谱图。图71显示了使用HIC方法4产生的抗CD71 Fab-PMO DAR 3缀合物的色谱图。“DAR”是指药物与抗体之比。将每个样品的260/280nm UV吸光度比值与已知比例的PMO和Fab的标准曲线进行比较以确认DAR。
抗CD71抗体硫代磷酸酯反义寡核苷酸缀合物(抗CD71 mAb-PS ASO)
抗CD71 mAb-PS ASO
通过加入4当量的TCEP水溶液并在37℃下孵育4小时来还原硼酸盐缓冲液(pH8.0)中的抗CD71抗体(10mg/mL)。通过将250mM PB(pH 7.5)与DMSO的1:1混合物中的PS ASO(50mg/mL)与DMSO 中的10当量SMCC(10mg/mL)一起孵育一小时，将4(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷羧酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(SMCC)添加至PS ASO的 5’端上的伯胺。使用MWCO为3kDa的Amicon Ultra-15离心过滤器单元，通过超滤除去未缀合的SMCC。用乙酸盐缓冲液(pH6.0)洗涤PS ASO-SMCC三次并立即使用。将还原的抗体与1.7当量的PS ASO-SMCC 混合，并在4℃下孵育过夜。然后将反应混合物的pH降至7.4，并在室温下向混合物中加入8当量的N-乙基马来酰亚胺保持30分钟以猝灭未反应的半胱氨酸。通过强阴离子交换色谱(SAX)方法2分析反应混合物显示了抗体-PS ASO缀合物以及未反应的抗体和ASO(图8A)。图 8A显示了用SAX方法2产生的抗CD71 mAb-PS ASO反应混合物的色谱图，其中显示游离抗体峰(1)、游离PS ASO(5)、DAR 1(2)、 DAR 2(3)、DAR>2(4)。“DAR”是指药物与抗体之比。括号中的数字是指峰。
纯化
使用SAX方法1，用AKTA Explorer FPLC纯化反应混合物。将含有药物与抗体之比(DAR)为1、2和3的缀合物的级分合并并分别浓缩，并在分析之前，使用MWCO为50kDa的Amicon Ultra-15离心过滤器单元用PBS(pH 7.4)进行缓冲液交换。
纯化的缀合物的分析
通过大小排阻色谱法(SEC)和SAX来表征分离的缀合物。大小排阻色谱法1用来证实不存在高分子量聚集体和未缀合的ASO。见图 8B-8E。图8B显示了使用SEC方法1产生的抗CD71 mAb的色谱图。图8C显示了使用SEC方法1产生的抗CD71 mAb-PS ASO DAR 1缀合物的色谱图。图8D显示了使用SEC方法1产生的抗CD71 mAb-PS ASO DAR 2缀合物的色谱图。图8E显示了使用SEC方法1产生的抗CD71 mAb-PS ASO DAR 3缀合物的色谱图。使用SAX方法2，通过分析型 HPLC评估缀合物的纯度。见图8F-8H。图8F显示了使用SAX方法2 产生的抗CD71mAb-PS ASO DAR 1缀合物的色谱图。图8G显示了使用SAX方法2产生的抗CD71 mAb-PS ASODAR 2缀合物的色谱图。图 8H显示了使用SAX方法2产生的抗CD71 mAb-PS ASO DAR 3缀合物的色谱图。将每个样品的260/280nm UV吸光度比值与已知比例的ASO 和抗体的标准曲线进行比较，以确认药物与抗体之比(DAR)。
实施例4：抗CD71 mAb-PMO缀合物的体外活性
如实施例3所述制备并表征抗CD71 mAb-PMO缀合物。使用与实施例2类似的方法，使用巢式PCR在分化的C2C12细胞中评估缀合物在体外介导外显子跳读的能力。简言之，将“裸”吗啉代ASO(“PMO”) 的效力与多种浓度的抗CD71 mAb-PMO缀合物及相关媒介物对照进行比较。对照包括媒介物(“Veh”)、50μM的杂乱(scramble)吗啉代(“Scr50”) 和无抗体(“Neg-Ab”)。所用PMO的浓度包括50μM、1μM和0.02μM。所用的抗CD71 mAb-PMO DAR 1,2的浓度包括200nM、20nM和2nM。“DAR”是指药物与抗体之比。
cDNA合成后，使用两轮PCR扩增(初级和巢式PCR)检测外显子跳读。在4％TAE琼脂糖凝胶中分析PCR反应(图9)。
参见图9，抗CD71 mAb-PMO缀合物在分化的C2C12细胞中产生了可测量的外显子23跳读，和低于“裸”PMO对照的浓度。野生型产物具有788个碱基对的预期大小和575个碱基对的跳读DMDΔ23。
第二个实验包括抗CD71 Fab-PMO缀合物和抗EGFR靶向的PMO (“Z-PMO”)作为阴性对照(图10)。所用PMO的浓度包括10μM和 2μM。所用的抗CD71 mAb-PMO的浓度包括0.2μM和0.04μM。抗CD71 mAb-PMO的DAR为2。Z-PMO的使用浓度为0.2μM，DAR为2。抗 CD71 Fab-PMO的浓度包括0.6μM和0.12μM。分析了0.6μM和0.12μM 的抗-CD71 mAb-PMO的DAR 1、2和3。
参见图10，采用转铁蛋白受体、抗CD71 mAb-PMO和抗CD71 Fab-PMO缀合物的受体介导的摄取在C2C12细胞中导致了可测量的外显子23跳读，和低于“裸”PMO对照的浓度。在测试的浓度下没有可测量的来自Z-PMO的外显子23跳读，这产生了来自抗CD71缀合物的跳读。
实施例5.抗CD71-ASO mAb PS缀合物的体外活性
如实施例3所述制备并表征抗CD71 mAb-PS ASO缀合物。使用与实施例2所述类似的方法，使用巢式PCR在分化的C2C12细胞中评估缀合物在体外介导外显子跳读的能力。简言之，将“裸”硫代磷酸酯ASO(“PS ASO”)的效力与多种浓度的抗CD71 mAb-PS ASO缀合物及相关媒介物对照进行比较。在cDNA合成后进行两轮PCR扩增(初级和巢式PCR)以检测外显子跳读。在4％TAE琼脂糖凝胶中分析PCR反应(图11)。图11显示了PMO、ASO、DAR1的缀合的抗CD71 mAb-ASO (“ASC-DAR1”)、DAR2的缀合的抗CD71 mAb-ASO(“ASC-DAR2”) 和DAR3的缀合的抗CD71 mAb-ASO(“ASC-DAR3”)的琼脂糖凝胶。“PMO”和“ASO”是指未与抗体缀合的游离PMO和ASO。“媒介物”是指仅有媒介物。测试的浓度包括0.2、1和5微摩尔(μM)。
参见图11，抗CD71 mAb-PS ASO缀合物在分化的C2C12细胞中产生可测量的外显子23跳读，和低于“裸”PS ASO对照的浓度。野生型产物具有788个碱基对的预期大小和575个碱基对的跳读DMDΔ23。
实施例6：抗CD71 mAb-PMO缀合物的体内活性
如实施例3所述制备并表征抗CD71 mAb-PMO缀合物。使用与实施例2所述类似的方法，在野生型CD-1小鼠中评估缀合物抗CD71 mAb-PMO DAR1,2抗CD71和mAb-PMO DAR>2在体内介导外显子跳读的能力。“DAR”是指药物与抗体之比。
通过静脉内(iv)注射以表12中提供的剂量向小鼠给予mAb、媒介物对照和反义缀合物(ASC)。“DAR”是指药物与抗体之比。通过肌肉内注射将“裸”PMO以表12中提供的剂量给予腓肠肌。在4天、7 天或14天后，收获心脏和腓肠肌组织并在液氮中骤冻。分离RNA，逆转录，并进行巢式PCR反应。在4％TAE琼脂糖凝胶中分析PCR反应，然后通过光密度测定法进行定量。
表12.体内研究设计
图12A显示了来自施用抗CD71 mAb-PMO DAR 1,2、抗CD71 mAb-PMO DAR>2、抗CD71mAb、PMO和媒介物4、7或14天的小鼠的腓肠肌样品的凝胶电泳。野生型产物具有788个碱基对的预期大小和 575个碱基对的跳读DMDΔ23。抗CD71 mAb-PMO DAR 1,2和抗CD71 mAb-PMO DAR>2在腓肠肌中产生可测量的外显子23跳读，和低于“裸” PMO对照的浓度。凝胶上的条带强度(图12A)通过光密度测定法进行定量，如图12B所示。图12C显示了使用TaqmanqPCR对野生型小鼠腓肠肌中的体内外显子跳读的定量。
图13A显示了来自施用抗CD71 mAb-PMO DAR 1,2、抗CD71 mAb-PMO DAR>2、抗CD71mAb、PMO和媒介物4、7或14天的小鼠的心脏样品的凝胶电泳。野生型产物具有788个碱基对的预期大小和 575个碱基对的跳读DMDΔ23。凝胶上的条带强度(图13A)通过光密度测定法进行定量，如图13B所示。获得与腓肠肌样品相似的结果。抗 CD71 mAb-PMO DAR 1,2和抗CD71 mAb-PMO DAR>2在腓肠肌中产生可测量的外显子23跳读和低于“裸”PMO对照的浓度。
然后从4％琼脂糖凝胶中分离DNA片段并测序。测序数据证实了跳读的和野生型产物中的正确序列，如图14所示。
实施例7.反义寡核苷酸序列和合成
针对不同基因中的不同外显子制备表13中的序列。
表13.序列
实施例8.CD71 mAb-PMO缀合物在多种组织中的体内活性
如实施例3所述制备并表征CD71 mAb-PMO缀合物。在野生型 CD-1小鼠中评估缀合物(DAR3+)在体内介导外显子跳读的能力，完整实验细节参见实施例2。简言之，通过静脉内(iv)注射以所示剂量向小鼠给予媒介物对照和所示ASC，参见图7A。在7、14或28天后，收获膈、心脏和腓肠肌组织并在液氮中骤冻。分离RNA，逆转录，使用适当的引物/探针组如实施例2所述进行实时qPCR和巢式PCR反应。在1％TAE琼脂糖凝胶中分析PCR反应。
表14中显示了用来评估CD71 mAb-PMO缀合物在野生型小鼠中介导外显子23跳读的能力的体内研究设计。
表14.体内研究设计
参见图15A、图15C和图15E，使用Taqman qPCR，在野生型小鼠的腓肠肌(图15A)、膈(图15C)和心肌(图15E)中测量体内外显子跳读。参见图15B、图15D和图15F，使用巢式PCR，CD71 mAb-PMO 缀合物在腓肠肌(图15B)、膈(图15D)和心肌(图15F)中产生可测量的外显子23跳读。野生型产物具有788bp的预期大小和大小为575 bp的跳读DMDΔ23。凝胶上的条带强度通过光密度测定法进行定量，并且数据呈现为跳读产物与野生型肌养蛋白相比的％。
实施例9.CD71 mAb-PMO缀合物针对小鼠MSTN的体内活性
如实施例3所述制备并表征靶向小鼠肌生成抑制蛋白外显子2的 CD71 mAb-PMO缀合物(5’AGCCCATCTTCTCCTGGTCCTGGGAAGG )(SEQ ID NO:46)。使用如实施例2所述的类似方法在野生型CD-1 小鼠中评估缀合物(DAR1/2和DAR3+)在体内介导外显子跳读的能力。简言之，通过静脉内(iv)注射以表15所示的剂量向小鼠给予mAb、媒介物对照和所示的ASC。
表15.体内研究设计
在7、14或28天后，收获膈、心脏和腓肠肌组织并在液氮中骤冻。分离RNA并逆转录。用正向引物(mMSTN-F1：5’ CCTGGAAACAGCTCCTAACATC)(SEQ ID NO:50)和反向引物(mMSTN-R1：5’CAGTCAAGCCCAAAGTCTCTC)(SEQ ID NO:51) 进行PCR反应(热启动：95℃ 2分钟，95℃变性45秒，56℃引物退火30秒，72℃引物延伸40秒，35个循环)。在1％TAE琼脂糖凝胶中分析PCR反应，如图16A-16C所示。CD71 mAb-PMO缀合物在小鼠膈(图16A)、心脏(图16B)和腓肠肌(图16C)肌肉组织中产生可测量的外显子2跳读。野生型产物具有622bp的预期大小和248bp的跳读MSTNΔ2。
实施例10.ASGPR mAb-PMO缀合物对PAH基因的体外活性
如实施例3所述制备并表征靶向小鼠PAH外显子11的ASGPR mAb-PMO(5’ATCCTCTTTGGTAACCTCACCTCAC)(SEQ ID NO:47 )缀合物。使用PCR(正向引物5’-CTAGTGCCCTTGTTTTCAGA-3’( SEQ ID NO:52)和反向引物5’-AGGATCTACCACTGATGGGT-3’(SEQ ID NO:53))在原代小鼠肝细胞中评估该缀合物在体外介导小鼠PAH 基因中的外显子11跳读的能力。简言之，将ASGPR mAb-PAH PMO缀合物的效力与多种浓度的ASGPR mAb-杂乱PMO以及相关媒介物对照进行比较。RNAiMAX也用来转染缀合物作为阳性对照。如图17所示，在1％TAE琼脂糖凝胶中分析PCR反应。如图17中的凝胶可见，ASGPR mAb-PMO缀合物产生可测量的外显子11跳读，与RNAiMAX转染的对照相当。野生型产物具有703bp的预期大小和569bp的跳读PAHΔ11。
实施例11.ASGPR mAb-PMO缀合物的体内活性
如实施例3所述制备并表征靶向小鼠PAH外显子11的ASGPR mAb-PMO(5’ATCCTCTTTGGTAACCTCACCTCAC)(SEQ ID NO:47 )缀合物。使用实施例2所述的方法在野生型CD-1小鼠中评估缀合物 (DAR1/2和DAR3+)在体内介导外显子跳读的能力。简言之，通过静脉内(iv)注射以表16所示的剂量向小鼠给予mAb、媒介物对照和所示的ASC。
表16.体内研究设计
从收获的肝组织中分离RNA并进行逆转录。使用正向引物 5’-CTAGTGCCCTTGTTTTCAGA-3’(SEQ ID NO:52)和反向引物5’-AGGATCTACCACTGATGGGT-3’(SEQID NO:53)的PCR反应在 1％TAE琼脂糖凝胶中进行分析，如图18所示。如图18中的凝胶可见， ASGPR mAb-PMO缀合物在小鼠肝脏中产生可测量的外显子11跳读可达两周。野生型产物具有703bp的预期大小和569bp的跳读PAHΔ11。
实施例12.序列
表17示出了使用如本文所述的组合物和方法在DMD基因中诱导插入、缺失、复制或改变的示例性靶序列。表18示出了使用如本文所述的组合物和方法在DMD基因中诱导插入、缺失、复制或改变的示例性核苷酸序列。表19和表20示出了用于在基因中诱导插入、缺失、复制或改变的几种基因中的示例性靶序列。表21示出了用于使用本文所述的组合物和方法在基因中诱导插入、缺失、复制或改变的示例性序列，包括DMD基因中的序列。
表17.
表18.
*第一个字母表示物种(例如H：人，M：鼠，C：犬)。“#”表示靶DMD 外显子编号。“A/D”分别表示在外显子开始和结束时的接受体或供体剪接位点。(x y)表示退火坐标，其中“-”或“+”分别表示内含子或外显子序列。
表19.
表20.
表21.
步骤1：抗体与马来酰亚胺-PEG-NHS缀合，随后与siRNA-DMD缀合物缀合
用1X磷酸盐缓冲液(pH 7.4)对抗肌养蛋白抗体进行缓冲液交换，并使其浓度达到5mg/ml。向该溶液中加入2当量的SMCC连接体或马来酰亚胺-PEGxkDa-NHS(x＝1、5、10、20)，并在室温下旋转4小时。使用50kDa MWCO Amicon旋转过滤器和PBS pH 7.4通过旋转过滤除去未反应的马来酰亚胺-PEG。收集抗体-PEG-Mal缀合物并转移到反应容器中。使用表13-17中列出的序列合成各种siRNA缀合物。将 siRNA-DMD缀合物(2当量)在室温下加入到PBS中的抗体-PEG-马来酰亚胺中并旋转过夜。通过分析型SAX柱色谱法分析反应混合物，可以看到缀合物以及未反应的抗体和siRNA。
步骤2：纯化
使用阴离子交换色谱法，通过AKTA explorer FPLC纯化粗反应混合物。将含有抗体-PEG-DMD缀合物的级分合并，浓缩，并用pH 7.4的 PBS进行缓冲液交换。抗体siRNA与SMCC连接体、PEG1kDa、PEG5kDa 和PEG10kDa的缀合物基于siRNA加样进行分离。
步骤3：纯化的缀合物的分析
通过质谱法或SDS-PAGE表征所分离的缀合物。使用阴离子交换色谱法通过分析型FIPLC评估缀合物的纯度。
本文描述的实例和实施方案仅用于说明目的，并且对本领域技术人员建议的各种修改或改变将包括在本申请的精神和范围内以及所附权利要求书的范围内。
序列表
<110> 艾维迪提生物科学有限责任公司
<120> 核酸-多肽组合物以及诱导外显子跳读的方法
<130> 45532-715.601
<140>
<141>
<150> 62/561,939
<151> 2017-09-22
<150> 62/443,514
<151> 2017-01-06
<160> 977
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
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<212> PRT
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<220>
<223> 人工序列的描述：合成
肽
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Asn Leu Ile Asp Trp Gly Asn Ala
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
肽
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Gly Leu Phe Glu Ala Ile Glu Gly Phe Ile Glu Asn Gly Trp Glu Gly
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20
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
肽
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Gly Leu Phe Glu Ala Ile Glu Gly Phe Ile Glu Asn Gly Trp Glu Gly
1 5 10 15
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肽
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20
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
肽
<400> 5
Gly Leu Phe Glu Ala Ile Glu Gly Phe Ile Glu Asn Gly Trp Glu Gly
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
肽
<400> 6
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肽
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肽
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肽
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肽
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肽
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<223> 人工序列的描述：合成
肽
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Ala
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<223> 人工序列的描述：合成
肽
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<223> 人工序列的描述：合成
肽
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Leu Trp Arg Ala
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<213> 人工序列
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<223> 人工序列的描述：合成
多肽
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Trp Glu Ala Ala Leu Ala Glu Ala Leu Ala Glu Ala Leu Ala Glu His
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Leu Ala Glu Ala Leu Ala Glu Ala Leu Glu Ala Leu Ala Ala
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<213> 人工序列
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<223> 人工序列的描述：合成
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多肽
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Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Ile Glu Asn Gly Trp Glu Gly
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Met Ile Asp Gly Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met
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<223> 人工序列的描述：合成
肽
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Met Ile Asp Gly Ser Ser Lys Lys Lys Lys
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<213> 人工序列
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<223> 人工序列的描述：合成
肽
<400> 24
Gly Leu Phe Glu Ala Ile Ala Gly Phe Ile Glu Asn Gly Trp Glu Gly
1 5 10 15
Met Ile Asp Gly Gly Gly Tyr Cys
20
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
肽
<400> 25
Gly Leu Phe His Ala Ile Ala His Phe Ile His Gly Gly Trp His Gly
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Leu Ile His Gly Trp Tyr Gly
20
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<212> PRT
<213> 人工序列
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<223> 人工序列的描述：合成
多肽
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Gly Leu Phe Glu Ala Ile Glu Gly Phe Ile Glu Asn Gly Trp Glu Gly
1 5 10 15
Leu Ala Glu Ala Leu Ala Glu Ala Leu Glu Ala Leu Ala Ala
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<212> PRT
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<223> 人工序列的描述：合成
肽
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Lys Trp Lys Leu Phe Lys Lys Ile Gly Ala Val Leu Lys Val Leu Thr
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Thr Gly Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg
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<212> DNA
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<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
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ggccaaacct cggcttacct gaaat 25
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<211> 20
<212> RNA
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<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
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ggccaaaccu cggcuuaccu 20
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
引物
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<223> 人工序列的描述：合成
引物
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ttcttcagct tgtgtcatcc 20
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
引物
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acccagtcta ccaccctatc 20
<210> 33
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
引物
<400> 33
ctctttatct tctgcccacc tt 22
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> 人工序列的描述：合成
引物
<400> 34
gcgctatcag gagacaatga g 21
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<212> DNA
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<223> 人工序列的描述：合成
引物
<400> 35
gtttttatgt gattctgtaa tttccc 26
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<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
探针
<400> 36
ctctctgtac cttatcttag tgtt 24
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> 人工序列的描述：合成
引物
<400> 37
tggaggagag actcgggaaa 20
<210> 38
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
引物
<400> 38
ttgaagccat tttgttgctc ttt 23
<210> 39
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
探针
<400> 39
acaggctctg caaagt 16
<210> 40
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
引物
<400> 40
aacagatgac aactactgcc gaaa 24
<210> 41
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
引物
<400> 41
ttggctctga tagggtggta gac 23
<210> 42
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
探针
<400> 42
cttgttgaaa accc 14
<210> 43
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
引物
<400> 43
tgagggtgtt aatgctgaaa gta 23
<210> 44
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
引物
<400> 44
caccaactgg gaggaaagtt 20
<210> 45
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 45
ggccaaacct cggcttacct gaaat 25
<210> 46
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 46
agcccatctt ctcctggtcc tgggaagg 28
<210> 47
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 47
atcctctttg gtaacctcac ctcac 25
<210> 48
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 48
tcgtccacaa aatgattctg aatta 25
<210> 49
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 49
cggtgtgtgt atcattctct agtgt 25
<210> 50
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
引物
<400> 50
cctggaaaca gctcctaaca tc 22
<210> 51
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
引物
<400> 51
cagtcaagcc caaagtctct c 21
<210> 52
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
引物
<400> 52
ctagtgccct tgttttcaga 20
<210> 53
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
引物
<400> 53
aggatctacc actgatgggt 20
<210> 54
<211> 31
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 54
gccugagcug aucugcuggc aucuugcagu u 31
<210> 55
<211> 57
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 55
gcagaauucg auccaccggc uguucaagcc ugagcugauc ugcucgcauc uugcagu 57
<210> 56
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 56
cagcaguagu ugucaucugc uc 22
<210> 57
<211> 29
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 57
cacaaagucu gcauccagga acauggguc 29
<210> 58
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 58
cugcaauucc ccgagucucu gc 22
<210> 59
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 59
cucauaccuu cugcuugaug auc 23
<210> 60
<211> 30
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 60
uccaacuggg gacgccucug uuccaaaucc 30
<210> 61
<211> 24
<212> RNA
<213> 智人
<400> 61
gauagguggu aucaacaucu guaa 24
<210> 62
<211> 21
<212> RNA
<213> 智人
<400> 62
gauagguggu aucaacaucu g 21
<210> 63
<211> 25
<212> RNA
<213> 智人
<400> 63
gauagguggu aucaacaucu guaag 25
<210> 64
<211> 20
<212> RNA
<213> 智人
<400> 64
ggugguauca acaucuguaa 20
<210> 65
<211> 20
<212> RNA
<213> 智人
<400> 65
guaucaacau cuguaagcac 20
<210> 66
<211> 23
<212> RNA
<213> 智人
<400> 66
ugcauguucc agucguugug ugg 23
<210> 67
<211> 25
<212> RNA
<213> 智人
<400> 67
cacuauucca gucaaauagg ucugg 25
<210> 68
<211> 25
<212> RNA
<213> 智人
<400> 68
auuuaccaac cuucaggauc gagua 25
<210> 69
<211> 21
<212> RNA
<213> 智人
<400> 69
ggccuaaaac acauacacau a 21
<210> 70
<211> 20
<212> RNA
<213> 犬
<400> 70
cauuuuugac cuacaugugg 20
<210> 71
<211> 20
<212> RNA
<213> 犬
<400> 71
uuugaccuac auguggaaag 20
<210> 72
<211> 26
<212> RNA
<213> 犬
<400> 72
uacauuuuug accuacaugu ggaaag 26
<210> 73
<211> 22
<212> RNA
<213> 犬
<400> 73
auuuuugacc uacaugggaa ag 22
<210> 74
<211> 23
<212> RNA
<213> 犬
<400> 74
uacgaguuga uugucggacc cag 23
<210> 75
<211> 25
<212> RNA
<213> 犬
<400> 75
guggucuccu uaccuaugac ugugg 25
<210> 76
<211> 17
<212> RNA
<213> 犬
<400> 76
ggucuccuua ccuauga 17
<210> 77
<211> 24
<212> RNA
<213> 智人
<400> 77
ugucucagua aucuucuuac cuau 24
<210> 78
<211> 24
<212> RNA
<213> 智人
<400> 78
ucuuaccuau gacuauggau gaga 24
<210> 79
<211> 20
<212> RNA
<213> 智人
<400> 79
gcaugaacuc uuguggaucc 20
<210> 80
<211> 20
<212> RNA
<213> 智人
<400> 80
ccaggguacu acuuacauua 20
<210> 81
<211> 21
<212> RNA
<213> 智人
<400> 81
aucguguguc acagcaucca g 21
<210> 82
<211> 30
<212> RNA
<213> 智人
<400> 82
uguucagggc augaacucuu guggauccuu 30
<210> 83
<211> 31
<212> RNA
<213> 智人
<400> 83
uaggaggcgc cucccauccu guaggucacu g 31
<210> 84
<211> 31
<212> RNA
<213> 智人
<400> 84
aggucuagga ggcgccuccc auccuguagg u 31
<210> 85
<211> 25
<212> RNA
<213> 智人
<400> 85
gcgccuccca uccuguaggu cacug 25
<210> 86
<211> 26
<212> RNA
<213> 智人
<400> 86
cuucgaggag gucuaggagg cgccuc 26
<210> 87
<211> 21
<212> RNA
<213> 智人
<400> 87
cucccauccu guaggucacu g 21
<210> 88
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人
<400> 88
uaccaguuuu ugcccuguca gg 22
<210> 89
<211> 26
<212> RNA
<213> 智人
<400> 89
ucaauaugcu gcuucccaaa cugaaa 26
<210> 90
<211> 25
<212> RNA
<213> 智人
<400> 90
cuaggaggcg ccucccaucc uguag 25
<210> 91
<211> 31
<212> RNA
<213> 智人
<400> 91
uuaugauuuc caucuacgau gucaguacuu c 31
<210> 92
<211> 31
<212> RNA
<213> 智人
<400> 92
cuuaccugcc aguggaggau uauauuccaa a 31
<210> 93
<211> 25
<212> RNA
<213> 智人
<400> 93
caucaggauu cuuaccugcc agugg 25
<210> 94
<211> 25
<212> RNA
<213> 智人
<400> 94
cgaugucagu acuuccaaua uucac 25
<210> 95
<211> 18
<212> RNA
<213> 智人
<400> 95
accauucauc aggauucu 18
<210> 96
<211> 18
<212> RNA
<213> 智人
<400> 96
accugccagu ggaggauu 18
<210> 97
<211> 27
<212> RNA
<213> 智人
<400> 97
ccaauauuca cuaaaucaac cuguuaa 27
<210> 98
<211> 30
<212> RNA
<213> 智人
<400> 98
caggauuguu accugccagu ggaggauuau 30
<210> 99
<211> 31
<212> RNA
<213> 智人
<400> 99
acgaugucag uacuuccaau auucacuaaa u 31
<210> 100
<211> 31
<212> RNA
<213> 智人
<400> 100
auuuccaucu acgaugucag uacuuccaau a 31
<210> 101
<211> 21
<212> RNA
<213> 智人
<400> 101
caggagcuuc caaaugcugc a 21
<210> 102
<211> 29
<212> RNA
<213> 智人
<400> 102
cuugucuuca ggagcuucca aaugcugca 29
<210> 103
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人
<400> 103
uccucagcag aaagaagcca cg 22
<210> 104
<211> 20
<212> RNA
<213> 智人
<400> 104
uuagaaaucu cuccuugugc 20
<210> 105
<211> 20
<212> RNA
<213> 智人
<400> 105
uaaauugggu guuacacaau 20
<210> 106
<211> 24
<212> RNA
<213> 智人
<400> 106
cccugaggca uucccaucuu gaau 24
<210> 107
<211> 20
<212> RNA
<213> 智人
<400> 107
aggacuuacu ugcuuuguuu 20
<210> 108
<211> 23
<212> RNA
<213> 智人
<400> 108
cuugaauuua ggagauucau cug 23
<210> 109
<211> 23
<212> RNA
<213> 智人
<400> 109
caucuucuga uaauuuuccu guu 23
<210> 110
<211> 24
<212> RNA
<213> 智人
<400> 110
ucuucuguuu uuguuagcca guca 24
<210> 111
<211> 20
<212> RNA
<213> 智人
<400> 111
ucuauguaaa cugaaaauuu 20
<210> 112
<211> 20
<212> RNA
<213> 智人
<400> 112
uucuggagau ccauuaaaac 20
<210> 113
<211> 24
<212> RNA
<213> 智人
<400> 113
cagcaguugc gugaucucca cuag 24
<210> 114
<211> 21
<212> RNA
<213> 智人
<400> 114
uucaucaacu accaccacca u 21
<210> 115
<211> 25
<212> RNA
<213> 智人
<400> 115
cuaagcaaaa uaaucugacc uuaag 25
<210> 116
<211> 28
<212> RNA
<213> 智人
<400> 116
cuuguaaaag aacccagcgg ucuucugu 28
<210> 117
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人
<400> 117
caucuacaga uguuugccca uc 22
<210> 118
<211> 23
<212> RNA
<213> 智人
<400> 118
gaaggauguc uuguaaaaga acc 23
<210> 119
<211> 20
<212> RNA
<213> 智人
<400> 119
accuguucuu caguaagacg 20
<210> 120
<211> 24
<212> RNA
<213> 智人
<400> 120
caugacacac cuguucuuca guaa 24
<210> 121
<211> 20
<212> RNA
<213> 智人
<400> 121
cauuugagaa ggaugucuug 20
<210> 122
<211> 24
<212> RNA
<213> 智人
<400> 122
aucucccaau accuggagaa gaga 24
<210> 123
<211> 31
<212> RNA
<213> 智人
<400> 123
gccaugcacu aaaaaggcac ugcaagacau u 31
<210> 124
<211> 24
<212> RNA
<213> 智人
<400> 124
ucuuuaaagc caguugugug aauc 24
<210> 125
<211> 21
<212> RNA
<213> 智人
<400> 125
uuucugaaag ccaugcacua a 21
<210> 126
<211> 25
<212> RNA
<213> 智人
<400> 126
guacauacgg ccaguuuuug aagac 25
<210> 127
<211> 31
<212> RNA
<213> 智人
<400> 127
cuagauccgc uuuuaaaacc uguuaaaaca a 31
<210> 128
<211> 31
<212> RNA
<213> 智人
<400> 128
ucuuuucuag auccgcuuuu aaaaccuguu a 31
<210> 129
<211> 25
<212> RNA
<213> 智人
<400> 129
cuagauccgc uuuuaaaacc uguua 25
<210> 130
<211> 23
<212> RNA
<213> 智人
<400> 130
ccgucuucug ggucacugac uua 23
<210> 131
<211> 26
<212> RNA
<213> 智人
<400> 131
cuagauccgc uuuuaaaacc uguuaa 26
<210> 132
<211> 20
<212> RNA
<213> 智人
<400> 132
ccgcuuuuaa aaccuguuaa 20
<210> 133
<211> 26
<212> RNA
<213> 智人
<400> 133
uggauugcuu uuucuuuucu agaucc 26
<210> 134
<211> 25
<212> RNA
<213> 智人
<400> 134
caugcuuccg ucuucugggu cacug 25
<210> 135
<211> 23
<212> RNA
<213> 智人
<400> 135
gaucuuguuu gagugaauac agu 23
<210> 136
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人
<400> 136
guuauccagc caugcuuccg uc 22
<210> 137
<211> 25
<212> RNA
<213> 智人
<400> 137
ugauaauugg uaucacuaac cugug 25
<210> 138
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人
<400> 138
guaucacuaa ccugugcugu ac 22
<210> 139
<211> 19
<212> RNA
<213> 智人
<400> 139
cugcuggcau cuugcaguu 19
<210> 140
<211> 31
<212> RNA
<213> 智人
<400> 140
gccugagcug aucugcuggc aucuugcagu u 31
<210> 141
<211> 28
<212> RNA
<213> 智人
<400> 141
cuggcagaau ucgauccacc ggcuguuc 28
<210> 142
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人
<400> 142
cagcaguagu ugucaucugc uc 22
<210> 143
<211> 19
<212> RNA
<213> 智人
<400> 143
ugauggggug guggguugg 19
<210> 144
<211> 25
<212> RNA
<213> 智人
<400> 144
aucugcauua acacccucua gaaag 25
<210> 145
<211> 24
<212> RNA
<213> 智人
<400> 145
ccggcuguuc aguuguucug aggc 24
<210> 146
<211> 28
<212> RNA
<213> 智人
<400> 146
aucugcauua acacccucua gaaagaaa 28
<210> 147
<211> 28
<212> RNA
<213> 智人
<400> 147
gaaggagaag agauucuuac cuuacaaa 28
<210> 148
<211> 20
<212> RNA
<213> 智人
<400> 148
auucgaucca ccggcuguuc 20
<210> 149
<211> 20
<212> RNA
<213> 智人
<400> 149
cagcaguagu ugucaucugc 20
<210> 150
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人
<400> 150
gccgguugac uucauccugu gc 22
<210> 151
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人
<400> 151
cugcauccag gaacaugggu cc 22
<210> 152
<211> 23
<212> RNA
<213> 智人
<400> 152
gucugcaucc aggaacaugg guc 23
<210> 153
<211> 24
<212> RNA
<213> 智人
<400> 153
guugaagauc ugauagccgg uuga 24
<210> 154
<211> 24
<212> RNA
<213> 智人
<400> 154
uacuuacugu cuguagcucu uucu 24
<210> 155
<211> 24
<212> RNA
<213> 智人
<400> 155
cacucauggu cuccugauag cgca 24
<210> 156
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人
<400> 156
cugcaauucc ccgagucucu gc 22
<210> 157
<211> 23
<212> RNA
<213> 智人
<400> 157
acugcuggac ccauguccug aug 23
<210> 158
<211> 21
<212> RNA
<213> 智人
<400> 158
cuaaguugag guauggagag u 21
<210> 159
<211> 23
<212> RNA
<213> 智人
<400> 159
uauucacaga ccugcaauuc ccc 23
<210> 160
<211> 26
<212> RNA
<213> 智人
<400> 160
acaguggugc ugagauagua uaggcc 26
<210> 161
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人
<400> 161
uaggccacuu uguugcucuu gc 22
<210> 162
<211> 19
<212> RNA
<213> 智人
<400> 162
uucagagggc gcuuucuuc 19
<210> 163
<211> 23
<212> RNA
<213> 智人
<400> 163
gggcaggcca uuccuccuuc aga 23
<210> 164
<211> 24
<212> RNA
<213> 智人
<400> 164
ucuucagggu uuguauguga uucu 24
<210> 165
<211> 27
<212> RNA
<213> 智人
<400> 165
cugggcugaa uugucugaau aucacug 27
<210> 166
<211> 26
<212> RNA
<213> 智人
<400> 166
cuguuggcac augugauccc acugag 26
<210> 167
<211> 24
<212> RNA
<213> 智人
<400> 167
gucuauaccu guuggcacau guga 24
<210> 168
<211> 25
<212> RNA
<213> 智人
<400> 168
ugcuuucugu aauucaucug gaguu 25
<210> 169
<211> 26
<212> RNA
<213> 智人
<400> 169
ccuccuuucu ggcauagacc uuccac 26
<210> 170
<211> 25
<212> RNA
<213> 智人
<400> 170
ugugucaucc auucgugcau cucug 25
<210> 171
<211> 25
<212> RNA
<213> 智人
<400> 171
uuaaggccuc uugugcuaca ggugg 25
<210> 172
<211> 23
<212> RNA
<213> 智人
<400> 172
ggggcucuuc uuuagcucuc uga 23
<210> 173
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人
<400> 173
gacuuccaaa gucuugcauu uc 22
<210> 174
<211> 24
<212> RNA
<213> 智人
<400> 174
gccaacaugc ccaaacuucc uaag 24
<210> 175
<211> 26
<212> RNA
<213> 智人
<400> 175
cagagauuuc cucagcuccg ccagga 26
<210> 176
<211> 21
<212> RNA
<213> 智人
<400> 176
cuuacaucua gcaccucaga g 21
<210> 177
<211> 25
<212> RNA
<213> 智人
<400> 177
uccgccaucu guuagggucu gugcc 25
<210> 178
<211> 25
<212> RNA
<213> 智人
<400> 178
auuuggguua uccucugaau gucgc 25
<210> 179
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人
<400> 179
cauaccucuu cauguaguuc cc 22
<210> 180
<211> 26
<212> RNA
<213> 智人
<400> 180
cauuugagcu gcguccaccu ugucug 26
<210> 181
<211> 26
<212> RNA
<213> 智人
<400> 181
uccugggcag acuggaugcu cuguuc 26
<210> 182
<211> 23
<212> RNA
<213> 智人
<400> 182
uugccugggc uuccugaggc auu 23
<210> 183
<211> 24
<212> RNA
<213> 智人
<400> 183
uucugaaaua acauauaccu gugc 24
<210> 184
<211> 25
<212> RNA
<213> 智人
<400> 184
uaguuucuga aauaacauau accug 25
<210> 185
<211> 21
<212> RNA
<213> 智人
<400> 185
gacuugucaa aucagauugg a 21
<210> 186
<211> 24
<212> RNA
<213> 智人
<400> 186
guuucugaaa uaacauauac cugu 24
<210> 187
<211> 20
<212> RNA
<213> 智人
<400> 187
caccagaaau acauaccaca 20
<210> 188
<211> 20
<212> RNA
<213> 智人
<400> 188
caaugauuua gcugugacug 20
<210> 189
<211> 23
<212> RNA
<213> 智人
<400> 189
cgaaacuuca uggagacauc uug 23
<210> 190
<211> 25
<212> RNA
<213> 智人
<400> 190
cuuguagacg cugcucaaaa uuggc 25
<210> 191
<211> 20
<212> RNA
<213> 智人
<400> 191
caugcacaca ccuuugcucc 20
<210> 192
<211> 24
<212> RNA
<213> 智人
<400> 192
ucuguacaau cugacgucca gucu 24
<210> 193
<211> 27
<212> RNA
<213> 智人
<400> 193
gucuuuauca ccauuuccac uucagac 27
<210> 194
<211> 25
<212> RNA
<213> 智人
<400> 194
ccgucugcuu uuucuguaca aucug 25
<210> 195
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人
<400> 195
uccauaucug uagcugccag cc 22
<210> 196
<211> 23
<212> RNA
<213> 智人
<400> 196
ccaggcaacu ucagaaucca aau 23
<210> 197
<211> 30
<212> RNA
<213> 智人
<400> 197
uuucuguuac cugaaaagaa uuauaaugaa 30
<210> 198
<211> 25
<212> RNA
<213> 智人
<400> 198
cauucauuuc cuuucgcauc uuacg 25
<210> 199
<211> 26
<212> RNA
<213> 智人
<400> 199
ugaucucuuu gucaauucca uaucug 26
<210> 200
<211> 30
<212> RNA
<213> 智人
<400> 200
uucagugaua uagguuuuac cuuuccccag 30
<210> 201
<211> 26
<212> RNA
<213> 智人
<400> 201
cuguagcugc cagccauucu gucaag 26
<210> 202
<211> 21
<212> RNA
<213> 智人
<400> 202
ucuucugcuc gggaggugac a 21
<210> 203
<211> 20
<212> RNA
<213> 智人
<400> 203
ccaguuacua uucagaagac 20
<210> 204
<211> 20
<212> RNA
<213> 智人
<400> 204
ucuucaggug caccuucugu 20
<210> 205
<211> 25
<212> RNA
<213> 智人
<400> 205
ugugaugugg uccacauucu gguca 25
<210> 206
<211> 20
<212> RNA
<213> 智人
<400> 206
ccauguguuu cugguauucc 20
<210> 207
<211> 25
<212> RNA
<213> 智人
<400> 207
cguguagagu ccaccuuugg gcgua 25
<210> 208
<211> 24
<212> RNA
<213> 智人
<400> 208
uacuaauuuc cugcaguggu cacc 24
<210> 209
<211> 24
<212> RNA
<213> 智人
<400> 209
uucuguguga aauggcugca aauc 24
<210> 210
<211> 20
<212> RNA
<213> 智人
<400> 210
ccuucaaagg aauggaggcc 20
<210> 211
<211> 25
<212> RNA
<213> 智人
<400> 211
ugcugaauuu cagccuccag ugguu 25
<210> 212
<211> 25
<212> RNA
<213> 智人
<400> 212
ugaagucuuc cucuuucaga uucac 25
<210> 213
<211> 24
<212> RNA
<213> 智人
<400> 213
cuggcuuucu cucaucugug auuc 24
<210> 214
<211> 20
<212> RNA
<213> 智人
<400> 214
guuguaaguu gucuccucuu 20
<210> 215
<211> 20
<212> RNA
<213> 智人
<400> 215
uugucuguaa cagcugcugu 20
<210> 216
<211> 20
<212> RNA
<213> 智人
<400> 216
gcucuaauac cuugagagca 20
<210> 217
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人
<400> 217
cuuugagacc ucaaauccug uu 22
<210> 218
<211> 25
<212> RNA
<213> 智人
<400> 218
cuuuauuuuc cuuucaucuc ugggc 25
<210> 219
<211> 27
<212> RNA
<213> 智人
<400> 219
aucguuucuu cacggacagu gugcugg 27
<210> 220
<211> 24
<212> RNA
<213> 智人
<400> 220
gggcuuguga gacaugagug auuu 24
<210> 221
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人
<400> 221
accuucagag gacuccucuu gc 22
<210> 222
<211> 25
<212> RNA
<213> 智人
<400> 222
uauguguuac cuacccuugu cgguc 25
<210> 223
<211> 20
<212> RNA
<213> 智人
<400> 223
ggagagagcu uccuguagcu 20
<210> 224
<211> 23
<212> RNA
<213> 智人
<400> 224
ucacccuuuc cacaggcguu gca 23
<210> 225
<211> 20
<212> RNA
<213> 智人
<400> 225
uuugugucuu ucugagaaac 20
<210> 226
<211> 20
<212> RNA
<213> 智人
<400> 226
aaagacuuac cuuaagauac 20
<210> 227
<211> 20
<212> RNA
<213> 智人
<400> 227
aucugucaaa ucgccugcag 20
<210> 228
<211> 20
<212> RNA
<213> 智人
<400> 228
uuaccuugac uugcucaagc 20
<210> 229
<211> 20
<212> RNA
<213> 智人
<400> 229
uccagguuca agugggauac 20
<210> 230
<211> 25
<212> RNA
<213> 智人
<400> 230
gcucuucugg gcuuauggga gcacu 25
<210> 231
<211> 27
<212> RNA
<213> 智人
<400> 231
accuuuaucc acuggagauu ugucugc 27
<210> 232
<211> 21
<212> RNA
<213> 智人
<400> 232
uuccaccagu aacugaaaca g 21
<210> 233
<211> 29
<212> RNA
<213> 智人
<400> 233
ccacucagag cucagaucuu cuaacuucc 29
<210> 234
<211> 27
<212> RNA
<213> 智人
<400> 234
cuuccacuca gagcucagau cuucuaa 27
<210> 235
<211> 25
<212> RNA
<213> 智人
<400> 235
gggauccagu auacuuacag gcucc 25
<210> 236
<211> 26
<212> RNA
<213> 智人
<400> 236
accagaguaa cagucugagu aggagc 26
<210> 237
<211> 23
<212> RNA
<213> 智人
<400> 237
cucauaccuu cugcuugaug auc 23
<210> 238
<211> 24
<212> RNA
<213> 智人
<400> 238
uucuguccaa gcccgguuga aauc 24
<210> 239
<211> 30
<212> RNA
<213> 智人
<400> 239
acaucaagga agauggcauu ucuaguuugg 30
<210> 240
<211> 25
<212> RNA
<213> 智人
<400> 240
acaucaagga agauggcauu ucuag 25
<210> 241
<211> 30
<212> RNA
<213> 智人
<400> 241
cuccaacauc aaggaagaug gcauuucuag 30
<210> 242
<211> 25
<212> RNA
<213> 智人
<400> 242
aucauuuuuu cucauaccuu cugcu 25
<210> 243
<211> 36
<212> RNA
<213> 智人
<400> 243
aucauuuuuu cucauaccuu cugcuaggag cuaaaa 36
<210> 244
<400> 244
000
<210> 245
<211> 21
<212> RNA
<213> 智人
<400> 245
cacccaccau cacccucugu g 21
<210> 246
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人
<400> 246
aucaucucgu ugauauccuc aa 22
<210> 247
<211> 21
<212> RNA
<213> 智人
<400> 247
uccugcauug uugccuguaa g 21
<210> 248
<211> 30
<212> RNA
<213> 智人
<400> 248
uccaacuggg gacgccucug uuccaaaucc 30
<210> 249
<211> 21
<212> RNA
<213> 智人
<400> 249
acuggggacg ccucuguucc a 21
<210> 250
<211> 20
<212> RNA
<213> 智人
<400> 250
ccguaaugau uguucuagcc 20
<210> 251
<211> 20
<212> RNA
<213> 智人
<400> 251
uguuaaaaaa cuuacuucga 20
<210> 252
<211> 25
<212> RNA
<213> 智人
<400> 252
cauucaacug uugccuccgg uucug 25
<210> 253
<211> 24
<212> RNA
<213> 智人
<400> 253
cuguugccuc cgguucugaa ggug 24
<210> 254
<211> 31
<212> RNA
<213> 智人
<400> 254
cauucaacug uugccuccgg uucugaaggu g 31
<210> 255
<211> 21
<212> RNA
<213> 智人
<400> 255
uacuaaccuu gguuucugug a 21
<210> 256
<211> 25
<212> RNA
<213> 智人
<400> 256
cugaaggugu ucuuguacuu caucc 25
<210> 257
<211> 27
<212> RNA
<213> 智人
<400> 257
uguauaggga cccuccuucc augacuc 27
<210> 258
<211> 25
<212> RNA
<213> 智人
<400> 258
cuaaccuugg uuucugugau uuucu 25
<210> 259
<211> 27
<212> RNA
<213> 智人
<400> 259
gguaucuuug auacuaaccu ugguuuc 27
<210> 260
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人
<400> 260
auucuuucaa cuagaauaaa ag 22
<210> 261
<211> 25
<212> RNA
<213> 智人
<400> 261
gauucugaau ucuuucaacu agaau 25
<210> 262
<211> 20
<212> RNA
<213> 智人
<400> 262
aucccacuga uucugaauuc 20
<210> 263
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人
<400> 263
uuggcucugg ccuguccuaa ga 22
<210> 264
<211> 30
<212> RNA
<213> 智人
<400> 264
cucuuuucca gguucaagug ggauacuagc 30
<210> 265
<211> 31
<212> RNA
<213> 智人
<400> 265
caagcuuuuc uuuuaguugc ugcucuuuuc c 31
<210> 266
<211> 30
<212> RNA
<213> 智人
<400> 266
uauucuuuug uucuucuagc cuggagaaag 30
<210> 267
<211> 28
<212> RNA
<213> 智人
<400> 267
cugcuuccuc caaccauaaa acaaauuc 28
<210> 268
<211> 26
<212> RNA
<213> 智人
<400> 268
ccaaugccau ccuggaguuc cuguaa 26
<210> 269
<211> 20
<212> RNA
<213> 智人
<400> 269
uccuguagaa uacuggcauc 20
<210> 270
<211> 27
<212> RNA
<213> 智人
<400> 270
ugcagaccuc cugccaccgc agauuca 27
<210> 271
<211> 20
<212> RNA
<213> 智人
<400> 271
cuaccucuuu uuucugucug 20
<210> 272
<211> 20
<212> RNA
<213> 智人
<400> 272
uguuuuugag gauugcugaa 20
<210> 273
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 273
tggttcttac ccagccgccg 20
<210> 274
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 274
gttattcttt agaatggtgc 20
<210> 275
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 275
tgctattacc ttaacccaga 20
<210> 276
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 276
ctgtgcttac cgggttttcc acctccc 27
<210> 277
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 277
atcgtcgtga ctgtctgttg gaggg 25
<210> 278
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 278
gctcacgttg aggggcatcg 20
<210> 279
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 279
acgttgaggg gcatcgtcgc 20
<210> 280
<211> 30
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 280
ggggcaucgu cgugacuguc uguuggaggg 30
<210> 281
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 281
cgucgugacu gucuguugga gg 22
<210> 282
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 282
cgtcgtgact gtctgttgga gg 22
<210> 283
<211> 28
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 283
ggcaucgucg cgggaggcug cuggagcg 28
<210> 284
<211> 28
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 284
ccgcgacaua ggacggagag cagagccc 28
<210> 285
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 285
actgtgaggg cgatcgctgc 20
<210> 286
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 286
acgatgagtg gcatagtcgc 20
<210> 287
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 287
ggcatcgtcg cgggaggctg 20
<210> 288
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 288
gggcatcgtc gcgggaggct 20
<210> 289
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 289
ggggcatcgt cgcgggaggc 20
<210> 290
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 290
aggggcatcg tcgcgggagg 20
<210> 291
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 291
gaggggcatc gtcgcgggag 20
<210> 292
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 292
tgaggggcat cgtcgcggga 20
<210> 293
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 293
ttgaggggca tcgtcgcggg 20
<210> 294
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 294
gttgaggggc atcgtcgcgg 20
<210> 295
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 295
cgttgagggg catcgtcgcg 20
<210> 296
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 296
acgttgaggg gcatcgtcgc 20
<210> 297
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 297
aacgttgagg ggcatcgtcg 20
<210> 298
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 298
taacgttgag gggcatcgtc 20
<210> 299
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 299
ctaacgttga ggggcatcgt 20
<210> 300
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 300
gctaacgttg aggggcatcg 20
<210> 301
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 301
agctaacgtt gaggggcatc 20
<210> 302
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 302
aagctaacgt tgaggggcat 20
<210> 303
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 303
gaagctaacg ttgaggggca 20
<210> 304
<211> 20
<212> DNA
<213> 大鼠
<400> 304
ctccgcaatg ctgaaaggtg 20
<210> 305
<211> 24
<212> RNA
<213> 大鼠
<400> 305
ggcgugccuc aaacauggug gcgg 24
<210> 306
<211> 27
<212> DNA
<213> 大鼠
<400> 306
ctgtgcttac cgggttttcc acctccc 27
<210> 307
<211> 25
<212> DNA
<213> 大鼠
<400> 307
atcgtcgtga ctgtctgttg gaggg 25
<210> 308
<211> 20
<212> DNA
<213> 大鼠
<400> 308
gctcacgttg aggggcatcg 20
<210> 309
<211> 20
<212> DNA
<213> 大鼠
<400> 309
ggtcactcac cggtagagaa 20
<210> 310
<211> 20
<212> DNA
<213> 大鼠
<400> 310
gggttccaag tctataaagg 20
<210> 311
<211> 14
<212> DNA
<213> 智人
<400> 311
tgtgtctttt ccag 14
<210> 312
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<400> 312
tttggagact gccagggacc atg 23
<210> 313
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人
<400> 313
catggtccct ggcagtctcc 20
<210> 314
<211> 36
<212> DNA
<213> 智人
<400> 314
tcaatgggca aaacatggtc cctggcagtc tccaaa 36
<210> 315
<211> 15
<212> DNA
<213> 智人
<400> 315
tttgtgttct cccag 15
<210> 316
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<400> 316
ggaaacagaa gtacctgtgc gcc 23
<210> 317
<211> 18
<212> DNA
<213> 智人
<400> 317
ggcgcacagg tacttctg 18
<210> 318
<211> 36
<212> DNA
<213> 智人
<400> 318
aatcatttct gctggcgcac aggtacttct gtttcc 36
<210> 319
<211> 18
<212> DNA
<213> 智人
<400> 319
cccctgcagc acgcgggt 18
<210> 320
<211> 37
<212> DNA
<213> 智人
<400> 320
gaggcagggc cggcaggacc ccctgcagca cgcgggt 37
<210> 321
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人
<400> 321
ggcatcgtcg cgggaggctg 20
<210> 322
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人
<400> 322
gggcatcgtc gcgggaggct 20
<210> 323
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人
<400> 323
ggggcatcgt cgcgggaggc 20
<210> 324
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人
<400> 324
aggggcatcg tcgcgggagg 20
<210> 325
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人
<400> 325
gaggggcatc gtcgcgggag 20
<210> 326
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人
<400> 326
tgaggggcat cgtcgcggga 20
<210> 327
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人
<400> 327
ttgaggggca tcgtcgcggg 20
<210> 328
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人
<400> 328
gttgaggggc atcgtcgcgg 20
<210> 329
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人
<400> 329
cgttgagggg catcgtcgcg 20
<210> 330
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人
<400> 330
acgttgaggg gcatcgtcgc 20
<210> 331
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人
<400> 331
aacgttgagg ggcatcgtcg 20
<210> 332
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人
<400> 332
taacgttgag gggcatcgtc 20
<210> 333
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人
<400> 333
ctaacgttga ggggcatcgt 20
<210> 334
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人
<400> 334
gctaacgttg aggggcatcg 20
<210> 335
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人
<400> 335
agctaacgtt gaggggcatc 20
<210> 336
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人
<400> 336
aagctaacgt tgaggggcat 20
<210> 337
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人
<400> 337
gaagctaacg ttgaggggca 20
<210> 338
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人
<400> 338
tcctcatctt cttgttcctc 20
<210> 339
<211> 36
<212> DNA
<213> 智人
<400> 339
aacaacatcg atttcttcct catcttcttg ttcctc 36
<210> 340
<211> 18
<212> DNA
<213> 智人
<400> 340
cccggaaggc agtctggc 18
<210> 341
<211> 36
<212> DNA
<213> 智人
<400> 341
tcctccatgg cagtgacccg gaaggcagtc tggctg 36
<210> 342
<211> 19
<212> DNA
<213> 智人
<400> 342
ctactggccg ctgaagggc 19
<210> 343
<211> 36
<212> DNA
<213> 智人
<400> 343
gctcaaagtc agatgctact ggccgctgaa gggctt 36
<210> 344
<211> 27
<212> DNA
<213> 人类免疫缺陷病毒1
<400> 344
tcgtcggtct ctccgcttct tcttgcc 27
<210> 345
<211> 20
<212> DNA
<213> 人类免疫缺陷病毒1
<400> 345
ctctggtggt gggtaagggt 20
<210> 346
<211> 37
<212> DNA
<213> 人类免疫缺陷病毒1
<400> 346
cgggtctgtc gggttccctc tggtggtggg taagggt 37
<210> 347
<211> 30
<212> RNA
<213> 大鼠
<400> 347
ggggcaucgu cgugacuguc uguuggaggg 30
<210> 348
<211> 22
<212> RNA
<213> 大鼠
<400> 348
cgucgugacu gucuguugga gg 22
<210> 349
<211> 22
<212> DNA
<213> 大鼠
<400> 349
cgtcgtgact gtctgttgga gg 22
<210> 350
<211> 28
<212> RNA
<213> 智人
<400> 350
ggcaucgucg cgggaggcug cuggagcg 28
<210> 351
<211> 28
<212> RNA
<213> 大鼠
<400> 351
ccgcgacaua ggacggagag cagagccc 28
<210> 352
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 352
ctgcaggtaa aagcatatgg atcaa 25
<210> 353
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 353
atcgcctgca ggtaaaagca tatgg 25
<210> 354
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 354
gtcaaatcgc ctgcaggtaa aagca 25
<210> 355
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 355
gatctgtcaa atcgcctgca ggtaa 25
<210> 356
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 356
caacagatct gtcaaatcgc ctgca 25
<210> 357
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 357
tttctcaaca gatctgtcaa atcgc 25
<210> 358
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 358
ccatttctca acagatctgt caaat 25
<210> 359
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 359
ataatgaaaa cgccgccatt tctca 25
<210> 360
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 360
aaatatcttt atatcataat gaaaa 25
<210> 361
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 361
tgttagccac tgattaaata tcttt 25
<210> 362
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 362
aaactgttca gcttctgtta gccac 25
<210> 363
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 363
ttgtgtcttt ctgagaaact gttca 25
<210> 364
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 364
ccaattctca ggaatttgtg tcttt 25
<210> 365
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 365
gtatttagca tgttcccaat tctca 25
<210> 366
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 366
cttaagatac catttgtatt tagca 25
<210> 367
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 367
cttaccttaa gataccattt gtatt 25
<210> 368
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 368
aaagacttac cttaagatac cattt 25
<210> 369
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 369
aaatcaaaga cttaccttaa gatac 25
<210> 370
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 370
aaaacaaatc aaagacttac cttaa 25
<210> 371
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 371
tcgaaaaaac aaatcaaaga cttac 25
<210> 372
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 372
ctgtaagata ccaaaaaggc aaaac 25
<210> 373
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 373
cctgtaagat accaaaaagg caaaa 25
<210> 374
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 374
agttcctgta agataccaaa aaggc 25
<210> 375
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 375
gagttcctgt aagataccaa aaagg 25
<210> 376
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 376
cctggagttc ctgtaagata ccaaa 25
<210> 377
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 377
tcctggagtt cctgtaagat accaa 25
<210> 378
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 378
gccatcctgg agttcctgta agata 25
<210> 379
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 379
tgccatcctg gagttcctgt aagat 25
<210> 380
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 380
ccaatgccat cctggagttc ctgta 25
<210> 381
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 381
cccaatgcca tcctggagtt cctgt 25
<210> 382
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 382
gctgcccaat gccatcctgg agttc 25
<210> 383
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 383
cgctgcccaa tgccatcctg gagtt 25
<210> 384
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 384
aacagtttgc cgctgcccaa tgcca 25
<210> 385
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 385
ctgacaacag tttgccgctg cccaa 25
<210> 386
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 386
gttgcattca atgttctgac aacag 25
<210> 387
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 387
gctgaattat ttcttcccca gttgc 25
<210> 388
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 388
attatttctt ccccagttgc attca 25
<210> 389
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 389
ggcatctgtt tttgaggatt gctga 25
<210> 390
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 390
tttgaggatt gctgaattat ttctt 25
<210> 391
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 391
aatttttcct gtagaatact ggcat 25
<210> 392
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 392
atactggcat ctgtttttga ggatt 25
<210> 393
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 393
accgcagatt caggcttccc aattt 25
<210> 394
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 394
aatttttcct gtagaatact ggcat 25
<210> 395
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 395
ctgtttgcag acctcctgcc accgc 25
<210> 396
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 396
agattcaggc ttcccaattt ttcct 25
<210> 397
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 397
ctcttttttc tgtctgacag ctgtt 25
<210> 398
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 398
acctcctgcc accgcagatt caggc 25
<210> 399
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 399
cctacctctt ttttctgtct gacag 25
<210> 400
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 400
gacagctgtt tgcagacctc ctgcc 25
<210> 401
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 401
gtcgccctac ctcttttttc tgtct 25
<210> 402
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 402
gatctgtcgc cctacctctt ttttc 25
<210> 403
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 403
tattagatct gtcgccctac ctctt 25
<210> 404
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 404
attcctatta gatctgtcgc cctac 25
<210> 405
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 405
agataccaaa aaggcaaaac 20
<210> 406
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 406
aagataccaa aaaggcaaaa 20
<210> 407
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 407
cctgtaagat accaaaaagg 20
<210> 408
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 408
gagttcctgt aagataccaa 20
<210> 409
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 409
tcctggagtt cctgtaagat 20
<210> 410
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 410
tgccatcctg gagttcctgt 20
<210> 411
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 411
cccaatgcca tcctggagtt 20
<210> 412
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 412
cgctgcccaa tgccatcctg 20
<210> 413
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 413
ctgacaacag tttgccgctg 20
<210> 414
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 414
gttgcattca atgttctgac 20
<210> 415
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 415
attatttctt ccccagttgc 20
<210> 416
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 416
tttgaggatt gctgaattat 20
<210> 417
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 417
atactggcat ctgtttttga 20
<210> 418
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 418
aatttttcct gtagaatact 20
<210> 419
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 419
agattcaggc ttcccaattt 20
<210> 420
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 420
acctcctgcc accgcagatt 20
<210> 421
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 421
gacagctgtt tgcagacctc 20
<210> 422
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 422
ctcttttttc tgtctgacag 20
<210> 423
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 423
cctacctctt ttttctgtct 20
<210> 424
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 424
gtcgccctac ctcttttttc 20
<210> 425
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 425
gatctgtcgc cctacctctt 20
<210> 426
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 426
tattagatct gtcgccctac 20
<210> 427
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 427
attcctatta gatctgtcgc 20
<210> 428
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 428
gggggatttg agaaaataaa attac 25
<210> 429
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 429
atttgagaaa ataaaattac cttga 25
<210> 430
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 430
ctagcctgga gaaagaagaa taaaa 25
<210> 431
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 431
agaaaataaa attaccttga cttgc 25
<210> 432
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 432
ttcttctagc ctggagaaag aagaa 25
<210> 433
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 433
ataaaattac cttgacttgc tcaag 25
<210> 434
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 434
ttttgttctt ctagcctgga gaaag 25
<210> 435
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 435
attaccttga cttgctcaag ctttt 25
<210> 436
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 436
tattcttttg ttcttctagc ctgga 25
<210> 437
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 437
cttgacttgc tcaagctttt ctttt 25
<210> 438
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 438
caagatattc ttttgttctt ctagc 25
<210> 439
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 439
cttttagttg ctgctctttt ccagg 25
<210> 440
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 440
ccaggttcaa gtgggatact agcaa 25
<210> 441
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 441
atctctttga aattctgaca agata 25
<210> 442
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 442
agcaatgtta tctgcttcct ccaac 25
<210> 443
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 443
aacaaattca tttaaatctc tttga 25
<210> 444
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 444
ccaaccataa aacaaattca tttaa 25
<210> 445
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 445
ttcctccaac cataaaacaa attca 25
<210> 446
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 446
tttaaatctc tttgaaattc tgaca 25
<210> 447
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 447
tgacaagata ttcttttgtt cttct 25
<210> 448
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 448
ttcaagtggg atactagcaa tgtta 25
<210> 449
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 449
agatattctt ttgttcttct agcct 25
<210> 450
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 450
ctgctctttt ccaggttcaa gtggg 25
<210> 451
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 451
ttcttttgtt cttctagcct ggaga 25
<210> 452
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 452
cttttctttt agttgctgct ctttt 25
<210> 453
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 453
ttgttcttct agcctggaga aagaa 25
<210> 454
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 454
cttctagcct ggagaaagaa gaata 25
<210> 455
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 455
agcctggaga aagaagaata aaatt 25
<210> 456
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 456
ctggagaaag aagaataaaa ttgtt 25
<210> 457
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 457
gaaagaagaa taaaattgtt 20
<210> 458
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 458
ggagaaagaa gaataaaatt 20
<210> 459
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 459
agcctggaga aagaagaata 20
<210> 460
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 460
cttctagcct ggagaaagaa 20
<210> 461
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 461
ttgttcttct agcctggaga 20
<210> 462
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 462
ttcttttgtt cttctagcct 20
<210> 463
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 463
tgacaagata ttcttttgtt 20
<210> 464
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 464
atctctttga aattctgaca 20
<210> 465
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 465
aacaaattca tttaaatctc 20
<210> 466
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 466
ttcctccaac cataaaacaa 20
<210> 467
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 467
agcaatgtta tctgcttcct 20
<210> 468
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 468
ttcaagtggg atactagcaa 20
<210> 469
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 469
ctgctctttt ccaggttcaa 20
<210> 470
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 470
cttttctttt agttgctgct 20
<210> 471
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 471
cttgacttgc tcaagctttt 20
<210> 472
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 472
attaccttga cttgctcaag 20
<210> 473
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 473
ataaaattac cttgacttgc 20
<210> 474
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 474
agaaaataaa attaccttga 20
<210> 475
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 475
atttgagaaa ataaaattac 20
<210> 476
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 476
gggggatttg agaaaataaa 20
<210> 477
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 477
ctgaaacaga caaatgcaac aacgt 25
<210> 478
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 478
agtaactgaa acagacaaat gcaac 25
<210> 479
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 479
ccaccagtaa ctgaaacaga caaat 25
<210> 480
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 480
ctcttccacc agtaactgaa acaga 25
<210> 481
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 481
ggcaactctt ccaccagtaa ctgaa 25
<210> 482
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 482
gcaggggcaa ctcttccacc agtaa 25
<210> 483
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 483
ctggcgcagg ggcaactctt ccacc 25
<210> 484
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 484
tttaattgtt tgagaattcc ctggc 25
<210> 485
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 485
ttgtttgaga attccctggc gcagg 25
<210> 486
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 486
gcacgggtcc tccagtttca tttaa 25
<210> 487
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 487
tccagtttca tttaattgtt tgaga 25
<210> 488
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 488
gcttatggga gcacttacaa gcacg 25
<210> 489
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 489
tacaagcacg ggtcctccag tttca 25
<210> 490
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 490
agtttatctt gctcttctgg gctta 25
<210> 491
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 491
tctgcttgag cttattttca agttt 25
<210> 492
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 492
atcttgctct tctgggctta tggga 25
<210> 493
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 493
ctttatccac tggagatttg tctgc 25
<210> 494
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 494
cttattttca agtttatctt gctct 25
<210> 495
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 495
ctaaccttta tccactggag atttg 25
<210> 496
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 496
atttgtctgc ttgagcttat tttca 25
<210> 497
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 497
aatgtctaac ctttatccac tggag 25
<210> 498
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 498
tggttaatgt ctaaccttta tccac 25
<210> 499
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 499
agagatggtt aatgtctaac cttta 25
<210> 500
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 500
acggaagaga tggttaatgt ctaac 25
<210> 501
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 501
acagacaaat gcaacaacgt 20
<210> 502
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 502
ctgaaacaga caaatgcaac 20
<210> 503
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 503
agtaactgaa acagacaaat 20
<210> 504
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 504
ccaccagtaa ctgaaacaga 20
<210> 505
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 505
ctcttccacc agtaactgaa 20
<210> 506
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 506
ggcaactctt ccaccagtaa 20
<210> 507
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 507
ctggcgcagg ggcaactctt 20
<210> 508
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 508
ttgtttgaga attccctggc 20
<210> 509
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 509
tccagtttca tttaattgtt 20
<210> 510
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 510
tacaagcacg ggtcctccag 20
<210> 511
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 511
gcttatggga gcacttacaa 20
<210> 512
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 512
atcttgctct tctgggctta 20
<210> 513
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 513
cttattttca agtttatctt 20
<210> 514
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 514
atttgtctgc ttgagcttat 20
<210> 515
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 515
ctttatccac tggagatttg 20
<210> 516
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 516
ctaaccttta tccactggag 20
<210> 517
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 517
aatgtctaac ctttatccac 20
<210> 518
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 518
tggttaatgt ctaaccttta 20
<210> 519
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 519
agagatggtt aatgtctaac 20
<210> 520
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 520
acggaagaga tggttaatgt 20
<210> 521
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 521
ctgaaaggaa aatacatttt aaaaa 25
<210> 522
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 522
cctgaaagga aaatacattt taaaa 25
<210> 523
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 523
gaaacctgaa aggaaaatac atttt 25
<210> 524
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 524
ggaaacctga aaggaaaata cattt 25
<210> 525
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 525
ctctggaaac ctgaaaggaa aatac 25
<210> 526
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 526
gctctggaaa cctgaaagga aaata 25
<210> 527
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 527
taaagctctg gaaacctgaa aggaa 25
<210> 528
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 528
gtaaagctct ggaaacctga aagga 25
<210> 529
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 529
tcaggtaaag ctctggaaac ctgaa 25
<210> 530
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 530
ctcaggtaaa gctctggaaa cctga 25
<210> 531
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 531
gtttctcagg taaagctctg gaaac 25
<210> 532
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 532
tgtttctcag gtaaagctct ggaaa 25
<210> 533
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 533
aatttctcct tgtttctcag gtaaa 25
<210> 534
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 534
tttgagcttc aatttctcct tgttt 25
<210> 535
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 535
ttttatttga gcttcaattt ctcct 25
<210> 536
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 536
aagctgccca aggtctttta tttga 25
<210> 537
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 537
aggtcttcaa gctttttttc aagct 25
<210> 538
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 538
ttcaagcttt ttttcaagct gccca 25
<210> 539
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 539
gatgatttaa ctgctcttca aggtc 25
<210> 540
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 540
ctgctcttca aggtcttcaa gcttt 25
<210> 541
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 541
aggagataac cacagcagca gatga 25
<210> 542
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 542
cagcagatga tttaactgct cttca 25
<210> 543
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 543
atttccaact gattcctaat aggag 25
<210> 544
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 544
cttggtttgg ttggttataa atttc 25
<210> 545
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 545
caactgattc ctaataggag ataac 25
<210> 546
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 546
cttaacgtca aatggtcctt cttgg 25
<210> 547
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 547
ttggttataa atttccaact gattc 25
<210> 548
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 548
cctaccttaa cgtcaaatgg tcctt 25
<210> 549
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 549
tccttcttgg tttggttggt tataa 25
<210> 550
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 550
agttccctac cttaacgtca aatgg 25
<210> 551
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 551
caaaaagttc cctaccttaa cgtca 25
<210> 552
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 552
taaagcaaaa agttccctac cttaa 25
<210> 553
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 553
atatttaaag caaaaagttc cctac 25
<210> 554
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 554
aggaaaatac attttaaaaa 20
<210> 555
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 555
aaggaaaata cattttaaaa 20
<210> 556
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 556
cctgaaagga aaatacattt 20
<210> 557
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 557
ggaaacctga aaggaaaata 20
<210> 558
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 558
gctctggaaa cctgaaagga 20
<210> 559
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 559
gtaaagctct ggaaacctga 20
<210> 560
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 560
ctcaggtaaa gctctggaaa 20
<210> 561
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 561
aatttctcct tgtttctcag 20
<210> 562
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 562
ttttatttga gcttcaattt 20
<210> 563
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 563
aagctgccca aggtctttta 20
<210> 564
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 564
ttcaagcttt ttttcaagct 20
<210> 565
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 565
ctgctcttca aggtcttcaa 20
<210> 566
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 566
cagcagatga tttaactgct 20
<210> 567
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 567
aggagataac cacagcagca 20
<210> 568
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 568
caactgattc ctaataggag 20
<210> 569
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 569
ttggttataa atttccaact 20
<210> 570
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 570
tccttcttgg tttggttggt 20
<210> 571
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 571
cttaacgtca aatggtcctt 20
<210> 572
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 572
cctaccttaa cgtcaaatgg 20
<210> 573
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 573
agttccctac cttaacgtca 20
<210> 574
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 574
caaaaagttc cctaccttaa 20
<210> 575
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 575
taaagcaaaa agttccctac 20
<210> 576
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 576
atatttaaag caaaaagttc 20
<210> 577
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 577
ctggggaaaa gaacccatat agtgc 25
<210> 578
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 578
tcctggggaa aagaacccat atagt 25
<210> 579
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 579
gtttcctggg gaaaagaacc catat 25
<210> 580
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 580
cagtttcctg gggaaaagaa cccat 25
<210> 581
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 581
tttcagtttc ctggggaaaa gaacc 25
<210> 582
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 582
tatttcagtt tcctggggaa aagaa 25
<210> 583
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 583
tgctatttca gtttcctggg gaaaa 25
<210> 584
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 584
actgctattt cagtttcctg gggaa 25
<210> 585
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 585
tgaactgcta tttcagtttc ctggg 25
<210> 586
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 586
cttgaactgc tatttcagtt tcctg 25
<210> 587
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 587
tagcttgaac tgctatttca gtttc 25
<210> 588
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 588
tttagcttga actgctattt cagtt 25
<210> 589
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 589
ttccacatcc ggttgtttag cttga 25
<210> 590
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 590
tgccctttag acaaaatctc ttcca 25
<210> 591
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 591
tttagacaaa atctcttcca catcc 25
<210> 592
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 592
gtttttcctt gtacaaatgc tgccc 25
<210> 593
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 593
gtacaaatgc tgccctttag acaaa 25
<210> 594
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 594
cttcactggc tgagtggctg gtttt 25
<210> 595
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 595
ggctggtttt tccttgtaca aatgc 25
<210> 596
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 596
attaccttca ctggctgagt ggctg 25
<210> 597
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 597
gcttcattac cttcactggc tgagt 25
<210> 598
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 598
aggttgcttc attaccttca ctggc 25
<210> 599
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 599
gctagaggtt gcttcattac cttca 25
<210> 600
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 600
atattgctag aggttgcttc attac 25
<210> 601
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 601
gaaaagaacc catatagtgc 20
<210> 602
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 602
gggaaaagaa cccatatagt 20
<210> 603
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 603
tcctggggaa aagaacccat 20
<210> 604
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 604
cagtttcctg gggaaaagaa 20
<210> 605
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 605
tatttcagtt tcctggggaa 20
<210> 606
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 606
actgctattt cagtttcctg 20
<210> 607
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 607
cttgaactgc tatttcagtt 20
<210> 608
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 608
tttagcttga actgctattt 20
<210> 609
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 609
ttccacatcc ggttgtttag 20
<210> 610
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 610
tttagacaaa atctcttcca 20
<210> 611
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 611
gtacaaatgc tgccctttag 20
<210> 612
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 612
ggctggtttt tccttgtaca 20
<210> 613
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 613
cttcactggc tgagtggctg 20
<210> 614
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 614
attaccttca ctggctgagt 20
<210> 615
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 615
gcttcattac cttcactggc 20
<210> 616
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 616
aggttgcttc attaccttca 20
<210> 617
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 617
gctagaggtt gcttcattac 20
<210> 618
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 618
atattgctag aggttgcttc 20
<210> 619
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 619
ctttaacaga aaagcataca catta 25
<210> 620
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 620
tcctctttaa cagaaaagca tacac 25
<210> 621
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 621
ttcctcttta acagaaaagc ataca 25
<210> 622
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 622
taacttcctc tttaacagaa aagca 25
<210> 623
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 623
ctaacttcct ctttaacaga aaagc 25
<210> 624
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 624
tcttctaact tcctctttaa cagaa 25
<210> 625
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 625
atcttctaac ttcctcttta acaga 25
<210> 626
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 626
tcagatcttc taacttcctc tttaa 25
<210> 627
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 627
ctcagatctt ctaacttcct cttta 25
<210> 628
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 628
agagctcaga tcttctaact tcctc 25
<210> 629
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 629
cagagctcag atcttctaac ttcct 25
<210> 630
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 630
cactcagagc tcagatcttc tact 24
<210> 631
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 631
ccttccactc agagctcaga tcttc 25
<210> 632
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 632
gtaaacggtt taccgccttc cactc 25
<210> 633
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 633
ctttgccctc agctcttgaa gtaaa 25
<210> 634
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 634
ccctcagctc ttgaagtaaa cggtt 25
<210> 635
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 635
ccaggagcta ggtcaggctg ctttg 25
<210> 636
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 636
ggtcaggctg ctttgccctc agctc 25
<210> 637
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 637
aggctccaat agtggtcagt ccagg 25
<210> 638
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 638
tcagtccagg agctaggtca ggctg 25
<210> 639
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 639
cttacaggct ccaatagtgg tcagt 25
<210> 640
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 640
gtatacttac aggctccaat agtgg 25
<210> 641
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 641
atccagtata cttacaggct ccaat 25
<210> 642
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 642
atgggatcca gtatacttac aggct 25
<210> 643
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 643
agagaatggg atccagtata cttac 25
<210> 644
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 644
acagaaaagc atacacatta 20
<210> 645
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 645
tttaacagaa aagcatacac 20
<210> 646
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 646
tcctctttaa cagaaaagca 20
<210> 647
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 647
taacttcctc tttaacagaa 20
<210> 648
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 648
tcttctaact tcctctttaa 20
<210> 649
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 649
tcagatcttc taacttcctc 20
<210> 650
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 650
ccttccactc agagctcaga 20
<210> 651
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 651
gtaaacggtt taccgccttc 20
<210> 652
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 652
ccctcagctc ttgaagtaaa 20
<210> 653
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 653
ggtcaggctg ctttgccctc 20
<210> 654
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 654
tcagtccagg agctaggtca 20
<210> 655
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 655
aggctccaat agtggtcagt 20
<210> 656
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 656
cttacaggct ccaatagtgg 20
<210> 657
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 657
gtatacttac aggctccaat 20
<210> 658
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 658
atccagtata cttacaggct 20
<210> 659
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 659
atgggatcca gtatacttac 20
<210> 660
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 660
agagaatggg atccagtata 20
<210> 661
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 661
ctaaaatatt ttgggttttt gcaaaa 26
<210> 662
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 662
gctaaaatat tttgggtttt tgcaaa 26
<210> 663
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 663
taggagctaa aatattttgg gttttt 26
<210> 664
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 664
agtaggagct aaaatatttt gggtt 25
<210> 665
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 665
tgagtaggag ctaaaatatt ttggg 25
<210> 666
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 666
ctgagtagga gctaaaatat tttggg 26
<210> 667
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 667
cagtctgagt aggagctaaa atatt 25
<210> 668
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 668
acagtctgag taggagctaa aatatt 26
<210> 669
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 669
gagtaacagt ctgagtagga gctaaa 26
<210> 670
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 670
cagagtaaca gtctgagtag gagct 25
<210> 671
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 671
caccagagta acagtctgag taggag 26
<210> 672
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 672
gtcaccagag taacagtctg agtag 25
<210> 673
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 673
aaccacaggt tgtgtcacca gagtaa 26
<210> 674
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 674
gttgtgtcac cagagtaaca gtctg 25
<210> 675
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 675
tggcagtttc cttagtaacc acaggt 26
<210> 676
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 676
atttctagtt tggagatggc agtttc 26
<210> 677
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 677
ggaagatggc atttctagtt tggag 25
<210> 678
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 678
catcaaggaa gatggcattt ctagtt 26
<210> 679
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 679
gagcaggtac ctccaacatc aaggaa 26
<210> 680
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 680
atctgccaga gcaggtacct ccaac 25
<210> 681
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 681
aagttctgtc caagcccggt tgaaat 26
<210> 682
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 682
cggttgaaat ctgccagagc aggtac 26
<210> 683
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 683
gagaaagcca gtcggtaagt tctgtc 26
<210> 684
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 684
gtcggtaagt tctgtccaag cccgg 25
<210> 685
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 685
ataacttgat caagcagaga aagcca 26
<210> 686
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 686
aagcagagaa agccagtcgg taagt 25
<210> 687
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 687
caccctctgt gattttataa cttgat 26
<210> 688
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 688
caaggtcacc caccatcacc ctctgt 26
<210> 689
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 689
catcaccctc tgtgatttta taact 25
<210> 690
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 690
cttctgcttg atgatcatct cgttga 26
<210> 691
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 691
ccttctgctt gatgatcatc tcgttg 26
<210> 692
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 692
atctcgttga tatcctcaag gtcacc 26
<210> 693
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 693
tcataccttc tgcttgatga tcatct 26
<210> 694
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 694
tcattttttc tcataccttc tgcttg 26
<210> 695
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 695
ttttctcata ccttctgctt gatgat 26
<210> 696
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 696
ttttatcatt ttttctcata ccttct 26
<210> 697
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 697
ccaactttta tcattttttc tcatac 26
<210> 698
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 698
atattttggg tttttgcaaa 20
<210> 699
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 699
aaaatatttt gggtttttgc 20
<210> 700
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 700
gagctaaaat attttgggtt 20
<210> 701
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 701
agtaggagct aaaatatttt 20
<210> 702
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 702
gtctgagtag gagctaaaat 20
<210> 703
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 703
taacagtctg agtaggagct 20
<210> 704
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 704
cagagtaaca gtctgagtag 20
<210> 705
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 705
cacaggttgt gtcaccagag 20
<210> 706
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 706
agtttcctta gtaaccacag 20
<210> 707
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 707
tagtttggag atggcagttt 20
<210> 708
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 708
ggaagatggc atttctagtt 20
<210> 709
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 709
tacctccaac atcaaggaag 20
<210> 710
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 710
atctgccaga gcaggtacct 20
<210> 711
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 711
ccaagcccgg ttgaaatctg 20
<210> 712
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 712
gtcggtaagt tctgtccaag 20
<210> 713
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 713
aagcagagaa agccagtcgg 20
<210> 714
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 714
ttttataact tgatcaagca 20
<210> 715
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 715
catcaccctc tgtgatttta 20
<210> 716
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 716
ctcaaggtca cccaccatca 20
<210> 717
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 717
catctcgttg atatcctcaa 20
<210> 718
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 718
cttctgcttg atgatcatct 20
<210> 719
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 719
cataccttct gcttgatgat 20
<210> 720
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 720
tttctcatac cttctgcttg 20
<210> 721
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 721
cattttttct cataccttct 20
<210> 722
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 722
tttatcattt tttctcatac 20
<210> 723
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 723
caacttttat cattttttct 20
<210> 724
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 724
ctgtaagaac aaatatccct tagta 25
<210> 725
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 725
tgcctgtaag aacaaatatc cctta 25
<210> 726
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 726
gttgcctgta agaacaaata tccct 25
<210> 727
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 727
attgttgcct gtaagaacaa atatc 25
<210> 728
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 728
gcattgttgc ctgtaagaac aaata 25
<210> 729
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 729
cctgcattgt tgcctgtaag aacaa 25
<210> 730
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 730
atcctgcatt gttgcctgta agaac 25
<210> 731
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 731
caaatcctgc attgttgcct gtaag 25
<210> 732
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 732
tccaaatcct gcattgttgc ctgta 25
<210> 733
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 733
tgttccaaat cctgcattgt tgcct 25
<210> 734
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 734
tctgttccaa atcctgcatt gttgc 25
<210> 735
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 735
aactggggac gcctctgttc caaat 25
<210> 736
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 736
gcctctgttc caaatcctgc attgt 25
<210> 737
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 737
cagcggtaat gagttcttcc aactg 25
<210> 738
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 738
cttccaactg gggacgcctc tgttc 25
<210> 739
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 739
cttgtttttc aaattttggg cagcg 25
<210> 740
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 740
ctagcctctt gattgctggt cttgt 25
<210> 741
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 741
ttttcaaatt ttgggcagcg gtaat 25
<210> 742
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 742
ttcgatccgt aatgattgtt ctagc 25
<210> 743
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 743
gattgctggt cttgtttttc aaatt 25
<210> 744
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 744
cttacttcga tccgtaatga ttgtt 25
<210> 745
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 745
ttgttctagc ctcttgattg ctggt 25
<210> 746
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 746
aaaaacttac ttcgatccgt aatga 25
<210> 747
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 747
tgttaaaaaa cttacttcga tccgt 25
<210> 748
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 748
atgcttgtta aaaaacttac ttcga 25
<210> 749
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 749
gtcccatgct tgttaaaaaa cttac 25
<210> 750
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 750
agaacaaata tcccttagta 20
<210> 751
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 751
gtaagaacaa atatccctta 20
<210> 752
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 752
tgcctgtaag aacaaatatc 20
<210> 753
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 753
attgttgcct gtaagaacaa 20
<210> 754
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 754
cctgcattgt tgcctgtaag 20
<210> 755
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 755
caaatcctgc attgttgcct 20
<210> 756
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 756
gcctctgttc caaatcctgc 20
<210> 757
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 757
cttccaactg gggacgcctc 20
<210> 758
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 758
cagcggtaat gagttcttcc 20
<210> 759
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 759
ttttcaaatt ttgggcagcg 20
<210> 760
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 760
gattgctggt cttgtttttc 20
<210> 761
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 761
ttgttctagc ctcttgattg 20
<210> 762
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 762
ttcgatccgt aatgattgtt 20
<210> 763
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 763
cttacttcga tccgtaatga 20
<210> 764
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 764
aaaaacttac ttcgatccgt 20
<210> 765
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 765
tgttaaaaaa cttacttcga 20
<210> 766
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 766
atgcttgtta aaaaacttac 20
<210> 767
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 767
gtcccatgct tgttaaaaaa 20
<210> 768
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 768
ctagaataaa aggaaaaata aatat 25
<210> 769
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 769
aactagaata aaaggaaaaa taaat 25
<210> 770
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 770
ttcaactaga ataaaaggaa aaata 25
<210> 771
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 771
ctttcaacta gaataaaagg aaaaa 25
<210> 772
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 772
attctttcaa ctagaataaa aggaa 25
<210> 773
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 773
gaattctttc aactagaata aaagg 25
<210> 774
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 774
tctgaattct ttcaactaga ataaa 25
<210> 775
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 775
attctgaatt ctttcaacta gaata 25
<210> 776
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 776
ctgattctga attctttcaa ctaga 25
<210> 777
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 777
cactgattct gaattctttc aacta 25
<210> 778
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 778
tcccactgat tctgaattct ttcaa 25
<210> 779
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 779
catcccactg attctgaatt ctttc 25
<210> 780
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 780
tacttcatcc cactgattct gaatt 25
<210> 781
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 781
ctgaaggtgt tcttgtactt catcc 25
<210> 782
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 782
cggttctgaa ggtgttcttg tact 24
<210> 783
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 783
ctgttgcctc cggttctgaa ggtgt 25
<210> 784
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 784
tttcattcaa ctgttgcctc cggtt 25
<210> 785
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 785
taacatttca ttcaactgtt gcctc 25
<210> 786
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 786
ttgtgttgaa tcctttaaca tttca 25
<210> 787
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 787
tcttccttag cttccagcca ttgtg 25
<210> 788
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 788
cttagcttcc agccattgtg ttgaa 25
<210> 789
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 789
gtcctaagac ctgctcagct tcttc 25
<210> 790
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 790
ctgctcagct tcttccttag cttcc 25
<210> 791
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 791
ctcaagcttg gctctggcct gtcct 25
<210> 792
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 792
ggcctgtcct aagacctgct cagct 25
<210> 793
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 793
tagggaccct ccttccatga ctcaa 25
<210> 794
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 794
tttggattgc atctactgta taggg 25
<210> 795
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 795
accctccttc catgactcaa gcttg 25
<210> 796
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 796
cttggtttct gtgattttct tttgg 25
<210> 797
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 797
atctactgta tagggaccct ccttc 25
<210> 798
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 798
ctaaccttgg tttctgtgat tttct 25
<210> 799
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 799
tttcttttgg attgcatcta ctgta 25
<210> 800
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 800
tgatactaac cttggtttct gtgat 25
<210> 801
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 801
atctttgata ctaaccttgg tttct 25
<210> 802
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 802
aaggtatctt tgatactaac cttgg 25
<210> 803
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 803
ttaaaaaggt atctttgata ctaac 25
<210> 804
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 804
ataaaaggaa aaataaatat 20
<210> 805
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 805
gaataaaagg aaaaataaat 20
<210> 806
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 806
aactagaata aaaggaaaaa 20
<210> 807
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 807
ctttcaacta gaataaaagg 20
<210> 808
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 808
gaattctttc aactagaata 20
<210> 809
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 809
attctgaatt ctttcaacta 20
<210> 810
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 810
tacttcatcc cactgattct 20
<210> 811
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 811
ctgaaggtgt tcttgtact 19
<210> 812
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 812
ctgttgcctc cggttctgaa 20
<210> 813
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 813
taacatttca ttcaactgtt 20
<210> 814
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 814
ttgtgttgaa tcctttaaca 20
<210> 815
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 815
cttagcttcc agccattgtg 20
<210> 816
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 816
ctgctcagct tcttccttag 20
<210> 817
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 817
ggcctgtcct aagacctgct 20
<210> 818
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 818
ctcaagcttg gctctggcct 20
<210> 819
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 819
accctccttc catgactcaa 20
<210> 820
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 820
atctactgta tagggaccct 20
<210> 821
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 821
tttcttttgg attgcatcta 20
<210> 822
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 822
cttggtttct gtgattttct 20
<210> 823
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 823
ctaaccttgg tttctgtgat 20
<210> 824
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 824
tgatactaac cttggtttct 20
<210> 825
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 825
atctttgata ctaaccttgg 20
<210> 826
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 826
aaggtatctt tgatactaac 20
<210> 827
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 827
ttaaaaaggt atctttgata 20
<210> 828
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 828
ctatagattt ttatgagaaa gaga 24
<210> 829
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 829
aactgctata gatttttatg agaaa 25
<210> 830
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 830
tggccaactg ctatagattt ttatg 25
<210> 831
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 831
gtctttggcc aactgctata gattt 25
<210> 832
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 832
cggaggtctt tggccaactg ctata 25
<210> 833
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 833
actggcggag gtctttggcc aactg 25
<210> 834
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 834
tttgtctgcc actggcggag gtctt 25
<210> 835
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 835
agtcatttgc cacatctaca tttgt 25
<210> 836
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 836
tttgccacat ctacatttgt ctgcc 25
<210> 837
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 837
ccggagaagt ttcagggcca agtca 25
<210> 838
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 838
gtatcatctg cagaataatc ccgga 25
<210> 839
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 839
taatcccgga gaagtttcag ggcca 25
<210> 840
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 840
ttatcatgtg gacttttctg gtatc 25
<210> 841
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 841
agaggcattg atattctctg ttatc 25
<210> 842
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 842
atgtggactt ttctggtatc atctg 25
<210> 843
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 843
cttttatgaa tgcttctcca agagg 25
<210> 844
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 844
atattctctg ttatcatgtg gactt 25
<210> 845
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 845
catacctttt atgaatgctt ctcca 25
<210> 846
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 846
ctccaagagg cattgatatt ctctg 25
<210> 847
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 847
taattcatac cttttatgaa tgctt 25
<210> 848
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 848
cttttatgaa tgcttctcca agagg 25
<210> 849
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 849
taatgtaatt catacctttt atgaa 25
<210> 850
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 850
agaaataatg taattcatac ctttt 25
<210> 851
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 851
gttttagaaa taatgtaatt catac 25
<210> 852
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 852
gatttttatg agaaagaga 19
<210> 853
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 853
ctatagattt ttatgagaaa 20
<210> 854
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 854
aactgctata gatttttatg 20
<210> 855
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 855
tggccaactg ctatagattt 20
<210> 856
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 856
gtctttggcc aactgctata 20
<210> 857
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 857
cggaggtctt tggccaactg 20
<210> 858
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 858
tttgtctgcc actggcggag 20
<210> 859
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 859
tttgccacat ctacatttgt 20
<210> 860
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 860
ttcagggcca agtcatttgc 20
<210> 861
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 861
taatcccgga gaagtttcag 20
<210> 862
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 862
gtatcatctg cagaataatc 20
<210> 863
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 863
atgtggactt ttctggtatc 20
<210> 864
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 864
atattctctg ttatcatgtg 20
<210> 865
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 865
ctccaagagg cattgatatt 20
<210> 866
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 866
cttttatgaa tgcttctcca 20
<210> 867
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 867
catacctttt atgaatgctt 20
<210> 868
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 868
taattcatac cttttatgaa 20
<210> 869
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 869
taatgtaatt catacctttt 20
<210> 870
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 870
agaaataatg taattcatac 20
<210> 871
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 871
gttttagaaa taatgtaatt 20
<210> 872
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 872
ctgcaaagga ccaaatgttc agatg 25
<210> 873
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 873
tcaccctgca aaggaccaaa tgttc 25
<210> 874
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 874
ctcactcacc ctgcaaagga ccaaa 25
<210> 875
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 875
tctcgctcac tcaccctgca aagga 25
<210> 876
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 876
cagcctctcg ctcactcacc ctgca 25
<210> 877
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 877
caaagcagcc tctcgctcac tcacc 25
<210> 878
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 878
tcttccaaag cagcctctcg ctcac 25
<210> 879
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 879
tctatgagtt tcttccaaag cagcc 25
<210> 880
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 880
gttgcagtaa tctatgagtt tcttc 25
<210> 881
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 881
gaactgttgc agtaatctat gagtt 25
<210> 882
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 882
ttccaggtcc agggggaact gttgc 25
<210> 883
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 883
gtaagccagg caagaaactt ttcca 25
<210> 884
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 884
ccaggcaaga aacttttcca ggtcc 25
<210> 885
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 885
tggcagttgt ttcagcttct gtaag 25
<210> 886
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 886
ttcagcttct gtaagccagg caaga 25
<210> 887
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 887
ggtagcatcc tgtaggacat tggca 25
<210> 888
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 888
gacattggca gttgtttcag cttct 25
<210> 889
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 889
tctaggagcc tttccttacg ggtag 25
<210> 890
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 890
cttttactcc cttggagtct tctag 25
<210> 891
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 891
gagcctttcc ttacgggtag catcc 25
<210> 892
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 892
ttgccattgt ttcatcagct ctttt 25
<210> 893
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 893
cttggagtct tctaggagcc tttcc 25
<210> 894
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 894
cttacttgcc attgtttcat cagct 25
<210> 895
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 895
cagctctttt actcccttgg agtct 25
<210> 896
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 896
cctgacttac ttgccattgt ttcat 25
<210> 897
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 897
aaatgcctga cttacttgcc attgt 25
<210> 898
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 898
agcggaaatg cctgacttac ttgcc 25
<210> 899
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 899
gctaaagcgg aaatgcctga cttac 25
<210> 900
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 900
aaggaccaaa tgttcagatg 20
<210> 901
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 901
ctgcaaagga ccaaatgttc 20
<210> 902
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 902
tcaccctgca aaggaccaaa 20
<210> 903
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 903
ctcactcacc ctgcaaagga 20
<210> 904
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 904
tctcgctcac tcaccctgca 20
<210> 905
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 905
cagcctctcg ctcactcacc 20
<210> 906
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 906
caaagcagcc tctcgctcac 20
<210> 907
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 907
tctatgagtt tcttccaaag 20
<210> 908
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 908
gaactgttgc agtaatctat 20
<210> 909
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 909
ttccaggtcc agggggaact 20
<210> 910
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 910
ccaggcaaga aacttttcca 20
<210> 911
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 911
ttcagcttct gtaagccagg 20
<210> 912
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 912
gacattggca gttgtttcag 20
<210> 913
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 913
ggtagcatcc tgtaggacat 20
<210> 914
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 914
gagcctttcc ttacgggtag 20
<210> 915
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 915
cttggagtct tctaggagcc 20
<210> 916
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 916
cagctctttt actcccttgg 20
<210> 917
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 917
ttgccattgt ttcatcagct 20
<210> 918
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 918
cttacttgcc attgtttcat 20
<210> 919
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 919
cctgacttac ttgccattgt 20
<210> 920
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 920
aaatgcctga cttacttgcc 20
<210> 921
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 921
agcggaaatg cctgacttac 20
<210> 922
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 922
gctaaagcgg aaatgcctga 20
<210> 923
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 923
ccactcagag ctcagatctt ctaacttcc 29
<210> 924
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 924
gggatccagt atacttacag gctcc 25
<210> 925
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 925
cttccactca gagctcagat cttctaa 27
<210> 926
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 926
acatcaagga agatggcatt tctagtttgg 30
<210> 927
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 927
ctccaacatc aaggaagatg gcatttctag 30
<210> 928
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 928
ttctgtccaa gcccggttga aatc 24
<210> 929
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 929
cacccaccat caccctcygt g 21
<210> 930
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 930
atcatctcgt tgatatcctc aa 22
<210> 931
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 931
acatcaagga agatggcatt tctag 25
<210> 932
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 932
accagagtaa cagtctgagt aggagc 26
<210> 933
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 933
tcaaggaaga tggcatttct 20
<210> 934
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 934
cctctgtgat tttataactt gat 23
<210> 935
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 935
atcatttttt ctcatacctt ctgct 25
<210> 936
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 936
ctcatacctt ctgcttgatg atc 23
<210> 937
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 937
tggcatttct agtttgg 17
<210> 938
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 938
ccagagcagg tacctccaac atc 23
<210> 939
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 939
tgttcagctt ctgttagcca ctga 24
<210> 940
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 940
tttgtgtctt tctgagaaac 20
<210> 941
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 941
cgccgccatt tctcaacag 19
<210> 942
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 942
atctgtcaaa tcgcctgcag 20
<210> 943
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 943
tgtttttgag gattgctgaa 20
<210> 944
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 944
gctgaattat ttcttcccc 19
<210> 945
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 945
gcccaatgcc atcctgg 17
<210> 946
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 946
ccaatgccat cctggagttc ctgtaa 26
<210> 947
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 947
cattcaactg ttgcctccgg ttctgaaggt g 31
<210> 948
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 948
ctgaaggtgt tcttgtactt catcc 25
<210> 949
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 949
ctgttgcctc cggttctg 18
<210> 950
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 950
attctttcaa ctagaataaa ag 22
<210> 951
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 951
gccatcctgg agttcctgta agataccaaa 30
<210> 952
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 952
ccaatgccat cctggagttc ctgtaagata 30
<210> 953
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 953
gccgctgccc aatgccatcc tggagttcct 30
<210> 954
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 954
gtttgccgct gcccaatgcc atcctggagt 30
<210> 955
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 955
caacagtttg ccgctgccca atgccatcct 30
<210> 956
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 956
ctgacaacag tttgccgctg cccaatgcca 30
<210> 957
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 957
tgttctgaca acagtttgcc gctgcccaat 30
<210> 958
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 958
caatgttctg acaacagttt gccgctgccc 30
<210> 959
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 959
cattcaatgt tctgacaaca gtttgccgct 30
<210> 960
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 960
tatttcttcc ccagttgcat tcaatgttct 30
<210> 961
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 961
gctgaattat ttcttcccca gttgcattca 30
<210> 962
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 962
ggattgctga attatttctt ccccagttgc 30
<210> 963
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 963
tttgaggatt gctgaattat ttcttcccca 30
<210> 964
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 964
gtacttcatc ccactgattc tgaattcttt 30
<210> 965
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 965
tcttgtactt catcccactg attctgaatt 30
<210> 966
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 966
tgttcttgta cttcatccca ctgattctga 30
<210> 967
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 967
cggttctgaa ggtgttcttg tacttcatcc 30
<210> 968
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 968
ctccggttct gaaggtgttc ttgtacttca 30
<210> 969
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 969
tgcctccggt tctgaaggtg ttcttgtact 30
<210> 970
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 970
tgttgcctcc ggttctgaag gtgttcttgt 30
<210> 971
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 971
aactgttgcc tccggttctg aaggtgttct 30
<210> 972
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 972
ttcaactgtt gcctccggtt ctgaaggtgt 30
<210> 973
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
肽
<400> 973
Gly Gly Phe Gly
1
<210> 974
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
肽
<400> 974
Ala Leu Ala Leu
1
<210> 975
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
肽
<400> 975
Gly Phe Leu Gly
1
<210> 976
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 976
gggaaattac agaatcacat aaaaac 26
<210> 977
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 977
gggaaattac aggctctgca aagttcttt 29

Claims (77)

1.一种治疗疾病或病症的方法，其包括：
向受试者施用多核酸分子缀合物；其中所述多核酸分子缀合物包含靶细胞结合部分和靶向的前mRNA特异性剪接调节多核酸部分；
其中所述靶细胞结合部分与靶向的细胞特异性结合，并且所述靶向的前mRNA特异性剪接调节多核酸部分在所述靶向的细胞中诱导靶向的前mRNA转录物的插入、缺失、复制或改变，以在所述靶向的前mRNA转录物中诱导剪接事件，从而生成mRNA转录物；并且其中所述mRNA转录物编码与未处理的靶细胞中的相同蛋白质相比得到修饰的蛋白质，从而治疗所述受试者的所述疾病或病症。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述剪接事件是外显子跳读。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述剪接事件是外显子包含。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述疾病或病症的特征还在于所述前mRNA中的一个或多个突变。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述疾病或病症包括神经肌肉疾病、遗传病、癌症、遗传性疾病或心血管疾病。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述疾病或病症是肌营养不良症。
7.根据权利要求5所述的方法，其中所述疾病或病症是杜氏肌营养不良症。
8.根据权利要求1所述的方法，其中所述剪接事件是DMD基因的外显子8、23、35、43、44、45、50、51、52、53或55的剪接事件。
9.根据权利要求1所述的方法，其中所述剪接事件是DMD基因的外显子23的剪接事件。
10.根据权利要求1所述的方法，其中所述剪接事件是PAH、MSTN或K-Ras基因的外显子的剪接事件。
11.根据权利要求1所述的方法，其中所述多核酸分子缀合物包含式(I)的结构：
A-X-B
式I
其中，
A包含结合部分；
B由多核苷酸组成；且
X由键或第一连接体组成。
12.根据权利要求1所述的方法，其中所述多核酸分子缀合物包含式(II)的结构：
A-X-B-Y-C
式II
其中，
A包含结合部分；
B由多核苷酸组成；
C由聚合物组成；
X由键或第一连接体组成；且
Y由键或第二连接体组成。
13.根据权利要求1所述的方法，其中所述多核酸分子缀合物包含式(III)的结构：
A-X-C-Y-B
式III
其中，
A包含结合部分；
B由多核苷酸组成；
C由聚合物组成；
X由键或第一连接体组成；且
Y由键或第二连接体组成。
14.根据权利要求1所述的方法，其中所述多核酸分子缀合物任选地包含至少一个2’修饰的核苷酸、至少一个修饰的核苷酸间连接、或至少一个反向脱碱基部分。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述至少一个2’修饰的核苷酸包括吗啉代、2’-O-甲基、2’-O-甲氧基乙基(2’-O-MOE)、2’-O-氨基丙基、2’-脱氧、T-脱氧-2’-氟代、2’-O-氨基丙基(2’-O-AP)、2’-O-二甲基氨基乙基(2’-O-DMAOE)、2’-O-二甲基氨基丙基(2’-O-DMAP)、T-O-二甲基氨基乙氧基乙基(2’-O-DMAEOE)或2’-O-N-甲基乙酰胺基(2’-O-NMA)修饰的核苷酸。
16.根据权利要求14所述的方法，其中所述至少一个2’修饰的核苷酸包括锁定核酸(LNA)、亚乙基核酸(ENA)或肽核酸(PNA)。
17.根据权利要求14所述的方法，其中所述至少一个2’修饰的核苷酸包含吗啉代。
18.根据权利要求14所述所述的方法，其中所述至少一个反向碱基部分是至少一个末端。
19.根据权利要求14所述的方法，其中所述至少一个修饰的核苷酸间连接包含硫代磷酸酯连接或二硫代磷酸酯连接。
20.根据权利要求1所述的方法，其中所述多核酸分子在长度上包含至少约10至约30个核苷酸。
21.根据权利要求1所述的方法，其中所述多核酸分子包含至少约15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％的修饰。
22.根据权利要求1所述的方法，其中所述多核酸分子包含单链。
23.根据权利要求1所述的方法，其中所述多核酸分子包含两条或更多条链。
24.根据权利要求1所述的方法，其中所述多核酸分子包含第一多核苷酸和与所述第一多核苷酸杂交以形成双链多核酸分子的第二多核苷酸。
25.根据权利要求24所述的方法，其中所述第二多核苷酸包含至少一个修饰。
26.根据权利要求24所述的方法，其中所述第一多核苷酸和所述第二多核苷酸包含RNA分子。
27.根据权利要求24所述的方法，其中所述第一多核苷酸和所述第二多核苷酸包含siRNA分子。
28.根据权利要求11所述的方法，其中X为键。
29.根据权利要求12所述的方法，其中X和Y独立地为键、可降解连接体、不可降解连接体、可切割连接体或非聚合连接体基团。
30.根据权利要求13所述的方法，其中X和Y独立地为键、可降解连接体、不可降解连接体、可切割连接体或非聚合连接体基团。
31.根据权利要求11所述的方法，其中X为C1-C6烷基。
32.根据权利要求12所述的方法，其中X或Y为C1-C6烷基。
33.根据权利要求13所述的方法，其中X或Y为C1-C6烷基。
34.根据权利要求11所述的方法，其中所述结合部分是抗体或其结合片段。
35.根据权利要求12所述的方法，其中所述结合部分是抗体或其结合片段。
36.根据权利要求13所述的方法，其中所述结合部分是抗体或其结合片段。
37.根据权利要求12所述的方法，其中C为聚乙二醇。
38.根据权利要求13所述的方法，其中C为聚乙二醇。
39.根据权利要求12所述的方法，其中A-X缀合至B的5’端且Y-C缀合至B的3’端。
40.根据权利要求12所述的方法，其中Y-C缀合至B的5’端且A-X缀合至B的3’端。
41.根据权利要求12所述的方法，其进一步包括D。
42.根据权利要求41所述的方法，其中D缀合至C或A。
43.根据权利要求11所述的方法，其进一步包括至少第二结合部分A。
44.根据权利要求12所述的方法，其进一步包括至少第二结合部分A。
45.根据权利要求13所述的方法，其进一步包括至少第二结合部分A。
46.一种在靶向的前mRNA转录物中诱导剪接事件的方法，其包括：
a)使靶细胞与多核酸分子缀合物接触，其中所述多核酸分子缀合物包含靶细胞结合部分和靶向的前mRNA剪接调节多核酸部分；
b)使所述靶向的前mRNA剪接调节多核酸部分与所述靶细胞内的所述靶向的前mRNA转录物杂交，以在所述靶向的前mRNA转录物中诱导剪接事件，从而产生mRNA转录物；以及
c)任选地，在所述靶细胞中翻译步骤b)的mRNA转录物，以产生蛋白质。
47.根据权利要求46所述的方法，其中所述剪接事件是外显子跳读。
48.根据权利要求46所述的方法，其中所述剪接事件是外显子包含。
49.根据权利要求46所述的方法，其中所述靶向的前mRNA转录物诱导疾病或病症。
50.根据权利要求49所述的方法，其中所述疾病或病症包括神经肌肉疾病、遗传病、癌症、遗传性疾病或心血管疾病。
51.根据权利要求46所述的方法，其中所述多核酸分子缀合物：
a)包含式(I)的结构：
A-X-B
式I
其中，
A包含结合部分；
B由多核苷酸组成；且
X由键或第一连接体组成；
b)包含式(II)的结构：
A-X-B-Y-C
式II
其中，
A包含结合部分；
B由多核苷酸组成；
C由聚合物组成；
X由键或第一连接体组成；且
Y为键或第二连接体；或者
c)包含式(III)的结构：
A-X-C-Y-B
式III
其中，
A包含结合部分；
B由多核苷酸组成；
C由聚合物组成；
X由键或第一连接体组成；且
Y由键或第二连接体组成。
52.根据权利要求46所述的方法，其中所述多核酸分子缀合物任选地包含至少一个2’修饰的核苷酸、至少一个修饰的核苷酸间连接或至少一个反向脱碱基部分。
53.根据权利要求52所述的方法，其中所述至少一个2'修饰的核苷酸包括吗啉代、2’-O-甲基、2’-O-甲氧基乙基(2’-O-MOE)、2’-O-氨基丙基、2’-脱氧、T-脱氧-2’-氟代、2’-O-氨基丙基(2’-O-AP)、2’-O-二甲基氨基乙基(2’-O-DMAOE)、2’-O-二甲基氨基丙基(2’-O-DMAP)、T-O-二甲基氨基乙氧基乙基(2’-O-DMAEOE)或2’-O-N-甲基乙酰胺基(2’-O-NMA)修饰的核苷酸。
54.根据权利要求52所述的方法，其中所述至少一个2’修饰的核苷酸包括锁定核酸(LNA)、亚乙基核酸(ENA)、肽核酸(PNA)。
55.根据权利要求52所述的方法，其中所述至少一个2’修饰的核苷酸包含吗啉代。
56.根据权利要求52所述的方法，其中所述至少一个反向碱基部分是至少一个末端。
57.根据权利要求52所述的方法，其中所述至少一个修饰的核苷酸间连接包含硫代磷酸酯连接或二硫代磷酸酯连接。
58.根据权利要求46-57中任一项所述的方法，其中所述多核酸分子在长度上包含至少约10至约30个核苷酸。
59.根据权利要求46-58中任一项所述的方法，其中所述多核酸分子包含至少约15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％的修饰。
60.根据权利要求46-59中任一项所述的方法，其中所述多核酸分子包含至少约3、约4、约5、约6、约7、约8、约9、约10、约11、约12、约13、约14、约15、约16、约17、约18、约19、约20、约21、约22个或更多个修饰。
61.根据权利要求46-60中任一项所述的方法，其中X和Y独立地为键、可降解连接体、不可降解连接体、可切割连接体或非聚合连接体基团。
62.根据权利要求46-61中任一项所述的方法，其中X为键。
63.根据权利要求46-61中任一项所述的方法，其中X为C1-C6烷基。
64.根据权利要求46-63中任一项所述的方法，其中Y为C1-C6烷基。
65.根据权利要求46-63中任一项所述的方法，其中X为同双官能连接体或异双官能连接体，任选地缀合至C1-C6烷基。
66.根据权利要求46-63中任一项所述的方法，其中Y为同双官能连接体或异双官能连接体。
67.根据权利要求46-66中任一项所述的方法，其中所述结合部分是抗体或其结合片段。
68.根据权利要求46-67中任一项所述的方法，其中C为聚乙二醇。
69.根据权利要求46-68中任一项所述的方法，其中A-X缀合至B的5’端且Y-C缀合至B的3’端。
70.根据权利要求46-69中任一项所述的方法，其中Y-C缀合至B的5’端且A-X缀合至B的3’端。
71.根据权利要求46-70中任一项所述的方法，其中A-X、Y-C或其组合缀合至核苷酸间连接基团。
72.根据权利要求46-71中任一项所述的方法，其进一步包括D。
73.根据权利要求72所述的方法，其中D缀合至C或A。
74.根据权利要求46-73中任一项所述的方法，其进一步包括至少第二结合部分A。
75.一种多核酸分子缀合物组合物，其包含靶细胞结合部分和靶向的前mRNA特异性剪接调节多核酸部分，其中所述靶向的前mRNA特异性剪接调节多核酸部分包含与SEQ ID NO:54-972具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的序列。
76.根据权利要求75所述的组合物，其中所述多核酸分子缀合物：
a)包含式(I)的结构：
A-X-B
式I
其中，
A包含结合部分；
B由多核苷酸组成；且
X由键或第一连接体组成；
b)包含式(II)的结构：
A-X-B-Y-C
式II
其中，
A包含结合部分；
B由多核苷酸组成；
C由聚合物组成；
X由键或第一连接体组成；且
Y由键或第二连接体组成；或者
c)包含式(III)的结构：
A-X-C-Y-B
式III
其中，
A包含结合部分；
B由多核苷酸组成；
C由聚合物组成；
X由键或第一连接体组成；且
Y由键或第二连接体组成。
77.根据权利要求75或76中任一项所述的组合物，其中药物组合物被配制成纳米颗粒制剂。
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111020018A (zh) * 2019-11-28 2020-04-17 天津金匙医学科技有限公司 一种基于宏基因组学的病原微生物检测方法及试剂盒
CN115151256A (zh) * 2019-11-29 2022-10-04 Facio知识产权有限公司 用于治疗与dux4表达相关的疾病的新化合物
CN115820642A (zh) * 2022-11-11 2023-03-21 昆明理工大学 一种用于治疗杜氏肌营养不良症的CRISPR-Cas9系统

Families Citing this family (49)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
MA45328A (fr) 2016-04-01 2019-02-06 Avidity Biosciences Llc Compositions acide nucléique-polypeptide et utilisations de celles-ci
SG11201906200WA (en) 2017-01-06 2019-08-27 Avidity Biosciences Llc Nucleic acid-polypeptide compositions and methods of inducing exon skipping
GB201711809D0 (en) 2017-07-21 2017-09-06 Governors Of The Univ Of Alberta Antisense oligonucleotide
CN111770757A (zh) * 2017-09-22 2020-10-13 艾维迪提生物科学公司 诱导外显子跳读的核酸-多肽组合物和方法
CA3077213A1 (en) 2017-10-04 2019-04-11 Avidity Biosciences, Inc. Nucleic acid-polypeptide compositions and uses thereof
AU2018378812A1 (en) 2017-12-06 2020-07-09 Avidity Biosciences, Inc. Compositions and methods of treating muscle atrophy and myotonic dystrophy
US11911484B2 (en) 2018-08-02 2024-02-27 Dyne Therapeutics, Inc. Muscle targeting complexes and uses thereof for treating myotonic dystrophy
US20210322562A1 (en) * 2018-08-02 2021-10-21 Dyne Therapeutics, Inc. Muscle targeting complexes and uses thereof for treating centronuclear myopathy
WO2020028842A1 (en) * 2018-08-02 2020-02-06 Dyne Therapeutics, Inc. Muscle targeting complexes and uses thereof for treating hypertrophic cardiomyopathy
EP3830259A4 (en) 2018-08-02 2022-05-04 Dyne Therapeutics, Inc. MUSCLE TARGETING COMPLEXES AND THEIR USES FOR THE TREATMENT OF FACIOSCAPULOHUMERAL MUSCULAR DYSTROPHY
EP3829595A4 (en) * 2018-08-02 2022-08-24 Dyne Therapeutics, Inc. MUSCLE TARGETING COMPLEXES AND THEIR USES FOR THE TREATMENT OF DYSTROPHINOPATHIES
US12018087B2 (en) 2018-08-02 2024-06-25 Dyne Therapeutics, Inc. Muscle-targeting complexes comprising an anti-transferrin receptor antibody linked to an oligonucleotide and methods of delivering oligonucleotide to a subject
US11168141B2 (en) * 2018-08-02 2021-11-09 Dyne Therapeutics, Inc. Muscle targeting complexes and uses thereof for treating dystrophinopathies
EA202190421A1 (ru) * 2018-08-02 2021-06-25 Дайн Терапьютикс, Инк. Мышечно-специфические комплексы и их применение для лечения мышечной атрофии
SG11202100931QA (en) * 2018-08-02 2021-02-25 Dyne Therapeutics Inc Muscle-targeting complexes and uses thereof
KR20210081323A (ko) * 2018-08-02 2021-07-01 다인 세라퓨틱스, 인크. 근육 표적화 복합체 및 근긴장성 이영양증을 치료하기 위한 그의 용도
US12097263B2 (en) 2018-08-02 2024-09-24 Dyne Therapeutics, Inc. Muscle targeting complexes and uses thereof for treating myotonic dystrophy
EP3829645A4 (en) * 2018-08-02 2022-05-18 Dyne Therapeutics, Inc. MUSCLE TARGETED COMPLEXES AND USES THEREOF IN THE TREATMENT OF FIBRODYSPLASIA OSSIFICANS PROGRESSIVA
EP3898693A4 (en) 2018-12-21 2022-09-21 Avidity Biosciences, Inc. ANTI-TRANSFERRIN RECEPTOR ANTIBODIES AND USES THEREOF
CA3137715A1 (en) * 2019-04-25 2020-10-29 Avidity Biosciences, Inc. Nucleic acid compositions and methods of multi-exon skipping
CN114375297A (zh) 2019-06-06 2022-04-19 艾维迪提生物科学公司 Una亚酰胺及其用途
CN114375296A (zh) 2019-06-06 2022-04-19 艾维迪提生物科学公司 核酸多肽组合物及其用途
US20220306685A1 (en) * 2019-06-07 2022-09-29 Dyne Therapeutics, Inc. Methods of preparing protein-oligonucleotide complexes
EP3987029A1 (en) * 2019-06-19 2022-04-27 Sarepta Therapeutics, Inc. Methods for treating muscular dystrophy
CN114466682A (zh) * 2019-08-02 2022-05-10 全国儿童医院研究所 用于治疗基于肌营养不良蛋白的肌病的靶向外显子44的核酸和包含所述核酸的重组腺相关病毒
AU2020408773A1 (en) * 2019-12-19 2022-07-14 National Center Of Neurology And Psychiatry Antisense nucleic acid enabling exon skipping
AU2021205492A1 (en) * 2020-01-10 2022-09-01 Dyne Therapeutics, Inc. Muscle targeting complexes and uses thereof for treating facioscapulohumeral muscular dystrophy
KR20220125802A (ko) * 2020-01-10 2022-09-14 다인 세라퓨틱스, 인크. 근육 표적화 복합체 및 디스트로핀병증을 치료하기 위한 그의 용도
CA3163608A1 (en) * 2020-01-10 2021-07-15 Romesh R. Subramanian Muscle-targeting complexes and uses thereof
CA3172111A1 (en) 2020-03-19 2021-09-23 Barbora MALECOVA Compositions and methods of treating facioscapulohumeral muscular dystrophy
MX2022011880A (es) 2020-03-27 2022-10-20 Avidity Biosciences Inc Composiciones y metodos para tratar distrofia muscular.
EP4146229A1 (en) * 2020-05-05 2023-03-15 Avidity Biosciences, Inc. Compositions and methods of treating pompe disease
US20230272065A1 (en) * 2020-07-23 2023-08-31 Dyne Therapeutics, Inc. Muscle targeting complexes and uses thereof for treating facioscapulohumeral muscular dystrophy
CN111808887B (zh) * 2020-09-10 2020-12-18 中国农业大学 一种制备与自然突变比利时蓝牛类似的双肌臀肉牛的方法
WO2022232478A1 (en) 2021-04-30 2022-11-03 Sarepta Therapeutics, Inc. Treatment methods for muscular dystrophy
US11969475B2 (en) 2021-07-09 2024-04-30 Dyne Therapeutics, Inc. Muscle targeting complexes and uses thereof for treating facioscapulohumeral muscular dystrophy
US11633498B2 (en) 2021-07-09 2023-04-25 Dyne Therapeutics, Inc. Muscle targeting complexes and uses thereof for treating myotonic dystrophy
US11638761B2 (en) 2021-07-09 2023-05-02 Dyne Therapeutics, Inc. Muscle targeting complexes and uses thereof for treating Facioscapulohumeral muscular dystrophy
US11771776B2 (en) 2021-07-09 2023-10-03 Dyne Therapeutics, Inc. Muscle targeting complexes and uses thereof for treating dystrophinopathies
US11648318B2 (en) 2021-07-09 2023-05-16 Dyne Therapeutics, Inc. Anti-transferrin receptor (TFR) antibody and uses thereof
AU2022345098A1 (en) 2021-09-16 2024-04-04 Avidity Biosciences, Inc. Compositions and methods of treating facioscapulohumeral muscular dystrophy
IL313731A (en) 2021-12-22 2024-08-01 Sapreme Tech Bv Preparations containing nucleic acids and sponges aimed at treating muscle wasting diseases
KR20240121778A (ko) 2021-12-22 2024-08-09 사프렘 테크놀로지스 비.브이. 근육 소모 장애의 치료를 위한 표적화된 사포닌-핵산 접합체
WO2023121445A1 (en) 2021-12-22 2023-06-29 Sapreme Technologies B.V. Compositions comprising therapeutic nucleic acid and saponin for the treatment of muscle-wasting disorders
WO2023122347A2 (en) * 2021-12-23 2023-06-29 Mirecule, Inc. Compositions for delivery of polynucleotides
IL315280A (en) 2022-03-17 2024-10-01 Sarepta Therapeutics Inc Morpholino phosphorodiamidate oligomer conjugates
US12071621B2 (en) 2022-04-05 2024-08-27 Avidity Biosciences, Inc. Anti-transferrin receptor antibody-PMO conjugates for inducing DMD exon 44 skipping
AU2023254846A1 (en) 2022-04-15 2024-10-10 Dyne Therapeutics, Inc. Muscle targeting complexes and formulations for treating myotonic dystrophy
WO2024064237A2 (en) * 2022-09-21 2024-03-28 Sarepta Therapeutics, Inc. Dmd antisense oligonucleotide-mediated exon skipping efficiency

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20080311557A1 (en) * 2007-06-15 2008-12-18 Idexx Laboratories, Inc. Device, kit and method for hookworm antigen capture and detection
WO2009054725A2 (en) * 2007-10-26 2009-04-30 Academisch Ziekenhuis Leiden Means and methods for counteracting muscle disorders
WO2009144481A2 (en) * 2008-05-30 2009-12-03 Isis Innovation Limited Conjugates for delivery of biologically active compounds
US20140315862A1 (en) * 2013-03-15 2014-10-23 Sarepta Therapeutics, Inc. Compositions for treating muscular dystrophy
WO2016187425A1 (en) * 2015-05-19 2016-11-24 Sarepta Therapeutics, Inc. Peptide oligonucleotide conjugates
CN106459955A (zh) * 2014-03-12 2017-02-22 日本新药株式会社 反义核酸

Family Cites Families (159)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US1000075A (en) 1910-07-27 1911-08-08 William R Collins Tunneling-machine.
US4458066A (en) 1980-02-29 1984-07-03 University Patents, Inc. Process for preparing polynucleotides
US4694778A (en) 1984-05-04 1987-09-22 Anicon, Inc. Chemical vapor deposition wafer boat
US5521063A (en) 1985-03-15 1996-05-28 Antivirals Inc. Polynucleotide reagent containing chiral subunits and methods of use
US5185444A (en) 1985-03-15 1993-02-09 Anti-Gene Deveopment Group Uncharged morpolino-based polymers having phosphorous containing chiral intersubunit linkages
ATE171185T1 (de) 1985-03-15 1998-10-15 Antivirals Inc Immunotestmittel für polynukleotid und verfahren
US5166315A (en) 1989-12-20 1992-11-24 Anti-Gene Development Group Sequence-specific binding polymers for duplex nucleic acids
US5217866A (en) 1985-03-15 1993-06-08 Anti-Gene Development Group Polynucleotide assay reagent and method
US5034506A (en) 1985-03-15 1991-07-23 Anti-Gene Development Group Uncharged morpholino-based polymers having achiral intersubunit linkages
US5506337A (en) 1985-03-15 1996-04-09 Antivirals Inc. Morpholino-subunit combinatorial library and method
US4828971A (en) 1988-03-24 1989-05-09 Eastman Kodak Company Thermally processable element comprising a backing layer
CA1251835A (en) 1988-04-05 1989-03-28 Wai-Cheung Tang Dielectric image-resonator multiplexer
WO1991004753A1 (en) 1989-10-02 1991-04-18 Cetus Corporation Conjugates of antisense oligonucleotides and therapeutic uses thereof
EP0552178B1 (en) 1990-10-12 1997-01-02 Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Modified ribozymes
DE4216134A1 (de) 1991-06-20 1992-12-24 Europ Lab Molekularbiolog Synthetische katalytische oligonukleotidstrukturen
US5652094A (en) 1992-01-31 1997-07-29 University Of Montreal Nucleozymes
US5627053A (en) 1994-03-29 1997-05-06 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. 2'deoxy-2'-alkylnucleotide containing nucleic acid
CN1120156C (zh) 1994-06-17 2003-09-03 弗·哈夫曼-拉罗切有限公司 N,n′－二(喹啉－4－基)－二胺衍生物、其制备及作为抗疟药的应用
US5716824A (en) 1995-04-20 1998-02-10 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. 2'-O-alkylthioalkyl and 2-C-alkylthioalkyl-containing enzymatic nucleic acids (ribozymes)
US5889136A (en) 1995-06-09 1999-03-30 The Regents Of The University Of Colorado Orthoester protecting groups in RNA synthesis
WO1997026270A2 (en) 1996-01-16 1997-07-24 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. Synthesis of methoxy nucleosides and enzymatic nucleic acid molecules
EP0904107B1 (en) 1996-03-18 2004-10-20 Board Of Regents, The University Of Texas System Immunoglobin-like domains with increased half lives
US5849902A (en) 1996-09-26 1998-12-15 Oligos Etc. Inc. Three component chimeric antisense oligonucleotides
US6111086A (en) 1998-02-27 2000-08-29 Scaringe; Stephen A. Orthoester protecting groups
US6194551B1 (en) 1998-04-02 2001-02-27 Genentech, Inc. Polypeptide variants
US6528624B1 (en) 1998-04-02 2003-03-04 Genentech, Inc. Polypeptide variants
DE69937291T2 (de) 1998-04-02 2008-07-10 Genentech, Inc., South San Francisco Antikörpervarianten und fragmente davon
AU3751299A (en) 1998-04-20 1999-11-08 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. Nucleic acid molecules with novel chemical compositions capable of modulating gene expression
GB9816575D0 (en) 1998-07-31 1998-09-30 Zeneca Ltd Novel compounds
CA2328356A1 (en) 1999-12-22 2001-06-22 Itty Atcravi Recreational vehicles
DE60031793T2 (de) 1999-12-29 2007-08-23 Immunogen Inc., Cambridge Doxorubicin- und daunorubicin-enthaltende, zytotoxische mittel und deren therapeutische anwendung
US7833992B2 (en) 2001-05-18 2010-11-16 Merck Sharpe & Dohme Conjugates and compositions for cellular delivery
US8202979B2 (en) 2002-02-20 2012-06-19 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of gene expression using chemically modified short interfering nucleic acid
US8273866B2 (en) 2002-02-20 2012-09-25 Merck Sharp & Dohme Corp. RNA interference mediated inhibition of gene expression using chemically modified short interfering nucleic acid (SINA)
US6784291B2 (en) 2000-05-04 2004-08-31 Avi Biopharma, Inc. Splice-region antisense composition and method
EP1191097A1 (en) 2000-09-21 2002-03-27 Leids Universitair Medisch Centrum Induction of exon skipping in eukaryotic cells
US6884869B2 (en) 2001-04-30 2005-04-26 Seattle Genetics, Inc. Pentapeptide compounds and uses related thereto
AU2003207708A1 (en) 2002-02-20 2003-09-09 Sirna Therapeutics, Inc. Rna interference mediated inhibition of map kinase genes
US9181551B2 (en) 2002-02-20 2015-11-10 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of gene expression using chemically modified short interfering nucleic acid (siNA)
US9657294B2 (en) 2002-02-20 2017-05-23 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of gene expression using chemically modified short interfering nucleic acid (siNA)
AU2002257333A1 (en) 2002-02-22 2003-09-09 Linda L. Bambrick Novel treatment of neurodegenerative diseases by altering levels of trkb isoforms and/or trkc isoforms
US20040023220A1 (en) 2002-07-23 2004-02-05 Lawrence Greenfield Integrated method for PCR cleanup and oligonucleotide removal
SI3222724T1 (sl) 2002-08-05 2019-03-29 Silence Therapeutics Gmbh Nadaljnje nove oblike molekul interferenčne RNA
US7956176B2 (en) 2002-09-05 2011-06-07 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of gene expression using chemically modified short interfering nucleic acid (siNA)
DK2284266T3 (da) 2002-11-14 2014-01-13 Thermo Fisher Scient Biosciences Inc sIRNA-MOLEKYLE MOD TP53
US7250496B2 (en) 2002-11-14 2007-07-31 Rosetta Genomics Ltd. Bioinformatically detectable group of novel regulatory genes and uses thereof
ES2566632T3 (es) 2002-11-25 2016-04-14 Masafumi Matsuo Fármacos de ácido nucleico ENA que modifican el corte y empalme en precursores de ARNm
US8084582B2 (en) 2003-03-03 2011-12-27 Xencor, Inc. Optimized anti-CD20 monoclonal antibodies having Fc variants
WO2004083432A1 (en) 2003-03-21 2004-09-30 Academisch Ziekenhuis Leiden Modulation of exon recognition in pre-mrna by interfering with the secondary rna structure
BR122018071808B8 (pt) 2003-11-06 2020-06-30 Seattle Genetics Inc conjugado
EP2206781B1 (en) 2004-06-28 2015-12-02 The University Of Western Australia Antisense oligonucleotides for inducing exon skipping and methods of use thereof
FR2874384B1 (fr) 2004-08-17 2010-07-30 Genethon Vecteur viral adeno-associe pour realiser du saut d'exons dans un gene codant une proteine a domaines dispensables
JP2008519863A (ja) 2004-11-12 2008-06-12 シアトル ジェネティクス インコーポレイティッド Ｎ末端にアミノ安息香酸単位を有するオーリスタチン
US7429482B2 (en) 2005-01-13 2008-09-30 United States Of America As Represented By The Department Of Veterans Affairs Screening tools for discovery of novel anabolic agents
WO2006112705A2 (en) 2005-04-22 2006-10-26 Academisch Ziekenhuis Leiden Modulation of exon recognition in pre-mrna by interfering with the binding of sr proteins and by interfering with secondary rna structure.
US7736647B2 (en) 2005-06-15 2010-06-15 Monoclonal Antibodies Therapeutics Anti-CD71 monoclonal antibodies and uses thereof for treating malignant tumor cells
EP1937312B1 (en) 2005-08-30 2016-06-29 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Chimeric oligomeric compounds for modulation of splicing
LT2024499T (lt) 2006-05-10 2018-02-26 Sarepta Therapeutics, Inc. Oligonukleotido analogai, turintys katijonines jungtis tarp subvienetų
EP1857548A1 (en) 2006-05-19 2007-11-21 Academisch Ziekenhuis Leiden Means and method for inducing exon-skipping
NZ574807A (en) 2006-08-11 2011-01-28 Prosensa Technologies Bv Methods and means for treating dna repeat instability associated genetic disorders
EP2170363B1 (en) 2007-06-29 2018-08-08 Sarepta Therapeutics, Inc. Tissue specific peptide conjugates and methods
US20110065774A1 (en) 2008-01-31 2011-03-17 Alnylam Pharmaceuticals Chemically modified oligonucleotides and uses thereof
WO2009099991A2 (en) 2008-01-31 2009-08-13 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Treatment of cancer
US8609105B2 (en) 2008-03-18 2013-12-17 Seattle Genetics, Inc. Auristatin drug linker conjugates
AU2009234266B2 (en) 2008-04-11 2015-08-06 Tekmira Pharmaceuticals Corporation Site-specific delivery of nucleic acids by combining targeting ligands with endosomolytic components
EP2119783A1 (en) 2008-05-14 2009-11-18 Prosensa Technologies B.V. Method for efficient exon (44) skipping in Duchenne Muscular Dystrophy and associated means
WO2009147368A1 (en) 2008-06-04 2009-12-10 Medical Research Council Peptides
US8084601B2 (en) 2008-09-11 2011-12-27 Royal Holloway And Bedford New College Royal Holloway, University Of London Oligomers
SI3133160T1 (sl) * 2008-10-24 2019-05-31 Sarepta Therapeutics, Inc. Sestavki, ki preskakujejo ekson za DMD
AU2013204838B2 (en) 2008-10-24 2016-12-22 Sarepta Therapeutics, Inc. Multiple exon skipping compositions for DMD
DK2607484T3 (en) 2008-10-27 2016-03-07 Biomarin Technologies B V Methods and means for efficient skipping of exon 45 in Duchenne muscular dystrophy pre-MRNA
KR101602431B1 (ko) 2008-11-05 2016-03-10 삼성전자 주식회사 냉장고
CA2744987C (en) 2008-12-02 2018-01-16 Chiralgen, Ltd. Method for the synthesis of phosphorus atom modified nucleic acids
WO2010115033A2 (en) 2009-04-02 2010-10-07 Regents Of The University Of Minnesota Nucleotide repeat expansion-associated polypeptides and uses thereof
US20120149756A1 (en) 2009-04-10 2012-06-14 Associatin Institut de Myologie Tricyclo-dna antisense oligonucleotides, compositions, and methods for the treatment of disease
ES2593836T3 (es) 2009-04-24 2016-12-13 Biomarin Technologies B.V. Oligonucleótido que comprende una inosina para tratar la DMD
WO2010129666A1 (en) 2009-05-05 2010-11-11 Altermune Technologies, Llc Chemically programmable immunity
US20110269665A1 (en) 2009-06-26 2011-11-03 Avi Biopharma, Inc. Compound and method for treating myotonic dystrophy
US20120172415A1 (en) * 2009-08-31 2012-07-05 Thomas Voit Exon Skipping Therapy for Functional Amelioration of Semifunctional Dystrophin in Becker and Duchenne Muscular Dystrophy
TR201804897T4 (tr) 2009-10-07 2018-06-21 Macrogenics Inc Fukosi̇lasyon ölçüsünün deği̇şi̇mleri̇nden dolayi geli̇şmi̇ş efektör i̇şlevi̇ sergi̇leyen fc bölgesi̇ni̇ i̇çeren poli̇pepti̇tler ve bunlarin kullanimlarina yöneli̇k yöntemler
ES2693459T3 (es) 2009-11-12 2018-12-11 The University Of Western Australia Moléculas antisentido y métodos para el tratamiento de patologías
WO2011078797A2 (en) 2009-12-22 2011-06-30 Singapore Health Services Pte. Ltd Antisense oligonucleotides and uses threreof
EP2558578B1 (en) 2010-04-13 2015-10-28 Life Technologies Corporation Compositions and methods for inhibition of nucleic acids function
US9242013B2 (en) 2010-04-15 2016-01-26 Seattle Genetics Inc. Targeted pyrrolobenzodiazapine conjugates
EP2558475A1 (en) 2010-04-15 2013-02-20 Spirogen Sàrl Pyrrolobenzodiazepines used to treat proliferative diseases
TWI620756B (zh) 2010-05-28 2018-04-11 薩羅塔治療公司 具有經修飾之單元間連結及／或末端基團之寡核苷酸類似物
IT1400425B1 (it) * 2010-06-08 2013-05-31 Amsterdam Molecular Therapeutics Bv Modified snrnas for use in therapy.
WO2011154542A1 (en) * 2010-06-11 2011-12-15 Artisense Pharma Gmbh Method for selective oligonucleotide modification
WO2012012443A2 (en) 2010-07-19 2012-01-26 Bennett C Frank Modulation of dystrophia myotonica-protein kinase (dmpk) expression
DK2632472T3 (en) 2010-10-29 2018-03-19 Sirna Therapeutics Inc RNA INTERFERENCE-MEDIATED INHIBITION OF GENE EXPRESSION USING SHORT INTERFERRING NUCLEIC ACIDS (SINA)
US8501930B2 (en) 2010-12-17 2013-08-06 Arrowhead Madison Inc. Peptide-based in vivo siRNA delivery system
WO2012109296A1 (en) 2011-02-08 2012-08-16 The Charlotte-Mecklenburg Hospital Authority D/B/A Carolinas Medical Center Antisense oligonucleotides
HUE041335T2 (hu) 2011-03-29 2019-05-28 Roche Glycart Ag Antitest FC-variánsok
WO2012138487A2 (en) 2011-04-07 2012-10-11 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Oligonucleotide modulation of splicing
US9161948B2 (en) 2011-05-05 2015-10-20 Sarepta Therapeutics, Inc. Peptide oligonucleotide conjugates
US9598496B2 (en) 2011-05-09 2017-03-21 Perseus Proteomics Inc. Antibody capable of specifically recognizing transferrin receptor
EP2732035A2 (en) 2011-07-15 2014-05-21 Sarepta Therapeutics, Inc. Methods and compositions for manipulating translation of protein isoforms from alternative initiation start sites
SG10201700554VA (en) 2011-07-19 2017-03-30 Wave Life Sciences Pte Ltd Methods for the synthesis of functionalized nucleic acids
US9418216B2 (en) 2011-07-21 2016-08-16 Microsoft Technology Licensing, Llc Cloud service authentication
US9302014B2 (en) 2011-08-30 2016-04-05 Medical Research Council Cell-penetrating peptides having a central hydrophobic domain
US9526798B2 (en) 2011-10-14 2016-12-27 Seattle Genetics, Inc. Pyrrolobenzodiazepines and targeted conjugates
KR102689177B1 (ko) 2011-11-18 2024-07-30 알닐람 파마슈티칼스 인코포레이티드 변형된 ＲＮＡｉ 제제
EP4043039A1 (en) 2012-01-27 2022-08-17 BioMarin Technologies B.V. Rna modulating oligonucleotides with improved characteristics for the treatment of duchenne and becker muscular dystrophy
WO2013121175A1 (en) 2012-02-16 2013-08-22 Ucl Business Plc Lysosome-cleavable linker
AR090905A1 (es) 2012-05-02 2014-12-17 Merck Sharp & Dohme Conjugados que contienen tetragalnac y peptidos y procedimientos para la administracion de oligonucleotidos, composicion farmaceutica
US9504756B2 (en) 2012-05-15 2016-11-29 Seattle Genetics, Inc. Self-stabilizing linker conjugates
CN104640572B (zh) 2012-05-15 2018-04-27 索伦托医疗有限公司 药物偶联物，偶联方法，及其用途
CA2877644A1 (en) 2012-07-03 2014-01-09 Prosensa Technologies B.V. Oligonucleotide for the treatment of muscular dystrophy patients
WO2014012081A2 (en) 2012-07-13 2014-01-16 Ontorii, Inc. Chiral control
KR101819404B1 (ko) 2012-10-12 2018-02-28 메디뮨 리미티드 피롤로벤조디아제핀 및 그의 컨주게이트
WO2014080251A1 (en) 2012-11-24 2014-05-30 Hangzhou Dac Biotech Co., Ltd. Hydrophilic linkers and their uses for conjugation of drugs to cell binding molecules
EP3885439A1 (en) 2012-12-20 2021-09-29 Sarepta Therapeutics, Inc. Improved exon skipping compositions for treating muscular dystrophy
SG10201705150RA (en) 2012-12-21 2017-07-28 Bioalliance Cv Hydrophilic self-immolative linkers and conjugates thereof
US9481905B2 (en) 2013-02-19 2016-11-01 Orizhan Bioscience Limited Method of using neutrilized DNA (N-DNA) as surface probe for high throughput detection platform
US9319764B2 (en) 2013-03-08 2016-04-19 Merry Electronics Co., Ltd. MEMS microphone packaging structure
EP3633035A1 (en) 2013-03-14 2020-04-08 Sarepta Therapeutics, Inc. Exon skipping compositions for treating muscular dystrophy
US9577459B2 (en) 2013-03-15 2017-02-21 Sequana Medical Ag Systems and methods for regulating inductive energy transfer to an implantable system
EP2777714A1 (en) 2013-03-15 2014-09-17 NBE-Therapeutics LLC Method of producing an immunoligand/payload conjugate by means of a sequence-specific transpeptidase enzyme
CN105188766B (zh) 2013-03-15 2019-07-12 瑞泽恩制药公司 生物活性分子、其偶联物及治疗用途
US9295731B2 (en) 2013-04-01 2016-03-29 Mark Quang Nguyen Cleavable drug conjugates, compositions thereof and methods of use
US9849066B2 (en) 2013-04-24 2017-12-26 Corning Incorporated Delamination resistant pharmaceutical glass containers containing active pharmaceutical ingredients
JP2016520574A (ja) 2013-04-28 2016-07-14 秦剛 新規リンカー、その製造方法およびその応用
PE20151926A1 (es) 2013-05-20 2016-01-07 Genentech Inc Anticuerpos de receptores de antitransferrina y metodos de uso
WO2014190441A1 (en) 2013-05-31 2014-12-04 Zymeworks Inc. Heteromultimers with reduced or silenced effector function
EP3004370B1 (en) 2013-06-05 2024-08-21 Duke University Rna-guided gene editing and gene regulation
WO2014197854A1 (en) 2013-06-06 2014-12-11 Igenica Biotherapeutics, Inc. Novel linkers for antibody-drug conjugates and related compounds, compositions, and methods of use
TW201536329A (zh) 2013-08-09 2015-10-01 Isis Pharmaceuticals Inc 用於調節失養性肌強直蛋白質激酶(dmpk)表現之化合物及方法
WO2015038426A1 (en) 2013-09-13 2015-03-19 Asana Biosciences, Llc Self-immolative linkers containing mandelic acid derivatives, drug-ligand conjugates for targeted therapies and uses thereof
US9982260B2 (en) 2013-09-30 2018-05-29 The Regents Of The University Of California Identification of structurally similar small molecules that enhance therapeutic exon skipping
EA201690780A1 (ru) 2013-10-15 2016-08-31 Сиэтл Дженетикс, Инк. Пегилированные лекарственные средства-линкеры для улучшенной фармакокинетики конъюгатов лиганд-лекарственное средство
WO2015057876A1 (en) 2013-10-15 2015-04-23 Sorrento Therapeutics Inc. Drug-conjugates with a targeting molecule and two different drugs
EP3065758B1 (en) 2013-11-06 2019-09-25 Merck Sharp & Dohme Corp. Peptide containing conjugates for dual molecular delivery of oligonucleotides
WO2015075747A1 (en) 2013-11-19 2015-05-28 Council Of Scientific And Industrial Research Cell-penetrating peptide for biomolecule delivery
MX2016009290A (es) 2014-01-16 2017-02-28 Wave Life Sciences Ltd Diseño quiral.
MX2016016526A (es) 2014-06-17 2017-04-04 Nippon Shinyaku Co Ltd Acidos nucleicos antisentido.
EP3286318A2 (en) 2015-04-22 2018-02-28 Mina Therapeutics Limited Sarna compositions and methods of use
HUE057952T2 (hu) 2015-06-24 2022-06-28 Hoffmann La Roche Anti-transzferrin receptor antitestek testreszabott affinitással
TWI741988B (zh) * 2015-07-31 2021-10-11 日商新力股份有限公司 堆疊式透鏡結構及其製造方法，以及電子裝置
BR112018006445A2 (pt) 2015-09-30 2018-12-11 Sarepta Therapeutics Inc métodos para tratar distrofia muscular
GB2545898B (en) 2015-12-21 2019-10-09 Sutura Therapeutics Ltd Improved drug delivery by conjugating oligonucleotides to stitched/stapled peptides
JP2019517991A (ja) 2016-03-01 2019-06-27 エフ・ホフマン−ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト 低減したａｄｃｐを有するオビヌツズマブ及びリツキシマブ変異体
MA45328A (fr) 2016-04-01 2019-02-06 Avidity Biosciences Llc Compositions acide nucléique-polypeptide et utilisations de celles-ci
MA45290A (fr) 2016-05-04 2019-03-13 Wave Life Sciences Ltd Procédés et compositions d'agents biologiquement actifs
US20190240346A1 (en) * 2016-06-20 2019-08-08 Genahead Bio, Inc. Antibody-drug conjugate
EP3478829A1 (en) 2016-06-29 2019-05-08 Crispr Therapeutics AG Materials and methods for treatment of myotonic dystrophy type 1 (dm1) and other related disorders
US10074359B2 (en) 2016-11-01 2018-09-11 Google Llc Dynamic text-to-speech provisioning
DK3554553T3 (da) 2016-12-19 2022-09-19 Sarepta Therapeutics Inc Exon-overspringnings-oligomerkonjugat til muskeldystrofi
SG11201906200WA (en) 2017-01-06 2019-08-27 Avidity Biosciences Llc Nucleic acid-polypeptide compositions and methods of inducing exon skipping
GB201711809D0 (en) 2017-07-21 2017-09-06 Governors Of The Univ Of Alberta Antisense oligonucleotide
CN111770757A (zh) 2017-09-22 2020-10-13 艾维迪提生物科学公司 诱导外显子跳读的核酸-多肽组合物和方法
AU2018378812A1 (en) 2017-12-06 2020-07-09 Avidity Biosciences, Inc. Compositions and methods of treating muscle atrophy and myotonic dystrophy
US10910559B2 (en) 2018-06-01 2021-02-02 Massachusetts Institute Of Technology Optoelectronic memristor devices including one or more solid electrolytes with electrically controllable optical properties
WO2020102287A1 (en) 2018-11-14 2020-05-22 University Of Hawaii Compositions and methods for the synthesis and identification of covalent aptamers
EP3898693A4 (en) 2018-12-21 2022-09-21 Avidity Biosciences, Inc. ANTI-TRANSFERRIN RECEPTOR ANTIBODIES AND USES THEREOF
CA3137715A1 (en) 2019-04-25 2020-10-29 Avidity Biosciences, Inc. Nucleic acid compositions and methods of multi-exon skipping
WO2021003573A1 (en) 2019-07-09 2021-01-14 The Governors Of The University Of Alberta Exons 45-55 skipping using mutation-tailored cocktails of antisense morpholinos in the dmd gene
CA3163608A1 (en) 2020-01-10 2021-07-15 Romesh R. Subramanian Muscle-targeting complexes and uses thereof
EP4314298A1 (en) 2021-04-02 2024-02-07 Avidity Biosciences, Inc. Antibody-oligonucleotide conjugate and antibody-peptide-oligonucleotide conjugate compositions and methods of inducing exon skipping
US12071621B2 (en) 2022-04-05 2024-08-27 Avidity Biosciences, Inc. Anti-transferrin receptor antibody-PMO conjugates for inducing DMD exon 44 skipping

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20080311557A1 (en) * 2007-06-15 2008-12-18 Idexx Laboratories, Inc. Device, kit and method for hookworm antigen capture and detection
WO2009054725A2 (en) * 2007-10-26 2009-04-30 Academisch Ziekenhuis Leiden Means and methods for counteracting muscle disorders
WO2009144481A2 (en) * 2008-05-30 2009-12-03 Isis Innovation Limited Conjugates for delivery of biologically active compounds
US20140315862A1 (en) * 2013-03-15 2014-10-23 Sarepta Therapeutics, Inc. Compositions for treating muscular dystrophy
CN106459955A (zh) * 2014-03-12 2017-02-22 日本新药株式会社 反义核酸
WO2016187425A1 (en) * 2015-05-19 2016-11-24 Sarepta Therapeutics, Inc. Peptide oligonucleotide conjugates

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
JEARAWIRIYAPAISARN N等: "Sustained dystrophin expression induced by peptide-conjugated morpholino oligomers in the musces of mdx mic", 《MOLECULAR THERAPY : THE JOURNAL OF THE AMERICAN SOCIETYOF GENE THERAPY, CELL PRESS》 *
R. P. WU等: "CeH-penetrating peptides as transporters for morpholino oligomers: effects of amino acid composition on intracellular delivery and cytotoxicity", 《NUCLEIC ACIDS RESEARCH》 *
SUGO TSUKASA等: "Development of antibody-siRNA conjugate targeted to cardiac and skeletal muscles", 《JOURNAL OF CONTROLLED RELEASE》 *

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111020018A (zh) * 2019-11-28 2020-04-17 天津金匙医学科技有限公司 一种基于宏基因组学的病原微生物检测方法及试剂盒
CN111020018B (zh) * 2019-11-28 2021-09-14 天津金匙医学科技有限公司 一种基于宏基因组学的病原微生物检测方法及试剂盒
CN115151256A (zh) * 2019-11-29 2022-10-04 Facio知识产权有限公司 用于治疗与dux4表达相关的疾病的新化合物
CN115820642A (zh) * 2022-11-11 2023-03-21 昆明理工大学 一种用于治疗杜氏肌营养不良症的CRISPR-Cas9系统
CN115820642B (zh) * 2022-11-11 2023-10-10 昆明理工大学 一种用于治疗杜氏肌营养不良症的CRISPR-Cas9系统

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