PT1068241E - Variantes de anticorpos e respectivos fragmentos - Google Patents
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Description
1
DESCRIÇÃO "VARIANTES DE ANTICORPOS E RESPECTIVOS FRAGMENTOS"
CONTEXTO DA INVENÇÃO Área da Invenção A presente invenção diz respeito a variantes de polipéptidos que compreendem uma região Fc. Mais particularmente, a presente invenção diz respeito a polipéptidos contendo uma região Fc que têm função efectora alterada em consequência de uma ou mais substituições de aminoácidos na região Fc do polipéptido não variante.
Descrição da Área Relacionada
Os anticorpos são proteínas que exibem especificidade de ligação para um antigene específico. Os anticorpos nativos são habitualmente glicoproteínas heterotetraméricas de cerca de 150 000 Dalton, compostas por duas cadeias leves (L) idênticas e duas cadeias pesadas (H) idênticas. Cada cadeia leve está ligada a uma cadeia pesada por uma ligação dissulfureto covalente, ao passo que o número de ligações dissulfureto varia entre as cadeias pesadas de diferentes isotipos de imunoglobulinas. Cada cadeia pesada e leve também tem pontes dissulfureto intra-cadeias regularmente espaçadas. Cada cadeia pesada tem, numa extremidade, um domínio variável (VH), seguido de alguns domínios constantes. Cada cadeia leve tem um domínio variável numa extremidade (VL) e um domínio constante na sua outra extremidade; o domínio constante da cadeia leve está alinhado com o primeiro domínio constante da cadeia pesada, e o domínio variável da cadeia leve está alinhado com o domínio variável da cadeia pesada. Crê-se que 2 resíduos de aminoácidos particulares formam uma interface entre os domínios variáveis das cadeias leves e pesadas. 0 termo "variável" refere-se ao facto das sequências de certas porções dos domínios variáveis diferirem extensamente entre anticorpos e serem responsáveis pela especificidade de ligação de cada anticorpo particular para o seu antigene particular. No entanto, a variabilidade não está uniformemente distribuída ao longo dos domínios variáveis dos anticorpos. Está concentrada em três segmentos, denominados regiões determinantes de complementaridade (CDRs), nos domínios variáveis das cadeias leves e das cadeias pesadas. As porções mais altamente conservadas dos domínios variáveis são denominadas regiões de arcabouço (FR). Cada um dos domínios variáveis das cadeias pesadas e leves nativas compreendem quatro regiões FR, que adoptam maioritariamente uma configuração em folhas β, ligadas por três CDRs, que formam alças que ligam e, nalguns casos, fazem parte da estrutura em folhas β. As CDRs presentes em cada cadeia mantêm-se proximamente reunidas pelas regiões FR e, com as CDRs da outra cadeia, contribuem para a formação do sítio de ligação de antigenes dos anticorpos (ver Kabat et al.f "Sequences of Proteins of Immunological Interest" 5a Edição, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)).
Os domínios constantes não estão directamente envolvidos na ligação de um anticorpo a um antigene, mas exibem várias funções efectoras. Dependendo da sequência de aminoácidos da região constante das suas cadeias pesadas, os anticorpos ou imunoglobulinas podem ser atribuídos a diferentes classes. Há cinco grandes classes de 3 imunoglobulinas: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, e várias destas podem ser suplementarmente divididas em subclasses (isotipos), por exemplo, IgGl, IgG2, IgG3 e IgG4; IgAl e IgA2. As regiões constantes das cadeias pesadas que correspondem às diferentes classes de imunoglobulinas são denominadas α, δ, ε, γ e μ, respectivamente. Das várias classes de imunoglobulinas humanas, sabe-se que apenas a IgGl, IgG2, IgG3 e IgM humanas activam o complemento.
Apresenta-se na Fig. 1 uma representação esquemática da estrutura da IgGl nativa, onde estão indicadas as várias porções da molécula do anticorpo nativo. A digestão de anticorpos por papaina produz dois fragmentos de ligação de antigenes idênticos, denominados fragmentos Fab, cada um com um sitio de ligação de antigenes, e um fragmento "Fc" residual, cujo nome reflecte a sua capacidade para cristalizar facilmente. Foi determinada a estrutura cristalina da região Fc da IgG humana (Deisenhofer, Biochemistry 2_0: 2361-2370 (1981) ) . Em moléculas de IgG humana, a região Fc é gerada por clivagem por papaina N-terminal a Cys 226. A região Fc é central para as funções efectoras dos anticorpos.
As funções efectoras mediadas pela região Fc de anticorpos podem ser divididas em duas categorias: (1) funções efectoras que operam após a ligação do anticorpo a um antigene (estas funções envolvem a participação da cascata do complemento ou células que contêm o receptor de Fc (FcR)), e (2) funções efectoras que operam independentemente da ligação de antigenes (estas funções conferem persistência na circulação e a capacidade para serem transferidos através de barreiras celulares por 4 transcitose). Ward e Ghetie, Therapeutic Immunology 2: 77-94 (1995). Não obstante a ligação de um anticorpo ao necessário antigene tenha um efeito neutralizador que poderá prevenir a ligação de um antigene estranho ao seu alvo endógeno (por exemplo, receptor ou ligando), a ligação isoladamente poderá não remover o antigene estranho. Para ser eficiente na remoção e/ou destruição de antigenes estranhos, um anticorpo deverá estar equipado com elevada afinidade de ligação para o seu antigene e funções efectoras eficientes.
Ligação de Clq
Clq e duas serina-proteases, Clr e Cls, formam o complexo Cl, o primeiro componente da via da citotoxicidade dependente do complemento (CDC). 0 Clq é uma molécula hexavalente com um peso molecular aproximadamente de 460 000 e uma estrutura semelhante a um ramo de tulipas, na qual seis "caules" colagenosos estão ligados a seis regiões de cabeças globulares. Burton e Woof, Advances in Immunol. 51: 1-84 (1992) . Para activar a cascata do complemento é necessário que o Clq se ligue a pelo menos duas moléculas de IgGl, IgG2 ou IgG3 (o consenso é que a IgG4 não activa o complemento) mas apenas uma molécula de IgM, ligada ao alvo antigénico. Ward e Ghetie, Therapeutic Immunology 2: 77-94 (1995) na página 80.
Com base nos resultados de modificações quimicas e estudos cristalográficos, Burton et al. {Nature 288: 338— 344 (1980)) propuseram que o sitio de ligação para o subcomponente do complemento Clq em IgG envolve os últimos dois filamentos β (C-terminais) do dominio CH2. Mais tarde, Burton sugeriu (Molec. Immunol. 2_2 (3) : 161-206 (1985)) que 5 a região que compreende os resíduos de aminoácidos 318 até 337 poderá estar envolvida na fixação do complemento.
Duncan e Winter (Nature 332: 738-40 (1988)), utilizando mutagénese dirigida a sítios, relataram que Glu318, Lys320 e Lys322 formam o sítio de ligação a Clq. Os dados de Duncan e Winter foram gerados testando a ligação de um isotipo IgG2b de ratinho a Clq de porquinho-da-índia. O papel dos resíduos Glu318, Lys320 e Lys322 na ligação de Clq foi confirmado pela capacidade de um pequeno péptido sintético que continha estes resíduos para inibir a lise mediada pelo complemento. Resultados semelhantes são revelados na Patente U.S. N° 5 648 260, publicada em 15 de Julho de 1997, e Patente U.S. N° 5 624 821, publicada em 29 de Abril de 1997. 0 resíduo Pro331 foi implicado na ligação de Clq por análise da capacidade de subclasses da IgG humana para efectuarem a lise celular mediada pelo complemento. A mutação de Ser331 em Pro331 na IgG4 conferiu a capacidade para activar o complemento (Tao et al., J. Exp. Med. 178: 661-667 (1993); Brekke et al., Eur. J. Immunol. 2_4: 2542-47 (1994); Morrison et al., The Immunologist, volume 2, 1994, páginas 119-124) .
Da comparação dos dados do grupo de Winter e dos artigos de Tao et al. e Brekke et al., Ward e Ghetie concluíram, no seu artigo de revisão, que há pelo menos duas regiões diferentes envolvidas na ligação de Clq: uma no filamento β do domínio CH2 que contém os resíduos Glu318, Lys320 e Lys322, e a outra numa volta localizada proximamente do mesmo filamento β e que contém um resíduo de aminoácido chave na posição 331. 6
Outros relatos sugeriram que os resíduos da IgGl humana Lys235 e Gly237, localizados na região conectora inferior, desempenham um papel crítico na fixação e activação do complemento. Xu et al.f J. Immunol. 150: 152A (Resumo) (1993) . A patente WO 94/29351, publicada em 22 de Dezembro de 1994, relata que resíduos de aminoácidos necessários para a ligação a Clq e FcR da IgGl humana estão localizados na região N-terminal do domínio CH2, isto é, os resíduos 231 até 238.
Também foi proposto que a capacidade da IgG para se ligar a Clq e activar a cascata do complemento também depende da presença, ausência ou modificação da fracção hidrato de carbono posicionada entre os dois domínios CH2 (que está normalmente ancorada em Asn297). Ward e Ghetie, Therapeutic Immunology 2: 77-94 (1995) na página 81.
Ligação de receptores de Fc
As funções efectoras também podem ser mediadas pela interacção da região Fc de um anticorpo com receptores de Fc (FcRs) , que são receptores da superfície celular especializados presentes em células hematopoiéticas. Os receptores de Fc pertencem à superfamília das imunoglobulinas e foi mostrado que medeiam tanto a remoção de patogenes revestidos com anticorpos, por fagocitose de complexos imunológicos, como a lise de eritrócitos e vários alvos celulares diferentes (por exemplo, células tumorais) revestidos com o anticorpo correspondente, via citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpos (ADCC) . Van de Winkel e Anderson, J. Leuk Biol. 4_9: 511-24 (1991). 7
Os FcRs são definidos pela sua especificidade para isotipos de imunoglobulinas; receptores de Fc para anticorpos IgG são referidos como FcyR, para IgE como FcsR, para IgA como FcaR e assim por diante. Foram identificadas três subclasses de receptores gama: FcyRI (CD64), FcyRII (CD32) e FcyRIII (CD16). Uma vez que cada subclasse de FcyR é codificada por dois ou três genes e que o processamento alternativo de RNA conduz a múltiplos transcritos, existe uma grande diversidade de isoformas de FcyR. Os três genes que codificam a subclasse FcyRI (FcyRIA, FcyRIB e FcyRIC) estão aglomerados na região lq21.1 do braço longo do cromossoma 1; os genes que codificam isoformas FcyRII (FcyRIIA, FcyRIIB e FcyRIIC) e os dois genes que codificam FcyRI II (FcyRII IA e FcyRI IIB) estão todos aglomerados na região lq22. Os FcRs são revistos em Ravetch e Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9_: 457-92 (1991); Capei et ai., Immunomethods _4: 25-34 (1994), e de Haas et al., J. Lab. Clin. Med. 126: 330-41 (1995).
Enquanto o FcyRI se liga à IgG monomérica com afinidade elevada, FcyRII e FcyRI II são receptores de baixa afinidade, que interagem com IgG complexada ou agregada. O método clássico para detectar estes receptores de baixa afinidade consiste em "formação de rosetas" utilizando eritrócitos revestidos com anticorpos (EA) sensibilizados com IgGs. Bredius et al. avaliaram a formação de rosetas entre glóbulos vermelhos sensibilizados com IgG e leucócitos polimorfonucleares (PMN) que expressam FcyRIIa e FcyRlllb nas suas superfícies celulares. Uma roseta foi definida como três ou mais EA ligados por PMN (Bredius et al., Immunology 8_3: 624-630 (1994)). No que se refere a 8 ensaios de rosetas ver também Tax et ai., J. Immunol. 133(3): 1185-1189 (1984); Nagarajan et ai., J. Biol. Chem. 270(43): 25762-25770 (1995), e Warmerdam et ai., J.
Immunol. 147 (4): 1338-1343 (1991) . No entanto, a ligação destes "complexos imunológicos" de EA a FcR não é facilmente quantificada. Em conformidade, foram desenvolvidos complexos mais definidos com afinidade detectável para estes FcRs. Por exemplo, formaram-se dimeros de IgG utilizando anticorpos monoclonais anti-cadeia leve (Nagarajan et ai., supra, e Warmerdam et ai., supra) ou agentes quimicos de formação de ligações cruzadas (Hogarth et ai., Immunomethods _4: 17-24 (1994), e Tamm et ai., J. Biol. Chem. 271 (7) : 3659-3666 (1996)). Também foram avaliados complexos imunológicos agregados por acção do calor quanto à ligação a células que expressam FcRs (Tax et ai., supra, e Tam et al., supra).
Verificou-se que o sitio de ligação de FcyRs na IgG humana reside na região conectora inferior, envolvendo principalmente resíduos nas posições de aminoácidos 233-238, todos os quais se verificou serem necessários para actividade completa de ligação de FcyR. Canfield e Morrison, J. Exp. Med. 173: 1483-91 (1991); Chappel et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 88: 9036-40 (1991); Lund et al., J. Immunol. 147: 2657-62 (1991); Lund et al., Molec.
Immunol. 2_9: 53-59 (1992); Jef feris et al., Molec. Immunol. 27: 1237-40 (1990), e Sarmay et al., Molec. Immunol. 29: 633-639 (1992).
Na IgG3, alterou-se Pro331 em Ser e analisou-se a afinidade deste mutante para células-alvo. Verificou-se que a afinidade era seis vezes inferior à da IgG3 não mutada, o 9 que indica o envolvimento de Pro331 na ligação de FcyRI. Morrison et al., Immunologist 2: 119-124 (1994), e Canfield e Morrison, J. Exp. Med. 173: 1483-91 (1991).
Adicionalmente, o resíduo Glu318 foi identificado como estando envolvido na ligação a FcyRII. Ward e Ghetie, Therapeutic Immunology 2: 77-94 (1995) .
RESUMO DA INVENÇÃO A presente invenção proporciona uma variante de um polipéptido que compreende a região Fc de uma IgG humana, cuja variante tem capacidade reduzida ou nula para activar o complemento e compreende uma substituição de aminoácidos na posição de aminoácidos 270 ou 329, ou em duas ou mais das posições de aminoácidos 270, 322, 329 e 331 da região Fc da IgG humana, em que a numeração dos resíduos na região Fc da IgG humana é a do índice EU, como em Kabat. A invenção também se refere a uma variante de um polipéptido que compreende a região Fc de uma IgG humana, cuja variante se liga a FcyRI, FcyRII, FcyRIII e FcRn, mas não activa o complemento, e compreende uma substituição de aminoácidos na posição do aminoácido 322 ou posição do aminoácido 329, ou em ambas as posições de aminoácidos da região Fc da IgG humana, em que a numeração dos resíduos na região Fc da IgG é a do índice EU, como em Kabat.
Ainda noutro aspecto, a invenção proporciona um método para modificar um polipéptido compreendendo a região Fc de uma IgG humana, que compreende substituir um resíduo de aminoácido na posição de aminoácidos 270 ou 329, ou em duas ou mais das posições de aminoácidos 270, 322, 329 e 331 da 10 região Fc da IgG humana, em gue a numeração dos resíduos na região Fc da IgG é a do índice EU, como em Kabat. A invenção também proporciona uma composição que compreende a variante do polipéptido e um transportador ou diluente fisiologicamente aceitável. Esta composição, para potencial utilização terapêutica, é esterilizada e pode ser liofilizada. São contempladas utilizações de diagnóstico e terapêuticas para a variante do polipéptido. Numa aplicação de diagnóstico, a invenção proporciona um método para determinar a presença de uma proteína de interesse, que compreende expor à variante do polipéptido uma amostra suspeita de conter a proteína e determinar a ligação da variante do polipéptido à amostra. Numa aplicação terapêutica, a invenção proporciona um método para tratar um mamífero que sofre de uma perturbação, que compreende administrar ao mamífero uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma variante de um polipéptido que compreende a região Fc de uma IgG humana, cuja variante se liga a FcyRI, FcyRII, FcyRIII e FcRn, mas não activa o complemento, e compreende uma substituição de aminoácidos na posição de aminoácidos 270, 322, 329 ou 331 da região Fc da IgG humana, em que a numeração dos resíduos na região Fc da IgG é a do índice EU, como em Kabat. A invenção também proporciona: um ácido nucleico isolado que codifica a variante do polipéptido; um vector que compreende o ácido nucleico, opcionalmente operativamente ligado a sequências de controlo reconhecidas por uma célula-hospedeiro transformada com o vector; uma célula-hospedeiro que compreende o vector; um processo para 11 preparar a variante do polipéptido, que compreende cultivar esta célula-hospedeiro de modo que o ácido nucleico seja expresso e, opcionalmente, recuperar a variante do polipéptido a partir da cultura da célula-hospedeiro (por exemplo, a partir do meio de cultura da célula-hospedeiro).
Descrição Breve das Figuras A Figura 1 é uma representação esquemática de uma IgG nativa. As ligações dissulfureto estão representadas por linhas grossas entre os domínios CHI e CL e os dois domínios CH2. V é domínio variável; C é domínio constante; L designa cadeia leve, e H designa cadeia pesada. A Figura 2 apresenta a ligação a Clq do anticorpo C2B8 de tipo selvagem (ts); anticorpo C2B8 com uma região constante da IgG2 humana (IgG2), e mutantes K322A, K320A e E318A. A Figura 3 representa a ligação a Clq dos mutantes P331A, P329A e K322A.
As Figuras 4A (ID SEQ NO: 1) e 4B (ID SEQ NO: 2) representam as sequências de aminoácidos da cadeia leve (Fig. 4A) e cadeia pesada (Fig. 4B) do anticorpo E27 anti-IgE. A Figura 5 é um diagrama esquemático do "complexo imunológico" preparado para utilização no ensaio de FcR descrito no Exemplo 1. Apresenta-se o hexâmero que compreende três moléculas de anticorpo anti-IgE (o "polipéptido que contém a região Fc") e três moléculas de IgE (a "primeira molécula-alvo"). A IgE tem dois "sítios de ligação" para o anticorpo anti-IgE (E27) na sua região Fc. Cada molécula de IgE do complexo é suplementarmente capaz de se ligar a duas moléculas de VEGF ("o segundo 12 polipéptido alvo"). 0 VEGF tem dois "sítios de ligação" para a IgE. A Figura 6 apresenta resultados de ligação a Clq obtidos para os mutantes D270K e D270V em comparação com o C2B8 de tipo selvagem. A Figura 7 representa a citotoxicidade dependente do complemento (CDC) dos mutantes D270K e D270V em comparação com o C2B8 de tipo selvagem.
Descrição Pormenorizada das Especificações Preferidas I. Definições
Ao longo da presente especificação e reivindicações, a numeração dos resíduos numa cadeia pesada da IgG é a do índice EU, como em Kabat et ai., "Sequences of Proteins of Immunological Interest", 5a Edição, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991), expressamente incorporado aqui por referência. 0 "índice EU como em Kabat" refere-se à numeração dos resíduos do anticorpo EU de IgGl humana.
Usa-se o termo "região Fc" para definir uma região C-terminal da cadeia pesada de uma IgG como apresentada na Figura 1. Apesar das fronteiras da região Fc da cadeia pesada de uma IgG poderem variar ligeiramente, a região Fc da cadeia pesada da IgG humana é habitualmente definida como estendendo-se desde o resíduo de aminoácido na posição Cys226 até ao terminal carboxilo. 0 termo "polipéptido que contém uma região Fc" refere-se a um polipéptido, como um anticorpo ou imunoadesina (ver definições abaixo), que compreende uma região Fc. A região Fc de uma IgG compreende dois domínios constantes, CH2 e CH3, como apresentado na Figura 1. 0 13 domínio "CH2" da região Fc de uma IgG humana (também referido como domínio "Cy2") estende-se habitualmente desde o aminoácido 231 até ao aminoácido 340. O domínio CH2 é único, pois não tem um emparelhamento próximo com outro domínio. Ao invés, duas cadeias de hidrato de carbono ramificadas N-ligadas estão interpostas entre os dois domínios CH2 de uma molécula de IgG nativa intacta. Especulou-se que o hidrato de carbono poderá proporcionar um substituto para o emparelhamento domínio-domínio e ajudar a estabilizar o domínio CH2. Burton, Molec. Immunol. 22: 161-206 (1985). "Região conectora" é geralmente definida como estendendo-se desde Glu216 até Pro230 da IgGl humana (Burton, Molec. Immunol. 2_2: 161-206 (1985)). As regiões conectoras de outros isotipos de IgG podem ser alinhadas com a sequência da IgGl colocando nas mesmas posições o primeiro e último resíduos cisteína que formam ligações S-S inter-cadeias pesadas. "Clq" é um polipéptido que inclui um sítio de ligação para a região Fc de uma imunoglobulina. O Clq juntamente com duas serina-proteases, Clr e Cls, forma o complexo Cl, o primeiro componente da via da citotoxicidade dependente do complemento (CDC). O Clq humano pode ser comercialmente adquirido, por exemplo, à Quidel, San Diego, CA. O termo "receptor de Fc" ou "FcR" é usado para descrever um receptor que se liga à região Fc de um anticorpo. O FcR preferido é tal que se liga a um anticorpo IgG (um receptor gama) e inclui receptores das subclasses FcyRI, FcyRII e FcyRIII, incluindo variantes alélicas e formas processadas alternativamente destes receptores. Os 14
FcRs são revistos em Ravetch e Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9: 457-92 (1991); Capei et al., Immunomethods 4_: 25-34 (1994) , e de Haas et al., J. Lab. Clin. Med. 126: 330-41 (1995) . Outros FcRs, incluindo aqueles a serem identificados no futuro, estão abrangidos no termo "FcR" aqui usado. O termo também inclui o receptor neonatal, FcRn, que é responsável pela transferência de IgGs maternas para o feto (Guyer et al., J. Immunol. 117: 587 (1976), e Kim et al., J. Immunol. 2_4: 249 (1994)). O termo "domínio de ligação" refere-se à região de um polipéptido que se liga a outra molécula. No caso de um FcR, o domínio de ligação pode compreender uma porção de uma respectiva cadeia polipeptídica (por exemplo, a sua cadeia a) que é responsável pela ligação a uma região Fc. Um domínio de ligação útil é o domínio extracelular da cadeia α de um FcR. O termo "anticorpo" é usado no sentido mais lato e abrange especificamente anticorpos monoclonais (incluindo anticorpos monoclonais completos), anticorpos policlonais, anticorpos multiespecíficos (por exemplo, anticorpos biespecíficos) e fragmentos de anticorpos, desde que exibam a actividade biológica desejada. "Fragmentos de anticorpos", como definido para a finalidade da presente invenção, compreendem uma porção de um anticorpo intacto, que geralmente inclui a região de ligação de antigenes ou variável do anticorpo intacto, desde que retenham pelo menos a região CH2 de um domínio constante da cadeia pesada de uma imunoglobulina IgG, compreendendo os resíduos de aminoácidos 322, 329 e 331, e tenham a capacidade, isoladamente ou em combinação com 15 outro fragmento de anticorpo, para se ligarem especificamente a um antigene seleccionado. Exemplos de fragmentos de anticorpos incluem anticorpos lineares, moléculas de anticorpos de cadeia única e anticorpos multiespecificos formados a partir de fragmentos de anticorpos. Preferivelmente, os fragmentos de anticorpos retêm pelo menos parte da região conectora e, opcionalmente, CHI da cadeia pesada de uma igG. Mais preferivelmente, os fragmentos de anticorpos retêm a totalidade da região constante da cadeia pesada de uma IgG e incluem a cadeia leve de uma IgG. 0 termo "anticorpo monoclonal", tal como é aqui utilizado, refere-se a um anticorpo obtido de uma população de anticorpos substancialmente homogéneos, isto é, os anticorpos individuais que constituem a população são idênticos exceptuando possíveis mutações de ocorrência natural que possam estar presentes em quantidades muito pequenas. Os anticorpos monoclonais são altamente específicos, sendo dirigidos contra um único sítio antigénico. Além disso, em contraste com preparações de anticorpos (policlonais) convencionais, que tipicamente incluem diferentes anticorpos dirigidos contra diferentes determinantes (epítopos), cada anticorpo monoclonal é dirigido contra um único determinante do antigene. 0 modificador "monoclonal" indica a característica do anticorpo que consiste em ser obtido de uma população substancialmente homogénea de anticorpos, e não deve ser considerado como requerendo a produção do anticorpo por qualquer método particular. Por exemplo, os anticorpos monoclonais a serem utilizados de acordo com a presente invenção podem ser preparados pelo método do hibridoma, primeiramente descrito por Kohler et al., Nature 256: 495 16 (1975), ou podem ser preparados por métodos de DNA recombinante (ver, por exemplo, Patente U.S. N° 4 816 567). Os "anticorpos monoclonais" também podem ser isolados de bibliotecas de anticorpos de expressão em fagos utilizando as técnicas descritas em Clackson et al., Nature 352: 624-628 (1991), e Marks et ai., J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1991), por exemplo.
Os anticorpos monoclonais aqui referidos especificamente incluem anticorpos "quiméricos" (imunoglobulinas), nos quais uma porção da cadeia pesada e/ou leve é idêntica ou homóloga a sequências correspondentes presentes em anticorpos derivados de uma espécie particular ou pertencentes a uma classe ou subclasse particular de anticorpos, ao passo que o restante da(s) cadeia(s) é(são) idêntica(s) ou homóloga(s) a sequências correspondentes presentes em anticorpos derivados de outra espécie ou pertencentes a outra classe ou subclasse de anticorpos, bem como fragmentos desses anticorpos, desde que exibam a actividade biológica desejada (Patente U.S. N° 4 816 567, e Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 81: 6851-6855 (1984)).
Formas "humanizadas" de anticorpos não humanos (por exemplo, murinos) são anticorpos quiméricos que contêm uma sequência mínima derivada de uma imunoglobulina não humana. Na sua maior parte, os anticorpos humanizados são imunoglobulinas humanas (anticorpo receptor) nas quais resíduos de uma região hipervariável do receptor são substituídos por resíduos de uma região hipervariável de uma espécie não humana (anticorpo dador), como ratinho, rato, coelho ou primata não humano, com a especificidade, afinidade e capacidade desejadas. Nalguns casos, resíduos 17 da região de arcabouço (FR) de Fv da imunoglobulina humana são substituídos por resíduos não humanos correspondentes. Além disso, anticorpos humanizados podem compreender resíduos que não se encontram no anticorpo receptor ou no anticorpo dador. Fazem-se estas modificações para refinar suplementarmente o desempenho do anticorpo. Em geral, o anticorpo humanizado compreenderá substancialmente a totalidade de pelo menos um, e tipicamente dois domínios variáveis, nos quais todas ou substancialmente todas as alças hipervariáveis correspondem às de uma imunoglobulina não humana e todas ou substancialmente todas as regiões FR são as de uma sequência de uma imunoglobulina humana. 0 anticorpo humanizado também compreenderá, opcionalmente, pelo menos uma porção de uma região constante de uma imunoglobulina (Fc), tipicamente a de uma imunoglobulina humana. Quanto a mais pormenores ver Jones et al., Nature 321: 522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332: 323-329 (1988), e Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2: 593-596 (1992) . 0 termo "região hipervariável", quando for usado aqui, refere-se aos resíduos de aminoácidos de um anticorpo que são responsáveis pela ligação de antigenes. A região hipervariável compreende resíduos de aminoácidos de uma "região determinante de complementaridade" ou "CDR" (isto é, os resíduos 24-34 (Ll) , 50-56 (L2) e 89-97 (L3) do domínio variável da cadeia leve e 31-35 (Hl), 50-65 (H2) e 95-102 (H3) do domínio variável da cadeia pesada; Kabat et al., "Sequences of Proteins of Immunological Interest" 5a Edição, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)) e/ou aqueles resíduos de uma "alça hipervariável" (isto é, os resíduos 26-32 (Ll), 50-52 (L2) e 91-96 (L3) do domínio variável da cadeia leve e 26- 18 32 (Hl), 53-55 (H2) e 96-101 (H3) do domínio variável da cadeia pesada; Chothia e Lesk, J. Mol. Biol. 196: 901-917 (1987)). Resíduos de "arcabouço" ou "FR" são aqueles resíduos do domínio variável diferentes dos resíduos da região hipervariável como definida aqui.
Tal como é usado aqui, o termo "imunoadesina" designa moléculas do tipo anticorpo que combinam o "domínio de ligação" de uma proteína "adesina" (por exemplo, um receptor, ligando ou enzima) heteróloga com um domínio constante de uma imunoglobulina. Estruturalmente, as imunoadesinas compreendem uma fusão da sequência de aminoácidos da adesina com a especificidade de ligação desejada, que é diferente do sítio de reconhecimento e ligação de antigenes (sítio de combinação de antigenes) de um anticorpo (isto é, é "heteróloga") e uma sequência do domínio constante de uma imunoglobulina. O termo "domínio de ligação de ligandos", tal como é usado aqui, refere-se a qualquer receptor nativo da superfície celular ou qualquer respectiva região ou derivado que retém pelo menos uma capacidade qualitativa de ligação de ligandos de um receptor nativo correspondente. Numa forma de realização específica, o receptor provém de um polipéptido da superfície celular com um domínio extracelular que é homólogo a um membro da superfamília de genes de imunoglobulinas. Outros receptores que não são membros da superfamília de genes de imunoglobulinas mas que, ainda assim, estão especificamente abrangidos por esta definição são receptores para citoquinas e, em particular, receptores com actividade de tirosina quinase (tirosina quinases receptoras), membros das superfamílias da hematopoietina e receptores do factor de crescimento dos 19 nervos e moléculas de adesão celular, por exemplo, (E-, L-e P-) selectinas. 0 termo "domínio de ligação de receptores" é usado para designar qualquer ligando nativo para um receptor, incluindo moléculas de adesão celular, ou qualquer região ou derivado desse ligando nativo que retém pelo menos uma capacidade qualitativa de ligação a receptores de um ligando nativo correspondente. Esta definição, entre outras, inclui especificamente sequências de ligação de ligandos para os receptores acima mencionados.
Uma "quimera anticorpo-imunoadesina" compreende uma molécula que combina pelo menos um domínio de ligação de um anticorpo (como definido aqui) com pelo menos uma imunoadesina (como definida nesta candidatura). Quimeras anticorpo-imunoadesina exemplificativas são as quimeras CD4-IgG biespecíficas descritas em Berg et al., PNAS (U.S.A.) 8_8_: 4723-4727 (1991), e Chamow et al., J. Immunol. 153: 4268 (1994) .
Um polipéptido "isolado" é um polipéptido que foi identificado e separado e/ou recuperado de um componente do seu ambiente natural. Componentes contaminantes do seu ambiente natural são materiais que iriam interferir em aplicações de diagnóstico ou terapêuticas do polipéptido, e podem incluir enzimas, hormonas e outros solutos proteináceos ou não proteináceos. Em especificações preferidas, o polipéptido será purificado (1) em mais de 95% por peso do polipéptido, determinado pelo método de Lowry, e muito preferivelmente mais de 99% por peso, (2) num grau suficiente para se obterem pelo menos 15 resíduos da sequência de aminoácidos N-terminal ou interna 20 utilizando um sequenciador com cavidade giratória ou (3) até à homogeneidade por SDS-PAGE, em condições redutoras ou não redutoras, utilizando coloração com azul de Coomassie ou, preferivelmente, prata. Polipéptido isolado inclui o polipéptido in situ no interior de células recombinantes, uma vez que não estará presente pelo menos um componente do ambiente natural do polipéptido. Habitualmente, no entanto, um polipéptido isolado será preparado por pelo menos um passo de purificação. "Tratamento" refere-se a tratamento terapêutico e a medidas profilácticas ou preventivas. Os necessitados de tratamento incluem os que já têm a perturbação, bem como aqueles onde se quer prevenir a perturbação.
Uma "perturbação" é qualquer estado que beneficiará do tratamento com a variante do polipéptido. Este termo inclui perturbações ou doenças crónicas e agudas, incluindo aqueles estados patológicos que predispõem o indivíduo à perturbação em questão. A palavra "etiqueta", quando é usada aqui, refere-se a um composto ou composição detectável que é conjugada directa ou indirectamente ao polipéptido. A etiqueta pode ser detectável por si própria (por exemplo, etiquetas de isótopos radioactivos ou etiquetas fluorescentes) ou, no caso de uma etiqueta enzimática, pode catalisar a alteração química de um composto ou composição do substrato que é detectável.
Uma molécula de ácido nucleico "isolada" é uma molécula de ácido nucleico que é identificada e separada de pelo menos uma molécula de ácido nucleico contaminante à qual 21 está habitualmente associada na fonte natural do ácido nucleico do polipéptido. Uma molécula de ácido nucleico isolada não tem a forma ou o cenário que se encontra na natureza. Em consequência, moléculas de ácidos nucleicos isoladas distinguem-se da molécula de ácido nucleico tal como existe em células naturais. No entanto, uma molécula de ácido nucleico isolada inclui uma molécula de ácido nucleico contida em células que habitualmente expressam o polipéptido nas quais, por exemplo, a molécula de ácido nucleico tem uma localização cromossómica diferente da de células naturais. A expressão "sequências de controlo" refere-se a sequências de DNA necessárias para a expressão de uma sequência codificadora operativamente ligada num organismo hospedeiro particular. As sequências de controlo que são adequadas para procariotas, por exemplo, incluem um promotor, opcionalmente uma sequência operadora e um sitio de ligação de ribossomas. É conhecido que células eucarióticas utilizam promotores, sinais de poliadenilação e intensificadores.
Um ácido nucleico está "operativamente ligado" quando adopta uma relação funcional com outra sequência de ácido nucleico. Por exemplo, DNA para uma pré-sequência ou lider secretor está operativamente ligado a DNA para um polipéptido se for expresso como uma pré-proteina que participa na secreção do polipéptido; um promotor ou intensificador está operativamente ligado a uma sequência codificadora se afectar a transcrição da sequência, ou um sitio de ligação de ribossomas está operativamente ligado a uma sequência codificadora se estiver posicionado de modo a facilitar a tradução. Em geral, "operativamente ligado" 22 significa que as sequências de DNA a serem ligadas são contíguas e, no caso de um líder secretor, contíguas e na fase de leitura. Todavia, os intensificadores não têm de ser contíguos. A ligação é efectuada por ligação em sítios de restrição convenientes. Se esses sítios não existirem, utilizam-se os adaptadores ou agentes de ligação oligonucleotídicos sintéticos de acordo com a prática convencional.
Tal como são usadas aqui, as expressões "célula", "linha celular" e "cultura celular" são usadas de forma intermutável e todas essas designações incluem a progenitura. Assim, as palavras "transformantes" e "células transformadas" incluem a célula primária em questão e culturas dela derivadas independentemente do número de transferências. Também deve entender-se que toda a progenitura poderá não ser precisamente idêntica no que se refere ao conteúdo do DNA, devido a mutações deliberadas ou inadvertidas. Está incluída progenitura mutante que tem a mesma função ou actividade biológica rastreada na célula originalmente transformada. Quando se pretenderem designações distintas, será claro do contexto. 0 termo "complexo molecular", quando usado aqui, refere-se à estrutura relativamente estável que se forma quando duas ou mais moléculas heterólogas (por exemplo, polipéptidos) se ligam (preferivelmente de forma não covalente) entre si. 0 complexo molecular preferido aqui é um complexo imunológico. "Complexo imunológico" refere-se à estrutura relativamente estável que se forma quando pelo menos uma molécula-alvo e pelo menos um polipéptido que contém uma 23 região Fc heteróloga se ligam entre si, formando um complexo de maior peso molecular. Exemplos de complexos imunológicos são agregados antigene-anticorpo e agregados molécula-alvo-imunoadesina. 0 termo "complexo imunológico", tal como é usado agui, a menos gue indicado em contrário, refere-se a um complexo ex vivo (isto é, diferente quanto à forma ou cenário que se encontra na natureza). No entanto, o complexo imunológico pode ser administrado a um mamífero, por exemplo, para avaliar a eliminação do complexo imunológico no mamífero. 0 termo "molécula-alvo" refere-se a uma molécula, habitualmente um polipéptido, à qual é capaz de se ligar uma molécula heteróloga e que tem um ou mais sítios de ligação para a molécula heteróloga. 0 termo "sítio de ligação" refere-se a uma região de uma molécula à qual se pode ligar outra molécula. A "primeira molécula-alvo" aqui compreende pelo menos dois sítios de ligação distintos (por exemplo, dois até cinco sítios de ligação separados) para um analito (por exemplo, um polipéptido que contém uma região Fc), de modo que pelo menos duas moléculas do analito se podem ligar à primeira molécula-alvo. Na especificação preferida da invenção, os dois ou mais sítios de ligação são idênticos (por exemplo, têm a mesma sequência de aminoácidos, em que a molécula-alvo é um polipéptido). No Exemplo 1 abaixo, a primeira molécula-alvo foi IgE e tinha dois sítios de ligação separados na sua região Fc, aos quais se pôde ligar o polipéptido que continha a região Fc (um anticorpo anti-IgE, E27) . Outras primeiras moléculas-alvo incluem dímeros de monómeros substancialmente idênticos (por exemplo, neurotrofinas, IL8 e VEGF) ou são polipéptidos que compreendem duas ou mais cadeias polipeptídicas substancialmente idênticas (por 24 exemplo, anticorpos ou imunoadesinas). A "segunda molécula-alvo" compreende pelo menos dois sítios de ligação distintos (por exemplo, dois até cinco sítios de ligação separados) para a primeira molécula-alvo, de modo que pelo menos duas primeiras moléculas-alvo se podem ligar à segunda molécula-alvo. Preferivelmente, os dois ou mais sítios de ligação são idênticos (por exemplo, têm a mesma sequência de aminoácidos, em que a molécula-alvo é um polipéptido). No Exemplo 2, a segunda molécula-alvo foi VEGF, que tem um par de sítios de ligação distintos aos quais se pôde ligar o domínio variável do anticorpo para IgE. São contempladas outras segundas moléculas-alvo, por exemplo, outros dímeros de monómeros substancialmente idênticos (por exemplo, neurotrofinas ou IL8) ou polipéptidos compreendendo dois ou mais domínios substancialmente idênticos (por exemplo, anticorpos ou imunoadesinas).
Um analito é uma substância que se pretende analisar. 0 analito preferido é um polipéptido que contém uma região Fc que se pretende analisar quanto à sua capacidade para se ligar a um receptor de Fc.
Um "receptor" é um polipéptido capaz de se ligar a pelo menos um ligando. 0 receptor preferido é um receptor da superfície celular que tem um domínio de ligação de ligandos extracelular e, opcionalmente, outros domínios (por exemplo, domínio transmembranar, domínio intracelular e/ou âncora membranar). 0 receptor a ser avaliado no ensaio descrito aqui pode ser um receptor intacto ou respectivo fragmento ou derivado (por exemplo, uma proteína de fusão que compreende o domínio de ligação do receptor fundido a um ou mais polipéptidos heterólogos). Além disso, o 25 receptor a ser avaliado quanto às suas propriedades de ligação pode estar presente numa célula ou isolado e opcionalmente revestido numa placa de ensaio, ou alguma outra fase sólida. A frase "receptor de baixa afinidade" designa um receptor que tem fraca afinidade de ligação para um ligando de interesse, por exemplo, tem uma constante de ligação de cerca de 50 nM ou afinidade pior. Receptores de baixa afinidade exemplificativos incluem FcyRII e FcyRIII, bem como moléculas de adesão, como integrinas.
Um "polipéptido paterno" é um polipéptido que compreende uma sequência de aminoácidos que não tem uma ou mais das substituições na região Fc reveladas aqui e/ou que difere quanto à função efectora em comparação com uma variante do polipéptido como revelada aqui. O polipéptido paterno pode compreender uma região Fc de sequência nativa ou uma região Fc com modificações existentes na sequência de aminoácidos (como adições, deleções e/ou substituições). II. Modos de Implementar a Invenção A invenção aqui apresentada refere-se a um método para preparar uma variante do polipéptido. O polipéptido "paterno", "de partida" ou "não variante" é preparado utilizando técnicas disponíveis na área para gerar polipéptidos compreendendo uma região Fc. Na especificação preferida da invenção, o polipéptido é um anticorpo, e métodos exemplificativos para gerar anticorpos são descritos em mais pormenor nas secções seguintes. No entanto, o polipéptido pode ser qualquer outro polipéptido compreendendo uma região Fc, por exemplo, uma imunoadesina. 26 Métodos para preparar imunoadesinas são aqui descritos abaixo mais pormenorizadamente. 0 polipéptido de partida de interesse particular aqui é habitualmente um polipéptido que se liga a Clq e exibe citotoxicidade dependente do complemento (CDC) . As substituições de aminoácidos descritas aqui servirão geralmente para alterar a capacidade do polipéptido de partida para se ligar a Clq e/ou modificar a sua função de citotoxicidade dependente do complemento, por exemplo, para reduzir e, preferivelmente, abolir estas funções efectoras. Contudo, são contemplados aqui polipéptidos compreendendo substituições em uma ou mais das posições descritas com funções efectoras melhoradas. Por exemplo, o polipéptido de partida pode ser incapaz de se ligar a Clq e/ou mediar CDC e pode ser modificado, de acordo com os ensinamentos aqui apresentados, de modo a adquirir estas funções efectoras. Além disso, polipéptidos com actividade pré-existente de ligação a Clq, opcionalmente possuindo também capacidade para mediar CDC, podem ser modificados de modo que uma ou ambas estas actividades sejam intensificadas.
Para gerar a variante do polipéptido introduzem-se na região Fc do polipéptido de partida uma ou mais alterações de aminoácidos (por exemplo, substituições). As posições de aminoácidos a serem modificadas são geralmente seleccionadas das posições da cadeia pesada 270, 322, 329 e 331, em que a numeração dos resíduos da cadeia pesada de uma IgG é a do índice EU, como em Kabat et al., "Sequences of Proteins of Immunological Interest" 5a Edição, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991). Preferivelmente, a região Fc provém de uma IgG humana e, muito preferivelmente, de uma IgGl humana ou IgG3 27 humana. A região Fc da IgGl humana pode ser um alótipo A ou não A humano. A prolina está conservada na posição 329 das IgG's humanas. Este resíduo é preferivelmente substituído por alanina; todavia, é contemplada a substituição com qualquer outro aminoácido, por exemplo, serina, treonina, asparagina, glicina ou valina. A prolina está conservada na posição 331 da IgGl, IgG2 e IgG3 humanas, mas não IgG4 humana (que tem um resíduo serina na posição 331). 0 resíduo 331 é preferivelmente substituído por alanina ou outro aminoácido, por exemplo, serina (para regiões de IgGs diferentes de IgG4), glicina ou valina. A lisina 322 está conservada em IgGs humanas, e este resíduo é preferivelmente substituído por um resíduo alanina, mas é contemplada a substituição com qualquer outro resíduo de aminoácido, por exemplo, serina, treonina, glicina ou valina. A D270 está conservada em IgGs humanas, e este resíduo pode ser substituído por outro resíduo de aminoácido, por exemplo, alanina, serina, treonina, glicina, valina ou lisina.
Numa especificação, apenas uma das oito posições acima identificadas é alterada para gerar a variante do polipéptido. Preferivelmente, apenas é alterado o resíduo 270 ou 329, se for este o caso. Alternativamente, são modificadas duas ou mais das posições acima identificadas. Se for pretendido combinar substituições, são geralmente 28 combinadas substituições que diminuem a ligação a Clq humano (por exemplo, nas posições dos resíduos 270, 322, 329 3 331) . Na última especificação, todas as quatro posições (isto é, 270, 322, 329 e 331) podem ser substituídas. Pode gerar-se uma variante na qual o resíduo de aminoácido nativo na posição 329 da região constante da cadeia pesada humana é substituído por outro aminoácido, opcionalmente em combinação com uma substituição do resíduo de aminoácido na posição 331 e/ou substituição do resíduo de aminoácido na posição 322. De outro modo, o resíduo de aminoácido nativo na posição 331 e o resíduo de aminoácido nativo na posição 322 da região Fc da IgG humana podem ser ambos substituídos por outros resíduos de aminoácidos. Também é possível combinar uma substituição do aminoácido na posição 270 com outra (s) substituição(substituições) na(s) posição (posições) 322, 329 e/ou 331. O DNA que codifica a variante da sequência de aminoácidos do polipéptido de partida é preparado por uma variedade de métodos conhecidos na área. Estes métodos incluem, mas não se limitam a estes, preparação por mutagénese dirigida a sítios (ou mediada por oligonucleótidos), mutagénese por PCR e mutagénese por cassete de um DNA anteriormente preparado que codifica o polipéptido. A mutagénese dirigida a sítios é um método preferido para preparar variantes de substituição. Esta técnica é bem conhecida na área (ver, por exemplo, Cárter et al., Nucleic Acids Res. 13g 4431-4443 (1985), e Kunkel et al., Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 82_: 488 (1987)). Em resumo, ao efectuar a mutagénese dirigida a sítios de DNA, o DNA de partida é alterado hibridizando primeiramente um 29 oligonucleótido que codifica a mutação desejada para um único filamento desse DNA de partida. Após a hibridização, utiliza-se uma DNA polimerase para sintetizar um segundo filamento completo, utilizando como "primer" 0 oligonucleótido hibridizado e utilizando como modelo 0 filamento simples do DNA de partida. Assim, 0 oligonucleótido que codifica a mutação desejada é incorporado no DNA de filamentação dupla resultante.
Mutagénese por PCR também é adequada para preparar variantes de sequências de aminoácidos do polipéptido de partida. Ver Higuchi, em "PCR Protocols", páginas 177-183 (Academic Press, 1990), e Vallette et al., Nuc. Acids Res. 17: 723-733 (1989). Em resumo, quando se utilizam pequenas quantidades de DNA modelo como material de partida numa PCR, podem utilizar-se "primers" cuja sequência difere ligeiramente da região correspondente num DNA modelo para gerar quantidades relativamente grandes de um fragmento de DNA especifico que difere da sequência do modelo apenas nas posições em que os "primers" diferem do modelo.
Outro método para preparar variantes, mutagénese por cassete, baseia-se na técnica descrita por Wells et al., Gene 3£: 315-323 (1985) . O material de partida é o plasmideo (ou outro vector) que compreende o DNA do polipéptido de partida a ser mutado. Identifica(m)-se o(s) codão(codões) do DNA de partida a ser(em) mutado(s). Deve existir um sitio único de endonuclease de restrição de cada lado do(s) sitio (s) de mutação identificado(s) . Se não existirem esses sitios de restrição, podem ser gerados utilizando o método de mutagénese mediada por oligonucleótidos descrito acima para introduzi-los em localizações apropriadas no DNA do polipéptido de partida. 30 O DNA plasmídico é cortado nestes sítios, para linearizá-lo. Sintetiza-se um oligonucleótido de filamentação dupla que codifica a sequência do DNA entre os sítios de restrição, mas contendo a(s) mutação(mutações) desejada(s), utilizando procedimentos comuns, nos quais os dois filamentos do oligonucleótido são sintetizados separadamente e depois hibridizados em conjunto utilizando técnicas comuns. Este oligonucleótido de filamentação dupla é referido como a cassete. Esta cassete é concebida de modo a ter extremidades 5' e 3' compatíveis com as extremidades do plasmídeo linearizado, para que possa ser directamente ligado ao plasmídeo. Agora, este plasmídeo contém a sequência de DNA mutada.
Alternativamente, ou adicionalmente, pode determinar-se a sequência de aminoácidos desejada que codifica uma variante do polipéptido, e pode gerar-se de modo sintético uma sequência de ácido nucleico que codifica essa variante da sequência de aminoácidos. A(s) variante(s) do polipéptido preparada(s) deste modo pode(m) ser sujeita(s) a outras modificações, muitas vezes dependendo da utilização pretendida do polipéptido. Essas modificações podem envolver a alteração suplementar da sequência de aminoácidos, fusão a polipéptido(s) heterólogo(s) e/ou modificações covalentes.
Por exemplo, pode ser útil combinar as substituições de aminoácidos acima com uma ou mais substituições de aminoácidos suplementares que reduzam ou anulem a ligação de FcRs. Por exemplo, os resíduos de aminoácidos nativos em qualquer um ou mais das posições da cadeia pesada 233-238, 318 ou 331 (em que a numeração dos resíduos da cadeia 31 pesada de uma IgG é o do índice EU, como em Kabat et al., supra) podem ser substituídos por resíduo(s) não nativo (s), por exemplo, alanina.
Relativamente a outras alterações da sequência de aminoácidos, qualquer resíduo cisteína não envolvido na manutenção da conformação apropriada da variante do polipéptido também pode ser substituído, geralmente por serina, para melhorar a estabilidade oxidativa da molécula e prevenir formação aberrante de ligações cruzadas.
Outro tipo de substituição de aminoácidos serve para alterar o padrão de glicosilação do polipéptido. Isto pode ser conseguido por deleção de uma ou mais fracções hidrato de carbono presentes no polipéptido e/ou adição de um ou mais sítios de glicosilação que não estão presentes no polipéptido. A glicosilação de polipéptidos é, tipicamente, N-ligada ou O-ligada. N-ligada refere-se à ligação da fracção hidrato de carbono à cadeia lateral de um resíduo asparagina. As sequências tripeptídicas asparagina-X-serina e asparagina-X-treonina, em que X é qualquer aminoácido excepto prolina, são as sequências de reconhecimento para a ligação enzimática da fracção hidrato de carbono à cadeia lateral de asparagina. Assim, a presença num polipéptido de qualquer uma destas sequências tripeptídicas cria um sítio de glicosilação potencial. Glicosilação O-ligada refere-se à ligação de um dos açúcares N-acetilgalactosamina, galactose ou xilose a um hidroxiaminoácido, muito habitualmente serina ou treonina, apesar de também se poderem utilizar 5-hidroxiprolina ou 5-hidroxilisina. A adição de sítios de glicosilação ao polipéptido é convenientemente realizada alterando a sequência de aminoácidos de modo a conter uma ou mais das sequências 32 tripeptídicas descritas acima (para sitios de glicosilação N-ligados). A alteração também pode ser efectuada pela adição, ou substituição, de um ou mais residuos serina ou treonina à sequência do polipéptido original (para sitios de glicosilação O-ligados). Uma variante de glicosilação exemplificativa tem uma substituição de aminoácidos do residuo Asn 297 da cadeia pesada. A variante do polipéptido pode ser sujeita a um ou mais ensaios para avaliar qualquer alteração da actividade biológica em comparação com o polipéptido de partida. Por exemplo, pode avaliar-se a capacidade da variante para se ligar a Clq e mediar a citotoxicidade dependente do complemento (CDC).
Para determinar a ligação a Clq pode realizar-se um ensaio ELISA de ligação de Clq. Em resumo, placas de ensaio podem ser revestidas, durante a noite a 4°C, com a variante do polipéptido ou polipéptido de partida (controlo) num tampão de revestimento. Em seguida, as placas podem ser lavadas e bloqueadas. Após a lavagem, uma aliquota de Clq humano pode ser adicionada a cada cavidade e incubada durante 2 horas à temperatura ambiente. Após outra lavagem, 100 μΐ de um anticorpo de ovelha conjugado com peroxidase anti-Clq do complemento podem ser adicionados a cada cavidade e incubados durante 1 hora à temperatura ambiente. A placa pode ser novamente lavada com tampão de lavagem e podem adicionar-se a cada cavidade 100 pL de tampão de substrato que contém OPD (dicloridrato de O-fenilenodiamina (Sigma)). Pode permitir-se que a reacção de oxidação, observada pelo aparecimento de uma cor amarela, prossiga durante 30 minutos, sendo terminada pela adição de 100 μΐ 33 de H2S04 4,5 N. Seguidamente pode ler-se a absorvância a (492 - 405) nm.
Uma variante do polipéptido exemplificativa é uma variante que exibe uma "redução significativa da ligação de Clq" neste ensaio. Isto significa que cerca de 100 pg/mL da variante do polipéptido exibem cerca de 50 vezes ou mais de redução da ligação de Clq, em comparação com 100 pg/mL de um anticorpo de controlo com uma região Fc de IgGl não mutada. Na especificação mais preferida, a variante do polipéptido "não se liga a Clq", isto é, 100 pg/mL da variante do polipéptido exibem cerca de 100 vezes ou mais de redução da ligação de Clq em comparação com 100 pg/mL do anticorpo de controlo.
Outra variante exemplificativa é uma variante que "tem maior afinidade de ligação para Clq humano do que o polipéptido paterno". Essa molécula pode exibir, por exemplo, cerca de duas vezes ou mais, e preferivelmente cerca de cinco vezes ou mais, de melhoria da ligação de Clq humano em comparação com o polipéptido paterno (por exemplo, aos valores IC50 para estas duas moléculas). Por exemplo, a ligação a Clq humano pode ser cerca de duas vezes até cerca de 500 vezes, e preferivelmente desde cerca de duas vezes ou desde cerca de cinco vezes até cerca de 1000 vezes melhorada em comparação com o polipéptido paterno.
Para avaliar a activação do complemento pode realizar-se um ensaio de citotoxicidade dependente do complemento (CDC), por exemplo, como descrito em Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202: 163 (1996). Em resumo, várias 34 concentrações da variante do polipéptido e do complemento humano podem ser diluídas com tampão. Células que expressam o antigene ao qual se liga a variante do polipéptido podem ser diluídas para uma densidade de ~1 x 106 células/mL. Misturas da variante do polipéptido, complemento humano diluído e células que expressam o antigene podem ser adicionadas a uma placa de 96 cavidades de cultura de tecidos de fundo plano e deixadas incubar durante 2 horas a 37°C e 5% de CO2, para facilitar a lise celular mediada pelo complemento. Em seguida, 50 pL de Alamar azul (Accumed International) podem ser adicionados a cada cavidade e o sistema pode ser incubado durante a noite a 37°C. Mede-se a absorvância utilizando um fluorómetro de 96 cavidades com excitação a 530 nm e emissão a 590 nm. Os resultados podem ser expressos em unidades de fluorescência relativa (RFU). As concentrações da amostra podem ser calculadas a partir de uma curva padrão e a actividade percentual, em comparação com o polipéptido não variante, é apresentada para a variante do polipéptido de interesse.
Ainda outra variante exemplificativa "não activa o complemento". Por exemplo, 0,6 pg/mL da variante do polipéptido exibem cerca de 0 - 10% de actividade de CDC neste ensaio em comparação com 0,6 pg/mL de um anticorpo de controlo com uma região Fc de IgGl não mutada. Preferivelmente, a variante não aparenta ter qualquer actividade de CDC no ensaio de CDC acima.
Preferivelmente, a variante do polipéptido retém essencialmente a capacidade para se ligar a antigenes em comparação com 0 polipéptido não variante, isto é, a capacidade de ligação não é pior do que cerca de 20 vezes, 35 por exemplo, não pior do que cerca de 5 vezes relativamente à do polipéptido não variante. Pode determinar-se a capacidade de ligação da variante do polipéptido utilizando técnicas tais como análise de triagem de células activadas por fluorescência (FACS) ou radioimunoprecipitação (RIA) , por exemplo.
Também pode avaliar-se a capacidade da variante do polipéptido para se ligar a um FcR. Quando o FcR for um receptor de Fc de afinidade elevada, como FcyRI ou FcRn, pode medir-se a ligação por titulação da variante do polipéptido monomérico e medindo a variante do polipéptido ligada utilizando um anticorpo que se liga especificamente à variante do polipéptido num formato de ELISA padrão (ver Exemplo 2 abaixo) . Outro ensaio de ligação de FcR para FcRs de baixa afinidade é apresentado mais pormenorizadamente na secção seguinte.
Preferivelmente, a variante retém a capacidade para se ligar a um ou mais FcRs, por exemplo, a capacidade da variante do polipéptido para se ligar a FcyRI, FcyRI I, FcyRIII e/ou FcRn não está reduzida em mais de cerca de 20 vezes, preferivelmente não está reduzida em mais de cerca de 10 vezes e muito preferivelmente não está reduzida em mais de cerca de duas vezes em comparação com o polipéptido de partida, como determinado nos ensaios de FcyRI ou FcRn do Exemplo 2 ou nos ensaios de FcyRll ou FcyRIII descritos na secção seguinte. Ά. Ensaio de Ligação de Receptores e Complexo Imunológico
Foi desenvolvido aqui um ensaio de ligação de receptores que é particularmente útil para determinar a 36 ligação de um analito de interesse a um receptor quando a afinidade do analito para o receptor é relativamente baixa, por exemplo, na gama micromolar, como é o caso de FcyRIIa, FcyRIIb, FcyRIIIa e FcyRIIIb. O método envolve a formação de um complexo molecular que tem maior avidez para o receptor de interesse em comparação com o analito não complexado. 0 complexo molecular preferido é um complexo imunológico que compreende: (a) um polipéptido que contém uma região Fc (como um anticorpo ou uma imunoadesina) ; (b) uma primeira molécula-alvo que compreende pelo menos dois sitios de ligação para o polipéptido que contém a região Fc, e (c) uma segunda molécula-alvo que compreende pelo menos dois sitios de ligação para a primeira molécula-alvo.
No Exemplo 1 abaixo, o polipéptido que contém a região Fc é um anticorpo anti-IgE, como o anticorpo E27 (Figs. 4A-4B) . 0 anticorpo E27, quando misturado com IgE humana numa razão molar 1:1, forma um hexâmero estável que consiste em três moléculas de E27 e três moléculas de IgE. No Exemplo 1 abaixo, a "primeira molécula-alvo" é uma forma quimérica da IgE em que a porção Fab de um anticorpo anti-VEGF está fundida à porção Fc da IgE humana, e a "segunda molécula-alvo" é o antigene ao qual se liga a porção Fab (isto é, VEGF) . Cada molécula de IgE liga-se a duas moléculas de VEGF. 0 VEGF também se liga a duas moléculas de IgE por molécula de VEGF. Quando o VEGF humano recombinante foi adicionado, numa razão molar 2:1, a hexâmeros lgE:E27, os hexâmeros ligaram-se em complexos de maior peso molecular via a interacção IgE:VEGF (Fig. 5). A região Fc do anticorpo anti-IgE do complexo imunológico resultante liga-se a FcR com maior avidez do que anti-IgE não complexado ou hexâmeros anti-IgE:IgE. 37 São contempladas outras formas de complexos moleculares para utilização no ensaio de receptores. Exemplos compreendendo apenas uma combinação polipéptido que contém uma região Fc:primeira molécula-alvo incluem uma combinação imunoadesina:ligando, como imunoadesina com o receptor do VEGF (KDR):VEGF, e um anticorpo biespecifico completo (bsAb):primeira molécula-alvo. Outro exemplo de uma combinação polipéptido que contém uma região Fc:primeira molécula-alvo:segunda molécula-alvo inclui uma combinação anticorpo não bloqueador:receptor solúvel:ligando, como anticorpo anti-Trk:receptor do Trk solúvel:neurotrofina (Urfer et ai., J. Biol. Chem. 273(10) : 5829-5840 (1998)).
Para além da utilização num ensaio de ligação de receptores, os complexos imunológicos descritos acima têm outras aplicações, incluindo a avaliação da função do polipéptido que contém uma região Fc e eliminação do complexo imunológico in vivo. Assim, o complexo imunológico pode ser administrado a um mamífero (por exemplo, num estudo animal pré-clínico) e ser avaliado quando ao seu tempo de semi-vida, etc.
Para determinar a ligação de receptores, um polipéptido que compreende pelo menos o domínio de ligação do receptor de interesse (por exemplo, o domínio extracelular de uma subunidade α de um FcR) pode ser revestido numa fase sólida, como uma placa de ensaio. O domínio de ligação do receptor isoladamente ou uma proteína de fusão com receptor pode ser revestido na placa utilizando procedimentos comuns. Exemplos de proteínas de fusão com receptores incluem a proteína de fusão receptor-glutationa S-transferase (GST), proteína de fusão receptor-domínio de ligação de quitina, proteína de fusão receptor-marcador 38 hexa-His (revestidas em placas revestidas com glutationa, quitina e níquel, respectivamente). Alternativamente, uma molécula de captura pode ser revestida na placa de ensaio e utilizada para se ligar à proteína de fusão com receptor via a porção não receptora da proteína de fusão. Exemplos incluem F(ab')2 anti-hexa-His revestido na placa de ensaio, usado para capturar a fusão receptor-cauda de hexa-His, ou anticorpo anti-GST revestido na placa de ensaio, usado para capturar uma fusão receptor-GST. Noutras especificações pode avaliar-se a ligação a células que expressam pelo menos o domínio de ligação do receptor. As células podem ser células hematopoiéticas de ocorrência natural que expressam o FcR de interesse ou podem ser transformadas com ácido nucleico que codifica o FcR, ou respectivo domínio de ligação, de modo que o domínio de ligação seja expresso na superfície da célula a ser testada. 0 complexo imunológico aqui descrito acima é adicionado às placas revestidas com o receptor e é incubado durante um período de tempo suficiente para que o analito se ligue ao receptor. Em seguida, as placas podem ser lavadas para remover complexos não ligados, e pode detectar-se a ligação do analito de acordo com métodos conhecidos. Por exemplo, pode detectar-se a ligação utilizando um reagente (por exemplo, um anticorpo ou respectivo fragmento) que se liga especificamente ao analito e que está opcionalmente conjugado com uma etiqueta detectável (etiquetas detectáveis e métodos para conjugá-las a polipéptidos são descritos abaixo na secção intitulada "Utilizações Não Terapêuticas da Variante do Polipéptido").
Por motivos de conveniência, os reagentes podem ser fornecidos um estojo de ensaio, isto é, uma combinação 39 empacotada de reagentes, para combinação com o analito na avaliação da capacidade do analito para se ligar a um receptor de interesse. Os componentes do estojo serão geralmente fornecidos em razões pré-determinadas. 0 estojo pode fornecer a primeira molécula-alvo e/ou a segunda molécula-alvo, opcionalmente complexadas entre si. 0 estojo também pode incluir placas de ensaio revestidas com o receptor, ou respectivo dominio de ligação (por exemplo, o dominio extracelular da subunidade α de um FcR) . Habitualmente, o estojo também fornecerá outros reagentes, como um anticorpo que se liga especificamente ao analito a ser avaliado, etiquetado directa ou indirectamente com uma etiqueta enzimática. Quando a etiqueta detectável for uma enzima, o estojo incluirá substratos e cofactores requeridos pela enzima (por exemplo, um precursor do substrato que proporciona o cromóforo ou fluoróforo detectável) . Adicionalmente, podem incluir-se outros aditivos, como estabilizadores, tampões (por exemplo, tampão de lise de ensaio e/ou lavagem) e afins. As quantidades relativas dos vários reagentes podem variar muito para proporcionar concentrações em solução dos reagentes que optimizam substancialmente a sensibilidade do ensaio. Em particular, os reagentes podem ser fornecidos na forma de pós secos, habitualmente liofilizados, incluindo excipientes que, por dissolução, darão origem a uma solução reagente com a concentração apropriada. Adequadamente, o estojo também inclui instruções para realizar o ensaio. B. Preparação de Anticorpos
Na especificação preferida da invenção, o polipéptido que contém uma região Fc que é modificado de acordo com os ensinamentos aqui apresentados é um anticorpo. Apresentam-se a seguir técnicas para produzir anticorpos. 40 (i) Selecção e preparação de antigenes
Quando o polipéptido for um anticorpo, é dirigido contra um antigene de interesse. Preferivelmente, o antigene é um polipéptido biologicamente importante, e a administração do anticorpo a um mamífero que sofre de uma doença ou perturbação pode resultar num benefício terapêutico para esse mamífero. No entanto, também são contemplados anticorpos dirigidos contra antigenes não polipeptídicos (tais como antigenes glicolipídicos associados a tumores; ver patente U.S. 5 091 178).
Quando o antigene for um polipéptido, poderá ser uma molécula transmembranar (por exemplo, receptor) ou um ligando, como um factor de crescimento. Antigenes exemplificativos incluem moléculas tais como renina; uma hormona de crescimento, incluindo hormona de crescimento humano e hormona de crescimento bovino; factor de libertação da hormona de crescimento; hormona paratiróide; hormona estimulante da tiróide; lipoproteínas; alfa-1-antitripsina; cadeia A da insulina; cadeia B da insulina; proinsulina; hormona estimulante do folículo; calcitonina; hormona luteinizante; glucagon; factores de coagulação, como factor VIIIC, factor IX, factor tecidual e factor de von Willebrand; factores anti-coagulação, como Proteína C; factor natriurético atrial; surfactante pulmonar; um activador do plasminogénio, como uroquinase ou urina humana ou activador do plasminogénio do tipo em tecidos (t-PA); bombesina; trombina; factor de crescimento hematopoiético; factor de necrose tumoral alfa e beta; encefalinase; RANTES (regulada na activação, normalmente expressa e segregada pelas células T); proteína inflamatória de macrófagos humanos (ΜΙΡ-1-alfa); uma albumina do soro, como albumina do soro humano; substância inibidora de Muellerian; cadeia 41 A da relaxina; cadeia B da relaxina; pró-relaxina; péptido associado à gonadotropina do ratinho; uma proteína microbiana, como beta-lactamase; DNase; IgE; um antigene associado a linfócitos T citotóxicos (CTLA), como CTLA-4; inibina; activina; factor de crescimento vascular endotelial (VEGF); receptores para hormonas ou factores de crescimento; proteína A ou D; factores reumatóides; um factor neurotrófico, como factor neurotrófico derivado do osso (BDNF), neurotrofina-3, 4, 5 ou 6 (NT-3, NT-4, NT-5 ou NT-6), ou um factor de crescimento dos nervos, como NGF-β; factor de crescimento derivado das plaquetas (PDGF); factor de crescimento de fibroblastos, como aFGF e bFGF; factor de crescimento epidérmico (EGF); factor de transformação do crescimento (TGF), como TGF-alfa e TGF-beta, incluindo TGF-βΐ, TGF^2, TGF-βΙ, TGF-βί ou TGF^5; factor de crescimento do tipo insulina I e II (IGF-I e IGF-II); des (1-3)-IGF-I (IGF-I do cérebro), proteínas de ligação ao factor de crescimento do tipo insulina; proteínas CD, como CD3, CD4, CD8, CD19 e CD20; eritropoietina; factores osteoindutores; imunotoxinas; uma proteína morfogenética do osso (BMP); um interferão, como interferão-alfa, beta e gama; factores estimuladores de colónias (CSFs), por exemplo, M-CSF, GM-CSF e G-CSF; interleuquinas (ILs), por exemplo, IL-1 até IL-10; superóxido dismutase; receptores de células T; proteínas membranares de superfície; factor acelerador do envelhecimento; antigene virai, tal como, por exemplo, uma porção do envelope do vírus da SIDA; proteínas de transporte; receptores de endereçamento; adressinas; proteínas reguladoras; integrinas, como CDlla, CDllb, CDllc, CD18, uma ICAM, VLA-4 e VCAM; um antigene associado a tumores, como um receptor HER2, HER3 ou HER4; e fragmentos de qualquer um dos polipéptidos listados acima. 42
Alvos moleculares preferidos para anticorpos abrangidos pela presente invenção incluem proteínas CD, como CD3, CD4, CD8, CD19, CD20 e CD34; membros da família de receptores ErbB, como o receptor do EGF, receptor HER2, HER3 ou HER4; moléculas de adesão celular, como LFA-1, Macl, pl50.95, VLA-4, ICAM-1, VCAM e αν/β3 integrina, incluindo qualquer uma das suas subunidades α ou β (por exemplo, anticorpos anti-CDlla, anti-CD18 ou anti-CDllb); factores de crescimento, como VEGF; IgE; antigenes de grupos sanguíneos; receptor flk2/flt3; receptor da obesidade (OB); receptor mpl; CTLA-4; proteína C, etc.
Antigenes solúveis ou respectivos fragmentos, opcionalmente conjugados com outras moléculas, podem ser utilizados como imunogenes para gerar anticorpos. Para moléculas transmembranares, como receptores, podem utilizar-se fragmentos destes (por exemplo, o domínio extracelular de um receptor) como imunogene. Alternativamente, células que expressam a molécula transmembranar podem ser utilizadas como imunogene. Essas células podem derivar de uma fonte natural (por exemplo, linhas de células de cancro) ou podem ser células que foram transformadas por técnicas recombinantes para expressarem a molécula transmembranar. Outros antigenes e respectivas formas úteis para preparar anticorpos serão claros para os experimentados na área. (ii) Anticorpos policlonais
Anticorpos policlonais são preferivelmente gerados em animais por múltiplas injecções subcutâneas (s.c.) ou intraperitoneais (i.p.) do antigene relevante e um adjuvante. Poderá ser útil conjugar o antigene relevante a uma proteína que é imunogénica na espécie a ser imunizada, 43 por exemplo, hemocianina de lapa californiana, albumina do soro, tiroglobulina bovina ou inibidor da tripsina da soja utilizando um agente bifuncional ou de derivatização, por exemplo, éster de maleimidobenzoilssulfossuccinimida (conjugação através de resíduos cisteína), N- hidroxissuccinimida (através de resíduos lisina), glutaraldeído, anidrido succínico, S0C12 ou R1N=C=NR, em que R e R1 são grupos alquilo diferentes.
Os animais são imunizados contra o antigene, conjugados imunogénicos ou derivados por combinação, por exemplo, de 100 pg ou 5 μg da proteína ou conjugado (para coelhos ou ratinhos, respectivamente) com 3 volumes de adjuvante completo de Freund e injecção da solução intradermicamente em múltiplos sítios. Um mês mais tarde, os animais recebem doses de reforço de 1/5 até 1/10 da quantidade original do péptido ou conjugado em adjuvante completo de Freund por injecção subcutânea em múltiplos sítios. Sete até 14 dias depois, os animais são sangrados e avalia-se o soro quanto ao título de anticorpos. Os animais recebem doses de reforço até o título atingir o patamar. Preferivelmente, o animal recebe doses de reforço do conjugado do mesmo antigene mas conjugado a uma proteína diferente e/ou por intermédio de um reagente de formação de ligações cruzadas diferente. Também podem preparar-se conjugados em culturas de células recombinantes na forma de proteínas de fusão. Agentes de agregação, como alum, também são adequadamente utilizados para intensificar a resposta imunológica. (iii) Anticorpos monoclonais
Podem preparar-se anticorpos monoclonais utilizando o método de hibridoma primeiramente descrito por Kohler et 44 âl., Nâture 256: 495 (1975), ou podem ser preparados por métodos de DNA recombinante (Patente U.S. N° 4 816 567).
No método de hibridoma, um ratinho ou outro animal hospedeiro apropriado, como um hamster ou macaco macaque, é imunizado como aqui descrito acima para induzir linfócitos que produzem, ou são capazes de produzir, anticorpos que se irão ligar especificamente à proteína utilizada para a imunização. Alternativamente, podem imunizar-se linfócitos in vitro. Em seguida, os linfócitos são fundidos a células de mieloma utilizando um agente de fusão adequado, como polietilenoglicol, para formar uma célula de hibridoma (Goding, "Monoclonal Antibodies: Principies and Practice", páginas 59-103 (Academic Press, 1986)).
As células de hibridoma preparadas deste modo são semeadas e crescem num meio de cultura adequado que contém, preferivelmente, uma ou mais substâncias que inibem o crescimento ou sobrevivência das células de mieloma paternas não fundidas. Por exemplo, se as células de mieloma paternas não tiverem a enzima hipoxantina guanina fosforribosil-transferase (HGPRT ou HPRT), o meio de cultura dos hibridomas incluirá tipicamente hipoxantina, aminopterina e timidina (meio HAT), cujas substâncias previnem o crescimento de células deficientes em HGPRT. Células de mieloma preferidas são aquelas que fundem eficientemente, suportam a produção estável em nível elevado de anticorpo pelas células produtoras do anticorpo seleccionado e são sensíveis a um meio, como meio HAT. De entre estas, linhas de células de mieloma preferidas são linhas de mieloma murino, como as derivadas de tumores de ratinho MOPC-21 e MPC-11, disponibilizadas pelo Salk 45
Institute Cell Distribution Center, San Diego, Califórnia, E.U.A., e células SP-2 ou X63-Ag8-653, disponibilizadas pela American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, E.U.A. Também foram descritas linhas de células de mieloma humano e de heteromieloma de ratinho-humano para a produção de anticorpos monoclonais humanos (Kozbor, J. Immunol. 133: 3001 (1984); Brodeur et al., "Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications", páginas 51-63 (Mareei Dekker, Inc., Nova Iorque, 1987)). O meio de cultura onde crescem as células de hibridoma é avaliado quanto à produção de anticorpos monoclonais dirigidos contra o antigene. Preferivelmente, determina-se a especificidade de ligação de anticorpos monoclonais produzidos por células de hibridoma por imunoprecipitação ou por um ensaio de ligação in vitro, como um radioimunoensaio (RIA) ou ensaio imunoabsorvente ligado a enzima (ELISA).
Depois de identificadas células de hibridoma que produzem anticorpos com a especificidade, afinidade e/ou actividade desejadas, os clones podem ser subclonados por procedimentos de diluição limitante e crescem por métodos comuns (Goding, "Monoclonal Antibodies: Principies and Practice", páginas 59-103 (Academic Press, 1986)). Meios de cultura adequados para esta finalidade incluem, por exemplo, meio D-MEM ou RPMI-1640. Adicionalmente, as células de hibridoma podem crescer in vivo na forma de tumores asciticos num animal.
Os anticorpos monoclonais segregados pelos subclones são adequadamente separados do meio de cultura, fluido de ascites ou soro por procedimentos convencionais de 46 purificação de imunoglobulinas, tais como, por exemplo, proteína A-Sefarose, cromatografia com hidroxilapatite, electroforese em gel, diálise ou cromatografia por afinidade. 0 DNA que codifica os anticorpos monoclonais é facilmente isolado e sequenciado utilizando procedimentos convencionais (por exemplo, utilizando sondas oligonucleotídicas que são capazes de se ligarem especificamente a genes que codificam as cadeias pesada e leve dos anticorpos monoclonais) . As células de hibridoma são uma fonte preferida desse DNA. Depois de isolado, o DNA pode ser colocado em vectores de expressão, que então são transfectados para células-hospedeiro, como células de E. coli, células COS símias, células de ovário de hamster chinês (CHO) ou células de mieloma que não produzem, de qualquer outra forma, proteína imunoglobulina, para sintetizar anticorpos monoclonais nas células-hospedeiro recombinantes. A produção recombinante de anticorpos será descrita mais pormenorizadamente abaixo.
Noutra especificação, anticorpos ou fragmentos de anticorpos podem ser isolados de bibliotecas de anticorpos de expressão em fagos geradas utilizando as técnicas descritas em McCafferty et al., Nature 348: 552-554 (1990). Clackson et al., Nature 352: 624-628 (1991), e Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1991), descrevem o isolamento de anticorpos murinos e humanos, respectivamente, utilizando bibliotecas de fagos. Publicações subsequentes descrevem a produção de anticorpos humanos de afinidade elevada (gama de nM) por mistura de cadeias (Marks et al., Bio/Technology 1Q_: 779-783 (1992)), bem como infecção combinatorial e recombinação in vivo, 47 como estratégia de construção de bibliotecas de fagos muito grandes (Waterhouse et al., Nuc. Acids Res. 2tL: 2265-2266 (1993)). Assim, estas técnicas são alternativas viáveis às técnicas tradicionais de hibridomas para anticorpos monoclonais para o isolamento de anticorpos monoclonais. 0 DNA também pode ser modificado, por exemplo, substituindo as sequências murinas homólogas pela sequência codificadora para os domínios constantes das cadeias pesada e leve humanas (Patente U.S. N° 4 816 567; Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 8JL: 6851 (1984)), ou pela reunião covalente à sequência codificadora da imunoglobulina da totalidade ou parte da sequência codificadora para um polipéptido diferente de imunoglobulina.
Tipicamente, esses polipéptidos diferentes de imunoglobulinas substituem os domínios constantes de um anticorpo, ou substituem os domínios variáveis de um sítio de combinação de antigenes de um anticorpo, para criar um anticorpo bivalente quimérico que compreende um sítio de combinação de antigenes com especificidade para um antigene e outro sítio de combinação de antigenes com especificidade para um antigene diferente. (iv) Anticorpos humanizados e humanos
Um anticorpo humanizado tem um ou mais resíduos de aminoácidos introduzidos de uma fonte não humana. Estes resíduos de aminoácidos não humanos são muitas vezes referidos como resíduos de "importação", que tipicamente provêm de um domínio variável de "importação". A humanização pode ser essencialmente efectuada seguindo o método de Winter e colaboradores (Jones et al., Nature 321: 48 522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332: 323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science 239: 1534-1536 (1988)), substituindo as sequências correspondentes de um anticorpo humano pelas CDRs ou sequências de CDRs de roedores. Em conformidade, esses anticorpos "humanizados" são anticorpos quiméricos (Patente U.S. N° 4 816 567) nos quais substancialmente menos do que um domínio variável humano intacto foi substituído pela sequência correspondente de uma espécie não humana. Na prática, anticorpos humanizados são tipicamente anticorpos humanos nos quais alquns resíduos de CDRs e, possivelmente, alquns resíduos de FRs estão substituídos por resíduos de sítios análogos em anticorpos de roedores. A escolha dos domínios variáveis humanos, leves e pesados, a serem utilizados na preparação dos anticorpos humanizados é muito importante para reduzir a antigenicidade. De acordo com o denominado método de "melhor ajustamento", a sequência do domínio variável de um anticorpo de roedor é rastreada contra a totalidade da biblioteca de sequências de domínios variáveis humanos conhecidos. A sequência humana mais próxima da do roedor é então aceite como arcabouço (FR) humano para o anticorpo humanizado (Sims et al., J. Immunol. 151: 2296 (1993);
Chothia et al., J. Mol. Biol. 196: 901 (1987)). Outro método usa um arcabouço particular derivado da sequência de consenso de todos os anticorpos humanos de um subgrupo particular de cadeias leves ou pesadas. O mesmo arcabouço pode ser utilizado para vários anticorpos humanizados diferentes (Cárter et al., Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 89: 4285 (1992); Presta et al., J. Immunol. 151: 2623 (1993)) . 49
Também é importante que anticorpos sejam humanizados retendo afinidade elevada para o antigene e outras propriedades biológicas favoráveis. Para esta finalidade, de acordo com um método preferido, preparam-se anticorpos humanizados por um processo de análise das sequências paternas e vários produtos humanizados conceptuais utilizando modelos tridimensionais das sequências paternas e humanizadas. Modelos tridimensionais de imunoglobulinas estão habitualmente disponíveis e são familiares para os experimentados na área. Estão disponíveis programas computacionais que ilustram e exibem estruturas conformacionais tridimensionais prováveis de candidatos seleccionados a sequências de imunoglobulinas. 0 estudo destas imagens permite analisar o papel provável dos resíduos no funcionamento do candidato a sequência de imunoglobulina, isto é, analisar os resíduos que influenciam a capacidade do candidato a imunoglobulina para se ligar ao seu antigene. Deste modo, resíduos de FRs podem ser seleccionados e combinados do receptor e sequências de "importação" de modo a obter-se a característica desejada do anticorpo, como afinidade acrescida para o(s) antigene(s)-alvo. Em geral, os resíduos de CDRs estão directa e muito substancialmente envolvidos na influência da ligação de antigenes.
Alternativamente, é agora possível gerar animais transgénicos (por exemplo, ratinhos) capazes, por imunização, de produzir um repertório completo de anticorpos humanos na ausência da produção de imunoglobulinas endógenas. Por exemplo, foi descrito que a deleção homozigótica do gene da região que reúne a cadeia pesada (JH) do anticorpo em ratinhos quiméricos e mutantes na linha germinativa resulta em inibição completa da 50 produção de anticorpos endógenos. A transferência da série de genes de imunoglobulinas da linha germinativa humana nesses ratinhos mutantes na linha germinativa resultará na produção de anticorpos humanos por provocação com antigenes. Ver, por exemplo, Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. _90: 2551 (1993); Jakobovits et al., Nature 362: 255-258 (1993); Bruggermann et al., Year in Immuno. 33 (1993), e Duchosal et al., Nature 355: 258 (1992). Anticorpos humanos também podem derivar de bibliotecas de expressão em fagos (Hoogenboom et al., J. Mol. Biol. 227: 381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1991); Vaughan et al., Nature Biotech 1_4: 309 (1996)). (v) Anticorpos multiespecificos
Anticorpos multiespecificos têm especificidades de ligação para pelo menos dois antigenes diferentes. Se bem que, normalmente, essas moléculas se liguem apenas a dois antigenes (isto é, anticorpos biespecificos, BsAbs), anticorpos com especificidades adicionais, como anticorpos triespecificos, estão abrangidos por esta expressão quando for usada aqui. Exemplos de BsAbs incluem aqueles com um braço dirigido contra um antigene de célula tumoral e o outro braço dirigido contra uma molécula de desencadeamento citotóxico, como anti-FcyRI/anti-CD15, anti-pl85HER2/FcyRIII (CD16), anti-CD3/anti-célula B maligna (1D10), anti-CD3/anti-pl85HER2, anti-CD3/anti-p97, anti-CD3/anti-carcinoma de células renais, anti-CD3/anti-OVCAR-3, anti-CD3/L-D1 (anti-carcinoma do cólon), anti-CD3/anti-análogo da hormona estimulante de melanócitos, anti-receptor do EGF/anti-CD3, anti-CD3/anti-CAMAl, anti-CD3/anti-CDl9, anti-CD3/MoV18, anti-molécula de adesão de células neurais (NCAM)/anti-CD3, anti-proteina de ligação de folato 51 (FBP)/anti-CD3, anti-antigene associado a pan-carcinoma (AMOC-31)/anti-CD3; BsAbs com um braço que se liga especificamente a um antigene tumoral e um braço que se liga a uma toxina, tal como anti-saporina/anti-Id-1, anti-CD22/anti-saporina, anti-CD7/anti-saporina, anti-CD38/anti-saporina, anti-CEA/anti-cadeia A da ricina, anti-interferão-α (IFN-a)/anti-idiotipo de hibridoma, anti-CEA/anti-alcalóide da vinca; BsAbs para converter pró-fármacos activados por enzimas, tais como anti-CD30/anti-fosfatase alcalina (que catalisa a conversão do pró-fármaco fosfato de mitomicina em álcool de mitomicina); BsAbs que podem ser utilizados como agentes fibrinoliticos, tais como anti-fibrina/anti-activador do plasminogénio em tecidos (tPA), anti-fibrina/anti-activador do plasminogénio do tipo uroquinase (uPA); BsAbs para dirigir complexos imunológicos para receptores da superfície celular, tais como anti-lipoproteína de baixa densidade (LDL)/anti-receptor de Fc (por exemplo, FcyRI, FcyRII ou FcyRIII); BsAbs para utilização na terapia de doenças infecciosas, como anti-CD3/anti-vírus herpes simplex (HSV), complexo anti-receptor de células T:CD3/anti-influenza; anti-FcyR/anti-HIV; BsAbs para detecção de tumores in vitro ou in vivo, tais como anti-CEA/anti-EOTUBE, anti-CEA/anti-DPTA, anti-pl85HER2/ anti-hapteno; BsAbs como adjuvantes de vacinas, e BsAbs como ferramentas de diagnóstico, tais como anti-IgG de coelho/anti-ferritina, anti-peroxidase de rábano bravo (HRP)/anti-hormona, anti-somatostatina/anti-substância P, anti-HRP/anti-FITC, anti-CEA/anti-p-galactosidase. Exemplos de anticorpos triespecíficos incluem anti-CD3/anti-CD4/anti-CD37, anti-CD3/anti-CD5/anti-CD37 e anti-CD3/anti-CD8/anti-CD37. Podem preparar-se anticorpos biespecíficos 52 na forma de anticorpos completos ou fragmentos de anticorpos (por exemplo, anticorpos biespecificos F(ab')2)· Métodos para preparar anticorpos biespecificos são conhecidos na área. A preparação tradicional de anticorpos biespecificos completos baseia-se na co-expressão de dois pares cadeia pesada - cadeia leve de imunoglobulinas, em que as duas cadeias têm especificidades diferentes (Millstein et al., Nature 305: 537-539 (1983)). Devido ao sortido aleatório das cadeias pesada e leve de imunoglobulinas, estes hibridomas (quadromas) produzem uma mistura potencial de 10 moléculas de anticorpos diferentes, das quais apenas uma tem a estrutura biespecifica correcta. A purificação da molécula correcta, que é habitualmente feita por passos de cromatograf ia de afinidade, é uma tarefa bastante pesada, e os rendimentos do produto são baixos. Procedimentos semelhantes são revelados em WO 93/08829 e em Traunecker et al., EMBO J. lOq 3655-3659 (1991).
De acordo com uma abordagem diferente, domínios variáveis de anticorpos com as especificidades de ligação desejadas (sítios de combinação anticorpo-antigene) são fundidos a sequências de domínios constantes de imunoglobulinas. A fusão é preferivelmente feita com um domínio constante da cadeia pesada de uma imunoglobulina, compreendendo pelo menos parte das regiões conectora, CH2 e CH3. É preferido que a primeira região constante da cadeia pesada (CHI), que contém o sítio necessário para a ligação da cadeia leve, esteja presente em pelo menos uma das fusões. DNAs que codificam as fusões da cadeia pesada de imunoglobulina e, se desejado, da cadeia leve de imunoglobulina são inseridos em vectores de expressão 53 separados e são co-transfectados num organismo hospedeiro adequado. Isto proporciona grande flexibilidade no ajustamento das proporções mútuas dos três fragmentos polipeptidicos em especificações nas quais razões diferentes das três cadeias polipeptidicas usadas na construção dão origem aos rendimentos óptimos. No entanto, é possível inserir as sequências codificadoras para duas ou para todas as três cadeias polipeptidicas num vector de expressão quando a expressão de pelo menos duas cadeias polipeptidicas em razões iguais resultar em rendimentos elevados, ou quando as razões não forem particularmente importantes.
Numa especificação preferida desta abordagem, os anticorpos biespecíficos são compostos por uma cadeia pesada de imunoglobulina híbrida com uma primeira especificidade de ligação num braço, e um par cadeia pesada - cadeia leve de imunoglobulina híbrida (proporcionando uma segunda especificidade de ligação) no outro braço. Verificou-se que esta estrutura assimétrica facilita a separação do composto biespecífico desejado de combinações de cadeias de imunoglobulinas indesejadas, uma vez que a presença de uma cadeia leve de imunoglobulina apenas numa metade da molécula biespecífica proporciona um modo de separação fácil. Esta abordagem é revelada em WO 94/04690. Quanto a mais pormenores relativos à geração de anticorpos biespecíficos ver, por exemplo, Suresh et al., Methods in Enzymology 121: 210 (1986) .
De acordo com outra abordagem descrita em WO 96/27011, a interface entre um par de moléculas de anticorpos pode ser manipulada para maximizar a percentagem de heterodímeros que são recuperados da cultura de células 54 recombinantes. A interface preferida compreende pelo menos uma parte do domínio CH3 de um domínio constante de um anticorpo. Neste método, uma ou mais cadeias laterais pequenas de aminoácidos da interface da primeira molécula de anticorpo são substituídas por cadeias laterais maiores (por exemplo, tirosina ou triptofano). "Cavidades" compensadoras de dimensão idêntica ou semelhante à da(s) cadeia (s) lateral(laterais) grande (s) são criadas na interface da segunda molécula de anticorpo substituindo cadeias laterais grandes de aminoácidos por outras mais pequenas (por exemplo, alanina ou treonina). Isto proporciona um mecanismo para aumentar o rendimento do heterodímero relativamente a outros produtos finais indesejados, como homodímeros.
Anticorpos biespecíficos incluem anticorpos com ligações cruzadas ou "heteroconjugados". Por exemplo, um dos anticorpos do heteroconjugado pode ser acoplado a avidina, o outro a biotina. Esses anticorpos foram propostos, por exemplo, para dirigir células do sistema imunológico para células indesejadas (Patente U.S. N° 4 676 980) e para o tratamento de infecção com HIV (WO 91/00360, WO 92/200373 e EP 03089). Podem preparar-se anticorpos heteroconjugados utilizando quaisquer métodos convenientes de formação de ligações cruzadas. Agentes adequados de formação de ligações cruzadas são bem conhecidos na área e são revelados na Patente U.S. N° 4 676 980, juntamente com algumas técnicas de formação de ligações cruzadas. São contemplados anticorpos com mais do que duas valências. Por exemplo, podem preparar-se anticorpos triespecíficos. Tutt et al., J. Immunol. 147: 60 (1991). 55 Não obstante o polipéptido de interesse aqui ser preferivelmente um anticorpo, são contemplados outros polipéptidos contendo uma região Fc que podem ser modificados de acordo com os métodos descritos aqui. Um exemplo de uma dessas moléculas é uma imunoadesina. C. Preparação de Imunoadesinas A concepção de uma imunoadesina mais simples e mais directa combina o(s) domínio(s) de ligação da adesina (por exemplo, o domínio extracelular (ECD) de um receptor) com a região Fc da cadeia pesada de uma imunoglobulina. Habitualmente, ao preparar as imunoadesinas da presente invenção, o ácido nucleico que codifica o domínio de ligação da adesina será fundido de modo C-terminal ao ácido nucleico que codifica o terminal N da sequência de um domínio constante de uma imunoglobulina; contudo, também são possíveis fusões N-terminais.
Tipicamente, nessas fusões, o polipéptido quimérico codificado reterá pelo menos os domínios conector, CH2 e Ch3 funcionalmente activos da região constante da cadeia pesada de uma imunoglobulina. Também se fazem fusões ao terminal C da porção Fc de um domínio constante, ou imediatamente N-terminal ao CH1 da cadeia pesada ou região correspondente da cadeia leve. 0 sítio preciso onde é feita a fusão não é crítico; sítios particulares são bem conhecidos e podem ser seleccionados para optimizar a actividade biológica, secreção ou características de ligação da imunoadesina.
Numa especificação preferida, a sequência da adesina é fundida ao terminal N da região Fc da imunoglobulina Gi (IgGi) . É possível fundir a totalidade da região constante 56 da cadeia pesada à sequência da adesina. No entanto, mais preferivelmente, é utilizada na fusão uma sequência que começa na região conectora imediatamente a montante do sitio de clivagem de papaina que define quimicamente a Fc da IgG (isto é, o resíduo 216, tomando o primeiro resíduo da região constante da cadeia pesada como sendo 114), ou sítios análogos de outras imunoglobulinas. Numa especificação particularmente preferida, a sequência de aminoácidos da adesina é fundida (a) à região conectora e Ch2 e Ch3 ou (b) aos domínios CH1, conector, CH2 e CH3 da cadeia pesada de uma IgG.
Para imunoadesinas biespecíficas, as imunoadesinas são reunidas na forma de multímeros, e particularmente como heterodímeros ou heterotetrâmeros. Em geral, estas imunoglobulinas reunidas terão estruturas unitárias conhecidas. Uma unidade estrutural básica de quatro cadeias é a forma em que existem a IgG, IgD e IgE. Uma unidade de quatro cadeias é repetida nas imunoglobulinas de peso molecular mais elevado; a IgM existe geralmente como um pentâmero de quatro unidades básicas reunidas por ligações dissulfureto. A globulina IgA e, ocasionalmente, a globulina IgG também podem existir em forma multimérica no soro. No caso de multímeros, cada uma das quatro unidades pode ser igual ou diferente.
Representam-se esquematicamente abaixo diagramas de várias imunoadesinas reunidas exemplificativas no âmbito da presente invenção: (a) ACl_ACl,' (b) ACh- (ACh, ACl~ACh, ACl~VhCh, ou VlCl_ACh) ; (C) ACl-ACh- (ACl-ACh, ACl-VhCh, VlCl-ACh, ou VlCl-VhCh) ; (d) ACl-VhCh- (ACh, OU ACl-VhCh, OU VlCl-ACh) ,' 57 (e) VlCl ACh-(ACl-VhCh; ou VlCl ACh), e (f) (A-Y) n- (VLCL-VHCH) 2r em que cada A representa sequências de aminoácidos de adesinas idênticas ou diferentes f VL é o domínio variável da cadeia leve de uma imunoglobulina; VH é o domínio variável da cadeia pesada de uma imunoglobulina; CL é o domínio constante da cadeia leve de uma imunoglobulina; CH é o domínio constante da cadeia pesada de uma imunoglobulina; n é um inteiro maior do que 1; Y designa o residuo de um agente de formação de ligações cruzadas covalentes.
Por motivos de brevidade, as estruturas anteriores apresentam apenas características-chave; não indicam o domínio de reunião (J) ou outros domínios das imunoglobulinas, nem são apresentadas ligações dissulfureto. No entanto, quando esses domínios forem necessários para a actividade de ligação, considerar-se-á que estão presentes nas localizações habituais que ocupam nas moléculas de imunoglobulinas.
Alternativamente, as sequências de adesinas podem ser inseridas entre sequências da cadeia pesada e cadeia leve de imunoglobulinas, de modo que se obtém uma imunoglobulina compreendendo uma cadeia pesada quimérica. Nesta especificação, as sequências de adesinas são fundidas à extremidade 3' da cadeia pesada de uma imunoglobulina em cada braço de uma imunoglobulina, quer entre a região conectora e o domínio CH2 quer entre os domínios CH2 e CH3. 58
Construções semelhantes foram relatadas por Hoogenboom et al., Mol. Immunol. 28_: 1027-1037 (1991).
Apesar de não ser necessária a presença da cadeia leve de uma imunoglobulina nas imunoadesinas da presente invenção, a cadeia leve de uma imunoglobulina poderá estar presente, covalentemente associada a um polipéptido de fusão adesina-cadeia pesada de imunoglobulina ou directamente fundida à adesina. No primeiro caso, DNA que codifica a cadeia leve de uma imunoglobulina é tipicamente co-expresso com o DNA que codifica a proteína de fusão adesina-cadeia pesada de imunoglobulina. Por secreção, a cadeia pesada e a cadeia leve híbridas serão covalentemente associadas, dando origem a uma estrutura do tipo imunoglobulina que compreende dois pares cadeia pesada -cadeia leve de imunoglobulina ligados por dissulfureto. Métodos adequados para preparar essas estruturas são revelados, por exemplo, na Patente U.S. N° 4 816 567, publicada em 28 de Março de 1989.
As imunoadesinas são muito convenientemente construídas fundindo a sequência de cDNA que codifica a porção da adesina na estrutura com a sequência de cDNA de uma imunoglobulina. No entanto, também pode usar-se fusão a fragmentos genómicos de imunoglobulinas (ver, por exemplo, Aruffo et al., Cell 61: 1303-1313 (1990), e Stamenkovic et al., Cell _66: 1133-1144 (1991)). O último tipo de fusão requer a presença de sequências reguladoras de Ig para a expressão. Podem isolar-se cDNAs que codificam regiões constantes da cadeia pesada de IgG com base em sequências publicadas de bibliotecas de cDNA derivadas do baço ou linfócitos do sangue periférico, por hibridização ou por técnicas de reacção em cadeia de polimerase (PCR). Os cDNAs 59 que codificam as partes de "adesina" e imunoglobulina da imunoadesina são inseridos em série num vector plasmidico que dirige a expressão eficiente nas células-hospedeiro escolhidas. D. Vectores, Células-Hospedeiro e Métodos Recombinantes A invenção também proporciona um ácido nucleico isolado que codifica uma variante do polipéptido como revelada aqui, vectores e células-hospedeiro que compreendem o ácido nucleico e técnicas recombinantes para a produção da variante do polipéptido.
Para a produção recombinante da variante do polipéptido, o ácido nucleico que a codifica é isolado e inserido num vector replicável para clonagem suplementar (amplificação do DNA) ou para expressão. 0 DNA que codifica a variante do polipéptido é facilmente isolado e sequenciado utilizando procedimentos convencionais (por exemplo, utilizando sondas oligonucleotidicas que são capazes de se ligarem especificamente a genes que codificam a variante do polipéptido). Estão disponíveis muitos vectores. Os componentes do vector incluem geralmente, mas não se limitam a um ou mais dos seguintes: uma sequência de sinal, uma origem da replicação, um ou mais genes marcadores, um elemento intensificador, um promotor e uma sequência de terminação da transcrição. (i) Componente sequência de sinal A variante do polipéptido desta invenção pode ser produzida de forma recombinante não só directamente mas também como um polipéptido de fusão com um polipéptido heterólogo, que é preferivelmente uma sequência de sinal ou outro polipéptido com um sítio de clivagem específico no 60 terminal N da proteína ou polipéptido maduro. A sequência de sinal heteróloga preferivelmente seleccionada é tal que é reconhecida e processada (isto é, clivada por uma peptidase de sinal) pela célula-hospedeiro. Para células-hospedeiro procarióticas que não reconhecem e processam a sequência de sinal da variante do polipéptido nativa, a sequência de sinal é substituída por uma sequência de sinal procariótica seleccionada, por exemplo, do grupo que consiste em fosfatase alcalina, penicilinase, lpp ou líderes de enterotoxina II estáveis por acção do calor. Para a secreção em levedura, a sequência de sinal nativa pode ser substituída, por exemplo, pelo líder da invertase de levedura, líder do factor α (incluindo líderes do factor α de Saccharomyces e Kluyveromyces), ou líder da fosfatase ácida, o líder da glucoamilase de C. albicans ou o sinal descrito em WO 90/13646. Na expressão em células de mamífero, estão disponíveis sequências de sinal de mamífero bem como líderes secretores virais, por exemplo, o sinal gD de herpes simplex. O DNA para essa região precursora é ligado na fase de leitura a DNA que codifica a variante do polipéptido. (ii) Componente origem da replicação
Os vectores de expressão e clonagem contêm uma sequência de ácido nucleico que permite ao vector replicar-se em uma ou mais células-hospedeiro seleccionadas. Em geral, em vectores de clonagem, esta sequência é tal que permite ao vector replicar-se independentemente do DNA cromossómico do hospedeiro, e inclui origens da replicação ou sequências de replicação autónoma. Essas sequências são bem conhecidas para uma variedade de bactérias, leveduras e vírus. A origem da replicação do plasmídeo pBR322 é 61 adequada para a maior parte das bactérias Gram-negativas, a origem do plasmideo 2μ é adequada para leveduras e várias origens virais (SV40, polioma, adenovirus, VSV ou BPV) são úteis para vectores de clonagem em células de mamífero. Em geral, o componente origem da replicação não é necessário para vectores de expressão de mamífero (a origem do SV40 pode ser tipicamente utilizada somente porque contém o promotor inicial). (iii) Componente gene de selecção
Os vectores de expressão e clonagem podem conter um gene de selecção, também denominado marcador seleccionável. Genes de selecção típicos codificam proteínas que (a) conferem resistência a antibióticos ou outras toxinas, por exemplo, ampicilina, neomicina, metotrexato ou tetraciclina, (b) complementam deficiências auxotróficas ou (c) fornecem nutrientes críticos não disponíveis em meios complexos, por exemplo, o gene que codifica a D-alanina racemase para Bacilli.
Um exemplo de um esquema de selecção utiliza um fármaco para parar o crescimento de uma célula-hospedeiro. As células que são transformadas com êxito com um gene heterólogo produzem uma proteína que confere resistência a fármacos e, assim, sobrevivem ao regime de selecção. Exemplos dessa selecção dominante usam os fármacos neomicina, ácido micofenólico e higromicina.
Outro exemplo de marcadores seleccionáveis adequados para células de mamífero são os que permitem identificar células competentes para recolher o ácido nucleico da variante do polipéptido, como DHFR, timidina quinase, metalotioneína-I e II, preferivelmente genes de 62 metalotioneína de primata, adenosina desaminase, ornitina descarboxilase, etc.
Por exemplo, células transformadas com o gene de selecção DHFR são primeiramente identificadas cultivando todos os transformantes num meio de cultura que contém metotrexato (Mtx), um antagonista competitivo de DHFR. Uma célula-hospedeiro apropriada, quando se emprega DHFR de tipo selvagem, é a linha de células de ovário de hamster chinês (CHO) deficiente na actividade de DHFR.
Alternativamente, células-hospedeiro (particularmente hospedeiros de tipo selvagem que contêm DHFR endógena) transformadas ou co-transformadas com sequências de DNA que codificam a variante do polipéptido, proteína DHFR de tipo selvagem e outro marcador seleccionável, como aminoglicósido 3' -fosfotransferase (APH), podem ser seleccionadas por crescimento das células em meio que contém um agente de selecção para o marcador seleccionável, como um antibiótico aminoglicosídico, por exemplo, canamicina, neomicina ou G418. Ver Patente U.S. N° 4 965 199.
Um gene de selecção adequado para utilização em leveduras é o gene trpl presente no plasmídeo de levedura YRp7 (Stinchcomb et al., Nature 282: 39 (1979)). 0 gene trpl proporciona um marcador de selecção para uma estirpe mutante de levedura sem capacidade para crescer em triptofano, por exemplo, N° da ATCC 44076 ou PEP4-1. Jones, Genetics 8_5: 12 (1977) . A presença da lesão de trpl no genoma da célula-hospedeiro de levedura proporciona um ambiente eficaz para detectar a transformação por crescimento na ausência de triptofano. De modo semelhante, 63 estirpes de levedura deficientes em Leu2 (ATCC 20 622 ou 38 626) são complementadas com plasmideos conhecidos com o gene Leu2.
Adicionalmente, vectores derivados do plasmideo circular de 1,6 μπι pKDl podem ser utilizados para a transformação de leveduras Kluyveromyces. Alternativamente, foi relatado um sistema de expressão para a produção em larga escala de quimosina de vitelo recombinante para K. lactis. Van den Berg, Bio/Technology 8: 135 (1990). Também foram revelados vectores de expressão de múltiplas cópias estáveis para a secreção de albumina do soro humano recombinante madura por estirpes industriais de Kluyveromyces. Fleer et al., Bio/Technology 9: 968-975 (1991). (iv) Componente promotor
Os vectores de expressão e clonagem contêm habitualmente um promotor que é reconhecido pelo organismo hospedeiro e que está operativamente ligado ao ácido nucleico da variante do polipéptido. Promotores adequados para utilização com hospedeiros procarióticos incluem o promotor phoA, sistemas promotores da β-lactamase e lactose, fosfatase alcalina, um sistema promotor do triptofano (trp) e promotores híbridos, como o promotor tac. Todavia, são adequados outros promotores bacterianos conhecidos. Os promotores a serem utilizados em sistemas bacterianos também conterão uma sequência de Shine-Dalgarno (S.D.) operativamente ligada ao DNA que codifica a variante do polipéptido.
Conhecem-se sequências promotoras para eucariotas. Virtualmente todos os genes eucarióticos têm uma região 64 rica em AT localizada aproximadamente 25 até 30 bases a montante do sitio onde é iniciada a transcrição. Outra sequência presente 70 a 80 bases a montante do inicio da transcrição de muitos genes é uma região CNCAAT, onde N pode ser qualquer nucleótido. Na extremidade 3' da maior parte dos genes eucarióticos está presente uma sequência AATAAA que pode ser o sinal para a adição da cauda poli A à extremidade 3' da sequência codificadora. Todas estas sequências são adequadamente inseridas em vectores de expressão eucarióticos.
Exemplos de sequências promotoras adequadas para utilização com hospedeiros de levedura incluem os promotores para a 3-fosfoglicerato quinase ou outras enzimas glicoliticas, como enolase, gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase, hexoquinase, piruvato descarboxilase, fosfo-frutoquinase, glucose-6-fosfato isomerase, 3-fosfoglicerato mutase, piruvato quinase, triosefosfato isomerase, fosfo-glucose isomerase e glucoquinase.
Outros promotores de levedura, que são promotores indutiveis com a vantagem adicional de transcrição controlada por condições de crescimento, são as regiões promotoras para o álcool desidrogenase 2, isocitocromo C, fosfatase ácida, enzimas degradativas associadas ao metabolismo do azoto, metalotioneina, gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase e enzimas responsáveis pela utilização de maltose e galactose. Vectores e promotores adequados para utilização na expressão em leveduras são suplementarmente descritos em EP 73 657. Intensificadores de leveduras também são vantajosamente utilizados com promotores de leveduras. 65 A transcrição da variante do polipéptido a partir de vectores em células-hospedeiro de mamifero é controlada, por exemplo, por promotores obtidos dos genomas de vírus tais como vírus polioma, vírus da varíola das aves domésticas, adenovírus (tal como Adenovírus 2), vírus papiloma bovino, vírus do sarcoma aviário, citomegalovírus, um retrovírus, vírus da hepatite B e muito preferivelmente Vírus Símio 40 (SV40), de promotores de mamífero heterólogos, por exemplo, o promotor da actina ou um promotor de imunoglobulina, de promotores de choque térmico, desde que esses promotores sejam compatíveis com os sistemas de células-hospedeiro.
Os promotores inicial e tardio do vírus SV40 são convenientemente obtidos na forma de um fragmento de restrição do SV40 que também contém a origem da replicação virai do SV40. O promotor inicial imediato do citomegalovírus humano é convenientemente obtido na forma de um fragmento de restrição de HindIII E. Um sistema para expressar DNA em hospedeiros mamíferos utilizando como vector o vírus papiloma bovino é revelado na Patente U.S. N° 4 419 446. Uma modificação deste sistema é descrita na Patente U.S. N° 4 601 978. Ver também Reyes et al., Nature 297: 598-601 (1982), quanto à expressão de cDNA de interferão-β humano em células de ratinho sob o controlo de um promotor da timidina quinase do vírus herpes simplex. Alternativamente, pode utilizar-se como promotor a repetição terminal longa do vírus do sarcoma de Rous. (v) Componente elemento intensificador A transcrição de um DNA que codifica a variante do polipéptido desta invenção por eucariotas superiores é muitas vezes aumentada por inserção no vector de uma 66 sequência intensificadora. Conhecem-se agora muitas sequências intensificadoras de genes de mamífero (globina, elastase, albumina, α-fetoproteina e insulina).
Tipicamente, no entanto, utilizar-se-á um intensificador de um virus de células eucarióticas. Exemplos incluem o intensificador do SV40 no lado tardio da origem da replicação (pares de bases 100 - 270), o promotor intensificador inicial de citomegalovirus, o intensificador de polioma no lado tardio da origem da replicação e intensificadores de adenovirus. Ver também Yaniv, Nature 297: 17-18 (1982), quanto a elementos intensificadores para activação de promotores eucarióticos. O intensificador pode ser processado no vector numa posição 5' ou 3' relativamente à sequência que codifica a variante do polipéptido, mas preferivelmente está localizado num sitio a 5' do promotor. (vi) Componente terminação da transcrição Os vectores de expressão utilizados em células- hospedeiro eucarióticas (células de levedura, fungos, insecto, planta, animal, humano ou células nucleadas de outros organismos multicelulares) também conterão sequências necessárias para a terminação da transcrição e para a estabilização do mRNA. Essas sequências estão habitualmente disponíveis das regiões 5' e, ocasionalmente, 3' não traduzidas de DNAs ou cDNAs eucarióticos ou virais. Estas regiões contêm segmentos de nucleótidos transcritos como fragmentos poliadenilados na porção não traduzida do mRNA que codifica a variante do polipéptido. Um componente de terminação da transcrição útil é a região de poliadenilaçâo da hormona de crescimento bovino. Ver WO 94/11026 e o vector de expressão aí revelado. 67 (vii) Selecção e transformação de células-hospedeiro Células-hospedeiro adequadas para a clonagem ou expressão do DNA nos vectores aqui apresentados são as células de procariotas, leveduras ou eucariotas superiores descritas acima. Procariotas adequados para esta finalidade incluem eubactérias, como organismos Gram-negativos ou Gram-positivos, por exemplo, Enterobacteriaceae, como Escherichia, por exemplo, E. coli, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, por exemplo, Salmonella typhimurium, Serratia, por exemplo, Serratia marcescans, e Shigella, bem como Bacilli, como B. subtilis e B. licheniformis (por exemplo, B. licheniformis 41P revelado em DD 266 710, publicado em 12 de Abril de 1989), Pseudomonas, como P. aeruginosa, e Streptomyces. Um hospedeiro de clonagem E. coli preferido é E. coli 294 (ATCC 31 446), apesar de serem adequadas outras estirpes, como E. coli B, E. coli X1776 (ATCC 31 537) e E. coli W3110 (ATCC 27 325). Estes exemplos são ilustrativos e não limitativos.
Para além de procariotas, micróbios eucariotas, como fungos filamentares ou leveduras, são hospedeiros de clonagem ou expressão adequados para vectores que codificam a variante do polipéptido. Saccharomyces cerevisiae, ou o comum fermento de padeiro, é o mais usualmente utilizado entre os microrganismos hospedeiros eucariotas inferiores. No entanto, alguns outros géneros, espécies e estirpes estão habitualmente disponíveis e são úteis aqui, tais como Schizosaccharomyces pombe; hospedeiros Kluyveromyces, tais como, por exemplo, K. lactis, K. fragilis (ATCC 12 424), K. bulgaricus (ATCC 16 045), K. wickeramii (ATCC 24 178), K. waltii (ATCC 56 500), K. drosophilarum (ATCC 36 906), K. thermotolerans e K. marxianus; yarrowia (EP 402 226); 68
Pichia pastoris (EP 183 070); Candida; Trichoderma reesia (EP 244 234); Neurospora crassa; Schwanniomyces, como Schwanniomyces occidentalis; e fungos filamentares, tais como, por exemplo, Neurospora, Penicillium, Tolypocladium, e hospedeiros Aspergillus, como A. nidulans e A. niger. Células -hospedeiro adequadas para a expressão da variante do polipéptido glicosilada são derivadas de organismos multicelulares. Exemplos de células de invertebrados incluem células de plantas e insectos. Foram identificadas numerosas estirpes de baculovirus e variantes e correspondentes células-hospedeiro de insecto permissivas de hospedeiros tais como Spodoptera frugiperda (lagarta), Aedes aegypti (mosquito), Aedes albopictus (mosquito), Drosophila melanogaster (mosca da fruta) e Bombyx mori. Está publicamente disponível uma variedade de estirpes virais para transfecção, por exemplo, a variante L-l de Autographa californica NPV e a estirpe Bm-5 de Bombyx mori NPV, e esses vírus podem ser utilizados aqui como vírus de acordo com a presente invenção, particularmente para a transfecção de células de Spodoptera frugiperda.
Também podem utilizar-se como hospedeiros culturas de células de plantas de algodão, milho, batata, soja, petúnia, tomate e tabaco.
No entanto, o maior interesse tem incidido em células de vertebrados, e a propagação de células de vertebrados em cultura (cultura de tecidos) tornou-se um procedimento de rotina. Exemplos de linhas de células-hospedeiro de mamífero úteis são a linha CVl de rim de macaco transformada por SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); linha de rim embrionário humano (293 ou células 293 subclonadas para 69 crescimento em cultura em suspensão, Graham et ai., J. Gen. Virol. 36: 59 (1977)); células de rim de hamster bebé (BHK, ATCC CCL 10) ; células de ovário de hamster chinês/-DHFR (CHO, Urlaub et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. TJ_: 4216 (1980)); células de Sertoli de ratinho (TM4, Mather, Biol. Reprod. 23: 243-251 (1980)); células de rim de macaco (CV1 ATCC CCL 70); células de rim de macaco verde africano (VERO-76, ATCC CRL-1587); células de carcinoma cervical humano (HELA, ATCC CCL 2); células de rim canino (MDCK, ATCC CCL 34); células de fígado de ratazana-castanha (BRL 3A, ATCC CRL 1442); células de pulmão humano (W138, ATCC CCL 75) ; células de fígado humano (Hep G2, HB 8065) ; tumor mamário de ratinho (MMT 060562, ATCC CCL51); células TRI (Mather et ai., Annals N. Y. Acad. Sei. 383: 44-68 (1982)); células MRC 5; células FS4, e uma linha de hepatoma humano (Hep G2).
As células-hospedeiro são transformadas com os vectores de expressão ou clonagem acima descritos para a produção da variante do polipéptido e são cultivadas em meio nutriente convencional modificado consoante o apropriado para induzir promotores, transformantes de selecção, ou amplificar os genes que codificam as sequências desejadas. (viii) Cultura das células-hospedeiro
As células-hospedeiro utilizadas para produzir a variante do polipéptido desta invenção podem ser cultivadas numa variedade de meios. Para a cultura das células-hospedeiro são adequados meios comercialmente disponíveis, tais como meio de Ham F10 (Sigma) , Meio Essencial Mínimo ( (MEM) , (Sigma), RPMI-1640 (Sigma) e Meio de Eagle Modificado de Dulbecco ((DMEM), Sigma). Adicionalmente, como meio de cultura para as células-hospedeiro pode 70 utilizar-se qualquer um dos meios descritos em Ham et al., Meth. Enz. 58_: 44 (1979), Barnes et al., Anal. Biochem. 102: 255 (1980), Patentes U.S. N°s 4 767 704, 4 657 866, 4 927 762, 4 560 655 ou 5 122 469; WO 90/03430; WO 87/00195 ou Patente U.S. Re. 30 985. Qualquer um destes meios pode ser suplementado, consoante o necessário, com hormonas e/ou outros factores de crescimento (como insulina, transferrina ou factor de crescimento epidérmico), sais (como cloreto de sódio, cálcio, magnésio e fosfato), tampões (como HEPES), nucleótidos (como adenosina e timidina), antibióticos (como o fármaco GENTAMICINA™), elementos vestigiais (definidos como compostos inorgânicos habitualmente presentes em concentrações finais na gama micromolar) e glucose, ou uma fonte de energia equivalente. Quaisquer outros suplementos necessários também podem ser incluídos em concentrações apropriadas que serão conhecidas dos experimentados na área. As condições de cultura, como temperatura, pH e afins, são as previamente usadas com a célula-hospedeiro seleccionada para expressão e serão claras para o técnico habitualmente experimentado. (ix) Purificação da variante do polipéptido Quando se utilizam técnicas recombinantes, a variante do polipéptido pode ser produzida intracelularmente, no espaço periplasmático ou pode ser directamente segregada para o meio. Se a variante do polipéptido for produzida intracelularmente, como primeiro passo removem-se os detritos em partículas, quer sejam células-hospedeiro ou fragmentos que sofreram lise, por exemplo, por centrifugação ou ultrafiltração. Cárter et al., Bio/ Technology 1_0: 163-167 (1992), descrevem um procedimento para isolar anticorpos que são segregados para o espaço periplasmático de E. coli. Em resumo, a pasta celular é 71 descongelada na presença de acetato de sódio (pH 3,5), EDTA e fluoreto de fenilmetilsulfonilo (PMSF) durante cerca de 30 minutos. Os detritos celulares podem ser removidos por centrifugação. Quando a variante do polipéptido é segregada para o meio, os sobrenadantes desses sistemas de expressão são, em geral, primeiramente concentrados utilizando um filtro de concentração de proteínas comercialmente disponível, por exemplo, uma unidade de ultrafiltração Amicon ou Millipore Pellicon. Um inibidor de proteases, como PMSF, pode ser incluído em qualquer um dos passos anteriores para inibir a proteólise, e podem incluir-se antibióticos para prevenir o crescimento de contaminantes acidentais. A composição da variante do polipéptido preparada a partir das células pode ser purificada utilizando, por exemplo, cromatografia com hidroxilapatite, electroforese em gel, diálise e cromatograf ia por afinidade, em que a técnica de purificação preferida é cromatografia por afinidade. A conveniência de proteína A como ligando de afinidade depende da espécie e isotipo da região Fc de qualquer imunoglobulina que esteja presente na variante do polipéptido. A proteína A pode ser utilizada para purificar variantes do polipéptido que se baseiam nas cadeias pesadas γΐ, γ2 ou γ4 humanas (Lindmark et al., J. Immunol. Meth. 62: 1-13 (1983)). A proteína G é recomendada para todos os isotipos de ratinho e para γ3 humana (Guss et al., EMBO J. .5: 1567-1575 (1986)). A matriz à qual se liga o ligando de afinidade é, na maior parte das vezes, agarose, mas estão disponíveis outras matrizes. Matrizes mecanicamente estáveis, como vidro com dimensão dos poros controlada ou poli(estirenodivinil)benzeno, permitem maiores velocidades de fluxo e menores tempos de processamento do que se podem 72 obter com agarose. Quando a variante do polipéptido compreende um domínio CH3, a resina Bakerbond ABX™ (J. T. Baker, Phillipsburg, NJ) é útil para a purificação. Também estão disponíveis outras técnicas para a purificação de proteínas, como fraccionamento numa coluna de permuta iónica, precipitação com etanol, HPLC de Fase Reversa, cromatografia em sílica, cromatografia em heparina, cromatografia com SEFAROSE™ numa resina de permuta aniónica ou catiónica (como uma coluna de ácido poliaspártico), cromatofocagem, SDS-PAGE e precipitação com sulfato de amónio, dependendo da variante do polipéptido a ser recuperada.
Após qualquer(quaisquer) passo(s) de purificação preliminar(es) , a mistura que compreende a variante do polipéptido de interesse e contaminantes pode ser submetida a cromatografia de interacção hidrófoba de baixo pH utilizando um tampão de eluição a um pH entre cerca de 2,5 - 4,5, preferivelmente realizada a baixas concentrações de sal (por exemplo, entre cerca de 0 - 0,25 M de sal). E. Formulações Farmacêuticas
Preparam-se formulações terapêuticas da variante do polipéptido para armazenamento por mistura da variante do polipéptido com o grau de pureza desejado com transportadores, excipientes ou estabilizadores opcionais fisiologicamente aceitáveis ("Remington's Pharmaceutical Sciences", 16a edição, Osol, A., Editor (1980)), na forma de formulações liofilizadas ou soluções aquosas. Transportadores, excipientes ou estabilizadores aceitáveis são não tóxicos para os receptores nas dosagens e concentrações empregues, e incluem tampões, tais como fosfato, citrato e outros ácidos orgânicos; antioxidantes, 73 incluindo ácido ascórbico e metionina; conservantes (como cloreto de octadecildimetilbenzilamónio; cloreto de hexametónio; cloreto de benzalcónio, cloreto de benzetónio; fenol, álcool butilico ou benzílico; alquilparabenos, como metil ou propilparabeno; catecol; resorcinol; ciclo-hexanol; 3-pentanol, e m-cresol); polipéptidos de baixo peso molecular (menos de cerca de 10 resíduos); proteínas, como albumina do soro, gelatina ou imunoglobulinas; polímeros hidrófilos, como polivinilpirrolidona; aminoácidos, como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina ou lisina; monossacáridos, dissacáridos e outros hidratos de carbono, incluindo glucose, manose ou dextrinas; agentes guelantes, como EDTA; açúcares, como sucrose, manitol, trealose ou sorbitol; contra-iões gue formam sais, como sódio; complexos metálicos (por exemplo, complexos Zn-proteína), e/ou surfactantes não iónicos, como TWEEN™, PLURONICS™ ou polietilenoglicol (PEG). A formulação agui apresentada também pode conter mais do gue um composto activo, consoante o necessário, para a indicação particular a ser tratada, preferivelmente agueles com actividades complementares gue não se afectam adversamente entre si. Essas moléculas estão adeguadamente presentes em combinação em quantidades gue são eficazes para a finalidade pretendida.
Os ingredientes activos também podem ser encerrados em microcápsulas preparadas, por exemplo, por técnicas de coacervação ou por polimerização interfacial, por exemplo, microcápsula de hidroximetilcelulose ou gelatina e microcápsula de poli (metacrilato de metilo), respectivamente, em sistemas coloidais de distribuição de fármacos (por exemplo, lipossomas, microesferas de 74 albumina, microemulsões, nanopartículas e nanocápsulas) ou em macroemulsões. Essas técnicas são reveladas em "Remington's Pharmaceutical Sciences", 16a edição, Osol, A., Editor (1980).
As formulações a serem utilizadas para administração in vivo devem ser esterilizadas. Isto é facilmente conseguido por filtração em membranas de filtração esterilizadas.
Podem preparar-se formulações de libertação prolongada. Exemplos adequados de preparações de libertação prolongada incluem matrizes semi-permeáveis de polímeros hidrófobos sólidos contendo a variante do polipéptido, cujas matrizes estão na forma de artigos configurados, por exemplo, filmes ou microcápsulas. Exemplos de matrizes de libertação prolongada incluem poliésteres, hidrogéis (por exemplo, poli (metacrilato de 2-hidroxietilo) ou poli(álcool vinílico)), poliláctidos (Patente U.S. N° 3 773 919), copolímeros de ácido L-glutâmico e L-glutamato de γ-etilo, copolímeros não degradáveis de etileno-acetato de vinilo, copolímeros degradáveis de ácido láctico-ácido glicólico, como LUPRON DEPOT™ (microesferas injectáveis compostas por copolímero de ácido láctico-ácido glicólico e acetato de leuprolida), e ácido poli-D-(-)-3-hidroxibutírico. Se bem que polímeros tais como etileno-acetato de vinilo e ácido láctico-ácido glicólico permitam a libertação de moléculas por mais de 100 dias, certos hidrogéis libertam proteínas durante períodos de tempo mais curtos. Quando anticorpos encapsulados permanecem no corpo durante um longo período de tempo, podem sofrer desnaturação ou agregar-se em resultado da exposição a humidade a 37°C, resultando em perda de actividade biológica e possíveis alterações da imunogenicidade. Podem conceber-se estratégias 75 fundamentadas para estabilização, dependendo do mecanismo envolvido. Por exemplo, se for descoberto que o mecanismo de agregação consiste em formação de ligações S-S intermoleculares por permuta de tiodissulfureto, pode obter-se estabilização por modificação de resíduos sulfidrilo, liofilização a partir de soluções acídicas, controlo do teor de humidade, utilização de aditivos apropriados e desenvolvimento de composições de matrizes poliméricas específicas. F. Utilizações Não Terapêuticas da Variante do Polipéptido A variante do polipéptido da invenção pode ser utilizada como agente de purificação por afinidade. Neste processo, a variante do polipéptido é imobilizada numa fase sólida, como uma resina Sephadex ou papel de filtro, utilizando métodos bem conhecidos na área. A variante do polipéptido imobilizada é contactada com uma amostra que contém o antigene a ser purificado e, seguidamente, o suporte é lavado com um solvente adequado que removerá substancialmente todo o material presente na amostra exceptuando o antigene a ser purificado, que está ligado à variante do polipéptido imobilizada. Por fim, o suporte é lavado com outro solvente adequado, como tampão de glicina, pH 5,0, que irá libertar o antigene da variante do polipéptido. A variante do polipéptido também pode ser útil em ensaios de diagnóstico, por exemplo, para detectar a expressão de um antigene de interesse em células ou tecidos específicos ou soro. 76
Para aplicações de diagnóstico, a variante do polipéptido será tipicamente etiquetada com uma fracção detectável. Estão disponíveis numerosas etiquetas, que podem ser genericamente agrupadas nas seguintes categorias. (a) Radioisótopos, como 35S, 14C, 125I, 3H e 131I. A variante do polipéptido pode ser etiquetada com o radioisótopo utilizando as técnicas descritas em "Current Protocols in Immunology", Volumes 1 e 2, Coligen et al., Editores, Wiley-Interscience, Nova Iorque, Nova Iorque, Pubs. (1991), por exemplo, e a radioactividade pode ser medida utilizando contagem de cintilações. (b) Estão disponíveis etiquetas fluorescentes, como quelatos de terras raras (quelatos de európio) ou fluoresceína e seus derivados, rodamina e seus derivados, dansilo, Lissamina, ficoeritrina e Vermelho Texas. As etiquetas fluorescentes podem ser conjugadas à variante do polipéptido utilizando as técnicas reveladas em "Current Protocols in Immunology", supra, por exemplo. A fluorescência pode ser quantificada utilizando um fluorímetro. (c) Estão disponíveis várias etiquetas enzima-substrato, e a Patente U.S. N° 4 275 149 apresenta uma revisão de algumas destas. Em geral, a enzima catalisa uma alteração química do substrato cromogénico, que pode ser medida utilizando várias técnicas. Por exemplo, a enzima pode catalisar uma alteração de cor num substrato, que pode ser medida espectrofotometricamente. Alternativamente, a enzima pode alterar a fluorescência ou quimioluminescência do substrato. Técnicas para quantificar uma alteração da fluorescência estão descritas acima. 0 substrato quimioluminescente é electronicamente excitado por uma reacção química e pode emitir luz, que pode ser medida (utilizando um quimioluminómetro, por exemplo), ou cede 77 energia para um aceitador fluorescente. Exemplos de etiquetas enzimáticas incluem luciferases (por exemplo, luciferase do pirilampo e luciferase bacteriana; Patente U.S. N° 4 737 456), luciferina, 2,3-di-hidroftalazino- dionas, malato desidrogenase, urease, peroxidase, como peroxidase de rábano bravo (HRPO), fosfatase alcalina, β-galactosidase, glucoamilase, lisozima, sacárido oxidases (por exemplo, glucose oxidase, galactose oxidase e glucose-6-fosfato desidrogenase), oxidases heterociclicas (como uricase e xantina oxidase), lactoperoxidase, micro-peroxidase e afins. Técnicas de conjugação de enzimas a anticorpos são descritas em 0'Sullivan et al., "Methods for the Preparation of Enzyme-Antibody Conjugates for use in Enzyme Immunoassay", em Methods in Enzym. (editores J. Langone e H. Van Vunakis), Academic Press, Nova Iorque, 73: 147-166 (1981).
Exemplos de combinações enzima-substrato incluem, por exemplo: (i) peroxidase de rábano bravo (HRPO) com hidrogénio peroxidase como substrato, em que a hidrogénio peroxidase oxida um precursor corante (por exemplo, orto-fenilenodiamina (OPD) ou cloridrato de 3, 3', 5, 5'-tetra-metilbenzidina (TMB)); (ii) fosfatase alcalina (AP) com fosfato de para-nitrofenilo como substrato cromogénico, e (iii) β-D-galactosidase (β-D-Gal) com um substrato cromogénico (por exemplo, p-nitrofenil^-D-galactosidase) ou substrato fluorogénico 4-metilumbeliferil-β-Ρ-galactosidase. 78
Numerosas combinações diferentes enzima-substrato estão disponíveis para os experimentados na área. Para uma revisão geral destas ver as Patentes U.S. N°s 4 275 149 e 4 318 980.
Por vezes, a etiqueta é conjugada indirectamente à variante do polipéptido. O técnico experimentado estará ciente das várias técnicas para consegui-lo. Por exemplo, a variante do polipéptido pode ser conjugada com biotina e qualquer uma das três categorias amplas de etiquetas mencionadas acima pode ser conjugada com avidina, ou vice-versa. A biotina liga-se selectivamente à avidina e, assim, a etiqueta pode ser conjugada à variante do polipéptido desta forma indirecta. Alternativamente, para se obter conjugação indirecta da etiqueta com a variante do polipéptido, a variante do polipéptido é conjugada com um hapteno pequeno (por exemplo, digoxina) e um dos diferentes tipos de etiquetas mencionados acima é conjugado com uma variante do polipéptido anti-hapteno (por exemplo, anticorpo anti-digoxina). Deste modo pode obter-se conjugação indirecta da etiqueta com a variante do polipéptido.
Noutra especificação da invenção não é necessário etiquetar a variante do polipéptido, e a sua presença pode ser detectada utilizando um anticorpo etiquetado que se liga à variante do polipéptido. A variante do polipéptido da presente invenção pode ser empregue em qualquer método de ensaio conhecido, como ensaios de ligação competitiva, ensaios em sanduíche directa e indirecta e ensaios de imunoprecipitação. Zola, 79 "Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques", páginas 147-158 (CRC Press, Inc. 1987). A variante do polipéptido também pode ser utilizada para ensaios de diagnóstico in vivo. Em geral, a variante do polipéptido é etiquetada com um radionuclido (como mIn, 99Tc, 14C, 131I, 125I, 3H, 32P ou 35S) de modo que o antigene, ou células que o expressam, possa ser localizado utilizando imunocintiografia. G. Utilizações In Vivo da Variante do Polipéptido É contemplado que a variante do polipéptido da presente invenção possa ser utilizada para tratar um mamífero, por exemplo, um paciente que sofre de uma doença ou perturbação que poderá beneficiar da administração da variante do polipéptido. Os estados que podem ser tratados com a variante do polipéptido são muitos e incluem cancro (por exemplo, em que a variante do polipéptido se liga ao receptor HER2 ou CD20); estados alérgicos, como asma (com um anticorpo anti-IgE), e perturbações mediadas por LFA (por exemplo, em que a variante do polipéptido é um anticorpo anti-LFA-1 ou anti-ICAM-1), etc. Quando a variante do polipéptido não se ligar ao complemento mas retiver capacidade de ligação de FcR, doenças ou perturbações exemplificativas a serem tratadas incluem: cancro (por exemplo, quando for desejável a função de ADCC mas em que a activação do complemento conduziria a efeitos secundários amplificados, como vasculite nos vasos sanguíneos no sítio do tumor); perturbações tratadas com um anticorpo agonista; perturbações em que a variante do polipéptido se liga a um antigene solúvel e em que a estequiometria conduz a complexos imunológicos que activam a cascata do complemento e resultam em efeitos secundários 80 indesejados; estados que empregam um anticorpo antagonista que modula negativamente a função de receptores sem danificar a função de tecidos ou órgãos; tratamento intravenoso com imunoglobulinas, por exemplo, para indivíduos imunologicamente deficientes com perturbações autoimunes. A variante do polipéptido é administrada por qualquer meio adequado, incluindo administração parentérica, subcutânea, intraperitoneal, intrapulmonar e intranasal e, se desejado para tratamento de supressão imunológica local, intra-lesão. Infusões parentéricas incluem administração intramuscular, intravenosa, intra-arterial, intraperitoneal ou subcutânea. Adicionalmente, a variante do polipéptido é adequadamente administrada por infusão descontínua, particularmente com doses decrescentes da variante do polipéptido. Preferivelmente, a dosagem é administrada por injecções, muito preferivelmente injecções intravenosas ou subcutâneas, dependendo, em parte, da administração ser breve ou crónica.
Para a prevenção ou tratamento de doenças, a dosagem apropriada da variante do polipéptido dependerá do tipo de doença a ser tratado, da gravidade e progressão da doença, da variante do polipéptido ser administrada para fins preventivos ou terapêuticos, terapia anterior, historial clínico do paciente e resposta à variante do polipéptido e critério do médico. A variante do polipéptido é adequadamente administrada ao paciente uma vez ou ao longo de uma série de tratamentos.
Dependendo do tipo e gravidade da doença, cerca de 1 μg/kg até 15 mg/kg (por exemplo, 0,1 - 20 mg/kg) da 81 variante do polipéptido é um candidato à dosagem inicial para administração ao paciente, seja, por exemplo, por uma ou mais administrações separadas ou por infusão continua. Uma dosagem diária típica poderá variar desde cerca de 1 μρ/kg até 100 mg/kg ou mais, dependendo dos factores mencionados acima. Para administrações repetidas durante vários dias ou mais, dependendo do estado, o tratamento é mantido até ocorrer uma supressão desejada dos sintomas da doença. No entanto, poderão ser úteis outros regimes de dosagem. A progressão desta terapia é facilmente monitorizada por técnicas e ensaios convencionais. A composição da variante do polipéptido será formulada, doseada e administrada de um modo consistente com a boa prática clínica. Neste contexto, factores a ter em consideração incluem a perturbação particular a ser tratada, o mamífero particular a ser tratado, o estado clínico do paciente individual, a causa da perturbação, o sítio da distribuição do agente, o método de administração, a calendarização da administração e outros factores conhecidos dos praticantes de medicina. A "quantidade terapeuticamente eficaz" da variante do polipéptido a ser administrada será ditada por essas considerações e é a quantidade mínima necessária para prevenir, melhorar ou tratar uma doença ou perturbação. Não é necessário que a variante do polipéptido seja, mas é opcionalmente formulada com um ou mais agentes correntemente utilizados para prevenir ou tratar a perturbação em questão. A quantidade eficaz desses outros agentes depende da quantidade da variante do polipéptido presente na formulação, do tipo de perturbação ou tratamento e outros factores discutidos acima. Estes são genericamente usados nas mesmas dosagens e 82 com vias de administração como aqui utilizadas antes ou desde cerca de 1 até 99% das dosagens empregues até aqui. A invenção será mais completamente compreendida por referência aos exemplos seguintes. No entanto, não devem ser considerados limitadores do âmbito desta invenção. Todas as citações de literatura e patentes aqui mencionadas são expressamente incorporadas por referência. EXEMPLO 1
Ensaio de Ligação de Receptores com Baixa Afinidade
Com este ensaio determina-se a ligação da região Fc de uma IgG às subunidades α de FcyRlla, FcyRIIb e FcyRIIIa recombinantes expressa como proteínas de fusão marcadas com His6-glutationa S transferase (GST). Uma vez que a afinidade da região Fc da igGl para FcyRl se situa na gama nanomolar, pode medir-se a ligação de mutantes Fc de IgGl por titulação de IgG monomérica e medição da IgG ligada com um anti-IgG policlonal num formato de ELISA padrão (Exemplo 2 abaixo). A afinidade dos outros membros da família FcyR, isto é, FcyRlla, FcyRIIb e FcyRIIIa para IgG situa-se, todavia, na gama micromolar, e a ligação da IgGl monomérica a estes receptores não pode ser medida de forma fiável num formato ELISA. O ensaio seguinte utiliza mutantes Fc de E27 anti-IgE recombinante (Figuras 4A e 4B) que, quando misturado com IgE humana numa razão molar 1:1, forma um hexâmero estável que consiste em três moléculas anti-IgE e três moléculas IgE. Preparou-se uma forma quimérica recombinante de IgE (IgE quimérica), que consiste na região Fc de uma IgE humana e no Fab de um anticorpo anti-VEGF (Presta et al.f 83 Câncer Research 57_: 4593-4599 (1997)), que se liga a duas moléculas de VEGF por mole de anti-VEGF. Quando o VEGF humano recombinante é adicionado, numa razão molar 2:1, a hexâmeros igE quimérica:E27, os hexâmeros ligam-se em complexos de maior peso molecular via a interacção Fab de IgE quimérica:VEGF. 0 componente E27 deste complexo liga-se às subunidades α de FcyRIIa, FcyRIIb e FcyRIIIa com avidez mais elevada, para permitir a detecção num formato ELISA.
MATERIAIS E MÉTODOS
Revestimento de Receptores. Subunidades α de receptores Fcy foram expressas como fusões com GST de domínios extracelulares (ECDs) marcados com His6 em células 293, resultando numa proteína de fusão ECD-6His-GST (Graham et al., J. Gen. Virol. 36ç 59-72 (1977), e Gorman et al., DNA Prot. Eng. Tech. 2: 3-10 (1990)), que foi purificada por cromatografia em coluna de Ni-NTA (Qiagen, Austrália) e o tampão foi mudado para solução salina tamponada com fosfato (PBS). Determinaram-se as concentrações por absorção a 280 nm, utilizando coeficientes de extinção derivados por análise da composição de aminoácidos. Os receptores foram revestidos em placas Nunc 96 Maxisorb (n° do catálogo 439454) a 100 ng por cavidade, por adição de 100 pL da fusão receptor-GST a 1 pg/mL em PBS, e incubação durante 48 horas a 4°C. Antes do ensaio, as placas são lavadas 3 x com 250 pL de tampão de lavagem (PBS, pH 7,4, contendo TWEEN 20™ 0,5%) e bloqueadas com 250 pL de tampão de ensaio (solução salina tamponada com Tris 50 mM, TWEEN 20™ 0,05%, albumina bovina de qualidade para RIA 0,5% (Sigma A7888) e EDTA 2 mM, pH 7,4). 84
Formação do Complexo Imunológico. Quantidades molares iguais (1:1) de E27 e IgE quimérica recombinante, que se liga a duas moles de VEGF humano recombinante por mole de IgE quimérica, são adicionadas a um tubo de polipropileno 12 x 75 mm em PBS e misturadas por rotação durante 30 minutos a 25°C. Durante esta incubação formam-se hexâmeros E27 (anti-IgE)/IgE quimérica (IgE). Adiciona-se VEGF humano recombinante (forma 165, P.M. 44 000), numa razão molar 2:1, à concentração de IgE e o sistema é misturado por rotação durante 30 minutos adicionais a 25°C. A ligação VEGF - IgE quimérica liga hexâmeros E27:IgE quimérica em complexos de maior peso molecular, que se ligam a placas revestidas com ECDs das subunidades α de FcyRs via a região Fc do anticorpo E27.
Complexos E27:IgE quimérica:VEGF (razão molar 1:1:2) são adicionados a placas revestidas com subunidades α de FcyRs às concentrações de E27 de 5 pg e 1 pg de IgG total, em quadruplicado, em tampão de ensaio, e o sistema é incubado durante 120 minutos a 25°C num agitador orbital.
Detecção dos Complexos. As placas são lavadas 5 x com tampão de lavagem, para remover complexos não ligados, e detecta-se a ligação de IgG por adição de 100 pL de anti-IgG (y) humana de cabra conjugado com peroxidase de rábano bravo (HRP) especifico para a cadeia pesada (Boehringer Mannheim 1814249), a 1:10 000, em tampão de ensaio, e incuba-se o sistema durante 90 minutos a 25°C num agitador orbital. As placas são lavadas 5 x com tampão de lavagem, para remover anti-IgG humana de cabra conjugado com HRP não ligado, detecta-se o anti-IgG ligado adicionando 100 pL de solução de substrato (0,4 mg/mL de dicloridrato de o- 85 fenilenodiamina, Sigma P6912, H2O2 6 mM em PBS) e incubando o sistema durante 8 minutos a 25°C. A reacção enzimática é terminada por adição de 100 μΡ de H2S04 4,5 N e mede-se o produto colorimétrico a 490 nm num densitómetro de placa de 96 cavidades (Molecular Devices). A ligação de complexos mutantes de E27 é expressa em percentagem do complexo que contém E27 de tipo selvagem. EXEMPLO 2
Identificação de Sítios de Ligação Únicos de Clq num Anticorpo IgG Humano
No presente estudo identificaram-se mutações no dominio CH2 de um anticorpo IgGl humano, "C2B8" (Reff et al., Blood 83: 435 (1994)), que eliminaram a ligação do anticorpo a
Clq mas não alteraram a conformação do anticorpo nem afectaram a ligação a cada um dos FcyRs. Por mutagénese de varrimento de alanina identificaram-se cinco mutantes da IgGl humana, D270K, D270V, K322A, P329A e P331, que não eram liticos e tinham ligação decrescida a Clq. Os dados sugeriram que os sítios de ligação de Clq do núcleo da IgGl humana são diferentes dos da IgG2b murina. Adicionalmente, descobriu-se que K322A, P329A e P331A se ligam normalmente ao antigene CD20 e a quatro receptores de Fc, FcyRI, FcyRII, FcyRIII e FcRn.
MATERIAIS E MÉTODOS
Construção de Mutantes de C2B8. Utilizaram-se as cadeias leve e pesada quiméricas do anticorpo anti-CD20 C2B8 (Reff et al., Blood 83: 435 (1994)), subclonadas separadamente em vectores PRK previamente descritos (Gorman et al., DNA Protein Eng. Tech. 2: 3 (1990)). Por mutagénese dirigida a sítios (Kunkel et al., Proc. Natl. Acad. Sei. 86 U.S.A. Q2_: 488 (1985)) construíram-se variantes de varrimento de alanina da região Fc na cadeia pesada. Os plasmídeos das cadeias pesada e leve foram co-transfectados para uma linha de células de rim embrionário humano transformadas com adenovírus como previamente descrito (Werther et al., J. Immunol. 157: 4986 (1996)). O meio foi alterado para meio sem soro 24 horas após a transfecção e o anticorpo segregado foi recolhido passados cinco dias. Os anticorpos foram purificados utilizando Proteína A-SEFAROSE CL”4B™ (Pharmacia), o tampão foi mudado, o sistema foi concentrado para 0,5 mL com PBS utilizando um Centricon-30 (Amicon) e foi armazenado a 4°C. Determinou-se a concentração do anticorpo utilizando ELISA para a ligação de Ig total. ELISA para a ligação a Clq. Placas de 96 cavidades Costar foram revestidas durante a noite, a 4°C, com as concentrações indicadas de C2B8 em tampão de revestimento (tampão de carbonato de sódio 0,05 M), pH 9. Em seguida, as placas foram lavadas 3 x com PBS/TWEEN 20™ 0,05%, pH 7,4, e foram bloqueadas com 200 μΐ de diluente de ELISA sem timerosal (NaP04 0,1 M/NaCl 0,1 M/gelatina 0,1%/TWEEN 20™ 0,05%/ProClin300 0,05%) durante 1 hora à temperatura ambiente. A placa foi lavada 3 x com tampão de lavagem, adicionou-se a cada cavidade uma alíquota de 100 pL de Clq 2 pg/mL (Quidel, San Diego, CA) e incubou-se o sistema durante 2 horas à temperatura ambiente. Seguidamente, a placa foi lavada 6 x com tampão de lavagem. Adicionaram-se a cada cavidade 100 pL de uma diluição 1:1000 de anticorpo de cabra anti-Clq do complemento conjugado com peroxidase (Biodesign) e incubou-se o sistema durante 1 hora à temperatura ambiente. A placa foi novamente lavada 6 x com 87 tampão de lavagem e adicionaram-se a cada cavidade 100 μΙ) de tampão de substrato (PBS/H2O2 0,012%) contendo OPD (dicloridrato de o-fenilenodiamina (Sigma)). Permitiu-se a progressão da reacção de oxidação, observada pelo aparecimento de uma cor amarela, durante 30 minutos, tendo sido terminada por adição de 100 μΐ de H2S04 4,5 N. Depois leu-se a absorvância a (492 - 405) nm utilizando um leitor de microplacas (SPECTRA MAX 250™, Molecular Devices Corp.). Conduziram-se em paralelo os controlos apropriados (isto é, o ensaio ELISA foi realizado sem Clq para cada concentração de C2B8 utilizada e o ensaio ELISA também foi realizado sem C2B8). Para cada mutante mediu-se a ligação de Clq representando graficamente a absorvância (492 - 405) nm versus a concentração de C2B8 em μg/mL, utilizando um programa de ajustamento de curvas com 4 parâmetros (KALEIDAGRAPH™) , e comparando os valores EC50.
Ensaio de Citotoxicidade Dependente do Complemento (CDC) . Este ensaio foi realizado essencialmente como previamente descrito (Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202: 163 (1997)). Várias concentrações de C2B8 (0,08 - 20 μρ/mL) foram diluidas com tampão RHB (RPMI 1640/HEPES 20 mM (pH 7,2)/Glutamina 2 mM/BSA 0,1%/Gentamicina 100 μρ/mL). Diluiu-se complemento humano (Quidel) 1:3 em tampão RHB e diluiram-se células WIL2-S (disponibilizadas pela ATCC, Manassas, VA), que expressam o antigene CD20, para uma densidade de 1 χ 106 células/mL com tampão RHB. A uma placa de cultura de tecidos de 96 cavidades de fundo plano adicionaram-se misturas de 150 μΐ que continham volumes iguais de C2B8, complemento humano diluído e células WIL2-S, e deixou-se incubar o sistema durante 2 horas a 37°C e 5% de C02, para facilitar a lise 88 celular mediada pelo complemento. Depois adicionaram-se a cada cavidade 50 μΐ de Alamar azul (Accumed International) e incubou-se o sistema durante a noite a 37°C. Mediu-se a absorvância utilizando um fluorómetro de 96 cavidades com excitação a 530 nm e emissão a 590 nm. Como descrito por Gazzano-Santoro et al., os resultados são expressos em unidades de fluorescência relativa (RFU). Calcularam-se as concentrações das amostras a partir de uma curva-padrão de C2B8, e apresenta-se para cada mutante a actividade percentual comparada com o C2B8 de tipo selvagem.
Potência de Ligação a CD20 dos Mutantes do C2B8.
Avaliou-se a ligação do C2B8 e mutantes ao antigene CD20 por um método previamente descrito (Reff et al. (1994), supra; revisto em Gazzano-Santoro et al. (1996), supra). Células WIL2-S cresceram durante 3-4 dias para uma densidade celular de 1 x 106 células/mL. As células foram lavadas e submetidas duas vezes a rotação em tampão FACS (PBS/BSA 0,l%/NaN3 0,02%) e foram novamente suspensas para uma densidade celular e 5 x 106 células/mL. A um tubo de 5 mL adicionaram-se 200 μΐ de células (5 x 106 células/mL) e 20 μ! de amostras diluídas de C2B8 e incubou-se o sistema à temperatura ambiente durante 30 minutos com agitação. Em seguida, a mistura foi lavada com 2 mL de tampão FACS frio, foi submetida a rotação e novamente suspensa em 200 μΐ de tampão FACS frio. Adicionaram-se à suspensão 10 μΐ de anti-IgG humana de cabra-FITC (American Qualex Labs.) e incubou-se a mistura no escuro à temperatura ambiente durante 30 minutos com agitação. Após a incubação, a mistura foi lavada com 2 mL de tampão FACS, foi submetida a rotação e novamente suspensa em 1 mL de tampão de fixação frio (formaldeído 1% em PBS) . As amostras foram analisadas por 89 citometria de fluxo e os resultados, expressos em unidades de fluorescência relativa (RFU), foram representados graficamente versus as concentrações de anticorpo utilizando um programa de ajustamento de curvas com 4 parâmetros (KALEIDAGRAPH™). Apresentam-se os valores EC50 como percentagem dos valores correspondentes do material de referência C2B8. ELISAs para Ligação de Fc/Rs. A fusão subunidade α de FcyRI-GST foi revestida em placas Nunc F96 Maxisorb (n° do catálogo 439454) por adição de 100 pL de fusão receptor-GST, a 1 pg/mL em PBS, e incubou-se o sistema durante 48 horas a 4°C. Antes do ensaio, as placas foram lavadas 3 x com 250 pL de tampão de lavagem (PBS pH 7,4 contendo TWEEN 20™ 0,5%) e bloqueadas com 250 pL de tampão de ensaio (solução salina tamponada com Tris 50 mM, TWEEN 20™ 0,05%, albumina bovina de qualidade para RIA 0,5% (Sigma A7888) e EDTA 2 mM pH 7,4). As amostras diluídas para 10 pg/mL em 1 mL de tampão de ensaio são adicionadas a placas revestidas com subunidade α de FcyRI e são incubadas durante 120 minutos a 25°C num agitador orbital. As placas são lavadas 5 x com tampão de lavagem, para remover complexos não ligados, e detecta-se a ligação de IgG adicionando 100 pL de anti-IgG (y) humana de cabra conjugado com peroxidase de rábano bravo (HRP) específico para a cadeia pesada (Boehringer Mannheim 1814249), a 1:10 000 em tampão de ensaio, e incubando o sistema durante 90 minutos a 25°C num agitador orbital. As placas são lavadas 5 x com tampão de lavagem, para remover anti-IgG humana de cabra conjugado com HRP não ligado, e detecta-se anti-IgG ligado por adição de 100 pL de solução de substrato (0,4 mg/mL de 90 dicloridrato de o-fenilenodiamina, Sigma P6912, H2O2 6 mM em PBS) e incubando o sistema durante 8 minutos a 25°C. A reacção enzimática é terminada por adição de 100 pL de H2SO4 4,5 N e mede-se 0 produto colorimétrico a 490 nm num densitómetro de placa de 96 cavidades (Molecular Devices) . A ligação da variante é expressa em percentagem da molécula de tipo selvagem.
Os ensaios ELISA para a ligação de FcyRII e III foram realizados como descrito no Exemplo 1 acima.
Para medir a actividade de ligação a FcRn de variantes da IgG, placas de ELISA foram revestidas com 2 pg/rnL de estreptavidina (Zymed, South San Francisco) em tampão de carbonato 50 mM, pH 9,6, a 4°C durante a noite, e foram bloqueadas com PBS-BSA 0,5%, pH 7,2, à temperatura ambiente durante uma hora. Adicionou-se à placa FcRn biotinilado (preparado utilizando biotina-X-NHS da Research Organics, Cleveland, OH, e utilizado a 1 - 2 μρ/πΛ) em PBS - BSA 0,5%, polissorbato 20 0,05%, pH 7,2, e incubou-se o sistema durante uma hora. Adicionaram-se à placa diluições em série de duas vezes de padrão de IgG (1,6 - 100 ng/mL) ou variantes em PBS - BSA 0,5%, polissorbato 20 0,05%, pH 6,0, e incubou-se o sistema durante duas horas. Detectou-se a IgG ligada utilizando F(ab')2 anti-IgG humana F(ab')2 de cabra etiquetado com peroxidase no tampão de pH 6,0 acima (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA), seguido de 3,3',5,5'-tetrametilbenzidina (Kirgaard & Perry Laboratories) como substrato. As placas foram lavadas entre os passos com PBS - polissorbato 20 0,05% a pH 7,2 ou 6,0. Leu-se a absorvância a 450 nm num leitor de placas Vmax (Molecular Devices, Menlo Park, CA). As curvas de titulação 91 foram ajustadas com um programa de ajustamento de curvas de regressão não linear de quatro parâmetros (KaleidaGraph, Synergy Software, Reading, PA). Calcularam-se as concentrações de variantes da IgG correspondentes à absorvência do ponto médio da curva de titulação do padrão, tendo sido divididas pela concentração do padrão correspondente à absorvância do ponto médio da curva de titulação do padrão.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Por mutagénese de varrimento de alanina construiram-se várias mutações num único ponto no domínio CH2 do C2B8, começando com E318A, K320A e K322A. Todos os mutantes construídos ligaram-se normalmente ao antigene CD20 (Tabela D -
Tabela 1 ts E318A K320A K322A P329A P331A FcRn + + + + CD20 + + + + + + FcyRI + + + + + + FcyRii + + + + + + FcyRIii + + + + + + *Clq +++ ++ +++ - - - CDC + + + - - (+) indica ligação e (-) indica ligação abolida *Relativamente à ligação de Clq, cada sinal + é equivalente a aproximadamente 33% de ligação.
Quando se analisou a ligação do complemento humano a um anticorpo com uma Fc humana, a capacidade de E318A e K320A para activar o complemento foi essencialmente idêntica à do C2B8 de tipo selvagem (Tabela 1) . Quando comparada com o C2B8 de tipo selvagem, parece haver pouca diferença na ligação de E318A e K320A a Clq. Há apenas um decréscimo de 92 10% na ligação de K320A e um decréscimo de cerca de 30% na ligação de E318A a Clq (Fig. 2). Os resultados indicam que o efeito da substituição E318A e K320A na activação do complemento e ligação de Clq é minimo. Além disso, a igGl humana de C2B8 foi substituída por IgG2 humana e usada como controlo negativo nos estudos de ligação de Clq. O mutante de IgG2 parece ter afinidade muito mais baixa para Clq do que os mutantes E318A e K320A (Fig. 2) . Assim, os resultados demonstram que E318 e K320 não constituem os sítios de ligação de Clq do núcleo para a IgGl humana. Inversamente, a substituição K322A teve um efeito significativo na actividade do complemento e ligação de Clq. O mutante K322A não exibiu actividade de CDC quando testado no ensaio de CDC acima e foi inferior em mais de 100 vezes do que o C2B8 de tipo selvagem relativamente à ligação de Clq (Fig. 2) . No sistema humano, ο K322 é o único resíduo dos sítios de ligação de Clq do núcleo propostos que parece exercer um efeito significativo na activação do complemento e ligação de Clq.
Uma vez que o estudo de Duncan e Winter foi realizado utilizando IgG2b de ratinho e os resultados acima revelam que K320 e E318 da IgGl humana não estão envolvidos na ligação de Clq, e sem pretender ficar restringido por qualquer teoria, os dados acima sugerem que a região de ligação de Clq em IgGs murinas é diferente da humana. Para investigar suplementarmente esta questão e também para identificar mutantes adicionais que não se ligam a Clq e, assim, não activam o complemento, construíram-se mais mutações pontuais diversas na vizinhança de K322, como avaliado a partir da estrutura tridimensional da Fc do C2B8. Os mutantes construídos, K274A, N276A, Y278A, S324A, P329A, P331A, K334A e T335A, foram avaliados quanto à sua 93 capacidade para se ligarem a Clq e também para activarem o complemento. Muitas destas substituições tiveram pouco ou nenhum efeito na ligação de Clq ou activação do complemento. Nos ensaios acima, os mutantes P329A e P331A não activaram o complemento e exibiram ligação decrescida a Clq. 0 mutante P331A não activou o complemento e a ligação a Clq foi 60 vezes inferior (Fig. 3) em comparação com o C2B8 de tipo selvagem (Fig. 2). A gama de concentrações das variantes do anticorpo utilizada na Fig. 3 está expandida para 100 μρ/ιηΐ para se observar a saturação da ligação a Clq da variante P331A. A mutação P329A resulta num anticorpo que não activa o complemento e exibe uma ligação a Clq inferior em mais de 100 vezes (Fig. 3) em comparação com o C2B8 de tipo selvagem (Fig. 2).
Os mutantes que não se ligaram ao Clq e, assim, não activaram o complemento foram examinados quanto à sua capacidade para se ligarem aos receptores de Fc: FcyRI, FcyRIIa, FcyRIIb, FcyRIIIa e FcRn. Realizou-se este estudo particular utilizando um anticorpo anti-IgE humanizado, um anticorpo IgGl com estas mutações (ver Exemplo 1 acima). Os resultados revelaram que os mutantes K322A e P329A se ligaram a todos os receptores de Fc na mesma extensão da proteína de tipo selvagem (Tabela 2). No entanto, observou-se um ligeiro decréscimo na ligação de P331A a FcyRIIb.
Em conclusão, identificaram-se duas substituições de aminoácidos na região COOH terminal do domínio CH2 da IgGl humana, K322A e P329A, que resultam num decréscimo superior a 100 vezes da ligação de Clq e não activam a via CDC. Estes dois mutantes, K322A e P329A, ligam-se a todos os receptores de Fc com a mesma afinidade do anticorpo de tipo 94 selvagem. Com base nos resultados, resumidos na Tabela 2, e sem pretender ficar restringido por qualquer teoria, é proposto que o epicentro da ligação a Clq da IgGl humana está centrado em redor de K322, P329 e P331, e que é diferente do epicentro da IgG2b murina, que consiste em E318, K320 e K322.
Tabela 2 ts E318A K320A K322A P329A P331A CD20 100 89 102 86 112 103 aFcyRI 100 93 102 90 104 74 aFcyRIIa 100 113 94 109 111 86 aFcyRIIb 100 106 83 101 96 58 aFcyRIII 100 104 72 90 85 73 CDC 100 108 108 Nenhuma Nenhuma Nenhuma aPara a ligação aos FcyRs, os mutantes foram preparados no fundo de E27 (anti-IgE).
Os resultados estão apresentados como percentagem do tipo selvagem.
Identificou-se outro residuo envolvido na ligação de Clq humano utilizando os métodos descritos no presente exemplo. 0 residuo D270 foi substituído por lisina e valina, gerando os mutantes D270K e D270V, respectivamente. Estes dois mutantes exibiram ligação decrescida a Clq humano (Fig. 6) e não foram líticos (Fig. 7). Os dois mutantes ligaram-se ao antigene CD20 normalmente e recrutaram ADCC. LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110> Genentech, Inc. <120> Variantes de Polipéptido 95 <13 0 > P1266R2PCT < 16 0 > 2 <210 > 1 Λ «—1 1—1 CS] V 218 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <221> Sequência Artificial <222> 1 - 218 <223> Sequência é completamente sintetizada <4 0 0 > 1
Asp 11« Gin Leu Thr Gin Ser Fro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Vai s 10 15 Gly Aep Arg Vai Thr *0 ;Ue Thr cys Arg Ala 25 Ser Lys Pro Vai ASp 30 Gly Cl» Gly ftsp Ser Tyr «et Asa Trp Tyr fila Gin Lys Fre fily n 40 45 hya Ala Fro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala. Ala Ser Tyr Leu Glu Ser so ss so Gly Vai F:ro Ser Arg Pim Sèr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp PM £S 70 75 Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pr o Gin Âep Fhe Ala Thr Tyr SD 8S so Tyr Cys Gls Gin Ser lis filu Ãsp Pro fyr Thr Fhe Gly Gla fily S.S 100 10> Thr Lys Vai GIu Xie Lys Arg Thr Vai Ala A.U pro ser vai PM no 115 130 ile Fhe Fro Pro Ser Aap Siu Gin Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser 125 130 135 vai vai Cys Leu Leu ksn Ae» Fhe Tyr Fro Arg Giu Ala Lys Vai 140 145 ISO Gin Trp Lys Vai Asp kar» Ala Leu Gin. Ser fily Asn Ser Gin filu 155 ISO 165 Ser Vai Thr Glu filó ASp Ser Lys Asp ser xhr Tyr Ser Leu Ser 170 175 180 96
Ser Tbr Leu Thr Lsu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lye His Lys Vai 3^05 190 195
Tyr Ala Cys Glu Vai Thr His Gin Gly Leu Ser Ser Pro Vai Thr aoo 2°5 210
Lye Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 215 218
<210> 2 <211> 451 <212> PRT <213> Sequência Artificial <2 2 0 > <221> Sequência Artificial <222> 1 - 451 <223> Sequência é completamente sintetizada <400> 2
Glu Vai Gin Leu val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly 1 5 10 15 Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr 20 25 30 Ser Gly Tyr Ser Trp Asn Trp Ile Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly 35 40 45 Leu Glu Trp Val Ala Ser Ile Lys Tyr Ser Gly Glu Thr Lys Tyr 50 55 60 Asn Pro Ser Vai Lys Gly Arg ile Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser 65 70 75 Lys Asn Thr Phe Tyr Leu Gin «et Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp 80 85 50 Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Ser His Tyr Phe Gly HiS 95 100 105 Trp His Phe Ala Val Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser 110 115 120 Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser 125 130 135 Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu val 140 145 150 Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly 155 ISO 165 Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gin Ser 170 175 180 Ser Gly Leu 'Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser ias 190 195 97
Ser Leu Gly Thr Gin Thr Tyr Ile Cys Asn. Vai Asa His Lys Pro 200 205 210
Ser Asa Thr Lys Vai Asp Lys Lys Vai Glu Pro Lys Ser Cys Asp 215 220 225
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly 230 235 240
Gly Pro Ser Vai Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu 245 250 255
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Vai Thr Cys vai Vai Vai Asp Vai 260 265 270
Ser His Glu Asp Pro Glu Vai Lys Phe Asa Trp Tyr Vai Asp Gly 275 280 285
Vai Glu Vai His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr 290 295 300
Asn Ser Thr Tyr Arg Vai vai Ser Vai Leu Thr Vai Leu His Gin 305 310 315
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Vai Ser Asn Lys 320 325 330
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Xle Ser Lys Ala Lys Gly 335 340 345
Gin. Pro Arg Glu Pro Gin Vai Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu 3S8 355 360
Glu Met Thr Lys Asn Gin Vai Ser Leu Thr Cys Leu Vai Lys Gly 3S5 370 3?5
Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Vai Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin 380 385 330
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Vai Leu Asp Ser Asp 395 400 405
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr vai Asp Lys Ser Arg 410 415 420
Trp Gin Gin Gly Asn Vai Phe Ser Cys Ser Vai Met His Glu Ala 425 430 435
Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 440 445 450
Lys 451
Lisboa, 6 de Novembro de 2007
Claims (17)
1 REIVINDICAÇÕES 1. Variante de um polipéptido que compreende a região Fc de uma IgG humana, cuja variante tem capacidade reduzida ou nula para activar o complemento e compreende uma substituição de aminoácidos na posição de aminoácidos 270 ou 329, ou em duas ou mais das posições de aminoácidos 270, 322, 329 e 331 da região Fc da IgG humana, em que a numeração dos resíduos na região Fc da IgG é a do índice EU de Kabat.
2. Variante da Reivindicação 1, em que Pro329 da região Fc da IgG humana está substituído por outro aminoácido.
3. Variante da Reivindicação 1, em que Asp270 da região Fc da IgG humana está substituído por outro aminoácido.
4. Variante da Reivindicação 1, em que o polipéptido compreende um anticorpo.
5. Variante da Reivindicação 1, em que o polipéptido compreende a região Fc de uma IgGl humana.
6. Variante da Reivindicação 1 que não activa o complemento.
7. Variante da Reivindicação 6 que se liga a um FcR.
8. Variante da Reivindicação 7 que se liga a FcyRI, FcyRII, FcyRIII e FcRn.
9. Variante da Reivindicação 8 que compreende uma substituição de aminoácidos na posição de aminoácido 329 ou nas posições de aminoácidos 322 e 329 da região Fc da IgG humana. 2
10. Composição que compreende a variante de qualquer uma das Reivindicações 1 até 9 e um transportador fisiologicamente aceitável.
11. Método para modificar um polipéptido compreendendo a região Fc de uma IgG humana, que compreende substituir um residuo de aminoácido na posição de aminoácidos 270 ou 329, ou em duas ou mais das posições de aminoácidos 270, 322, 329 e 331 da região Fc da IgG humana, em que a numeração dos resíduos na região Fc da IgG é a do índice EU de Kabat.
12. Ácido nucleico isolado que codifica uma variante de acordo com qualquer uma das Reivindicações 1 até 9.
13. Vector que compreende o ácido nucleico da Reivindicação 12.
14. Célula-hospedeiro que compreende o vector da Reivindicação 13.
15. Processo para produzir uma variante do polipéptido de acordo com as Reivindicações 1-9, que compreende cultivar a célula-hospedeiro da Reivindicação 14 de modo que o ácido nucleico de acordo com a Reivindicação 12 seja expresso.
16. Processo da Reivindicação 15, que também compreende recuperar a variante da cultura da célula-hospedeiro.
17. Variante do polipéptido de acordo com qualquer uma das Reivindicações 1 até 9 para utilização como medicamento. Lisboa, 6 de Novembro de 2007
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