JP2016521715A - 抗tweakr抗体およびその使用 - Google Patents
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Abstract
本発明は、TWEAKR(TNFRSF12A、FN14)に対して特異的な組換え抗原結合領域ならびにこのような抗原結合領域を含有する抗体および機能的断片を提供する。したがって、前記抗体は、TWEAKRの発現に関連する腫瘍ならびに他の障害および症状を治療するために使用され得る。本発明はまた、上記抗体をコードする核酸配列、これを含有するベクター、医薬組成物、および使用説明書を含むキットを提供する。
Description
本発明は、TWEAKR(TNFRSF12A、FN14)に対して特異的な組換え抗原結合領域ならびにこのような抗原結合領域を含有する抗体および機能的断片を提供する。
したがって、本抗体は、TWEAKRの発現に関連する腫瘍ならびに他の障害および症状を治療するために使用することができる。本発明はまた、上記抗体をコードする核酸配列、これを含有するベクター、医薬組成物、および使用説明書を含むキットを提供する。
抗体ベースの治療法は、固形腫瘍を含む様々な癌の治療に極めて有効であることが判明しつつある。例えば、ハーセプチン(HERCEPTIN(登録商標))は乳癌の治療に使用されて成功を収めており、リツキサン(RITUXAN(登録商標))はB細胞関連癌タイプに有効である。奏効する新規な抗体ベースの治療法の開発において中核を成すのは、腫瘍細胞上に優先的に発現することが見出された細胞表面タンパク質に対する抗体の単離である。
Tumor necrosis factor(TNF)like weak inducer of apoptosis(TWEAK)およびTWEAK受容体(TWEAKR、エイリアスTNFRSF12A、FN14、CD266;Swiss Prot Acc.Q9NP84、NP_057723)は、炎症、増殖、浸潤、遊走、分化、アポトーシスおよび血管新生に関与するTNFスーパーファミリーリガンド−受容体のペアである(Winkles JA,Nat Rev Drug Discov.2008 May;7(5):411−25;Michaelson JS and Burkly LC,Results Probl Cell Differ.2009;49:145−60)。TWEAKは、0.8〜2.4nMの親和性でTWEAKRに結合し、この受容体に結合する唯一のTNFファミリーメンバーである(Wiley SR et al.,Immunity.2001 Nov;15(5):837−46)。TWEAKRは、正常組織では比較的低レベルで発現しているが、それが組織リモデリングにおいて役割を果たす損傷組織では、局所的に著しく増加している(Winkles JA,Nat Rev Drug Discov.2008 May;7(5):411−25;Zhou et al.,Mol Cancer Ther.2011 Jul;10(7):1276−88;Burkly LC et al.,Immunol Rev.2011 Nov;244(1):99−114)。TWEAKRシグナル伝達は、創傷治癒、慢性自己免疫疾患および急性虚血性脳卒中のようなプロセスに関与する(Burkly LC et al.,Immunol Rev.2011 Nov;244(1):99−114)。加えて、様々な種類の固形腫瘍、例えば膵臓癌、非小細胞肺癌(NSCLC)、結腸直腸癌(CRC)、乳癌、腎臓癌、頭頸部癌、食道癌、膀胱癌、肝細胞癌、卵巣癌、黒色腫ならびに肝臓および骨転移では、TWEAKRは高発現している(Culp P et al.,Clin Cancer Res.2010 Jan 15;16(2):497−508;Zhou H et al.,J Invest Dermatol.2013 Apr;133(4):1052−62)。脳癌(Tran NL et al.,Cancer Res.2006 Oct 1;66(19):9535−42)、乳癌(Willis AL et al.,Mol Cancer Res.2008 May;6(5):725−34;Wang J et al.,Histol Histopathol.2013 Jan 9[Epub ahead of print])、食道癌(Watts GS et al.,Int J Cancer.2007 Nov 15;121(10):2132−9 2007)、前立腺癌(Huang M et al.,Carcinogenesis.2011 Nov;32(11):1589−96)、胃癌(Kwon OH et al.,Cancer Lett.2012 Jan 1;314(1):73−81)、神経芽細胞腫(Pettersen I et al.,Int J Oncol.2013 Apr;42(4):1239−48)および膀胱癌(Shimada K et al.,Clin Cancer Res.2012 Oct 1;18(19):5247−55)では、TWEAKRの発現の増加と高い腫瘍悪性度および/または予後不良との関連が示されている。
TWEAKRの発現は、FGF、PDGFおよびVEGFのような成長因子によって誘導される(Winkles JA,Nat Rev Drug Discov.2008 May;7(5):411−25)。この観察と一致して、TWEAKRの発現は、NSCLCでは、EGFRの過剰発現または活性化と相関することが示されており(Whitsett TG et al.,Am J Pathol.2012 Jul;181(1):111−20)、乳癌では、HER2の発現と相関することが示されている(Wang J et al.,Histol Histopathol.2013 Jan 9[Epub ahead of print];Chao DT et al.,J Cancer Res Clin Oncol.2013 Feb;139(2):315−25)。
TWEAKによってTWEAKRが活性化されると、TNF受容体関連因子(TRAF)が細胞内結合ドメインに動員され、標準的および非標準的なNF−κB経路によりNF−κBが長期に活性化され、IL−8およびMCP−1のようなサイトカイン分泌が誘導される(Michaelson JS and Burkly LC,Results Probl Cell Differ.2009;49:145−60に概説されている)。これは、TWEAK/TWEAKR経路の説明されている炎症促進的な役割によく一致する。しかしながら、TWEAKRは特徴的な「デスドメイン」を欠くので、TWEAKRを介した細胞殺傷に関与するシグナル伝達経路は不明確である。いくつかの腫瘍細胞株(Kym−1、SKOV−3、OVCAR)では、それは、TNFを介したアポトーシスおよびTRAF2の動員を誘導し、続いて、その結果生じたTRAF2−cIAP複合体がリソソーム分解される(Nakayama M.et al,J Immunol.2002 Jan 15;168(2):734−43;Schneider P et al,Eur J Immunol.1999 Jun;29(6):1785−92;Vince JE et al,J Cell Biol.2008 Jul 14;182(1):171−84)。他の細胞株(HSC3、HT−29、KATO−III)では、TWEAK誘導性アポトーシスは、TNF非依存性であると報告されている(Nakayama M et al,J Immunol.2003 Jan 1;170(1):341−8;Wilson CA et al,Cell Death Differ.2002 Dec;9(12):1321−33)。最近の報告では、JAK阻害剤による処理が、WiDr細胞におけるカスパーゼ3/7活性化を増加させるTWEAKの能力を無効化したので、TWEAKによるアポトーシスの誘導は、Stat−1リン酸化の刺激に依存することが示された(Chapman MS et al,Cytokine.2013 Jan;61(1):210−7)。
いくつかの研究は、腫瘍学的標的としてTWEAKRが検証された。Michaelsonらは、TWEAKの投与が、マウス異種移植モデルにおける腫瘍成長を軽減することを示した(Michaelson JS et al,MAbs.2011 Jul−Aug;3(4):362−75)。いくつかのグループが、アゴニスト抗TWEAKR抗体を用いて、この抗腫瘍効果を模倣した。マウスの免疫化とそれに続くクローン選択およびヒト化によって、潜在的な薬物候補(すなわち、BIIB0036/P4A8(Michaelson JS et al,MAbs.2011 Jul−Aug;3(4):362−75)およびPDL−192(Culp PA et al,Clin Cancer Res.2010 Jan 15;16(2):497−508))が作製されている。
PDL−192は、5.5nMの結合親和性でTWEAKRに結合し(Culp PA et al,Clin Cancer Res.2010 Jan 15;16(2):497−508)、いくつかのTWEAKR発現癌細胞株の成長を阻害する。しかし、EC/IC50に関する増殖およびアポトーシスアッセイでは、TWEAKリガンドと比較して、PDL−192は効力が弱いことが示されており、低いカスパーゼ3/7活性化効果(Vmax)を達成したに過ぎなかった(Culp PA et al,Clin Cancer Res.2010 Jan 15;16(2):497−508)。より大規模な乳癌細胞株パネルのプロファイリングにより、単量体PDL−192の抗増殖活性がごくわずかであることが確認され(Culp PA et al,Clin Cancer Res.2010 Jan 15;16(2):497−508;Chao DT et al,J Cancer Res Clin Oncol.2013 Feb;139(2):315−25)、20%超の増殖阻害で反応する細胞株は、27種のうちのわずか5種であった。抗体の抗増殖活性は、抗体の架橋または固定化によってわずかに増強される。加えて、PDL−192はADCCを示すので、異種移植モデルで示された抗腫瘍活性は、ADCCおよび腫瘍細胞成長阻害効果が合わさったものであると考えられる(Culp PA et al,Clin Cancer Res.2010 Jan 15;16(2):497−508)。PDL−192のさらなる限界は、種交差反応性(特に、マウスおよびラット)の欠如であり、例えば、毒性研究のような一般的な前臨床試験による評価が不可能である。
薬物候補として説明されている第2のアゴニスト抗TWEAKR抗体BIIB036/P4A8は、内因性リガンドTWEAKと同程度の1.7nMの親和性でTWEAKに結合する(Michaelson JS et al,MAbs.2011 Jul−Aug;3(4):362−75)。この抗体は、癌細胞においてNF−κBの活性化およびサイトカイン放出を誘導することが示されているが、有効性は、Fc−TWEAK(これは、組換え可溶性TWEAKと同様の活性を有する可溶性TWEAKのhIgG1 Fc融合物(aa106〜249)である)と比較して有意に低い(Michaelson JS et al.,Oncogene.2005 Apr 14;24(16):2613−24)。抗体で細胞を処理した後のTUNEL染色(BIIB036/P4A8の効力も、Fc−TWEAKと比較して有意に減少している)で示されるように、細胞増殖アッセイおよびアポトーシス誘導についても同じことが言える。抗増殖活性は、抗体の多量化後に増加するが、多量体型は依然として、組換えFc−TWEAKと比較して有効性が低い。対照的に、BIIB036/P4A8は、ADCCの強力な誘導因子であり、異種移植モデルにおける抗腫瘍活性は、Fcエフェクター機能に大きく依存することが示された。
両薬物候補の他に、いくつかのマウス抗体は、ヒト治療に有用なヒト化の抗体操作が必要であると説明されている。癌細胞に対する抗増殖活性を有する第1の抗TWEAKR抗体は、Nakayamaら(Nakayama M et al,Biochem Biophys Res Commun.2003 Jul 11;306(4):819−25)によって記載されている抗体Item1−4であった。しかしながら、これらの抗体は、比較的弱いアゴニスト活性を有するに過ぎず、TWEAK媒介性のTWEAKR活性化に関して、部分的なアゴニスト/アンタゴニストとして作用することが示された。抗体136.1および18.3.3(国際公開第2009/020933号)は、TWEAKリガンドと比較して高い親和性結合を示すが、これが、より有効なカスパーゼ活性化につながるわけではない。抗体P3G5およびP2D3(国際公開第2009/140177号)は、癌細胞におけるサイトカイン放出を誘導するが、Fc−TWEAKと比較して有効性が有意に低い。要約すると、当技術分野で説明されている抗TWEAKR抗体によるアポトーシスの誘導および増殖の阻害に関するTWEAKRアゴニスト活性は限定的であり、内因性リガンドTWEAKの有効性に及ぶものではなく、それを上回るものでもない。これらの抗体は、内因性リガンドTWEAKと比較して同程度の親和性でTWEAKRに結合し(Michaelson JS et al,MAbs.2011 Jul−Aug;3(4):362−75;Culp PA et al,Clin Cancer Res.2010 Jan 15;16(2):497−508)、また、高い結合親和性を有する抗体が、より強力なシグナル伝達活性を必ずしも示すわけではないので(Culp PA et al,Clin Cancer Res.2010 Jan 15;16(2):497−508)、このアゴニスト活性の欠如は、低い親和性によるものではない。以前に記載されている抗体の抗腫瘍活性は、Fcエフェクター機能に依存することが示されており、ADCCは、マウスモデルにおいてインビボ有効性に重要な役割を果たすことが示されている。しかしながら、抗体のチャレンジおよび免疫エフェクター細胞の固形腫瘍への浸潤(Culp PA et al,Clin Cancer Res.2010 Jan 15;16(2):497−508)を考慮すると、臨床では、Fc−Fc受容体(FcR)相互作用を介したADCCおよびインビボ架橋の、固形腫瘍における抗腫瘍活性への寄与は依然として不明である。加えて、FcγRIIIAの低親和性対立遺伝子を保有する患者は、Fc−FcR相互作用能力が低いので、治療から受ける利益が少ないであろう(Varchetta S et al,Cancer Res.2007 Dec 15;67(24):11991−9)。
したがって、TWEAKRの過剰活性化による癌細胞のアポトーシスおよび成長阻害を、内因性リガンドTWEAKと比較して同じかまたはそれ以上に誘導する強力な固有能力を有する開発可能なヒト抗体が、非常に求められている。患者における抗腫瘍反応の誘導において、アポトーシスの誘導および増殖の阻害は、長年にわたる有効な構想であるので(Hanahan D and Weinberg RA,Cell.2000 Jan 7;100(1):57−70;Kim R et al,Cancer Chemother Pharmacol.2002 Nov;50(5):343−52;Fesik SW,Nat Rev Cancer.2005 Nov;5(11):876−855)、これらの抗体は、ヒトの固形腫瘍において高い抗腫瘍活性を示すことが期待されており、したがって、癌治療の有望な薬物候補である。
Winkles JA,Nat Rev Drug Discov.2008 May;7(5):411−25
Michaelson JS and Burkly LC,Results Probl Cell Differ.2009;49:145−60
Wiley SR et al.,Immunity.2001 Nov;15(5):837−46
Zhou et al.,Mol Cancer Ther.2011 Jul;10(7):1276−88
Burkly LC et al.,Immunol Rev.2011 Nov;244(1):99−114
Culp P et al.,Clin Cancer Res.2010 Jan 15;16(2):497−508
Zhou H et al.,J Invest Dermatol.2013 Apr;133(4):1052−62
Tran NL et al.,Cancer Res.2006 Oct 1;66(19):9535−42
Willis AL et al.,Mol Cancer Res.2008 May;6(5):725−34
Wang J et al.,Histol Histopathol.2013 Jan 9[Epub ahead of print]
Watts GS et al.,Int J Cancer.2007 Nov 15;121(10):2132−9 2007
Huang M et al.,Carcinogenesis.2011 Nov;32(11):1589−96
Kwon OH et al.,Cancer Lett.2012 Jan 1;314(1):73−81
Pettersen I et al.,Int J Oncol.2013 Apr;42(4):1239−48
Shimada K et al.,Clin Cancer Res.2012 Oct 1;18(19):5247−55
Whitsett TG et al.,Am J Pathol.2012 Jul;181(1):111−20
Chao DT et al.,J Cancer Res Clin Oncol.2013 Feb;139(2):315−25
Nakayama M.et al,J Immunol.2002 Jan 15;168(2):734−43
Schneider P et al,Eur J Immunol.1999 Jun;29(6):1785−92
Vince JE et al,J Cell Biol.2008 Jul 14;182(1):171−84
Nakayama M et al,J Immunol.2003 Jan 1;170(1):341−8
Wilson CA et al,Cell Death Differ.2002 Dec;9(12):1321−33
Chapman MS et al,Cytokine.2013 Jan;61(1):210−7
Michaelson JS et al,MAbs.2011 Jul−Aug;3(4):362−75
Michaelson JS et al.,Oncogene.2005 Apr 14;24(16):2613−24
Nakayama M et al,Biochem Biophys Res Commun.2003 Jul 11;306(4):819−25
Varchetta S et al,Cancer Res.2007 Dec 15;67(24):11991−9
Hanahan D and Weinberg RA,Cell.2000 Jan 7;100(1):57−70
Kim R et al,Cancer Chemother Pharmacol.2002 Nov;50(5):343−52
Fesik SW,Nat Rev Cancer.2005 Nov;5(11):876−855
本発明は、TWEAKRの強力な活性化をもたらし、それにより、TWEAKRの過剰発現を示す様々な癌細胞において、アポトーシスの強力な誘導をもたらす抗体またはその抗原結合抗体断片またはその変異体に関する。本明細書に記載される抗体による癌細胞アポトーシスの誘導は、当技術分野で説明されているすべての抗体(例えば、PDL−192またはBIIB0036/P4A8;例えば、架橋剤の追加を必要とする)と比較してより有効である。本発明の抗体のユニークな特性は、TWEAKR(配列番号:169;および図1を参照のこと)の47位のアミノ酸(D47)に対する抗体の選択的結合を特徴とする新規な結合エピトープに基づくものである。
したがって、本発明の抗体は、癌およびその転移、特に特定のTWEAKR発現腫瘍、例えば結腸直腸癌、非小細胞肺癌(NSCLC)、頭頸部癌、食道癌、黒色腫、肝細胞癌、膀胱癌、胃癌、乳癌、膵臓癌、腎細胞癌、前立腺癌、卵巣癌および子宮頸癌の治療に適切である。
本発明は、ほとんどの細胞株において、内因性リガンドTWEAKと比較して優れたレベルで、癌細胞アポトーシスの強力な活性化を誘導するという点において、既存の抗TWEAKR抗体と区別される抗体を説明する。本発明の抗体またはその抗原結合断片は、a)TWEAKRを強力に活性化し、b)癌細胞におけるアポトーシスを誘導し、c)癌細胞からのサイトカイン分泌を誘導し、d)インビボ腫瘍実験において、共に抗体の抗腫瘍活性をもたらし、e)加えて、前記抗体のみでは効果がない実験条件において、前記抗体は、サポリンコンジュゲート二次抗体と共にインキュベートすると、TWEAKRのインターナリゼーションおよび癌細胞増殖の阻害をもたらし、f)いくつかの種に対して交差反応性である。本発明のこれらのおよび他の目的は、本明細書により詳細に記載されている。
本発明の抗体は、公知の医薬と共に同時投与され得、一部の場合には、前記抗体は、それ自体が改変され得る。例えば、有効性を潜在的にさらに増加させるために、抗体を細胞毒性剤、免疫毒素、担毒体または放射性同位体にコンジュゲートし得る。
本発明はさらに、正常組織と比較してTWEAKR発現が上昇している悪性症状または形成異常症状を診断するためのツールを構成する抗体を提供する。検出可能なマーカーにコンジュゲートされた抗TWEAKR抗体が提供される。好ましいマーカーは、放射性ラベル、酵素、発色団または発蛍光体である。
本発明はまた、本発明の抗体またはその抗原結合断片をコードするポリヌクレオチド、本発明の抗体またはその抗原結合断片を発現する細胞、本発明の抗体またはその抗原結合断片を生産するための方法、本発明の抗体またはその抗原結合断片を使用して形成異常細胞の成長を阻害するための方法、および本発明の抗体またはその抗原結合断片を使用して癌を治療および検出するための方法に関する。
本発明はまた、単離された核酸配列であって、そのそれぞれが、TWEAKRのエピトープに対して特異的な上記抗体またはその抗原結合断片をコードし得る単離された核酸配列に関する。本発明の核酸は、抗体または抗原結合抗体断片の組換え生産に適切である。したがって、本発明はまた、本発明の核酸配列を含有するベクターおよび宿主細胞に関する。
本発明の組成物は、治療用途または予防用途に使用することができる。したがって、本発明は、本発明の抗体またはその抗原結合断片と、したがって薬学的に許容され得る担体または賦形剤とを含む医薬組成物を含む。関連する態様では、本発明は、TWEAKR発現細胞の望ましくない存在に関連する障害または症状を治療するための方法を提供する。好ましい実施形態では、上記障害は、癌である。このような方法は、本明細書に記載されるまたは本明細書で想定される本発明の抗体を含有する有効量の医薬組成物を、それを必要とする被験体に投与する工程を含有する。
本発明はまた、抗体ライブラリーを使用して、このようなライブラリーのTWEAKRに特異的に結合する1つ以上のメンバーを単離するための指示を提供する。
本発明は、TWEAKRに対する特異的親和性を有し、被験体に治療的利益を送達することができる新規抗体の発見に基づくものである。ヒト抗体、ヒト化抗体またはキメラ抗体であり得る本発明の抗体は、本明細書により詳細に説明される多くの状況において使用することができる。
定義
別段の定義がある場合を除き、本明細書で使用される技術用語および科学用語はすべて、本発明が属する技術分野の当業者が一般に理解している意味を有する。しかしながら、本発明が関係する技術分野の当業者であれば、本発明で使用される用語の多くについて、その一般的定義を、以下の参考文献に見出すことができ、それらの定義が当技術分野で一般に理解されている意味と合致している限り、以下の参考文献を参照し、使用することができる。このような参考文献には、例えばSingleton et al,Dictionary of Microbiology and Molecular Biology(2d ed.1994);The Cambridge Dictionary of Science and Technology(Walker ed.,1988);Hale&Marham,The Harper Collins Dictionary of Biology(1991);およびLackie et al.,The Dictionary of Cell&Molecular Biology(3d ed.1999);およびCellular and Molecular Immunology,Eds.Abbas,Lichtman and Pober,2nd Edition,W.B.Saunders Companyが含まれるが、これらに限定されない。当業者に利用可能な任意のさらなる技術情報源であって、当技術分野で一般に理解されている意味を有する本明細書で使用される用語の定義を提供するものを参照し得る。本発明の目的のために、以下の用語をさらに定義する。さらなる用語は、本明細書の他の箇所で定義する。本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される単数形「a」および「the」は、文脈上そうでないことが明白である場合を除き、複数の言及を含む。したがって、例えば「遺伝子(a gene)」は1つ以上の遺伝子への言及であり、当業者に公知のその均等物などを含む。
別段の定義がある場合を除き、本明細書で使用される技術用語および科学用語はすべて、本発明が属する技術分野の当業者が一般に理解している意味を有する。しかしながら、本発明が関係する技術分野の当業者であれば、本発明で使用される用語の多くについて、その一般的定義を、以下の参考文献に見出すことができ、それらの定義が当技術分野で一般に理解されている意味と合致している限り、以下の参考文献を参照し、使用することができる。このような参考文献には、例えばSingleton et al,Dictionary of Microbiology and Molecular Biology(2d ed.1994);The Cambridge Dictionary of Science and Technology(Walker ed.,1988);Hale&Marham,The Harper Collins Dictionary of Biology(1991);およびLackie et al.,The Dictionary of Cell&Molecular Biology(3d ed.1999);およびCellular and Molecular Immunology,Eds.Abbas,Lichtman and Pober,2nd Edition,W.B.Saunders Companyが含まれるが、これらに限定されない。当業者に利用可能な任意のさらなる技術情報源であって、当技術分野で一般に理解されている意味を有する本明細書で使用される用語の定義を提供するものを参照し得る。本発明の目的のために、以下の用語をさらに定義する。さらなる用語は、本明細書の他の箇所で定義する。本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される単数形「a」および「the」は、文脈上そうでないことが明白である場合を除き、複数の言及を含む。したがって、例えば「遺伝子(a gene)」は1つ以上の遺伝子への言及であり、当業者に公知のその均等物などを含む。
「ポリペプチド」および「タンパク質」という用語は、本明細書では、アミノ酸残基のポリマーを指すために互換的に使用される。この用語は、1つ以上のアミノ酸残基が、対応する天然に存在するアミノ酸の人工化学模倣体であるアミノ酸ポリマー、ならびに天然に存在するアミノ酸ポリマーおよび天然に存在しないアミノ酸ポリマーに適用される。別段の指示がない限り、特定のポリペプチド配列はまた、その保存的に改変された変異体を黙示的に包含する。
「ヒト」抗体またはその抗原結合断片は、本明細書では、キメラ抗体ではなく(例えば、「ヒト化」抗体ではなく)、非ヒト種に(全部または一部が)由来する抗体でもないものと定義される。ヒト抗体またはその抗原結合断片は、ヒトに由来し得るか、または合成ヒト抗体であり得る。「合成ヒト抗体」は、本明細書では、公知のヒト抗体配列の分析に基づく合成配列からインシリコで全部または一部が導き出された配列を有する抗体と定義される。ヒト抗体配列またはその断片のインシリコ設計は、例えばヒト抗体配列または抗体断片配列のデータベースを分析し、そこから得られたデータを利用してポリペプチド配列を考案することなどによって、達成することができる。ヒト抗体またはその抗原結合断片の別の例は、ヒト起源の抗体配列のライブラリーから単離された核酸によってコードされるものである(すなわち、上記ライブラリーはヒト天然供給源から採取された抗体に基づく)。ヒト抗体の例には、Soderlind et al.,Nature Biotech.2000,18:853−856に記載されている抗体が含まれる。
「ヒト化抗体」またはそのヒト化抗原結合断片は、本明細書では、(i)非ヒト供給源(例えば、異種免疫系を保持するトランスジェニックマウス)に由来し、ヒト生殖細胞系配列に基づく抗体、(ii)非ヒト抗体のフレームワーク領域のアミノ酸が遺伝子工学によってヒトアミノ酸配列に部分的に交換されているもの、または(iii)CDR移植されたものであって、可変ドメインのCDRが非ヒト起源のものであり、一方、可変ドメインの1つ以上のフレームワークはヒト起源のものであり、定常ドメイン(存在する場合)はヒト起源のものであるものと定義される。
「キメラ抗体」またはその抗原結合断片は、本明細書では、可変ドメインが非ヒト起源に由来し、定常ドメインの一部または全部がヒト起源に由来するものと定義される。
本明細書で使用される「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を指す。すなわち、その集団を含む個々の抗体は、微量に存在し得る可能な突然変異(例えば、天然に存在する突然変異)を除いて同一である。したがって、「モノクローナル」という用語は、別個の抗体の混合物ではないという抗体の特徴を示している。典型的には異なる決定基(エピトープ)に対する異なる抗体を含んでいるポリクローナル抗体調製物とは対照的に、モノクローナル抗体調製物の各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に向けられる。モノクローナル抗体調製物は、その特異性だけではなく、それらが典型的には他の免疫グロブリンによって汚染されていないという点でも有利である。「モノクローナル」という用語が、何らかの特定の方法による抗体の生産を要求しているとは解釈すべきでない。モノクローナル抗体という用語は、特にキメラ抗体、ヒト化抗体およびヒト抗体を含む。本明細書で使用される「アゴニスト/アゴニスト抗体」は、目的のポリペプチド(本明細書では、TWEAKRリガンドであるTWEAK)の機能活性の少なくとも1つを模倣する抗体である。
本明細書で使用される場合、目的の抗原、例えば腫瘍関連ポリペプチド抗原標的(本明細書ではTWEAKR)「に特異的に結合する」抗体、目的の抗原「に対して/に関して特異的な」抗体、または目的の抗原「を特異的に認識する」抗体は、抗体が、その抗原を発現する細胞または組織を標的とする際に治療剤として有用であり、他のタンパク質と有意に交差反応しないか、または上記抗原標的のオルソログおよび変異体(例えば、変異型、スプライス変異体、またはタンパク質分解によって切断された形態)以外のタンパク質と有意に交差反応しないような形で、その抗原に十分な親和性で結合するものである。特定のポリペプチドまたは特定のポリペプチド標的上のエピトープ「を特異的に認識する」または「に特異的に結合する」または「に対して/関して特異的な」という用語は、本明細書では、例えば、その抗原に関して、約10−4M未満、あるいは約10−5M未満、あるいは約10−6M未満、あるいは約10−7M未満、あるいは約10−8M未満、あるいは約10−9M未満、あるいは約10−10M未満、あるいは約10−11M未満、あるいは約10−12M未満、またはそれ未満の一価KDを有する抗体またはその抗原結合断片によって表すことができる。抗体は、その抗体がある抗原と1つ以上の(1または複数の)参照抗原とを識別できるのであれば、その抗原「に特異的に結合」し、その抗原「に対して/関して特異的」であり、またはその抗原「を特異的に認識」する。その最も一般的な形態において、「特異的結合」、「に特異的に結合する」、「に対して/関して特異的である」または「を特異的に認識する」は、例えば次に挙げる方法の1つにしたがって決定される、目的の抗原と無関係な抗原とを識別する抗体の能力を指している。このような方法には、ウエスタンブロット、ELISA試験、RIA試験、ECL試験、IRMA試験およびペプチドスキャンが含まれるが、これらに限定されない。例えば、標準的なELISAアッセイを行うことができる。スコア化は、標準的な発色法(例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼを有する二次抗体およびテトラメチルベンジジンと過酸化水素)で行うことができる。特定のウェルにおける反応を、例えば450nmにおける光学密度によってスコア化する。典型的なバックグラウンド(=陰性反応)は、0.1ODであり得る;典型的な陽性反応は、1ODであり得る。これは陽性/陰性差が、5倍超、10倍超、50倍超、そして好ましくは100倍超であることを意味する。典型的には、結合特異性の決定は、単一の参照抗原ではなく、例えば粉乳、BSA、トランスフェリンなどの、およそ3〜5個の無関係な抗原のセットを使用して行われる。
「結合親和性」は、分子の単一結合部位とその結合パートナーとの間の非共有結合的相互作用の総和の強さを指す。別段の指示がない限り、本明細書で使用される「結合親和性」は、結合ペアのメンバー(例えば、抗体と抗原)の間の1:1相互作用を反映する固有の結合親和性を指す。解離定数「KD」は、ある分子(例えば、抗体)とその結合パートナー(例えば、抗原)との間の親和性を表すために、すなわち、リガンドが特定タンパク質にどのくらい強固に結合するかを表すために一般的に使用される。リガンド−タンパク質親和性は、それら2つの分子間の非共有結合的分子間相互作用による影響を受ける。親和性は、本明細書に記載される方法を含め、当技術分野で公知の一般的な方法によって測定することができる。一実施形態では、本発明による「KD」または「KD値」が、実施例2にしたがって、Biacore T100機器(GE Healthcare Biacore,Inc.)を用いる表面プラズモン共鳴アッセイによって測定される。他の適切なデバイスは、BIACORE T200、BIACORE(R)−2000、BIACORe 4000、BIACORE(R)−3000(BIAcore,Inc.,Piscataway,NJ)またはProteOn XPR36機器(Bio−Rad Laboratories,Inc.)である。
本明細書で使用される「抗体」という用語は、免疫グロブリン分子、好ましくは4本のポリペプチド鎖、すなわち典型的にはジスルフィド結合によって相互に連結されている2本の重(H)鎖および2本の軽(L)鎖で構成されるものを指すものとする。各重鎖は、重鎖可変領域(本明細書ではVHと略記する)と重鎖定常領域とで構成される。重鎖定常領域は、例えば3つのドメインCH1、CH2およびCH3を含み得る。各軽鎖は、軽鎖可変領域(本明細書ではVLと略記する)と軽鎖定常領域とで構成される。軽鎖定常領域は、1つのドメイン(CL)で構成される。VH領域およびVL領域は、さらに、フレームワーク領域(FR)と称される保存度の比較的高い領域がところどころに挿入された、相補性決定領域(CDR)と称される超可変領域に細分することができる。各VHおよびVLは、典型的には、アミノ末端からカルボキシ末端に向かって、例えば次の順序で配置された3つのCDRと4つまでのFRとで構成される:FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。
本明細書で使用される「相補性決定領域」(CDR;例えば、CDR1、CDR2、およびCDR3)という用語は、抗原結合にとってその存在が必要な、抗体可変ドメインのアミノ酸残基を指す。各可変ドメインは、典型的には、CDR1、CDR2およびCDR3と同定される3つのCDR領域を有する。各相補性決定領域は、Kabatが定義した「相補性決定領域」からのアミノ酸残基[例えば、軽鎖可変ドメインにおける残基24〜34(L1)、50〜56(L2)および89〜97(L3)ならびに重鎖可変ドメインにおける31〜35(H1)、50〜65(H2)および95〜102(H3)付近(Kabat et al.,Sequences of Proteins of Immulological Interest,5th Ed.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD.(1991))]および/または「超可変ループ」からの残基[例えば、軽鎖可変ドメインにおける残基26〜32(L1)、50〜52(L2)および91〜96(L3)、ならびに重鎖可変ドメインにおける26〜32(H1)、53〜55(H2)および96〜101(H3)付近(Chothia and Lesk;J Mol Biol 196:901−917(1987))]を含み得る。いくつかの例において、相補性決定領域は、Kabatにしたがって定義されるCDR領域と超可変ループの両方からのアミノ酸を含み得る。
インタクトな抗体は、その重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に応じて、異なる「クラス」に割り当てることができる。インタクトな抗体には5つの主要クラス、すなわちIgA、IgD、IgE、IgG、およびIgMがあり、これらのうちのいくつかは、「サブクラス」(アイソタイプ)、例えばIgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、およびIgA2へと、さらに分割することができる。異なるクラスの抗体に対応する重鎖定常ドメインは、それぞれα、δ、ε、γ、およびμと称される。異なるクラスの免疫グロブリンのサブユニット構造および三次元立体配置は周知である。本明細書で使用される抗体は、従来から公知の抗体およびその機能的断片である。
抗体/免疫グロブリンの「機能的断片」または「抗原結合抗体断片」は、本明細書では、抗原結合領域を保っている抗体/免疫グロブリンの断片(例えば、IgGの可変領域)と定義される。抗体の「抗原結合領域」は、典型的には、抗体の1つ以上の(1または複数の)超可変領域、例えばCDR1、CDR2、および/またはCDR3領域に見られる;しかしながら、可変「フレームワーク」領域も、CDRに足場を提供することなどにより、抗原結合に重要な役割を果たすことができる。好ましくは、「抗原結合領域」は、少なくとも可変軽(VL)鎖のアミノ酸残基4〜103と、可変重(VH)鎖のアミノ酸残基5〜109とを含み、より好ましくはVLのアミノ酸残基3〜107とVHのアミノ酸残基4〜111とを含み、特に好ましいのは、完全なVL鎖およびVH鎖(VLのアミノ酸位置1〜109とVHのアミノ酸位置1〜113;国際公開第97/08320号による番号付与)である。本発明における使用にとって好ましい免疫グロブリンクラスはIgGである。
本発明の「機能的断片」または「抗原結合抗体断片」には、Fab、Fab’、F(ab’)2、およびFv断片;ダイアボディ;単一ドメイン抗体(DAb)、線状抗体;単鎖抗体分子(scFv);および抗体断片から形成される多重特異性(例えば、二重特異性および三重特異性)抗体(C.A.K Borrebaeck,editor(1995)Antibody Engineering(Breakthroughs in Molecular Biology),Oxford University Press;R.Kontermann&S.Duebel,editors(2001)Antibody Engineering(Springer Laboratory Manual),Springer Verlag)が含まれる。「多重特異性」または「多官能性」抗体以外の抗体は、その結合部位のそれぞれが同一であると理解される。F(ab’)2またはFabは、CH1ドメインとCLドメインとの間に生じる分子間ジスルフィド相互作用が最小限になるか完全に除去されるように、工学的に操作することができる。
本明細書における「Fc領域」という用語は、定常領域の少なくとも一部分を含む、免疫グロブリン重鎖のC末端領域を定義するために使用される。この用語は、天然配列のFc領域および変種Fc領域を含む。一実施形態では、ヒトIgG重鎖Fc領域は、Cys226またはPro230から、重鎖のカルボキシル末端まで及ぶ。しかしながら、Fc領域のC末端リジン(Lys447)は、存在してもよいし、または存在しなくてもよい。本明細書で別段の指定がない限り、Fc領域中または定常領域中のアミノ酸残基の番号付与は、EU指標とも称されるEU番号付与方式にしたがい、これは、Kabat et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th Ed.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD,1991に記載されている。
本発明で想定される抗体または抗原結合抗体断片の変異体は、TWEAKRに対する抗体または抗原結合抗体断片の結合活性が維持されている分子である。
本発明で想定される結合タンパク質は、例えば、アフィボディ、アドネクチン、アンチカリン、DARPin、アビマー、ナノボディなどの抗体模倣体である(Gebauer M.et al.,Curr.Opinion in Chem.Biol.2009;13:245−255;Nuttall S.D.et al.,Curr.Opinion in Pharmacology 2008;8:608−617に総説がある)。
本明細書で使用される「エピトープ」という用語は、免疫グロブリンまたはT細胞受容体に特異的に結合する能力を有する任意のタンパク質決定基を含む。エピトープ決定基は、通常、アミノ酸または糖側鎖などの分子またはそれらの組み合わせの化学的に活性な表面配置からなり、通常は特異的な三次元構造特徴と、特異的な電荷特徴とを有する。
「単離された」抗体は、同定され、それを発現する細胞の構成要素から分離された抗体である。細胞の夾雑構成要素は、抗体の診断的または治療的使用を妨害するであろう物質であり、酵素、ホルモン、および他のタンパク質性または非タンパク質性の溶質を含み得る。好ましい実施形態では、抗体が、(1)例えばローリー法、UV−Vis分光法、またはSDS−キャピラリーゲル電気泳動(例えば、Caliper LabChip GXII、GX 90またはBiorad Bioanalyzer装置によるもの)などによる決定で、抗体の95重量%を上回るまで、さらに好ましい実施形態では99重量%を上回るまで精製されるか、(2)少なくとも15残基のN末端アミノ酸配列または内部アミノ酸配列を得るのに十分な程度にまで精製されるか、または(3)還元条件下もしくは非還元条件下に、クーマシーブルーを使用するか、好ましくは銀染色を使用して、SDS−PAGEで単一バンドになるまで精製される。抗体の天然環境の少なくとも1つの構成要素が存在しないので、単離された天然に存在する抗体には、組換え細胞内におけるインサイチューの抗体が含まれる。しかしながら、通常は、単離された抗体は、少なくとも1つの精製工程によって調製されるであろう。
「抗体依存性細胞性細胞傷害」または「ADCC」は、特定の細胞傷害性細胞(例えば、NK細胞、好中球、およびマクロファージ)上に存在するFcガンマ受容体(FcγR)に結合した分泌Igによって、これらの細胞傷害性エフェクター細胞が、抗原を保持する標的細胞に特異的に結合し、次いでその標的細胞を、例えば細胞毒によって殺すことが可能になる、細胞傷害性の一形態を指す。目的の抗体のADCC活性を評価するには、インビトロADCCアッセイ、例えば米国特許第5,500,362号または米国特許第5,821,337号または米国特許第6,737,056号(Presta)に記載されているものを行うことができる。このようなアッセイに有用なエフェクター細胞には、PBMCおよびNK細胞が含まれる。
「補体依存性細胞傷害」または「CDC」は、補体の存在下での標的細胞の溶解を指す。古典的補体経路の活性化は、それぞれのコグネイト抗原に結合している抗体(適切なサブクラスのもの)に補体系の第1構成要素(C1q)が結合することによって開始される。補体活性化を評価するには、例えばGazzano−Santoro et al.,J.Immunol.Methods 202:163(1996)に記載されているようなCDCアッセイを行うことができる。変化したFc領域アミノ酸配列を有し、C1q結合の増加または減少を伴うポリペプチド変異体(変異Fc領域を有するポリペプチド)が、例えば米国特許第6,194,551号および国際公開第1999/51642号に記載されている。
イムノコンジュゲート(免疫複合体)という用語(互換的に「抗体−薬物コンジュゲート(抗体−薬物複合体)」または「ADC」とも称される)は、化学療法剤、薬物、成長阻害剤、毒素(例えば、タンパク質毒素、細菌、真菌、植物、動物起源の酵素的に活性な毒素、またはその断片)、または放射性同位元素(すなわち、ラジオコンジュゲート)などの1つ以上の細胞毒性剤または細胞増殖抑制剤にコンジュゲートされた抗体を指す。イムノコンジュゲートは、癌の治療において、細胞毒性剤、すなわち細胞を殺すか、その成長または増殖を阻害する薬物を、局所的に送達するために使用されてきた(例えば、Liu et al.,Proc Natl.Acad.Sci.(1996),93,8618−8623))。イムノコンジュゲートは、非コンジュゲート薬物の全身性投与が正常細胞および/または正常組織に許容できないレベルの毒性をもたらし得る場合に、腫瘍への薬物成分の標的送達と、そこでの細胞内蓄積を可能にする。抗体−毒素コンジュゲートに使用される毒素には、ジフテリア毒素などの細菌毒素、リシン(ricin)などの植物毒素、ゲルダナマイシンなどの小分子毒素が含まれる。毒素は、その細胞傷害効果を、チューブリン結合、DNA結合、またはトポイソメラーゼ阻害を含む機序によって発揮し得る。
参照ポリヌクレオチド配列または参照ポリペプチド配列に関して、それぞれ「パーセント(%)配列同一性」は、最大のパーセント配列同一性が得られるように配列をアラインメントし、必要であればギャップを導入した後に、それぞれ参照ポリヌクレオチド配列または参照ポリペプチド配列中のそれぞれ核酸残基またはアミノ酸残基と同一である候補配列中のそれぞれ核酸残基またはアミノ酸残基のパーセンテージと定義される。保存的置換は、配列同一性の一部とはみなされない。好ましいのは、ギャップなしのアラインメントである。パーセントアミノ酸配列同一性を決定するためのアラインメントは、当技術分野における技能の範囲に含まれる様々な方法で、例えばBLAST、BLAST−2、ALIGNまたはMegalign(DNASTAR)ソフトウェアなどの公的に利用可能なコンピュータソフトウェアを使用して、達成することができる。当業者であれば、比較される配列の全長にわたって最大のアラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含めて、配列をアラインメントするための適切なパラメータを決定することができる。
「成熟抗体」または「成熟抗原結合断片」、例えば成熟Fab変異体という用語は、TWEAKRの細胞外ドメインなどの所定の抗原に対して、より強力な結合−すなわち、増加した親和性での結合−を示す抗体または抗体断片の誘導体を含む。成熟は、抗体または抗体断片の6個のCDR内にある少数の変異であってこの親和性増加につながるものを同定するプロセスである。成熟プロセスは、抗体中に変異を導入するための分子生物学的方法と、改善された結合体を同定するためのスクリーニングとの組み合わせである。
本明細書では、アミノ酸は、一般的に公知の3文字記号によって、またはIUPAC−IUB Biochemical Nomenclature Commissionが推奨する1文字記号によって参照され得る。同様に、ヌクレオチドは、一般的に認められている1文字コードによって参照され得る。
「アゴニスト」抗体または「アゴニスト活性」を有する抗体は、その標的に結合して各標的の活性化を誘導する(例えば、各標的によって媒介されるシグナル伝達経路または生物学的効果の活性化をもたらす)ものである。
本発明の抗体
本発明は、TWEAKR(配列番号:169(タンパク質);配列番号:170(DNA))の強力な活性化をもたらして、TWEAKRの過剰発現を示す様々な癌細胞において、アポトーシスの強力な誘導をもたらす抗体またはその抗原結合抗体断片またはその変異体に関する。
本発明は、TWEAKR(配列番号:169(タンパク質);配列番号:170(DNA))の強力な活性化をもたらして、TWEAKRの過剰発現を示す様々な癌細胞において、アポトーシスの強力な誘導をもたらす抗体またはその抗原結合抗体断片またはその変異体に関する。
アポトーシスの誘導および増殖の阻害に関する、以前に記載されている抗TWEAKR抗体(例えば、PDL−192)のTWEAKRアゴニスト活性は限定的であり、内因性リガンドTWEAKの有効性に及ばない。これらの抗体は、内因性リガンドTWEAKと比較して同程度の親和性でTWEAKRに結合し(Michaelson JS et al,MAbs.2011 Jul−Aug;3(4):362−75;Culp PA et al,Clin Cancer Res.2010 Jan 15;16(2):497−508)、また、高い結合親和性を有する抗体が、より有効なシグナル伝達活性を必ずしも示すわけではないので(Culp PA,et al,Clin Cancer Res.2010 Jan 15;16(2):497−508)、アゴニスト活性のこの欠如は、低い親和性によるものではない。加えて、以前に記載されている抗体の抗腫瘍活性は、Fcエフェクター機能に依存することが示されており、ADCCは、マウスモデルにおいてインビボ有効性に重要な役割を果たすことが示されている。
本発明は、重要な役割を果たすADCCを伴わずにインビボ抗腫瘍効果を達成することができるような、アポトーシスの誘導および増殖の阻害に関する強力なアゴニスト活性を有する抗体、その抗原結合断片またはその変異体を提供する。当業者であれば、抗原結合およびアゴニスト活性を維持しながら、ADCCを抑制するためにFcガンマ受容体活性化を欠く抗体変異体を提供するための方法を認識している。このような方法には、ヒトIgG2およびヒトIgG4抗体アイソタイプの使用、アグリコシル化抗体の使用、またはFcガンマ受容体活性化を抑制する突然変異を有する抗体の使用が含まれるが、これらに限定されない。
本発明の一実施形態は、1つ以上のTWEAKR発現細胞株において、カスパーゼ3/7の強力な誘導を有する抗体またはその抗原結合抗体断片またはその変異体を提供することである。好ましい実施形態では、1つ以上のTWEAKR発現細胞株は、WiDr、A253、NCI−H322、HT−29および786−O細胞からなる群に含まれる。「カスパーゼ3/7の誘導」は、当技術分野で公知の一般的な方法(本明細書に記載されるものを含む)によって測定され得る。一実施形態では、本発明の「カスパーゼ3/7の誘導」は、カスパーゼ3/7溶液(Promega,#G8093)による活性の決定を使用し、VICTOR V(Perkin Elmer)で発光の読むことによって測定される。インキュベーション時間の終了時に、カスパーゼ3/7活性を決定し、カスパーゼ3/7の誘導倍率を未処理細胞と比較して計算した。誘導倍率が1.2超、好ましくは1.5超、より好ましくは1.8超、より好ましくは2.1超、より好ましくは2.5超である場合に、抗体は、カスパーゼ3/7の「強力な誘導」を有すると言われる。以前に記載されているアゴニスト抗体[例えば、PDL−192(TPP−1104)、P4A8(TPP−1324)、136.1(TPP−2194)]と比較して、およびまた300ng/mlの組換えヒトTWEAKと比較して、HT−29細胞においてカスパーゼ3/7の強力な誘導をもたらす抗TWEAKR抗体が提供される。癌細胞におけるこの強力なカスパーゼ3/7誘導効果は、WiDr、A253、NCI−H322および786−O細胞においても見られ、ほとんどの実験において、試験した本発明の抗体は、参照抗体[PDL−192(TPP−1104)、P4A8(TPP−1324)]および300ng/mlのTWEAKと比較して高倍率の変化を誘導した。いくつかの本発明の抗体は、ごく普通の親和性(>10nM)(これは、内因性リガンドTWEAKの親和性と比較して明確に低く、他の公知のアゴニスト抗体と比較して低い)でTWEAKRに結合する。この特性は、例えば、腫瘍浸潤の潜在的改善のようなさらなる潜在的な利点を提供する。
これらの目的のために、本発明の一実施形態は、新規エピトープにおいてTWEAKRに特異的に結合する抗体またはその抗原結合抗体断片であって、TWEAKR(配列番号:169;および図1を参照のこと)の47位のアスパラギン酸(D47)に対する選択的結合を特徴とする抗体またはその抗原結合抗体断片を提供することである。抗体相互作用に関して、特定のTWEAKRアミノ酸に対する同定された依存性は、これらの抗体について決定されたアゴニスト活性と相関する。ネイティブリガンドのTWEAKは、TWEAKRの効率的な活性化を示し、TWEAKRのシステインリッチドメインのロイシン46依存的に結合する(Pellegrini et al,FEBS 280:1818−1829)。P4A8は、非常に低いアゴニスト活性を示し、TWEAKRのシステインリッチドメインの外側のドメインと少なくとも部分的に相互作用する。PDL−192は、わずかなアゴニスト活性を示し、TWEAKリガンド部位とは反対側に、R56依存的にシステインリッチドメインに結合する。本発明の抗体(例示的には、TPP−2090)は、D47依存的に結合し、TWEAKは、L46依存的に結合し、類似するが区別可能な結合部位に結合する(図7)。したがって、強力なアゴニスト活性を示す本発明の抗体は、抗体の非常に強力なアゴニスト活性に関係する新規エピトープに(D47依存的に)結合する。
TWEAKR(配列番号:169)の47位のアミノ酸(D47)は、本発明の抗体の結合に重要であるとみなされ、これは、実施例2および図6に記載されているように、この残基をアラニンに変化させることによって、前記抗体がそのELISAシグナルの20%超、あるいは30%超、あるいは40%超、あるいは50%超、あるいは60%超、あるいは70%超、あるいは80%超、あるいは90%超、あるいは100%を喪失すると、前記抗体は、TWEAKR(配列番号:169)の47位のD(D47)に特異的に結合することを意味する。あるいは、抗体が、TPP−2203と比較してTPP−2614に対するそのELISAシグナルの20%超、あるいは30%超、あるいは40%超、あるいは50%超、あるいは60%超、あるいは70%超、あるいは80%超、あるいは90%超、あるいは100%を喪失すると、抗体は、TWEAKR(配列番号:169)の47位のD(D47)に特異的に結合する。好ましくは、抗体が、TPP−2203と比較してTPP−2614に対するそのELISAシグナルの80%超を喪失すると、抗体は、TWEAKR(配列番号:169)の47位のD(D47)に特異的に結合する。
本発明の好ましい実施形態は、TWEAKR(配列番号:169)のアスパラギン酸47(D47)に特異的に結合する抗TWEAKR抗体またはその抗原結合断片である。
本発明のさらに好ましい実施形態は、TWEAKR(配列番号:169)のアスパラギン酸47(D47)に特異的に結合するアゴニスト抗TWEAKR抗体またはその抗原結合断片である。
本発明のさらに好ましい実施形態は、減少したADCC活性を有するか、またはADCC活性を欠くアゴニスト抗TWEAKR抗体またはその抗原結合断片であって、TWEAKR(配列番号:169)のアスパラギン酸47(D47)に特異的に結合するアゴニスト抗TWEAKR抗体またはその抗原結合断片である。本発明のさらに好ましい実施形態は、TWEAKR(配列番号:169)のアスパラギン酸47(D47)に特異的に結合するアゴニスト抗TWEAKR抗体またはその抗原結合断片であって、抗TWEAKR抗体のアゴニスト活性が、カスパーゼ3/7の誘導、TWEAKR発現細胞株の増殖の阻害、およびサイトカイン分泌の誘導からなるアゴニスト活性の群より選択されるアゴニスト抗TWEAKR抗体またはその抗原結合断片である。
本発明のさらに好ましい実施形態は、TWEAKR(配列番号:169)のアスパラギン酸47(D47)に特異的に結合するアゴニスト抗TWEAKR抗体またはその抗原結合断片であって、抗TWEAKR抗体のアゴニスト活性が、カスパーゼ3/7の誘導であるアゴニスト抗TWEAKR抗体またはその抗原結合断片である。
本発明のさらに好ましい実施形態は、TWEAKR(配列番号:169)のアスパラギン酸47(D47)に特異的に結合するアゴニスト抗TWEAKR抗体またはその抗原結合断片であって、抗TWEAKR抗体のアゴニスト活性が、TWEAKR発現癌細胞株におけるカスパーゼ3/7の誘導であるアゴニスト抗TWEAKR抗体またはその抗原結合断片である。
本発明のさらに好ましい実施形態は、TWEAKR(配列番号:169)のアスパラギン酸47(D47)に特異的に結合するアゴニスト抗TWEAKR抗体またはその抗原結合断片であって、抗TWEAKR抗体のアゴニスト活性が、WiDr、A253、NCI−H322、HT−29および786−O細胞からなる群に含まれるTWEAKR発現癌細胞株におけるカスパーゼ3/7の誘導であるアゴニスト抗TWEAKR抗体またはその抗原結合断片である。
本発明のさらにより好ましい実施形態は、TWEAKR(配列番号:169)のアスパラギン酸47(D47)に特異的に結合するアゴニスト抗TWEAKR抗体またはその抗原結合断片であって、抗TWEAKR抗体のアゴニスト活性が、HT−29および/または786−O細胞株における、組換えヒトTWEAKによる誘導と比較して高いカスパーゼ3/7の誘導であるアゴニスト抗TWEAKR抗体またはその抗原結合断片である。さらに好ましい実施形態では、使用される抗TWEAKR抗体の濃度は100μg/mlであり、組換えヒトTWEAKの濃度は300ng/mlである。
本発明の別の実施形態は、様々な種のTWEAKRのシステインリッチドメイン(配列番号:169のaa34〜68)(図1)に特異的に結合する抗体またはその抗原結合抗体断片またはその変異体を提供することである。
本発明の別の好ましい実施形態は、TWEAKRのシステインリッチドメイン(配列番号:169のaa34〜68)に特異的に結合する抗体またはその抗原結合抗体断片またはその変異体であって、TWEAKRの47位のD(D47)に特異的に結合する抗体またはその抗原結合抗体断片またはその変異体を提供することである。
本発明の別の好ましい実施形態は、ヒト、マウス、イヌ、ブタ、ラットおよびカニクイザルからなるTWEAKR種の群に含まれる少なくとも2つの種のTWEAKRのシステインリッチドメイン(配列番号:169のaa34〜68)に特異的に結合する抗体またはその抗原結合抗体断片またはその変異体であって、TWEAKRの47位のD(D47)に特異的に結合する抗体またはその抗原結合抗体断片またはその変異体を提供することである。好ましい実施形態では、2つの種は、ヒトおよびマウスである。
本発明の別の実施形態は、様々なTWEAKR発現細胞株の増殖を阻害する抗体またはその抗原結合抗体断片またはその変異体を提供することである。カスパーゼ3/7の強力な誘導と一致して、様々な癌細胞株の増殖の有効な阻害が観察される。本発明の抗体は、様々な癌細胞の増殖の阻害において、他の公知の抗体(PDL−192、P4A8)と比較して有効である。ほとんどの実験において、本発明の抗体は、TWEAKリガンドと比較して高いかまたは同じ有効性を示す。したがって、前記抗体は、限定されないが、786−O、LOVO、NCI−H1975、SW480、WiDr、HT−29、A253、SK−OV3を含む広範な癌細胞株パネルにおけるアポトーシスおよび増殖阻害の誘導効果の点でユニークである。
本発明のさらに好ましい実施形態は、TWEAKR(配列番号:169)のアスパラギン酸47(D47)に特異的に結合するアゴニスト抗TWEAKR抗体またはその抗原結合断片であって、抗TWEAKR抗体のアゴニスト活性が、TWEAKR発現細胞株の増殖の阻害であるアゴニスト抗TWEAKR抗体またはその抗原結合断片である。本発明の好ましい実施形態では、TWEAKR発現細胞株は、786−O、LOVO、NCI−H1975、SW480、WiDr、HT−29、A253およびSK−OV3からなる群に含まれる。
本発明のさらにより好ましい実施形態は、TWEAKR(配列番号:169)のアスパラギン酸47(D47)に特異的に結合するアゴニスト抗TWEAKR抗体またはその抗原結合断片であって、抗TWEAKR抗体のアゴニスト活性が、組換えヒトTWEAKによる阻害と比較して強力な786−Oおよび/またはWiDr細胞株の増殖阻害であるアゴニスト抗TWEAKR抗体またはその抗原結合断片である。さらに好ましい実施形態では、使用される抗TWEAKR抗体の濃度は100μg/mlであり、組換えヒトTWEAKの濃度は300ng/mlである。
本発明の別の実施形態は、限定されないが、A375、WiDr細胞および異種移植片を含む様々な癌細胞からのサイトカイン分泌を強力に誘導する抗体またはその抗原結合抗体断片またはその変異体を提供することである。誘導されるサイトカインには、IL−8、IL−15、IP−10、IL−1RAおよびMCP−1が含まれるが、これらに限定されない。誘導される好ましいサイトカインは、IL−8である。本発明の抗体は、他の公知の抗体(PDL−192(TPP−1104)、P4A8(TPP−1324)、136.1(TPP−2194))と比較して高いA375細胞におけるIL−8誘導効果を示す。
本発明の好ましい実施形態は、TWEAKR(配列番号:169)のアスパラギン酸47(D47)に特異的に結合するアゴニスト抗TWEAKR抗体またはその抗原結合断片であって、抗TWEAKR抗体のアゴニスト活性が、サイトカイン分泌の誘導であるアゴニスト抗TWEAKR抗体またはその抗原結合断片である。
本発明の好ましい実施形態は、TWEAKR(配列番号:169)のアスパラギン酸47(D47)に特異的に結合するアゴニスト抗TWEAKR抗体またはその抗原結合断片であって、抗TWEAKR抗体のアゴニスト活性が、TWEAKR発現癌細胞株におけるサイトカイン分泌の誘導であるアゴニスト抗TWEAKR抗体またはその抗原結合断片である。より好ましい実施形態では、TWEAKR発現癌細胞株は、A375またはWiDr細胞株である。
本発明のさらに好ましい実施形態は、TWEAKR(配列番号:169)のアスパラギン酸47(D47)に特異的に結合するアゴニスト抗TWEAKR抗体またはその抗原結合断片であって、抗TWEAKR抗体のアゴニスト活性が、サイトカイン分泌の誘導であり、サイトカインが、IL−8、IL−15、IP−10、IL−1RAおよびMCP−1からなるサイトカインの群に含まれるアゴニスト抗TWEAKR抗体またはその抗原結合断片である。
本発明のさらに好ましい実施形態は、TWEAKR(配列番号:169)のアスパラギン酸47(D47)に特異的に結合するアゴニスト抗TWEAKR抗体またはその抗原結合断片であって、抗TWEAKR抗体のアゴニスト活性が、TWEAKR発現癌細胞株分泌におけるサイトカイン分泌の誘導であり、サイトカインが、IL−8、IL−15、IP−10、IL−1RAおよびMCP−1からなるサイトカインの群に含まれるアゴニスト抗TWEAKR抗体またはその抗原結合断片である。
本発明のさらに好ましい実施形態は、TWEAKR(配列番号:169)のアスパラギン酸47(D47)に特異的に結合するアゴニスト抗TWEAKR抗体またはその抗原結合断片であって、抗TWEAKR抗体のアゴニスト活性が、TWEAKR発現癌細胞株分泌におけるサイトカイン分泌の誘導であり、サイトカインが、IL−8、IL−15、IP−10、IL−1RAおよびMCP−1からなるサイトカインの群に含まれ、TWEAKR発現癌細胞株がA375またはWiDr細胞株であるアゴニスト抗TWEAKR抗体またはその抗原結合断片である。
さらに好ましい実施形態では、サイトカインはIL−8であり、さらにより好ましい実施形態では、IL−8はヒトIL−8である。
本発明の好ましい実施形態は、TWEAKR(配列番号:169)のアスパラギン酸47(D47)に特異的に結合するアゴニスト抗TWEAKR抗体またはその抗原結合断片であって、抗TWEAKR抗体のアゴニスト活性が、マウス腫瘍異種移植モデルにおけるサイトカイン分泌の誘導であるアゴニスト抗TWEAKR抗体またはその抗原結合断片である。さらに好ましい実施形態では、分泌されるサイトカインは、腫瘍異種移植片由来のヒトサイトカインである。
本発明のさらに好ましい実施形態は、TWEAKR(配列番号:169)のアスパラギン酸47(D47)に特異的に結合するアゴニスト抗TWEAKR抗体またはその抗原結合断片であって、抗TWEAKR抗体のアゴニスト活性が、マウス腫瘍異種移植モデルにおけるヒトIL−8分泌の誘導であるアゴニスト抗TWEAKR抗体またはその抗原結合断片である。
さらに好ましい実施形態では、マウス腫瘍異種移植モデルは、A375またはWiDrマウス異種移植モデルである。
さらに好ましい実施形態では、サイトカイン分泌の誘導は、3mg/kg以上または10mg/kg以上の本発明の抗TWEAKR抗体の注射後に観察される。
本発明のさらに好ましい実施形態は、TWEAKR(配列番号:169)のアスパラギン酸47(D47)に特異的に結合するアゴニスト抗TWEAKR抗体またはその抗原結合断片であって、抗TWEAKR抗体のアゴニスト活性が、3mg/kgの前記抗体の注射後のマウスWiDr腫瘍異種移植モデルにおけるヒトIL−8分泌の誘導であり、マウスIL−8類似体KCの誘導が検出されないアゴニスト抗TWEAKR抗体またはその抗原結合断片である。
さらに好ましい実施形態では、サイトカイン分泌の誘導は、腫瘍担持マウスの血漿中で観察される。
本発明の別の実施形態は、限定されないが、表21に示されているものを含む広範囲の様々なTWEAKR発現細胞株に結合する抗体またはその抗原結合抗体断片またはその変異体を提供することである。表21の例は、多くの腫瘍起源由来のヒトおよびマウス細胞株を含む(例えば、NSCLC、CRC、HNSCC、RCC、膵臓CA、OvCa、乳房CA、黒色腫、胃CA、食道CA、膀胱CA、HCC、前立腺CA、神経芽細胞腫)。
本発明の別の実施形態は、ヒトへの投与に安全な抗体またはその抗原結合抗体断片またはその変異体を提供することである。
本発明の別の実施形態は、ヒトTWEAKRに結合する抗体またはその抗原結合抗体断片またはその変異体であって、同様の親和性で、限定されないが、マウス、ラット、ブタ、イヌ、カニクイザルを含む別の種のTWEAKRと交差反応性である抗体またはその抗原結合抗体断片またはその変異体を提供することである。好ましくは、前記他の種は、例えばマウスまたはラットなどの齧歯類である。最も好ましくは、前記抗体またはその抗原結合抗体断片またはその変異体は、ヒトTWEAKRに結合し、マウスTWEAKRと交差反応性である。
本発明の別の実施形態は、TWEAKR発現が正常組織と比較して上昇しているか、またはTWEAKRが細胞表面から脱落して血清中で検出可能となっている悪性症状または形成異常症状の診断ツールを構成する抗体を提供することである。検出可能なマーカーにコンジュゲートした抗TWEAKR抗体が提供される。好ましいマーカーは、放射性標識、酵素、発色団または蛍光である。
本明細書を通じて、表31に示されている以下の本発明の好ましい抗体について言及する:「TPP−2090」、「TPP−2149」、「TPP−2093」、「TPP−2148」、「TPP−2084」、「TPP−2077」、「TPP−1538」、「TPP−883」、「TPP−1854」、「TPP−1853」、「TPP−1857」、「TPP−1858」および「TPP−2658」。
TPP−2090は、配列番号:2に対応する重鎖領域、および配列番号:1に対応する軽鎖領域を含む抗体を表す。
TPP−2149は、配列番号:12に対応する重鎖領域、および配列番号:11に対応する軽鎖領域を含む抗体を表す。
TPP−2093は、配列番号:22に対応する重鎖領域、および配列番号:21に対応する軽鎖領域を含む抗体を表す。
TPP−2148は、配列番号:32に対応する重鎖領域、および配列番号:31に対応する軽鎖領域を含む抗体を表す。
TPP−2084は、配列番号:42に対応する重鎖領域、および配列番号:41に対応する軽鎖領域を含む抗体を表す。
TPP−2077は、配列番号:52に対応する重鎖領域、および配列番号:51に対応する軽鎖領域を含む抗体を表す。
TPP−1538は、配列番号:62に対応する重鎖領域、および配列番号:61に対応する軽鎖領域を含む抗体を表す。
TPP−883は、配列番号:72に対応する重鎖領域、および配列番号:71に対応する軽鎖領域を含む抗体を表す。
TPP−1854は、配列番号:82に対応する重鎖領域、および配列番号:81に対応する軽鎖領域を含む抗体を表す。
TPP−1853は、配列番号:92に対応する重鎖領域、および配列番号:91に対応する軽鎖領域を含む抗体を表す。
TPP−1857は、配列番号:102に対応する重鎖領域、および配列番号:101に対応する軽鎖領域を含む抗体を表す。
TPP−1858は、配列番号:112に対応する重鎖領域、および配列番号:111に対応する軽鎖領域を含む抗体を表す。
TPP−2658は、配列番号:213に対応する重鎖領域、および配列番号:1に対応する軽鎖領域を含む抗体を表す。
TPP−2090は、配列番号:10に対応する可変重鎖領域、および配列番号:9に対応する可変軽鎖領域を含む抗体を表す。
TPP−2149は、配列番号:20に対応する可変重鎖領域、および配列番号:19に対応する可変軽鎖領域を含む抗体を表す。
TPP−2093は、配列番号:30に対応する可変重鎖領域、および配列番号:29に対応する可変軽鎖領域を含む抗体を表す。
TPP−2148は、配列番号:40に対応する可変重鎖領域、および配列番号:39に対応する可変軽鎖領域を含む抗体を表す。
TPP−2084は、配列番号:50に対応する可変重鎖領域、および配列番号:49に対応する可変軽鎖領域を含む抗体を表す。
TPP−2077は、配列番号:60に対応する可変重鎖領域、および配列番号:59に対応する可変軽鎖領域を含む抗体を表す。
TPP−1538は、配列番号:70に対応する可変重鎖領域、および配列番号:69に対応する可変軽鎖領域を含む抗体を表す。
TPP−883は、配列番号:80に対応する可変重鎖領域、および配列番号:79に対応する可変軽鎖領域を含む抗体を表す。
TPP−1854は、配列番号:90に対応する可変重鎖領域、および配列番号:89に対応する可変軽鎖領域を含む抗体を表す。
TPP−1853は、配列番号:100に対応する可変重鎖領域、および配列番号:99に対応する可変軽鎖領域を含む抗体を表す。
TPP−1857は、配列番号:110に対応する可変重鎖領域、および配列番号:109に対応する可変軽鎖領域を含む抗体を表す。
TPP−1858は、配列番号:120に対応する可変重鎖領域、および配列番号:119に対応する可変軽鎖領域を含む抗体を表す。
さらに好ましい実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、抗体「TPP−2090」、「TPP−2149」、「TPP−2093」、「TPP−2148」、「TPP−2084」、「TPP−2077」、「TPP−1538」、「TPP−883」、「TPP−1854」、「TPP−1853」、「TPP−1857」もしくは「TPP−1858」の少なくとも1つの(好ましくは、対応する)CDR配列と少なくとも50%、55%、60%70%、80%、90もしくは95%同一の、またはそれぞれ「TPP−2090」、「TPP−2149」、「TPP−2093」、「TPP−2148」、「TPP−2084」、「TPP−2077」、「TPP−1538」、「TPP−883」、「TPP−1854」、「TPP−1853」、「TPP−1857」もしくは「TPP−1858」のVHもしくはVL配列と少なくとも50%、60%、70%、80%、90%、92%もしくは95%同一の重鎖または軽鎖CDR配列を含む。
さらに好ましい実施形態では、本発明の抗体またはその抗原結合断片は、表31に示されている少なくとも1つのCDR配列または少なくとも1つの可変重鎖もしくは可変軽鎖配列を含む。
より好ましい実施形態では、本発明の抗体またはその抗原結合断片は、配列番号:6(H−CDR1)、配列番号:7(H−CDR2)および配列番号:8(H−CDR3)を含む重鎖抗原結合領域を含み、配列番号:3(L−CDR1)、配列番号:4(L−CDR2)および配列番号:5(L−CDR3)を含む軽鎖抗原結合領域を含む。
より好ましい実施形態では、本発明の抗体またはその抗原結合断片は、配列番号:16(H−CDR1)、配列番号:17(H−CDR2)および配列番号:18(H−CDR3)を含む重鎖抗原結合領域を含み、配列番号:13(L−CDR1)、配列番号:14(L−CDR2)および配列番号:15(L−CDR3)を含む軽鎖抗原結合領域を含む。
より好ましい実施形態では、本発明の抗体またはその抗原結合断片は、配列番号:26(H−CDR1)、配列番号:27(H−CDR2)および配列番号:28(H−CDR3)を含む重鎖抗原結合領域を含み、配列番号:23(L−CDR1)、配列番号:24(L−CDR2)および配列番号:25(L−CDR3)を含む軽鎖抗原結合領域を含む。
より好ましい実施形態では、本発明の抗体またはその抗原結合断片は、配列番号:36(H−CDR1)、配列番号:37(H−CDR2)および配列番号:38(H−CDR3)を含む重鎖抗原結合領域を含み、配列番号:33(L−CDR1)、配列番号:34(L−CDR2)および配列番号:35(L−CDR3)を含む軽鎖抗原結合領域を含む。
より好ましい実施形態では、本発明の抗体またはその抗原結合断片は、配列番号:46(H−CDR1)、配列番号:47(H−CDR2)および配列番号:48(H−CDR3)を含む重鎖抗原結合領域を含み、配列番号:43(L−CDR1)、配列番号:44(L−CDR2)および配列番号:45(L−CDR3)を含む軽鎖抗原結合領域を含む。
より好ましい実施形態では、本発明の抗体またはその抗原結合断片は、配列番号:56(H−CDR1)、配列番号:57(H−CDR2)および配列番号:58(H−CDR3)を含む重鎖抗原結合領域を含み、配列番号:53(L−CDR1)、配列番号:54(L−CDR2)および配列番号:55(L−CDR3)を含む軽鎖抗原結合領域を含む。
より好ましい実施形態では、本発明の抗体またはその抗原結合断片は、配列番号:66(H−CDR1)、配列番号:67(H−CDR2)および配列番号:68(H−CDR3)を含む重鎖抗原結合領域を含み、配列番号:63(L−CDR1)、配列番号:64(L−CDR2)および配列番号:65(L−CDR3)を含む軽鎖抗原結合領域を含む。
より好ましい実施形態では、本発明の抗体またはその抗原結合断片は、配列番号:76(H−CDR1)、配列番号:77(H−CDR2)および配列番号:78(H−CDR3)を含む重鎖抗原結合領域を含み、配列番号:73(L−CDR1)、配列番号:74(L−CDR2)および配列番号:75(L−CDR3)を含む軽鎖抗原結合領域を含む。
より好ましい実施形態では、本発明の抗体またはその抗原結合断片は、配列番号:86(H−CDR1)、配列番号:87(H−CDR2)および配列番号:88(H−CDR3)を含む重鎖抗原結合領域を含み、配列番号:83(L−CDR1)、配列番号:84(L−CDR2)および配列番号:85(L−CDR3)を含む軽鎖抗原結合領域を含む。
より好ましい実施形態では、本発明の抗体またはその抗原結合断片は、配列番号:96(H−CDR1)、配列番号:97(H−CDR2)および配列番号:98(H−CDR3)を含む重鎖抗原結合領域を含み、配列番号:93(L−CDR1)、配列番号:94(L−CDR2)および配列番号:95(L−CDR3)を含む軽鎖抗原結合領域を含む。
より好ましい実施形態では、本発明の抗体またはその抗原結合断片は、配列番号:106(H−CDR1)、配列番号:107(H−CDR2)および配列番号:108(H−CDR3)を含む重鎖抗原結合領域を含み、配列番号:103(L−CDR1)、配列番号:104(L−CDR2)および配列番号:105(L−CDR3)を含む軽鎖抗原結合領域を含む。
より好ましい実施形態では、本発明の抗体またはその抗原結合断片は、配列番号:116(H−CDR1)、配列番号:117(H−CDR2)および配列番号:118(H−CDR3)を含む重鎖抗原結合領域を含み、配列番号:113(L−CDR1)、配列番号:114(L−CDR2)および配列番号:115(L−CDR3)を含む軽鎖抗原結合領域を含む。
本発明の抗体のCDRの配列アラインメントは、コンセンサス配列を明らかにする(図24を参照のこと)。より好ましい実施形態では、本発明の抗体またはその抗原結合断片は、
式PYPMX(配列番号:171)(式中、Xは、IまたはMである)を含むアミノ酸配列によってコードされる重鎖CDR1;
式YISPSGGXTHYADSVKG(配列番号:172)(式中、Xは、SまたはKである)を含むアミノ酸配列によってコードされる重鎖CDR2;および
式GGDTYFDYFDY(配列番号:173)を含むアミノ酸配列によってコードされる重鎖CDR3
を含む可変重鎖と、
式RASQSISXYLN(配列番号:174)(式中、Xは、GまたはSである)を含むアミノ酸配列によってコードされる軽鎖CDR1;
式XASSLQS(配列番号:175)(式中、Xは、Q、AまたはNである)を含むアミノ酸配列によってコードされる軽鎖CDR2;および
式QQSYXXPXIT(配列番号:176)(式中、5位のXは、TまたはSであり、6位のXは、TまたはSであり、8位のXは、GまたはFである)を含むアミノ酸配列によってコードされる軽鎖CDR3
を含む可変重鎖とを含む。
式PYPMX(配列番号:171)(式中、Xは、IまたはMである)を含むアミノ酸配列によってコードされる重鎖CDR1;
式YISPSGGXTHYADSVKG(配列番号:172)(式中、Xは、SまたはKである)を含むアミノ酸配列によってコードされる重鎖CDR2;および
式GGDTYFDYFDY(配列番号:173)を含むアミノ酸配列によってコードされる重鎖CDR3
を含む可変重鎖と、
式RASQSISXYLN(配列番号:174)(式中、Xは、GまたはSである)を含むアミノ酸配列によってコードされる軽鎖CDR1;
式XASSLQS(配列番号:175)(式中、Xは、Q、AまたはNである)を含むアミノ酸配列によってコードされる軽鎖CDR2;および
式QQSYXXPXIT(配列番号:176)(式中、5位のXは、TまたはSであり、6位のXは、TまたはSであり、8位のXは、GまたはFである)を含むアミノ酸配列によってコードされる軽鎖CDR3
を含む可変重鎖とを含む。
抗体は、相補性決定領域(CDR)内だけではなくフレームワーク(FR)の配列も異なる。これらの配列差異は、異なるV遺伝子でコードされる。ヒト抗体生殖系列レパートリーは、完全に配列決定されている。VH1、VH2、VH3、VH4、VH5およびVH6の配列相同性にしたがって、6つのサブファミリーに分類され得る約50個の機能VH生殖系列遺伝子がある(Tomlinson et al.,1992,J.Mol.Biol.227,776−798;Matsuda&Honjo,1996,Advan.Immunol.62,1−29)。7つのサブファミリーを含む約40個の機能VLκ遺伝子が公知である(Cox et al.,1994,Eur.J.Immunol.24,827−836;Barbie&Lefranc,1998,Exp.Clin.Immunogenet.15,171−183)。Vκ1、Vκ2、Vκ3、Vκ4、Vκ5、Vκ6およびVκ7。ヒトVH3サブファミリーに属する本発明の抗体の重鎖、およびヒトVκ1サブファミリーに属する本発明の抗体の軽鎖がそれぞれ本明細書に開示される。同じサブファミリーに属する抗体のフレームワーク配列は密接に関係する(例えば、ヒトVh3サブファミリーメンバーを含む抗体はすべて、同程度の安定性を共有する)ことが公知である(Honegger et al,2009,Protein Eng Des Sel.22(3):121−134)。対応する元の抗体の特別な特徴を維持しながら、抗体由来のCDRを異なるフレームワークに移植し得ることが当技術分野で周知である。異なるサブファミリーに属する同じ種のフレームワークだけではなく、異なる種に属するフレームワークへのCDRの移植も成功している。さらなる実施形態では、本発明の抗体または抗原結合断片は、表31に示されている本発明の抗体の少なくとも1つのCDR配列と、ヒト可変鎖フレームワーク配列とを含む。
好ましい実施形態では、本発明の抗体または抗原結合断片は、表31に示されている、可変軽鎖のL−CDR1、L−CDR2およびL−CDR3配列を含む可変軽鎖または軽鎖抗原結合領域と、本発明の可変重鎖抗体のH−CDR1、H−CDR2およびH−CDR3配列を含む可変重鎖または重鎖抗原結合領域と、ヒト可変軽鎖およびヒト可変重鎖フレームワーク配列とを含む。
より好ましい実施形態では、本発明の抗体または抗原結合断片は、表31に示されている、可変軽鎖のL−CDR1、L−CDR2およびL−CDR3配列を含む可変軽鎖または軽鎖抗原結合領域と、本発明の可変重鎖抗体のH−CDR1、H−CDR2およびH−CDR3配列を含む可変重鎖または重鎖抗原結合領域と、可変重鎖のヒトVH3サブファミリーフレームワーク配列と、可変軽鎖のヒトVκ1サブファミリーフレームワーク配列とを含む。より好ましい実施形態では、可変重鎖のヒトVH3サブファミリーフレームワーク配列は、VH3−07、VH3−09、VH3−11、VH3−13、VH3−15、VH3−20、VH3−21、VH3−23、VH3−30、VH3−30.3、VH3−30.5、VH3−33、VH3−43、VH3−48、VH3−49、VH3−53、VH3−64、VH3−66、VH3−72、VH3−73、VH3−74およびVH3−dからなるVH3サブファミリーフレームワーク配列の群に含まれる。さらにより好ましい実施形態では、ヒトVH3フレームワーク配列は、ヒトVH3−23フレームワーク配列と比較して16個以下または15個以下のアミノ酸置換を有する。より好ましい実施形態では、可変軽鎖のヒトVκ1サブファミリーフレームワーク配列は、Vκ1−5、Vκ1−6、Vκ1−8、Vκ1D−8、Vκ1−9、Vκ1−12、Vκ1D−12、Vκ1−13、Vκ1D−13、Vκ1−16、Vκ1D−16、Vκ1−17、Vκ1D−17、Vκ1−27、Vκ1−33、Vκ1D−33、Vκ1−37、Vκ1D−37、Vκ1−39、Vκ1D−39、Vκ1D−42、Vκ1D−43からなるVκ1サブファミリーフレームワーク配列の群に含まれる。さらにより好ましい実施形態では、ヒトVκ1フレームワーク配列は、ヒトVκ1−39フレームワーク配列と比較して15個以下または13個以下のアミノ酸置換を有する。
より好ましい実施形態では、本発明の抗体または抗原結合断片は、表31に示されている、可変軽鎖のL−CDR1、L−CDR2およびL−CDR3配列を含む可変軽鎖または軽鎖抗原結合領域と、本発明の可変重鎖抗体のH−CDR1、H−CDR2およびH−CDR3配列を含む可変重鎖または重鎖抗原結合領域と、可変重鎖のヒトVH3サブファミリーフレームワーク配列と、可変軽鎖のヒトVκ1−39フレームワーク配列とを含む。
最も好ましい実施形態では、本発明の抗体または抗原結合断片は、表31に示されている、可変軽鎖のL−CDR1、L−CDR2およびL−CDR3配列を含む可変軽鎖または軽鎖抗原結合領域と、本発明の可変重鎖抗体のH−CDR1、H−CDR2およびH−CDR3配列を含む可変重鎖または重鎖抗原結合領域と、可変重鎖のヒトVH3−3フレームワーク配列と、可変軽鎖のヒトVκ1−39フレームワーク配列とを含む。
好ましい実施形態では、可変軽鎖フレームワーク配列は、ヒトVκ1サブファミリーに属し、可変重鎖フレームワーク配列は、ヒトVH3サブファミリーに属する。VH3サブファミリーまたはVκ1サブファミリー可変鎖フレームワーク配列は、各CDR配列の挿入のためのフレームワークを採用するために、各野生型(WT)フレームワーク配列と比較して配列変異を含み得る。さらなる実施形態では、WTフレームワーク配列と比較して配列変異を含むVH3サブファミリーまたはVκ1サブファミリー可変鎖フレームワーク配列は、それぞれVH3サブファミリーメンバーまたはVκ1サブファミリーメンバーである。好ましくは、このような変異体フレームワーク配列は、最大15個の配列変異、より好ましくは最大10個の配列変異、より好ましくは最大5個の配列変異、最も好ましくは最大3個の配列変異を有する。
例えば、本発明の抗体は、IgG(例えば、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)であり得、抗体断片は、Fab、Fab’、F(ab’)2またはscFvであり得る。したがって、本発明の抗体断片は、本明細書に記載される1つ以上の挙動を示す抗原結合領域であり得るか、または前記抗原結合領域を含有し得る。
好ましい実施形態では、本発明の抗体または抗原結合抗体断片は、モノクローナルである。さらに好ましい実施形態では、本発明の抗体または抗原結合抗体断片は、ヒト、ヒト化またはキメラである。
別の態様では、本発明は、TWEAKRに特異的に結合し、および/またはTWEAKRに対して高い親和性を有する抗原結合領域を有する抗体またはその抗原結合断片を提供する。親和性測定が250nM未満である場合(抗体または抗原結合断片の一価親和性)、抗体またはその抗原結合断片は、抗原に対して「高い親和性」を有すると言われる。本発明の抗体または抗原結合領域は、好ましくは、表6に示されているように、ヒトTWEAKRに対する一価親和性として決定した場合に(実施例2を参照のこと)、250nM未満、好ましくは150nM未満、より好ましくは100nM未満、より好ましくは50nM未満、より好ましくは30nM未満、より好ましくは20nM未満の親和性で、ヒトTWEAKRに結合し得る。
別の態様では、本発明は、例えばTPP−2090について図11に示されているように、TWEAKRに特異的に結合するが、TNF受容体スーパーファミリーの他のメンバー(表20を参照のこと)に結合しない抗原結合領域を有する抗体またはその抗原結合断片を提供する。
IgG1フォーマットを、蛍光活性化細胞分類(FACS)による細胞ベースの親和性評価に使用した。表21は、例えばTPP−2090およびTPP−1538について、ヒトおよびマウス起源の癌細胞株における代表的な抗TWEAKR抗体の結合の概要を提供する。本発明のFACS分析によって検出された抗体の最大細胞結合は、記載されている他の抗体と比較してわずかであるが、それにもかかわらず、これらの抗体は非常に強力なアゴニスト活性を有しており、本発明の抗体について見出された新規エピトープの重要性を示している。
本発明の別の実施形態は、TWEAKR発現細胞に対する結合後に効率的にインターナリゼーションされる抗体またはその抗原結合抗体断片またはその変異体を提供することである。本発明の抗体は、公知の医薬と共に同時投与され得、一部の場合には、前記抗体は、それ自体が改変され得る。例えば、有効性を潜在的にさらに増加させるために、抗体を細胞毒性剤、免疫毒素、担毒体または放射性同位体にコンジュゲートし得る。
TWEAKR発現腫瘍細胞内へのその半最大インターナリゼーション時間(t1/2)(顆粒数/細胞によって測定)が400分間未満、またはより好ましくは300分間未満、さらにより好ましくは200分間未満であれば、本発明の抗体または抗原結合断片は「効率的に」インターナリゼーションする。実施例7および図17に記載されているプロトコールによって決定した場合に、100分間以下の半最大インターナリゼーション時間(t1/2)を有する抗体または抗原結合断片がさらに好ましい。
インターナリゼーション可能な本発明の抗体またはその抗原結合断片は、抗体−薬剤コンジュゲート(ADC)のターゲティング部分として適切である。抗体または抗原結合断片は、化合物、好ましくは細胞毒性剤をTWEAKR発現細胞に送達するためのインビトロ方法またはインビボ方法に適切である。効率的なインターナリゼーションは、蛍光標識抗体を用いて示されている(実施例7)。抗体薬物コンジュゲートとしての効率的な使用は、サポリンコンジュゲート抗体を用いて例証されている(実施例7)。
いくつかの実施形態では、本発明の抗体またはその抗原結合断片またはこれらをコードする核酸は、単離されている。単離された生物学的成分(例えば、核酸分子またはタンパク質、例えば抗体)は、前記成分が天然に存在する生物の細胞中の他の生物学的成分(例えば、他の染色体および染色体外DNAおよびRNA、タンパク質および細胞小器官)から実質的に分離または精製されている。「単離された」核酸およびタンパク質には、例えば、Sambrook et al.,1989(Sambrook,J.,Fritsch,E.F.and Maniatis,T.(1989)Molecular Cloning:A laboratory manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,USA)およびRobert K.Scopes et al.1994(Protein Purification,−Principles and Practice,Springer Science and Business Media LLC)に記載されている標準的な精製方法によって精製された核酸およびタンパク質が含まれるが、これらに限定されない。この用語はまた、宿主細胞における組換え発現によって調製された核酸およびタンパク質、ならびに化学的に合成された核酸を包含する。
本発明の抗体は、例えば、n−CoDeR(登録商標)技術を使用して、多数の健常志願者の抗体から単離されたアミノ酸配列をベースとする組換え抗体ライブラリーに由来し得、完全ヒトCDRは、新たな抗体分子に組換えられる。あるいは、Hoet RM et al,Nat Biotechnol 2005;23(3):344−8)に記載されている完全ヒト抗体ファージディスプレイライブラリーのような抗体ライブラリーを使用して、TWEAKR特異的抗体を単離し得る。
抗体の作製
完全ヒト抗体ファージディスプレイライブラリー(Hoet RM et al,Nat Biotechnol 2005;23(3):344−8)を使用して、固定化標的としてヒトおよびマウスTWEAKRの二量体Fc融合細胞外ドメインを用いるタンパク質パンニング(Hoogenboom H.R.,Nat Biotechnol 2005;23(3):1105−16)によって、本発明のTWEAKR特異的ヒトモノクローナル抗体を単離した。
完全ヒト抗体ファージディスプレイライブラリー(Hoet RM et al,Nat Biotechnol 2005;23(3):344−8)を使用して、固定化標的としてヒトおよびマウスTWEAKRの二量体Fc融合細胞外ドメインを用いるタンパク質パンニング(Hoogenboom H.R.,Nat Biotechnol 2005;23(3):1105−16)によって、本発明のTWEAKR特異的ヒトモノクローナル抗体を単離した。
11個の異なるFabファージを同定し、対応する抗体を哺乳動物IgG発現ベクター(これは、可溶性Fabに存在しないミッシングCH2−CH3ドメインを提供する)に再クローニングした。好ましい抗体の同定後、これらを全長IgGとして発現させた。例えば、Tom et al.,Chapter 12 in Methods Express:Expression Systems edited by Micheal R.Dyson and Yves Durocher,Scion Publishing Ltd,2007に記載されている哺乳動物細胞において、これらの構築物を一過性発現させた(実施例1を参照のこと)。実施例2に記載されているように、プロテインAクロマトグラフィーによって抗体を精製し、ELISAおよびBIAcore分析において、可溶性単量体TWEAKRに対する結合親和性をさらに特性評価した。抗TWEAKR抗体の細胞結合特性を決定するために、細胞株(HT29、HS68、HS578)のパネルに対するフローサイトメトリーによって、結合を試験した。
NF−κBレポーター遺伝子アッセイを実施して、同定された11個の抗体(ヒトIgG1)すべてのアゴニスト活性を評価した。さらなる効力および親和性の成熟のために、最も強力なインビトロ有効性を有する抗体(TPP−883)を選択した(詳細については、実施例1を参照のこと)。改善されたアゴニスト活性を有する1個の単一置換変異体が検出された:CDR−H3のG102T。最終的に、最良の単一置換変異体G102Tと比較して増強した親和性に基づいて、7個の変異体を選択した。これらの対応するDNAを哺乳動物IgG発現ベクターに再クローニングし、上記NFkBレポーター細胞アッセイにおいて、機能活性について試験した。最後に、得られた配列をヒト生殖系列配列と比較し、親和性および効力に対して有意な影響を伴わない偏差を調整した。抗体ライブラリースクリーニングによって、ならびに親和性および/または効力の成熟によって、以下の抗体を得た:「TPP−2090」、「TPP−2149」、「TPP−2093」、「TPP−2148」、「TPP−2084」、「TPP−2077」、「TPP−1538」、「TPP−883」、「TPP−1854」、「TPP−1853」、「TPP−1857」および「TPP−1858」。
抗体ファージディスプレイスクリーニング(例えば、Hoet RM et al,Nat Biotechnol 2005;23(3):344−8を参照のこと)、十分に確立されたハイブリドーマ技術(例えば、Kohler and Milstein Nature.1975 Aug 7;256(5517):495−7を参照のこと)、またはマウスの免疫化(とりわけ、hMAbマウス(例えば、VelocImmune mouse(登録商標))の免疫化)のような当技術分野で公知の方法によって、本発明の抗体をさらに作製し得る。
ペプチド変異体
本発明の抗体または抗原結合断片は、本明細書で提供される特定のペプチド配列に限定されない。むしろ本発明は、これらのポリペプチドの変異体も包含する。本開示ならびに従来から利用できる技術および参考文献を参照することで、当業者であれば、本明細書に開示される抗体の機能的変異体を調製し、試験し、利用することができると共に、TWEAKRに結合する能力を有するこれらの変異体が本発明の範囲に包含されることを理解するであろう。
本発明の抗体または抗原結合断片は、本明細書で提供される特定のペプチド配列に限定されない。むしろ本発明は、これらのポリペプチドの変異体も包含する。本開示ならびに従来から利用できる技術および参考文献を参照することで、当業者であれば、本明細書に開示される抗体の機能的変異体を調製し、試験し、利用することができると共に、TWEAKRに結合する能力を有するこれらの変異体が本発明の範囲に包含されることを理解するであろう。
変異体には、例えば、本明細書に開示されるペプチド配列と比較して変化した少なくとも1つの相補性決定領域(CDR)(超可変)および/またはフレームワーク(FR)(可変)ドメイン/位置を有する抗体が含まれ得る。この概念をよりよく説明するために、抗体の構造を以下に簡単に説明する。
抗体は2本のペプチド鎖で構成され、それぞれが1つ(軽鎖)または3つ(重鎖)の定常ドメインと可変領域(VL、VH)とを含有し、このうち後者は、いずれも、4つのFR領域と、その間に配置された3つのCDRから構成されている。抗原結合部位は1つ以上のCDRによって形成されるが、FR領域はCDRに構造的フレームワークを提供しており、したがって、抗原結合において重要な役割を果たしている。CDRまたはFR領域中の1つ以上のアミノ酸残基を改変することによって、当業者であれば、突然変異された抗体配列または多様化された抗体配列をルーチンに作製させることができ、それらを、例えば新たな性質または改善された性質について、抗原に対してスクリーニングすることができる。
本発明のさらに好ましい実施形態は、VH配列およびVL配列が表31に示すように選択された抗体または抗原結合断片である。当業者であれば、表31のデータを使用して、本発明の範囲内のペプチド変異体を設計することができる。変異体は1つ以上のCDR領域内のアミノ酸を変化させることによって構築することが好ましい;変異体はまた、1つ以上の変化したフレームワーク領域を有し得る。フレームワーク領域内に改変を加えることもできる。例えば、生殖細胞系配列と比較して残基に変動があるペプチドFRドメインが変化され得る。
あるいは、当業者であれば、例えばKnappik A.,et al.,JMB 2000,296:57−86に記載されている手法などを使用して本明細書に開示されるアミノ酸配列を、その抗体と同じクラスの公知配列と比較することにより、同じ分析を行うこともできる。
さらに、ある抗体を、抗体中の1つ以上のアミノ酸残基(好ましくは1つ以上のCDR中のアミノ酸残基)を多様化することによるさらなる最適化の出発点として使用し、その結果生じた一群の抗体変異体を、改善された性質を有する変異体についてスクリーニングすることによって、変異体を取得することもできる。特に好ましいのは、VLおよび/またはVHのCDR3中の1つ以上のアミノ酸残基の多様化である。多様化は、例えば、トリヌクレオチド変異誘発(trinucleotide mutagenesis)(TRIM)技術(Virnekas B.et al.,Nucl.Acids Res.1994,22:5600.)を使用して一群のDNA分子を合成することによって行うことができる。抗体またはその抗原結合断片には、例えば、半減期の変化(例えば、Fc部分の改変またはPEGなどのさらなる分子の取り付け)、結合親和性の変化、またはADCCもしくはCDC活性の変化につながる改変などの、改変/変異を有する分子が含まれるが、これらに限定されない。
抗体の一実施形態は、変化したADCCをもたらす改変を含むTPP−2658である。TPP−2658は、(TPP−2090と比較して)Fc部分のN297において、ADCCを欠くアグリコシル化抗体変異体をもたらす突然変異を有する。
保存的アミノ酸変異体
本明細書に記載される抗体ペプチド配列の全体的分子構造を保存しているポリペプチド変異体を作製することができる。個々のアミノ酸の性質を考慮して、当業者であれば、いくつかの合理的な置換を認識するであろう。アミノ酸置換、すなわち「保存的置換」は、例えば、関与する残基の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性、および/または両親媒性の類似性に基づいて行うことができる。
本明細書に記載される抗体ペプチド配列の全体的分子構造を保存しているポリペプチド変異体を作製することができる。個々のアミノ酸の性質を考慮して、当業者であれば、いくつかの合理的な置換を認識するであろう。アミノ酸置換、すなわち「保存的置換」は、例えば、関与する残基の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性、および/または両親媒性の類似性に基づいて行うことができる。
例えば、(a)非極性(疎水性)アミノ酸には、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、およびメチオニンが含まれ;(b)極性中性アミノ酸には、グリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、およびグルタミンが含まれ;(c)陽性荷電(塩基性)アミノ酸には、アルギニン、リジン、およびヒスチジンが含まれ;(d)陰性荷電(酸性)アミノ酸には、アスパラギン酸およびグルタミン酸が含まれる。置換は、典型的には、(a)〜(d)のグループ内で行うことができる。加えて、グリシンおよびプロリンは、αヘリックスを破壊するその能力に基づいて、互いに置換することができる。同様に、アラニン、システイン、ロイシン、メチオニン、グルタミン酸、グルタミン、ヒスチジンおよびリジンなどの特定のアミノ酸は、αヘリックス中に見られることの方が多く、一方、バリン、イソロイシン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファンおよびスレオニンは、βプリーツシート中に見られることの方が多い。グリシン、セリン、アスパラギン酸、アスパラギン、およびプロリンはターン中によく見出される。いくつかの好ましい置換は、次に挙げるグループ内で行うことができる:(i)SおよびT;(ii)PおよびG;ならびに(iii)A、V、LおよびI。公知の遺伝暗号、組換え技術および合成DNA技術を考慮して、当業者であれば、保存的アミノ酸変異体をコードするDNAを容易に構築することができる。
本明細書では、2つのポリペプチド配列間の「配列同一性」は、それらの配列の間で同一であるアミノ酸のパーセンテージを示す。「配列相同性」は、同一であるか、または保存的アミノ酸置換に相当する、アミノ酸のパーセンテージを示す。
本発明のDNA分子
本発明はまた、本発明の抗体またはその抗原結合断片をコードするDNA分子に関する。発現される抗体に使用されるDNA配列は、表32に示されている。これらの配列は、哺乳動物発現に最適化される。本発明のDNA分子は本明細書に開示される配列に限定されるわけではなく、その変異体も含む。本発明に含まれるDNA変異体は、ハイブリダイゼーションにおけるその物理的性質に言及することによって表すことができる。当業者であれば、DNAを使用してその相補体を同定することができ、DNAは二本鎖であることから、核酸ハイブリダイゼーション技術を使用して、その等価物またはホモログを同定することができることを認識するであろう。ハイブリダイゼーションが100%未満の相補性で起こり得ることも認識されよう。しかしながら、条件を適切に選択すれば、ハイブリダイゼーション技術を使用して、DNA配列を特定のプローブに対するその構造的関連性に基づいて区別することができる。このような条件に関する指針については、Sambrook et al.,1989 前掲およびAusubel et al.,1995(Ausubel,F.M.,Brent,R.,Kingston,R.E.,Moore,D.D.,Sedman,J.G.,Smith,J.A.,&Struhl,K.eds.(1995).Current Protocols in Molecular Biology.New York:John Wiley and Sons)を参照のこと。
本発明はまた、本発明の抗体またはその抗原結合断片をコードするDNA分子に関する。発現される抗体に使用されるDNA配列は、表32に示されている。これらの配列は、哺乳動物発現に最適化される。本発明のDNA分子は本明細書に開示される配列に限定されるわけではなく、その変異体も含む。本発明に含まれるDNA変異体は、ハイブリダイゼーションにおけるその物理的性質に言及することによって表すことができる。当業者であれば、DNAを使用してその相補体を同定することができ、DNAは二本鎖であることから、核酸ハイブリダイゼーション技術を使用して、その等価物またはホモログを同定することができることを認識するであろう。ハイブリダイゼーションが100%未満の相補性で起こり得ることも認識されよう。しかしながら、条件を適切に選択すれば、ハイブリダイゼーション技術を使用して、DNA配列を特定のプローブに対するその構造的関連性に基づいて区別することができる。このような条件に関する指針については、Sambrook et al.,1989 前掲およびAusubel et al.,1995(Ausubel,F.M.,Brent,R.,Kingston,R.E.,Moore,D.D.,Sedman,J.G.,Smith,J.A.,&Struhl,K.eds.(1995).Current Protocols in Molecular Biology.New York:John Wiley and Sons)を参照のこと。
2つのポリヌクレオチド配列間の構造類似性は、それら2つの配列が互いにハイブリダイズするであろう条件の「ストリンジェンシー」の関数として表現することができる。本明細書で使用される「ストリンジェンシー」という用語は、その条件がハイブリダイゼーションを嫌う度合を指す。ストリンジェントな条件はハイブリダイゼーションに好ましくないものであり、このような条件下では、構造的に最も近縁の分子だけが互いにハイブリダイズするであろう。逆に、非ストリンジェントな条件は、より低度の構造的関連性を示す分子のハイブリダイゼーションにとって有利になる。したがって、ハイブリダイゼーションストリンジェンシーは、2つの核酸配列の構造的関係と直接的に相関する。次の関係は、ハイブリダイゼーションと関連性とを相関させるのに有用である(式中、Tmは核酸二重鎖の融解温度である):
a.Tm=69.3+0.41(%G+C)℃
b.ミスマッチ塩基対の数が1%増加するごとに、二重鎖DNAのTmは1℃低下する。
a.Tm=69.3+0.41(%G+C)℃
b.ミスマッチ塩基対の数が1%増加するごとに、二重鎖DNAのTmは1℃低下する。
c.(Tm)μ2−(Tm)μ1=18.5log10μ2/μ1
式中、μ1およびμ2は2つの溶液のイオン強度である。
式中、μ1およびμ2は2つの溶液のイオン強度である。
ハイブリダイゼーションストリンジェンシーは、総DNA濃度、イオン強度、温度、プローブサイズおよび水素結合を破壊する薬剤の存在などの数多くの因子の関数である。ハイブリダイゼーションを促進する因子には、高いDNA濃度、高いイオン強度、低い温度、長いプローブサイズ、および水素結合を破壊する薬剤の不在が含まれる。ハイブリダイゼーションは、典型的には、「結合」段階および「洗浄」段階の二段階で行われる。
機能的に等価な変異体
本発明の範囲内のさらに別のクラスのDNA変異体は、それらがコードする産物に言及することによって表すことができる。これらの機能的に等価なポリヌクレオチドは、遺伝暗号の縮重のために同じペプチド配列をコードするという事実を特徴とする。
本発明の範囲内のさらに別のクラスのDNA変異体は、それらがコードする産物に言及することによって表すことができる。これらの機能的に等価なポリヌクレオチドは、遺伝暗号の縮重のために同じペプチド配列をコードするという事実を特徴とする。
本明細書で提供されるDNA分子の変異体をいくつかの異なる方法で構築できることが認識される。例えば、それらは、完全な合成DNAとして構築することができる。20〜約150ヌクレオチドの範囲のオリゴヌクレオチドを効率的に合成する方法が広く利用可能である。Ausubel et al.,section 2.11,Supplement 21(1993)を参照のこと。Khorana et al.,J.Mol.Biol.72:209 217(1971)によって初めて報告された方法で、オーバーラップオリゴヌクレオチドを合成し、アセンブルすることができる。Ausubel et al.前掲、Section 8.2も参照のこと。適切なベクターへのクローニングを容易にするために、合成DNAは、好ましくは、遺伝子の5’端および3’端で操作された便利な制限部位を有するように設計される。
示されているように、変異体を作製させる方法は、本明細書に開示されるDNAの1つから出発し、次に部位特異的変異誘発を行うことである。Ausubel et al.前掲、chapter 8,Supplement 37(1997)を参照のこと。典型的な方法では、標的DNAを一本鎖DNAバクテリオファージビヒクルにクローニングする。一本鎖DNAを単離し、所望の(1または複数の)ヌクレオチド変化を含有するオリゴヌクレオチドとハイブリダイズさせる。相補鎖を合成し、二本鎖ファージを宿主中に導入する。その結果生じる子孫の一部は所望の突然変異体を含有し、そのことは、DNA配列決定を使用して確認することができるであろう。加えて、子孫ファージが所望の突然変異体になる確率を増加させる様々な方法を利用することができる。これらの方法は当業者には周知であり、このような突然変異体を作製させるためのキットが市販されている。
組換えDNA構築物および発現
本発明はさらに、本発明のヌクレオチド配列の1つ以上を含む組換えDNA構築物を提供する(表32を参照のこと)。本発明の組換え構築物は、本発明の抗体またはその抗原結合断片またはその変異体をコードするDNA分子が挿入されるプラスミド、ファージミド、ファージまたはウイルスベクターなどのベクターと共に使用される。
本発明はさらに、本発明のヌクレオチド配列の1つ以上を含む組換えDNA構築物を提供する(表32を参照のこと)。本発明の組換え構築物は、本発明の抗体またはその抗原結合断片またはその変異体をコードするDNA分子が挿入されるプラスミド、ファージミド、ファージまたはウイルスベクターなどのベクターと共に使用される。
本明細書で使用される「ベクター」という用語は、連結されている別の核酸を増殖させることができる核酸分子を指す。この用語は、自己複製する核酸構造体としてのベクター、ならびに導入された先の宿主細胞のゲノム中に組み入れられるベクターを含む。特定のベクターは、機能的に連結されている核酸の発現を指示することができる。このようなベクターは、本明細書では「発現ベクター」と称される。
「宿主細胞」、「宿主細胞株」、および「宿主細胞培養物」という用語は互換的に使用され、外来性核酸が導入された細胞(このような細胞の子孫を含む)を指す。宿主細胞には、初代形質転換細胞およびそれに由来する子孫を継代の回数に関わらず含む「形質転換体」および「形質転換細胞」が含まれる。子孫の核酸含量は親細胞と完全に同一ではなくてもよく、突然変異を含み得る。最初に形質転換された細胞においてスクリーニングまたは選択されたのと同じ機能または生物活性を有する突然変異体子孫は、本明細書に含まれる。
本明細書で提供される抗体、その抗原結合部分または変異体は、宿主細胞における軽鎖および重鎖またはその一部をコードする核酸配列の組換え発現によって調製することができる。抗体、その抗原結合部分または変異体を組換え発現させるために、軽鎖および/もしくは重鎖またはその一部をコードするDNA断片を保有する1つ以上の組換え発現ベクターで、軽鎖および重鎖が宿主細胞中で発現するように、宿主細胞をトランスフェクトすることができる。標準的な組換えDNA法、例えばSambrook,Fritsch and Maniatis(eds.),Molecular Cloning;A Laboratory Manual,Second Edition,Cold Spring Harbor,N.Y.,(1989),Ausubel,F.M.et al.(eds.)Current Protocols in Molecular Biology,Greene Publishing Associates,(1989)およびBoss et al.による米国特許第4,816,397号に記載されている方法などを使用して、重鎖および軽鎖をコードする核酸を調製し、および/または取得し、これらの核酸を組換え発現ベクター中に組み込み、そのベクターを宿主細胞中に導入する。
加えて、重鎖および/または軽鎖の可変領域をコードする核酸配列は、例えば、全長抗体鎖もしくはFab断片をコードする核酸、またはscFvに変換することができる。VLまたはVHをコードするDNA断片は、別のDNA断片(例えば、抗体定常領域またはフレキシブルなリンカーをコードするもの)に(2つのDNA断片によってコードされるアミノ酸配列がインフレームになるように)作動的に連結することができる。ヒト重鎖および軽鎖定常領域の配列は当技術分野で公知であり(例えば、Kabat,E.A.,el al.(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest,Fifth Edition,U.S.Department of Health and Human Services,NIH Publication No.91−3242を参照のこと)、これらの領域を含むDNA断片は、標準的なPCR増幅によって得ることができる。
特定のアッセイでは、マウスIgGとしての本発明の抗体の発現が好ましく、例えばヒトサンプルでの免疫組織化学は、マウス抗体を使用することによって、より容易に分析することができる。
scFvをコードするポリヌクレオチド配列を作製するために、VL領域とVH領域とがフレキシブルなリンカーで接合されている連続した単鎖タンパク質としてVH配列およびVL配列が発現し得るように、VHコード核酸およびVLコード核酸を、フレキシブルなリンカーをコードする別の断片と作動的に連結することができる(例えば、Bird et al.(1988)Science 242:423−426;Huston et al.(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879−5883;McCafferty et al.,Nature(1990)348:552−554を参照のこと)。
抗体、その抗原結合断片またはその変異体を発現させるには、標準的な組換えDNA発現法を使用することができる(例えば、Goeddel;Gene Expression Technology.Methods in Enzymology 185,Academic Press,San Diego,Calif.(1990)を参照のこと)。例えば、所望のポリペプチドをコードするDNAを発現ベクター中に挿入し、次にそれを適切な宿主細胞中にトランスフェクトすることができる。適切な宿主細胞は原核細胞および真核細胞である。原核宿主細胞の例は、例えば細菌であり、真核宿主細胞の例は、酵母、昆虫または哺乳動物細胞である。いくつかの実施形態では、重鎖をコードするDNAと軽鎖をコードするDNAが、別々のベクターに挿入される。他の実施形態では、重鎖および軽鎖をコードするDNAが、同じベクターに挿入される。調節配列の選択を含む発現ベクターの設計は、宿主細胞の選択、所望するタンパク質の発現レベル、および発現が構成的または誘導性であるかなどの因子によって影響されると理解される。
細菌発現
細菌での使用に有用な発現ベクターは、所望のタンパク質をコードする構造DNA配列を、適切な翻訳開始シグナルおよび翻訳終結シグナルと共に、機能的プロモーターと作動可能な読み枠で挿入することによって構築される。ベクターは、ベクターの維持が保証されるように、また所望であれば、宿主内での増幅がもたらされるように、1つ以上の表現型選択可能マーカーと複製起点とを含むであろう。形質転換に適切な原核宿主には、大腸菌(E.coli)、枯草菌(Bacillus subtilis)、ネズミチフス菌(Salmonella typhimurium)、ならびにシュードモナス(Pseudomonas)属、ストレプトミセス(Streptomyces)属、およびスタフィロコッカス(Staphylococcus)属の様々な種が含まれるが、これらに限定されない。
細菌での使用に有用な発現ベクターは、所望のタンパク質をコードする構造DNA配列を、適切な翻訳開始シグナルおよび翻訳終結シグナルと共に、機能的プロモーターと作動可能な読み枠で挿入することによって構築される。ベクターは、ベクターの維持が保証されるように、また所望であれば、宿主内での増幅がもたらされるように、1つ以上の表現型選択可能マーカーと複製起点とを含むであろう。形質転換に適切な原核宿主には、大腸菌(E.coli)、枯草菌(Bacillus subtilis)、ネズミチフス菌(Salmonella typhimurium)、ならびにシュードモナス(Pseudomonas)属、ストレプトミセス(Streptomyces)属、およびスタフィロコッカス(Staphylococcus)属の様々な種が含まれるが、これらに限定されない。
細菌ベクターは、例えばバクテリオファージベース、プラスミドベース、またはファージミドベースのベクターであり得る。これらのベクターは、典型的には周知のクローニングベクターpB322(ATCC37017)の要素を含有する市販のプラスミドに由来する選択可能マーカーおよび細菌複製起点を含有し得る。適切な宿主株を形質転換し、その宿主株を適切な細胞密度まで成長させた後、選択したプロモーターを、適切な手段(例えば、温度シフトまたは化学的誘導)によって抑制解除/誘導し、細胞をさらにある期間培養する。細胞を典型的には遠心分離によって回収し、物理的または化学的手段によって破壊し、その結果得られた粗抽出物を、さらなる精製のためにとっておく。
細菌系では、発現させるタンパク質の使用目的に応じて、いくつかの発現ベクターを、有利に選択することができる。例えば、抗体を作製させるために、またはペプチドライブラリーをスクリーニングするために、上記タンパク質を大量に生産しようとする場合は、例えば、精製が容易な融合タンパク質産物の高レベルな発現を指示するベクターが望ましいであろう。
したがって、本発明の実施形態は、本発明の新規抗体をコードする核酸を含む発現ベクターである。例示的な説明については、実施例1を参照のこと。
本発明の抗体またはその抗原結合断片またはその変異体には、天然精製産物、化学合成手法の生成物、ならびに例えば大腸菌、枯草菌、ネズミチフス菌などを含む原核宿主や、シュードモナス属、ストレプトミセス属およびスタフィロコッカス属の様々な種から(好ましくは大腸菌細胞から)組換え技術によって生産された産物が含まれる。
哺乳動物発現および精製
哺乳動物宿主細胞発現のための好ましい調節配列には、哺乳動物細胞における高レベルのタンパク質発現を指示するウイルス要素、例えば、サイトメガロウイルス(CMV)(CMVプロモーター/エンハンサーなど)、シミアンウイルス40(SV40)(SV40プロモーター/エンハンサーなど)、アデノウイルス(例えば、アデノウイルス主要後期プロモーター(AdMLP))およびポリオーマに由来するプロモーターおよび/またはエンハンサーなどが含まれる。ウイルス調節要素のさらなる説明およびその配列については、例えばStinskiによる米国特許第5,168,062号、Bellらによる米国特許第4,510,245号、およびSchaffnerらによる米国特許第4,968,615号を参照のこと。組換え発現ベクターは複製起点および選択可能マーカーも含み得る(例えば、Axelらによる米国特許第4,399,216号、米国特許第4,634,665号および米国特許第5,179,017号を参照のこと)。適切な選択可能マーカーには、そのベクターが導入されている宿主細胞にG418、ハイグロマイシンまたはメトトレキサートなどの薬物に対する耐性を付与する遺伝子が含まれる。例えばジヒドロ葉酸レダクターゼ(DHFR)遺伝子は、メトトレキサートに対する耐性を付与し、neo遺伝子はG418に対する耐性を付与する。
哺乳動物宿主細胞発現のための好ましい調節配列には、哺乳動物細胞における高レベルのタンパク質発現を指示するウイルス要素、例えば、サイトメガロウイルス(CMV)(CMVプロモーター/エンハンサーなど)、シミアンウイルス40(SV40)(SV40プロモーター/エンハンサーなど)、アデノウイルス(例えば、アデノウイルス主要後期プロモーター(AdMLP))およびポリオーマに由来するプロモーターおよび/またはエンハンサーなどが含まれる。ウイルス調節要素のさらなる説明およびその配列については、例えばStinskiによる米国特許第5,168,062号、Bellらによる米国特許第4,510,245号、およびSchaffnerらによる米国特許第4,968,615号を参照のこと。組換え発現ベクターは複製起点および選択可能マーカーも含み得る(例えば、Axelらによる米国特許第4,399,216号、米国特許第4,634,665号および米国特許第5,179,017号を参照のこと)。適切な選択可能マーカーには、そのベクターが導入されている宿主細胞にG418、ハイグロマイシンまたはメトトレキサートなどの薬物に対する耐性を付与する遺伝子が含まれる。例えばジヒドロ葉酸レダクターゼ(DHFR)遺伝子は、メトトレキサートに対する耐性を付与し、neo遺伝子はG418に対する耐性を付与する。
宿主細胞への発現ベクターのトランスフェクションは、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿、およびDEAE−デキストラントランスフェクションなどの標準的技術を使用して行うことができる。
本明細書で提供される抗体、その抗原結合断片またはその変異体を発現させるのに適切な哺乳動物宿主細胞には、チャイニーズハムスター卵巣(CHO細胞)[例えば、R.J.Kaufman and P.A.Sharp(1982)Mol.Biol.159:601−621に記載されているようにDHFR選択可能マーカーと共に使用されるUrlaub and Chasin,(1980)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:4216−4220に記載されているdhfr−CHO細胞を含む]、NSO骨髄腫細胞、COS細胞およびSP2細胞が含まれる。いくつかの実施形態では、発現したタンパク質が宿主細胞を成長させる培養培地中に分泌されるように、発現ベクターが設計される。抗体、その抗原結合断片または変異体は、標準的なタンパク質精製方法を使用して、培養培地から回収することができる。
本発明の抗体またはその抗原結合断片またはその変異体は、例えば限定されないが、硫酸アンモニウム沈殿またはエタノール沈殿、酸抽出、プロテインAクロマトグラフィー、プロテインGクロマトグラフィー、アニオンまたはカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィーおよびレクチンクロマトグラフィーなどの周知の方法によって、組換え細胞培養物から回収し精製することができる。高速液体クロマトグラフィー(「HPLC」)も精製に使用することができる。例えば、Colligan,Current Protocols in Immunology,or Current Protocols in Protein Science,John Wiley&Sons,NY,N.Y.,(1997−2001)の例えばChapter1、4、6、8、9、10を参照のこと(これらはそれぞれ、その全体が参照により本明細書に組み込まれる)。
本発明の抗体またはその抗原結合断片またはその変異体には、天然精製産物、化学合成手法の生成物、ならびに例えば酵母、高等植物、昆虫および哺乳動物細胞を含む真核宿主から組換え技術によって生産された産物が含まれる。組換え生産手法に使用する宿主に応じて、本発明の抗体はグリコシル化体であり得るか、または非グリコシル化体であり得る。このような方法は、多くの標準的な実験マニュアル、例えばSambrook,supra,Sections 17.37−17.42;Ausubel前掲,Section17.37〜17.42;Ausubel前掲,Chapter10、12、13、16、18および20などに記載されている。
したがって、本発明の実施形態はまた、ベクターまたは核酸分子を含む宿主細胞であって、哺乳動物細胞などの高等真核宿主細胞、酵母細胞などの下等真核宿主細胞であり得、細菌細胞などの原核細胞であり得る宿主細胞である。
本発明の別の実施形態は、宿主細胞を使用して抗体および抗原結合断片を生産する方法であって、前記宿主細胞を適切な条件下で培養すること、および前記抗体を回収することを含む方法である。
したがって、本発明の別の実施形態は、本発明の宿主細胞を用いて本発明の抗体を生産すること、およびこれらの抗体を少なくとも95重量%の均一性まで精製することである。
治療方法
治療方法は、治療有効量の本発明によって想定される抗体またはその抗原結合断片またはその変異体を、治療を必要とする被験体に投与することを含む。「治療有効」量は、本明細書では、単回投与として、または複数回投与レジメンにしたがって、単独で、または他の薬剤と組み合わせて、被験体の治療部位におけるTWEAKR陽性細胞の増殖を減少させるか、またはTWEAKR発現腫瘍のサイズを減少させるのに十分な抗体または抗原結合断片の量であって、有害症状の軽減をもたらすが、毒物学的には認容され得るものと定義される。被験体は、ヒトまたは非ヒト動物(例えば、ウサギ、ラット、マウス、イヌ、サルまたは他の下等霊長類)であり得る。
治療方法は、治療有効量の本発明によって想定される抗体またはその抗原結合断片またはその変異体を、治療を必要とする被験体に投与することを含む。「治療有効」量は、本明細書では、単回投与として、または複数回投与レジメンにしたがって、単独で、または他の薬剤と組み合わせて、被験体の治療部位におけるTWEAKR陽性細胞の増殖を減少させるか、またはTWEAKR発現腫瘍のサイズを減少させるのに十分な抗体または抗原結合断片の量であって、有害症状の軽減をもたらすが、毒物学的には認容され得るものと定義される。被験体は、ヒトまたは非ヒト動物(例えば、ウサギ、ラット、マウス、イヌ、サルまたは他の下等霊長類)であり得る。
本発明の一実施形態は、細胞株由来のおよび患者由来のヒト腫瘍モデルの広範なパネルにおいて、強力な抗腫瘍効果を有する抗体またはその抗原結合抗体断片またはその変異体を提供することである。腫瘍モデルには、786−O、A375、A253、SK−OV−3、WiDr、SW480、Co5682、NCI−H1975、NCI−H322、Lu7343およびLu7433(さらなる詳細については、実施例8を参照のこと)、Co5676およびCo5841(さらなる詳細については、実施例10を参照のこと)、SCaBER(さらなる詳細については、実施例11を参照のこと)およびSCC4(さらなる詳細については、実施例12を参照のこと)が含まれるが、これらに限定されない。例えば、ヒト腎細胞癌モデル786−Oについて、TPP−2084およびTPP−2090の用量依存的な有効性が図19に示されている。例えばTPP−2090の場合、ヒト結腸癌異種移植WiDr(図20)およびヒト肺癌異種移植NCI−H322(図21)において、インビボ抗腫瘍効果が示されている。また、他の結腸直腸腫瘍モデル、例えばSW480および患者由来の腫瘍モデルCo5682において、単独療法および/または併用療法によって、TWEAKR抗体TPP−2090の有効性を調査したところ、結果は同様に良好であった(表29を参照のこと)。さらなる腫瘍モデル786−O、A375、A253、SK−OV−3、Bx−PC3を表28に示し、NCI−H322、NCI−H1975、Lu7343およびLu7433を表30に示す。
本発明の一実施形態は、医薬として使用するための本発明の抗体またはその抗原結合断片を提供することである。
本発明の一実施形態は、癌を治療するための医薬として使用するための、本発明の抗体またはその抗原結合断片を提供することである。好ましい実施形態では、癌は、固形腫瘍である。本発明の一実施形態は、癌の治療に使用するための、本発明の抗体またはその抗原結合断片を提供することである。好ましい実施形態では、癌は、固形腫瘍である。
本発明の一実施形態は、癌の治療に使用するための医薬を製造するための、本発明の抗体またはその抗原結合断片の使用を提供することである。好ましい実施形態では、癌は、固形腫瘍である。
本発明の別の実施形態は、癌を治療するための方法であって、治療有効量の本発明の抗体またはその抗原結合断片を、それを必要とする被験体に投与することを含む方法を提供することである。好ましい実施形態では、癌は、固形腫瘍である。
本発明の抗体またはその抗原結合断片またはその変異体は、公知の医薬と共に同時投与され得、一部の場合には、前記抗体は、それ自体が改変され得る。例えば、有効性を潜在的にさらに増加させるために、抗体またはその抗原結合断片またはその変異体を細胞毒性剤または放射性同位体にコンジュゲートし得る。
本発明の抗体またはその抗原結合断片またはその変異体は、単独の医薬品として投与され得るか、または許容され得ない有害作用を組み合わせが引き起こさない場合には、1つ以上のさらなる治療剤と組み合わせて投与され得る。この併用療法は、本発明の抗体またはその抗原結合断片またはその変異体と、1つ以上のさらなる治療剤とを含有する単一の医薬投与製剤を投与すること、ならびにそれ自体が別個の医薬投与製剤によって、本発明の抗体および各さらなる治療剤を投与することを含む。例えば、本発明の抗体またはその抗原結合断片またはその変異体および治療剤を単一の液体組成物によって一緒に患者に投与してもよいし、または各薬剤を別個の投与製剤によって投与してもよい。
別個の投与製剤を使用する場合、本発明の抗体またはその抗原結合断片またはその変異体および1つ以上のさらなる治療剤を本質的に同じ時点において(例えば、同時に)投与してもよいし、または別個に時間差で(例えば、逐次に)投与してもよい。
本発明の別の実施形態は、抗体治療をイリノテカン、レゴラフェニブ、パクリタキセル、PI3K阻害剤1、オキサリプラチン、シスプラチン、5−フルオロウラシル(5−FU)、ゲムシタビンまたはセツキシマブと組み合わせた場合に、細胞株由来のおよび患者由来のヒト腫瘍モデルにおいて相乗効果または相加効果を有する抗体またはその抗原結合抗体断片またはその変異体を提供することである。
本発明の好ましい実施形態は、本発明の抗体またはその抗原結合抗体断片またはその変異体と、イリノテカン、シスプラチン、オキサリプラチン、5−フルオロウラシル(5−FU)、レゴラフェニブおよびセツキシマブからなる成分の群に含まれるさらなる有効成分との組み合わせである。抗体TPP−2090と、イリノテカン、シスプラチン、5−フルオロウラシル(5−FU)およびレゴラフェニブからなる成分の群に含まれるさらなる有効成分との組み合わせがさらにより好ましい。
本発明の好ましい実施形態は、結腸直腸癌の治療に使用するための組み合わせであって、本発明の抗体またはその抗原結合抗体断片またはその変異体と、イリノテカン、オキサリプラチン、5−フルオロウラシル(5−FU)、レゴラフェニブおよびセツキシマブからなる成分の群に含まれるさらなる有効成分との組み合わせである。結腸直腸癌の治療に使用するための組み合わせであって、抗体TPP−2090と、イリノテカン、シスプラチン、5−フルオロウラシル(5−FU)およびレゴラフェニブからなる成分の群に含まれるさらなる有効成分との組み合わせがさらにより好ましい。
好ましい実施形態では、本発明の抗体またはその抗原結合抗体断片またはその変異体と、イリノテカン、オキサリプラチン、5−フルオロウラシル(5−FU)、レゴラフェニブまたはセツキシマブとの組み合わせで結腸直腸癌を治療する。TPP−2090とイリノテカン、5−フルオロウラシル(5−FU)またはレゴラフェニブとの組み合わせによる結腸直腸癌の治療がさらにより好ましい。
さらに好ましい実施形態は、膀胱癌の治療に使用するための組み合わせであって、本発明の抗体またはその抗原結合抗体断片またはその変異体と、シスプラチンとの組み合わせである。膀胱癌の治療に使用するための組み合わせであって、抗体TPP−2090とシスプラチンとの組み合わせがさらにより好ましい。
さらに好ましい実施形態は、本発明の抗体またはその抗原結合抗体断片またはその変異体と、シスプラチンとの組み合わせによる膀胱癌の治療である。TPP−2090とシスプラチンとの組み合わせによる膀胱癌の治療がさらにより好ましい。
ヒト結腸癌異種移植片WiDrでは、例えば、TPP−2090をイリノテカンまたはレゴラフェニブと組み合わせた場合に、明らかなプラス効果を実証し得る。ヒト肺癌異種移植片NCI−H322およびNCI−H1975では、例えば、TPP−2090をパクリタキセルと組み合わせた場合に、プラス効果を実証し得る。
特に、本発明の抗体またはその抗原結合断片またはその変異体は、他の抗腫瘍剤、例えばアルキル化剤、代謝拮抗物質、植物由来の抗腫瘍剤、ホルモン療法剤、トポイソメラーゼ阻害剤、カンプトテシン誘導体、キナーゼ阻害剤、標的薬、抗体、インターフェロンおよび/または生物学的応答調整物質、抗血管形成化合物、および他の抗腫瘍薬との一定の組み合わせまたは別個の組み合わせで、使用することができる。これに関して、以下は、本発明の抗体と組み合わせて使用することができる二次薬剤の例の非限定的なリストである。
アルキル化剤には、ナイトロジェンマスタードN−オキシド、シクロホスファミド、イホスファミド、チオテパ、ラニムスチン、ニムスチン、テモゾロミド、アルトレタミン、アパジコン、ブロスタリシン、ベンダムスチン、カルムスチン、エストラムスチン、ホテムスチン、グルフォスファミド、マフォスファミド、ベンダムスチン、およびミトラクトールが含まれるが、これらに限定されない。また、白金配位アルキル化化合物には、シスプラチン、カルボプラチン、エプタプラチン、ロバプラチン、ネダプラチン、オキサリプラチン、およびサトラプラチンが含まれるが、これらに限定されない。
代謝拮抗物質には、メトトレキサート、6−メルカプトプリンリボシド、メルカプトプリン、5−フルオロウラシル(単独、またはロイコボリンとの組み合わせ)、テガフール、ドキシフルリジン、カルモフール、シタラビン、シタラビンオクホスファート、エノシタビン、ゲムシタビン、フルダラビン、5−アザシチジン、カペシタビン、クラドリビン、クロファラビン、デシタビン、エフロルニチン、エチニルシチジン、シトシンアラビノシド、ヒドロキシ尿素、メルファラン、ネララビン、ノラトレキシド、オクホスファイト、プレメトレキセド二ナトリウム、ペントスタチン、ペリトレキソール、ラルチトレキセド、トリアピン、トリメトレキセート、ビダラビン、ビンクリスチン、およびビノレルビンが含まれるが、これらに限定されない。
ホルモン療法剤には、エクセメスタン、ルプロン、アナストロゾール、ドキセルカルシフェロール、ファドロゾール、フォルメスタン、11−βヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ1阻害剤、17−αヒドロキシラーゼ/17,20リアーゼ阻害剤、例えば酢酸アビラテロン、5−αレダクターゼ阻害剤、例えばフィナステリドおよびエプリステリド、抗エストロゲン薬、例えばクエン酸タモキシフェンおよびフルベストラント、トレルスター(Trelstar)、トレミフェン、ラロキシフェン、ラソフォキシフェン、レトロゾール、抗アンドロゲン薬、例えばビカルタミド、フルタミド、ミフェプリストン、ニルタミド、カソデックス、および抗プロゲステロンならびにそれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。
植物由来の抗腫瘍物質には、例えば有糸分裂阻害剤、例えばサゴピロン、イクサベピロンおよびエポチロンBなどのエポチロン類、ビンブラスチン、ビンフルニン、ドセタキセル、およびパクリタキセルから選択されるものなどが含まれる。
細胞毒性トポイソメラーゼ阻害剤には、アクラルビシン、ドキソルビシン、アモナフィド、ベロテカン、カンプトテシン、10−ヒドロキシカンプトテシン、9−アミノカンプトテシン、ジフロモテカン、イリノテカン、トポテカン、エドテカリン、エピムビシン、エトポシド、エキサテカン、ジマテカン、ラルトテカン、ミトキサントロン、ピラムビシン、ピクサントロン、ルビテカン、ソブゾキサン、タフルポシド、およびそれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。
免疫薬には、インターフェロン、例えばインターフェロンα、インターフェロンα−2a、インターフェロンα−2b、インターフェロンβ、インターフェロンγ−1aおよびインターフェロンγ−n1、ならびに他の免疫増進剤、例えばL19−IL2および他のIL2誘導体、フィルグラスチム、レンチナン、シゾフィラン、セラシス(TheraCys)、ウベニメクス、アルデスロイキン、アレムツズマブ、BAM−002、ダカルバジン、ダクリズマブ、デニロイキン、ゲムツズマブ、オゾガマイシン、イブリツモマブ、イミキモド、レノグラスチム、レンチナン、黒色腫ワクチン(Corixa)、モルグラモスチム、サルグラモスチム、タソネルミン、テクロイキン、チマラシン、トシツモマブ、ビムリジン、エプラツズマブ、ミツモマブ、オレゴボマブ、ペムツモマブ、およびプロベンジなどがある。
生物学的応答調整物質は、生体の防御機構、または組織細胞の生存、成長もしくは分化などの生物学的応答を改変して、それらが抗腫瘍活性を有するように指示する薬剤である。このような薬剤には、例えばクレスチン、レンチナン、シゾフィラン、ピシバニール、プロミューン、およびウベニメクスなどがある。
抗血管形成化合物には、アシトレチン、アフリベルセプト、アンジオスタチン、アプリジン、アセンタール、アキシチニブ、ベバシズマブ、ブリバニブアラニネート、シレングタイド、コンブレタスタチン、エンドスタチン、フェンレチニド、ハロフジノン、パゾパニブ、ラニビズマブ、レビマスタット、レセンチン、レゴラフェニブ、レモバブ、レブリミド、ソラフェニブ、スクアラミン、スニチニブ、テラチニブ、サリドマイド、ウクライン、バタラニブ、およびビタキシンが含まれるが、これらに限定されない。
抗体には、トラスツズマブ、セツキシマブ、ベバシズマブ、リツキシマブ、チシリムマブ、イピリムマブ、ルミリキシマブ、カツマキソマブ、アタシセプト、オレゴボマブ、およびアレムツズマブが含まれるが、これらに限定されない。
VEGF阻害剤、例えばソラフェニブ、レゴラフェニブ、ベバシズマブ、スニチニブ、レセンチン、アキシチニブ、アフリベルセプト、テラチニブ、ブリバニブアラニネート、バタラニブ、パゾパニブ、およびラニビズマブなど。
EGFR(HER1)阻害剤、例えばセツキシマブ、パニツムマブ、ベクチビックス、ゲフィチニブ、エルロチニブ、およびザクチマなど。
HER2阻害剤、例えばラパチニブ、トラツズマブ、およびペルツズマブなど。
mTOR阻害剤、例えばテムシロリムス、シロリムス/ラパマイシン、およびエベロリムスなど。
c−Met阻害剤。
PI3K阻害剤、例えばPI3K阻害剤1(2−アミノ−N−[7−メトキシ−8−(3−モルホリン−4−モルホリン−4−イルプロポキシ)−2,3−ジヒドロイミダゾ)−2,3−モルホリン−4−イルプロポキシ)−2,3−ジヒドロイミダゾ[1,2−c]キナゾリン−5−イル]ピリミジン−5−カルボキサミドジヒドロクロリド(実施例1および国際公開第2012/136553号(これは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる)に記載されている化合物を参照のこと)
およびAKT阻害剤。
およびAKT阻害剤。
CDK阻害剤、例えばロスコビチンおよびフラボピリドール。
紡錘体集合チェックポイント阻害剤および標的抗有糸分裂剤、例えばPLK阻害剤、オーロラ阻害剤(例えば、ヘスペラジン)、チェックポイントキナーゼ阻害剤、およびKSP阻害剤。
HDAC阻害剤、例えばパノビノスタット、ボリノスタット、MS275、ベリノスタット、およびLBH589など。
HSP90およびHSP70阻害剤。
プロテアソーム阻害剤、例えばボルテゾミブおよびカーフィルゾミブ。
セリン/スレオニンキナーゼ阻害剤、例えばMEK阻害剤およびRaf阻害剤、例えばソラフェニブ。
ファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤、例えばティピファルニブなど。
チロシンキナーゼ阻害剤、例えばダサチニブ、ニロチビブ、レゴラフェニブ、ボスチニブ、ソラフェニブ、ベバシズマブ、スニチニブ、セジラニブ、アキシチニブ、アフリベルセプト、テラチニブ、イマチニブメシラート、ブリバニブアラニネート、パゾパニブ、ラニビズマブ、バタラニブ、セツキシマブ、パニツムマブ、ベクチビックス、ゲフィチニブ、エルロチニブ、ラパチニブ、トラツズマブ、ペルツズマブ、およびc−Kit阻害剤など。
ビタミンD受容体アゴニスト。
Bcl−2タンパク質阻害剤、例えばオバトクラックス、オブリメルセンナトリウム、およびゴシポールなど。
分化クラスタ20受容体アンタゴニスト、例えばリツキシマブなど。
リボヌクレオチドレダクターゼ阻害剤、例えばゲムシタビンなど。
腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド受容体1アゴニスト、例えばマパツムマブなど。
腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド受容体2アゴニスト、例えばレクサツムマブ、コナツムマブ、CS−1008、PRO95780など。
5−ヒドロキシトリプタミン受容体アンタゴニスト、例えばrEV598、キサリプローデ、パロノセトロン塩酸塩、グラニセトロン、ジンドール、およびAB−1001など。
インテグリン阻害剤、例えばα5β1インテグリン阻害剤、例えばE7820、JSM6425、ボロシキシマブ、およびエンドスタチンなど。
アンドロゲン受容体アンタゴニスト、例えばデカン酸ナンドロロン、フルオキシメステロン、アンドロイド、プロストエイド、アンドロムスチン、ビカルタミド、フルタミド、アポ−シプロテロン、アポ−フルタミド、酢酸クロルマジノン、アンドロキュア、Tabi、酢酸シプロテロン、およびニルタミド。
アロマターゼ阻害剤、例えばアナストロゾール、レトロゾール、テストラクトン、エクセメスタン、アミノグルテチミド、およびフォルメスタンなど。
マトリックスメタロプロテイナーゼ阻害剤。
他の抗癌剤、例えばアリトレチノイン、アンプリジェン、アトラセンタンベキサロテン、ボルテゾミブ、ボセンタン、カルシトリオール、エクシスリンド、ホテムスチン、イバンドロン酸、ミルテホシン、ミトキサントロン、I−アスパラギナーゼ、プロカルバジン、ダカルバジン、ヒドロキシカルバミド、ペガスパルガーゼ、ペントスタチン、タザロテン、ベルケイド、硝酸ガリウム、カンホスファミド、ダリナパルシン、およびトレチノインなど。
好ましい実施形態では、本発明の抗体を、化学療法(すなわち、細胞毒性剤)、抗ホルモンおよび/または標的療法、例えば他のキナーゼ阻害剤(例えば、EGFR阻害剤)、mTOR阻害剤および血管新生阻害剤と組み合わせて使用することができる。
本発明の化合物を、放射線療法および/または外科的介入と共に、癌治療に使用してもよい。
本発明の抗体またはその抗原結合断片は、場合によっては、それ自体が改変されていてもよい。例えば抗体は、効力を潜在的にさらに高めるために、限定されないが、上記化合物いずれかまたは任意の放射性同位体にコンジュゲートすることができる。さらに、本発明の抗体は、当技術分野で周知である研究および診断に、または分析用参照標準などとして、そのまま利用するか、組成物に入れて利用することができる。
本発明の抗体またはその抗原結合断片は、異常なTWEAKRシグナリングを伴う様々な状況において、例えば癌または線維性疾患などの細胞増殖性障害において、治療ツールまたは診断ツールとして使用することができる。本発明の抗体による治療に特に適切な障害および症状は、固形腫瘍、例えば、乳房、気道、脳、生殖器、消化管、尿路、眼、肝臓、皮膚、頭頸部、甲状腺、副甲状腺の癌、およびそれらの遠隔転移などである。これらの障害には、リンパ腫、肉腫および白血病も含まれる。
消化管の腫瘍には、肛門癌、大腸癌、結腸直腸癌、食道癌、胆嚢癌、胃癌、膵癌、直腸癌、小腸癌、および唾液腺癌が含まれるが、これらに限定されない。
食道癌の例には、食道細胞癌および食道腺癌、ならびに扁平上皮細胞癌、平滑筋肉腫、悪性黒色腫、横紋筋肉腫およびリンパ腫が含まれるが、これらに限定されない。
胃癌の例には、腸型およびびまん型の胃腺癌が含まれるが、これらに限定されない。
膵癌の例には、膵管腺癌、腺扁平上皮癌および膵内分泌腫瘍が含まれるが、これらに限定されない。
乳癌の例には、トリプルネガティブ乳癌、浸潤性乳管癌、浸潤性小葉癌、導管上皮内癌、および上皮内小葉癌が含まれるが、これらに限定されない。
気道の癌の例には、小細胞および非小細胞肺癌、ならびに気管支腺腫および胸膜肺芽腫が含まれるが、これらに限定されない。
脳癌の例には、脳幹神経膠腫、視床下部神経膠腫、小脳星状細胞腫、大脳星状細胞腫、膠芽腫、髄芽腫、脳室上衣腫、ならびに神経外胚葉腫瘍および松果体腫瘍が含まれるが、これらに限定されない。
男性生殖器の腫瘍には、前立腺癌および精巣癌が含まれるが、これらに限定されない。女性生殖器の腫瘍には、子宮内膜癌、子宮頸癌、卵巣癌、膣癌および外陰癌、ならびに子宮の肉腫が含まれるが、これらに限定されない。
卵巣癌の例には、漿液性腫瘍、類内膜腫瘍、粘液性嚢胞腺癌、顆粒膜細胞腫、セルトリ・ライディッヒ細胞腫および男性化細胞種が含まれるが、これらに限定されない。
子宮頸癌の例には、扁平上皮細胞癌、腺癌、腺扁平上皮癌、小細胞癌、神経内分泌腫瘍、すりガラス細胞癌および絨毛腺管状腺癌が含まれるが、これらに限定されない。
尿路の腫瘍には、膀胱、陰茎、腎臓、腎盂、尿管、尿道、ならびに遺伝性および散発性乳頭状腎細胞癌が含まれるが、これらに限定されない。
腎癌の例には、腎細胞癌、尿路上皮細胞癌、傍糸球体細胞腫(レニノーマ)、血管腎脂肪腫、腎オンコサイトーマ、ベリーニ管癌、腎臓の明細胞肉腫、中胚葉性腎腫、ウィルムス腫瘍が含まれるが、これらに限定されない。
膀胱癌の例には、移行上皮癌、扁平上皮細胞癌、腺癌、肉腫および小細胞癌が含まれるが、これらに限定されない。
眼癌には、眼内黒色腫および網膜芽細胞腫が含まれるが、これらに限定されない。
肝癌の例には、肝細胞癌(線維層板状変異を伴うまたは伴わない肝臓細胞癌)、胆管癌(肝内胆管癌)、および混合型肝細胞胆管癌が含まれるが、これらに限定されない。
皮膚癌には、扁平上皮細胞癌、カポジ肉腫、悪性黒色腫、メルケル細胞皮膚癌、および非黒色腫皮膚癌が含まれるが、これらに限定されない。
頭頸部癌には、頭頸部の扁平上皮細胞癌、喉頭癌、下咽頭癌、鼻咽頭癌、中咽頭癌、唾液腺癌、口唇癌および口腔癌、ならびに扁平上皮細胞癌が含まれるが、これらに限定されない。
リンパ腫には、AIDS関連リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、皮膚T細胞性リンパ腫、バーキットリンパ腫、ホジキン病、および中枢神経系のリンパ腫が含まれるが、これらに限定されない。
肉腫には、軟組織の肉腫、骨肉腫、悪性線維性組織球腫、リンパ肉腫、および横紋筋肉腫が含まれるが、これらに限定されない。
白血病には、急性骨髄性白血病、急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病、およびヘアリー細胞白血病が含まれるが、これらに限定されない。
好ましい実施形態では、本発明の抗体またはその抗原結合断片は、癌疾患を治療または診断するための治療方法または診断方法に適切である。好ましい実施形態では、本発明の抗体またはその抗原結合断片は、癌が固形癌である癌疾患を治療または診断するための治療方法または診断方法に適切である。
好ましい実施形態では、本発明の抗体またはその抗原結合断片は、胃癌、乳癌、膵臓癌、結腸直腸癌、腎臓癌、前立腺癌、卵巣癌、子宮頸癌、肺癌、子宮内膜癌、食道癌、頭頸部癌、肝細胞癌、黒色腫および膀胱癌からなる群に含まれる癌疾患を治療または診断するための治療方法または診断方法に適切である。
より好ましい実施形態では、本発明の抗体またはその抗原結合断片は、膀胱癌、結腸直腸癌、非小細胞肺癌、腎臓癌、黒色腫、卵巣癌、頭頸部癌および膵臓癌からなる群に含まれる癌疾患を治療または診断するための治療方法または診断方法に適切である。
より好ましい実施形態では、本発明の抗体またはその抗原結合断片は、膀胱癌、結腸直腸癌、非小細胞肺癌、腎臓癌、黒色腫、卵巣癌、頭頸部癌および膵臓癌からなる群に含まれる癌疾患を治療するための治療方法に使用するためのものである。
より好ましい実施形態は、膀胱癌、結腸直腸癌、非小細胞肺癌、腎臓癌、黒色腫、卵巣癌、頭頸部癌および膵臓癌からなる群に含まれる癌疾患の治療に使用するための医薬を製造するための、本発明の抗体またはその抗原結合断片の使用である。
より好ましい実施形態は、膀胱癌、結腸直腸癌、非小細胞肺癌、腎臓癌、黒色腫、卵巣癌、頭頸部癌および膵臓癌からなる群に含まれる癌疾患を治療するための方法であって、治療有効量の本発明の抗体または抗原結合断片を投与することを含む方法である。
加えて、本発明の抗体またはその抗原結合断片は、TWEAKRが関与する他の様々な障害、例えば限定されないが、肺胞内線維症、シリカ誘発性肺線維症、実験的肺線維症、特発性肺線維症、腎線維症などの線維性疾患、ならびにリンパ管平滑筋腫症、多嚢胞性卵巣症候群、ざ瘡、乾癬、コレステリン腫、真珠腫性慢性中耳炎、歯周炎、光黒子、腸疾患、アテローム性動脈硬化または子宮内膜症などにおいて、治療ツールまたは診断ツールとして使用することもできる。
上記障害はヒトにおいて詳細に特徴づけられているが、哺乳動物を含む他の動物にも、類似する病因により存在し、本発明の医薬組成物を投与することによって治療することができる。
上記障害のいずれかを治療するには、本発明にしたがって使用するための医薬組成物を、1つ以上の生理学的に許容できる担体または賦形剤を使用して従来の方法で製剤化することができる。本発明の抗体またはその抗原結合断片は、治療される傷害の種類に応じて変化し得る任意の適切な手段によって、投与することができる。可能な投与経路には、非経口(例えば、筋肉内、静脈内、動脈内、腹腔内、または皮下)、肺内および鼻腔内が含まれ、局所免疫抑制治療にとって望ましい場合には、病変内投与も含まれる。加えて、本発明の抗体またはその抗原結合断片またはその変異体は、例えば抗体の用量を減らしていく、パルス注入によって投与することもできる。好ましくは、投薬は、投与が短期間または長期間であるかに部分的に応じて、注射によって、最も好ましくは静脈内注射または皮下注射によって行われる。投与すべき量は、臨床症候、個体の体重、他の薬物を投与するかなどの様々な因子に依存するであろう。当業者であれば、投与の経路が治療すべき障害または症状に応じて変化するであろうことを認識するであろう。
本発明の新規抗体またはその抗原結合断片またはその変異体の治療有効量の決定は、主として、特定の患者特徴、投与経路、および治療される障害の性質に依存するであろう。一般的な指針は、例えばInternational Conference on Harmonizationの刊行物およびREMINGTON’S PHARMACEUTICAL SCIENCES,chapters 27 and 28,pp.484−528(18th ed.,Alfonso R.Gennaro,Ed.,Easton,Pa.:Mack Pub.Co.,1990)に見られ得る。より具体的には、治療有効量の決定は、医薬の毒性および効力などの因子に依存するであろう。毒性は、上記参考文献に見られる当技術分野で周知の方法を使用して決定することができる。有効性は、同じ指針を、下記の実施例で述べる方法と合わせて利用することによって、決定することができる。
診断方法
抗TWEAKR抗体またはその抗原結合断片は、TWEAKR発現腫瘍の存在を検出するために使用することができる。血清および組織生検標本を含む様々な生物学的サンプルにおけるTWEAKR含有細胞または脱落したTWEAKRの存在は、抗TWEAKR抗体を使用して検出することができる。加えて、抗TWEAKR抗体は、99Tc(または他の同位体)コンジュゲート抗体を使用した免疫シンチグラフィなどの、様々なイメージング方法に使用することができる。例えば、111Inコンジュゲート抗PSMA抗体を使用して表されたものに似たイメージングプロトコールを使用して、膵臓癌または卵巣癌を検出することができる(Sodee et al.,Clin.Nuc.Med.21:759−766,1997)。使用することができる別の検出方法は、本発明の抗体を適切な同位体にコンジュゲートすることによる陽電子放出断層撮影である(Herzog et al.,J.Nucl.Med.34:2222−2226,1993を参照のこと)。
抗TWEAKR抗体またはその抗原結合断片は、TWEAKR発現腫瘍の存在を検出するために使用することができる。血清および組織生検標本を含む様々な生物学的サンプルにおけるTWEAKR含有細胞または脱落したTWEAKRの存在は、抗TWEAKR抗体を使用して検出することができる。加えて、抗TWEAKR抗体は、99Tc(または他の同位体)コンジュゲート抗体を使用した免疫シンチグラフィなどの、様々なイメージング方法に使用することができる。例えば、111Inコンジュゲート抗PSMA抗体を使用して表されたものに似たイメージングプロトコールを使用して、膵臓癌または卵巣癌を検出することができる(Sodee et al.,Clin.Nuc.Med.21:759−766,1997)。使用することができる別の検出方法は、本発明の抗体を適切な同位体にコンジュゲートすることによる陽電子放出断層撮影である(Herzog et al.,J.Nucl.Med.34:2222−2226,1993を参照のこと)。
医薬組成物および投与
本発明の実施形態は、単独で、または安定化化合物などの少なくとも1つの他の薬剤と組み合わせて、抗TWEAKR抗体またはその抗原結合断片またはその変異体を含む医薬組成物であって、限定されないが、食塩水、緩衝食塩水、デキストロース、および水を含む任意の滅菌生体適合性医薬担体で投与することができる医薬組成物である。さらなる実施形態は、TWEAKR結合抗体またはその抗原結合断片と、癌などのTWEAKR関連疾患を治療するのに適切なさらに別の医薬活性化合物とを含む医薬組成物である。これらの分子はいずれも、単独で、または他の薬剤、薬物もしくはホルモンと組み合わせて、医薬組成物として患者に投与することができ、医薬組成物中で、(1または複数の)賦形剤または薬学的に許容され得る担体と混合されている。本発明の実施形態では、薬学的に許容され得る担体は医薬的に不活性である。
本発明の実施形態は、単独で、または安定化化合物などの少なくとも1つの他の薬剤と組み合わせて、抗TWEAKR抗体またはその抗原結合断片またはその変異体を含む医薬組成物であって、限定されないが、食塩水、緩衝食塩水、デキストロース、および水を含む任意の滅菌生体適合性医薬担体で投与することができる医薬組成物である。さらなる実施形態は、TWEAKR結合抗体またはその抗原結合断片と、癌などのTWEAKR関連疾患を治療するのに適切なさらに別の医薬活性化合物とを含む医薬組成物である。これらの分子はいずれも、単独で、または他の薬剤、薬物もしくはホルモンと組み合わせて、医薬組成物として患者に投与することができ、医薬組成物中で、(1または複数の)賦形剤または薬学的に許容され得る担体と混合されている。本発明の実施形態では、薬学的に許容され得る担体は医薬的に不活性である。
本発明はまた、医薬組成物の投与に関する。このような投与は、経口的または非経口的に行われる。非経口送達の方法には、局所、動脈内(腫瘍に直接)、筋肉内、皮下、髄内、髄腔内、室内、静脈内、腹腔内、または鼻腔内投与が含まれる。これらの医薬組成物は、有効成分に加えて、活性化合物を医薬的に使用することができる調製物に加工することを容易にする賦形剤および助剤を含む薬学的に許容され得る適切な担体を含有し得る。製剤および投与のための技術に関するさらなる詳細は、最新版のRemington’s Pharmaceutical Sciences(Ed.Maack Publishing Co,Easton,Pa.)に見られ得る。
「医薬製剤」という用語は、その中に含まれる有効成分の生物活性が有効になることを可能にするような形態である調製物であって、製剤が投与される被験体に対して許容され得ない毒性のさらなる成分を含有しない調製物を指す。
経口投与用の医薬組成物は、当技術分野で周知の薬学的に許容され得る担体を使用して、経口投与に適切な投与量で、製剤化することができる。このような担体は、医薬組成物を、患者による摂取のための錠剤、丸剤、糖衣丸、カプセル剤、液剤、ゲル剤、シロップ剤、スラリー剤、懸濁剤などとして、製剤化することを可能にする。
経口使用のための医薬調製物は、活性化合物を固形賦形剤と混和し、得られた混合物を粉砕してもよく、所望であれば適切な助剤を添加した後に、錠剤または糖衣丸の核が得られるように顆粒の混合物を加工することによって、得ることができる。適切な賦形剤は、糖質またはタンパク質充填剤、例えば、ラクトース、スクロース、マンニトール、またはソルビトールを含む糖類;トウモロコシ、コムギ、コメ、ジャガイモ、または他の植物由来のデンプン;メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースまたはカルボキシメチルセルロースナトリウムなどのセルロース;アラビアゴムおよびトラガカントゴムを含むゴム;ならびにゼラチンおよびコラーゲンなどのタンパク質などである。所望であれば、架橋ポリビニルピロリドン、寒天、アルギン酸、またはその塩、例えばアルギン酸ナトリウムなどの崩壊剤または可溶化剤を加えてもよい。
糖衣丸の核には、濃厚糖溶液などの適切なコーティングが施され得、このコーティング溶液も、アラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カーボポールゲル、ポリエチレングリコールおよび/または二酸化チタン、ラッカー溶液、および適切な有機溶媒または溶媒混合物を含み得る。製品識別のために、または活性化合物の量、すなわち投与量を特徴づけるために、錠剤または糖衣丸のコーティングには、染料または顔料を加えてもよい。
経口的に使用することができる医薬調製物には、ゼラチン製の押込み式カプセル剤、ならびにゼラチンおよびグリセロールまたはソルビトールなどのコーティングで作られた密封軟カプセル剤が含まれる。押込み式カプセル剤は、ラクトースまたはデンプンなどの充填剤または結合剤、タルクまたはステアリン酸マグネシウムなどの滑沢剤と混合され、安定化剤と混合されていてもよい有効成分を含有し得る。軟カプセル剤では、活性化合物を適切な液体、例えば安定化剤を含む、または安定化剤を含まない、脂肪油、液体パラフィン、または液体ポリエチレングリコールなどに溶解または懸濁することができる。
非経口投与用の医薬製剤は、活性化合物の水溶液を含む。注射のために、本発明の医薬組成物を、水溶液中に、好ましくは生理学的に適合するバッファ、例えばハンクス液、リンゲル液、または生理的緩衝食塩水中に製剤化することができる。水性注射懸濁液は、懸濁液の粘度を増加させる物質、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、またはデキストランを含有し得る。加えて、活性化合物の懸濁液は、適切な油性注射用懸濁剤として製造することもできる。適切な親油性の溶剤またはビヒクルには、ゴマ油などの脂肪油、または合成脂肪酸エステル、例えばオレイン酸エチルもしくはトリグリセリド、またはリポソームが含まれる。懸濁液は、高濃度溶液の調製が可能になるように、適切な安定化剤、または化合物の溶解度を増加させる薬剤も含有していてもよい。
局所投与または経鼻投与のためには、浸透すべき特定の障壁に適切な浸透剤を製剤化に使用する。このような浸透剤は、一般に、当技術分野で公知である。
キット
本発明はさらに、上記本発明の組成物の成分の1つ以上が充填された1つ以上の容器を含む医薬パックおよびキットに関する。(1または複数の)このような容器には、医薬または生物学的製剤の製造、使用または販売を規制する政府当局によって指示された形式で、当局によるヒト投与用製品の製造、使用または販売の認可を反映した告知書を、添付することができる。
本発明はさらに、上記本発明の組成物の成分の1つ以上が充填された1つ以上の容器を含む医薬パックおよびキットに関する。(1または複数の)このような容器には、医薬または生物学的製剤の製造、使用または販売を規制する政府当局によって指示された形式で、当局によるヒト投与用製品の製造、使用または販売の認可を反映した告知書を、添付することができる。
別の実施形態では、キットは、本発明の抗体またはその抗原結合断片またはその変異体をコードするDNA配列を含有し得る。これらの抗体をコードするDNA配列は、好ましくは、宿主細胞へのトランスフェクションと宿主細胞による発現に適切なプラスミドに入れて提供される。プラスミドは、宿主細胞におけるDNAの発現を調節するために、プロモーター(多くの場合、誘導性プロモーター)を含有し得る。プラスミドは、プラスミド中に他のDNA配列を挿入して様々な抗体を生産することが容易になるように、適切な制限部位も含有し得る。プラスミドは、コードされているタンパク質のクローニングおよび発現を容易にするために、数多くの他の要素も含有し得る。このような要素は、当業者には周知であり、例えば選択可能マーカー、開始コドン、停止コドンなどが含まれる。
製造および貯蔵
本発明の医薬組成物は、当技術分野で周知である方法で、例えば従来の混合、溶解、造粒、糖衣形成、研和、乳化、カプセル化、捕捉または凍結乾燥プロセスなどによって、製造することができる。
本発明の医薬組成物は、当技術分野で周知である方法で、例えば従来の混合、溶解、造粒、糖衣形成、研和、乳化、カプセル化、捕捉または凍結乾燥プロセスなどによって、製造することができる。
医薬組成物は塩として提供することができ、限定されないが、塩酸、硫酸、酢酸、乳酸、酒石酸、リンゴ酸、コハク酸を含む酸を使用して形成させることができる。塩は、水性溶媒または他のプロトン性溶媒に、対応する遊離塩基型よりも溶解しやすい傾向を示す。他の場合では、好ましい調製物は、使用前にバッファと混合されるpH範囲4.5〜5.5の1mM〜50mMヒスチジン、0.1%〜2%スクロース、2%〜7%マンニトール中の凍結乾燥粉末であり得る。
許容され得る担体中に製剤化された本発明の化合物を含む医薬組成物を製造したら、それらを適切な容器に入れ、適応症の治療に関して医薬品の表示をすることができる。抗TWEAKR抗体またはその抗原結合断片の投与に関して、このような医薬品の表示には、投与の量、頻度および方法が含まれるであろう。
治療有効量
本発明に使用するのに適切な医薬組成物には、その有効成分が、意図する目的、すなわちTWEAKR発現を特徴とする特定の疾患状態の治療を達成するのに有効な量で含まれる組成物が含まれる。有効量の決定は、当業者の能力の範囲で十分に可能である。
本発明に使用するのに適切な医薬組成物には、その有効成分が、意図する目的、すなわちTWEAKR発現を特徴とする特定の疾患状態の治療を達成するのに有効な量で含まれる組成物が含まれる。有効量の決定は、当業者の能力の範囲で十分に可能である。
任意の化合物について、最初は細胞培養アッセイにおいて、例えば新生物細胞において、または動物モデル、通常はマウス、ウサギ、イヌ、ブタまたはサルにおいて、治療有効量を推定することができる。動物モデルを使用して、望ましい濃度範囲および投与経路も得られる。次に、このような情報を、ヒトにおける投与にとって有用な用量および経路を決定するために使用することができる。
治療有効量は、症候または症状を改善する、抗体またはその抗原結合断片の量を指す。このような化合物の治療効力および毒性は、細胞培養または実験動物において、例えばED50(集団の50%において治療的に有効な用量)およびLD50(集団の50%にとって致死的な用量)などの、標準的な医薬的手法によって決定することができる。治療効果と毒性効果との間の用量比が治療係数であり、これは比ED50/LD50として表すことができる。大きな治療係数を示す医薬組成物が好ましい。細胞培養アッセイおよび動物試験から得られたデータは、ヒトでの使用のための投与量範囲を処方する際に使用される。このような化合物の投与量は、好ましくは、ほとんどまたは全く毒性を伴わないED50を含む循環濃度の範囲内にある。投与量は、使用する剤形、患者の感度、および投与経路に応じて、この範囲内で変化する。
厳密な投与量は、治療すべき患者を考慮して個々の医師が選択する。投与量および投与は、十分なレベルの有効成分が提供されるように、または所望の効果が維持されるように、調節される。考慮することができるさらなる因子には、疾患状態の重症度、例えば腫瘍のサイズおよび場所;患者の年齢、体重および性別;食餌、投与の時間および頻度、(1または複数の)併用薬、反応感度、および治療に対する認容性/応答が含まれる。長時間作用性医薬組成物を、その特定製剤の半減期およびクリアランス率に応じて、例えば、3〜4日ごと、1週間ごと、2週間に1回、または3週間に1回投与してもよい。
通常の投与量は、投与経路に応じて、0.1〜100,000マイクログラム、合計用量約2gまでの範囲で変化し得る。特定の投与量および送達方法に関する指針は文献に記載されている。米国特許第4,657,760号;米国特許第5,206,344号;または米国特許第5,225,212号を参照のこと。当業者であれば、ポリヌクレオチド用には、タンパク質用またはそれらの阻害剤用とは異なる製剤を用いるであろう。同様に、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの送達は、特定の細胞、症状、場所などに特異的であろう。放射標識抗体の場合、好ましい比放射能は0.1〜10mCi/mgタンパク質の範囲にあり得る(Riva et al.,Clin.Cancer Res.5:3275−3280,1999;Ulaner et al.,2008 Radiology 246(3):895−902)。
本発明のさらに好ましい実施形態は、以下のものである:
1.TWEAKR(配列番号:169)の47位のD(D47)に特異的に結合する、単離された抗TWEAKR抗体またはその抗原結合断片。
1.TWEAKR(配列番号:169)の47位のD(D47)に特異的に結合する、単離された抗TWEAKR抗体またはその抗原結合断片。
2.抗体が、TPP−2203と比較してTPP−2614に対するそのELISAシグナルの80%超を喪失すると、抗体が、TWEAKR(配列番号:169)の47位のD(D47)に特異的に結合する、実施形態1に記載の抗体またはその抗原結合断片。
3.抗体がアゴニスト抗体である、実施形態1または2に記載の抗体またはその抗原結合断片。
4.(a)式PYPMX(配列番号:171)(式中、Xは、IまたはMである)を含むアミノ酸配列によってコードされる重鎖CDR1;
(b)式YISPSGGXTHYADSVKG(配列番号:172)(式中、Xは、SまたはKである)を含むアミノ酸配列によってコードされる重鎖CDR2;および
(c)式GGDTYFDYFDY(配列番号:173)を含むアミノ酸配列によってコードされる重鎖CDR3
を含む可変重鎖と、
(a)式RASQSISXYLN(配列番号:174)(式中、Xは、GまたはSである)を含むアミノ酸配列によってコードされる軽鎖CDR1;
(b)式XASSLQS(配列番号:175)(式中、Xは、Q、AまたはNである)を含むアミノ酸配列によってコードされる軽鎖CDR2;および
(c)式QQSYXXPXIT(配列番号:176)(式中、5位のXは、TまたはSであり、6位のXは、TまたはSであり、8位のXは、GまたはFである)を含むアミノ酸配列によってコードされる軽鎖CDR3
を含む可変軽鎖とを含む、実施形態1〜3のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
(b)式YISPSGGXTHYADSVKG(配列番号:172)(式中、Xは、SまたはKである)を含むアミノ酸配列によってコードされる重鎖CDR2;および
(c)式GGDTYFDYFDY(配列番号:173)を含むアミノ酸配列によってコードされる重鎖CDR3
を含む可変重鎖と、
(a)式RASQSISXYLN(配列番号:174)(式中、Xは、GまたはSである)を含むアミノ酸配列によってコードされる軽鎖CDR1;
(b)式XASSLQS(配列番号:175)(式中、Xは、Q、AまたはNである)を含むアミノ酸配列によってコードされる軽鎖CDR2;および
(c)式QQSYXXPXIT(配列番号:176)(式中、5位のXは、TまたはSであり、6位のXは、TまたはSであり、8位のXは、GまたはFである)を含むアミノ酸配列によってコードされる軽鎖CDR3
を含む可変軽鎖とを含む、実施形態1〜3のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
5.a.配列番号:6によって示される可変重鎖CDR1配列、配列番号:7によって示される可変重鎖CDR2配列、および配列番号:8によって示される可変重鎖CDR3配列を含む可変重鎖、ならびに
配列番号:3によって示される可変軽鎖CDR1配列、配列番号:4によって示される可変軽鎖CDR2配列、および配列番号:5によって示される可変軽鎖CDR3配列を含む可変軽鎖、または
b.配列番号:16によって示される可変重鎖CDR1配列、配列番号:17によって示される可変重鎖CDR2配列、および配列番号:18によって示される可変重鎖CDR3配列を含む可変重鎖、ならびに
配列番号:13によって示される可変軽鎖CDR1配列、配列番号:14によって示される可変軽鎖CDR2配列、および配列番号:15によって示される可変軽鎖CDR3配列を含む可変軽鎖、または
c.配列番号:26によって示される可変重鎖CDR1配列、配列番号:27によって示される可変重鎖CDR2配列、および配列番号:28によって示される可変重鎖CDR3配列を含む可変重鎖、ならびに
配列番号:23によって示される可変軽鎖CDR1配列、配列番号:24によって示される可変軽鎖CDR2配列、および配列番号:25によって示される可変軽鎖CDR3配列を含む可変軽鎖、または
d.配列番号:36によって示される可変重鎖CDR1配列、配列番号:37によって示される可変重鎖CDR2配列、および配列番号:38によって示される可変重鎖CDR3配列を含む可変重鎖、ならびに
配列番号:33によって示される可変軽鎖CDR1配列、配列番号:34によって示される可変軽鎖CDR2配列、および配列番号:35によって示される可変軽鎖CDR3配列を含む可変軽鎖、または
e.配列番号:46によって示される可変重鎖CDR1配列、配列番号:47によって示される可変重鎖CDR2配列、および配列番号:48によって示される可変重鎖CDR3配列を含む可変重鎖、ならびに
配列番号:43によって示される可変軽鎖CDR1配列、配列番号:44によって示される可変軽鎖CDR2配列、および配列番号:45によって示される可変軽鎖CDR3配列を含む可変軽鎖、または
f.配列番号:56によって示される可変重鎖CDR1配列、配列番号:57によって示される可変重鎖CDR2配列、および配列番号:58によって示される可変重鎖CDR3配列を含む可変重鎖、ならびに
配列番号:53によって示される可変軽鎖CDR1配列、配列番号:54によって示される可変軽鎖CDR2配列、および配列番号:55によって示される可変軽鎖CDR3配列を含む可変軽鎖、または
g.配列番号:66によって示される可変重鎖CDR1配列、配列番号:67によって示される可変重鎖CDR2配列、および配列番号:68によって示される可変重鎖CDR3配列を含む可変重鎖、ならびに
配列番号:63によって示される可変軽鎖CDR1配列、配列番号:64によって示される可変軽鎖CDR2配列、および配列番号:65によって示される可変軽鎖CDR3配列を含む可変軽鎖、または
h.配列番号:76によって示される可変重鎖CDR1配列、配列番号:77によって示される可変重鎖CDR2配列、および配列番号:78によって示される可変重鎖CDR3配列を含む可変重鎖、ならびに
配列番号:73によって示される可変軽鎖CDR1配列、配列番号:74によって示される可変軽鎖CDR2配列、および配列番号:75によって示される可変軽鎖CDR3配列を含む可変軽鎖、または
i.配列番号:86によって示される可変重鎖CDR1配列、配列番号:87によって示される可変重鎖CDR2配列、および配列番号:88によって示される可変重鎖CDR3配列を含む可変重鎖、ならびに
配列番号:83によって示される可変軽鎖CDR1配列、配列番号:84によって示される可変軽鎖CDR2配列、および配列番号:85によって示される可変軽鎖CDR3配列を含む可変軽鎖、または
j.配列番号:96によって示される可変重鎖CDR1配列、配列番号:97によって示される可変重鎖CDR2配列、および配列番号:98によって示される可変重鎖CDR3配列を含む可変重鎖、ならびに
配列番号:93によって示される可変軽鎖CDR1配列、配列番号:94によって示される可変軽鎖CDR2配列、および配列番号:95によって示される可変軽鎖CDR3配列を含む可変軽鎖、または
k.配列番号:106によって示される可変重鎖CDR1配列、配列番号:107によって示される可変重鎖CDR2配列、および配列番号:108によって示される可変重鎖CDR3配列を含む可変重鎖、ならびに
配列番号:103によって示される可変軽鎖CDR1配列、配列番号:104によって示される可変軽鎖CDR2配列、および配列番号:105によって示される可変軽鎖CDR3配列を含む可変軽鎖、または
l.配列番号:116によって示される可変重鎖CDR1配列、配列番号:117によって示される可変重鎖CDR2配列、および配列番号:118によって示される可変重鎖CDR3配列を含む可変重鎖、ならびに
配列番号:113によって示される可変軽鎖CDR1配列、配列番号:114によって示される可変軽鎖CDR2配列、および配列番号:115によって示される可変軽鎖CDR3配列を含む可変軽鎖
を含む、実施形態1〜4のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
配列番号:3によって示される可変軽鎖CDR1配列、配列番号:4によって示される可変軽鎖CDR2配列、および配列番号:5によって示される可変軽鎖CDR3配列を含む可変軽鎖、または
b.配列番号:16によって示される可変重鎖CDR1配列、配列番号:17によって示される可変重鎖CDR2配列、および配列番号:18によって示される可変重鎖CDR3配列を含む可変重鎖、ならびに
配列番号:13によって示される可変軽鎖CDR1配列、配列番号:14によって示される可変軽鎖CDR2配列、および配列番号:15によって示される可変軽鎖CDR3配列を含む可変軽鎖、または
c.配列番号:26によって示される可変重鎖CDR1配列、配列番号:27によって示される可変重鎖CDR2配列、および配列番号:28によって示される可変重鎖CDR3配列を含む可変重鎖、ならびに
配列番号:23によって示される可変軽鎖CDR1配列、配列番号:24によって示される可変軽鎖CDR2配列、および配列番号:25によって示される可変軽鎖CDR3配列を含む可変軽鎖、または
d.配列番号:36によって示される可変重鎖CDR1配列、配列番号:37によって示される可変重鎖CDR2配列、および配列番号:38によって示される可変重鎖CDR3配列を含む可変重鎖、ならびに
配列番号:33によって示される可変軽鎖CDR1配列、配列番号:34によって示される可変軽鎖CDR2配列、および配列番号:35によって示される可変軽鎖CDR3配列を含む可変軽鎖、または
e.配列番号:46によって示される可変重鎖CDR1配列、配列番号:47によって示される可変重鎖CDR2配列、および配列番号:48によって示される可変重鎖CDR3配列を含む可変重鎖、ならびに
配列番号:43によって示される可変軽鎖CDR1配列、配列番号:44によって示される可変軽鎖CDR2配列、および配列番号:45によって示される可変軽鎖CDR3配列を含む可変軽鎖、または
f.配列番号:56によって示される可変重鎖CDR1配列、配列番号:57によって示される可変重鎖CDR2配列、および配列番号:58によって示される可変重鎖CDR3配列を含む可変重鎖、ならびに
配列番号:53によって示される可変軽鎖CDR1配列、配列番号:54によって示される可変軽鎖CDR2配列、および配列番号:55によって示される可変軽鎖CDR3配列を含む可変軽鎖、または
g.配列番号:66によって示される可変重鎖CDR1配列、配列番号:67によって示される可変重鎖CDR2配列、および配列番号:68によって示される可変重鎖CDR3配列を含む可変重鎖、ならびに
配列番号:63によって示される可変軽鎖CDR1配列、配列番号:64によって示される可変軽鎖CDR2配列、および配列番号:65によって示される可変軽鎖CDR3配列を含む可変軽鎖、または
h.配列番号:76によって示される可変重鎖CDR1配列、配列番号:77によって示される可変重鎖CDR2配列、および配列番号:78によって示される可変重鎖CDR3配列を含む可変重鎖、ならびに
配列番号:73によって示される可変軽鎖CDR1配列、配列番号:74によって示される可変軽鎖CDR2配列、および配列番号:75によって示される可変軽鎖CDR3配列を含む可変軽鎖、または
i.配列番号:86によって示される可変重鎖CDR1配列、配列番号:87によって示される可変重鎖CDR2配列、および配列番号:88によって示される可変重鎖CDR3配列を含む可変重鎖、ならびに
配列番号:83によって示される可変軽鎖CDR1配列、配列番号:84によって示される可変軽鎖CDR2配列、および配列番号:85によって示される可変軽鎖CDR3配列を含む可変軽鎖、または
j.配列番号:96によって示される可変重鎖CDR1配列、配列番号:97によって示される可変重鎖CDR2配列、および配列番号:98によって示される可変重鎖CDR3配列を含む可変重鎖、ならびに
配列番号:93によって示される可変軽鎖CDR1配列、配列番号:94によって示される可変軽鎖CDR2配列、および配列番号:95によって示される可変軽鎖CDR3配列を含む可変軽鎖、または
k.配列番号:106によって示される可変重鎖CDR1配列、配列番号:107によって示される可変重鎖CDR2配列、および配列番号:108によって示される可変重鎖CDR3配列を含む可変重鎖、ならびに
配列番号:103によって示される可変軽鎖CDR1配列、配列番号:104によって示される可変軽鎖CDR2配列、および配列番号:105によって示される可変軽鎖CDR3配列を含む可変軽鎖、または
l.配列番号:116によって示される可変重鎖CDR1配列、配列番号:117によって示される可変重鎖CDR2配列、および配列番号:118によって示される可変重鎖CDR3配列を含む可変重鎖、ならびに
配列番号:113によって示される可変軽鎖CDR1配列、配列番号:114によって示される可変軽鎖CDR2配列、および配列番号:115によって示される可変軽鎖CDR3配列を含む可変軽鎖
を含む、実施形態1〜4のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
6.a.配列番号:10によって示される可変重鎖配列、および配列番号:9によって示される可変軽鎖配列、または
b.配列番号:20によって示される可変重鎖配列、および配列番号:19によって示される可変軽鎖配列、または
c.配列番号:30によって示される可変重鎖配列、および配列番号:29によって示される可変軽鎖配列、または
d.配列番号:40によって示される可変重鎖配列、および配列番号:39によって示される可変軽鎖配列、または
e.配列番号:50によって示される可変重鎖配列、および配列番号:49によって示される可変軽鎖配列、または
f.配列番号:60によって示される可変重鎖配列、および配列番号:59によって示される可変軽鎖配列、または
g.配列番号:70によって示される可変重鎖配列、および配列番号:69によって示される可変軽鎖配列、または
h.配列番号:80によって示される可変重鎖配列、および配列番号:79によって示される可変軽鎖配列、または
i.配列番号:90によって示される可変重鎖配列、および配列番号:89によって示される可変軽鎖配列、または
j.配列番号:100によって示される可変重鎖配列、および配列番号:99によって示される可変軽鎖配列、または
k.配列番号:110によって示される可変重鎖配列、および配列番号:109によって示される可変軽鎖配列、または
l.配列番号:120によって示される可変重鎖配列、および配列番号:119によって示される可変軽鎖配列
を含む、実施形態1〜5のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
b.配列番号:20によって示される可変重鎖配列、および配列番号:19によって示される可変軽鎖配列、または
c.配列番号:30によって示される可変重鎖配列、および配列番号:29によって示される可変軽鎖配列、または
d.配列番号:40によって示される可変重鎖配列、および配列番号:39によって示される可変軽鎖配列、または
e.配列番号:50によって示される可変重鎖配列、および配列番号:49によって示される可変軽鎖配列、または
f.配列番号:60によって示される可変重鎖配列、および配列番号:59によって示される可変軽鎖配列、または
g.配列番号:70によって示される可変重鎖配列、および配列番号:69によって示される可変軽鎖配列、または
h.配列番号:80によって示される可変重鎖配列、および配列番号:79によって示される可変軽鎖配列、または
i.配列番号:90によって示される可変重鎖配列、および配列番号:89によって示される可変軽鎖配列、または
j.配列番号:100によって示される可変重鎖配列、および配列番号:99によって示される可変軽鎖配列、または
k.配列番号:110によって示される可変重鎖配列、および配列番号:109によって示される可変軽鎖配列、または
l.配列番号:120によって示される可変重鎖配列、および配列番号:119によって示される可変軽鎖配列
を含む、実施形態1〜5のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
7.IgG抗体である、実施形態1〜6のいずれか一項に記載の抗体。
8.a.配列番号:2によって示される重鎖配列、および配列番号:1によって示される軽鎖配列、または
b.配列番号:12によって示される重鎖配列、および配列番号:11によって示される軽鎖配列、または
c.配列番号:22によって示される重鎖配列、および配列番号:21によって示される軽鎖配列、または
d.配列番号:32によって示される重鎖配列、および配列番号:31によって示される軽鎖配列、または
e.配列番号:42によって示される重鎖配列、および配列番号:41によって示される軽鎖配列、または
f.配列番号:52によって示される重鎖配列、および配列番号:51によって示される軽鎖配列、または
g.配列番号:62によって示される重鎖配列、および配列番号:61によって示される軽鎖配列、または
h.配列番号:72によって示される重鎖配列、および配列番号:71によって示される軽鎖配列、または
i.配列番号:82によって示される重鎖配列、および配列番号:81によって示される軽鎖配列、または
j.配列番号:92によって示される重鎖配列、および配列番号:91によって示される軽鎖配列、または
k.配列番号:102によって示される重鎖配列、および配列番号:101によって示される軽鎖配列、または
l.配列番号:112によって示される重鎖配列、および配列番号:111によって示される軽鎖配列、または
m.配列番号:213によって示される重鎖配列、および配列番号:1によって示される軽鎖配列
を含む、実施形態1〜7のいずれか一項に記載の抗体。
b.配列番号:12によって示される重鎖配列、および配列番号:11によって示される軽鎖配列、または
c.配列番号:22によって示される重鎖配列、および配列番号:21によって示される軽鎖配列、または
d.配列番号:32によって示される重鎖配列、および配列番号:31によって示される軽鎖配列、または
e.配列番号:42によって示される重鎖配列、および配列番号:41によって示される軽鎖配列、または
f.配列番号:52によって示される重鎖配列、および配列番号:51によって示される軽鎖配列、または
g.配列番号:62によって示される重鎖配列、および配列番号:61によって示される軽鎖配列、または
h.配列番号:72によって示される重鎖配列、および配列番号:71によって示される軽鎖配列、または
i.配列番号:82によって示される重鎖配列、および配列番号:81によって示される軽鎖配列、または
j.配列番号:92によって示される重鎖配列、および配列番号:91によって示される軽鎖配列、または
k.配列番号:102によって示される重鎖配列、および配列番号:101によって示される軽鎖配列、または
l.配列番号:112によって示される重鎖配列、および配列番号:111によって示される軽鎖配列、または
m.配列番号:213によって示される重鎖配列、および配列番号:1によって示される軽鎖配列
を含む、実施形態1〜7のいずれか一項に記載の抗体。
9.scFv、Fab、Fab’断片またはF(ab’)2断片である、実施形態1〜8のいずれか一項に記載の抗原結合断片。
10.モノクローナル抗体またはその抗原結合断片である、実施形態1〜9のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合断片。
11.ヒト、ヒト化またはキメラ抗体または抗原結合断片である、実施形態1〜10のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合断片。
12.実施形態1〜11に記載の抗体またはその抗原結合断片を含む、抗体−薬物複合体。
13.実施形態1〜11に記載の抗体または抗原結合断片をコードする、単離された核酸配列。
14.実施形態13に記載の核酸配列を含む、ベクター。
15.実施形態1〜11のいずれか一項に記載の抗体もしくは抗原結合断片を発現し、ならびに/または実施形態13に記載の核酸もしくは実施形態14に記載のベクターを含む、単離された細胞
16.前記細胞が原核細胞または真核細胞である、実施形態15に記載の単離された細胞。
16.前記細胞が原核細胞または真核細胞である、実施形態15に記載の単離された細胞。
17.実施形態1〜11のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合断片を生産する方法であって、実施形態16に記載の細胞を培養すること、および前記抗体または抗原結合断片を精製することを含む、方法。
18.医薬として使用するための、実施形態1〜11に記載の抗体もしくは抗原結合断片または実施形態12に記載の抗体−薬物複合体。
19.診断剤として使用するための、実施形態1〜11に記載の抗体または抗原結合断片。
20.癌の治療に使用するための、実施形態1〜11に記載の抗体もしくは抗原結合断片または実施形態12に記載の抗体−薬物複合体。
21.実施形態1〜11に記載の抗体もしくは抗原結合断片または実施形態12に記載の抗体−薬物複合体を含む、医薬組成物。
22.実施形態21に記載の医薬組成物と、1つ以上の治療的に活性な化合物との組み合わせ。
23.TWEAKRの望ましくない存在に関連する障害または症状を治療するための方法であって、有効量の実施形態21に記載の医薬組成物または実施形態22に記載の組み合わせを、該治療を必要とする被験体に投与することを含む、方法。
以下の実施例によって、本発明をさらに説明する。実施例は、特定の実施形態を参照することによって本発明を例証するためだけに提供されるものである。これらの例示は、本発明の特定の具体的態様を例証しているが、限定を表すものではなく、開示される本発明の範囲を限定するものでもない。
詳細に記載されている場合を除いて、当業者に周知のルーチンな標準技術を使用して、すべての実施例を行った。以下の実施例のルーチンな分子生物学技術は、Sambrook et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,2nd Ed.;Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,1989などの標準的な実験マニュアルに記載されているように行うことができる。
[実施例]
[実施例1]Dyax抗体ライブラリーからの抗体の作製
完全ヒト抗体ファージディスプレイライブラリー(Hoet RM et al,Nat Biotechnol 2005;23(3):344−8)を使用して、固定化標的としてヒトおよびマウスTWEAKRの二量体Fc融合細胞外ドメインを用いるタンパク質パンニング(Hoogenboom H.R.,Nat Biotechnol 2005;23(3):1105−16)によって、本発明のTWEAKR特異的ヒトモノクローナル抗体を単離した。
[実施例1]Dyax抗体ライブラリーからの抗体の作製
完全ヒト抗体ファージディスプレイライブラリー(Hoet RM et al,Nat Biotechnol 2005;23(3):344−8)を使用して、固定化標的としてヒトおよびマウスTWEAKRの二量体Fc融合細胞外ドメインを用いるタンパク質パンニング(Hoogenboom H.R.,Nat Biotechnol 2005;23(3):1105−16)によって、本発明のTWEAKR特異的ヒトモノクローナル抗体を単離した。
製造業者の説明書にしたがって、約2倍モル過剰のビオチン−LC−NHS(Pierce;Cat.No.21347)を使用して、抗原をビオチン化し、Zeba脱塩カラム(Pierce;Cat.No.89889)を使用して脱塩した。洗浄した磁気ビーズ(Dynabeads)を200nMのビオチン化ヒト抗原と共に4℃、o/nでインキュベートし、ブロッキング緩衝液(3%BSA、0.05%Tween−20を含むPBS)を用いて4℃で1時間ブロッキングした。ブロッキングしたFabファージライブラリーを、ブロッキングしたTWEAKRビーズ(Dynabeads streptavidin M280−Invitrogen 112−06D)に追加し、室温で30分間インキュベートした。ストリンジェントな洗浄(ブロッキング緩衝液で3回、および0.05%Tween−20を含むPBS(150mM NaCl;8mM Na2HPO4;1.5mM KH2PO4;pH=7.4〜7.6に調整)で9回)の後、ビオチン化TWEAKRビーズ(Dynabeads streptavidin M280−Invitrogen 112−06D)に特異的に結合しているFabファージをPBSに再懸濁し、増幅のために大腸菌株TG1の感染に直接使用した。選択ラウンドでは、交差反応性結合体を選択するために、2つのマウスTWEAKR(200nM)を使用し、選択ラウンドでは、高親和性結合体の選択圧を増大させるために、3つの濃度のヒトTWEAKRを減少させた(100nM)。
11個の異なるFabファージを同定し、対応する抗体を哺乳動物IgG発現ベクター(これは、可溶性Fabに存在しないミッシングCH2−CH3ドメインを提供する)に再クローニングした。Tom et al.,Chapter 12 in Methods Express:Expression Systems edited by Micheal R.Dyson and Yves Durocher,Scion Publishing Ltd,2007に記載されている哺乳動物細胞において、得られたIgGを一過性発現させた。簡潔に言えば、CMVプロモーターベースの発現プラスミドをHEK293−6E細胞にトランスフェクトし、フェルンバッハフラスコまたはウェーブバッグ中でインキュベートした。F17培地(Invitrogen)中で、発現を37℃で5〜6日間行った。トランスフェクションの24時間後に、1%Ultra−Low IgG FCS(Invitrogen)および0.5mMバルプロ酸(Sigma)を補充した。実施例2に記載されているように、プロテインAクロマトグラフィーによって抗体を精製し、ELISAおよびBIAcore分析において、可溶性単量体TWEAKRに対する結合親和性をさらに特性評価した。
抗TWEAKR抗体の細胞結合特性を決定するために、細胞株(HT29、HS68、HS578)のパネルに対するフローサイトメトリーによって、結合を試験した。FACS緩衝液による抗体(5μg/ml)希釈物に細胞を懸濁し、氷上で1時間インキュベートした。その後、二次抗体(PEヤギ抗ヒトIgG、Dianova #109−115−098)を追加した。氷上で1時間インキュベートした後、FACSアレイ(BD Biosciences)を使用してフローサイトメトリーによって、細胞を分析した。
NF−κBレポーター遺伝子アッセイを実施して、11個の同定された抗体(ヒトIgG1)すべてのアゴニスト活性を評価した。製造業者の説明書にしたがって293フェクチンを使用して、NF−κBレポーター構築物(BioCat,cat.No.LR−0051−PA)でHEK293細胞を一過性トランスフェクトした。F17培地(無血清;Invitrogen)中、37℃、5%CO2で、トランスフェクトした細胞をポリリシンコーティング白色384ウェルプレート(BD)に播種した。翌日、様々な濃度の精製抗体で細胞を6時間刺激し、続いて、標準的な手順にしたがってルシフェラーゼアッセイを行った。
インターナリゼーションの後に、抗TWEAKR抗体(CypHer 5EモノNHSエステル;GE Healthcare)の蛍光標識を行う。処理前に、HT29細胞(2×104個/ウェル)を96−MTPプレート(fat,black,clear bottom No 4308776,Applied Biosystems)中の培地100μlに播種した。37℃/5%CO2で18時間インキュベートした後、培地(表番号21)を交換し、標識抗TWEAKR抗体を様々な濃度(10、5、2.5、1、0.1μg/ml)で追加した。選択したインキュベーション時間は、0、0.25、0.5、1、1.5、2、3、6および24時間であった。InCell analyzer 1000(GE Healthcare)を用いて、蛍光測定を実施した。
さらなる効力および親和性の成熟のために、最も強力なインビトロ有効性を有する抗体(TPP−883)を選択した。
TPP−883の軽鎖(配列番号:71)および重鎖(配列番号:72)のアミノ酸配列;重鎖および軽鎖の両方のCDRには下線が付されている。
1回目の突然変異収集ラウンドを行い、続いて、親和性および効力が最も増加したアミノ酸変化の組換えによって、成熟を行った。突然変異収集では、NNKコドン多様化を含む合成オリゴヌクレオチドを使用して部位特異的変異誘発によって、以下の個々のアミノ酸位置におけるNNK(N=AGCT、K=GまたはT)ランダム化を行った(連続するアミノ酸の命名、図25を比較):CDR−L1のS35、S36、Y37およびN39;CDR−L2のA51、S53、S54、Q56およびS57;CDR−L3のS92、Y93、S94、S95、G97およびI98;CDR−H1のP31、Y32、P33、M34およびM35;CDR−H2のY50、S52、P53、S54、G56、K57およびH59;CDR−H3のG99、G100、D101、G102、Y103、F104、D105およびY106。すべての単一NNK飽和突然変異誘発ライブラリーのDNAを、それぞれ、効力成熟の場合には哺乳動物IgG発現ベクターに再クローニングし、親和性成熟の場合にはファージミドベクターに再クローニングした。ファージパニングによって、親和性成熟を行った。洗浄した磁気ビーズ(Dynabeads)を10nM、1nM、100pMおよび10pMのビオチン化ヒト抗原と共に4℃、o/nでインキュベートし、ブロッキング緩衝液(3%BSA、0.05%Tween−20を含むPBS)を用いて4℃で1時間ブロッキングした。ブロッキングしたFabファージライブラリーを、理論上のライブラリー複雑性と比較して10000倍、1000倍および100倍過剰で、ブロッキングしたTWEAKR−Dynabeadsに追加し、室温で30分間インキュベートした。したがって、全部で12の戦略にしたがった(4つの抗原濃度×3つのFabファージ力価)。ストリンジェントな洗浄(ブロッキング緩衝液で3回、および0.05%Tween−20を含むPBSで9回)の後、ビオチン化TWEAKR−Dynabeads(Dynabeads streptavidin M280−Invitrogen 112−06D)に特異的に結合しているFabファージをPBSに再懸濁し、増幅のために大腸菌株TG1の感染に直接使用した。選択ラウンドでは、2つの濃度のヒトTWEAKR−Fcを減少させ(1nM、100pM、10pMおよび1pM)、同じFabファージの力価を12の戦略すべてに使用した(4.4×1011)。可溶性Fab発現のために、制限エンドヌクレアーゼMluIでファージミドベクターを消化して、Fabをファージ上にディスプレイするのに必要なgeneIII膜アンカー配列を除去し、再ライゲーションした。12個の各選択プールの96個の変異体を可溶性Fabとして発現させ、ELISAフォーマットで試験した。したがって、2.5nMのビオチン化TWEAKR−Fc抗原をコーティングし、抗c−Myc抗体(Abcam ab62928)によって、可溶性Fabの結合を検出した。TWEAKR−Fc(配列番号:138)に対する結合が改善された7個の単一置換変異体(連続するアミノ酸の命名、図25を比較)が検出された:CDR−L1のS36G、CDR−L2のA51QおよびS57K、CDR−L3のS94TおよびG97F、CDR−H1のM35IならびにCDR−H3のG102T。効力成熟のために、NF−κBレポーター(BioCat,cat.No.LR−0051−PA)でHEK293細胞をトランスフェクトした。F17培地(無血清;Invitrogen)中で、トランスフェクトした細胞をポリリシンコーティング白色384ウェルプレート(BD)に播種し、哺乳動物細胞において、NNK多様化位置抗体(ヒトIgG1)ライブラリーの個々の変異体を一過性発現させた。翌日、発現させた単一NNK突然変異誘発抗体変異体でNF−κBレポーター細胞を6時間刺激し、続いて、標準的な手順にしたがってルシフェラーゼアッセイを行った。アゴニスト活性が改善された1個の単一置換変異体が検出された:CDR−H3のG102T。この変異体は、親和性成熟からも得られ、最も大きな親和性増強を示した。突然変異収集の後、親和性および効力のスクリーニングによって、1個の組換えライブラリーにおいて、7個の有益な単一置換すべてを組換えた(ライブラリーの複雑性:128個の変異体)。この目的のために、オリゴヌクレオチドを合成して、選択した突然変異または対応する野生型アミノ酸を各選択位置に導入した。連続ラウンドのオーバーラップ伸長PCRを使用して、ライブラリー構築を実施した。最終PCR産物を細菌可溶性Fab発現ベクターにライゲーションし、前記のように、可溶性Fabを用いる平衡ELISAスクリーニングのために、528個の変異体をランダムに選択した(約4倍のオーバーサンプリング)。最終的に、最良の単一置換変異体G102Tと比較して増強した親和性に基づいて、7個の変異体を選択した。これらの対応するDNAを哺乳動物IgG発現ベクターに再クローニングし、上記NF−κBレポーター細胞アッセイにおいて、機能活性について試験した。最後に、得られた配列をヒト生殖系列配列と比較し、親和性および効力に対して有意な影響を伴わない偏差を調整した。抗体ライブラリースクリーニングによって、ならびに親和性および/または効力の成熟によって、以下の配列を有する抗体を得た:
TPP−2090
配列番号:1
TPP−2090
配列番号:1
TPP−2090の軽鎖(配列番号:1)および重鎖(配列番号:2)のアミノ酸配列;重鎖および軽鎖の両方のCDRには下線が付されている。
TPP−2149の軽鎖(配列番号:11)および重鎖(配列番号:12)のアミノ酸配列;重鎖および軽鎖の両方のCDRには下線が付されている。
TPP−2093の軽鎖(配列番号:21)および重鎖(配列番号:22)のアミノ酸配列;重鎖および軽鎖の両方のCDRには下線が付されている。
TPP−2148の軽鎖(配列番号:31)および重鎖(配列番号:32)のアミノ酸配列;重鎖および軽鎖の両方のCDRには下線が付されている。
TPP−2084の軽鎖(配列番号:41)および重鎖(配列番号:42)のアミノ酸配列;重鎖および軽鎖の両方のCDRには下線が付されている。
TPP−2077の軽鎖(配列番号:51)および重鎖(配列番号:52)のアミノ酸配列;重鎖および軽鎖の両方のCDRには下線が付されている。
TPP−1538の軽鎖(配列番号:61)および重鎖(配列番号:62)のアミノ酸配列;重鎖および軽鎖の両方のCDRには下線が付されている。
TPP−1854の軽鎖(配列番号:81)および重鎖(配列番号:82)のアミノ酸配列;重鎖および軽鎖の両方のCDRには下線が付されている。
TPP−1853の軽鎖(配列番号:91)および重鎖(配列番号:92)のアミノ酸配列;重鎖および軽鎖の両方のCDRには下線が付されている。
TPP−1857の軽鎖(配列番号:101)および重鎖(配列番号:102)のアミノ酸配列;重鎖および軽鎖の両方のCDRには下線が付されている。
TPP−1858の軽鎖(配列番号:111)および重鎖(配列番号:112)のアミノ酸配列;重鎖および軽鎖の両方のCDRには下線が付されている。
[実施例2]抗体の生化学的特性
Biacore分析による結合親和性の決定:
Biacore T100機器(GE Healthcare Biacore,Inc.)による表面プラズモン共鳴分析によって、抗TWEAKR抗体の結合親和性を決定した。間接カップリング試薬の抗ヒトIgG(Fc)によって、抗体をCM5センサーチップ上に固定化した。製造業者が説明しているように、「ヒト抗体捕捉キット」(BR−1008−39,GE Healthcare Biacore,Inc.)の試薬を使用した。抗TWEAKR抗体を濃度10μg/ml、10μl/分で10秒間注入した。
Biacore分析による結合親和性の決定:
Biacore T100機器(GE Healthcare Biacore,Inc.)による表面プラズモン共鳴分析によって、抗TWEAKR抗体の結合親和性を決定した。間接カップリング試薬の抗ヒトIgG(Fc)によって、抗体をCM5センサーチップ上に固定化した。製造業者が説明しているように、「ヒト抗体捕捉キット」(BR−1008−39,GE Healthcare Biacore,Inc.)の試薬を使用した。抗TWEAKR抗体を濃度10μg/ml、10μl/分で10秒間注入した。
様々な濃度(200nM、100nM、50nM、25nM、12.5nM、6.25nM、3.12nM、1.56nM)の精製組換えヒトTWEAKRタンパク質(TPP−2305、配列番号:168)を、HEPES−EP緩衝液(GE Healthcare Biacore,Inc.)によって固定化抗TWEAKR抗体に対して流速60μl/分で3分間注入し、5分間解離させた。インライン参照セル補正とそれに続くバッファサンプル控除の後に、センサーグラムを作成した。一次1:1結合モデルを用いてセンサーグラムをフィッティングすることによって得られた、会合速度定数(kon)と解離速度定数(koff)との比に基づいて、解離平衡定数(KD)を計算した。
本発明の抗体は、中程度の親和性(KD10〜200nM)でTWEAKRに結合するのに対して、比較に使用したいくつかの抗体(例えば、PDL−192(TPP−1104)、136.1(TPP−2194)、18.3.3(TPP−2193)、P4A8(TPP−1324)、P3G5(TPP−2195)、P2D3(TPP−2196)、ITEM−1、ITEM−4)は、高い親和性結合(0.7〜3.7nM)を示すと決定された。抗体PDL−192、136.1、18.3.3、P4A8、P3G5およびP2D3の可変ドメインの配列は、国際公開第2009/020933号および国際公開第2009/140177号から入手し、ヒトIgG1およびマウスIgG2の定常領域をコードする配列を追加して、全長IgG PDL−192(TPP−1104)、136.1(TPP−2194)、18.3.3(TPP−2193)、P4A8(TPP−1324)、P3G5(TPP−2195)、P2D3(TPP−2196)を得た。以前に記載されている他の抗体について本研究で測定した親和性の範囲は、公開されているデータとよく一致している:PDL−192、18.3.3および136.1については、5.5、0.2および0.7nMのKD値が公開された(国際公開第2009/020933号);P4A8については、2.6nM(国際公開第2009/140177号)。比較のために、ネイティブリガンドTWEAKは、0.8〜2.4nMのKD値でTWEAKRに結合する(Immunity.2001 Nov;15(5):837−46;Biochem J.2006 Jul 15;397(2):297−304;Arterioscler Thromb Vasc Biol.2003 Apr 1;23(4):594−600)。
その結果、本発明の抗体(TPP−883、TPP−1538、TPP−2077、TPP−2084、TPP−2148、TPP−2093、TPP−2149およびTPP−2090)は、中程度の親和性(KD10〜200nM)でTWEAKRに結合する。
Biacore分析による種交差反応性の分析:
種交差反応性の分析のために、ヒト、ラット、マウス、イヌ、ブタおよびカニクイザルのTWEAKRを発現させ、ヒトFc断片融合タンパク質として精製し、標準的なEDC/NHS媒介化学反応(BR−1006−33,GE Healthcare Biacore,Inc.)によるアミンカップリングを使用してCM5センサーチップ上に固定化した。
種交差反応性の分析のために、ヒト、ラット、マウス、イヌ、ブタおよびカニクイザルのTWEAKRを発現させ、ヒトFc断片融合タンパク質として精製し、標準的なEDC/NHS媒介化学反応(BR−1006−33,GE Healthcare Biacore,Inc.)によるアミンカップリングを使用してCM5センサーチップ上に固定化した。
様々な濃度(200nM、100nM、50nM、25nM、12.5nM、6.25nM、3.12nM、1.56nM)の抗TWEAKR抗体を、HEPES−EP緩衝液(GE Healthcare Biacore,Inc.)によって固定化抗TWEAKR種に対して流速60μl/分で3分間注入し、5分間解離させた。インライン参照セル補正とそれに続くバッファサンプル控除の後に、センサーグラムを作成した。Biavaluationソフトウェア(バージョン4.0)を使用する二価分析物モデルを用いてセンサーグラムをフィッティングすることによって得られた、会合速度定数(kon1)と解離速度定数(koff1)との比に基づいて、解離平衡定数(KD)を計算した。固定化二価抗原を用いて「アビディティモード」(これは、「絶対」KD値を提供するものではないが、優れた比較データが得られる)で、抗TWEAKR抗体の種交差反応性を決定した。
その結果、本発明の抗体(TPP−1538、TPP−2077、TPP−2084およびTPP−2090)は、試験したすべての種(ヒト、ラット、マウス、イヌ、ブタおよびカニクイザルのTWEAKR)に対して親和性を示す。
TWEAKR外部ドメインのN末端およびC末端短縮型変異体によるTPP−2090の結合エピトープの特性評価:
様々な種のTWEAKRシステインリッチドメイン(aa34〜68)のアライメント(図1)は、分析した6つの種すべてを通して、それがよく保存されていることを示している。PDL−192は、R56依存的に結合するので(国際公開第2009/020933号:図2B)、ラット、ブタおよびマウスのTWEAKRに結合しない。TPP−2090は、保存されたアミノ酸D47依存的に結合するので、示されているすべての種に結合する。
様々な種のTWEAKRシステインリッチドメイン(aa34〜68)のアライメント(図1)は、分析した6つの種すべてを通して、それがよく保存されていることを示している。PDL−192は、R56依存的に結合するので(国際公開第2009/020933号:図2B)、ラット、ブタおよびマウスのTWEAKRに結合しない。TPP−2090は、保存されたアミノ酸D47依存的に結合するので、示されているすべての種に結合する。
上記抗体の結合エピトープを特性評価するための第1のアプローチでは、TWEAKR外部ドメインのN末端およびC末端切断短縮型突然変異体を作製し、様々な抗TWEAKR抗体に対する結合能について試験した。N末端においてアミノ酸28〜33が検出され、C末端においてアミノ酸69〜80が検出されたことから、Cys36−Cys49、Cys52−Cys67およびCys55−Cys64のジスルフィド架橋を有するシステインリッチドメインは依然としてインタクトであった(図2を比較)。両構築物(N末端およびC末端を含む全外部ドメイン28〜80、ならびに短縮型外部ドメイン34〜68)を発現させ、それぞれFc融合タンパク質TPP−2202およびTPP−2203として精製した。
結合を分析するために、1μg/mlの各二量体TWEAKR−Fc構築物をコーティングし、0.3μg/mlおよび0.08μg/mlのビオチン化IgGを可溶性結合パートナーとして使用した。ストレプトアビジン−HRPおよびAmplex−Red基質を用いて、検出を行った。製造業者の説明書にしたがって、約2倍モル過剰のビオチン−LC−NHS(Pierce;Cat.No.21347)を使用して、IgGをビオチン化し、Zeba脱塩カラム(Pierce;Cat.No.89889)を使用して脱塩した。可溶性リガンドの適用濃度すべてにおいて、本発明の抗体は、両構築物に対する飽和的な結合を示すのに対して、抗体P4A8(TPP−1324)、P3G5(TPP−2195)およびITEM−4は、全長外部ドメインに対してのみ飽和的な結合を示し、N末端およびC末端短縮型構築物に対する結合障害を示す(図3および図4)。これは、本発明の抗体の結合エピトープが、アミノ酸34〜68のシステインリッチドメイン内に位置することを示している。TWEAKR外部ドメインのN末端またはC末端がP4A8(TPP−1324)およびP3G5(TPP−2195)結合に必要であるかを分析するために、C末端のアミノ酸69〜80が欠失した単量体外部ドメインを作製した。C末端短縮型TWEAKR外部ドメインに対するP4A8(TPP−1324)およびP3G5(TPP−2195)の結合も障害されているのに対して、本発明の抗体は、飽和的な結合を示す(図5)。
したがって、TPP−2090、TPP−2084、PDL−192(TPP−1104)および136.1(TPP−2194)の結合エピトープは、システインリッチドメイン内に位置し、P4A8(TPP−1324)およびP3G5(TPP−2195)の結合エピトープは、システインリッチドメインの外側に少なくとも部分的に位置する。
抗体親和性に対するTWEAKR−Fc変異タンパク質の効果:
本発明の抗体の結合特性をより詳細に規定するために、公知のアゴニスト抗体の結合に適切であると提案されている特定のTWEAKR変異タンパク質を試験した(国際公開第2009/140177号)。したがって、以下の単一アミノ酸置換を有する全外部ドメイン(アミノ酸28−80)を発現させ、Fc融合タンパク質として精製した:T33Q;S40R;W42A;M50A;R56P;H60K;L65Q。
本発明の抗体の結合特性をより詳細に規定するために、公知のアゴニスト抗体の結合に適切であると提案されている特定のTWEAKR変異タンパク質を試験した(国際公開第2009/140177号)。したがって、以下の単一アミノ酸置換を有する全外部ドメイン(アミノ酸28−80)を発現させ、Fc融合タンパク質として精製した:T33Q;S40R;W42A;M50A;R56P;H60K;L65Q。
用量応答データを収集するために、様々なTWEAKR−Fc変異タンパク質を低濃度(62ng/ml)で384ウェルMaxisorb ELISAプレートにコーティングし、濃度100nMから開始する系列2倍希釈のビオチン化IgGを可溶性結合パートナーとして使用した。ストレプトアビジン−HRPおよびAmplex Redを用いて、検出を行った。試験したIgGは、本発明のTPP−2090およびTPP−2084、国際公開第2009/020933号のPDL−192、136.1および18.3.3、国際公開第2009/140177号のP4A8およびP3G5、ならびにNakayama et al[Biochem Biophys Res Com 306:819−825]のITEM−1およびITEM−4であった。
製造業者の説明書にしたがって、約2倍モル過剰のビオチン−LC−NHS(Pierce;Cat.No.21347)を使用して、IgGをビオチン化し、Zeba脱塩カラム(Pierce;Cat.No.89889)を使用して脱塩した。用量応答データをフィッティングし、IC50を決定した。結果を可視化するために、表を作成し、「−」は、IC50が50nM超であることを示し、「+」は、IC50が1〜150pMの範囲内であることを示す。
以前に公開されているように、ITEM−4は、H60K変異タンパク質に対する結合障害を示し[国際公開第2009/140177号:図23F]、PDL−192は、R56P変異タンパク質に対する結合障害を示す[国際公開第2009/020933号:図22B]。公開されているデータとは対照的に。ITEM−1は、R56Pに対する結合障害を示し、すべての抗体は、W42Aに対する結合障害を示す[国際公開第2009/140177号:図23E、図23F]。この差異は、選択した方法によって説明することができる;極めて低濃度のコーティングは、アビディティ効果を最小化するので、オフ速度障害の区別を容易にする。分析した抗体はいずれも、W42A変異タンパク質に対する結合が障害されていないので、この置換は、いくらかの構造変化を引き起こすが、結合エピトープの直接的な変化を引き起こさないと思われる。
ITEM−1、ITEM−4、PDL−192、136.1および18.3.3とは対照的に、本発明の抗体は、W42A以外のすべての置換に非依存的に結合する。
システインリッチドメインのアラニンスキャン:
本発明の抗体の結合部位を表すために、システインリッチドメイン(アミノ酸34〜68)のアラニンスキャンを実施した。図6において、TWEAKRの全長外部ドメインのN末端およびC末端短縮型変異体は、本発明の抗体の結合を障害しないことを示すことができた。したがって、結合エピトープは、システインリッチドメイン内に局在する。以下の置換をTWEAKR(34−68)−Fc構築物に導入した:S37A、R38A、S40A、S41A、W42A、S43A、D45A、D47A、K48A、D51A、S54A、R56A、R58A、P59A、H60A、S61A、D62A、F63AおよびL65A。
本発明の抗体の結合部位を表すために、システインリッチドメイン(アミノ酸34〜68)のアラニンスキャンを実施した。図6において、TWEAKRの全長外部ドメインのN末端およびC末端短縮型変異体は、本発明の抗体の結合を障害しないことを示すことができた。したがって、結合エピトープは、システインリッチドメイン内に局在する。以下の置換をTWEAKR(34−68)−Fc構築物に導入した:S37A、R38A、S40A、S41A、W42A、S43A、D45A、D47A、K48A、D51A、S54A、R56A、R58A、P59A、H60A、S61A、D62A、F63AおよびL65A。
HEK293細胞において、これらのTWEAKR(34−68)−Fc変異タンパク質を発現させた。用量応答データを収集するために、IgGを濃度1μg/mlで384ウェルMaxisorb ELISAプレートにコーティングし、TWEAKR変異タンパク質を含有する系列2倍希釈の上清を可溶性結合パートナーとして使用した。抗HIS−HRPおよびAmplex Redを用いて、検出を行った。試験したIgGは、本発明のTPP−2090、国際公開第2009/020933号のPDL−192および国際公開第2009/140177号のP4A8であった。
様々なIgGに対する結合について、各TWEAKR変異タンパク質の適切性を評価するために、特定の変異タンパク質濃度の相関ブロットを作成した。例示的に、図6において、TWEAKR発現ブロスの8倍希釈上清の相関ブロットを示す(PDL−192(TPP−1104)はX軸、TPP−2090はX軸)。前記ブロットは、TPP−2090の結合が置換D47Aによって障害され、PDL−192(TPP−1104)の結合が置換R56Aによって障害されたことを示している。すべての構築物について、P4A8(TPP−1324)に対する結合を検出することができなかったが、これは、先に得られた結果と一致している(図6)。したがって、P4A8エピトープは、システインリッチドメインの外側に少なくとも部分的に局在する。抗体相互作用に関して、特定のTWEAKRアミノ酸に対する同定された依存性は、これらの抗体について決定されたアゴニスト活性と相関する。ネイティブリガンドのTWEAKは、TWEAKRの効率的な活性化を示し、TWEAKRのシステインリッチドメインのロイシン46依存的に結合する(Pellegrini et al,FEBS 280:1818−1829)。P4A8は、非常に低いアゴニスト活性を示し、TWEAKRのシステインリッチドメインの外側のドメインと少なくとも部分的に相互作用する。PDL−192は、わずかなアゴニスト活性を示し、TWEAKリガンド部位とは反対側に、R56依存的にシステインリッチドメインに結合する。TPP−2090およびTWEAKは、それぞれD47およびL46依存的に結合するので、類似する結合部位に結合する(図7)。
すべての本発明の抗体に関する共通のエピトープの証拠を裏付けるために、さらなる抗体(すなわち、TPP−2090、TPP−2149、TPP−2093、TPP−2148、TPP−2084、TPP−2077、TPP−1538、TPP−883、TPP−1854、TPP−1853、TPP−1857、TPP−1858)を試験した。試験した抗体はすべて、TWEAKRの47位のD(D47)に特異的に結合する(図6Cを参照のこと)。やはり、PDL−192(TPP−1104)は依然として、TWEAKRのD47A変異タンパク質に結合することができる。
結論として、本発明の抗体(例えば、TPP−2090)は、D47依存的にTWEAKRに結合する。
抗体相互作用に関して、特定のTWEAKRアミノ酸に対する同定された依存性は、これらの抗体について決定されたアゴニスト活性と相関する。ネイティブリガンドのTWEAKは、TWEAKRの効率的な活性化を示し、TWEAKRのシステインリッチドメインのロイシン46依存的に結合する(Pellegrini et al,FEBS 280:1818−1829)。P4A8は、非常に低いアゴニスト活性を示し、TWEAKRのシステインリッチドメインの外側のドメインと少なくとも部分的に相互作用する。PDL−192は、わずかなアゴニスト活性を示し、TWEAKリガンド部位とは反対側に、R56依存的にシステインリッチドメインに結合する。本発明の抗体(図6Cを参照のこと)は、D47依存的に結合し、TWEAKは、L46依存的に結合し、類似するが区別可能な結合部位に結合する(図7)。したがって、強力なアゴニスト活性を示す本発明の抗体は、抗体の非常に強力なアゴニスト活性に関係する抗体に関する新規エピトープに(D47依存的に)結合する。興味深いことに、Michaelsonら(page 369,left column in Michaelson JS et al,MAbs.2011 Jul−Aug;3(4):362−75を参照のこと)は、彼らが調査したすべてのアゴニスト抗体が天然リガンドTWEAKと比較して弱いアゴニスト活性を有する理由を説明した。彼らの結論では、有効性の減少は、抗体と、TWEAKがおそらくは三量体で会合しているTWEAKRとの二量体結合相互作用に依存し得る。したがって、本発明の抗体が、TWEAKRとの二量体相互作用によって、より高いアゴニスト活性を有することは、驚くべき知見である。この驚くべき効果は、本発明の抗体の特異的結合特性に連動しているので、TWEAKRのD47に対する特異的結合に連動している。
エピトープ競合実験による本発明の抗体の特性評価:
本発明の抗体および他の公知の抗TWAEKR抗体の差異を理解するために、競合実験を実施した。Biacore T100機器(GE Healthcare Biacore,Inc.)による表面プラズモン共鳴分析によって、いくつかの抗TWEAKR抗体のオーバーラップする結合モチーフに関するこの調査を実施した。
本発明の抗体および他の公知の抗TWAEKR抗体の差異を理解するために、競合実験を実施した。Biacore T100機器(GE Healthcare Biacore,Inc.)による表面プラズモン共鳴分析によって、いくつかの抗TWEAKR抗体のオーバーラップする結合モチーフに関するこの調査を実施した。
「アミンカップリングキット」(BR−1006−33,GE Healthcare Biacore,Inc.)を使用して、すべての抗体をCM5センサーチップ上に直接固定化した。製造業者が説明しているように、試薬を使用した。抗原による第2の抗体(固定化抗体)の飽和のために、200nMのTWEAKR(TPP−2305)のHEPES−EP緩衝液(GE Healthcare Biacore,Inc.)を30μl/分で120秒間注入した。続いて、200nMの第2の抗体(「競合抗体」)のHEPES−EP緩衝液をフローセルに30μl/分で120秒間注入した。一般に、インライン参照セル補正とそれに続くサンプルバッファ控除の後に、センサーグラムを作成した。Biavaluationソフトウェア(バージョン4.0)を使用して、センサーグラムを徹底的に手動で検査することによって、定性的な競合データ(図8)を作成した。第2の抗体の注入後における第2の結合事象の欠如により、各抗体ペア内の明確な競合が示された。非競合抗体ペアは、第2の抗体の注入後に、バックグラウンドを超える明確な結合シグナルを示した。加えて、内部システム対照として、自己競合(第1の抗体および第2の抗体が同一)をモニタリングした。全体として、9対9の抗体のマトリックスがこの分析に含まれていた。
一般に、抗TWEAKR抗体を3つの異なる「競合群」(図9)にクラスタ化することができる。1つの群は、TPP−2084およびTPP−2090(これらは両方とも、試験したすべての他のメンバーとの競合を示す)のみを含有する。これらの他のメンバーを、互いにいかなる競合も示さない2つの別個の抗体セットに分けることができる。したがって、試験したすべての抗TWEAKR抗体との「完全な」競合は、TPP−2084およびTPP−2090にユニークなものである。
これは、試験した本発明の抗体が両方とも、ユニークな新規エピトープに結合するという上記知見を裏付けている。
本発明の抗体の選択性評価:
また、TNF受容体スーパーファミリーの他のメンバーに対する結合について、本発明の抗体TPP−2090を試験して、その選択性を評価した。図10に示されているように、TNF受容体スーパーファミリーは、非常に高い配列多様性を示す。TWEAKRと最も類似するのはTNFRSF13CおよびTNFRSF17であるが、配列同一性はわずか約30%である。他のTNFRSFメンバーのいずれにおいても、エピトープ領域それ自体(システインリッチドメイン)は、マッチを有しない(最高ヒットのBLAST E値=0.7)。29個の公知のTNF受容体スーパーファミリーメンバーすべての外部ドメインをFc融合タンパク質として購入し(表20)、1μg/mlをMaxisorp ELISAプレートにコーティングした。
また、TNF受容体スーパーファミリーの他のメンバーに対する結合について、本発明の抗体TPP−2090を試験して、その選択性を評価した。図10に示されているように、TNF受容体スーパーファミリーは、非常に高い配列多様性を示す。TWEAKRと最も類似するのはTNFRSF13CおよびTNFRSF17であるが、配列同一性はわずか約30%である。他のTNFRSFメンバーのいずれにおいても、エピトープ領域それ自体(システインリッチドメイン)は、マッチを有しない(最高ヒットのBLAST E値=0.7)。29個の公知のTNF受容体スーパーファミリーメンバーすべての外部ドメインをFc融合タンパク質として購入し(表20)、1μg/mlをMaxisorp ELISAプレートにコーティングした。
用量応答データを収集するために、濃度2μMから開始する系列3倍希釈のビオチン化IgGを可溶性結合パートナーとして使用した。抗hIgG1−HRPおよびAmplex Redを用いて、検出を行った。試験したIgGは、本発明のTPP−2090であった。図11に示されているように、TPP−2090は、300pMの非常に低い濃度において、TWEAKRに飽和的に既に結合しているのに対して、75nMの非常に高い濃度においても、他の28個のTNF受容体スーパーファミリーメンバーすべてに結合していない。
[実施例3]癌細胞株の細胞表面に対する抗TWEAKR抗体の結合
マウスおよびヒト癌細胞株に対する抗TWEAKR抗体の結合特性を決定するために、細胞株パネルに対してフローサイトメトリーによって、結合を試験した。CaおよびMgを含まないPBS(Biochrom #L1825:8000mg/l NaCl、200mg/l KCl、1150mg/l Na2HPO4および200mg/l KH2PO4を含有する水溶液)で接着細胞を2回洗浄し、PBSベースの酵素フリー細胞解離緩衝液(Invitrogen)によって剥離した。細胞を細胞約105個/ウェルでFACS緩衝液(Ca/Mgを含まず、3%FCSを含有するPBS、Biochrom)に懸濁した。細胞を遠心分離し(250g、5分間、4℃)し、上清を廃棄した。FACS緩衝液による目的の抗体の希釈物(特に指示がない場合には80μl中、10μg/ml)に細胞を再懸濁し、氷上で1時間インキュベートした。その後、100μlの冷FACS緩衝液で細胞を1回洗浄し、80μlの1:150希釈した二次抗体(PEヤギ抗ヒトIgG、Dianova #109−115−098またはPEヤギ抗マウスIgG、Jackson Immuno Research #115−115−164)を追加した。氷上で1時間インキュベートした後、冷FACS緩衝液で細胞を再度洗浄し、100μlのFACS緩衝液に再懸濁し、FACSアレイ(BD Biosciences)を使用してフローサイトメトリーによって分析した。目的の抗体によって検出された蛍光の幾何平均から、二次抗体のみによる検出によって測定したバックグラウンド蛍光を差し引いたものとして、結果を計算する。以下のシステムにしたがって、値をスコア化する:
幾何平均−二次抗体のみの幾何平均>10:+、>100:++、>1000:+++、10000:++++、()内のカテゴリー境界付近。細胞株の供給源を表21に示す。
マウスおよびヒト癌細胞株に対する抗TWEAKR抗体の結合特性を決定するために、細胞株パネルに対してフローサイトメトリーによって、結合を試験した。CaおよびMgを含まないPBS(Biochrom #L1825:8000mg/l NaCl、200mg/l KCl、1150mg/l Na2HPO4および200mg/l KH2PO4を含有する水溶液)で接着細胞を2回洗浄し、PBSベースの酵素フリー細胞解離緩衝液(Invitrogen)によって剥離した。細胞を細胞約105個/ウェルでFACS緩衝液(Ca/Mgを含まず、3%FCSを含有するPBS、Biochrom)に懸濁した。細胞を遠心分離し(250g、5分間、4℃)し、上清を廃棄した。FACS緩衝液による目的の抗体の希釈物(特に指示がない場合には80μl中、10μg/ml)に細胞を再懸濁し、氷上で1時間インキュベートした。その後、100μlの冷FACS緩衝液で細胞を1回洗浄し、80μlの1:150希釈した二次抗体(PEヤギ抗ヒトIgG、Dianova #109−115−098またはPEヤギ抗マウスIgG、Jackson Immuno Research #115−115−164)を追加した。氷上で1時間インキュベートした後、冷FACS緩衝液で細胞を再度洗浄し、100μlのFACS緩衝液に再懸濁し、FACSアレイ(BD Biosciences)を使用してフローサイトメトリーによって分析した。目的の抗体によって検出された蛍光の幾何平均から、二次抗体のみによる検出によって測定したバックグラウンド蛍光を差し引いたものとして、結果を計算する。以下のシステムにしたがって、値をスコア化する:
幾何平均−二次抗体のみの幾何平均>10:+、>100:++、>1000:+++、10000:++++、()内のカテゴリー境界付近。細胞株の供給源を表21に示す。
表21に示されているように、濃度10μg/mlで使用した本発明の抗TWEAKR抗体はすべて、様々な腫瘍エンティティに相当するマウス(4T1,Lewis Lung)およびヒト(表に含まれるすべての他の細胞株)起源のTWEAKRを発現する広範囲の腫瘍細胞に結合する。
(幾何平均−二次抗体のみの幾何平均>10:+、>100:++、>1000:+++、10000:++++、()内のカテゴリー境界付近)
*表21の癌細胞株の成長培地のリスト:
1.DMEM/Ham’s F12;(Biochrom;# FG 4815、安定グルタミンを含む)、10%FCS
2.RPMI 1640;(Biochrom;# FG 1215、安定グルタミンを含む)、10%FCS
3.DMEM;(Biochrom;# FG 0435、安定グルタミンを含む)、10%FCS
4.MEM Earle’s;(Biochrom;# FG 0325、安定グルタミンを含む)、10%FCS
5.DMEM;(Biochrom;# FG 0435、安定グルタミンを含む)L−アラニル−L−グルタミン;(最終4mMで2mMエキストラ,Biochrom,# K 0302)非必須アミノ酸;(最終:1×、Biochrom;# K 0293),10%FCS
6.DMEM;(Biochrom;# FG 0445、安定グルタミンを含む高グルコース),10%FCS
7.RPMI 1640;(Biochrom;# FG 1215、安定グルタミンを含む)、20%FCS
8.MEM Earle’s;(Biochrom;# F 0315)、L−アラニル−L−グルタミン;(最終:2mM、Biochrom;# K 0302)非必須アミノ酸;(最終:1×、Biochrom;# K 0293)、10%FCS
9.DMEM/Ham’s F12;(Biochrom;# FG 4815、安定グルタミンを含む)、ウマ血清(最終:2.5%);(Biochrom;# S 9135)10%FCS
10.DMEM/Ham’s F12;(Biochrom;# FG 4815、安定グルタミンを含む)、ヒドロコルチゾン;(最終:40ng/mL、Biochrom;# K 3520)、10%FCS
11.McCoy’s 5A;(Biochrom;# F 1015)L−アラニル−L−グルタミン;(1.5mMエキストラ、Biochrom;# K 0302)、10%FCS
全体として、FACS分析によって検出された本発明の抗体の最大細胞結合は、他の公知の抗体と比較してわずかであることに留意しなければならない。表23および図12に示されているように、FACS分析によって検出された、様々な細胞に結合した抗体の量は、10μg/ml(FACS分析によって検出された抗体の細胞結合がプラトーに達した濃度)では、他の公知の抗体(PDL−192(TPP−1104)、P4A8(TPP−1324))と比較して少ない(データは示さず)。
*表21の癌細胞株の成長培地のリスト:
1.DMEM/Ham’s F12;(Biochrom;# FG 4815、安定グルタミンを含む)、10%FCS
2.RPMI 1640;(Biochrom;# FG 1215、安定グルタミンを含む)、10%FCS
3.DMEM;(Biochrom;# FG 0435、安定グルタミンを含む)、10%FCS
4.MEM Earle’s;(Biochrom;# FG 0325、安定グルタミンを含む)、10%FCS
5.DMEM;(Biochrom;# FG 0435、安定グルタミンを含む)L−アラニル−L−グルタミン;(最終4mMで2mMエキストラ,Biochrom,# K 0302)非必須アミノ酸;(最終:1×、Biochrom;# K 0293),10%FCS
6.DMEM;(Biochrom;# FG 0445、安定グルタミンを含む高グルコース),10%FCS
7.RPMI 1640;(Biochrom;# FG 1215、安定グルタミンを含む)、20%FCS
8.MEM Earle’s;(Biochrom;# F 0315)、L−アラニル−L−グルタミン;(最終:2mM、Biochrom;# K 0302)非必須アミノ酸;(最終:1×、Biochrom;# K 0293)、10%FCS
9.DMEM/Ham’s F12;(Biochrom;# FG 4815、安定グルタミンを含む)、ウマ血清(最終:2.5%);(Biochrom;# S 9135)10%FCS
10.DMEM/Ham’s F12;(Biochrom;# FG 4815、安定グルタミンを含む)、ヒドロコルチゾン;(最終:40ng/mL、Biochrom;# K 3520)、10%FCS
11.McCoy’s 5A;(Biochrom;# F 1015)L−アラニル−L−グルタミン;(1.5mMエキストラ、Biochrom;# K 0302)、10%FCS
全体として、FACS分析によって検出された本発明の抗体の最大細胞結合は、他の公知の抗体と比較してわずかであることに留意しなければならない。表23および図12に示されているように、FACS分析によって検出された、様々な細胞に結合した抗体の量は、10μg/ml(FACS分析によって検出された抗体の細胞結合がプラトーに達した濃度)では、他の公知の抗体(PDL−192(TPP−1104)、P4A8(TPP−1324))と比較して少ない(データは示さず)。
[実施例4]様々なTWEAKR発現細胞株におけるカスパーゼ3/7活性化の誘導
アポトーシス誘導のレベルを決定するために、TWEAKまたはアゴニスト抗TWEAKR抗体による癌細胞の処理後に、カスパーゼ3/7活性化を測定した。したがって、アッセイ培地(DMEM/Ham´sF12、Biochrom #FG4815+10%FCS+100ng/ml IFNガンマ(R&D Systems #285−IF))中、HT−29細胞を細胞4000個/75μl/ウェルの密度で96ウェルプレートにプレートした。24時間後、細胞を、示されている様々な濃度の抗TWEAKR抗体(表24を参照のこと)、組換えヒトTWEAK(R&D,#1090−TW−025/CF、大腸菌由来の組換え可溶性ヒトTWEAK、アクセッション# Q4ACW9のArg93−His249、Entrez Gene ID 8742、N末端Metおよび6−Hisタグを含む)または対応するアイソタイプ対照IgGと共にインキュベートした。抗体と共に24時間インキュベートした後、100μl/ウェルのカスパーゼ3/7溶液(Promega,#G8093)を細胞に追加し、1時間インキュベートし、VICTOR V(Perkin Elmer)で発光を読むことによって、カスパーゼ3/7活性を決定した。
アポトーシス誘導のレベルを決定するために、TWEAKまたはアゴニスト抗TWEAKR抗体による癌細胞の処理後に、カスパーゼ3/7活性化を測定した。したがって、アッセイ培地(DMEM/Ham´sF12、Biochrom #FG4815+10%FCS+100ng/ml IFNガンマ(R&D Systems #285−IF))中、HT−29細胞を細胞4000個/75μl/ウェルの密度で96ウェルプレートにプレートした。24時間後、細胞を、示されている様々な濃度の抗TWEAKR抗体(表24を参照のこと)、組換えヒトTWEAK(R&D,#1090−TW−025/CF、大腸菌由来の組換え可溶性ヒトTWEAK、アクセッション# Q4ACW9のArg93−His249、Entrez Gene ID 8742、N末端Metおよび6−Hisタグを含む)または対応するアイソタイプ対照IgGと共にインキュベートした。抗体と共に24時間インキュベートした後、100μl/ウェルのカスパーゼ3/7溶液(Promega,#G8093)を細胞に追加し、1時間インキュベートし、VICTOR V(Perkin Elmer)で発光を読むことによって、カスパーゼ3/7活性を決定した。
図13および表25に示されているように、本発明の抗体は、従来技術に記載されている抗体(PDL−192(TPP−1104)、P4A8(TPP−1324)、136.1(TPP−2194))と比較して、およびまた300ng/mlの組換えヒトTWEAKと比較して、カスパーゼ3/7の強力な最大誘導をもたらす(表25)。したがって、本明細書に記載される抗体は、以前に記載されている抗体よりも、HT−29細胞においてカスパーゼ3/7を誘導するのに優れている。
本発明の抗体の強力な有効性がHT−29以外の細胞株にも当てはまるかを決定するために、組換えヒトTWEAKと比較した抗TWEAKR抗体によるカスパーゼ3/7誘導能を細胞株パネルで評価した。この分析では、以下の条件を使用した:WiDr細胞を細胞3000個/ウェルでプレートし、TWEAKまたは記載されている抗体の存在下で48時間インキュベートし、A253細胞を細胞2500個/ウェルでプレートし、24時間インキュベートし、NCI−H322細胞を細胞5000個/ウェルでプレートし、48時間インキュベートし、786−O細胞を細胞2500個/ウェルでプレートし、48時間インキュベートした。A253、NCI−H322および786−O細胞の場合には、表21に記載されている培地に細胞をプレートし、100ng/ml IFNガンマ(R&D Systems #285−IF)を追加した。プレートした24時間後、100μg/mの抗体または300ng/mlのTWEAK(NCI−H322の場合には、100ng/mlのTWEAK)を追加し、細胞をさらに上記時間インキュベートした。インキュベーション時間の終了時に、HT−29細胞について記載されているように、カスパーゼ3/7活性を決定した。カスパーゼ3/7の誘導倍率を未処理細胞と比較して計算した。
表25に示されているように、試験した本発明の抗体はすべて、HT−29細胞において、他の公知の抗体と比較して増加したカスパーゼ3/7誘導を示し、300ng/mlのTWEAKリガンドと比較して強力な活性に及んだ。癌細胞における(カスパーゼ3/7活性化によって測定した場合の)この強力なアポトーシス誘導効果は、WiDr、A253、NCI−H322および786−O細胞においても見られ、ほとんどの実験において、試験した本発明の抗体は、他の抗体および300ng/mlのTWEAKと比較して高倍率の変化を誘導した。
[実施例5]癌細胞株におけるアゴニスト抗TWEAKR抗体による増殖の阻害
本発明の抗体によるカスパーゼ3/7誘導性が、様々な癌細胞株の増殖の有効な阻害によっても反映されるかを調査するために、本発明の抗体と共にインキュベートした後に、参照抗体またはTWEAKリガンドと比較して、抗増殖活性を測定した。
本発明の抗体によるカスパーゼ3/7誘導性が、様々な癌細胞株の増殖の有効な阻害によっても反映されるかを調査するために、本発明の抗体と共にインキュベートした後に、参照抗体またはTWEAKリガンドと比較して、抗増殖活性を測定した。
したがって、75μlのアッセイ培地(表21の成長培地、786−O細胞の場合にはそれに加えて100ng/ml IFNガンマ)中、細胞を以下の細胞数で96ウェルプレートにプレートした:WiDr細胞、細胞3000個/ウェル、786−O細胞、細胞2500個/ウェル。24時間後、示されている濃度(抗体は0.03〜300μg/ml、TWEAKは100または300ng/ml)の抗TWEAKR抗体(表26を参照のこと)、組換えヒトTWEAKまたはアイソタイプ対照IgG(示さず)と共に細胞をインキュベートした。抗体の追加時に、シスタープレートにおいて、細胞生存率を決定した(時点ゼロ):したがって、75μl/ウェルのCTG溶液(Promega Cell Titer Glo solution(catalog #G755B and G756B)を細胞に追加し、10分間インキュベートし、Victor V(Perkin Elmer)で発光を読んだ。薬剤と共に96時間インキュベートした後、100μl/ウェルのCTG溶液を追加し、10分間インキュベートし、発光を読むことによって、細胞生存率をアッセイプレートにおいて測定した。未処理対照ウェルにおける発光値から、時間ゼロの値を差し引くことによって、対照ウェルにおける増殖を計算した。化合物処理ウェルにおいて、未処理対照ウェルと比較した%細胞増殖を計算した。
得られた用量応答曲線(これは、対照細胞と比較した、処理細胞における細胞増殖を表す)を図14A(WiDr細胞)および図14B(786−O細胞)に示す。試験した本発明の抗体はすべて、WiDr細胞の増殖を50−60%阻害し、786−O細胞の増殖を70−80%阻害したが、これは、他の公知の抗体(例えば、PDL−192(TPP−1104)およびP4A8(TPP−1324))が達成した増殖阻害よりも有意であった。したがって、本発明の抗体は、これまでに記載されている最も有効な抗増殖性抗TWEAKR抗体である。
この強力な抗増殖活性が、より広範な細胞パネルにおいても観察され得るかを評価するために、さらに、LOVO、NCI−H1975、SW−480(すべて、細胞3000個/ウェル)、HT−29(細胞4000個/ウェル)、A253およびSK−OV3(両方とも、細胞2500個/ウェル)細胞を100μg/mlの抗TWEAKR抗体またはTWEAKリガンドと共に、表27に示されている時間インキュベートした。表21に示されている成長培地にすべての細胞を播種し、WiDr細胞を除くすべての細胞について、細胞を播種する際に、100ng/ml IFNガンマをアッセイ培地に追加した。未処理対照細胞における増殖と比較した処理細胞の成長阻害率を測定し、上記のように計算した。
表27に示されているように、本発明の抗体は、100μg/mlにおいて、他の公知の抗体と比較して、様々な癌細胞株の増殖を阻害するのに有効である。ほとんどの実験において、本発明の抗体はまた、100−300ng/mlのTWEAKリガンドと比較して同等かまたはそれよりも強力な有効性を示す。したがって、本発明に記載される抗体は、広範な癌細胞株パネルにおけるアポトーシスおよび増殖阻害の誘導活性の点でユニークである。
[実施例6]抗TWEAKR抗体によって誘導される、癌細胞および異種移植腫瘍からのサイトカイン分泌
次に、本発明の抗体の強力なアゴニスト活性が、癌細胞からのサイトカイン分泌の誘導においても見られるかを調査することが関心対象であった。
次に、本発明の抗体の強力なアゴニスト活性が、癌細胞からのサイトカイン分泌の誘導においても見られるかを調査することが関心対象であった。
したがって、成長培地DMEM(Biochrom;#FG 0435、安定グルタミンを含む)、10%FCS中、A375細胞を細胞2500個/ウェルで96ウェルプレートにプレートした。24時間後、細胞を、示されている様々な濃度の抗TWEAKR抗体、組換えヒトTWEAKまたは対応するアイソタイプ対照IgGと共にインキュベートした。抗体と共にインキュベートを開始した24時間後、細胞上清またはその希釈物をヒトCXCL8/IL−8 ELISAキット(R&D Systems DY208)の捕捉Elisaプレートに追加し、300rpmで振盪することによって4℃で一晩インキュベートした。翌日、製造業者の説明書にしたがって、ヒトCXCL8/IL−8−ELISAキット(R&D Systems DY208)を使用することによって、サンプルを分析した。光学密度を450nmで測定し(Tecan Spectra,Rainbow)、それと同時にバックグラウンド補正した。IL−8の絶対レベルを計算するために、製造業者の推奨(R&D Systems)にしたがって、組換えヒトIL−8タンパク質を使用した標準曲線を適用した。
図15に示されているように、本発明の抗体は、以前に公知の他の抗体と比較して増加したIL−8放出誘導を示した。100μg/mlにおいて、本発明の抗体TPP−1538/−1854/−2084/−2090は、300ng/mlのTWEAKリガンドと比較してそれぞれ134/129/113/103%の活性化を達成した。対照的に、比較のために使用した抗体PDL−192(TPP−1104)/P4A8(TPP−1324)/136.1(TPP−2194)は、それぞれ66/29/93%を達成したに過ぎなかった。したがって、本発明の抗体は、以前に公知の他の抗体および300ng/mlのTWEAKリガンドと比較して、IL−8分泌の誘導に関して最も強力な活性を示す。
観察されたサイトカイン分泌が、マウス内の異種移植腫瘍においても妥当するかを調査するために、腫瘍担持マウス(A375、WiDr)および無腫瘍マウス由来の血清/血漿中のヒトおよびマウスサイトカインを調査した。5×106個のA375細胞を含むMatrigel/PBS(1:1)または5×106個のWiDr細胞を含むMatrigel/培地(1:1)を免疫不全雌性NMRIヌードマウスに皮下接種した。A375担持マウスと平行して、非腫瘍マウスを調査した。約40mm2の樹立腫瘍を接種した7日後に、処理を開始した。PBSで希釈したTPP−1538(10mg/kg)またはTPP−2090(3mg/kg)を尾静脈に単回静脈内注射することによって、マウスを処理した。次いで、所定時点(A375担持マウスの場合には0、6時間、24時間、およびWiDr担持マウスの場合には0、7時間、24時間、72時間、168時間、240時間)にマウスを屠殺して、血清/血漿サンプルを収集した。断頭後に血液を採取し、30分間凝固させてから1000×gで遠心分離することによって、血清を調製した。
Luminex(登録商標)ビーズイムノアッセイを使用して、サイトカインを定量した。IL−1β、IL−1RA、IL−2、IL−2R、IL−4、IL−5、IL−6、IL−7、IL−8、IL−10、IL−12(p40)、IL−13、IL−15、IL−17、TNF−α、IFN−α、IFN−γ、GM−CSF、MIP−1α、MIP−1β、IP−10、MIG、エオタキシン、RANTESおよびMCP−1を含むヒトサイトカイン磁気25プレックスパネル(Invitrogen(登録商標),Cat−No.LHC0009M)を用いて、ヒトサイトカインを決定した。塩基性FGF、GM−CSF、IFN−γ、IL−1α、IL−1β、IL−2、IL−4、IL−5、IL−6、IL−10、IL−13、IL−12(p40/p70)、IL−17、IP−10、KC、MCP−1、MIG、MIP−1α、TNF−αおよびVEGFを含むマウスサイトカイン磁気20プレックスパネル(Invitrogen(登録商標),Cat−No.LHC0006M)を用いて、マウスサイトカインを決定した。製造業者の説明書にしたがってアッセイを行い、Luminex reader Bio−Plex 200(Bio−Rad GmbH)によって測定した。分析手順の一環として、オペレーティングソフトウェアBio−Plex Manger(Bio−Rad GmbH)によって、標準曲線からサイトカイン濃度を補間した。
図16Aに示されているように、3mg/kgのTPP−2090による単回処理によって、WiDr異種移植片からヒトIL−8が時間依存的に放出されている。加えて、TPP−2090による処理後に、ヒトMCP−1、IP−10およびIL−15の分泌の誘導が観察された(示さず)。
本発明のアゴニスト抗TWEAKR抗体による処理後の腫瘍担持マウスの血漿中で観察されたサイトカイン誘導が、実際に腫瘍特異的であったかをさらに調査するために、A375腫瘍担持マウスおよび無腫瘍マウスにおいて同様の調査を行い、ヒトサイトカインおよびマウスサイトカインを測定した。
図16Bに示されているように、10mg/kgのTPP−1538による処理の6時間後に、腫瘍担持マウス内のA375異種移植片からヒトIL−8が放出されている。加えて、ヒトMCP−1、IP−10およびIL−1RAのレベルの増加が観察された(示さず)。対照的に、処理した無腫瘍マウスの血漿中では、ヒトサイトカインの分泌の増加は検出されなかった(図16Bおよび示さず)。加えて、TPP−1538による処理後に、腫瘍担持マウスおよび無腫瘍マウスのいずれの血漿中においても、マウスサイトカイン(マウスIL−8類似体KCを含む)の増加は検出されなかった(データは示さず)。要約すると、本発明の抗体は、インビボにおいて、癌細胞および異種移植片からのサイトカインの分泌を腫瘍特異的に強力に誘導する。
[実施例7]抗TWEAKR抗体のインターナリゼーションおよび薬物コンジュゲートアプローチの有用性
本発明の抗TWEAKR抗体が、抗体薬物コンジュゲート(ADC)の作製に潜在的に使用可能であるかを調査するために、抗体のインターナリゼーション能力を調査した。
本発明の抗TWEAKR抗体が、抗体薬物コンジュゲート(ADC)の作製に潜在的に使用可能であるかを調査するために、抗体のインターナリゼーション能力を調査した。
このプロセスを可視化するために、TWEAKR特異的抗体TPP−1538およびTPP−2090ならびにアイソタイプ対照抗体を選択した。2倍モル過剰のCypHer 5EモノNHSエステル(batch 357392,GE Healthcare)(pH8.3)の存在下で、抗体をコンジュゲートした。コンジュゲートした後、反応混合物を4℃で一晩透析して(slide−A−Lyser Dialysis Cassettes MWCD 10kD,Fa.Pierce)、過剰な色素を除去し、pH値を調整した。その後、タンパク質溶液を濃縮した(VIVASPIN 500,Fa Sartorius Stedim Biotec)。pH依存性蛍光色素CypHer5Eに加えて、ph非依存性色素Alexa488を使用した。分光光度計(Fa.NanoDrop)を用いて、抗体の色素負荷を決定した。TPP−1538、TPP−2090およびアイソタイプ対照抗体の色素負荷は、同様の範囲内であった。標識細胞結合アッセイにおいて標識抗体の親和性を試験して、TWEAKRに対する結合を標識が変化させなかったことを確認した。以下のインターナリゼーションアッセイおいて、これらの標識抗体を使用した。処理前に、細胞(2×104個/ウェル)を96−MTP(fat,black,clear bottom No 4308776,Fa.Applied Biosystems)中の培地100μlに播種した。37℃/5%CO2で18時間インキュベートした後、培地を交換し、標識抗TWEAKR抗体TPP−1538およびTPP−2090を様々な濃度(10、5、2.5、1、0.3、0.1μg/ml)で追加した。同位体対照抗体(陰性対照)を用いて、同一の処理を行った。インキュベーション時間は、0、0.5時間、1時間、2時間、3時間、6時間および24時間になるように選択した。InCellAnalyzer 1000(Fa.GE Healthcare)を用いて、蛍光測定を実施した。細胞当たりの顆粒数および総蛍光強度を動的に測定した。
内因性TWEAKRを発現する癌細胞株786−O(腎臓癌)およびHT−29(結腸癌では、TPP−1538およびTPP−2090の高特異的かつ有意なインターナリゼーションが観察された。
抗TWEAKR抗体を使用して取り込みのみを実証することができ、アイソタイプ対照抗体ではインターナリゼーションが観察されなかったので、このインターナリゼーションは標的依存的であった。最初の6時間の間に、抗TWEAKR抗体は、アイソタイプ対照と比較して、抗体インターナリゼーションの20〜40倍の増加を示した。長時間(>24時間)の曝露後に、アイソタイプ対照抗体は、わずかなインターナリゼーションを示した。
結合によるAlexa488標識抗TWEAKR抗体のインターナリゼーションは、インターナリゼーションした抗体の50%超がエンドサイトーシス経路にしたがうと思われることを示している。
図17では、内因性TWEAKR発現細胞に対する結合に関する、TPP−1538およびTPP−2090の経時的な特異的インターナリゼーションの評価が示されている。腎癌細胞株786−Oにおいて、抗体(1μg/ml)のインターナリゼーションを調査した。細胞当たりの顆粒数を動的に測定した。TPP−1538およびTPP−2090では、迅速なインターナリゼーションを観察することができたのに対して、アイソタイプ対照hIgG1はインターナリゼーションしなかった。加えて、TPP−2090では、有意に改善されたインターナリゼーション効果が見られた。受容体レベルが異なる様々な癌細胞を使用して実施したインターナリゼーションアッセイにおいて、TPP−2090の高い有効性を検証することができた(示さず)。
加えて、サポリンコンジュゲート二次抗体の存在下でインキュベートした場合の、抗TWEAKR抗体の細胞増殖阻害活性をHumZapアッセイで評価した。したがって、成長培地中(DMEM/Ham´sF12,Biochrom #FG4815+10%FCS)、786−O細胞を細胞2500個/ウェルで96ウェルプレートにプレートした。24時間後、40nMサポリンコンジュゲート二次抗体(Hum Zap,Advanced Targeting Systems Cat #IT−22,Lot 59−83)の存在下または非存在下で、40nM抗体(TPP−1538、TPP−2090またはアイソタイプ対照抗体)を室温で15分間インキュベートした。インキュベーション時間後、25μlの反応混合物を細胞に追加し、サンプルウェル中の抗体の最終濃度を10nMとした。抗体の追加時に、シスタープレートにおいて、細胞生存率を決定した(時点ゼロ)。したがって、75μl/ウェルCTG溶液(Promega Cell Titer Glo solution(catalog #G755B and G756B)を細胞に追加し、10分間インキュベートし、Victor V(Perkin Elmer)で発光を読んだ。
抗体/Zap複合体と共にインキュベートを開始した48時間後、100μL/ウェルCTG溶液をすべての試験ウェルに追加し、10分間インキュベートし、VICTOR Vで発光を読んだ。
図18に示されているように、サポリンコンジュゲート二次抗体の存在下で、786−O細胞を10nMの抗TWEAKR抗体と共にインキュベートすることにより、細胞増殖がほぼ完全に阻害されたのに対して、サポリンコンジュゲート二次抗体の非存在下では、およびアイソタイプ対照抗体の場合には、同じ実験条件下(IFNガンマの非存在下で48時間インキュベートのみ)で、抗増殖活性は観察されなかった。
要約すると、本発明の抗TWEAKR抗体は、迅速なインターナリゼーション、コンジュゲートしたペイロードのターゲティング送達を示すので、ADCの作製およびADCとしての使用に非常に適切である。
[実施例8]インビボ異種移植モデルにおける抗TWEAKR抗体の抗腫瘍効果
抗TWEAKR抗体が、インビボにおいて抗腫瘍活性を示すかを調査するために、単独療法または併用療法において、アゴニスト抗TWEAKR抗体による腫瘍成長阻害に対するそれらの感度について、様々な癌細胞株由来の異種移植腫瘍または患者由来の腫瘍モデルを試験した。
抗TWEAKR抗体が、インビボにおいて抗腫瘍活性を示すかを調査するために、単独療法または併用療法において、アゴニスト抗TWEAKR抗体による腫瘍成長阻害に対するそれらの感度について、様々な癌細胞株由来の異種移植腫瘍または患者由来の腫瘍モデルを試験した。
インビボ実験の開始前に、選択した異種移植モデルにおけるTWEAKRの発現を免疫組織化学によって評価した。したがって、アセトンを用いて、対応する異種移植片の凍結切片(5μM)を4℃で5分間固定し、非特異的結合タンパク質およびペルオキシダーゼ活性に対してブロッキングした。組織切片をウサギ抗TWEAKR抗体(Fn14,Epitomics,3488−1)と共に室温で60分間インキュベートし、続いて、ペルオキシダーゼ標識抗ウサギポリマー(DAKO,K4011)と共に30分間インキュベートした。ジアミノベンジジンで切片を現像し、最後にヘマトキシリンで対比染色した。TWEAKRの発現について陽性であったモデルのみをインビボ実験に使用した。
インビボにおける抗TWEAKR抗体の抗腫瘍活性の調査のために、様々なヒト腫瘍細胞株または患者由来の腫瘍の異種移植片を担持するヌードマウスを反復静脈内注射によって処理した。
上記パートに記載されているように腫瘍細胞株を培養し、細胞株特異的な数の腫瘍細胞を含有する100μlを雌性無胸腺ヌードマウス(NMRI nu/nu,6〜8週齢、20〜25g、Taconic)に皮下(s.c.)接種した。標準的な無菌条件下でマウスを飼育し、動物保護ガイドラインにしたがって処理した。
腫瘍が約40mm2のサイズに成長した後、マウスを対照群および処理群にランダムに分けた(各群のサイズn=8−10)。PBSで希釈した様々な用量の抗TWEAKR抗体を週2回のスケジュール(q4dx3:週2回の適用、合計3回の適用;q4dx8:週2回の適用、合計8回の適用)で尾静脈に静脈内(i.v.)注射することによって、マウスを処理した。レゴラフェニブ(10mg/kg、毎日、経口)およびPI3K阻害剤1(10mg/kg、BID、2d on、5d off(2日連続で1日2回の適用、その後は5日間処理せず)、i.v.)などの併用療法パートナーは、それらの各製剤で希釈したのに対して、標準治療のイリノテカン(5mg/kg、4d on、3d off(4日連続で1日1回の適用、その後は3日間処理せず)i.v.)およびパクリタキセル(16mg/kg、q7dx4(週1回の適用、合計4回の適用)、i.v.)は、0.9%NaClで希釈した。PBSを注射した動物は、対照(ビヒクル)群としての役割を果たした。化合物の適用量は、5ml/kg体重/マウスであった。
キャリパー測定(長さ×幅、mm単位)および体重(g単位)によって、腫瘍成長を週2〜3回モニタリングした。研究の終了時に、腫瘍を解剖し、計量し、腫瘍対対照(T/C)の比(処理動物の平均腫瘍重量を対照/ビヒクル動物の平均腫瘍重量で割ったもの)の計算に使用した。
ヒト腎細胞癌モデル(陽性TWEAKR発現)において、アイソタイプ対照抗体と対比して、抗TWEAKR抗体TPP−2084およびTPP−2090の有効性を3つの異なる低用量で試験した。100%マトリゲル中の2×106個の腫瘍細胞を雌性ヌードマウスに皮下(s.c.)接種した。7日後、約40mm2のサイズの樹立腫瘍を、0.3mg/kg、1mg/kgおよび3mg/kgの抗体(i.v.、q4dx3:週2回の適用、合計3回の適用)で処理した。40日目において、解剖後の腫瘍重量の比較により、TPP−2084およびTPP−2090の用量依存的な有効性(これは、3mg/kgにおいて最高であった)が示された(図19)。(PBSで処理した)アイソタイプ群およびビヒクル群との明確な区別を証明することができた。いかなる群においても、体重の減少は観察されなかった。表28に記載されている腫瘍対対照比は、q7dx3(週1回の適用、合計3回の適用)またはq4dx3(週2回の適用、合計3回の適用)スケジュールによって3〜10mg/kgの抗TWEAKR抗体TPP−1538、TPP−2094またはTPP−2090で処理した786−Oモデルおよびさらなる腫瘍モデル(A375、A253、SK−OV−3、Bx−PC3)における優れた有効性を実証しているが、MDA−MB−231については、単独療法の有効性を達成するためには、より強力な投与スケジュールの抗TWEAKR抗体が必要であり得る。
図20は、ヒト結腸癌異種移植片WiDr(これは、HT−29腫瘍細胞株のサブクローンに相当する)における、単独療法ならびにイリノテカンおよびレゴラフェニブとの併用療法による抗TWEAKR抗体TPP−2090の有効性を示す。マトリゲル/培地(1:1)中の5×106個のWiDr細胞を免疫不全NMRIヌードマウスに皮下(s.c.)接種した。約40mm2の樹立腫瘍を接種した7日後に、処理を開始した。単独療法による3mg/kgのTPP−2090(i.v.、q4dx7:週2回の適用、合計7回の適用)でさえ、腫瘍成長を制御するのに非常に有効であった。3mg/kgのTPP−2090とイリノテカン(5mg/kg、i.v.、4d on、3d off)またはレゴラフェニブ(10mg/kg、p.o.、毎日)のいずれかとの組み合わせは、腫瘍退縮を伴う相加効果をもたらした。治療計画はすべて、マウスに十分許容されるものであった(最大4%の回復可能な初期体重減少)。最終的なT/C値は、表29に記載されている。
他の結腸直腸腫瘍モデル、例えばSW480および患者由来の腫瘍モデルCo5682においても、TPP−2090を調査したところ、同様に良好な結果であった(表29)。用量10mg/kgのTPP−2090は、SW480における単独療法では、腫瘍成長を制御するのに有効であり(T/C0.49)、5mg/kgイリノテカン(T/C0.22)または10mg/kgレゴラフェニブ(T/C0.37)と組み合わせた場合には、腫瘍退縮をもたらすのに有効であった。Co5682異種移植片では、3mg/kgのTPP−2090は、イリノテカンと組み合わせた場合には、腫瘍退縮を伴う相乗効果を示し(T/C0.23)、レゴラフェニブと組み合わせた場合には、腫瘍鬱滞を伴う相乗効果を示した(T/C0.27)。
図21は、ヒト非小細胞肺癌異種移植NCI−H322における、単独療法およびパクリタキセルとの併用療法による抗TWEAKR抗体TPP−2090の有効性を示す。マトリゲル中の5×106個のNCI−H322細胞を免疫不全NMRIヌードマウスに皮下(s.c.)接種した。約45mm2の樹立腫瘍を接種した14日後に、処理を開始した。用量5mg/kgにおいて、TPP−2090(i.v.、q4dx8)は単独療法で非常に有効であり、腫瘍退縮を示した。10mg/kgのTPP−2090とパクリタキセル(16mg/kg、i.v.、q7dx4)との組み合わせは、わずかな相加効果をもたらした。治療計画はすべて、マウスに十分許容されるものであった(最大3%の回復可能な体重減少)。最終的なT/C値は、表30に記載されている。
先と同様に、他の肺癌モデル、例えばNCI−H1975ならびに患者由来の腫瘍モデルLu7343およびLu7433においても、TPP−2090を調査したところ、同程度の結果であった(表30)。用量3mg/kgのTPP−2090は、NCI−H1975では、16mg/kgパクリタキセルと組み合わせた場合に相加効果を示し、腫瘍退縮をもたらした(T/C0.08)。同様に、患者由来のNSCLCモデルLu7343およびLu7433では、3mg/kgのTPP−2090と10mg/kgのPI3K阻害剤1との組み合わせは、相加効果的に、腫瘍制御または腫瘍退縮をもたらした(T/C0.18−0.36)。
PI3K阻害剤1は、(2−アミノ−N−[7−メトキシ−8−(3−モルホリン−4−モルホリン−4−イルプロポキシ)−2,3−ジヒドロイミダゾ)[1,2−c]キナゾリン−5−イル]ピリミジン−5−カルボキサミドジヒドロクロリドである。
記載されているインビボの実施例はすべて、細胞株由来のおよび患者由来のヒト腫瘍モデル(これらはすべて、TWEAKR発現が陽性である)の広範なパネルにおける、単独療法および併用療法による抗TWEAKR抗体TPP−2090の強力な有効性を実証している。使用したすべて用量において、TPP−2090は、マウスに十分許容されるものであった。
[実施例9]異種移植モデルにおける抗TWEAKR抗体の作用機序
インビボにおける抗TWEAKR抗体の作用機序を調査するために、実施例8に記載されているように、WiDr異種移植片由来の腫瘍を研究終了時に採取し、免疫組織化学およびウエスタンブロット分析によって調査した。
インビボにおける抗TWEAKR抗体の作用機序を調査するために、実施例8に記載されているように、WiDr異種移植片由来の腫瘍を研究終了時に採取し、免疫組織化学およびウエスタンブロット分析によって調査した。
増殖マーカータンパク質Ki67について、WiDr異種移植片(1群当たり3匹の個々の動物の腫瘍)の凍結切片(5μm)を免疫組織化学的に染色した(インビボ実験の詳細については、実施例8を参照のこと)。新たに調製した4%パラホルムアルデヒドを用いて、切片を4℃で20分間固定し、非特異的結合タンパク質およびペルオキシダーゼ活性に対してブロッキングした。製造業者の説明書(DAKO,K3954)にしたがって、ビオチンでマウス抗Ki67抗体(DAKO,M7240)を標識し、組織切片と共に室温で60分間インキュベートし、続いて、エクストラアビジン−ペルオキシダーゼ(DAKO,K3468)と共に30分間インキュベートした。ジアミノベンジジンで切片を現像し、最後にヘマトキシリンで対比染色した。定量のために、腫瘍切片全体をスキャンし、ARIOL自動顕微鏡バージョン3.2(Applied Imaging,San Jose CA,USA)を使用して分析した。PBS(i.v.、q4dx7)およびTPP−2090(10mg/kg、i.v.、q4dx7)で処理した異種移植片をKi67について染色した代表的な画像をそれぞれ図22AおよびBに示す。ARIOL画像システムを使用した定量により、10mg/kgのTPP−2090(i.v.q4dx7)で処理した群における355+/−59 Ki67陽性細胞/mm2、およびビヒクル処理群における863+/−90 Ki67陽性細胞/mm2が明らかになった。したがって、観察された腫瘍体積の減少と一致して、アゴニスト抗TWEAKR抗体による処理は、異種移植腫瘍における増殖マーカーKi67の減少をもたらす。
加えて、研究終了時に急速凍結したWiDr異種移植片腫瘍(インビボ実験の詳細については、実施例8を参照のこと)をウエスタンブロットによって分析して、Stat−1およびNF−κBシグナル伝達経路に対する抗体処理の効果を評価した。1群当たり4匹の個々の動物の腫瘍を直径約5mmの薄片に切断し、各薄片を、予冷5mm steel bull(Qiagen)および500μlの溶解緩衝液(50mM Hepes pH7.2、150mM NaCl、1mM MgCl2、10mM Na4P2O7、100mM NaF、10%グリセリン、1.5%Triton X−100、新たに追加した完全プロテアーゼ阻害剤カクテル(Roche No.1873580001)、4mM Na3VO4、NaOHでpHを7.4に調整))と一緒に2mlエッペンドルフチューブにデポした。Tissuelyzer(Qiagen)によってサンプルを300Hzで3分間溶解し、続いて、氷上で30分間インキュベートした。その後、マイクロ遠心分離機(Eppendorf)によってサンプルを13000rpm、4℃で10分間遠心分離し、1つの元の腫瘍由来の上清を一緒にプールした。BCAタンパク質アッセイキット(Novagen、H2Oで溶解物を1:50希釈)を使用することによって、腫瘍溶解物中のタンパク質レベルを決定した。サンプルを最終濃度4mg/mlに希釈し、10μlのサンプルを3.08μlの(10*)サンプル還元剤、10μlのH2Oおよび7,68μlの(4*)NuPAGEサンプル緩衝液(Invitrogen)と混合した。40μgのタンパク質に相当するサンプルをInvitrogenのNuPage 4−12%SDS pageゲルにアプライし、120Vで2時間45分間ランした。製造業者の推奨にしたがって、iBlotシステム(Invitrogen)によって、ブロッティングを行った。5%BLOT QuickBlockerのPBST(Invitrogen)溶液によって膜を室温で2時間ブロッキングし、続いて、一次抗体と共に4℃で一晩インキュベートした。一次抗体は、以下のとおりであった:Phospho−Stat1 #9167S,Stat−1 #9172、両方ともCell Signaling Technology、1:1000希釈;TWEAKR/Fn14 #3488−1 Epitomics、1:10000希釈;NF−κB2 p100/p52 #4882S,Cell Signaling Technology、3%BLOT QuickBlockerのPBST溶液で1:1000希釈。翌日、PBSTで膜を3回洗浄し、続いて、二次抗体(ペルオキシダーゼコンジュゲートロバ抗ウサギIgG #NA934,GE Healthcare、3%BLOT QuickBlocker/PBSTで1:10000)と共に室温で2時間インキュベートした。続いて、PBSTで膜を10分間かけて4回洗浄し、ECL試薬と共にインキュベートした後に化学発光によって、シグナルを検出したローディング対照を検出するために、室温で振盪しながら、ストリッピング溶液Re−Blot+濃縮液#2504,Milipore(Milipore−H2Oで1:10)で膜を15分間ストリップし、続いて、ブロッキングし、抗GAPDH抗体(clone6C5,# MAB374,Millipore、3%QuickBlocker/PBSTで1:10000)および二次抗体(ペルオキシダーゼコンジュゲートヤギ抗マウスIgG,Jackson Immunoresearch #115−035−003、3%BLOT Quickblocker/PBSTで1:10000)で検出した。
TPP−2090 3mg/kgで処理した1群当たり2匹の動物の腫瘍からの代表的なブロットを、ビヒクル処理動物由来の腫瘍と並べて図23に示す。p52断片の出現によって示されるように、TPP−2090による処理は、全Stat−1およびリン酸化Stat−1レベルの強力な増加、ならびにNF−κB2の強力な活性化をもたらす。したがって、異種移植腫瘍において、NF−κB2およびStat−1経路は、アゴニスト抗TWEAKR抗体によって活性化され、この活性化は、対応する抗体の抗腫瘍活性に潜在的に関与する。
[実施例10]さらなるヒト結腸直腸癌インビボモデルにおける抗TWEAKR抗体TPP−2090の抗腫瘍効果
さらなるヒト結腸直腸癌腫瘍細胞株Colo205細胞について、ならびにさらなるヒト結腸直腸癌患者由来モデルCo7553、Co5896、Co5676、Co5841、CXF1103およびCXF533について、実施例8に記載されているように、動物研究を行った。標準投与スケジュールは、単独療法によって、またはレゴラフェニブもしくは標準治療(SoC)イリノテカン(5−15mg/kg i.p.、4d on、3d off)、オキサリプラチン(3−8mg/kg i.p.、週2回)、5−フルオロウラシル(50−100mg/kg i.p.、週1回)およびセツキシマブ(15mg/kg i.p.、週2回)と組み合わせて、10mg/kgのTPP−2090を4週間にわたって週2回であった。TPP−2090およびセツキシマブをPBS(対照群では、これをビヒクルとしても使用した)で製剤化し、SoCを0.9%NaClで製剤化した。レゴラフェニブの製剤化は、実施例8に記載されている。
さらなるヒト結腸直腸癌腫瘍細胞株Colo205細胞について、ならびにさらなるヒト結腸直腸癌患者由来モデルCo7553、Co5896、Co5676、Co5841、CXF1103およびCXF533について、実施例8に記載されているように、動物研究を行った。標準投与スケジュールは、単独療法によって、またはレゴラフェニブもしくは標準治療(SoC)イリノテカン(5−15mg/kg i.p.、4d on、3d off)、オキサリプラチン(3−8mg/kg i.p.、週2回)、5−フルオロウラシル(50−100mg/kg i.p.、週1回)およびセツキシマブ(15mg/kg i.p.、週2回)と組み合わせて、10mg/kgのTPP−2090を4週間にわたって週2回であった。TPP−2090およびセツキシマブをPBS(対照群では、これをビヒクルとしても使用した)で製剤化し、SoCを0.9%NaClで製剤化した。レゴラフェニブの製剤化は、実施例8に記載されている。
これらのヒト結腸直腸癌患者由来のおよび細胞株ベースのモデルにおけるTPP−2090の単独療法の有効性は中程度であり、最終的な腫瘍対対照(T/C)比は0.48〜1.07の範囲内であった。TPP−2090とSoC(特に、5−FUおよびイリノテカン)との組み合わせは、有意な相加効果および相乗効果をもたらした(表33〜35を参照のこと)。これらのモデルにおけるTPP−2090の単独療法の有効性が限定的であった場合、結腸直腸癌に関する実施例8に示されているのと同様に、より高い単独療法の有効性を達成するためには、より強力な投与スケジュールの抗TWEAKR抗体が必要であり得る。
[実施例11]ヒト膀胱癌インビボモデルにおける抗TWEAKR抗体TPP−2090の抗腫瘍効果
ヒト膀胱癌細胞株SCaBERおよびKU−19−19について、ならびにヒト膀胱癌患者由来モデルBXF1352およびBXF1228について、実施例8に記載されているように、動物研究を行った。標準投与スケジュールは、単独療法によって、または標準治療(SoC)ゲムシタビン(200mg/kg i.p.、週1回)およびシスプラチン(3mg/kg i.p.、週1回)と組み合わせて、10mg/kgのTPP−2090を4週間にわたって週2回であった。TPP−2090をPBS(対照群では、これをビヒクルとしても使用した)で製剤化し、標準治療(SoC)を0.9%NaClで製剤化した。
ヒト膀胱癌細胞株SCaBERおよびKU−19−19について、ならびにヒト膀胱癌患者由来モデルBXF1352およびBXF1228について、実施例8に記載されているように、動物研究を行った。標準投与スケジュールは、単独療法によって、または標準治療(SoC)ゲムシタビン(200mg/kg i.p.、週1回)およびシスプラチン(3mg/kg i.p.、週1回)と組み合わせて、10mg/kgのTPP−2090を4週間にわたって週2回であった。TPP−2090をPBS(対照群では、これをビヒクルとしても使用した)で製剤化し、標準治療(SoC)を0.9%NaClで製剤化した。
SCaBER異種移植モデルでは、TPP−2090の強力な単独療法の有効性が見出された。ヒト膀胱癌患者由来の膀胱癌モデルBXF1352およびBXF1228では、TPP−2090とSoC(シスプラチンおよびゲムシタビン)との組み合わせは、有意な相乗効果をもたらした(表36を参照のこと)。これらの膀胱癌モデルにおけるTPP−2090の単独療法の有効性が限定的であった場合、より高い単独療法の有効性を達成するためには、より強力な投与スケジュールの抗TWEAKR抗体が必要であり得る。
[実施例12]さらなるヒト癌インビボモデルにおける抗TWEAKR抗体TPP−2090の抗腫瘍効果
異なる適応症のさらなるヒト癌細胞株について、実施例8に記載されているように、動物研究を行った。標準投与スケジュールは、単独療法によって、10mg/kgのTPP−2090を2〜3週間にわたって週2回であった。TPP−2090をPBS(対照群では、これをビヒクルとしても使用した)で製剤化した。
異なる適応症のさらなるヒト癌細胞株について、実施例8に記載されているように、動物研究を行った。標準投与スケジュールは、単独療法によって、10mg/kgのTPP−2090を2〜3週間にわたって週2回であった。TPP−2090をPBS(対照群では、これをビヒクルとしても使用した)で製剤化した。
SCC4(頭頸部癌)およびA375(黒色腫)異種移植片では、TPP−2090の強力な単独療法の有効性が見出され、BxPC3(膵臓癌)異種移植片では、わずかな有効性が見出された(表37を参照のこと)。特定の異種移植モデルにおけるTPP−2090の単独療法の有効性が限定的であった場合(ACHN(腎細胞癌)、PA−1(卵巣癌)、NCI−292(非小細胞肺癌)およびU87MG(神経膠芽腫))、より高い単独療法の有効性を達成するためには、より強力な投与スケジュールの抗TWEAKR抗体が必要であり得る。
[実施例13]異種移植モデルにおける抗TWEAKR抗体のさらなる作用機序
TPP−2090の抗腫瘍効果が抗体依存性細胞傷害(ADCC)に依存するか、またはアゴニスト活性のみで既に十分であるかを評価するために、SCIDベージュマウス(Janvier)における異種移植研究を行い、NMRIヌードマウスにおいて、TPP−2090のアグリコシル化変異体(すなわち、TPP−2658)を調査した。
TPP−2090の抗腫瘍効果が抗体依存性細胞傷害(ADCC)に依存するか、またはアゴニスト活性のみで既に十分であるかを評価するために、SCIDベージュマウス(Janvier)における異種移植研究を行い、NMRIヌードマウスにおいて、TPP−2090のアグリコシル化変異体(すなわち、TPP−2658)を調査した。
SCIDベージュマウス内のWiDr(ヒト結腸直腸癌)およびSCaBER(ヒト膀胱癌)異種移植片において、実施例8に記載されているように、動物研究を行ったところ、対照群の腫瘍成長は、先の研究のNMRIヌードマウスのものと同程度であった。標準投与スケジュールは、単独療法によって、10mg/kgのTPP−2090(PBSで製剤化)を静脈内(i.v.)で2週間にわたって週2回であった。
NK細胞を欠くSCIDベージュマウス異種移植モデル(WiDrおよびSCaBER)では、NMRIヌードマウスで見られたように、TPP−2090の同様に強力な単独療法の有効性が見出された。これは、インビボにおける作用機序がADCCとは無関係であることを示している(表38を参照のこと)。
インビトロ分析により、HT29細胞に対するTPP−2090結合は、NK92Vエフェクター細胞による標的細胞の用量依存的なADCCをもたらしたが、アグリコシル化TPP−2658は、ADCCを誘導することができなかったことが示された(表40)。1×104個のHT−29標的細胞を分注し、試験抗体を最終濃度25μg/ml;5μg/ml;1μg/ml;0,2μg/mlおよび0,04μg/mlで追加した。30分間プレインキュベートした後、エフェクター細胞を追加した(5×104NK92V個のNK92Vエフェクター細胞)。37℃で4時間インキュベートした後、「細胞毒性検出キット−LDH(Roche)」を用いて、HT29細胞溶解を決定したところ、1%Triton X−100で可溶化した細胞から最大放出が得られ、陰性対照は抗体と共にプレインキュベートしなかった。以下の式を%HT29溶解の計算に使用した:[Ext(サンプル)−Ext(陰性)×100]/[Ext(最大放出)−Ext(陰性)]。TPP−2090は、NK92Vエフェクター細胞による標的細胞の用量依存的なADCCをもたらしたが、これはN297グリコシル化に依存している。
Claims (22)
- 配列番号:169に示されるTWEAKRの47位のD(D47)に特異的に結合する、単離された抗TWEAKR抗体またはその抗原結合断片。
- 抗体がアゴニスト抗体である、請求項1に記載の抗体またはその抗原結合断片。
- (a)式PYPMX(配列番号:171)(式中、Xは、IまたはMである)を含むアミノ酸配列によってコードされる重鎖CDR1;
(b)式YISPSGGXTHYADSVKG(配列番号:172)(式中、Xは、SまたはKである)を含むアミノ酸配列によってコードされる重鎖CDR2;および
(c)式GGDTYFDYFDY(配列番号:173)を含むアミノ酸配列によってコードされる重鎖CDR3
を含む可変重鎖と、
(a)式RASQSISXYLN(配列番号:174)(式中、Xは、GまたはSである)を含むアミノ酸配列によってコードされる軽鎖CDR1;
(b)式XASSLQS(配列番号:175)(式中、Xは、Q、AまたはNである)を含むアミノ酸配列によってコードされる軽鎖CDR2;および
(c)式QQSYXXPXIT(配列番号:176)(式中、5位のXは、TまたはSであり、6位のXは、TまたはSであり、8位のXは、GまたはFである)を含むアミノ酸配列によってコードされる軽鎖CDR3
を含む可変軽鎖とを含む、請求項1または2に記載の抗体またはその抗原結合断片。 - a.配列番号:6によって示される可変重鎖CDR1配列、配列番号:7によって示される可変重鎖CDR2配列、および配列番号:8によって示される可変重鎖CDR3配列を含む可変重鎖、ならびに
配列番号:3によって示される可変軽鎖CDR1配列、配列番号:4によって示される可変軽鎖CDR2配列、および配列番号:5によって示される可変軽鎖CDR3配列を含む可変軽鎖、または
b.配列番号:16によって示される可変重鎖CDR1配列、配列番号:17によって示される可変重鎖CDR2配列、および配列番号:18によって示される可変重鎖CDR3配列を含む可変重鎖、ならびに
配列番号:13によって示される可変軽鎖CDR1配列、配列番号:14によって示される可変軽鎖CDR2配列、および配列番号:15によって示される可変軽鎖CDR3配列を含む可変軽鎖、または
c.配列番号:26によって示される可変重鎖CDR1配列、配列番号:27によって示される可変重鎖CDR2配列、および配列番号:28によって示される可変重鎖CDR3配列を含む可変重鎖、ならびに
配列番号:23によって示される可変軽鎖CDR1配列、配列番号:24によって示される可変軽鎖CDR2配列、および配列番号:25によって示される可変軽鎖CDR3配列を含む可変軽鎖、または
d.配列番号:36によって示される可変重鎖CDR1配列、配列番号:37によって示される可変重鎖CDR2配列、および配列番号:38によって示される可変重鎖CDR3配列を含む可変重鎖、ならびに
配列番号:33によって示される可変軽鎖CDR1配列、配列番号:34によって示される可変軽鎖CDR2配列、および配列番号:35によって示される可変軽鎖CDR3配列を含む可変軽鎖、または
e.配列番号:46によって示される可変重鎖CDR1配列、配列番号:47によって示される可変重鎖CDR2配列、および配列番号:48によって示される可変重鎖CDR3配列を含む可変重鎖、ならびに
配列番号:43によって示される可変軽鎖CDR1配列、配列番号:44によって示される可変軽鎖CDR2配列、および配列番号:45によって示される可変軽鎖CDR3配列を含む可変軽鎖、または
f.配列番号:56によって示される可変重鎖CDR1配列、配列番号:57によって示される可変重鎖CDR2配列、および配列番号:58によって示される可変重鎖CDR3配列を含む可変重鎖、ならびに
配列番号:53によって示される可変軽鎖CDR1配列、配列番号:54によって示される可変軽鎖CDR2配列、および配列番号:55によって示される可変軽鎖CDR3配列を含む可変軽鎖、または
g.配列番号:66によって示される可変重鎖CDR1配列、配列番号:67によって示される可変重鎖CDR2配列、および配列番号:68によって示される可変重鎖CDR3配列を含む可変重鎖、ならびに
配列番号:63によって示される可変軽鎖CDR1配列、配列番号:64によって示される可変軽鎖CDR2配列、および配列番号:65によって示される可変軽鎖CDR3配列を含む可変軽鎖、または
h.配列番号:76によって示される可変重鎖CDR1配列、配列番号:77によって示される可変重鎖CDR2配列、および配列番号:78によって示される可変重鎖CDR3配列を含む可変重鎖、ならびに
配列番号:73によって示される可変軽鎖CDR1配列、配列番号:74によって示される可変軽鎖CDR2配列、および配列番号:75によって示される可変軽鎖CDR3配列を含む可変軽鎖、または
i.配列番号:86によって示される可変重鎖CDR1配列、配列番号:87によって示される可変重鎖CDR2配列、および配列番号:88によって示される可変重鎖CDR3配列を含む可変重鎖、ならびに
配列番号:83によって示される可変軽鎖CDR1配列、配列番号:84によって示される可変軽鎖CDR2配列、および配列番号:85によって示される可変軽鎖CDR3配列を含む可変軽鎖、または
j.配列番号:96によって示される可変重鎖CDR1配列、配列番号:97によって示される可変重鎖CDR2配列、および配列番号:98によって示される可変重鎖CDR3配列を含む可変重鎖、ならびに
配列番号:93によって示される可変軽鎖CDR1配列、配列番号:94によって示される可変軽鎖CDR2配列、および配列番号:95によって示される可変軽鎖CDR3配列を含む可変軽鎖、または
k.配列番号:106によって示される可変重鎖CDR1配列、配列番号:107によって示される可変重鎖CDR2配列、および配列番号:108によって示される可変重鎖CDR3配列を含む可変重鎖、ならびに
配列番号:103によって示される可変軽鎖CDR1配列、配列番号:104によって示される可変軽鎖CDR2配列、および配列番号:105によって示される可変軽鎖CDR3配列を含む可変軽鎖、または
l.配列番号:116によって示される可変重鎖CDR1配列、配列番号:117によって示される可変重鎖CDR2配列、および配列番号:118によって示される可変重鎖CDR3配列を含む可変重鎖、ならびに
配列番号:113によって示される可変軽鎖CDR1配列、配列番号:114によって示される可変軽鎖CDR2配列、および配列番号:115によって示される可変軽鎖CDR3配列を含む可変軽鎖
を含む、請求項1〜3のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片。 - a.配列番号:10によって示される可変重鎖配列、および配列番号:9によって示される可変軽鎖配列、または
b.配列番号:20によって示される可変重鎖配列、および配列番号:19によって示される可変軽鎖配列、または
c.配列番号:30によって示される可変重鎖配列、および配列番号:29によって示される可変軽鎖配列、または
d.配列番号:40によって示される可変重鎖配列、および配列番号:39によって示される可変軽鎖配列、または
e.配列番号:50によって示される可変重鎖配列、および配列番号:49によって示される可変軽鎖配列、または
f.配列番号:60によって示される可変重鎖配列、および配列番号:59によって示される可変軽鎖配列、または
g.配列番号:70によって示される可変重鎖配列、および配列番号:69によって示される可変軽鎖配列、または
h.配列番号:80によって示される可変重鎖配列、および配列番号:79によって示される可変軽鎖配列、または
i.配列番号:90によって示される可変重鎖配列、および配列番号:89によって示される可変軽鎖配列、または
j.配列番号:100によって示される可変重鎖配列、および配列番号:99によって示される可変軽鎖配列、または
k.配列番号:110によって示される可変重鎖配列、および配列番号:109によって示される可変軽鎖配列、または
l.配列番号:120によって示される可変重鎖配列、および配列番号:119によって示される可変軽鎖配列
を含む、請求項1〜4のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片。 - IgG抗体である、請求項1〜5のいずれか一項に記載の抗体。
- a.配列番号:2によって示される重鎖配列、および配列番号:1によって示される軽鎖配列、または
b.配列番号:12によって示される重鎖配列、および配列番号:11によって示される軽鎖配列、または
c.配列番号:22によって示される重鎖配列、および配列番号:21によって示される軽鎖配列、または
d.配列番号:32によって示される重鎖配列、および配列番号:31によって示される軽鎖配列、または
e.配列番号:42によって示される重鎖配列、および配列番号:41によって示される軽鎖配列、または
f.配列番号:52によって示される重鎖配列、および配列番号:51によって示される軽鎖配列、または
g.配列番号:62によって示される重鎖配列、および配列番号:61によって示される軽鎖配列、または
h.配列番号:72によって示される重鎖配列、および配列番号:71によって示される軽鎖配列、または
i.配列番号:82によって示される重鎖配列、および配列番号:81によって示される軽鎖配列、または
j.配列番号:92によって示される重鎖配列、および配列番号:91によって示される軽鎖配列、または
k.配列番号:102によって示される重鎖配列、および配列番号:101によって示される軽鎖配列、または
l.配列番号:112によって示される重鎖配列、および配列番号:111によって示される軽鎖配列
を含む、請求項1〜6のいずれか一項に記載の抗体。 - scFv、Fab、Fab’断片またはF(ab’)2断片である、請求項1〜7のいずれか一項に記載の抗原結合断片。
- モノクローナル抗体またはその抗原結合断片である、請求項1〜8のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合断片。
- ヒト抗体、ヒト化抗体もしくはキメラ抗体または抗原結合断片である、請求項1〜9のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合断片。
- 請求項1〜10に記載の抗体またはその抗原結合断片を含む、抗体−薬物複合体。
- 請求項1〜10に記載の抗体または抗原結合断片をコードする、単離された核酸配列。
- 請求項12に記載の核酸配列を含む、ベクター。
- 請求項1〜10のいずれか一項に記載の抗体もしくは抗原結合断片を発現し、ならびに/または請求項12に記載の核酸もしくは請求項13に記載のベクターを含む、単離された細胞。
- 前記細胞が原核細胞または真核細胞である、請求項14に記載の単離された細胞。
- 請求項1〜10のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合断片を生産する方法であって、請求項15に記載の細胞を培養すること、および前記抗体または抗原結合断片を精製することを含む、方法。
- 医薬として使用するための、請求項1〜10に記載の抗体もしくは抗原結合断片または請求項11に記載の抗体−薬物複合体。
- 診断剤として使用するための、請求項1〜10に記載の抗体または抗原結合断片。
- 癌を治療するための医薬として使用するための、請求項1〜10に記載の抗体もしくは抗原結合断片または請求項11に記載の抗体−薬物複合体。
- 請求項1〜10に記載の抗体もしくは抗原結合断片または請求項11に記載の抗体−薬物複合体を含む、医薬組成物。
- 請求項20に記載の医薬組成物と、1つ以上の治療的に活性な化合物との組み合わせ。
- TWEAKRの望ましくない存在に関連する障害または症状を治療するための方法であって、有効量の請求項20に記載の医薬組成物または請求項21に記載の組み合わせを、該治療を必要とする被験体に投与することを含む、方法。
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